IT201900007785A1 - Vescicole extracellulari per veicolare farmaci terapeutici o diagnostici - Google Patents

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Paolo Ciana
Mariangela Garofalo
Alessandro Maria Villa
Vincenzo Mazzaferro
Adriana Maggi
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Description

Titolo: "Vescicole extracellulari per veicolare farmaci terapeutici o diagnostici
DESCRIZIONE
Campo tecnico dell’invenzione
La presente invenzione trova applicazione nel campo medico e, in particolare, per la diagnosi o la terapia tumorale.
La terapia chirurgica in oncologia resta il trattamento più efficace per l’eradicazione dei tumori solidi. Il successo della terapia dipende quasi esclusivamente dalla capacità del chirurgo di resecare i margini tumorali. Questa capacità non è al momento facilmente standardizzabile e viene affidata all’esperienza e alla sensibilità tattile/visiva del chirurgo stesso. L’uso di composti diagnostici altamente selettivi permetterebbe al chirurgo di visualizzare direttamente, o attraverso metodiche di imaging, i margini del tumore all’interno di un tessuto sano durante la procedura chirurgica.
L’efficacia di modalità di imaging quali PET, MRI ed ecografia nella diagnosi del tumore dipende dalla loro sensibilità di rilevazione. L’accumulo selettivo di molecole di contrasto (come, ad esempio, ICG, gadolinio, 18FDG, microbolle) consentirebbe di aumentare il rapporto segnale/rumore di fondo.
Negli ultimi vent'anni, sono numerose le nanoparticelle di diversa natura (liposomi, vescicole extracellulari, nanoparticelle biocompatibili) che sono state proposte quale sistema di delivery patotropico nell'ambito oncologico; tuttavia, sono poche le metodologie che hanno raggiunto la pratica clinica, quali, ad esempio, il lipoplatino o la doxorubicina liposomiale.
Recentemente, le pubblicazioni di M. Garofalo et al. (Journal of Controlled Release 2018 Aug 10;283:223-234; Journal of Controlled Release, 2019 Jan 28;294:165-175; Viruses,2018 Oct 13;10(10)) riportano gli studi sull’effetto e sulla selettività di virus oncolitici e di paclitaxel incapsulati in vescicole extracellulari nel trattamento di cellule tumorali di origine polmonare.
Anche se limitati, questi pochi esempi applicativi sono significativi, in quanto queste formulazioni hanno permesso di ridurre notevolmente la tossicità dei farmaci chemioterapici nell'ambito del trattamento di diversi tipi di tumore.
Vi sono, tuttavia, limitazioni nei sistemi fino ad ora proposti, le cui principali sono ascrivibili: 1) alla limitata patotropicità, 2) alla scarsa biocompatibilità e 3) alla limitata possibilità di veicolare molecole di grandi dimensioni, tipicamente rappresentate da farmaci biologici.
Riassunto dell’invenzione
Gli inventori della presente domanda di brevetto hanno sorprendentemente trovato che è possibile impiegare vescicole extracellulari isolate da plasma di pazienti oncologici per veicolare farmaci ad attività diagnostica o terapeutica selettivamente verso cellule tumorali.
Breve descrizione delle figure
La figura 1 (pannello a sinistra) mostra i risultati della caratterizzazione delle vescicole extracellulari ottenute secondo la presente invenzione;
la figura 1 (pannello a destra) mostra i risultati delle analisi delle dimensioni attraverso la tecnica NTA;
la figura 2A mostra i risultati delle prove di imaging in vivo (sinistra) e ex vivo (destra) su topo dopo iniezione i.v. con vescicole extracellulari derivate da plasma di paziente oncologico caricate con verde di Indocianina;
la figura 2B mostra i risultati delle prove di imaging in vivo (sinistra) e ex vivo (destra) su topo dopo iniezione i.v. con vescicole extracellulari derivate da plasma di individuo sano caricate con verde di Indocianina;
la figura 3A mostra i risultati nel topo dopo 18 dall’iniezione i.v. di 50 µL di acido gadoterico;
la figura 3B mostra i risultati nel topo dopo 18 dall’iniezione i.v. di 50 µL di acido gadoterico caricato in vescicole extracellulari in accordo con la presente invenzione;
la figura 4 mostra i risultati dei saggi di fluorescenza acquisiti mediante IVIS Lumina in seguito all’incorporazione di anticorpi nelle vescicole extracellulari dell’invenzione incubate per 10 minuti (sinistra) o 12 ore (destra) con ICG;
la figura 5 mostra i risultati dei saggi di fluorescenza acquisiti mediante IVIS Lumina in seguito all’incorporazione di anticorpi nelle vescicole extracellulari dell’invenzione incubate per 10 minuti (sinistra) o 12 ore (destra) con ICG;
la figura 6 mostra i risultati dell’acquisizione in chemioluminescenza di dot blots per vescicole extracellulari secondo l’invenzione incubate per 10 minuti (sinistra, -) o per 12 ore (destra, ) con oligonucleotidi coniugati con digossigenina.
Oggetto dell’invenzione
In un primo oggetto, la presente domanda di brevetto descrive vescicole extracellulari isolate da plasma di paziente oncologico comprendenti farmaci ad attività diagnostica o terapeutica tumorale.
In un secondo e terzo oggetto dell’invenzione, sono descritti un metodo per l’isolamento ed un processo per la purificazione di vescicole extracellulari da un campione isolato di plasma di paziente oncologico.
In un quarto oggetto è descritto un metodo per il caricamento di farmaci ad attività diagnostica o terapeutica in vescicole extracellulari isolate da plasma di paziente oncologico.
In un quinto oggetto è descritto l’uso medico delle vescicole extracellulari isolate da plasma di paziente oncologico e caricate con un farmaco ad attività diagnostica e/o terapeutica per la diagnosi e/o la terapia di tumori.
In un ulteriore oggetto è descritto un metodo per la diagnosi e/o la terapia di tumori comprendente la somministrazione ad un paziente che ne ha bisogno di vescicole extracellulari isolate da plasma di paziente oncologico e caricate con un farmaco ad attività diagnostica e/o terapeutica.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Secondo un primo oggetto, la presente invenzione descrive vescicole extracellulari comprendenti farmaci diagnostici e/o terapeutici per il trasporto selettivo verso un tessuto tumorale.
Per gli scopi della presente invenzione, il termine “vescicole extracellulari” (qui a seguito talvolta abbreviato con “EV”) è stato proposto per comprendere tutti i tipi di vescicole di membrana rilasciate nello spazio extracellulare, indipendentemente dalle loro differenze nella biogenesi e composizione.
Esosomi, microvescicole e corpi apoptotici sono quindi inclusi all’interno di questa definizione.
In particolare, gli esosomi sono piccole vescicole (30-150 nm) coinvolte nella comunicazione intercellulare, le microvescicole sono vescicole di 100-1000 nm, mentre i corpi apoptotici hanno origine da cellule apoptotiche e la loro dimensione è compresa tra 1000-5000 nm.
Per gli scopi della presente invenzione, un farmaco diagnostico è un farmaco scelto nel gruppo che comprende:
- marcatori fluorescenti, ad esempio scelti nel gruppo che comprende: DiD (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina, sale 4-clorobenzensolfonato), ICG (verde di indocianina, cardiogreen);
- mezzi di contrasto, ad esempio scelti nel gruppo che comprende composti comprendenti gadolinio, come acido gadoterico, gadodiamide, acido gadodenico, gadobutrolo, gadofosveset, acido gadopentetico, gadoteridolo e acido gadoxetico;
- ligandi proteici coniugati, ad esempio scelti nel gruppo che comprende: ocreotide.
Per gli scopi della presente invenzione, un farmaco terapeutico è rappresentato da un farmaco per la terapia del tumore ed è preferibilmente scelto nel gruppo che comprende:
- farmaci chemioterapici, scelti ad esempio nel gruppo che comprende: paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, carboblatino, vinorelbina, pemetrexed; - anticorpi monoclonali, scelti ad esempio nel gruppo che comprende: bevacizumab, cetuximab, nivolumab, pembrolizumab;
- acidi nucleici, scelti ad esempio nel gruppo che comprende: oligonucleotidi antisenso e aptameri;
- adenovirus oncolitici, scelti ad esempio nel gruppo che comprende Ad5D24.
Secondo un aspetto preferito della presente invenzione, le vescicole extracellulari descritte sono isolate da plasma sanguigno (di seguito riportato per brevità come “plasma”).
Secondo un aspetto particolarmente preferito della presente invenzione, il plasma è rappresentato da plasma di un paziente oncologico, cioè di un paziente con una patologia oncologica.
Secondo un aspetto, le vescicole sono isolate dal plasma dello stesso paziente (uso autologo) al quale le vescicole sono somministrate per la diagnosi e/o la terapia tumorale, come qui a seguito riportato; alternativamente, si tratta di un paziente differente (uso eterologo) da quello dal cui plasma sono isolate le vescicole.
Per gli scopi della presente domanda di brevetto, la forma tumorale da cui è affetto il paziente dal cui plasma sono isolate le vescicole extracellulare è la stessa forma tumorale da cui è affetto il paziente a cui le vescicole comprendenti il farmaco diagnostico o terapeutico sono somministrate; alternativamente, si tratta di una forma tumorale differente.
In un aspetto preferito della presente invenzione, le vescicole extracellulari hanno una dimensione compresa fra 50 e 300 nm.
Secondo un altro aspetto dell’invenzione, le vescicole hanno un potenziale Z che non è modificato dal caricamento di un farmaco diagnostico/terapeutico.
Per gli scopi della presente invenzione, il potenziale Z è la carica netta posseduta dalle particelle, ossia il potenziale elettrocinetico presente nelle dispersioni colloidali; in altre parole, il potenziale Z è la differenza di potenziale tra il mezzo di dispersione e lo strato stazionario di fluido attaccato alla particella dispersa.
In un secondo e terzo oggetto dell’invenzione, sono descritti un metodo per l’isolamento ed un processo per la purificazione di vescicole extracellulari da plasma di paziente oncologico.
In particolare, il metodo della presente invenzione comprende una fase di preparazione del plasma da un campione isolato di sangue di paziente. Tale fase di preparazione comprende, in particolare, le fasi di:
A1) trattare un campione isolato di sangue da un paziente con un agente opportuno in grado di inibire la cascata coagulativa,
A2) sottoporre il campione così trattato ad una fase di centrifugazione a bassa velocità,
A3) separare il surnatante,
A4) sottoporre il surnatante ad una fase di centrifugazione ad alta velocità.
In particolare, nella fase A1) il sangue isolato è trattato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o in alternativa eparina o citrato.
Per gli scopi della presente invenzione, tutti i passaggi successivi vanno eseguiti entro poche ore dal prelievo e, preferibilmente, entro 12 ore.
La fase A2) di centrifugazione a bassa velocità è preferibilmente condotta alla velocità di 1600 RCF per un tempo di circa 10 minuti a temperatura ambiente.
La fase A4) di centrifugazione ad alta velocità è preferibilmente condotta alla velocità di circa 3000 RCF per un tempo di circa 10 minuti a temperatura ambiente.
Dal metodo secondo quanto sopra descritto sono quindi isolate vescicole extracellulari (VE).
In un secondo e terzo oggetto dell’invenzione, sono descritti un metodo per l’isolamento ed eventualmente anche per la purificazione di vescicole extracellulari da un campione isolato di plasma di paziente oncologico.
In particolare, il metodo per l’isolamento comprende le fasi di:
B1) sottoporre il campione isolato di plasma ad una centrifugazione,
B2) allontanare il surnatante.
Più in dettaglio, la fase B1) di centrifugazione è preferibilmente condotta alla velocità di circa 10.000 RCF per 120 minuti alla temperatura di circa 4°C.
Inoltre, preferibilmente, la fase B1) è condotta su un campione di plasma isolato ottenuto secondo quanto sopra descritto.
Il deposito solido ottenuto dalla fase B2) comprende vescicole extracellulari, che possono essere risospese in una opportuna soluzione tampone e poi filtrate.
In particolare, dette vescicole extracellulare sono: risospese in un’opportuna soluzione tampone, che poi è opportunamente filtrata, per evitare contaminazioni, con filtri in politetrafluoroetilene (PTFE), idrofili, con maglia da 0,1 µm; ad esempio, può essere impiegato tampone fosfato (PBS) contenente sieroalbumina bovina (BSA), ad esempio alla concentrazione di circa 0,5%.
Per gli scopi della presente invenzione, la sospensione di vescicole extracellulari in una soluzione tampone ottenuta secondo quanto sopra descritto può essere sottoposta a purificazione.
In un aspetto preferito dell’invenzione, detta purificazione può essere condotta mediante separazione magnetica.
Più in dettaglio, tale purificazione comprende le fasi di:
C1) aggiunta di una soluzione contenente beads magnetici legati ad un opportuno anticorpo,
C2) incubazione della sospensione della fase C1) per un tempo opportuno,
C3) purificazione su colonna per la separazione magnetica in un campo magnetico,
C4) centrifugazione della sospensione di vescicole extracellulari purificate dalla fase C3), C5) allontanamento del surnatante.
Nella fase C1) può essere aggiunto un quantitativo di soluzione di beads magnetici di circa 20 µl.
In particolare, tali beads magnetici sono legati ad un anticorpo anti-human CD81.
L’incubazione della fase C2) è preferibilmente condotta per 16 ore a 4°C.
Con riferimento alla purificazione su colonna della fase C3), questa comprende, più in particolare, le fasi di:
C3.a) caricamento della sospensione su una colonna per la separazione magnetica in campo magnetico,
C3.b) lavaggio con opportuna soluzione per l’eliminazione delle impurezze. In un aspetto preferito, il lavaggio può essere condotto con soluzione tampone fosfato a cui segue opportuno filtraggio secondo la procedura della fase B2,
C3.c) rilascio delle vescicole extracellulari per allontanamento del campo magnetico dalla colonna e eluizione con opportuna soluzione. In un aspetto preferito, l’eluizione è condotta con soluzione tampone fosfato a cui segue opportuno filtraggio secondo la procedura della fase B2, e preferibilmente a pressione elevata.
Per quanto concerne la fase C4), la centrifugazione è preferibilmente condotta alla velocità di circa 100.000 RCF per un tempo di circa 120 minuti alla temperatura di circa 4°C.
Dopo l’allontanamento del surnatante, le vescicole sono risospese in un’opportuna soluzione tampone, ad esempio rappresentata da tampone fosfato (PBS) a cui segue opportuno filtraggio secondo la procedura della fase B2.
Secondo un quarto oggetto dell’invenzione, è descritto un metodo per il caricamento di farmaci ad attività diagnostica e/o terapeutica in vescicole extracellulari isolate da plasma di paziente oncologico.
In un aspetto preferito, le vescicole extracellulari caricate sono ottenute, ed eventualmente purificate, secondo il metodo della presente invenzione.
In particolare, il metodo comprende la fase D1) di incubare le vescicole extracellulari per un opportuno periodo di tempo con una soluzione contenente il farmaco ad attività diagnostica e/o terapeutica.
Più in particolare, le vescicole sono poste in incubazione a partire da una sospensione comprendente circa 10<8>-10<9 >vescicole.
Preferibilmente, tali vescicole possono essere sospese in 1 ml di un’opportuna soluzione tampone, rappresentata, ad esempio, da tampone fosfato (PBS), a cui segue opportuno filtraggio, ad esempio con filtri in politetrafluoroetilene (PTFE), idrofili, con maglia da 0,1 µm.
Per quanto concerne il farmaco, questo è posto in incubazione a partire da una soluzione ad una concentrazione opportuna, in funzione delle necessità, come ad esempio, quantitativo di farmaco da veicolare e in funzione del farmaco stesso.
Per gli scopi della presente invenzione, l’incubazione è condotta per un tempo di circa 1-24 ore, preferibilmente di circa 1-12 ore, in funzione delle necessità, come ad esempio, quantitativo di farmaco da veicolare e la natura del farmaco stesso. L’incubazione è preferibilmente condotta a 4°C.
Dopo la fase D1) di incubazione, la sospensione può essere sottoposta alle fasi di:
D2) centrifugazione, e
D3) allontanamento del surnatante.
Le vescicole extracellulari caricate così ottenute possono essere risospese in un’opportuna soluzione tampone, ad esempio rappresentata da tampone fosfato (PBS) a cui segue opportuno filtraggio secondo la procedura della fase B2.
In particolare, la fase D2) è condotta alla velocità di circa 150.000 per un tempo di circa 180 minuti e, preferibilmente, a temperatura ambiente.
Per gli scopi della presente invenzione, alcuni parametri del metodo di caricamento del farmaco diagnostico e/o terapeutico dipendono da alcuni fattori, quali, ad esempio: il volume di soluzione tampone per preparare la sospensione da centrifugare, il quantitativo di farmaco per l’incubazione, il tempo di incubazione, il quantitativo di soluzione per la risospensione delle vescicole extracellulari caricate con il farmaco.
L’individuazione delle condizioni precise si ritiene sia nelle competenze della persona esperta nel settore.
Il quantitativo dipenderà dalle necessità e dal farmaco caricato all’interno delle vescicole.
In accordo con il quinto oggetto dell’invenzione è descritto l’uso medico delle vescicole extracellulari isolate da plasma di paziente oncologico per la diagnosi e/o la terapia di tumori.
In particolare, come sopra descritto, le vescicole sono isolate dal plasma dello stesso paziente al quale le vescicole sono somministrate per la diagnosi e/o la terapia tumorale (uso autologo); alternativamente, sono isolate dal plasma di un paziente per essere successivamente impiegate per l’uso medico in un paziente differente (uso eterologo).
Per gli scopi della presente domanda di brevetto, la forma tumorale da cui è affetto il paziente dal cui plasma sono isolate le vescicole extracellulari è la stessa forma tumorale da cui è affetto il paziente a cui le vescicole caricate sono somministrate; alternativamente, si tratta di una forma tumorale differente.
La quantità di preparazione di vescicole extracellulari caricate da somministrare al paziente potrà essere determinata dal tecnico del settore sulla base delle necessità.
In particolare, le vescicole extracellulari preparate in accordo con la descrizione qui sopra sono somministrate endovena.
In accordo con un ulteriore oggetto è descritto un metodo per la diagnosi e/o la terapia di tumori comprendente la somministrazione ad un paziente che ne ha bisogno di vescicole extracellulari isolate da plasma di paziente oncologico e caricate con un farmaco ad attività diagnostica e/o terapeutica secondo quanto sopra decritto.
Il tipo di farmaco e la sua quantità da somministrare possono essere definite dall’esperto del settore a seconda delle necessità.
In particolare, le vescicole extracellulari preparate in accordo con la descrizione qui sopra sono somministrate endovena.
L’invenzione verrà qui a seguito maggiormente descritta grazie ad esempi da intendersi come non limitativi.
ESEMPIO 1
Preparazione di vescicole extracellulari purificate A. Separazione del plasma dal prelievo ematico
• Il sangue (10-20 mL) viene prelevato utilizzando provette sottovuoto contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). I passaggi successivi vanno eseguiti entro poche ore dal prelievo (massimo 12 ore).
• La provetta (p1) viene centrifugata alla velocità di 1600 RCF per 10 minuti a temperatura ambiente (rt). • Il surnatante viene prelevato e trasferito in una nuova provetta (p2) di volume adeguato.
• La provetta (p2) viene centrifugata alla velocità di 3000 RCF per 10 minuti a rt.
• Il surnatante rappresenta il campione di plasma che verrà utilizzato per i passaggi successivi.
B. Isolamento delle vescicole extracellulari
• Il plasma viene trasferito in provette per ultracentrifuga (U1).
• Le provette (U1) vengono centrifugate alla velocità di 100000 RCF per 120 minuti a 4°C.
• Il surnatante viene aspirato ed eliminato.
• Il deposito solido residuo nelle provette (U1), contenente le vescicole, viene risospeso in 1 mL di tampone fosfato (PBS) contenente lo 0,5% di sieroalbumina bovina (BSA), opportunamente filtrato con filtri da 0,1 µm.
C. Purificazione delle vescicole extracellulari
• Alla sospensione contenente le vescicole vengono aggiunti 20 µL di soluzione contenente beads magnetici legati ad un anticorpo anti–human CD81.
• La sospensione di VE viene lasciata in incubazione con l’anticorpo per 16 ore a 4°C.
• Dopo l’incubazione, la sospensione di VE viene fatta eluire attraverso una colonna per la separazione magnetica in campo magnetico.
• La colonna viene lavata per 3 volte con PBS, opportunamente filtrato come descritto sopra.
• Le EV all’interno della colonna vengono rilasciate allontanando la colonna dal campo magnetico e lavandola con 5 mL di PBS, opportunamente filtrato come descritto sopra, ad elevata pressione.
• La sospensione viene trasferita in una provetta da ultracentrifuga (U2).
• Le provette (U2) vengono centrifugate alla velocità di 100000 RCF per 120 minuti a 4°C.
• Il surnatante viene aspirato ed eliminato.
• Il deposito solido residuo nelle provette (U2), contenente le vescicole, viene risospeso in 200 µL di tampone fosfato (PBS), opportunamente filtrato come descritto sopra.
ESEMPIO 2
Caricamento con agente terapeutico oncologico –
Paclitaxel
Una preparazione di vescicole extracellulari preparate e purificate secondo l’Esempio 1 è caricata con il farmaco terapeutico oncologico Paclitaxel.
- Un quantitativo compreso tra 10<8 >e 10<9 >VE viene risospeso in 1 mL di PBS, opportunamente filtrato come descritto sopra.
- L’agente terapeutico Paclitaxel viene diluito alla concentrazione di circa 10 nmol.
- Le EV sono lasciate in incubazione con l’agente terapeutico per 1 ora a rt.
- Il campione è trasferito in provette per ultracentrifuga (U3).
- Le provette (U3) sono centrifugate alla velocità di 150000 RCF per 180 minuti a rt.
- Il surnatante è aspirato ed eliminato.
- Il deposito solido residuo nelle provette (U3) è risospeso in 1 mL di tampone fosfato (PBS), opportunamente filtrato come descritto sopra.
ESEMPIO 3
Caricamento con agente diagnostico –
Verde di Indocianina
- Un quantitativo compreso tra 108 e 109 VE viene risospeso in 1 mL di PBS, opportunamente filtrato come descritto sopra.
- 10 µg dell’agente diagnostico sono diluiti ad una concentrazione adeguata.
- Le EV sono lasciate in incubazione con l’agente diagnostico per 12 ore a 4°C.
- Le provette (U3) sono centrifugate alla velocità di 150000 RCF per 180 minuti a rt.
- Il surnatante è aspirato ed eliminato.
- Il deposito solido residuo nelle provette (U3) è risospeso in 200 µL di tampone fosfato (PBS), opportunamente filtrato come descritto sopra, per l’iniezione del diagnostico.
ESEMPIO 4
Caricamento con agente terapeutico biologico – virus oncolitico
- Un quantitativo compreso tra 108 e 109 VE viene risospeso in 1 mL di PBS, opportunamente filtrato con filtri da 0,1 µm.
- Una preparazione comprendente 10<9 >di virus oncolitico è diluita ad una concentrazione adeguata al caricamento nelle VE.
- Le EV sono lasciate in incubazione con l’agente terapeutico biologico per 1 ora a rt.
- Il campione è trasferito in provette per ultracentrifuga (U3).
- Le provette (U3) sono centrifugate alla velocità di 150000 RCF per 180 minuti a rt.
- Il surnatante è aspirato ed eliminato.
- Il deposito solido residuo nelle provette (U3) è risospeso in 1 mL di tampone fosfato (PBS), opportunamente filtrato con filtri da 0,1 µm.
ESEMPIO 5
Metodo di caratterizzazione delle vescicole 10 µL della sospensione di cellule ottenute dall’Esempio 1 vengono prelevati per la successiva caratterizzazione.
Il numero e le dimensioni delle VE isolate sono determinati utilizzando le tecniche definite Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) (Figura 1, sinistra) e Electrophoretic Light Scattering (ELS, Figura 1, destra) seguendo le indicazioni dei produttori degli strumenti (Miltenyi Biotec GmbH, Germania).
In particolare, la figura 1 riporta i risultati della caratterizzazione di VE ottenute da plasma di pazienti oncologici, prima e dopo il caricamento con agenti terapeutici.
Nel pannello a sinistra sono riportati i risultati delle analisi delle dimensioni attraverso la tecnica NTA: le curve sono relative alle vescicole prima e dopo il caricamento e dei virus non incapsulati. Nel pannello a destra, sono riportati i risultati delle analisi della carica attraverso la tecnica ELS: sinistra le vescicole prima del caricamento, centro le vescicole dopo il caricamento con il virus, destra il virus non incapsulato.
Le vescicole da utilizzare devono avere una dimensione compresa tra i 50 e 300 nm ed un potenziale Z che non è modificato dall’inserimento di agenti terapeutici (es., virus oncolitico nella figura).
ESEMPIO 6
EV da plasma di pazienti oncologici come agente teranostico
Per la prova è stata utilizzata una preparazione di 1*10<6 >cellule di una linea cellulare di tumore al polmone LL/2 (Lewis Lung carcinoma).
Quando il tumore ha raggiunto le dimensioni palpabili (diametro di circa 5 mm) è stata effettuata un’acquisizione dell’emissione di autofluorescenza basale per eliminare il “rumore di fondo”; l’acquisizione è stata ottenuta attraverso anestesia gassosa con diisoflurano e misurando l’emissione di fluorescenza per 1 secondo di esposizione attraverso il dispositivo IVIS Lumina II Quantitative Fluorescent and Bioluminescent Imaging (PerkinElmer, Waltham, MA, US).
Le immagini sono la fluorescenza basale emessa dagli animali (autofluorescenza). La sovrapposizione delle immagini a luce riflessa e quelle di fluorescenza è stato effettuato con il software Living Image Software 3.2 (PerkinElmer).
Le VE isolate dal plasma di pazienti oncologici sono state caricate con un virus oncolitico come agente terapeutico e con ICG come agente diagnostico (VE1) come descritto dalla procedura descritta più sopra. 10<8 >VE sono state iniettate per endovena e 24 ore dopo l’iniezione è stata acquisita la fluorescenza emessa in vivo dai topi (in vivo imaging) come descritto sopra.
Al termine dell’acquisizione, i topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale, dissezionati, ed è stata valutata la fluorescenza emessa dai seguenti organi: cervello, fegato, milza, reni, polmoni, cuore, intestino, tessuto adiposo, tessuto tumorale (ad esempio, vedi Figura 2A) sempre con il dispositivo IVIS Lumina II.
Nel pannello superiore della figura 2 è mostrato il risultato in vivo e nel pannello inferiore il risultato ex vivo dell’imaging del segnale di fluorescenza nello spettro di emissione del Verde di Indocianina (ex.: 788 nm, em.: 813 nm). L’animale è stato sottoposto alla procedura di acquisizione delle immagini di fluorescenza prima in vivo e poi ex vivo sugli organi espiantati dopo sacrificio per dislocazione cervicale. Come riportato in Figura 2A-B e 3A-B, gli esperimenti di imaging mostrano un tropismo specifico delle VE da plasma di pazienti oncologici per il tessuto tumorale. L’iniezione di vescicole ottenute da plasma di soggetti sani, e in particolare non affetti da patologie oncologiche, caricate con un virus oncolitico, come agente terapeutico, e con ICG, come agente diagnostico (VE1), come descritto dalla presente invenzione e mostrato nelle figure, non hanno mostrato un accumulo specifico in nessuno degli organi presi in esame, come determinato utilizzando la procedura di ex-vivo imaging descritta.
L’iniezione i.v. nel topo di 50 µL di una preparazione di vescicole extracellulari ottenute secondo la presente invenzione da paziente oncologico e caricate con acido gadoterico ha mostrato dopo 24 h dall’inoculo notevole selettività per i tessuti tumorali da LL2 (come mostrato in figura 3B) rispetto all’iniezione i.v. di 0,5 M di acido gadoterico 50 µL (figura 3A).
ESEMPIO 7
Anticorpi e oligonucleotidi Sono stati concotti saggi di incorporazione di anticorpi (figure 4 e 5) e oligonucleotidi (figura 6).
In particolare, per il saggio della figura 4, le immagini di fluorescenza sono state acquisite con IVIS Lumina, applicando filtri ICG (ex. 710 – 760 nm; em.
810 – 875) su vescicole extracellulari incubate per 10 minuti (sinistra) o 12 ore (destra) con ICG.
Per il saggio della figura 5, le immagini di fluorescenza sono state acquisite con IVIS Lumina, applicando filtri Cy5.5 (ex. 615 – 665 nm; em. 695 – 770) su vescicole extracellulari incubate per 10 minuti (sinistra) o 12 ore (destra) con anticorpo secondario anti-sheep, coniugato con sonda fluorescente Alexafluor 647.
La figura 6 è relativa all’acquisizione in chemiluminescenza di dot blots relativi a vescicole extracellulari incubate per 10 minuti (sx, -) o per 12 ore (dx, ) con oligonucleotidi coniugati con digossigenina. Le vescicole extracellulari sono state lisate con ripa buffer, spottate su membrana in PTFE ed incubate con anticorpo anti-DIG, coniugato con HRP per 1 ora. Dopo i lavaggi con TBS-T, la membrana è stata esposta a ECL ed acquisita con lo strumento Li-Cor Odyssey. L’ingrandimento riporta i valori di densitometria riferiti alla regione di interesse sovrastante (indicata con una linea tratteggiata).
Da quanto sopra descritto saranno evidenti alla persona esperta del settore i vantaggi offerti dalle formulazioni dell’invenzione.
In particolare, per quanto concerne le applicazioni diagnostiche, queste possono essere:
- intraoperatorie, oppure
- nella diagnostica per immagini.
Nell’applicazione intraoperatoria, le vescicole preparate secondo la presente invenzione hanno il vantaggio di consentire di visualizzare un tumore primario o le metastasi, delineando quali sono i margini del tumore rispetto ai tessuti sani e permettere così al chirurgo di agire in modo preciso.
Nelle applicazioni di visualizzazione per immagini (imaging) possono essere impiegate le tecniche ritenute più opportune dal tecnico del settore, in sede di diagnosi preliminare oppure di trattamento, farmacologico oppure chirurgico.
Nelle applicazioni di diagnostica per immagini, inoltre, le vescicole extracellulari della presente invenzione consentono il trasporto di una grande quantità di farmaco, grazie al loro volume importante; vantaggiosamente, ciò può portare ad un aumento della sensibilità della metodica diagnostica.
Più in generale, grazie alle vescicole extracellulare proposte dalla presente invenzione, possono essere veicolati farmaci, rappresentati da piccole molecole o da farmaci biologici, in modo selettivo al bersaglio tumorale, permette di aumentare l’efficacia di un protocollo terapeutico e di ridurne, così, gli effetti collaterali.
Grazie alle loro dimensioni, le vescicole si prestano ottimamente al trasporto di farmaci di grandi dimensioni, come, ad esempio, molecole fluorescenti, elementi chimici come il gadolinio, molecole radioattive come il 18FDG.
Inoltre, si deve notare come la vescicola extracellulare funga da guscio proteggendo il farmaco dall’azione di metabolismo e/o degradazione svolta dall’organismo umano, nonché protegge i tessuti non bersaglio dall’azione dello stesso farmaco; tale aspetto risulta particolarmente importante per i farmaci biologici.
Il processo descritto per la preparazione delle vescicole della presente invenzione caricate con farmaci ad azione terapeutico e/o diagnostica, comprende fasi e passaggi semplici e veloci ed è, nel complesso, una metodologia applicabile ed integrabile nelle procedure dei centri ospedalieri anche più piccoli.
L’impiego di vescicole extracellulari autologhe, inoltre, fornisce ampie garanzie circa l’assenza di eventuali rigetti causati dall’incompatibilità con i tessuti dell’ospite.

Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico comprendenti un farmaco avente attività diagnostica o terapeutica per uso medico.
  2. 2. Vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico secondo la rivendicazione precedente, in cui detto farmaco è un farmaco per la diagnosi o la terapia tumorale.
  3. 3. Vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto farmaco è un farmaco per la diagnosi tumorale scelto nel gruppo che comprende: - marcatori fluorescenti, ad esempio scelti nel gruppo che comprende: DiD (1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′- tetrametilindodicarbocianine, sale 4-clorobenzenesulfonato), ICG (verde di indocianina, cardiogreen); - mezzi di contrasto, ad esempio scelti nel gruppo che comprende composti comprendenti gadolinio; - ligandi proteici coniugati, ad esempio scelti nel gruppo che comprende: ocreotide.
  4. 4. Vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto farmaco per la terapia tumorale è scelto nel gruppo che comprende: - farmaci chemioterapici, scelti ad esempio nel gruppo che comprende: paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, carboblatino, vinorelbina, pemetrexed; - anticorpi monoclonali, scelti ad esempio nel gruppo che comprende: bevacizumab, cetuximab, nivolumab, pembrolizumab; - acidi nucleici, scelti ad esempio nel gruppo che comprende: oligonucleotidi antisenso e aptameri; - adenovirus oncolitici, scelti ad esempio nel gruppo che comprende Ad5D24.
  5. 5. Vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico comprendenti un farmaco avente attività diagnostica o terapeutica per uso medico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto uso medico è verso lo stesso paziente da cui dette vescicole extracellulari sono isolate oppure è un paziente diverso dal soggetto da cui dette vescicole extracellulari sono isolate.
  6. 6. Vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico per uso medico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette vescicole hanno una dimensione compresa fra circa 50 e 300 nm.
  7. 7. Vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico per uso medico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui dette vescicole comprendono esosomi, microvescicole e corpi apoptotici.
  8. 8. Un metodo per l’isolamento di vescicole extracellulari da un campione isolato di plasma sanguigno comprendente le fasi di: B1) sottoporre detto campione isolato di plasma ad una fase di centrifugazione, preferibilmente alla velocità di circa 10.000 RCF per 120 minuti alla temperatura di circa 4°C, B2) allontanare il surnatante.
  9. 9. Il metodo secondo la rivendicazione precedente, comprendente ulteriormente la fase di risospendere dette vescicole in un’opportuna soluzione tampone e di sottoporla a filtraggio.
  10. 10. Il metodo secondo la rivendicazione precedente 8 o 9, comprendente la fase ulteriore di purificare dette vescicole extracellulari.
  11. 11. Un metodo per la preparazione di un campione isolato di plasma da un paziente oncologico comprendente le fasi di A1) trattare detto campione isolato di sangue con un agente opportuno in grado di inibire la cascata coagulativa, A2) sottoporre il campione così trattato ad una fase di centrifugazione a bassa velocità, A3) separare il surnatante, A4) sottoporre il surnatante ad una fase di centrifugazione ad alta velocità.
  12. 12. Il metodo secondo la rivendicazione precedente, in cui detta fase A2) è condotta alla velocità di 1.600 RCF per un tempo di circa 10 minuti a temperatura ambiente.
  13. 13. Il metodo secondo la rivendicazione 11 o 12, in cui detta fase A4) è condotta alla velocità di circa 3.000 RCF per un tempo di circa 10 minuti a temperatura ambiente.
  14. 14. Un metodo per la preparazione di vescicole extracellulari isolate da plasma sanguigno di paziente oncologico comprendenti un farmaco avente attività diagnostica o terapeutica comprendente la fase di incubare una sospensione di vescicole extracellulari ottenute secondo il metodo della rivendicazione 8 o 9 o 10 per un opportuno periodo di tempo con una soluzione contenente detto farmaco ad attività diagnostica e/o terapeutica.
  15. 15. Il metodo secondo la rivendicazione precedente, in cui in incubazione è posta una sospensione comprendente circa 10<8>-10<9 >vescicole extracellulari.
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