IT201700020707A1 - Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications - Google Patents

Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications

Info

Publication number
IT201700020707A1
IT201700020707A1 IT102017000020707A IT201700020707A IT201700020707A1 IT 201700020707 A1 IT201700020707 A1 IT 201700020707A1 IT 102017000020707 A IT102017000020707 A IT 102017000020707A IT 201700020707 A IT201700020707 A IT 201700020707A IT 201700020707 A1 IT201700020707 A1 IT 201700020707A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
poly
acid
chitosan
process according
coacervated
Prior art date
Application number
IT102017000020707A
Other languages
English (en)
Inventor
Enza Torino
Paolo Netti
Original Assignee
Fondazione St Italiano Tecnologia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fondazione St Italiano Tecnologia filed Critical Fondazione St Italiano Tecnologia
Priority to IT102017000020707A priority Critical patent/IT201700020707A1/it
Priority to PCT/IB2018/051087 priority patent/WO2018154470A1/en
Priority to US16/487,896 priority patent/US11311853B2/en
Priority to EP18708491.8A priority patent/EP3585447A1/en
Publication of IT201700020707A1 publication Critical patent/IT201700020707A1/it

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/10—Complex coacervation, i.e. interaction of oppositely charged particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A61K49/0034—Indocyanine green, i.e. ICG, cardiogreen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1821—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1824—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/0491—Sugars, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, nucleic acids, e.g. DNA, RNA, nucleic acid aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1241—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins
    • A61K51/1244—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L67/00—Compositions of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L67/02—Polyesters derived from dicarboxylic acids and dihydroxy compounds
    • C08L67/03—Polyesters derived from dicarboxylic acids and dihydroxy compounds the dicarboxylic acids and dihydroxy compounds having the carboxyl- and the hydroxy groups directly linked to aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L77/00—Compositions of polyamides obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L77/04—Polyamides derived from alpha-amino carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2205/00—Polymer mixtures characterised by other features
    • C08L2205/22—Mixtures comprising a continuous polymer matrix in which are dispersed crosslinked particles of another polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2207/00—Properties characterising the ingredient of the composition
    • C08L2207/53—Core-shell polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2312/00—Crosslinking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Graft Or Block Polymers (AREA)

Description

“Processo per la preparazione di nanoparticelle polimeriche doppiamente reticolate per applicazioni di diagnostica per immagini e teranostica”
CAMPO TECNICO
La presente invenzione riguarda il campo delle sonde, radiotraccianti ed agenti di contrasto per la diagnostica medicale per immagini, in particolare per le tecniche emergenti di diagnostica per immagini multimodale.
STATO DELL’ARTE
Il campo della diagnostica per immagini ha visto rapidi progressi nell’ultimo decennio, grazie al suo valore dimostrato in numerosi studi. La diagnostica per immagini multimodale permette l’integrazione dei punti di forza delle modalità individuali superando allo stesso tempo le loro limitazioni. Ad esempio, le tecnologie di diagnostica per immagini anatomica, quali la risonanza magnetica per immagini (RM), forniscono un dettaglio strutturale senza pari; mentre le modalità funzionali come la tomografia ad emissione di positroni (PET) forniscono la conoscenza dei comportamenti morfologici e funzionali. La recente comparsa di dispostivi per diagnostica per immagini “ibridi” combinanti le modalità RM e PET permette di eseguire due test diagnostici sullo stesso sistema simultaneamente, evitando così test multipli e migliorando la prestazione di registrazione, tutto ciò si dimostra utile per pianificare la radioterapia.
I recenti sviluppi nella diagnostica per immagini multimodale hanno portato a strumentazione diagnostica ibrida come ad esempio PET-RM, tomografia computerizzata a singolo fotone–risonanza magnetica per immagini (SPECT-RM) e PET ottica, le quali hanno spalancato la via per l’implementazione dei protocolli di diagnostica per immagini multimodale. In parallelo con la comparsa di questi strumenti “ibridi”, la necessità di nuove sonde e radiotraccianti è cresciuta e la nanotecnologia sta ora giocando un ruolo chiave nella preparazione di nuove sonde che possano essere usate per applicazioni multimodali.
In particolare, la coacervazione complessa, che è un tipo unico di separazione di fase liquido-liquido guidata elettrostaticamente dall’associazione di macro-ioni carichi in maniera opposta, è un interessante processo di preparazione perché è considerato scalabile ed a basso costo. Inoltre, un altro grande vantaggio di questo processo è la produzione di nanostrutture con elevato carico (fino al 99%) con proprietà di rilascio controllate.
Il maggiore svantaggio del processo di coacervazione è l’elevato numero di parametri coinvolti e questa complessità ha attratto l’interesse di diversi studi sulla stabilità dei coacervati, in particolare di quelli fatti di polimeri biocompatibili. Per esempio, in EP1163274B9 la formazione di coacervati acido ialurionico-chitosano è riportata come sottoprodotto di un processo per la preparazione di film e gel di acido ialuronico reticolato più di una volta. Kaimatzer et al. in Soft Matter, (2015), 11, 8605 ha studiato gli effetti di pH, forza ionica, densità di carica, lunghezza della catena e rapporto tra le cariche sulla sintesi di coacervati acido ialurionico-chitosano non caricati.
Attualmente, i processi di coacervazione complessa sono ampiamente impiegati per la micro-produzione di cibo confezionato, cosmetici, carta e tessili, in aggiunta al loro uso nel campo farmaceutico e nutraceutico. Per esempio, Liu et al. in J Mater Sci: Mater Med (2007) 18:2215-2224 hanno riportato un processo di coacervazione per la preparazione di particelle chitosano-ialuronato a doppia parete ed il loro uso come vettori per farmaci proteici.
Contrariamente, nel campo della diagnostica per immagini, specialmente per RM, l’uso del processo di coacervazione è stato limitato finora dalle difficoltà nel combinare nanostrutture stabili ed agenti di contrasto. Infatti, la coniugazione di agenti di contrasto a polimeri incapsulanti necessita un compromesso tra la stabilità del coacervato e l’uso di materiali non completamente biocompatibili per applicazioni RM. Un tentativo in questa direzione è riportato da Wang et al. in Chem Commun., 2013, 49, 3736, in cui ioni dei lantanidi, ossia europio (III) e gadolinio (III), sono stati incapsulati in una struttura micellare coacervata di raggio 20 nm in maniera controllata. I materiali incapsulanti sono il ligando 1,11-bis(2,6-dicarbossipiridin-4-ilossi)-3,6,9-triossaundecano (anche chiamato L2EO4) ed il copolimero a due blocchi poli(N-metil-2-vinil-piridinio ioduro)-bpoli(etileneossido) (anche chiamato P2MVP41-b-PEO205). Le micelle così ottenute hanno mostrato un rilassamento magnetico dello stesso ordine osservato in altri sistemi micellari.
Ciononostante, la biocompatibilità dei coacervati e la loro abilità di incapsulare stabilmente agenti di contrasto evitando così il rischio di rilascio indesiderato all’interno del corpo continuano ad essere problemi cruciali per l’approvazione clinica di questa nuova generazione di sonde e radiotraccianti per le tecniche di diagnostica per immagini multimodali.
La presente descrizione risolve questo problema a lungo sentito fornendo un processo di coacervazione che combina la presenza di due agenti reticolanti con uno stretto controllo delle condizioni di coacervazione complessa di polimeri biocompatibili durante il passaggio di separazione di fase, portando così a coacervati stabili e biocompatibili incapsulanti agenti di contrasto multimodali.
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
La presente descrizione riguarda un processo di preparazione di nanoparticelle coacervate fatte di polimeri biocompatibili ed incapsulanti stabilmente un agente di contrasto per la diagnostica per immagini. La descrizione riguarda anche particelle coacervate fatte di polimeri biocompatibili caricati con almeno un agente di contrasto o un radiotracciante ed il loro uso in metodi di diagnostica per immagini in vivo.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La Figura 1 mostra il diagramma ternario sperimentale a temperatura ambiente per il sistema acqua-acido acetico-chitosano.
La Figura 2 è uno schema dei passaggi di coacervazione coinvolti in questo processo
La Figura 3 mostra un grafico del profilo di demiscelamento della reazione a differenti gradienti di temperatura.
La Figura 4 mostra in (A) e (B) nanoparticelle stabili raccolte in etanolo ed in (C) nanoparticelle instabili caricate con Gd-acido dietilentriamminopentaacetico (Gd-DTPA) in acqua.
La Figura 5 mostra immagini TEM delle nanoparticelle prodotte secondo l’esempio 1.
La Figura 6 mostra un’immagine SEM di nanoparticelle prodotte secondo l’esempio 1, caricate con Gd-DTPA e dopo l’assorbimento con un volume di Fluorodeossiglucosio (FDG) a 0,014 mg/mL.
La Figura 7 è uno spettro FT-IR registrato sui coacervati ottenuti secondo l’esempio 1.
La Figura 8 è un grafico che riporta le proprietà relassometriche come funzione della concentrazione dell’agente di contrasto (Gd-DTPA).
La Figura 9 mostra un’immagine al microscopio a fluorescenza delle nanoparticelle coniugate con Fluoresceina isotiocianato (FITC) (488nm) e intrappolanti Gd-DTPA. Nell’immagine, è possibile notare la differenza tra un nucleo ed un guscio (bianco in figura).
La Figura 10 mostra un’immagine a microscopia a fluorescenza delle nanoparticelle in cui Gd-DTPA e colorante cianino 5 (Cy5) (633nm) sono entrambi incapsulati nelle nanoparticelle.
La Figura 11 mostra un’immagine delle nanoparticelle prodotte secondo l’esempio 10.
La Figura 12 mostra un’illustrazione schematica qualitativa di una finestra diagnostica migliorata ottenibile utilizzando le nanoparticelle coacervate incapsulanti un agente di contrasto dell’invenzione. Le nanoparticelle coacervate dell’invenzione permettono di superare i limiti legati all’uso di agenti di contrasto commerciali come ad esempio basso rilassamento, limitato tempo di acquisizione e ridotta specificità del tessuto.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Per l’estensione della presente descrizione, i seguenti termini sono da intendersi con il significato qui specificato:
“polimero polielettrolita” è un polimero in cui una sostanziale porzione delle unità costituenti possiede gruppi ionizzabili o ionici, o entrambi.
La parola “biocompatibile” riferito ad un materiale, significa che detto materiale non ha effetti tossici o nocivi sulle funzioni biologiche.
“Agente di contrasto” o “mezzo di contrasto” è una sostanza usata per aumentare il contrasto delle strutture o fluidi all’interno del corpo in diverse tecniche di diagnostica per immagini mediche.
“Radiotracciante” è un composto chimico in cui uno o più atomi sono stati rimpiazzati da un radioisotopo quindi in virtù del suo decadimento radioattivo possono essere usati nella diagnostica per immagini per esplorare il meccanismo delle reazioni chimiche all’interno del corpo vivente tracciando il percorso che il radioisotopo segue dai reagenti ai prodotti.
“tracciante ottico” è una molecola non tossica che può essere visualizzata utilizzando luce visibile, ultravioletta e infrarossa.
“coacervato” o “nanoparticella coacervata” significa una particella ottenuta attraverso separazione di fase liquido-liquido guidata elettrostaticamente. “RM” è l’acronimo di risonanza magnetica per immagini.
“PET” è l’acronimo di tomografia ad emissione di positroni.
“Diagnostica per immagini ottica” si riferisce a varie tecniche di diagnostica per immagini che usano luce visibile, ultravioletta e infrarossa. Esempi di diagnostica per immagini ottica in medicina sono la tomografia ottica a coerenza di fase, la spettroscopia, la microscopia a fluorescenza.
In un primo aspetto la presente descrizione riguarda un processo per la preparazione di coacervati caricati comprendente i seguenti passaggi: a) Fornire un’emulsione acqua in olio di un polimero polielettrolita biocompatibile;
b) Fornire una soluzione acquosa di un polimero polielettrolita biocompatibile avente cariche opposte rispetto al polielettrolita del passaggio a);
c) Aggiungere due agenti reticolanti, uno all’emulsione e l’altro alla soluzione acquosa;
d) Aggiungere un agente di contrasto per diagnostica per immagini all’emulsione e/o alla soluzione;
e) Aggiungere la soluzione acquosa all’emulsione ad una temperatura costante compresa tra 19 e 37 °C e ad un pH compreso tra 3 e 7, ottenendo così la separazione di particelle coacervate.
f) Opzionalmente aggiungere un ulteriore tracciante ottico, radiotracciante o agente di contrasto per diagnostica per immagini alle particelle coacervate ottenute nel passaggio e).
Nel passaggio a) un’emulsione acqua in olio (a/o) è preparata dissolvendo inizialmente un polimero polielettrolita biocompatibile, avente una concentrazione variante da 0,1% a 1 % p/v, in una soluzione acquosa e poi mischiando la soluzione ottenuta con una fase oleosa. Detta fase oleosa è ottenuta dissolvendo un tensioattivo, come ad esempio Span 80, Span 20, CTAB, SDS, Tween 20, Tween 80, Brij93 e polossameri, in un olio come ad esempio olio minerale, olio siliconico, olio di paraffina clorurato, olio di semi di cotone, olio vegetale, olio animale, olio di trigliceridi, una loro combinazione e prodotti simili, e omogeneizzando l’intera miscela. In una forma di realizzazione preferita detto polimero polielettrolita biocompatibile è scelto nel gruppo costituito da poli(L-lisina), chitosano, albumina serica bovina (BSA), albumina serica umana, acido poli lattico-co-glicolico (PLGA), acido poli lattico-co-glicolico (PLGA)-polietilene glicole (PLGA-PEG) di e tri-blocco, acido polilattico (PLA) e acido polilattico-polietilene glicole (PLA-PEG) tri e di diblocco, derivati della cellulosa come ad esempio chitosano-carbossimetil cellulosa (CMC), n-alginato, idrossipropilmetil cellulosa (HPMC), derivati del destrano come ad esempio poli(N-isopropilacrilamide) (PNIPAAm) e poli(N-vinilcaprolattame)-idrossietilmetacrilato (PVCL-HEMA) innestati sulla catena del destrano, destrano metacrilato (dex-MA) e destrano idrossietilmetacrilato (dex-HEMA), destrano glicidil metacrilato (dex-GMA), poli(vinilbenzil trialchil ammonio), poli(4-vinil-N-alchil-piridinio), poli(acriloilossialchil-trialchil ammonio), poli (acriamidoalchil-traiclhil ammonio), poli(diallildimetil-amonio), poli(N-isopropilacrilammide) (PNIPAAm), poli-(idrossietilmetacrilato) poly(HEMA) e copolimero acido maleico/diallilammina. In un’ulteriore forma di realizzazione preferita, il primo polimero polielettrolita biocompatibile è chitosano o albumina serica bovina (BSA).
Nel passaggio b) una soluzione acquosa di un secondo polielettrolita biocompatibile avente cariche opposte rispetto al polielettrolita del passaggio a) è preparato in un intervallo di concentrazione compreso tra 0,01 e 1 % p/v.
In una forma di realizzazione preferita detto secondo polimero polielettrolita biocompatibile è scelto dal gruppo costituito da acido ialuronico, acido poli(L-glutammico), carragenina, alginati, pectina, chitina, derivati della cellulosa, derivati dell’amido, derivati del destrano, acido poli(stirensulfonico), acido poli(vinilsulfonico), acido poli(acrilico o metacrilico), acido poli(itaconico), copolimero acido maleico/diallilammina e chitosano. In un ulteriore forma di realizzazione preferita, il primo polimero polielettrolita biocompatibile è acido ialuronico o chitosano.
Nel passaggio c) un agente reticolante in un intervallo di concentrazione tra 5 e 60 % v/v è aggiunto all’emulsione ed un altro agente reticolante è aggiunto alla soluzione. In una forma di realizzazione preferita, l’gente reticolante è un agente reticolante biocompatibile.
Preferibilmente, divinil sulfone (DVS) è usato come primo agente reticolante e tripolifosfato (TPP) come secondo. La persona esperta del ramo riconoscerebbe agenti reticolanti biocompatibili adatti per l’emulsione o la soluzione, sulla base delle compatibilità chimiche note, senza sperimentazione eccessiva.
Nel passaggio d), l’agente di contrasto può essere aggiunto all’emulsione e/o alla soluzione sulla base della compatibilità chimica con le sostanze impiegate fino a questo passaggio. Agenti di contrasto adatti allo scopo sono scelti dal gruppo costituito da Gd-dietilentriamminopentaacetato (Gd-DTPA), gadolinio-acido dietilentriamminopentaacetico (Gd-DOTA), Gadoreato, Gadodiammide, Gadobenato, Gadoteridol, Gadofosveset e Gadoversetammide, Fluoro-19.
In una forma di realizzazione preferita, l’agente di contrasto per RM è Gd-DTPA o Gd-DOTA o Fluoro-19.
Il passaggio e) è eseguito a valori di pH e temperatura strettamente controllati, rispettivamente mantenuti nell’intervallo di 3 e 7 e 19°C e 37°C. Dopo l’aggiunta della fase soluzione all’emulsione, la coacervazione inizia non appena le molecole di polielettrolita della soluzione raggiungono la superficie delle gocce contenute nell’emulsione. La reazione è mantenuta sotto agitazione ad una temperatura costante selezionata finché avviene spontaneamente una separazione di fase. Preferibilmente:
- se il processo è eseguito ad un valore di temperatura costante compreso nell’intervallo da 19 a 27 °C, la coacervazione continuerà alla stessa temperatura isoterma finché avviene una coacervazione completa;
- altrimenti, se il processo è eseguito ad una temperatura più alta, cioè sopra i 27 °C (ad esempio a 35°C), non appena inizia la coacervazione la soluzione è rapidamente raffreddata ad una temperatura compresa tra 19 e 25 °C. In una forma di realizzazione preferita, la temperatura di 23 °C è usata per eseguire una coacervazione isoterma, mentre se il processo è eseguito a 35 °C allora la soluzione è rapidamente raffreddata a 25 °C ad una velocità di circa 5°C/h
Infine, i nanocoacervati così ottenuti sono preferibilmente dializzati ed ultracentrifugati.
Il passaggio f) permette di aggiungere altri agenti di contrasto alle particelle coacervate ottenute nel passaggio e), come ad esempio i fluorofori per diagnostica per immagini ottica e/o sostanze radiofarmaceutiche per PET o scintigrafia, in aggiunta ad agenti di contrasto per RM incapsulati nel passaggio d). Il passaggio f) viene eseguito attraverso comuni tecniche di aggiunta come ad esempio assorbimento, adsorbimento, evaporazione del solvente, spostamento del solvente, liofilizzazione, tecniche con diossido di carbonio supercritico, separazione di fase, miscelamento. Il prodotto finale così ottenuto particelle coacervate caricate con diversi agenti di contrasto per diagnostica per immagini multimodale. Radiotraccianti adatti per la PET sono per esempio fluorodeossiglucosio (FDG) e tecnezio radioattivo (Tc99m-MAA). Agenti di contrasto adatti per diagnostica per immagini ottica, sono per esempio verde indocianino (ICG) ed altri traccianti ottici commercialmente disponibili come ad esempio nt(BLZ-100), CLR1501, CLR1502, OTL38, cRGD-ZW800-1, YC-27, PSMA-1-IR8000, fluorocoxib A, BMW109, LUM105, MMP-2 sensibile sonda NIRF, Z-Phe-Arg-HRMG, sonda lipidata 3, 6QCNIR, RACPP, AVB-620 e C-SNAF. Preferibilmente l’agente di contrasto per diagnostica per immagini ottica è il verde indocianino.
In una forma di realizzazione preferita, la capacità di diagnostica per immagini trimodale è ottenuta attraverso: Gd-DTPA agente di contrasto per RM, fluorodeossiglucosio (FDG) radiotracciante per PET e verde indocianino per diagnostica per immagini ottica. Tutti questi composti sono impiegati senza alcuna modifica chimica, perciò preservano la formulazione approvata FDA.
Il processo sopra descritto e, in particolare lo stretto controllo sulle condizioni di coacervazione nel passaggio e), permette una migliorata stabilità dei coacervati finali caricati ed una riduzione dell’intera durata del processo. Infatti gli inventori hanno trovato che, grazie al monitoraggio della temperatura, può essere raggiunta una riduzione del tempo di processo da 24 ore ad appena 6,5-7 ore. Inoltre, questo processo può essere facilmente ottimizzato e portato su grande scala fino ad un processo industriale a basso costo, grazie alla disponibilità di tecnologie di monitoraggio industriale per parametri quali la concentrazione dei due polimeri, la percentuale di tensioattivi, il pH, la temperatura e la durata dei differenti passaggi del processo.
In un ulteriore aspetto, la presente descrizione riguarda particelle coacervate nucleo-guscio incapsulanti stabilmente un agente di contrasto e opzionalmente includenti almeno un altro agente di contrasto (ad esempio una molecola radiotracciante o fluorofora) per diagnostica medica per immagini. In una forma di realizzazione preferita, le particelle coacervate della presente descrizione incapsulano un agente di contrasto RM, una molecola fluorofora ed un radiotracciante. Preferibilmente detto agente di contrasto RM è Gd-DTPA, detto agente fluoroforo è un colorante cianino o fluoresceina isotiocianato (ICG) e detto radiotracciante è fluorodeossiglucosio (FDG).
Le particelle coacervate della presente descrizione preferibilmente hanno una dimensione compresa tra 40 e 500 nm, ancor più preferibilmente tra 40 e 70 nm.
Le particelle coacervate qui descritte, ottenute attraverso il passaggio di raffreddamento, sono estremamente stabili in acqua e non mostrano il comportamento di rigonfiamento tipico dei coacervati dell’arte nota, come si può vedere dall’esempio comparativo 5 di questa descrizione dettagliata, anche a diversi valori di pH, come mostrato nell’esempio 11. Al contrario, le nanoparticelle ottenute a temperatura isoterma variabile tra 22 e 27°C mostrano un comportamento sensibile al pH a pH 4-4,5.
Questo comportamento caratteristico rispetto al pH potrebbe fornire significativi progressi nell’uso delle nanoparticelle coacervate descritte come vettori per la diagnosi e trattamento delle patologie tumorali, per esempio nel campo emergente delle particelle teranostiche. Infatti, l’ambiente tumorale, oltre ad essere carente di ossigeno, è anche caratterizzato da un pH acido e da un’abilità di drenaggio del sistema linfatico compromessa. Quindi il comportamento rispetto al pH di qualsiasi vettore è un parametro chiave per prevedere il suo comportamento nel microambiente tumorale e, perciò, per raggiungere una migliore diagnosi e/o terapia.
Inoltre, le particelle coacervate qui descritte mostrano un rilassamento medio in RM aumentato, fino a 8 volte più alto del Gd-DTPA commerciale (4mM sec<-1>), come mostrato in Figura 8. Questo è principalmente dovuto al complesso equilibrio formato nelle particelle coacervate dagli allungamenti delle catene polimeriche, pressione osmotica dell’acqua e grado di idratazione in grado di sostenere il rilassamento (dati non mostrati). Da un punto di visto teorico, detto complesso equilibrio può essere riassunto in un nuovo concetto chiamato dai presenti inventori “idrodenticità”, il quale può essere applicato non solo a particelle coacervate, ma anche ad altri tipi di materiali, come ad esempio idrogeli, film polimerici, ecc. In particolare, gli attuali inventori hanno trovato che l’idrodenticità permette la formazione di compartimenti di acqua contenenti l’agente di contrasto incapsulato. Il compartimento di acqua è responsabile del miglioramento della prestazione in diagnostica per immagini delle nanoparticelle dell’invenzione.
La modulazione dell’idrodenticità attraverso: (i) l’allungamento elastico delle maglie del polimero (ii) pressione osmotica e (iii) stato di idratazione dell’agente di contrasto (ad esempio Gd-DTPA) permette di ottenere nanoparticelle personalizzate per ogni patologia da diagnosticare. Come risultato, è possibile identificare una finestra diagnostica personalizzata per ogni patologia (mostrato per esempio in Figura 12) definendo un intervallo di proprietà ottimali della matrice polimerica e degli agenti di contrasto. Tale finestra diagnostica personalizzata migliora l’efficacia nel trattamento di una particolare malattia, evitando così effetti tossici, ed aumentando la prestazione delle acquisizioni RM.
In aggiunta, è degno di nota che i coacervati aventi dimensione minore di 70 nm, ottenibili attraverso il processo qui descritto, possono anche essere impiegati per il rilascio controllato di agenti di contrasto al cervello.
Infine, in un ulteriore aspetto, la presente descrizione riguarda l’uso delle particelle coacervate sopra descritte come sonda per diagnostica per immagini multimodale. Le particelle coacervate potrebbero vantaggiosamente essere utilizzati in diagnostica per immagini con acquisizione simultanea PET/RM, preservando la ridotta tossicità, aumentando la specificità del tessuto e sensibilità più alta. Preferibilmente, le particelle coacervate della presente descrizione sono usate, dopo caricamento con gli agenti di contrasto appropriati, come singola sonda per diagnostica per immagini trimodale, in particolare combinando diagnostica per immagini RM, PET e fluorescenza simultanee.
ESEMPI
Eempio 1: sintesi di coacervati acido ialuronico-chitosano
I diversi materiali che sono usati per la produzione di nanoparticelle sono: chitosano (CHS) a basso peso molecolare; divinil sulfone (DVS) 118,15 g/mol; sodio tripolifosfato (TPP) 367,87 g/mol; acido acetico glaciale peso molecolare 60,05; etanolo (EtOH) peso molecolare 46,07, Gd-DTPA peso molecolare 547,57; olio minerale 0,84 g/mL a 25 °C (lett.) sono acquistate da Sigma-Aldrich<®>mentre acido ialuronico (HA) 850 kDa grado parenterale è da Hyasis<®>. Acqua MilliQ è utilizzata per tutti gli esperimenti. Inizialmente, il chitosano è solubilizzato in una soluzione acquosa in condizioni acide. Una soluzione acquosa di chitosano e acido acetico (10-400 µL) è stata ottenuto miscelando 5 mL di acqua MilliQ ad una concentrazione di chitosano del 1% p/v. La concentrazione di acido acetico è aggiustata da 1,39 M a 0,034 M per equilibrare l’aggiunta di Gd-DTPA ad una concentrazione di 1,8 µM. Successivamente, il volume di acido acetico è aggiunto per equilibrare la natura acida del Gd-DTPA per ristabilire le condizioni di pH tra 4,5 e 5. La fase oleosa è ottenuta dissolvendo il tensioattivo Span 80 (0,5-1% p/v) in 45 mL di olio minerale ed omogeneizzando per 5 minuti a 7000 rpm.
La soluzione secondaria (fase coacervante), composta da 0,1 % p/v di acido ialuronico in una soluzione acquosa di 3 mL al 30% TPP (pH 10-11), è aggiunta goccia a goccia all’emulsione primaria a/o preparata ed omogeneizzata a 7000 rpm per 30 min, controllando i valori di pH e temperatura rispettivamente a 4,5 e 35°C. La reazione è mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente finché non si verifica spontaneamente una separazione di fase. La dispersione finale è stata omogeneizzata a 7000 rpm per altri 30 min, mantenendo la temperatura ad un valore costante di 35 °C. Successivamente, quando si verifica la coacervazione, un passaggio di raffreddamento è eseguito da 35 °C a 25 °C a circa 5-10 °C/h. Dopodiché, 200 µL della soluzione finale sono raccolti e diluiti in 50 ml di EtOH, poi filtrati attraverso una membrana filtro ISOPORE di 100 nm e ultracentrifugati per 10 min a 15000 rpm e 4°C. Successivamente le nanoparticelle sono state concentrate fino a 10 mg/mL ed è eseguito l’adsorbimento di glucosio (simulante FDG).100 microlitri di una soluzione a 0,014 mg/mL di glucosio è aggiunta alle nanoparticelle. I composti sono mantenuti sotto agitazione per 10 minuti e poi ultrafiltrati per rimuovere l’eccesso di fase di glucosio. L’adsorbimento di glucosio è 61% della concentrazione iniziale.
La stessa procedura può essere applicata senza effettuare un passaggio di raffreddamento ma in condizioni isoterme, preferibilmente a 23 °C.
Esempio 2: sintesi di coacervati chitosano-albumina serica bovina Una soluzione acquosa di 0,3 % p/v di albumina bovina serica (BSA) è stata preparata in una soluzione acquosa di 3 mL a pH 5-6 ed è stata aggiunta una quantità di 1,8 mM di Gd-DTPA. La fase oleosa è stata ottenuta dissolvendo il tensioattivo Span 80 (0,5-1% p/v) in 45 mL di olio minerale ed omogeneizzando per 5 minuti a 7000 rpm. L’emulsione primaria così ottenuta è stata trattata per 20 minuti a 7000 rpm.
La soluzione secondaria (fase coacervante) di chitosano 0,1% p/v è preparata in una soluzione acida acquosa di 3 mL a pH 5-6. La concentrazione di acido acetico è aggiustata da 1,39 M a 0,034M.
Poi, la soluzione secondaria, contenente chitosano come polimero coacervato, è aggiunta goccia a goccia nell’emulsione primaria acqua in olio precedentemente preparata ed omogeneizzata a 7000 rpm per 30 minuti, mantenendo il pH a valori costanti di 5-6. La reazione è mantenuta sotto agitazione per l’intera notte a 300 rpm a temperatura ambiente. La dispersione finale è omogeneizzata a 7000 rpm per altri 30 minuti, mantenendo il sistema a temperatura ambiente costante.
Esempio 3: Valutazione del diagramma di stato ternario a temperatura ambiente.
La valutazione sperimentale del diagramma di stato ternario è stata fatta variando la composizione dei 3 composti dell’esempio 1 a temperatura ambiente ed analizzando il comportamento della miscela finale. I dati sperimentali sono ottenuti da una soluzione ottenuta mischiando 1 mL di ciascuno dei 3 composti. È stato trovato che, aggiungendo l’acido acetico goccia a goccia, la lacuna tra chitosano e acqua diminuisce, permettendo così la completa dissoluzione del polimero nella soluzione acetica. I punti di lavoro triangolari rappresentano le concentrazioni alle quali il polimero non è dissolto nella soluzione (precipitazione), mentre i punti di lavoro circolari rappresentano la completa dissoluzione del polimero. La linea che disegna la lacuna di miscibilità rappresenta una linea di transizione tra due differenti comportamenti. La saturazione del sistema a 1% p/v di chitosano è 2µL/mL di soluzione di acido acetico.
Esempio 4: ottimizzazione del processo
Come riassunto nello schema di Figura 2, i principali passaggi del processo di coacervazione alla luce del diagramma ternario, sono i seguenti:
I. Dopo la preparazione dell’emulsione a/o, il punto di lavoro è collocato al di fuori della lacuna di miscibilità che esiste tra acqua e chitosano. Perciò, c’è ancora completa dissoluzione del polimero nella soluzione di acido acetico;
II. La fase di coacervazione è aggiunta all’emulsione primaria, promuovendo la diluizione della fase acquosa; in questa condizione la concentrazione della soluzione di acido acetico diminuisce a 1,2 µL/mL andando così al di sotto del limite di saturazione. Nello stesso tempo, mantenendo costante la temperatura, l’acido acetico continua ad evaporare inducendo lo spostamento del punto di lavoro all’interno della lacuna di miscibilità. Quest’ultimo passaggio porterà alla formazione di una struttura modello di chitosano e alla coacervazione dell’acido ialuronico su di esso;
III. Nell’ultima fase, le diverse condizioni isoterme sono valutate al fine di incrementare il passaggio di coacervazione e promuovere la stabilità dell’architettura della nanoparticella.
Gli inventori hanno trovato che, grazie al monitoraggio della temperatura, si è raggiunta una riduzione da 24 h a 6,5-7 h del tempo di durata del processo.
La variazione della temperatura che è usata per accelerare il processo è un’isoterma a 35°C per 5,5 h ed una rampa da 35°C a 23°C per 1,5 h (8°C/h) (riportato in figura 3). Dopo il passaggio isotermo, si verifica la reazione di coacervazione e si osserva un demiscelamento della soluzione preparata. Dopo la fase di demiscelamento, una variazione repentina della temperatura dovrebbe essere eseguita per evitare i fenomeni di aggregazione e la distruzione dei nanovettori. Infatti, non appena si verifica il demiscelamento della fase, le nanoparticelle prodotte diventano instabili ed un ulteriore calo in temperatura è necessario per aumentare la stabilità del sistema.
Esempio 5: esempio comparativo
Qui sono riportate le nanoparticelle ottenute secondo un processo di coacervazione tradizionale (le condizioni di coacervazione impiegate sono 0,1% p/v di HA, 1% p/v di chitosano, 30% TPP p/v e Gd-DTPA/chitosano in rapporto 1:1) mostrando come la presenza di Gd-DTPA porta a nanoparticelle instabili in acqua, caratterizzate da un comportamento di rigonfiamento.
In figura 4(A) è mostrato come le nanoparticelle prodotte secondo lo stesso metodo di coacervazione sono stabili in acqua in assenza di Gd-DTPA e sono instabili in presenza di Gd-DTPA aggiunto alla soluzione. I risultati mostrano chiaramente che Gd-DTPA aggiunto alla soluzione compromette la stabilità e la morfologia delle particelle ottenute secondo il processo di coacervazione con un solo agente reticolante. La Figura 4 (A) e (B) sono nanoparticelle raccolte in etanolo e mostrano come il processo di coacervazione si verifica regolarmente anche in presenza di Gd. La Figura (C) mostra l’instabilità delle nanoparticelle quando sono dissolte in acqua e ottenute in presenza di Gd-DTPA, il quale interferisce con il reticolante.
Esempio 6: caratterizzazione TEM
Un microscopio elettronico in trasmissione (TEM) della FEI<®>nelle modalità DRY, CRYO e tomografia (TOMO) sono state eseguite. In modalità DRY i campioni sono preparati usando Formvar/Carbon 200 mesh Cu Agar<®>depositando 20 µL delle nanoparticelle sospese. In modalità CRYO i campioni sono preparati usando VITROBOT FEI<®>ricoprendo Lacey Carbon film 200 mesh Cu Agar<®>con 3 µL di sospensione di nanoparticelle. I parametri di vetrificazione eseguita da VITROBOT sono: tempo di asciugatura di 1s, umidità maggiore del 70% e temperatura 20°C. Dalle immagini ottenute, si può osservare una tipica morfologia nucleo-guscio. I risultati sono mostrati in Figura 5, in cui sono riportate le immagini TEM delle nanoparticelle prodotte secondo il processo qui descritto all’1% p/v di chitosano, 0,1 % p/v di acido ialuronico e a temperatura ambiente.
Esempio 7: caratterizzazione SEM
Un microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo (FE-SEM) della Zeiss<®>è stato usato per studiare le nanoparticelle caricate con Gd-DTPA incapsulato e assorbite FDG. La ricopertura “sputter” dei campioni è stata fatta con 7 nm di Au o PtPd. Le misure di spettrometria di massa (MS) sono fatte su eluato dopo un passaggio di purificazione delle nanoparticelle. I risultati mostrano un assorbimento di circa il 50% del FDG dopo un contatto di 10 min con le nanoparticelle. La Figura 6 mostra le nanoparticelle con Gd-DTPA dopo l’assorbimento con un volume di FDG a 0,014 mg/mL e può essere visto come la morfologia delle particelle non è stata compromessa dalla procedura di assorbimento.
Esempio 8: studio FT-IR
Al fine di studiare la formazione del legame tra chitosano, TPP e acido ialuronico nel processo di formazione delle nanoparticelle dell’esempio 1, sono stati eseguiti studi con FT-IR. La spettroscopia IR Thermo<®>è stata usata e l’analisi IR è stata eseguita attraverso misure su campioni grezzi polverizzati di chitosano, acido ialuronico e TPP mentre i campioni trattati sono analizzati per deposizione di 150 µL di sospensione di nanoparticelle su silicio. Lo studio IR ha provato la formazione di reticolazione interpolimero e intrapolimero, confermando così l’ipotesi che il TPP lega chitosano e acido ialuronico (cioè il nucleo ed il guscio del coacervato), mentre DVS lega le catene di acido ialuronico ed è responsabile per stabilizzare il nucleo del coacervato.
Nell’interpretazione dello spettro IR, una banda a 3450 cm<-1>può essere attribuita all’allungamento dei gruppi –NH2e –OH nel chitosano puro. Nello spettro IR dei coacervati ottenuti (si veda figura 7), questi segnali non sono presenti, provando così che i gruppi considerati del chitosano hanno reagito.
Le due bande a 1658,64 cm<-1>e 1730,91 cm<-1>sono assegnate all’allungamento del C=O dell’acido ialuronico.
Il picco P=O (assorbimento di vibrazione) a 1269 cm<-1>indica la reazione tra chitosano e tripolifosfato. I picchi a 2953,42 cm<-1>, 2922,48 cm<-1>e 283,39cm<-1>mostrano le interazioni dei gruppi –CH.
Considerando i segnali del DVS, si può osservare un picco 1119,76 cm<-1>(vibrazioni di allungamento simmetrico di S=O). Dopo la reazione DVS-acido ialuronico compaiono i due picchi a 720,99 cm<-1>(vibrazioni di allungamento di S-C) e 1269 cm<-1>del legame etereo (vibrazioni dell’allungamento C−O−C).
Esempio 9: proprietà rilassometriche
Le proprietà rilassometriche sono studiate da Minispec 60mq BRUKER<®>attraverso la valutazione dei tempi di rilassamento T1 e T2. Gli esperimenti di Minispec 60mq sono fatti con tubo di vetro su 300 µL di sospensione di nanoparticelle. Il decadimento libero dell’induzione (FID) è usato per valutare il miglior valore dell’aumento per controllare la saturazione del segnale e misurare T2*; sequenze “Saturation Receovery” (SR) e Inversion Recovery (IR) sono usate per misurare T1 invece della sequenza Carr Purcell (CPC) per valutare T2. Le concentrazioni di Gd-DTPA in diverse nanostrutture sono valutate con ICP-MS Agilent<®>per ottenere informazioni sulla capacità di caricamento delle nanocapsule prodotte.
Il metodo di spettrometria di massa (Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS) è dedicato all’analisi di FDG. La fase mobile del sistema di eluizione è scelta come acetonitrile (solvente A) e acqua (solvente B), con una velocità di flusso di 10 µL/min ed un volume di iniezione di 10µL. La colonna usata è PLRP-S 100A 3µm 50X45MM.
Le concentrazioni di Gd-DTPA nelle diverse nanostrutture sono valutate con ICP-MS Agilent<®>. Combinando questi dati e le misure dei tempi di rilassamento è possibile stabilire se il metodo di produzione ha portato al caricamento dell’agente di contrasto (Gd-DTPA) ma anche ad un aumento del segnale dovuto all’interazione del mezzo di contrasto incapsulato con l’acqua esterna del vettore. I risultati mostrano un aumento di 12 volte del segnale RM T1. I risultati ottenuti sono riportati in Figura 12.
Esempio 10: Diagnostica per immagini in fluorescenza
Le particelle ottenute incapsulando un agente di contrasto RM (Gd-DTPA) e diversi agenti fluorescenti sono state osservate sotto microscopio a fluorescenza (esaurimento dell’emissione stimolata STED). Prima del test, colorante cianino 5 (Cy5) (633nm) è stato incapsulato nelle nanoparticelle. Questo colorante è stato anche utile per la diagnostica per immagini ottica (tomografia molecolare in fluorescenza, FMT) della Perkin Elmer.
In un caso (figura 9) l’immagine mostrava il guscio come parte fluorescente mentre in figura 10 le nanoparticelle intere appaiono fluorescenti e non c’è apparentemente una differenza tra i due polimeri.
Esempio 11
Risultati preliminari su nanoparticelle ibride nucleo-guscio (HyCos) riportano un peculiare interessante comportamento dei nanovettori sensibili al pH. In dettaglio, per HyCos nanocoacervati prodotti a 35°C per 5,5 h e seguiti da una rampa da 35°C a 23°C per 1,5h (8°C/h), a pH 4, mantengono la loro stabilità fino alla prima ora, ma dopo questo tempo dissolvono completamente. Al contrario, a pH 7 preservano la loro stabilità a tutti i diversi tempi (30 min, 1h, 2h, 3h, 6h, 8h, 12h, 24h). Le nanoparticelle coacervate ottenute attraverso il processo qui descritto non sembrano essere sensibili al pH e rimangono stabili ad ogni condizione di pH fino a 24 ore. Al contrario, la coacervazione avvenuta a temperatura ambiente produce nanoparticelle che sono sensibili al pH che sembrano essere stabili a pH 7 per più di 24 ore mentre a pH 4 dissolvono completamente.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1.Un processo per la preparazione di particelle coacervate comprendente i seguenti passaggi: a) Fornire un’emulsione acqua in olio di un polimero polielettrolita biocompatibile; b) Fornire una soluzione acquosa di un polimero polielettrolita biocompatibile avente cariche opposte rispetto al polielettrolita del passaggio a); c) Aggiungere due agenti reticolanti, uno all’emulsione e l’altro alla soluzione acquosa; d) Aggiungere un agente di contrasto per diagnostica per immagini medicale all’emulsione o alla soluzione acquosa; e) Aggiungere la soluzione acquosa all’emulsione a temperatura costante compresa tra 19 e 37 °C e ad un pH compreso tra 3 e 7, ottenendo così la separazione delle nanoparticelle coacervate; f) Opzionalmente, aggiungere un ulteriore agente di contrasto, un tracciante ottico o un radiotracciante per diagnostica per immagini medica alle particelle coacervate ottenute nel passaggio e).
  2. 2. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui se il passaggio e) è eseguito ad un valore di temperatura costante compreso nell’intervallo tra 19 e 27 °C, la coacervazione continuerà alla stessa temperatura isoterma fino al verificarsi della completa coacervazione.
  3. 3. Un processo secondo la rivendicazione 1, in cui se il passaggio e) è eseguito al di sopra di 27°C non appena la coacervazione inizia la soluzione è rapidamente raffreddata ad una temperatura compresa tra 19 e 25 °C.
  4. 4. Un processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui il polimero polielettrolita biocompatibile del passaggio a) è scelto dal gruppo costituito da poli(L-lisina), chitosano, albumina serica bovina (BSA), derivati della cellulosa, derivati dell’amido, derivati del destrano, poli(vinilbenzil trialchil ammonio), poli(4-vinil-N-alchil-piridinio), poli(acriloil ossialchiltralchil ammonio), poli(acriammidoalchil-trialchil ammonio), poli(diallimetil-ammonio) e copolimero acido maleico/diallil ammina
  5. 5. Un processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui il polimero polielettrolita biocompatibile del passaggio b) è scelto dal gruppo costituito da acido ialuronico, acido poli(L-glutammico), carragenina, alginati, pectina, derivati della cellulosa, derivati dell’amido, derivati del destrano, acido poli(stirensulfonico), acido poli(vinilsulfonico), acido poli(acrilico o metacrilico), acido poli(itaconico), copolimero acido maleico/diallil ammina e chitosano.
  6. 6. Un processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il polimero polielettrolita biocompatibile del passaggio a) è chitosano, acido poli lattico-co-glicolico (PLGA) o albumina serica bovina.
  7. 7. Un processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il polimero polielettrolita biocompatibile del passaggio b) è acido ialuronico, chitosano o acido poli lattico-co-glicolico (PLGA).
  8. 8. Un processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il polimero polielettrolita biocompatibile del passaggio a) è chitosano ed il polimero polielettrolita biocompatibile del passaggio b) è acido ialuronico.
  9. 9. Un processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la temperatura costante ed il pH del passaggio e) sono rispettivamente compresi tra 22°C e 27°C e 3 e 7.
  10. 10. Particelle coacervate aventi una struttura nucleo-guscio ed incapsulanti almeno un agente di contrasto.
  11. 11. Particelle coacervate secondo la rivendicazione 10, aventi dimensione compresa tra 40 nm e 500 nm, preferibilmente tra 40 nm e 70nm.
  12. 12. Uso delle particelle coacervate secondo le rivendicazioni 8 o 9 come sonde per diagnostica per immagini medicale.
  13. 13. Particelle coacervate secondo le rivendicazioni 10 o 11, per uso nel trattamento teranostico del cancro.
IT102017000020707A 2017-02-23 2017-02-23 Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications IT201700020707A1 (it)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102017000020707A IT201700020707A1 (it) 2017-02-23 2017-02-23 Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications
PCT/IB2018/051087 WO2018154470A1 (en) 2017-02-23 2018-02-22 Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications
US16/487,896 US11311853B2 (en) 2017-02-23 2018-02-22 Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications
EP18708491.8A EP3585447A1 (en) 2017-02-23 2018-02-22 Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102017000020707A IT201700020707A1 (it) 2017-02-23 2017-02-23 Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications

Publications (1)

Publication Number Publication Date
IT201700020707A1 true IT201700020707A1 (it) 2018-08-23

Family

ID=59101619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
IT102017000020707A IT201700020707A1 (it) 2017-02-23 2017-02-23 Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11311853B2 (it)
EP (1) EP3585447A1 (it)
IT (1) IT201700020707A1 (it)
WO (1) WO2018154470A1 (it)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112261955A (zh) * 2018-05-18 2021-01-22 巴德外周血管股份有限公司 含有放射性同位素和其它标记物的微球及相关方法
IT202100002537A1 (it) 2021-02-05 2022-08-05 Kyme Nanoimaging Srl Processo microfluidico per la preparazione di nanostrutture liposomiche caricate con idrogel
IT202100006866A1 (it) 2021-03-22 2022-09-22 Kyme Nanoimaging Srl Un processo per la preparazione di nanostrutture di idrogel mediante gelificazione ionotropica in microfluidica

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9902652D0 (en) 1999-02-05 1999-03-31 Fermentech Med Ltd Process

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIRIDHARAN LOGHANATHAN MALARVIZHI ET AL: "A rationally designed photo-chemo core-shell nanomedicine for inhibiting the migration of metastatic breast cancer cells followed by photodynamic killing", NANOMEDICINE: NANOTECHNOLOGY, BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 10, no. 3, 1 April 2014 (2014-04-01), NL, pages 579 - 587, XP055417423, ISSN: 1549-9634, DOI: 10.1016/j.nano.2013.10.006 *
LI ZHANG ET AL: "Hyaluronic Acid-Chitosan Nanoparticles to Deliver Gd-DTPA for MR Cancer Imaging", NANOMATERIALS, vol. 5, no. 3, 20 August 2015 (2015-08-20), pages 1379 - 1396, XP055417234, DOI: 10.3390/nano5031379 *
MARIA RUSSO ET AL: "A Microfluidic Platform to design crosslinked Hyaluronic Acid Nanoparticles (cHANPs) for enhanced MRI", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6, no. 1, 30 November 2016 (2016-11-30), XP055417257, DOI: 10.1038/srep37906 *
THOMAS COURANT ET AL: "Imaging Agents Hydrogels Incorporating GdDOTA: Towards Highly Efficient Dual T 1 /T 2 MRI Contrast Agents", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, 2 August 2012 (2012-08-02), pages 9119 - 9122, XP055417244, Retrieved from the Internet <URL:http://onlinelibrary.wiley.com/store/10.1002/anie.201203190/asset/9119_ftp.pdf?v=1&t=j8ydnrui&s=8f4562c1accd86696cf076f6ad59b5a84f9d4369> [retrieved on 20171019] *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018154470A1 (en) 2018-08-30
EP3585447A1 (en) 2020-01-01
US11311853B2 (en) 2022-04-26
US20190381471A1 (en) 2019-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ren et al. Red blood cell membrane camouflaged magnetic nanoclusters for imaging-guided photothermal therapy
US10143658B2 (en) Multistage delivery of active agents
Yang et al. Dragon fruit-like biocage as an iron trapping nanoplatform for high efficiency targeted cancer multimodality imaging
Zhu et al. Surface modification of Gd nanoparticles with pH-responsive block copolymers for use as smart MRI contrast agents
CA2924018C (en) Cell-specific targeting using nanostructured delivery systems
KR101043407B1 (ko) 암 표적성이 우수한 단백질 복합체 및 이의 제조방법
US20110158901A1 (en) Chitosan-based nanoparticles and methods for making and using the same
US20100260686A1 (en) Nanoparticles for brain tumor imaging
US11311853B2 (en) Process for the preparation of double crosslinked core-shell polymeric nanoparticles for multimodal imaging and theranostic applications
Lee et al. Amphiphilic hyaluronic acid-based nanoparticles for tumor-specific optical/MR dual imaging
EP2922577B1 (en) Superparamagnetic iron oxide nanoparticles with ultra-thin polymer layers
AU2015205350B2 (en) Magnetic nanoparticles functionalized with cathecol, production and use thereof
US9504761B2 (en) Stabilized chitosan-based nanoparticles and methods for making the same
Song et al. GSH/pH dual-responsive and HA-targeting nano-carriers for effective drug delivery and controlled release
EP1945192A2 (de) Nanoskalige partikel als kontrastmittel für die kernspintomographie
Zhang et al. Gadolinium-hybridized mesoporous organosilica nanoparticles with high magnetic resonance imaging performance for targeted drug delivery
JP7390665B2 (ja) 選択的ビヒクルとしてのナノシステム
Chen et al. A dual-targeting nanocarrier based on modified chitosan micelles for tumor imaging and therapy
WO2020068806A1 (en) Armored cells
Wei et al. A tumor-associated bacteria-responsive magnetic exosome as a clearable T1 contrast agent for targeted imaging of tumors
Bigaj-Józefowska et al. Biomimetic theranostic nanoparticles for effective anticancer therapy and MRI imaging
Dahanayake et al. Paramagnetic Mn8Fe4-co-Polystyrene Nanobeads as a Potential T1–T2 Multimodal Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent with In Vivo Studies
Vitaliano et al. New clathrin-based nanoplatforms for magnetic resonance imaging
WO2010148395A1 (en) Paramagnetic porous polymersomes and uses thereof
WO2017093902A1 (en) A process for the preparation of nanoparticles for use as contrast agents in the magnetic resonance imaging