IT202100002537A1 - Processo microfluidico per la preparazione di nanostrutture liposomiche caricate con idrogel - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione dal titolo: Processo microfluidico per la preparazione di nanostrutture liposomiche caricate con idrogel
Stato dell'arte dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce al campo della chimica in quanto riguarda la produzione di nanoparticelle da utilizzare per scopi diagnostici e terapeutici. Pi? in particolare, la presente invenzione si riferisce ad un processo per la preparazione di nanoparticelle shell-core (guscio-nucleo) mediante tecniche microfluidiche, che possono intrappolare ingredienti attivi da utilizzare come agenti di contrasto per imaging multimodale e in terapia teranostica.
Arte nota
A. Porous Polymersomes with Encapsulated Gd-labeled Dendrimers as Highly Efficient MRI Contrast Agents. Adv. Funct. Mater. 19, 3753?3759 (2009) ha sintetizzato una piattaforma di contrasto MR composita, costituita da coniugati di dendrimeri incapsulati in polimersomi porosi. I polimersomi porosi, di ~130 nm di diametro, sono stati prodotti attraverso l'assemblaggio acquoso dei polimeri, polietilene ossido-b-polibutadiene (PBdEO) e polietilene ossido-b-policaprolattone (PEOCL). La successiva idrolisi del blocco caprolattone (CL) ha prodotto una membrana esterna altamente permeabile. Per evitare la fuoriuscita di un piccolo chelato di Gd attraverso i pori, Gd ? stato coniugato al dendrimero PAMAM tramite dianidride di acido dietilentriamminopentaacetico (dianidride DTPA) prima dell'incapsulamento. Le nanoparticelle ottenute mostrano una permeabilit? migliorata al flusso d'acqua e una grande capacit? di immagazzinare i chelati di Gd all'interno del lume acquoso, determinando una relassivit? longitudinale potenziata. Come risultato del tempo di correlazione rotazionale pi? lento dei dendrimeri marcati con Gd, della membrana esterna porosa della nanovescicola e dell'elevato carico utile di Gd, queste nanoparticelle funzionali hanno mostrato una relassivit? (R1) di 292, 109 mM?1s?1 per particella. ? stato inoltre riscontrato che i polimersomi mostrano una farmacocinetica unica con un'emivita di circolazione >3,5 ore e uno smaltimento prevalentemente renale. Quando iniettati in soggetti viventi, la destabilizzazione graduale dei polimersomi consente ai dendrimeri marcati con Gd di essere smaltiti prevalentemente dai reni, pur mantenendo un tempo di circolazione relativamente lungo >3,5 ore. Ci? potrebbe fornire un vantaggio importante rispetto ad altri CA per MRI a lunga circolazione, che generalmente richiedono il metabolismo del CA nel fegato e mostrano una ritenzione prolungata nel corpo. Inoltre, con il loro lavoro gli autori hanno anche mostrato un modo per impedire la fuoriuscita di Gd incapsulato attraverso i pori della membrana del nanocostrutto.
Novel Gd Nanoparticles Enhance Vascular Contrast for High-Resolution Magnetic Resonance Imaging. PLoS ONE 5, (2010) divulga la produzione di NP lipidiche contenenti fosfolipidi che esprimono Gd-chelato o DTPA incorporando DTPA-PE nel nucleo lipidico delle NP e quindi aggiungendo Gd3+ a NP preformate (per legame a Gd3+ come Gd-DTPA -PE chelato). Essi aggiungono anche una percentuale di 10 moli di lipide coniugato a mPEG-PE a nanoparticelle lipidiche per aumentare l'acqua legata sulla superficie delle nanoparticelle lipidiche, aumentando cos? il contrasto MRI. In questo caso, il seguente sistema di nanoparticelle mostra una relassivit? longitudinale maggiore (33 volte) rispetto alle attuali CA chelate con Gd approvate dalla FDA. Inoltre, la somministrazione endovenosa di questi Gd-LNP solo al 3% della dose clinica raccomandata di Gd produce rapporti segnalerumore MRI superiori a 300 volte in tutti i vasi vascolari.
Liao, Z. et al. Multifunctional Nanoparticles Composed of A Poly(dl-lactide-coglycolide) Core and A Paramagnetic Liposome Shell for Simultaneous Magnetic Resonance Imaging and Targeted Therapeutics. Adv. Funct. Mater. 21, 1179?1186 (2011) divulga un sistema di NP core-shell composto da un nucleo PLGA e un guscio liposomico paramagnetico per MRI simultanea e terapie mirate. Essi incapsulano Dox all'interno di NP di PLGA biocompatibili e approvate dalla FDA, e DTPA-Gd ? coniugato al chitosano modificato con lisina quaternizzata con ottadecile anfifilico (OQLCS). Il guscio paramagnetico del liposoma ? a base di OQLCS coniugato con Gd-DTPA (Gd-DTPA-OQLCS), OQLCS coniugato con folato (FA-OQLCS) e OQLCS PEGilato (PEG-OQLCS). In breve, i gruppi carbossilici di DTPA usati come agente chelante sono combinati con i gruppi amminici di OQLCS. Quindi Gd viene incorporato nel complesso. Di conseguenza, le NP mostrano propriet? paramagnetiche con un potenziamento di circa 3 volte nella relassivit? longitudinale (r1 = 14,381 mM?1s?1) rispetto al complesso Gd-DTPA commerciale ed effetti antitumorali eccezionali senza tossicit? sistemica.
Relaxometric investigations and MRI evaluation of a liposome-loaded pH-responsive gadolinium(III) complex. Inorg. Chem. 51, 7210?7217 (2012) riporta la preparazione di liposomi caricati con Gd-DO3Asa reattivi al pH che mantengono la reattivit? al pH del complesso paramagnetico non legato, e le loro relassivit? sono notevolmente influenzate dall'intensit? del campo magnetico, mostrando un brusco cambiamento nella relassivit? nell'intervallo di pH 5-7,5. Inoltre, essi forniscono un metodo raziometrico per la misurazione del pH basato su un confronto degli effetti di rilassamento a diversi campi magnetici, offrendo uno strumento alternativo per accedere alla misurazione del pH senza una preventiva conoscenza della concentrazione dell'agente paramagnetico.
A polymeric fastener can easily functionalize liposome surfaces with gadolinium for enhanced magnetic resonance imaging. ACS Nano 7, 9599?9610 (2013) divulga un processo per caricare Gd esclusivamente su una superficie liposomiale utilizzando un elemento di fissaggio polimerico. L'elemento di fissaggio, cos? chiamato per la sua capacit? di collegare fisicamente tra loro due componenti funzionali, era costituito da chitosano sostituito con acido dietilentriamminopentaacetico (DTPA) per chelare il gadolinio, nonch? da catene ottadeciliche per stabilizzare il chitosano modificato sulla superficie del liposoma. La strategia di assemblaggio, imitando i meccanismi attraverso i quali virus e proteine si ancorano naturalmente a una cellula, ha fornito una maggiore relassivit? T1 rispetto ai liposomi caricati con gadolinio sia nel lembo interno che in quello esterno. I liposomi sono stati preparati con un metodo di idratazione del film seguito da sonicazione. Il film lipidico, formato come descritto sopra, ? stato quindi idratato con la miscela acquosa di gadolinio e DTPA-chitosano-g-C18. Il processo proposto disaccoppia l'assemblaggio di particelle e la funzionalizzazione e ha un potenziale considerevole per migliorare la qualit? dell'imaging, attenuando al contempo molte delle difficolt? associate alla fabbricazione di particelle multifunzionali. I diametri medi dei liposomi prima e dopo un'ora di incubazione in PBS integrato con siero erano rispettivamente 4,3 ? 2 e 3,7 ? 2 ?m. Il gadolinio caricato sul liposoma modificato da DTPA-chitosano-g-C18 ha migliorato significativamente il segnale MR, rispetto al liposoma modificato con DTPA-chitosano. A una data concentrazione di liposomi, R1 della sospensione ? stato aumentato con DTPA-chitosano-g-C18. Tuttavia, la relassivit? molare del gadolinio immobilizzato era quasi la stessa in tutti i campioni. Pertanto, gli autori hanno interpretato che il potenziamento di R1 ottenuto con DTPA-chitosano-g-C18 ? dovuto esclusivamente al maggiore carico di gadolinio sulla superficie dei liposomi, osservando che il 30% del DTPA-chitosano ? stato desorbito all'esposizione a GdCl3. Inoltre, la relassivit? ? stata aumentata oltre quella del complesso DTPA-Gd non coniugato usato clinicamente con una relassivit? molare di 4,85 mM?1s?1. Gli autori hanno anche valutato i liposomi rivestiti di gadolinio in vivo usando modelli di ischemia murina per evidenziare la capacit? diagnostica del sistema.
Cittadino, E. et al. In Vivo Magnetic Resonance Imaging Detection of Paramagnetic Liposomes Loaded with Amphiphilic Gadolinium(III) Complexes: Impact of Molecular Structure on Relaxivity and Excretion Efficiency. in (2013) riporta l'indagine sulle prestazioni di MRI in vitro (relassometria) e in vivo (modello di tumore del melanoma su topi) di liposomi che incorporano LIPO-GdDOTA-(GAC12)2 (LIPO=liposoma, GA=acido glutarico) o un agente Gd monoammide anfifilo coniugato con catene C18 LIPOGdDOTAMA(C18)2 come riferimento. I liposomi sono stati preparati utilizzando una tecnica di deposizione di strato sottile/estrusione. La dimensione idrodinamica media dei liposomi ? risultata essere di circa 140 nm con un valore di indice di polidispersit? inferiore a 0,2. Attraverso i profili NMRD, gli autori hanno mostrato una marcata differenza di relassivit? su tutta la gamma di frequenze studiata, e la loro forma ? piuttosto simile e tipica dei sistemi macromolecolari caratterizzati da un tasso ridotto di rotolamento rotazionale. Essi hanno distinto: 1) una regione di relassivit? costante a campi bassi (0,01-0,5 MHz); 2) una dispersione intorno a 1?3 MHz; 3) un picco centrato a circa 20-30 MHz; e 4) una forte diminuzione di r1 a campi pi? alti. Tuttavia, sebbene per LIPO-GdDOTAMA(C18)2 il picco r1 (r1=11,4 mM-1s-1) sia ampio e centrato a 30 MHz, per LIPO-GdDOTA(GAC12)2 ? pi? stretto e con un massimo a 20 MHz (r1=40,0 mM-1s-1). Per quanto riguarda gli studi in vivo, dopo circa 7 ore dall'iniezione, il potenziamento di contrasto osservato per i liposomi pi? efficienti diminuisce rapidamente e diventa inferiore rispetto a LIPO-GdDOTAMA(C18)2. I dati relassometrici e la quantificazione dei complessi Gd negli organi hanno indicato che: 1) le differenze nel potenziamento del contrasto possono essere attribuite al diverso tasso di scambio idrico e alla dinamica rotazionale dei complessi Gd; 2) la rapida diminuzione del contrasto ? causata da un pi? rapido smaltimento di GdDOTA (GAC12)2 dagli organi. I risultati complessivi hanno evidenziato chiaramente le prestazioni relassometriche superiori dei liposomi caricati con GdDOTA(GAC12)2 rispetto alla formulazione liposomica basata sul complesso GdDOTAMA(C18)2. Pertanto, il complesso GdDOTA(GAC12)2 pu? rappresentare un buon candidato per lo sviluppo di protocolli MRI migliorati basati su nanoparticelle lipidiche marcate paramagneticamente.
Non-ionic Gd-based MRI contrast agents are optimal for encapsulation into phosphatidyldiglycerol-based thermosensitive liposomes. J. Control. Release Off. J.
Control. Release Soc. 166, 22?29 (2013) hanno studiato le formulazioni di 6 CA clinicamente approvati incapsulati in liposomi termosensibili (TL) e hanno osservato che Omniscan? e Prohance? sono i candidati pi? promettenti da incapsulare in DPPG2-TSL. In particolare, Prohance? consente la pi? alta capacit? di carico (256 mM) grazie alla pi? bassa osmolalit? e produce la pi? alta relassivit?. Omniscan? ? l'unica formulazione che pu? essere conservata a 4 ?C per settimane. Gli altri CA inducono l'idrolisi dei fosfolipidi, che si traduce in perdite di CA indesiderate e quindi riducono la durata di conservazione del TSL. Tuttavia, Omniscan? ? associato a fibrosi sistemica nefrogenica (NSF). L'albumina sierica umana (HSA) e l'immunglobulina G (IgG) contribuiscono all'aumento del segnale MRI a 30 ?C aumentando Pd. Un'alta concentrazione di CA incapsulato ? un prerequisito per ottenere un ?r1 sufficientemente alto durante il rilascio di CA innescato dal calore combinato con un r1 basso a 37 ?C. Quindi, il CA ottimale ? caratterizzato da una struttura non ionica e un basso contributo all'osmolalit?.
Cheng, Z. et al. Stabilized porous liposomes with encapsulated Gd-labeled dextran as a highly efficient MRI contrast agent. Chem. Commun. Camb. Engl. 50, 2502?2504 (2014) divulga un CA per MRI altamente efficiente basato su liposomi fosfolipidici porosi stabilizzati con destrano marcato con Gd incapsulato. Liposomi unilamellari sono stati preparati utilizzando il metodo di idratazione del film. Per evitare che piccoli chelati Gd (cio? Gd-DOTA) fuoriuscissero attraverso le membrane porose a doppio strato, Gd-DOTA ? stato attaccato a destrano di grande peso molecolare prima dell'incapsulamento (questo attaccamento ha aumentato la relassivit? protonica di GdDOTA rallentando la rotazione molecolare). In particolare, 1 mL di Gd-DOTA-destrano (10 mg/mL) ? stato aggiunto al film lipidico essiccato (2 mg di lipide) mentre Gd-DOTA-destrano non intrappolato ? stato rimosso attraverso ripetuti lavaggi su dispositivi di filtraggio centrifughi. Il diametro medio dei liposomi ? risultato essere di circa 100 nm. La membrana altamente porosa porta ad un'elevata relassivit? del Gd incapsulato. Gd-DOTA-destrano incapsulato all'interno dei liposomi porosi aveva un r1 di 9,9 mM?1s?1, che era simile all'r1 di Gd-DOTA-destrano (9,4 mM?1s?1) in acqua sfusa. Ci? indica che Gd-DOTA-destrano incapsulato all'interno dei liposomi porosi sperimenta un rapido tasso di scambio idrico con l'acqua sfusa circostante. Al contrario, Gd-DOTA-destrano incapsulato all'interno dei liposomi non porosi aveva un r1 di soli 4 mM?1s?1, che ? pi? di 2,4 volte inferiore all'r1 per Gd-DOTA-destrano incapsulato in liposomi porosi. Inoltre, l'r1 misurato da Gd-DOTA-destrano incapsulato in liposomi ? 2,6 volte superiore all'r1 di Gd-DOTA clinicamente utilizzato (3,9 mM?1s?1). Coniugando ligandi mirati contro il cancro alla loro superficie esterna non ostruita, questi CA risultano promettenti per essere utilizzati come agenti di imaging molecolare mirati.
Kozlowska, D. et al. Gadolinium-loaded polychelating amphiphilic polymer as an enhanced MRI contrast agent for human multiple myeloma and non Hodgkin?s lymphoma (human Burkitt?s lymphoma). RSC Adv. 4, 18007?18016 (2014) divulga la sintesi di liposomi caricati con ioni Gd utilizzando diversi lipidi chelanti incorporati nella membrana e funzionalizzati con anticorpo monoclonale anti-CD138 (syndecan-1) per la diagnosi di mieloma multiplo e linfoma non Hodgkin. In questo caso, l'uso del polimero anfifilico polichelante aumenta sia il contenuto di Gd che la relassivit? longitudinale dei liposomi caricati con Gd rispetto agli equivalenti Gd-DTPA-BSA.
Park, J.-H. et al. Hyaluronic acid derivative-coated nanohybrid liposomes for cancer imaging and drug delivery. J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 174, 98?108 (2014) divulga liposomi nanoibridi rivestiti con acido ialuronico anfifilico-ceramide per il rilascio mirato di farmaci anticancro e imaging del cancro in vivo. Dox, un farmaco antitumorale, e Magnevist, una CA per MRI a base di Gd, vengono caricati in questa formulazione liposomiale nanoibrida. Essi scoprono che il rilascio in vitro e lo smaltimento in vivo di Dox cos? come l'assorbimento cellulare dal liposoma nanoibrido ? potenziato rispetto a quello dal liposoma convenzionale, grazie alla circolazione prolungata del liposoma nanoibrido nel flusso sanguigno e alle interazioni del recettore HA-CD44.
H.-C. Development of a diagnostic polymersome system for potential imaging delivery. Colloids Surf. B Biointerfaces 128, 67?76 (2015) divulga un sistema polimersomico diagnostico per doppio imaging caratterizzato da una struttura di parete multilamellare altamente idratata in grado di incorporare simultaneamente un fluoroforo idrofobo nel vicino infrarosso, Cy5.5, e una sonda paramagnetica, cationi Gd. I polimersomi sono stati ottenuti dall'autoassemblaggio del copolimero contenente lipidi, poli(acido acrilico-co-distearina acrilato), in soluzione acquosa. Le specie Cy5.5 e Gd sono state caricate in polimersomi tramite associazione idrofoba (efficienza di caricamento di Cy5.5 circa 74%) e complessazione elettrostatica (Gd circa 83%), rispettivamente. Grazie alla struttura altamente idratata della membrana vescicolare, il potenziamento del contrasto superiore dei liposomi caricati con Gd in MRI ? stato ottenuto come risultato del tempo di correlazione rotazionale prolungato dei cationi Gd e del rapido scambio idrico da Gd alla soluzione sfusa. Il sistema mostra un valore di relassivit? longitudinale 15 volte superiore (circa 60 mM-1s-1) rispetto a quello (4 mM-1s-1) del CA commerciale Magnevist in soluzione salina tamponata con fosfato. La caratterizzazione in vivo dimostra che i liposomi mostrano un rapporto segnale-rumore nel contrasto dell'immagine RM pesata in T1 simile a quello di Magnevist, ma con una dose di Gd 5 volte inferiore. Insieme alla loro non tossicit? alla dose utilizzata, questi risultati dimostrano il grande potenziale dei CGLP come nanodispositivo diagnostico avanzato. Un eccellente contrasto nell'imaging NIR in corrispondenza del sito del tumore ? stato ottenuto dopo l'iniezione endovenosa di liposomi in topi portatori di tumore Tramp-C1 (C57BL/6).
Mannose-coated gadolinium liposomes for improved magnetic resonance imaging in acute pancreatitis. Int. J. Nanomedicine 12, 1127?1141 (2017) divulga la sintesi di liposomi mannosilati caricati con Gd-DTPA (M-Gd-NL) e verifica la loro capacit? di mirare ai macrofagi nella pancreatite acuta (AP) e discriminare tra AP lieve e grave. Il metodo basato su film lipidico viene utilizzato per sintetizzare liposomi DSPE-PEG2000-Man che incapsulano DPPE-DTPA-Gd, con dimensioni intorno ai 100 nm. Test in vitro mostrano un legame efficiente e un rapido rilascio di Gd-DTPA nei macrofagi, determinando una capacit? di MRI potenziata. Infatti, M-Gd-NL mostra una relassivit? longitudinale 1,8-1,9 superiore a Gd-DTPA, come conseguenza dell'incorporazione di DPPE-DTPA-Gd nel doppio strato dei liposomi, che ha rallentato il movimento di rotolamento verso il basso dei complessi Gd. Per quanto riguarda il profilo di sicurezza, M-Gd-NL non mostra alcuna grave tossicit? per gli organi nei ratti, dimostrandosi cos? promettenti nanoveicoli per uso clinico e per la diagnosi precoce di AP.
La domanda di brevetto internazionale, numero di pubblicazione WO2017/093902 divulga un processo per la preparazione di nanoparticelle di un polisaccaride reticolato, all'interno di dette nanoparticelle essendo geometricamente confinato un agente di contrasto a base di gadolinio o a base di manganese, detto processo comprendendo le fasi di preparare una soluzione di partenza comprendente il polisaccaride in un solvente e un agente di contrasto a base di gadolinio o a base di manganese, iniettare detta soluzione in un canale centrale di un dispositivo microfluidico comprendente il canale centrale e canali laterali in cui viene iniettato un anti-solvente di detto polisaccaride, aggiungere un agente reticolante nel dispositivo microfluidico, precipitare nanoparticelle costituite da polisaccaride reticolato contenente l'agente di contrasto caratterizzato dal fatto che l'aggiunta dell'agente reticolante avviene nel canale laterale contenente l'antisolvente oppure, nel canale centrale contenente la soluzione a una temperatura compresa tra 5 e 23 ?C e durante la precipitazione la temperatura ? tra 25 e 40 ?C e il rapporto tra il flusso volumetrico della soluzione nel canale centrale e il flusso volumetrico dell'anti-solvente nel canale laterale ? compreso tra 0,001 e 3.
La domanda di brevetto internazionale, numero di pubblicazione WO2018154470 divulga un processo per la preparazione di particelle coacervate comprendente le fasi di preparare un'emulsione acqua in olio di un polimero di polielettrolita biocompatibile e una soluzione acquosa di un polimero di polielettrolita biocompatibile avente cariche opposte del polielettrolita dell'emulsione in olio, aggiungere due agenti reticolanti, uno all'emulsione e l'altro alla soluzione acquosa e un mezzo di contrasto per imaging medicale, miscelare la soluzione acquosa con l'emulsione a una temperatura compresa tra 19 e 37 ?C e a un pH compreso tra 3 e 7 per ottenere la separazione delle nanoparticelle coacervate e opzionalmente aggiungere un ulteriore agente di contrasto e un tracciante ottico o un radiotracciante per imaging medico alle particelle coacervate.
Problema tecnico
Alla luce dei risultati dell'arte nota anteriore, gli inventori della presente domanda hanno progettato un processo per la preparazione di nanostrutture ibride costituite da un guscio a doppio strato lipidico che avvolge un nucleo di idrogel in cui sono incapsulati agenti di imaging e farmaci.
La nanostruttura ibrida della presente invenzione rappresenta un miglioramento rispetto ai convenzionali liposomi che incapsulano farmaci poich? accoppia i vantaggi dello strato lipidico per intrappolare farmaci lipofili e della struttura di idrogel per potenziare le prestazioni degli agenti di imaging caricati.
Pi? in particolare, la porosit? del nucleo di idrogel migliora il tasso di scambio idrico in modo che la struttura complessiva sviluppata mostri un aumento della relassivit? rispetto ai chelati metallici liberi e potenzi le propriet? relassometriche dell'agente di contrasto incapsulato.
D'altra parte il doppio strato lipidico del liposoma impedisce la fuoriuscita dei mezzi di contrasto, favorisce la biocompatibilit? della nanostruttura e le sue interazioni con l'ambiente biologico circostante.
Il processo della presente invenzione utilizza dispositivi microfluidici e grazie alla selezione mirata di tutti i parametri di lavoro, quali temperature, portata e concentrazione dei materiali permette di ottenere un prodotto finale con propriet? migliorate.
Oggetto dell'invenzione
Con riferimento alle rivendicazioni allegate, il problema tecnico di cui sopra viene risolto fornendo:
un processo per la preparazione di nanoparticelle
costituito da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo di idrogel in cui sono intrappolati agenti attivi
in cui il processo viene eseguito in un dispositivo microfluidico comprendente un canale centrale (intermedio) e almeno un canale laterale
il processo comprendendo le seguenti fasi:
a) Preparazione di una soluzione madre lipidica composta da almeno due diversi lipidi
b) Preparazione di una miscela di solventi aggiungendo la soluzione madre lipidica ottenuta nella fase a) a una soluzione solvente di etanolo e acqua
c) Preparazione di una soluzione acquosa di almeno un polimero idrofilo e l'agente attivo e acido acetico
d) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase c) nel canale intermedio del dispositivo microfluidico
e) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase b) in un canale laterale del dispositivo microfluidico
f) Raccolta del prodotto finale come precipitato nel punto di confluenza dei canali intermedio e laterale In cui
nella fase a) il rapporto tra i due diversi lipidi ? compreso tra 1:8 e 8:1
nella fase b) la soluzione solvente ? etanolo tra il 45% e il 100% e acqua tra lo 0% e il 55%
nella fase c) la soluzione acquosa contiene una quantit? di acido acetico inferiore al 10%
la portata nel canale intermedio ? tra 1 e 3 ?l/min.
Ulteriore oggetto della presente invenzione sono le nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo di idrogel caratterizzate dall'avere un diametro medio compreso tra 80 e 710 nm, indice di polidispersit? compreso tra 0,1 e 1, potenziale Zeta compreso tra -22 e 53 mV, parametri di mobilit? compresi tra -2 e -4 ?mcm/Vs, conduttivit? compresa tra 0,07 e 1 mS/cm, preferibilmente ottenute mediante il processo di cui sopra.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l'uso delle nanoparticelle di cui sopra come veicoli che intrappolano ingredienti attivi.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l'uso delle nanoparticelle di cui sopra come agenti di contrasto per tecniche di imaging.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l'uso delle nanoparticelle di cui sopra come farmaci per applicazioni teranostiche.
Ulteriori caratteristiche risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata con riferimento ai dati sperimentali forniti e alla figura allegata.
Breve descrizione della figura
La Figura 1 mostra nel grafico i risultati della relassometria, distribuzione del tempo di rilassamento longitudinale di magnetizzazione T1.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Definizioni
Nell?ambito della presente invenzione, processo microfluidico significa un processo eseguito in un dispositivo microfluidico dotato di micro-canali chiamati "dispositivi microfluidici" in cui il flusso di soluzioni di partenza a portate specifiche verso un'uscita del dispositivo consente di ottenere la precipitazione di particelle di dimensione nanometrica.
Nell?ambito della presente invenzione, idrogel significa una rete di catene polimeriche idrofile reticolate con acqua che ? il mezzo di dispersione.
Nell?ambito della presente invenzione, agente attivo significa agenti di imaging e farmaci.
Gli agenti di imaging possono essere fluorofori per l'imaging ottico, chelati di metallo per la risonanza magnetica, radiotraccianti per la tomografia a emissione di positroni.
I farmaci possono essere farmaci lipofili e farmaci idrofili.
La presente invenzione riguarda un processo per la preparazione di nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo di idrogel che fungono da veicoli in cui sono intrappolati agenti attivi
in cui il processo viene eseguito in un dispositivo microfluidico comprendente un canale centrale (intermedio) e almeno un canale laterale
il processo comprendendo le seguenti fasi:
a) Preparazione di una soluzione madre lipidica composta da almeno due diversi lipidi
b) Preparazione di una miscela di solventi aggiungendo la soluzione madre lipidica ottenuta nella fase a) a una soluzione solvente di etanolo e acqua
c) Preparazione di una soluzione acquosa di almeno un polimero idrofilo e l'agente attivo e acido acetico
d) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase c) nel canale intermedio del dispositivo microfluidico
e) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase b) in un canale laterale del dispositivo microfluidico
f) Raccolta del prodotto finale come precipitato nel punto di confluenza dei canali intermedio e laterale
In cui
nella fase a) il rapporto tra i due diversi lipidi ? compreso tra 1:8 e 8:1
nella fase b) la soluzione solvente ? etanolo tra il 45% e il 100% e acqua tra lo 0% e il 55%
nella fase c) la soluzione acquosa contiene una quantit? di acido acetico inferiore al 10%
la portata nel canale intermedio ? tra 1 e 3 ?l/min.
e nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un idrogel
Ulteriore oggetto della presente invenzione sono le nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo di idrogel caratterizzate dall'avere un diametro medio compreso tra 80 e 710 nm, indice di polidispersit? compreso tra 0,1 e 1, potenziale Zeta compreso tra -22 e 53 mV, parametri di mobilit? compresi tra -2 e -4 ?mcm/Vs, conduttivit? compresa tra 0,07 e 1 mS/cm.
Preferibilmente le nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo in idrogel caratterizzate dall'avere un diametro medio compreso tra 80 e 710 nm, indice di polidispersit? compreso tra 0,1 e 1, potenziale Zeta compreso tra -22 e 53 mV, parametri di mobilit? compresi tra -2 e -4 ?mcm/Vs, conduttivit? compresa tra 0,07 e 1 mS/cm fungono da veicoli che intrappolano agenti attivi.
Preferibilmente le nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo di idrogel caratterizzate dall'avere un diametro medio compreso tra 80 e 710 nm, indice di polidispersit? compreso tra 0,1 e 1, potenziale Zeta compreso tra -22 e 53 mV, parametri di mobilit? compresi tra -2 e -4 ?mcm/Vs, conduttivit? compresa tra 0,07 e 1 mS/cm che fungono da veicoli che intrappolando agenti attivi sono ottenute mediante un processo effettuato in un dispositivo microfluidico comprendente un canale centrale (intermedio) e almeno un canale laterale comprendente le seguenti fasi:
a) Preparazione di una soluzione madre lipidica composta da almeno due diversi lipidi
b) Preparazione di una miscela di solventi aggiungendo la soluzione madre lipidica ottenuta nella fase a) a una soluzione solvente di etanolo e acqua
c) Preparazione di una soluzione acquosa di almeno un polimero idrofilo e l'agente attivo e acido acetico
d) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase c) nel canale intermedio del dispositivo microfluidico
e) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase b) in un canale laterale del dispositivo microfluidico
f) Raccolta del prodotto finale come precipitato nel punto di confluenza dei canali intermedio e laterale
In cui
nella fase a) il rapporto tra i due diversi lipidi ? compreso tra 1:8 e 8:1
nella fase b) la soluzione solvente ? etanolo tra il 45% e il 100% e acqua tra lo 0% e il 55%
nella fase c) la soluzione acquosa contiene una quantit? di acido acetico inferiore al 10%
la portata nel canale intermedio ? tra 1 e 3 ?l/min.
Preferibilmente nella fase a) il rapporto tra i due diversi lipidi ? 1:4
Preferibilmente nella fase a) i lipidi sono fosfatidilcolina e colesterolo in un rapporto 1:4
Preferibilmente nella fase b) la soluzione solvente ? etanolo al 65% e acqua al 35%
Preferibilmente la fase b) viene eseguita a temperatura ambiente
Preferibilmente nella fase c) la soluzione acquosa contiene l'1% di acido acetico
Preferibilmente nel canale intermedio la portata ? di 3 ?l/min.
Preferibilmente nei canali laterali la portata ? di 42 ?l/min.
Preferibilmente i lipidi sono fosfolipidi e steroli.
Preferibilmente i lipidi sono selezionati dal gruppo costituito da fosfatidilcolina (PC), L-? fosfatidilcolina (soia/uovo) (PC di soia/PC di uovo), fosfatidilcolina di soia idrogenata (HSPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosphfatidiilglycerolo (DMPG), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), PC combinati con polietilenglicole (PEG), PC combinati con catene di acidi grassi come acido oleico, laurilico, palmitico e stearico, fosfatidilglicerolo (PG), complessi ciclici come ciclodestrina, fosfatidilserina (PS), sfingomielina (SM), acido fosfatidico (PA), fosfatidiletanolammina (PE), ancora pi? preferibilmente fosfatidilcolina e colesterolo.
Preferibilmente il polimero idrofilo dell'idrogel ? scelto dal gruppo costituito da polielettroliti, polisaccaridi, glicosamminglicano.
Pi? preferibilmente il polimero idrofilo dell'idrogel ? selezionato dal gruppo costituito da acido ialuronico, acido poli(lattico-co-glicolico), destrano, alginato, cellulosa, chitosano, ancora pi? preferibilmente ? chitosano.
Pi? preferibilmente il chitosano ? in una concentrazione tra 0 e 0,5 mg/ml.
Ancora pi? preferibilmente il chitosano ? in una concentrazione di 0,1 mg/ml.
Preferibilmente l'acido acetico ? in una quantit? dell'1% della soluzione acquosa.
In una forma di realizzazione preferita fosfatidilcolina e colesterolo in un rapporto tra colesterolo e fosfatidilcolina di 1:4, aggiunti a una soluzione di EtOH al 65% in acqua MilliQ al 35%. La soluzione di chitosano ? stata aggiunta gradualmente all'acido acetico all'1% in acqua, aggiunta gradualmente agitando continuamente a 25 ?C. Portata nei canali laterali e portata nel canale intermedio di 3 ?L/min.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l'uso delle nanoparticelle di cui sopra come veicoli che intrappolano ingredienti attivi.
Gli ingredienti attivi sono selezionati dal gruppo costituito da: farmaci, ingredienti farmaceuticamente attivi, agenti di imaging.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l'uso delle nanoparticelle di cui sopra come agenti di contrasto per tecniche di imaging.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l'uso delle nanoparticelle di cui sopra come farmaci per applicazioni teranostiche.
Preferibilmente gli agenti di imaging sono selezionati dal gruppo costituito da traccianti ottici, coloranti, radiotraccianti, agenti di contrasto.
Preferibilmente traccianti ottici e coloranti sono selezionati dal gruppo costituito da: coloranti a base di rodamina, coloranti a base di bodipy, coloranti a base di indocianina, coloranti verdi di indocianina, coloranti a base di porfirine, coloranti a base di ftalocianine.
Preferibilmente i radiotraccianti sono selezionati dal gruppo costituito da: radiotraccianti a base di 99mTc, radiotraccianti a base di 18F, radiotraccianti a base di 18F-FDG.
Preferibilmente gli agenti di contrasto sono selezionati dal gruppo costituito da: agenti di contrasto a base di iodio, agenti di contrasto a base di bario, agenti di contrasto a base di ferro, agenti di contrasto a base di gadolinio, agente di contrasto a base di manganese.
In una forma di realizzazione preferita, la nanoparticella ? costituita da un guscio di fosfatidilcolina e colesterolo e da un nucleo costituito da un agente di contrasto a base di gadolinio o a base di manganese che intrappola chitosano.
Esempi
Materiali e metodi
Come lipidi, ? stata utilizzata fosfatidilcolina ricavata da fagioli di soia (polvere liofilizzata; temperatura di conservazione ?20 ?C; peso molecolare medio di circa 776 g/mol) e colesterolo derivato da lana di pecora (formula empirica C27H46O; peso molecolare 386,65 g/mol; temperatura di conservazione ?20 ?C) di Sigma Aldrich. Come polimero ? stato utilizzato il chitosano (basso peso molecolare: 50.000-190.000 Da; solubile in acido acquoso diluito) acquistato anch'esso da Sigma Aldrich. Come solventi, sono stati utilizzati acido acetico (assoluto), etanolo (puriss. p.a., assoluto, ?99,8% GC; PM: 46,07 g/mol) e acqua MilliQ filtrata per tutti gli esperimenti e le fasi di purificazione (dialisi).
Preparazione della soluzione madre. Preparazione di soluzioni madre lipidiche (PC:Ch ? 4:1): PC: 80 mg in 10 ml (8 mg/ml); Ch: 10 mg in 10 ml (1 mg/ml). Ad ogni prova il rapporto tra colesterolo e fosfatidilcolina era di 1:4, rispettivamente.
Per determinare la distribuzione dimensionale delle NP (dimensione idrodinamica e indice di polidispersit?), mostrata nella tabella 4, viene eseguita diffusione dinamica della luce (DLS) utilizzando uno Zetasizer S-90 1000 HS (Malvern Instruments, UK). Tutti i campioni vengono diluiti (1:10) con acqua deionizzata per prevenire gli effetti della diffusione multipla. La temperatura di misurazione ? impostata a 25 ?C.
Test di solubilit?
In primo luogo ? stata preparata una soluzione di lipidi ed etanolo, quindi aggiungendo gradualmente l'1% di acido acetico in acqua (2,92 ml di acqua 0,08 ml di acido acetico), la soluzione ? stata agitata continuamente (300x) a una temperatura di 25 ?C. La concentrazione di partenza dei lipidi nell'etanolo era di 2,25 mg/ml dopo l'aggiunta di 3 ml di acido acetico all'1% si verifica precipitazione (concentrazione di lipidi di 1,28 mg/ml). ? stata verificata la solubilit? dei lipidi in etanolo e acido acetico. La concentrazione iniziale di lipidi era 1,6 mg/ml in etanolo. Quindi ? stato aggiunto acido acetico gradualmente fino al 7,41% di acido acetico quando si verifica precipitazione. La precipitazione scompare dopo aver ridotto la percentuale di acido al 6%. In questo modo abbiamo verificato la solubilit? dei lipidi in presenza di acido acetico (concentrazione lipidica finale 1,2 mg/ml). Con una concentrazione iniziale di lipidi di 0,1125 mg/ml, ? stato ottenuto il 10% di acido acetico senza precipitazione. Nella stessa soluzione ? stata verificata la solubilit? del chitosano in concentrazione 0,25 mg/ml, agitazione 24 ore, soluzione non trasparente. ? stata gradualmente aggiunta acqua (33,3%) alla soluzione, dopo 24 ore successive la soluzione ? diventata trasparente (lipidi 0,00375 mg/ml; acido acetico 6,66%; etanolo 58,5%; chitosano 0,166%; acqua 33,33%). Il test successivo ? stato la solubilit? del chitosano in acido acetico assoluto. Il punto di partenza era 5 mg/ml di chitosano in acido acetico; la concentrazione finale era 1 mg/ml, ma la soluzione non era trasparente. Per questo motivo ? stata aggiunta acqua, dopo 24 ore la soluzione era trasparente (concentrazioni finali: acido acetico 77%; chitosano 0,77 mg/ml; acqua 23%). L'ultimo test di solubilit? ha verificato la miscelazione della soluzione lipidica (lipidi: 0,072 mg/ml; etanolo 64,3%; acqua 35,7%) con la soluzione di chitosano (acido acetico 77%; acqua 23%; 0,77 mg/ml). La soluzione di chitosano ? stata aggiunta gradualmente ogni 15 minuti alla soluzione di lipidi fino alle seguenti concentrazioni: lipidi 0,05305 mg/ml; chitosano 0,203 mg/ml; etanolo 45%; acqua 35%; acido acetico 20%.
Ogni prova ? stata eseguita su piattaforma microfluidica. Le condizioni sperimentali sono riportate nella seguente tabella 1.
Tabella 1
Caratterizzazioni dei campioni
La caratterizzazione ? stata eseguita sul microscopio elettronico a trasmissione di FEI? in modalit? DRY e CRYO e sul microscopio elettronico a scansione a emissione di campo (FE-SEM) di Zeiss. I campioni per la caratterizzazione TEM sono stati colorati in alcuni casi con acido fosfotungstico (acido fosfotungstico al 2%) su pellicola di carbonio formvar 300 mesh. Campioni regolari su TEM sono stati raccolti su pellicole di carbonio su rame a griglia da 300 mesh. La dimensione delle nanoparticelle e il potenziale Z sono stati analizzati mediante diffusione dinamica della luce (DLS). I tempi di rilassamento sono misurati su un relassometro da banco Bruker Minispec (mq 60) che opera a 60 MHz per protoni (intensit? del campo magnetico: 1,41 T). Le acquisizioni vengono eseguite a 37 ?C e, prima di ogni misurazione, il campione viene posto nella sonda NMR per 15 min per l'equilibratura termica.
Effetto della concentrazione di EtOH
? stato studiato l'effetto di due diverse frazioni volumetriche di EtOH utilizzate nella miscela di solventi per solubilizzare i lipidi (0,072 mg/ml). La condizione ottimale per rendere efficace il processo di autoassemblaggio pu? essere osservata in termini di produzione, morfologia e distribuzione dimensionale dei liposomi. In particolare, solubilizzando i liposomi in una miscela di solventi composta da EtOH al 65% e da acqua MilliQ al 35%, ? possibile ottenere dimensioni e polidispersit? inferiori dopo il trattamento attraverso la piattaforma microfluidica.
Effetto della concentrazione di chitosano
? stato studiato l'effetto della concentrazione di chitosano sulla formazione e produzione di liposomi. La condizione migliore pu? essere trovata a una concentrazione di chitosano di 0,1 mg/ml. Infatti, non solo la distribuzione dimensionale ? migliore, sia in termini di dimensione che di polidispersit?, rispetto alle prove con solo acido acetico e alla prova con 0,375 mg/ml, ma anche la struttura dei liposomi sembra essere in grado di incapsulare il polimero all'interno del nucleo del liposoma per effetto della concentrazione di acido acetico.
? stato studiato l'effetto dell'aumentata concentrazione di acido acetico sulla formazione dei liposomi. Nel caso di acido acetico al 10% v/v, il chitosano non ? pi? intrappolato nel nucleo del liposoma.
Ottimizzazione delle portate
? stato effettuato un confronto tra due differenti portate utilizzate per il canale intermedio della piattaforma microfluidica. Liposomi di chitosano a 1 ?L/min e gli stessi liposomi ottenuti a 3 ?L/min. La portata leggermente superiore nel canale intermedio rappresenta non solo un vantaggio in termini di maggiore resa ma anche in termini di minore dimensione e polidispersit?.
Incapsulamento di Gd-DTPA
? stato effettuato un confronto tra liposomi di chitosano caricati con Gd in due diverse condizioni di portata (1 ?L/min e 3 ?L/min). Come gi? evidenziato nel paragrafo precedente, il valore di 3 ?L/min ? la migliore condizione di portata. Liposomi di chitosano pi? piccoli e meno polidispersi che incapsulano Gd-DTPA possono essere ottenuti con una portata del canale intermedio impostata a 3 ?L/min.
Inoltre, in termini di tempo di rilassamento longitudinale (T1), la migliore condizione di processo si ottiene con una portata di 3 ?L/min nel canale intermedio. Come mostrato nelle tabelle 2 e 3, il T1 dei liposomi di chitosano caricati con Gd ? di gran lunga inferiore a quello dei liposomi di chitosano non caricati. Inoltre, dopo una dialisi per rimuovere l'eccesso di Gd-DTPA, il segnale per i liposomi di chitosano caricati con Gd ? ancora significativo, il che significa che il Gd-DTPA ? incapsulato nel nucleo dei liposomi.
Tabella 2
Tabella 3
Effetto del volume di raccolta sui liposomi caricati e non caricati
I liposomi caricati con chitosano che incapsulano un CA a base di Gd sono sintetizzati attraverso un approccio di focalizzazione del flusso idrodinamico. Da un lato, la struttura del gel di chitosano intrappolata nel nucleo dei liposomi insieme migliora le propriet? relassometriche del CA incapsulato; dall'altro lato, il doppio strato lipidico del liposoma impedisce la fuoriuscita degli agenti di contrasto, favorendo potenzialmente la biocompatibilit? della nanostruttura e le sue interazioni con il l'ambiente biologico circostante.
Nella seguente tabella 4 sono riportati i dati relativi al diametro medio delle nanoparticelle e all'indice di polidispersit? (PDI). Tra le migliori condizioni ottenute, quella evidenziata in grassetto nella tabella 4 rappresenta la distribuzione dimensionale di liposomi di chitosano non caricati e caricati con Gd a due diverse condizioni di portata (1 ?L/min e 3 ?L/min). Come gi? evidenziato, il valore di 3 ?L/min ? la migliore condizione di portata anche nel caso di liposomi caricati con Gd. Liposomi di chitosano pi? piccoli e meno polidispersi che incapsulano Gd-DTPA possono essere ottenuti con una portata del canale intermedio impostata a 3 ?L/min.
Tabella 4
Claims (10)
1. Processo per la preparazione di nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo di idrogel in cui sono intrappolati agenti attivi
in cui il processo viene eseguito in un dispositivo microfluidico comprendente un canale centrale (intermedio) e almeno un canale laterale
il processo comprendendo le seguenti fasi:
a) Preparazione di una soluzione madre lipidica composta da almeno due diversi lipidi
b) Preparazione di una miscela di solventi aggiungendo la soluzione madre lipidica ottenuta nella fase a) a una soluzione solvente di etanolo e acqua
c) Preparazione di una soluzione acquosa di almeno un polimero idrofilo e l'agente attivo e acido acetico
d) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase c) nel canale intermedio del dispositivo microfluidico
e) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase b) in un canale laterale del dispositivo microfluidico
f) Raccolta del prodotto finale come precipitato nel punto di confluenza dei canali intermedio e laterale
In cui nella fase a) il rapporto tra i due diversi lipidi ? compreso tra 1:8 e 8:1, nella fase b) la soluzione solvente ? etanolo tra il 45% e il 100% e acqua tra lo 0% e il 55%, nella fase c) la soluzione acquosa contiene una quantit? di acido acetico inferiore al 10%, la portata nel canale intermedio ? tra 1 e 3 ?l/min.
2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui nella fase a) il rapporto tra i due diversi lipidi ? 1:4.
3. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui nella fase b) la soluzione solvente ? etanolo al 65% e acqua al 35%.
4. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui nella fase c) la soluzione acquosa contiene l'1% di acido acetico.
5. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui nel canale intermedio la portata ? 3 ?l/min.
6. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui i lipidi sono fosfolipidi e steroli.
7. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui il polimero idrofilo dell'idrogel ? selezionato dal gruppo costituito da polielettroliti, polisaccaridi, glicosamminglicano.
8. Nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo di idrogel caratterizzate dall'avere un diametro medio compreso tra 80 e 710 nm, indice di polidispersit? compreso tra 0,1 e 1, potenziale Zeta compreso tra -22 e 53 mV, parametri di mobilit? compresi tra -2 e -4 ?mcm/Vs, conduttivit? compresa tra 0,07 e 1 mS/cm.
9. Nanoparticelle secondo la rivendicazione 9 ottenute mediante il processo della rivendicazione 1 eseguito in un dispositivo microfluidico comprendente un canale centrale (intermedio) e almeno un canale laterale comprendente le seguenti fasi:
a) Preparazione di una soluzione madre lipidica composta da almeno due diversi lipidi
b) Preparazione di una miscela di solventi aggiungendo la soluzione madre lipidica ottenuta nella fase a) a una soluzione solvente di etanolo e acqua
c) Preparazione di una soluzione acquosa di almeno un polimero idrofilo e l'agente attivo e acido acetico
d) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase c) nel canale intermedio del dispositivo microfluidico
e) Iniezione della soluzione come ottenuta nella fase b) in un canale laterale del dispositivo microfluidico
f) Raccolta del prodotto finale come precipitato nel punto di confluenza dei canali intermedio e laterale
In cui
nella fase a) il rapporto tra i due diversi lipidi ? compreso tra 1:8 e 8:1
nella fase b) la soluzione solvente ? etanolo tra il 45% e il 100% e acqua tra lo 0% e il 55%
nella fase c) la soluzione acquosa contiene una quantit? di acido acetico inferiore al 10%
la portata nel canale intermedio ? tra 1 e 3 ?l/min.
10. Uso di nanoparticelle costituite da un guscio a doppio strato lipidico e un nucleo in idrogel caratterizzate dall'avere un diametro medio compreso tra 80 e 710 nm, indice di polidispersit? compreso tra 0,1 e 1, potenziale Zeta compreso tra -22 e 53 mV, parametri di mobilit? compresi tra -2 e -4 ?mcm/Vs, conduttivit? compresa tra 0,07 e 1 mS/cmAn secondo le rivendicazioni 8 e 9 come veicoli per intrappolare ingredienti attivi.
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Also Published As
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|---|---|
| WO2022167536A2 (en) | 2022-08-11 |
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