JP6170047B2 - アポトーシス−ターゲティングナノ粒子 - Google Patents

Description

政府援助に関する陳述
本発明は、合衆国政府のＮＩＨにより授与された、認可番号１Ｐ３０ＧＭ０９２３７８の下で、政府支援を得て行われた。政府は、本発明にある一定の権利を有する。

本出願は、２０１１年８月３１日に提出した、米国仮特許出願第６１／５２９，６３７号明細書への優先権の利益を主張し、その出願は、本開示に抵触しない程度までその全体が本願明細書に組込まれる。

本開示は、アポトーシス細胞、特に血管プラークのアポトーシスマクロファージをターゲットするために設計されたナノ粒子、ならびに診断的使用および治療的使用を含む、その使用方法に関する。

アテローム血栓性血管疾患（ＡＴＶＤ）は、依然として先進工業国における死因の第一位であり、しかも世界中で肥満およびインスリン耐性の割合が増加しているため、この問題は毎年増加している。全身的危険因子を低下させる経口薬物は成功したものの、高リスク個体群の最高７０％を継続的なリスクにさらされたままにしておくという甚だしい治療ギャップがある。アテローム性動脈硬化症の動物モデルで分子遺伝学的手法を使用して、幾つかの有望な動脈壁ターゲットが同定され確認されているが、これらの多くは経口または標準全身治療にも適さない。

ＡＴＶＤにつながりかねない脆弱なプラークを予め同定するための、広く認められている診断方法は、現在、皆無である。しかし、そのように脆弱なプラークを予め同定することにより、血栓塞栓症の罹病率および死亡率を低下させることが可能であろう。

アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死は、動脈硬化性病変の不安定性に寄与する、遺伝的に調節されるプロセスである。マクロファージおよび平滑筋細胞（ＳＭＣ）のアポトーシスは、プラーク破綻および血栓形成のプロセスで重要な役割を果たす。細胞膜外葉上のアニオン性ホスファチジルセリン（ＰＳ）の露出は、アポトーシスにおける最初の分子イベントの１つである。技術的観点から、アポトーシスは、血栓性イベントを生じやすい動脈硬化性プラークならびに癌の診断のための魅力的なターゲットであろう。

細胞表面上のＰＳの最も一般的な検出方法は、Ｃａ²⁺依存的、ＰＳ−結合性蛋白質アネキシンＶの使用を含む。インビトロアッセイには、３５−ｋＤａアネキシンＶ蛋白質が一般的に蛍光色素で標識され、インビボ撮像には放射性の拡散強調磁気共鳴画像（ＭＲＩ）テクニックが使用される。標識されたアネキシンＶ蛋白質は広範に使用されるが、高価でやや不安定であり、また拡散強調ＭＲＩは、その方法が強い磁界勾配に依存しかつ人工物に敏感なため、適用は限定される。加えて、アネキシンＶ拡散強調ＭＲＩと関連した変化の大きさは小さく、そのため組織収縮、壊死、および動脈血管壁で起こる他のプロセス間の差を認識することは困難である。

ＰＳをターゲットするための他の可能な選択肢としては、高いアフィニティおよび特異性でＰＳを結合するペプチド類、およびアネキシンＶのアポトーシスセンシング機能を模倣することが証明されている、亜鉛２，２’−ジピコリルアミン（Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ）配位化合物等が挙げられる。

（アポトーシスの代わりとして）ＰＳ転位置を検出する代替手法は、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の崩壊の検出である。ΔΨｍは、アポトーシスの開始時期の特徴である。ＰＳ露出の一時的性質と違って、ΔΨｍの崩壊は、前進プロセスである。ΔΨｍモニタリングは、一般にＡＴＶＤまたは環動脈性心疾患（ＣＨＤ）に関連したマクロファージ炎症に対して直接的な効果を示す治療法を送達することによって、進行を予防したり減速したりするのを助けるための早期診断および積極的管理につながる動脈壁のアポトーシスマクロファージ動脈硬化性プラークをモニターすることにより、脆弱なプラークを検出するための効果的な戦略を提供することが可能である。

本開示は、とりわけ、アポトーシス細胞をターゲットするナノ粒子について記述する。実施態様で、ナノ粒子はアポトーシスマクロファージを選択的にターゲットする。実施態様で、ナノ粒子は脆弱なプラークの撮像および診断に使用される。実施態様で、ナノ粒子は、標的治療のために治療薬を脆弱なプラークに送達するために使用される。

本明細書に記載のナノ粒子は、アポトーシス細胞をターゲットまたはモニターするために設計された１つまたは複数の部分を含む。そのような部分は、ＰＳ−ターゲティング部分であってもよく、ΔΨｍモニタリング部分であってもよい。ナノ粒子は、マクロファージをターゲットするように設計された１つまたは複数の部分も含んでもよい。ナノ粒子は、可視化、撮像、診断等のために、１つまたは複数の造影剤を含んでもよい。加えて、または或いは、ナノ粒子は、ＣＨＤ、ＡＴＶＤ等を治療するために設計された１つまたは複数の治療薬を含んでもよい。

ナノ粒子をアポトーシス細胞またはアポトーシスマクロファージに向けることによって、ナノ粒子は血管プラーク中に蓄積することが可能である。ナノ粒子が造影剤を含む場合、蓄積したナノ粒子の可視化を、ＡＴＶＤの脆弱なプラークの診断に使用することが可能である。ナノ粒子が治療薬を含む場合、ＡＴＶＤまたはＣＨＤの治療のために、標的治療を送達することが可能である。

以前のナノ粒子、撮像方法論、治療法等に優る、本明細書で提示される様々な実施態様の１つまたは複数の利点は、添付の図面と併せて読むとき、以下の詳細な記述に基づいて、当業者に容易に明白になるであろう。

動脈硬化性プラークのための、ナノ沈殿によるＨＤＬ−模倣ナノ粒子に関する反応スキームの一実施態様の概要である。 ナノ沈殿によるＨＤＬ−模倣ナノ粒子に関する反応スキームの一実施態様の概要である。 動脈硬化性プラークのためのナノセンサーの、ブレンドされたナノ沈殿に関する反応スキームの一実施態様の概要である。 動脈硬化性プラークのためのナノセンサーの、ブレンドされたナノ沈殿に関する反応スキームの一実施態様の概要である。 本明細書に記述されている通り形成されたナノ粒子の透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を示す。 本明細書に記述されている通りに形成された様々なナノ粒子のサイズ（左のパネル）およびゼータ電位（右のパネル）を表す棒グラフを示す。 蛍光標識ホスファチジルセリン（ＰＳ）ターゲティングナノ粒子が導入された、クロロホルム（ＣＨＣｌ₃）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）またはホスファチジルコリン（ＰＣ）が入ったバイアルの画像を示す。 ＰＳターゲティング蛍光標識ナノ粒子と共にインキュベートしたアポトーシス細胞の共焦点蛍光顕微鏡写真を示す。 酸化鉄含有ＰＳターゲティングナノ粒子と共にインキュベートしたアポトーシス細胞のＭＲＩ画像を示す。 ミトコンドリア基質ターゲテドナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。 ミトコンドリア基質ターゲテドナノ粒子のサイズ（左のパネル）およびゼータ電位（右のパネル）を表す棒グラフを示す。 指示通りに、ミトコンドリアターゲテドナノ粒子をチャレンジしたマクロファージの、ＩＬ−６（左のパネル）およびＴＮＦ−α（右のパネル）に対して実施されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す棒グラフを示す。 ミトコンドリア基質ターゲテドナノ粒子（Ａ）ミトコンドリア非ターゲテドナノ粒子（Ｂ）と共にインキュベートした細胞の共焦点画像である。 ミトコンドリア基質ターゲテドナノ粒子（Ａ）ミトコンドリア非ターゲテドナノ粒子（Ｂ）と共にインキュベートした細胞の共焦点画像である。 本明細書に記述されているＨＤＬ−模倣ナノ粒子の、コレステロール結合作用を表すグラフである。 指示通り、ＨＤＬ−模倣ナノ粒子の細胞毒性実験の結果を表すグラフを示す。

図面は、必ずしも一定の縮尺ではない。図で使用した同じ数字は、同じ成分、ステップ等を指す。しかし、当然のことながら、所与の図で成分を指すための数字の使用は、同じ数字が付けられた別の図における成分を限定する意図はない。加えて、成分を指すための異なる数字の使用は、異なる数字が付けられた成分が同一であるかまたは類似していることはあり得ないことを示す意図はない。

以下の詳細な説明では、本明細書の一部を成し、デバイス、システムおよび方法の幾つかの具体的な実施態様を実例として示す、添付の図面について言及する。当然のことながら、本開示の範囲または精神から逸脱することなく、他の実施態様を熟慮して製造することが可能である。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で捉えてはならない。

本明細書で使用される全ての科学用語および技術用語は、別段の定めがない限り、当技術分野でよく使用される意味を有する。本明細書で提供される定義は、本明細書で頻繁に使用されるある一定の用語の理解を容易にするためのものであって、本開示の範囲を限定するためのものではない。

この明細書および別記特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段の規定をしない限り、複数の指示対象を有する実施態様を含む。この明細書および別記特許請求の範囲で使用されるとき、用語「または（ｏｒ）」は、内容が明らかに別段の規定をしない限り、「および／または」を含む意味で一般に使用される。

本明細書で使用されるとき、有する（「ｈａｖｅ」、「ｈａｖｉｎｇ」）、含む（「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）、含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）等は、それらが限定しない意味で使用され、「含むが、その限りではない」を一般に意味する。当然のことながら、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」等は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等に包含される。

本明細書で使用されるとき、「治療する」等は、疾患や病態の１つまたは複数の症状を治癒する、予防する、または寛解することを意味する。

本明細書で使用されるとき、「脂質」は、リン脂質を含む。

「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用されるとき、「疎水性」である化合物は、水に不溶性の化合物、すなわち水への溶解度が１μｇ／リットル未満である化合物である。

本明細書で使用されるとき、「親水性」である化合物は、水溶性である化合物、すなわち水への溶解度が１０ｍｇ／リットル超である化合物である。

本明細書で使用されるとき、「結合する」、「結合された」等は、化学的実体が、任意の適当な結合タイプ、たとえば共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力等によって結合されていることを意味する。「結合する」、「結合した」等は、本明細書では「付着する」、「付着した」等と互換的に使用される。

本明細書で使用するとき、ナノ粒子のコアに「付着した」分子ないし部分は、コアの中に包埋される、コア内に含まれる、コアの少なくとも一部を形成する分子に付着する、コアに付着した分子に付着する、またはコアに直接付着する、ことが可能である。

本明細書で使用するとき、化合物の「誘導体」は、誘導体の元の化合物に構造的に類似した化合物である。多くの誘導体は、機能的誘導体である。すなわち、誘導体は一般に、誘導体の元の化合物に似た所望の機能を有する。例として、マンノースはマクロファージマンノース受容体を結合するため、本明細書では、マンノースはマクロファージターゲティング部分として記述されている。したがって、機能的マンノース誘導体は、マンノースと同じか類似したアフィニティでマクロファージマンノース受容体を結合することが可能な（たとえば、マンノースの解離定数の約１００倍の範囲内、たとえばマンノースのそれの約１０倍等の範囲、である解離定数を有する）、マンノース誘導体である。さらなる例として、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）は、ミトコンドリア基質中に、蓄積できるか、またはＴＰＰが結合されて蓄積する化合物または複合体（たとえばナノ粒子等）をもたらすことができるため、本明細書では、ＴＰＰはミトコンドリアターゲティング部分として記述されている。したがって、ＴＰＰの機能的誘導体は、ＴＰＰと類似した濃度（たとえば、約１００倍濃度範囲内、たとえば約１０倍濃度範囲内等）で、ミトコンドリア基質中に、蓄積できるか、それが結合されて蓄積する化合物または複合体をもたらすことができる、ＴＰＰの誘導体である。

ナノ粒子は、本明細書に記述されるとき、コアおよび１つまたは複数のターゲティング部分、ならびに１つまたは複数の造影剤あるいは１つまたは複数の治療薬を含む。実施態様で、造影剤または治療薬はコアの中に含まれるかまたは包埋される。ナノ粒子が治療薬を含む場合、その治療薬は好ましくは所望の速度でコアから放出される。実施態様で、コアは生分解性であって、コアが分解されるか侵食されるとき治療薬を放出する。ターゲティング部分は、好ましくは、細胞成分との相互作用に利用できるようにコアから外に向かって伸び、その相互作用がナノ粒子を適当な細胞、たとえばアポトーシス細胞等；小器官、たとえばミトコンドリア等；等に向ける。ターゲティング部分は、コアまたはコアと相互に作用する成分に繋留することが可能である。

Ｉ．コア
ナノ粒子のコアは、任意の適当な成分また諸成分から形成することが可能である。好ましくは、コアは、疎水性成分、たとえば疎水性ポリマーまたは疎水性部分あるいはポリマーまたは脂質等から形成される。実施態様で、コアは、疎水性コアと親水性外表面を有するミセルを形成することができるリン脂質を含む。コアはまた、または或いは、水性環境で、疎水性コアと親水性外表面を有する粒子に自己組織化できる部分を有する疎水性部分と親水性部分を有するブロックコポリマーを含んでもよい。実施態様で、コアは、１つまたは複数の生分解性ポリマーまたは生分解性部分を有するポリマーを含む。

適当な合成または天然の生体吸収性ポリマーを使用してもよい。このようなポリマーは、当業者により認識され、また同定され得る。合成の、生分解性ポリマーの非限定的な例としては、以下のもの等が挙げられる：ポリ（アミド類）たとえばポリ（アミノ酸類）およびポリ（ペプチド類）；ポリ（エステル類）たとえばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、およびポリ（カプロラクトン）；ポリ（無水物）；ポリ（オルトエステル類）；ポリ（カーボネート類）；およびそれらの化学誘導体（化学基、たとえば、アルキル、アルキレンの、置換、付加、水酸化、酸化および当業者により日常的に行われる他の修飾）、フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、澱粉、コラーゲン、およびヒアルロン酸、それらのコポリマー類および混合物。これらのポリマー類および他の適当なポリマー類の特性および放出プロフィールは既知であり容易に同定できる。

本明細書に記述されている、様々な実施態様で、コアはＰＬＧＡを含む。ＰＬＧＡは、所望の速度で治療薬を送達および放出するために使用される、よく知られた十分に試験された疎水性生分解性ポリマーである。

好ましくは，コアを形成するために使用されるポリマーの少なくとも一部は、疎水性部分と親水性部分を有する両親媒性である。疎水性部分はコアを形成することができ、親水性領域はナノ粒子が免疫系による認識を回避するのを助け、循環半減期を増すシェルに適するであろう。両親媒性ポリマーの例としては、疎水性ブロックと親水性ブロックを有するブロックコポリマー等が挙げられる。実施態様で、コアは、ブロックコポリマーの疎水性部分、疎水性ポリマー、またはそれらの組合せから形成される。

任意の適当な親水性ポリマーは、ブロックコポリマーの親水性ブロックを形成することが可能である。適当な親水性ポリマーの例としては、多糖類、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸等が挙げられる。実施態様で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ブロックコポリマーの親水性部分としての役割を果たすために使用される親水性ポリマーである。

ＩＩ．ターゲティング部分
本明細書に記述されているナノ粒子は、ナノ粒子をアポトーシス細胞に向けるか、またはアポトーシスのモニタリングを可能にする、１つまたは複数の部分を含む。実施態様で、ナノ粒子は、ナノ粒子をマクロファージに向ける部分を含む。ターゲティング部分は、コアの一部を形成する分子またはコアに結合されている分子への結合等の、任意の適当な方法でコアに繋留することが可能である。

実施態様で、ターゲティング部分は、コアの一部を形成する疎水性ポリマーに結合しているか、あるいはコアに結合しているかまたはコアの一部を形成するリン脂質等の脂質に結合している、親水性ポリマーに結合している。実施態様で、ターゲティング部分は、コアの一部を形成する疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの親水性部分に結合している。

親水性ポリマー、またはその一部は、適当な官能基を有するかまたは適当な官能基を有するように改変されているターゲティング部分との反応およびターゲティング部分への結合に適当な官能基、たとえば−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ等を含んでもよく、または含むように改変されていてもよい。

ポリマーおよび脂質に繋留されたターゲティング部分の例は、起こり得る反応のタイプおよび繋留を例示する目的で、この開示の至るところに提示されている。しかし、当業者は、ポリマー、脂質、ポリペプチド等へのターゲティング部分の繋留は、幾つかの既知の化学反応プロセスのいずれかに従って実施し得ることを理解するであろう。

ターゲティング部分は、任意の適当な濃度でナノ粒子中に存在することが可能である。実施態様で、インビボ試験または使用に先立って最適化するための初期インビトロ分析に基づいて濃度を容易に変更することが可能である。実施態様で、ターゲティング部分は、約１０％〜約１００％の表面被覆率を有する。

Ａ．アポトーシス細胞をターゲットするための部分
アポトーシス中の細胞かまたはまさにアポトーシスが起ころうとしている細胞に、ナノ粒子を向けるのに適当な部分を、ナノ粒子に組み入れることが可能である。実施態様で、ターゲティング部分はホスファチジルセリン（ＰＳ）をターゲットする。細胞膜外葉上へのＰＳ露出は、アポトーシスにおける最初の分子イベントの１つであるため、外膜に転位置したＰＳをターゲットすることは、アポトーシス細胞をターゲットする代わりになる可能性がある。

ＰＳをターゲットする任意の適当な部分を使用することが可能である。実施態様で、ＰＳ−ターゲティング部分は、高いアフィニティおよび特異性でＰＳを結合するポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、たとえばＢｕｔｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９），“Ｐｅｐｔｉｄｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＲＩ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ”，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．６：１９０３−１９１９に記述されている、ファージディスプレイ・ライブラリーの使用による等、任意の適当なメカニズムによって、当業者により容易に同定され得る。高いアフィニティおよび特異性でＰＳを結合するポリペプチドの非限定的例としては、下記のアミノ酸配列ＬＩＫＫＰＦ（配列番号１）、ＰＧＤＬＳＲ（配列番号２）、ＤＡＨＳＦＳ（配列番号３）等を含むポリペプチド等が挙げられる。

好ましくは、ポリペプチドは、ポリマーのペンダント反応基にコンジュゲートすることができるアミノ酸を含む。ポリペプチドとの反応のためにポリマーが有し得る反応基の例としては、マレイミド、グリシジル、イソシアネート、イソチオシアネート、活性化エステル類、活性化カーボネート類、無水物、スルフヒドリル等が挙げられる。例として、たとえばアミド結合形成によって、求核付加を可能にする官能性を有する天然または生物模倣型のアミノ酸を、適当な反応基を有するポリペプチドにコンジュゲートするためにポリペプチドに含めることが可能である。リシン、ホモリジン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびジアミノブタン酸は、ポリマーの反応基、たとえばカルボキシル基等へのコンジュゲーションに適した性質を有するアミノ酸の例である。加えて、Ｎ末端アミンがキャップされていなければ、ポリペプチドのＮ末端αアミンを使用して、ポリマーの適当な反応基にコンジュゲートすることが可能である。別の例として、ポリマーとポリペプチドとの間のジスルフィド結合形成を使用して、ポリペプチドをポリマーに結合することが可能である。ポリペプチドをポリマーに結合するために上述したものに類似した反応戦略を、ポリペプチドをリン脂質等の脂質に結合するために使用することが可能である。

実施態様で、ＰＳ−ターゲティングポリペプチドを、ＰＥＧ等の親水性ポリマーにコンジュゲートする。親水性ポリマーは、ナノ粒子のコアの一部を形成する疎水性ポリマー、たとえばＰＬＧＡ等に結合してもよく、またはリン脂質等の脂質に結合してもよい。脂質はコアの一部を形成してもよく、または疎水性相互作用によってコアに結合してもよい。本明細書の教示にしたがって使用することが可能な繋留されたＰＳ−ターゲティング部分の一例は、式Ｉ：

に示す構造を有するＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＬＩＫＫＰＦであり、
ここでｍ、ｎ、およびｏは、任意の適当な整数である。ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨをＰＥＧ−ＮＨ₂にカップリングして、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧを生じさせることが可能である。ポリペプチドのＰＥＧへのカップリングは、ＰＥＧのＰＬＧＡへのカップリングの前に生じてもよく、後に生じてもよい。ＰＬＧＡは、ナノ粒子のコアの一部を形成することが可能である。

本明細書の教示にしたがって使用することが可能な繋留されたＰＳ−ターゲティング部分の別の例は、式ＩＩ：

に示す構造を有するジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ−ＬＩＫＫＰＦである。

当然のことながら、ＰＳ−ターゲティング部分を含む、式ＩおよびＩＩの化合物は、例示の目的で示されており、他のポリマー、リン脂質またはＰＳ−ターゲティングポリペプチドを使用してもよい。

実施態様で、ＰＳ−ターゲティング部分は、亜鉛２，２’−ジピコリルアミン（Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ）配位化合物を含む。Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ錯体は、アネキシンＶのアポトーシスセンシング機能を模倣することが証明されている。亜鉛（ＩＩ）は、ＤＰＡの３つの窒素原子に配位した錯体を容易に形成する。亜鉛（ＩＩ）は、酸化還元活性ではなく、付着した色素の蛍光を消さないため、金属カチオンの実行可能な選択でもある。Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ ＰＳ−ターゲティング部分は、ＰＥＧ等の親水性ポリマーにコンジュゲートすることが可能である。親水性ポリマーは、ナノ粒子のコアの一部を形成する疎水性ポリマー、たとえばＰＬＧＡ等に、結合してもよく、またはリン脂質等の脂質に結合してもよい。脂質は、コアの一部を形成してもよく、または疎水性相互作用によってコアに結合してもよい。本明細書の教示にしたがって使用することが可能な繋留されたＺｎ²⁺−ＤＰＡ錯体の一例は、式ＩＩＩ：

に示す構造を有するＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡであり、
ここでｍ、ｎ、およびｏは、任意の適当な整数である。ＤＰＡ部分、たとえば２−（ビス（ピリジン−２−イルメチル）アミノ）エタンチオールは、マレイミド−ＰＥＧ−ＮＨ₂を使用してＰＥＧにカップリングさせてＮＨ₂−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡを生じさせることが可能であり、これをＰＬＧＡ−ＣＯＯＨにカップリングさせて、式ＩＩＩに示されているＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡを生じさせることが可能である。

本明細書の教示にしたがって使用することが可能な繋留されたＺｎ²⁺−ＤＰＡ錯体の別の例は、式ＩＶ：

に示す構造を有するＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡである。

当然のことながら、ＤＰＡ錯体を含む、式ＩＩＩおよびＩＶの化合物は、例示の目的で示されており、他のポリマーまたはリン脂質を使用してもよい。

ＰＳ結合の程度は、ナノ粒子中のＺｎ²⁺−ＤＰＡ部分の数によって異なる。より多いＺｎ²⁺−ＤＰＡ結合モチーフは、分子と膜の間の極性相互作用を増強し、同時にＰＳに対してより強い反応を生じることが証明されている。Ｚｎ²⁺−ＤＰＡは、好ましくは、アポトーシスの開始を示すＰＳの一部である、５％以下のＰＳを含有する二分子膜を検出する。種々の配置のジピコリルアミンと他の二金属センサーを含む、他の配位化合物を、Ｚｎ²⁺−ＤＰＡの代替として使用することが可能である。

理論に束縛されるものではないが、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡのＤＰＡ部分は、脂質層に埋伏されてＺｎ²⁺結合に容易に利用できなくてもよいと考えられている。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡを生成するためのＰＥＧ仲介物を介した、ＤＰＡ部分のリン脂質ジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）へのコンジュゲーションは、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡに比べてＺｎ²⁺結合の増加を招くことが分かっている（非表示データ）。

Ｂ．アポトーシスをモニターするための部分−ミトコンドリアターゲティング
アポトーシスのモニタリングに適した部分を、ナノ粒子に組み入れることが可能である。実施態様で、アポトーシスモニタリング部分は、ミトコンドリア基質におけるナノ粒子の蓄積を促進する部分である。ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の崩壊は、アポトーシスの開始期の特徴である。ミトコンドリア膜の崩壊と同時に、ミトコンドリア基質の成分が細胞質中に放出される。したがって、適当な造影剤を有するナノ粒子が、ミトコンドリア基質に向けられると、細胞質全体にわたってミトコンドリア基質からのナノ粒子の拡散を（造影剤により）観測することによって、ΔΨｍ（したがって、アポトーシスの開始）を検出することが可能である。例として、ミトコンドリア基質内のナノ粒子の蓄積は、非アポトーシス細胞を示し、細胞質全体にわたるナノ粒子の広汎性拡散は、アポトーシスの初期段階の細胞を示す。

ミトコンドリア基質内のナノ粒子の蓄積を促進するのに適した部分を使用してもよい。ミトコンドリア内膜を隔てて維持される電気化学電位は実質的に負であるため、非局在化した親油性カチオンが疎水性膜の横断およびミトコンドリア基質内での蓄積に有効である。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）含有化合物は、ミトコンドリア基質内に１０００倍超蓄積できる。任意の適当なＴＰＰ含有化合物を、ミトコンドリア基質ターゲティング部分として使用することが可能である。ＴＰＰをベースとする部分の代表例は、式Ｖ、式ＶＩまたは式ＶＩＩ：

または

で以下に示す構造を有することが可能であり、
ここで、（描かれている）アミンは、ナノ粒子に組み入れるために、ポリマー、脂質等にコンジュゲートすることが可能である。

実施態様で、ミトコンドリア基質をターゲットするための非局在化した親油性カチオンはローダミンカチオン、たとえば以下に示す式ＶＩＩＩを有するローダミン１２３等である：

ここで、（描かれている）二級アミンは、ナノ粒子に組み入れるために、ポリマー、脂質等にコンジュゲートすることが可能である。

もちろん、非−カチオン性化合物は、ターゲットしてミトコンドリア基質中での蓄積に役立つことが可能である。例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ターゲットおよびミトコンドリア基質中でのナノ粒子の蓄積に役立つことができる。適当なＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、ミトコンドリア基質ターゲティング部分として使用することが可能である。適当なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定的例としては、以下に示す、それぞれ式ＩＸおよび式Ｘを有する、ＳＳ−０２およびＳＳ−３１等が挙げられる：

または

ここで、（描かれている）二級アミンは、ナノ粒子に組み入れるために、ポリマー、脂質等にコンジュゲートすることが可能である。

例の目的で、ジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ−ＴＰＰを合成するための反応スキームを、以下にスキームＩに示す。当然のことながら、他のスキームを使用して、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰを合成することが可能であり、また類似した反応スキームを使用して他のミトコンドリアのターゲティング部分をＤＳＰＥ−ＰＥＧに繋留したり、部分を他のポリマー、コポリマー、または脂質に繋留したりすることが可能である。

Ｃ．マクロファージをターゲットするための部分
アテローム性動脈硬化症病変の特徴である、マクロファージ細胞に対するナノ粒子のアフィニティを高めるために、マンノースまたは他の単糖部分をナノ粒子に組み入れることが可能である。単糖類、たとえばマンノースおよびガラクトース等は、受容体を介して、マクロファージと選択的に相互作用することが可能である。たとえば、マクロファージはマクロファージマンノース受容体および選択的にガラクトースを結合するレクチン（マクロファージガラクトース−結合性レクチン）を含む。こうした選択的相互作用を介して、そのような単糖類またはそのような単糖類を含む化合物の存在を使用してナノ粒子をマクロファージに向けることが可能である。実施態様で、マクロファージターゲティング部分は、マンノース、ガラクトースまたはラクトビオン酸を含む。

単糖類の存在は、ナノ粒子とマクロファージとの相互作用を促進するので、ナノ粒子が所望の位置、たとえば動脈硬化性プラーク等に到達するまで、細網内皮系（ＲＥＳ）への露出を最小限に抑えるために、糖部分はナノ粒子の中に隠されていることが望ましい。

適当な方法で、糖部分を一時的に隠すことが可能である。実施態様で、糖部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の親水性ポリマー；ＰＥＧブロックを含むブロックコポリマー等の、ポリマーの親水性部分；コアに結合されているかまたはコアを、少なくとも部分的に、形成する化合物の一部である、脂質に結合した親水性ポリマー；等によって隠されている。シールディングポリマーは、ナノ粒子のコアの一部を形成することが可能であり（たとえば、ポリマーがブロックコポリマーであり、且つポリマーの疎水性ブロックがコアの形成に寄与するとき）、あるいは別の方法でコアに結合することも可能である。

好ましくは、ナノ粒子がその標的位置、たとえば動脈硬化性プラーク等に到達したとき、シールディングポリマーはナノ粒子から放出可能であり、マクロファージ−ターゲティング部分を露出する。たとえば、シールディングポリマーは、切断可能なリンカーによって、コア、ポリマー，脂質等に結合され得る。切断可能なリンカーは、標的位置に到達したとき切断され得る。任意の適当な切断可能なリンカーを使用することが可能である。実施態様で、切断可能なリンカーはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって切断可能なペプチドリンカーである。ＭＭＰ２によって切断可能なペプチドリンカーの一例は、アミノ酸配列ＧＰＬＧＶＲＧ（配列番号４）を有するポリペプチドである。使用されるリンカーと関係なく、切断は好ましくは、動脈硬化性プラークに存在する切断酵素（ＭＭＰ等）濃度以下で起こる。実施態様で、切断可能なリンカーの切断はマクロファージ−ターゲティング部分の露出を来たす表面スイッチングを誘導する。

使用することが可能な他の切断可能なリンカーは、グルタチオン、ｐＨ変化、温度変化等によって切断を受けやすいものである。

ポリマー、脂質等に結合したマクロファージターゲティング部分の非限定的例としては、短い親水性ポリマー鎖、たとえばＰＥＧ₅₀₀等に結合したマンノース、ガラクトース、またはラクトビオン酸等が挙げられる。実施態様で、短い親水性ポリマー鎖は、脂質または親水性ポリマーによってコアに結合されている。たとえば、ＰＥＧ₅₀₀は、コアの一部を形成する疎水性ポリマー、たとえばＰＬＧＡ等に結合され得る。実施態様で、短い親水性ポリマーは、コアまたはコアの一部を形成する親水性ポリマーに結合されている脂質、たとえばジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等に結合されている。大きい親水性鎖、たとえばＰＥＧ₃₄₀₀等は、シールディングポリマーとしての役割を果たすことが可能である。シールディングポリマーは、疎水性ポリマー、脂質等によってコアに結合され得る。シールディングポリマーは、切断可能なリンカーによって疎水性ポリマー、脂質等に結合され得る。

実施態様で、マクロファージターゲティング部分は、ＰＬＧＡに結合されているＰＥＧ、たとえばＰＥＧ₅₀₀等に結合されている（すなわち、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ターゲティング部分）。実施態様で、マクロファージターゲティング部分は、ＤＳＰＥに結合されているＰＥＧ、たとえばＰＥＧ₅₀₀等に結合されている（すなわち、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ターゲティング部分）。

実施態様で、シールディングポリマー、たとえばＰＥＧ₃₄₀₀等は、ＰＬＧＡに結合されており（すなわち、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）また切断可能なリンカーによってＰＬＧＡに結合され得る（すなわち、ＰＬＧＡ−リンカー−ＰＥＧ）。実施態様で、シールディングポリマー、たとえばＰＥＧ₃₄₀₀等は、ＤＳＰＥに結合されており（すなわち、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、また切断可能なリンカーによってＤＳＰＥに結合され得る（すなわち、ＤＳＰＥ−リンカー−ＰＥＧ）。

マクロファージ−ターゲティング部分は、任意の適当な方法でポリマーまたは脂質に結合することが可能である。例として、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノースは、たとえば、下記の反応スキーム：

に示す通り、Ｄ−マンノサミン塩酸塩とＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨとのアミドカップリングによって合成することが可能であり、
ここで、ＥＤＣは、１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）−プロピル）カルボジイミドである。

ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ラクトビオン酸は、下記の反応スキーム：

に従って合成することが可能である。

当然のことながら、スキームＩＩおよびＩＩＩに示されている反応スキームは例示のためであって、他の反応スキーム、ならびに他のリン脂質、ポリマー、またはマンノースあるいはガラクトース含有化合物を使用してもよい。

ＩＩＩ．リン脂質単分子層
実施態様で、ナノ粒子は、ナノ粒子の疎水性コアと親水性シェルとの界面に存在してもよいリン脂質単分子層を含む。単分子層のリン脂質は、ナノ粒子の疎水性コアと相互作用する疎水性尾部を有する。このようにリン脂質を使用して、様々な成分、たとえばターゲティング部分や造影剤等を、コアに繋留することが可能である。脂質層はまた、コア内の薬剤がコアから自由に拡散するのを防止するのにも役立つことができ、またコアへの水浸透を減らすことも可能である。

任意の適当な脂質またはリン脂質を使用することが可能である。使用することが可能な脂質またはリン脂質の例としては、レシチン、種々の鎖長のＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ含有分枝ＰＥＧ等が挙げられる。好ましくは、脂質は生分解性である。実施態様で、リン脂質単分子層を形成するために使用される脂質はジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。

上述の通り、脂質を使用して様々な成分をコアに繋留することが可能である。実施態様で、繋留された成分は、介在ポリマー、好ましくはＰＥＧ等の親水性ポリマーによって、さらに繋留される。脂質は、様々なポリマー（適当な反応基を有するかまたは有するように改変されていてもよい）、または他成分（適当な反応基を有するかまたは有するように改変されていてもよい）との反応および結合のための反応基を含んでもよく、または反応基を含むように改変されていてもよい。

脂質ベースの繋留された分子の例としては、上で論じたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ラクトビオン酸、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノース、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰ等が挙げられる。当然のことながら、他のリン脂質および親水性ポリマー（ＤＳＰＥおよびＰＥＧ以外）を使用してもよい。さらに当然のことながら、ＤＰＡ、ＰＳ−結合性ポリペプチド等の部分は、介在親水性ポリマー中にあっても無くても、リン脂質に同様の方法で繋留され得る。

ＩＶ．ＨＤＬ成分
実施態様で、ナノ粒子は、ＨＤＬまたはＨＤＬ−模倣成分を含む。ＨＤＬは、泡沫細胞からコレステロールを除去することにより、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）の酸化を阻止することにより、また、アテローム性動脈硬化症の根底にある炎症プロセスを制限することによって、アテローム性動脈硬化症に直接抵抗する。ＨＤＬはまた抗−血栓形成特性も有する。このように、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、幾つかの主要段階でアテローム形成のプロセスを中断する。泡沫細胞からのコレステロール流出を促進するａｐｏＥに加えて、ＨＤＬを含有するａｐｏＡ−１は、病変からのコレステロールの輸送を促進すると考えられる。したがって、ＨＤＬ成分および関連成分、たとえばａｐｏＡ−１蛋白質またはその合成模倣物等を、動脈硬化性病変をターゲットするナノ粒子に組み入れることは、ＡＴＶＤまたはＣＨＤに罹患した患者に大きな利益を提供する可能性がある。

実施態様で、ナノ粒子に組み入れられるＨＤＬ成分はコレステロール、たとえばコレステリルオレイン酸、ヒト血漿から再構成されたＨＤＬ等である。実施態様で、コレステロールは、ナノ粒子の疎水性コアに組み入れられるか、またはナノ粒子の疎水性コアの一部を形成する。実施態様で、ナノ粒子中に存在する場合、リン脂質単分子層にコレステロールを組み入れることが可能である。

ａｐｏＡ−１または適当なａｐｏＡ−１ペプチド模倣物をナノ粒子に組み入れてもよい。ａｐｏＡ−１ペプチド模倣物の一例は、アミノ酸配列ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（配列番号５）を有するポリペプチドである。ａｐｏＡ−１またはａｐｏＡ−１模倣物は、特に、ナノ粒子がリン脂質単分子層を含む場合、ナノ粒子に自己組織化する傾向があり、したがってポリマーまたは脂質等の他成分に繋留される必要がない。しかし、そのようなポリペプチドは、ポリマーまたは脂質に繋留されていてもよい。

実施態様で、自己組織化したａｐｏＡ−１ペプチドネットワークおよびコロイド状のリン脂質単分子層は血漿由来ＨＤＬを模倣する。

Ｖ．造影剤
本明細書に記述されているナノ粒子（ＮＰ）は、撮像、可視化または診断のために１つまたは複数の造影剤を含むことが可能である。任意の適当な造影剤を使用することが可能である。実施態様で、造影剤は、インビボ磁気共鳴画像（ＭＲＩ）に適した、たとえば酸化鉄（ＩＯ）ナノ結晶等である。実施態様で、造影剤は、イクスビボ／インビボ光学イメージングに適した、たとえば量子ドット（ＱＤ）（蛍光）、ｃｄｏｔｓ、ｐｄｏｔｓ等である。実施態様で、ナノ粒子は、ＭＲＩ用造影剤と蛍光光学イメージング用造影剤の両方を含む。

補完的撮像剤を含む１つの構築物は、アテローム性動脈硬化症に非常に役立つ可能性がある。蛍光（ＱＤ）プローブとＭＲＩ（ＩＯ）プローブの両者を担持できるＮＰは、独特のプラットホームを表し、少数の例を挙げれば、炎症性アテローム性動脈硬化症、塞栓後治癒、移植拒絶反応、および初期の大動脈弁疾患の試験で、広い前臨床用途がある。こうした造影剤は、蛍光による高い撮像感度とＭＲＩによる高い空間解像度の両者を達成することを可能にし、蛍光撮像の限られた撮像深さを補うのにも役立つ。脆弱なプラークにおけるアポトーシスマクロファージの撮像を可能にするための蛍光とＭＲＩ造影剤の両者を含むターゲテドシングルＮＰプラットホームは、脆弱な冠動脈プラークと関連した微小血栓の撮像を含む、多くの前途有望なヒト適用のための門戸を開くことが可能であろう。

ＱＤもＩＯも、同じサイズ範囲および類似したキャッピングリガンドで合成できるため、ＮＰプラットホームは一様になり、ＮＰの全体的な特性を大きく変えずに、成分の簡易交換を可能にすることができる。このプラットホームを使用してエクスビボで見られる、より高い蛍光信号の局所領域は、ＭＲＩによりインビボで同定される脆弱なプラークとの相互関係を示すのに有用であろう。

任意の適当な方法で、造影剤をＮＰに組み入れることが可能である。実施態様で、造影剤は、コアに組み入れられるかまたはコアの中に含まれる。実施態様で、造影剤は、脂質、ポリマー、蛋白質またはナノ粒子の他成分に繋留されている。そのような繋留は、ナノ粒子の他成分、たとえばターゲティング部分に関して上述された通りに実施することができる。

例として、本明細書に記述されている通り、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤを生成するためにＰＬＧＡ−ＣＯＯＨにコンジュゲートされたＱＤ−コンジュゲーテド・アミン−終端ＰＥＧ（ＮＨ₂−ＰＥＧ−ＱＤ）を形成するために、ＱＤはＰＥＧにコンジュゲートされている。

造影剤は、適量で、ナノ粒子中に存在してもよい。実施態様で、造影剤はナノ粒子中に、ナノ粒子の約０．０５重量％〜約２０重量％存在する。

ＶＩ．治療薬
ナノ粒子は、本明細書に記述されている通り、１つまたは複数の治療薬を含むことが可能である。治療薬は、ナノ粒子のコアの中に包埋されてもよく、または含まれてもよい。好ましくは、治療薬は、所望の速度でコアから放出される。コアが周知かつ十分に試験されたポリマー（たとえばＰＬＧＡ等）またはポリマーの組合せから形成される場合、放出速度は容易に制御することができる。

実施態様で、治療薬またはその前駆体は、ターゲティング部分に関して上述された方法で、ポリマー、脂質等にコンジュゲートされる。ナノ粒子が標的位置、たとえばアポトーシスマクロファージ等に到達したとき治療薬が放出され得るように、治療薬を、切断可能なリンカーによってコンジュゲートすることが可能である。

治療薬は、任意の適当な濃度でナノ粒子中に存在することが可能である。たとえば、治療薬はナノ粒子中に、ナノ粒子の約０．０１重量％〜約２０重量％の濃度で存在してもよい。

実施態様で、ナノ粒子は、血管プラーク、ＡＴＶＤ、またはＣＨＤの治療に有用な１つまたは複数の治療薬を含む。たとえば、ナノ粒子は、１つまたは複数のスタチン、１つまたは複数のフィブラート、またはそれらの組合せを含んでもよい。適当なスタチンとしては、アトバスチン、シンバスタチン、およびロバスタチン等が挙げられる。適当なフィブラートとしては、ベザフィブラート、フェノフィブラート、およびゲムフィブリゾル等が挙げられる。実施態様で、アトルバスタチンは、シンバスタチン、ロバスタチン、ベザフィブラート、フェノフィブラート、またはゲムフィブリゾルの１つまたは複数と組み合わせて存在する。

実施態様で、ナノ粒子は、ケノデオキシルコール酸またはＰＣＳＫ９の他のリプレッサー（たとえば、ｓｉＲＮＡ）を含む。ＰＣＳＫ９の抑制は肝臓のＬＤＬ受容体低下を促進し、スタチンまたはフィブラートは、併用したとき、それらの有効性を増強する可能性がある。

ＶＩＩ．ナノ粒子のサイズ
ナノ粒子は、本明細書に記述されている通り、任意の適当なサイズであってもよい。一般に、ナノ粒子は直径の寸法が約９９９ｎｍ未満、たとえば約７５０ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００未満、約３００ｎｍ未満、または約２００ｎｍ未満等である。加えて、または或いは、ナノ粒子は、約５ｎｍより大きい直径寸法であってもよい。実施態様で、ナノ粒子は直径約３０ｎｍ〜約３００ｎｍである。実施態様で、ナノ粒子はサイズによって、たとえば約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ等に、分けられる。

適切な場合、ナノ粒子のサイズは、生体分布およびミトコンドリアの取り込みに影響を及ぼす可能性がある一要素である。

ＶＩＩＩ．ナノ粒子の合成
ナノ粒子は、本明細書に記述されている通り、任意の適当な方法で合成するかまたは集合させることが可能である。好ましくは、プロセス変動を最小限に抑えるために、ナノ粒子は一段階で集合させる。一段階プロセスは、ナノ沈殿および自己集合を含んでもよい。

概して、ナノ粒子は、好ましくは、沈殿に使用される水性溶媒中で混和性である有機溶媒に、疎水性成分を溶解または懸濁することによって、合成または集合させることが可能である。実施態様で、アセトニトリルが有機溶媒として使用されるが、任意の適当な溶媒を使用してもよい。親水性成分は、適当な水性溶媒、たとえば水、４重量％エタノール等に溶解される。水性溶媒中で疎水性成分をナノ沈殿させてナノ粒子の自己集合を可能にするために、有機相溶液を水相溶液に滴加してもよい。

ナノ粒子を形成するために適当な条件を決定するプロセスは、下記の通りであってもよい。簡単に記載すると、官能化ポリマーおよびリン脂質を有機溶媒混合物に共溶解することが可能である（実施態様で、リン脂質または官能化リン脂質は、水性溶媒に溶解される）。この溶液は、熱い（たとえば６５℃）水性溶媒（たとえば、水、４重量％エタノール等）に滴加することが可能であり、溶媒が蒸発すると直ぐに、リン脂質で被覆された疎水性コアを有するナノ粒子が生成する。この段階で使用されるリン脂質は、親水性ポリマー成分、たとえばＰＥＧ等も含むことが可能な、非官能化リン脂質と官能化リン脂質（たとえば、ターゲティング部分にコンジュゲートされた）の混合物であってもよい。高い（たとえば、＞７５％）ターゲティング部分表面負荷レベルが達成されている、一組の条件がいったん達成されたら、造影剤または治療薬を、ナノ粒子のナノ沈殿および自己集合に含めることが可能である。

手動混合で、結果が好ましく再現できない場合、微少流体チャネルを使用してもよい。

ＮＰ表面に多数のＺｎ²⁺−ＤＰＡＰＳ結合部位を形成するために、表面にＤＰＡ部分を含むナノ粒子の水性懸濁液を、Ｚｎ（ＮＯ₃）₂．６Ｈ₂Ｏの水溶液と反応させることが可能である。ＮＰ中の造影剤（ＩＯまたはＱＤ等）およびＺｎ²⁺負荷は、ＩＣＰ−ＭＳで定量化することが可能である。治療薬負荷およびカプセル化効率（ＥＥ）は、ＨＰＬＣで測定することが可能である。

結果として得られるＮＰは、テストしてその物性を特性化することが可能である。たとえば、ＰＥＧ鎖の切断に対するＭＭＰ２の作用は、粒径測定によって立証することが可能である。好ましくは、切断は、動脈硬化性プラーク中のＭＭＰ２濃度より低いＭＭＰ２濃度で見られる。こうした所望の特性について、ＮＰのライブラリーをスクリーニングすることが可能である。

周知の方法または公開された方法を使用して、サイズ、電荷、安定性、ＩＯおよびＱＤ負荷、薬物負荷、薬物放出速度論、表面形状、および安定性についてＮＰを特性化することが可能である。

（ａ）ポリマー溶液の組成を調節すること、および（ｂ）混合時間、温度、および水と有機溶媒との比率等の、混合条件を調節することによって、ＮＰ特性を調節することが可能である。合成に必要な加工ステップ数が増加するにつれて、ＮＰ特性の変動の可能性が高まる。

生成されるナノ粒子のサイズは、疎水性コア成分と両親媒性シェル成分との比率を変更することによって変えることができる。ペグ化脂質および二層形成性リン脂質の選択は、結果として生じるナノ粒子のサイズに影響を及ぼす可能性がある。ＰＥＧ鎖によって表面張力が課せられるため、ペグ化脂質は小さいミセル構造を形成することが知られている。ＮＰのサイズはまた、ポリマー長さを変えることによって、混合時間を変えることによって、および有機相との比率を調整することによっても、調節することができる。種々の長さのＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧからのＮＰを用いた先の経験から、短いポリマー（たとえばＰＬＧＡ₃₀₀₀〜ＰＥＧ₇₅₀）での最小限約２０ｎｍから長いポリマー（たとえばＰＬＧＡ_100,000〜ＰＥＧ_10,000）での最大限約１５０ｎｍまで、ＮＰ粒径が増加することが示唆される。このように、ポリマーの分子量は、サイズを調整するのに役立つであろう。

ＮＰ表面電荷は、適切に帯電した末端基を有するポリマーを混合することによって調節することができる。さらに、種々の親水性ポリマー長さを有するポリマー、分枝親水性ポリマーを混合することによって、または疎水性ポリマーを加えることによって、組成および表面化学を調節することができる。

いったん形成されたら、遠心分離、遠心限外濾過等で、ナノ粒子を集めて洗浄することが可能である。凝集が起きた場合、ＮＰを透析によって精製することができる、より低速度で、より長時間の遠心分離によって精製することができる、界面活性剤の使用によって精製することができる等である。

いったん集めたら、あらゆる残りの溶媒を除去して、粒子を乾燥させることが可能であり、それは成分の早期破壊および放出を最小限に抑えるのに役立つはずである。ＮＰは、マンニトール等の増量剤を使用して凍結乾燥してもよく、使用前に他の方法で保存の準備をしてもよい。

例示のために、マクロファージ、ミトコンドリア基質−ターゲテドＨＤＬ模倣ポリマー脂質ハイブリッドのナノ沈殿および自己集合のために使用することが可能な反応スキームの一例を、図１Ａに示す反応スキームに描く。描かれている通り、コレステリルオレイン酸、ＰＬＧＡおよびＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤを含む有機相が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰ、ＤＳＰＥ−ラクトビオン酸、およびａｐｏＡ−Ｉペプチド模倣物を含む水相中でナノ沈殿し、結果として生じる混合物を渦巻き撹拌し、撹拌してナノ粒子を自己組織化させる。図１Ｂは、反応スキームに関する追加的な詳細を提供する。水相を加熱し、穏やかに撹拌しながら水相に有機相を滴加することが可能である。結果として生じる混合物を適当な時間、たとえば約３分間、渦巻き撹拌し、たとえば、室温で、適当な時間（たとえば、約２時間）穏やかに撹拌して自己集合させることが可能である。適当な方法、たとえば洗浄および適当な分子量カットオフ（たとえば、約１００００Ｄａ）で遠心濾過機を使用して、溶媒および遊離分子を除去することが可能である。

有機相成分は、有機溶媒、たとえばアセトニトリル等の中に、適当な濃度、たとえば約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ等で、存在してもよい。水相成分は、水性溶媒、たとえば４重量％エタノールの中に、適当な濃度で存在してもよい。有機相のナノ沈殿後、ａｐｏＡ−１ペプチドは、ＰＬＧＡポリマーに対して１５％の重量比で存在してもよい。

表示されていないが、当然のことながら、治療薬はそれらの溶解度によって有機相または水相に入れることが可能である。たとえば、ほとんどのスタチンまたはフィブラートは有機相に溶解することができる。ケノデオキシコール酸は水相に溶解することができる。

図２Ａ〜Ｂは、ナノ粒子の実施態様を調製するための別の反応スキームを例示する。描かれた反応スキームＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡ、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＬＩＫＫＰＦＧ、およびＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−マンノースは、有機溶媒、たとえばＤＭＦ等に溶解して、水性溶媒中でナノ沈殿することが可能であり、図２Ｂに図式的に表されたナノ粒子へと自己組織化させる。

当然のことながら、図１Ａ〜Ｂおよび２Ａ〜２Ｂに描かれた反応スキームおよび成分は、例示のためだけであって限定するためのものではない。当然のことながら他の成分および反応スキームを使用して、本明細書に記述されているナノ粒子を製造することが可能である。

本願が優先権を主張する仮特許出願に示されている通り、実施態様で、ＮＰコアはＰＬＧＡマトリックスを含み、またコアは官能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖で被覆されている。コンジュゲートされたＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧブロックコポリマーは、生体系におけるその調節された生分解性、安全性、および相溶性のために選択される。多機能ＰＥＧはまた、動脈硬化性プラークにおけるアポトーシスに対するターゲティング部分のコンジュゲーションおよび結合を可能にする。最初に、ターゲティングリガンドをブロックコポリマーに付着させることによって、またはリガンドをヘテロ官能性ＰＥＧ鎖に付着させ、次いでＰＬＧＡにコンジュゲートすることによって、ＮＰの合成が遂行された。コンジュゲーションで使用される試薬としては：１−プロパンホスホン酸環状無水物（Ｔ３Ｐ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣ）（表１）等が挙げられるが、その限りではない。

混合沈殿法によって高分子ナノ粒子を製造するために官能化ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧポリマーの組合せを結合した。ナノ沈殿は、フルオロフォアまたはＭＲＩ造影剤をカプセル化してまたはカプセル化せずに、様々なｍｇ／ｍＬ濃度でポリマーを有機溶媒に溶解し、ポリマー溶液を水に滴加することによって遂行された。ナノ沈殿で使用される溶媒としては、とりわけ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルママミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）等が挙げられる。パーセント組成を調整することによって、重量基準でナノ沈殿ブレンドした官能化ポリマーの複数の組成、ならびにナノ粒子粒径およびターゲティング能力のさらなる最適化を実施することが可能である。

ブレンドされたナノ沈殿法の代わりとして、ＰＬＧＡコアを、長循環特性を保証する表面−スイッチング脂質ポリエチレングリコールコンジュゲートで被覆してもよい。ハイブリッドナノ粒子合成は、リン脂質および１，２−ジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボキシから有機溶媒に溶解されたポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を含む。ＰＬＧＡ、疎水性リン脂質、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ鎖は、ＮＰへと自己組織化する。ＤＳＰＥ−ＰＥＧをリン脂質単分子層に組み入れることは、ＮＰプラットホームを安定化し、より長いインビボ循環を提供する。さらに、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ鎖のカルボキシ末端は、アポトーシスターゲティング部分の結合を可能にする。ＰＳ−センシングおよびマクロファージ−ターゲティングリガンドは、ＮＰ表面に直接コンジュゲートすることが可能である。ＰＬＧＡおよびＰＥＧの濃度を調節することによって、ＰＥＧ鎖のサイズおよび数が変化する。表面に加える官能化リガンドの量を最適化することが可能である。ＰＬＧＡ−ＰＥＧＮＰを製造するために、微少流体急速混合を含むテクニックも使用することが可能である。高分子ナノ粒子を包囲するリガンド−官能化金ナノ粒子からなる構築物も、動脈硬化性プラークの検出および動脈硬化性プラークのための潜在的薬物送達媒体に使用することが可能である。

臨床撮像法でＮＰ蓄積の可視化を可能にするために、ＰＬＧＡコアは、それぞれ蛍光または磁気共鳴画像のために、フルオロフォアまたは酸化鉄ナノ結晶の何れかを組み入れることが可能である。撮像剤の包含は、同様の自己集合方法によって遂行することが可能である。フルオロフォアカプセル化の共焦点イメージングを撮影して、負荷を最適化することが可能である。十分な負荷が確認された後、文献の方法で合成される可変濃度による酸化鉄ナノ結晶をカプセル化することが可能である。ＩＯ濃度を変更して、ＭＲＩに適した負荷効率を達成することが可能である。アポトーシスを化学的に誘導してまた誘導をせずに、ヒトおよびネズミマクロファージ細胞株を使用して、ＮＰ構築物のＰＳセンシング能力を評価することが可能である。

ＩＸ．使用およびテスト
概して、本明細書に記述されているナノ粒子は、アポトーシス細胞に向けることが可能であり、また細胞のアポトーシスをモニターするのにも有用な可能性がある。好ましくは、ナノ粒子は、動脈硬化性プラーク内のマクロファージをターゲットする。しかし、ナノ粒子は他のアポトーシス細胞、たとえば癌細胞等をターゲットすることもある。

アポトーシス細胞個体群の可視化、撮像、モニタリング、診断、または処置に、ナノ粒子を使用することが可能である。たとえば、動脈硬化性プラークまたはその関連疾病、たとえばＡＴＶＤやＣＨＤ等の、可視化、撮像、モニタリング、診断、または処置に、ナノ粒子を使用することが可能である。

本明細書で製造されるナノ粒子の性能および特徴は、任意の適当な方法でテストまたは試験することが可能である。例として、細胞ベースのコレステロール低下アッセイを使用して、治療効果を評価することができる。毒性、生体分布、薬物動態学、および有効性試験を、齧歯類または他の哺乳動物でテストすることができる。ゼブラフィッシュモデルを、撮像および治療複合試験に使用することができる。動脈硬化のウサギおよびブタを使用して、ナノ粒子の診断または治療可能性をさらに評価することが可能である。ナノ粒子の性能または特性を評価するために実施することが可能な試験の幾つかの補足的詳細は、ナノ粒子の性質を最適化する目的で使用することが可能であり、後述する。しかし、当業者は、他のアッセイおよび手順を容易に実施することができる。

蛍光ＱＤをカプセル化したナノ粒子（ＮＰ）の取り込み特性および結合特性は、任意の適当な細胞株、たとえばＲＡＷ２６４．７，Ｊ７７４，ｊｕｒｋａｔ，およびＨＵＶＥＧｓ細胞等で、評価されるであろう。こうした細胞が様々な濃度のＮＰに曝露されるとき、サイトカインの放出を測定することによって、ＮＰＳの免疫調節任務をアッセイすることが可能である。たとえばＳａｌｖａｄｏｒ−Ｍｏｒａｌｅｓ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ｆａｒｏｋｈｚａｄ ＯＣ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ-ｐｏｌｙｍｅｒ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０：２２３１−２２４０，（２００９）に記述されている通り、オプソニン化されたＮＰを単離するためにカラムを使用して、どの経路が誘発されるかを同定するために補体活性化を試験することが可能である。蛍光測定は、プレートリーダー、ＦＡＣＳ等を使用して、実施することが可能である。ＮＰのサイズは生体分布を決定する重要な因子であるため、ＮＰは様々なサイズ（たとえば、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、および１５０〜３００ｎｍ）に分け、サイズに従ってテストすることが可能である。

平滑筋細胞（ＳＭＣ）、マクロファージ、および内皮細胞は、動脈硬化性プラークで対象となる主要な細胞型である。こうした細胞型における、ＭＭＰ２があるまたはＭＭＰ２が無いＮＰの取り込みは、ハイスループット蛍光撮像テクニックで評価することが可能である。ナノ粒子が、マクロファージ結合部分を保護するＭＭＰ２切断可能なリンカーを有するシールディングポリペプチドを含む場合（たとえば、マンノース、ガラクトース、ラクトビオン酸）、ＮＰがマクロファージおよびＭＭＰ２と共にインキュベートされる場合にのみ、ＮＰの受容体−仲介取り込みが認められるであろうことが予想される。そのような取り込み実験の結果は、ＭＭＰ２および管理状況下でインキュベートされた細胞のペレットのＭＲＩ撮像を使用して確認することが可能である。細胞ペレットのＭＲＩ測定は、３８ｍｍ伝送および受信１Ｈ直交コイルを使用した７Ｔシステムで実施することが可能である。アガロースファントムをバックグラウンド信号とする、ＭＲＩシステムに、４〜６個のセルバイアル一組を入れることができる。種々の濃度のセルバイアルの単一薄片Ｔ２＊、Ｔ２、およびＴ１イメージを得ることが可能である。Ｔ２＊加重は、単一薄片多勾配エコーシーケンスを使用して達成することが可能である。定量的Ｔ２測定は、Ｃａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌシーケンスを使用して実施することが可能である。こうした測定値から、ｒ１、ｒ２およびｒ２＊緩和能を算出することが可能である。こうしたエクスビボ想定値を使用して、最適濃度、撮像シーケンス、インビボ撮像のためのパラメータの決定に役立つことが可能である。アポトーシス検出には、Ｊｕｒｋｅｔ細胞を使用することが可能である。ＭＲＩ撮像の場合もＦＬ撮像の場合も、アポトーシスを誘導するために細胞をエトポシド処理することができる。アネキシン−Ｖをコントロールとして使用することが可能である。加えて、壊死細胞に優先してアポプトシス細胞に向かう選択性は、壊死細胞に入る、ＤＮＡインターカレータ ７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色によって評価することが可能である。

ＮＰ製剤中の治療薬、たとえばスタチン、フィブラート、またはそれらの併用等の効果は、早期アテローム形成の特徴である酸化されたＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）によって形成されるマクロファージ−由来の泡沫細胞で試験することが可能である。泡沫細胞形成については、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを様々な用量のｏｘＬＤＬで処置し、続いてＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色することが可能である。泡沫細胞形成後、こうした細胞を、治療薬を含有するターゲッテドＮＰで処置することが可能である。ヘキサン／イソプロパノール（３／２、ｖ／ｖ）中で細胞を超音波処理して２４時間抽出することにより、細胞脂質を得ることが可能である。遠心分離で細胞屑を除去した後、上澄を窒素フラッシュ下で乾燥させ、イソプロパノールに再溶解することが可能である。総コレステロールは、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔで測定することができる。

ＮＰがＩＯ−ＱＤおよびスタチン等の治療薬を含む拡大複合型撮像および治療試験を実施するために、好ましくは細胞培養系を使用したインビトロテストおよび最適化の後で、ゼブラフィッシュモデルを使用することが可能である。開発初期の問題をはらむ製剤を除去するために、主要なＮＰの撮像および治療効果を、ゼブラフィッシュで評価することが可能である。スタチン併用の有効性およびＮＰ構築物の撮像能力は、高−コレステロール食餌（ＨＣＤ）−給餌ゼブラフィッシュ幼生で評価することが可能である。ゼブラフィッシュを使用する利点は、それらの幼生が発生後約３０日目まで光学的に透明なことであり、生きた動物における蛍光プローブの一時的観察が可能である。ヒトアテローム形成に関係がある、ゼブラフィッシュで達成された高コレステロール血症およびリポ蛋白質酸化ならびに炎症プロセスにおける血管脂質蓄積の特徴によって、ゼブラフィッシュモデルは魅力的なインビボ系になっている。ＨＣＤ−給餌ゼブラフィッシュ幼生で、ＮＰがコレステロール値を低下させる能力を試験することが可能である。野生型（ＡＢ）ゼブラフィッシュ胚は、１４／１０時間 明／暗周期で、２８℃に維持された成体のインビトロ受精および自然産卵によって得ることが可能である。ゼブラフィッシュ幼生に、コントロール食餌またはＨＣＤを１日２回給餌することが可能である。ゼブラフィッシュ幼生に、ＮＰをｉ．ｖ．注射することが可能である。処置期間後、共焦点顕微鏡を使用して撮像を実施することが可能である。ゼブラフィッシュ幼生は、０．０５％トリカインに曝露することにより安楽死させることが可能であり、未消化の餌を含む腹部を除去し、残りの身体をプールして穏やかにホモジナイズすることが可能である。総脂質リポイド抽出は、１：２メタノール／ジクロロメタンで実施することが可能である。コレステロールエステルを鹸化して、総コレステロールを測定することが可能である。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定または他の適切な統計解析を使用して、２群間の平均値の差を解析することが可能である。

生体分布（ｂｉｏＤ）および薬物動態（ＰＫ）試験は、ラットまたは他の適当な哺乳動物で実施することが可能である。ＰＫおよびｂｉｏＤ分析の場合、側尾静脈注射によって、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、ＱＤ−標識した、アポトーシス−ターゲティング、マクロファージ−ターゲティングＮＰまたはターゲティング基を持たない類似したＮＰを投与することが可能である。ｂｉｏＤは最初、注射後１〜２４時間、蛍光撮像によって追跡することが可能である。動物を屠殺し；脳、心臓、腸、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉、骨、肺、リンパ節、消化管、および皮膚を切除して重量測定し、ホモジナイズして、ＩＣＰ−ＭＳを使用してＱＤからＣｄを定量化することが可能である。組織濃度は、組織１ｇ当たりの、注射した用量の％（％ＩＤ／ｇ）として表すことが可能である。血液半減期は、様々な時点における血中Ｃｄ濃度から算出することが可能である。

複合撮像および治療試験を、動脈硬化性ウサギまたはブタあるいは他の適当な動物モデルで使用することが可能である。ＮＰはアテローム性動脈硬化症の二重バルーン損傷ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ白色ウサギモデルで試験することが可能である。ＮＰは、患者で一般的に使用される、ＦＤＡ認可スタチン用量範囲で投与することが可能である。第一に、動物を使用して半減期、ｂｉｏＤ、および細胞局在性を測定することが可能である。ＮＰの循環半減期を使用して、撮像時点を決定することが可能である。注射後撮像は、血液からの信号が取り除かれた、循環半減期の５倍に実施することが可能である。ｂｉｏＤ試験のために、動物の器官を回収することが可能である。５ｍｍ片を各動物の大動脈から切り取り、包埋して薄切することが可能である。大動脈におけるＮＰの分布を調査するために、結果として得られた組織切片を、共焦点検鏡法およびＴＥＭを使用して撮像することが可能である。プラークへのＮＰの送達は、Ｔ２＊−加重ＭＲＩ撮像および蛍光（ＦＬ）撮像を使用して評価することが可能である。各コントロールＮＰ、および様々なＮＰ製剤、遊離薬物、食塩水等に、動物群を使用することが可能である。こうした動物に４回、１週間に１回４週間、注射することが可能である。ベースラインパラメータを立証するために、治療の前に動物を撮像することが可能である。循環半減期から決定された注射後時点に、ＭＲおよびＦＬ撮像を実施することが可能である。いったん撮像試験が完了したら、全動物を屠殺して、組織学、ＳＭＣのための染色、マクロファージ、および内皮細胞のために、それらの大動脈を切除して、治療効果の評価を可能にできる。

ヒト使用に有効なナノ粒子の治療的投薬量は、周知のテクニック、たとえば表面積または体重に基づいた拡大縮小等に従った動物試験から推定することができる。

以下に、代表的なナノ粒子の様々な実施態様、ナノ粒子の製造方法、およびナノ粒子の使用方法を記述した、非限定的例を提示する。

実施例１：ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡの合成
置換されたＤＰＡリガンド、２−（ビス（ピリジン−２−イルメチル）アミノ）エタンチオールを合成し、分光法で特性化した。マレイミド−ＰＥＧ−ＮＨ₂を使用して、このＤＰＡリガンドをＰＥＧにカップリングしてＮＨ₂−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡを生じさせ、Ｚｎ²⁺配位のために、これをＰＬＧＡＣＯＯＨにカップリングしてＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡを生じさせた。合成は、ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定によって特性化し、純度は、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）で確認した。

実施例２：ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＬＩＫＫＰＦの合成
ＬＩＫＫＰＦ（配列番号１）は、Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＧＡの、自動ペプチドシンセサイザーを使用して合成した。ペプチドは、液体クロマトグラフィ法で精製し、Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）質量分析で分析した。ペプチドカップリング試薬によって、ロイシン、イソロイシン、リシン、リシン、プロリン、およびフェニルアラニンのアミノ酸モノマーをグリシン（Ｇ）ベースの樹脂に加えた。

ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（０．０３７７ｇ，１．０８〜０．６２７マイクロモル）を、ＥＤＣ ０．００２５ｇ（０．６１７マイクロモル）およびスルホＮＨＳ ０．００３０ｇ（０．６１７マイクロモル）と共に、ジクロロメタンに溶解した。混合物を２時間撹拌し、氷冷ジエチルエーテルでＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを沈殿させた。生成物を２回洗浄し、４０００ｒｐｍおよび−１０℃で１０分間遠心分離した。ペレットを３０分間乾燥し、ジクロロメタン中にＤＩＥＡ ６μＬが存在する条件下で、脱保護ペプチドに加えた（スキーム５）。混合物を一晩撹拌した。コンジュゲートしたポリマー−ペプチドを、上述の通り、２回洗浄により、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させた。ペレットを一晩乾燥した。ポリマー−ペプチド構築物を、５０／５０（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／ジクロロメタン１ｍＬに再溶解し、ジクロロメタンでリフレッシュしながら２時間撹拌した。試料を濃縮し、ジエチルエーテル６ｍＬで洗浄してＴＦＡを除去し、それぞれ、ポリマー−ペプチドを沈殿させた。バイアルを乾燥して、０．０２１１ｇの塊が得られ、これは９５％〜５５％の収率を表す。

結果として得られた構築物はＮＭＲで特性化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定値および純度はゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）で確認した。

実施例３：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノースの合成
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［カルボキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−ＣＯＯＨ）への、マンノサミンのカルボジイミドカップリングは、文献に報告されている方法に従って実施した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ １０３．８ｍｇ（０．０３６４ミリモル）を先ず、０．０１Ｍ ＰＢＳバッファー１０ｍＬの中でミセル化した。ＥＤＣ（１１．１ｍｇ，０．０５７９ミリモル）およびＳｕｌｆ−ＮＨＳ（１１．７ｍｇ，０．５４３ミリモル）をＰＢＳ中のＤＳＰＥに加え、ｐＨ ４．１３にした。１５分撹拌した後、マンノサミン塩酸塩１５．３ｍｇ（０．０７１０ミリモル）を加えた（スキーム６）。混合物のｐＨは約７．０に上昇し、３時間維持した。混合物を、ｐＨ ７．３４でＰＢＳに対して一晩透析した（ＭＷＣＯ １００〜５００ダルトン）。混合物を凍結乾燥して、白色粉末を生じた。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノースを、６０℃のエタノールに溶解して、あらゆる未反応の糖またはバッファー塩を除去した。エタノールを、回転蒸発および凍結乾燥で蒸発させた。白色粉末０．４３６２ｇ、収率２４％。

結果として得られた構築物はＮＭＲで特性化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定値および純度はゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）で確認した。

実施例４：ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤの合成
ＱＤカプセル化のために、ＥＤＣ／ＮＨＳアミドカップリング反応を使用して、ＱＤ−コンジュゲーテド・アミン−終端ＰＥＧ、ＮＨ₂−ＰＥＧ−ＱＤ、をＰＬＧＡ−ＣＯＯＨにコンジュゲートし、トリ−ブロックコポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤをもたらした。生成物は、ＤＬＳ測定により特性化した。

実施例５：ナノ粒子の形成
予備試験で、ナノ沈殿を使用して、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＬＩＫＫＰＦ（実施例２に従って調製した）、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡ（実施例１に従って調製した）をＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨとブレンドすることにより、様々なＩＯ濃度およびＱＤ濃度を、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＮＰ（ＱＤカプセル化には、実施例４に従って調製したＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤを使用した）の中に封入した。ポリマーをナノ粒子に自己組織化させるため、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−Ｍａｌ−ＤＰＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＬＩＫＫＰＦ、およびＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤをアセトニトリルに溶解した。４％エタノール−水中のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノースを６５℃まで加熱した。ポリマー溶液を、約１ｍＬ／分の速度で脂質混合物にゆっくり加えた。溶液を２時間撹拌した。ナノ粒子を、超遠心分離法を使用することによって精製し、水に再懸濁させた。Ｚｎ²⁺配位には、１０^-3Ｚｎ（ＮＯ₃）₂・６Ｈ₂Ｏ １０μＬをナノ粒子に加え、約３０分間インキュベートし、超遠心分離で精製した。

実施例６：ナノ粒子の特性化
動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して、各ＮＰ製剤のサイズおよびゼータ電位を測定した。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して、表面形状を試験した。結果として得られたＮＰは、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって定量化したとき、サイズ範囲約１５０ｎｍ、ＱＤ約４％、ＩＯ約５％、および亜鉛負荷約１０％であった。表面に多官能性を有するターゲテドＦＬ／ＭＲＩ活性なＮＰの合成における我々の最初の成功で。

図３は、（上の図に示した）あるナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。図３に示す通り、結果として得られるナノ粒子はサイズ範囲が変化するが、かなりの程度までではない。図４に、（表示されている）様々なナノ粒子のサイズ（左のパネル）およびゼータ電位（右のパネル）を表す。

実施例７：ＰＳに対するナノ粒子の特異性
実施例５に従って調製されたナノ粒子が、他のリン脂質すなわちホスファチジルコリン（ＰＣ）よりも優先的にＰＳに結合する能力をテストするために、我々は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーに懸濁した、ＱＤ−カプセル化した、Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ結合部位とＬＩＫＫＰＦの両者を含むブレンドＮＰ懸濁液を、ＣＨＣｌ₃中のＰＣまたはＰＳと混合した。図５に示す通り、ＣＨＣｌ₃中のＰＣの場合、ＮＰを表すピンク色がバッファー（上）層に残存した。ＣＨＣｌ₃中のＰＳを用いると、ＮＰはＣＨＣｌ₃（下）層に移動した。この予備実験から、本明細書に記述されているＮＰ構築物が、ＰＳのリン脂質溶液をＰＣのリン脂質溶液とを区別できることが裏付けられる。

実施例８：アポトーシスマクロファージの蛍光
実施例５に従って調製された表面にＬＩＫＫＰＦとＺｎ²⁺−ＤＰＡの両者を含むＱＤ−カプセル化した、ブレンドされたＮＰの蛍光（ＦＬ）撮像を実施した。この手順の間に、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを先ずアポトーシス刺激で処理し、エトポシド（５０μＭ）で３時間、その後室温でＮＰと共に１０分間インキュベートした。ターゲテドＮＰはアポトーシス細胞の表面を染色して、細胞表面に結合しているＰＳを示すが、Ｚｎ²⁺結合部位がないＮＰは非特異的取り込みを示すことが、このＦＬ撮像から分かる（図６）。これらの結果は、Ｚｎ²⁺−ＤＰＡは、ＰＳのリン酸基への共有結合を提供するが、ＬＩＫＫＰＦは非−共有結合のみを提供するということに起因すると考えられる。

実施例９：アポトーシスマクロファージのＭＲＩ
表面にＬＩＫＫＰＦとＺｎ²⁺−ＤＰＡの両者を含むＩＯ−カプセル化した、ブレンドされたＮＰ（実施例５に従って調製された）を使用して、アポトーシス細胞ペレットのＭＲＩを開始した。７Ｔで、マウスＲＡＷ ２６４．７細胞のゆるく充填されたペレットの、Ｔ２加重高速スピンエコー撮像を実施した。実施例８における上述と同じ手順にしたがって、アポトーシスを誘導した。未処置のままで残されるかまたはＺｎ²⁺−ＤＰＡ無しでＮＰと一緒にインキュベートした細胞に比べて、アポトーシス細胞の信号強度は、Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ−ＮＰ構築物とのインキュベーション後に急激に低下することが、予備的撮像から分かる（図７）。

実施例１０：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成
簡単に記載すると、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを使用することによって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ₂をＴＰＰ−（ＣＨ₂）₄−ＴＰＰにカップリングし、精製およびＮＭＲ、ＭＡＬＤＩによる特性化のために、生成物を水に対して凍結乾燥した。

実施例１１：ミトコンドリア−ターゲティングナノ粒子の集合
二段階変形ナノ沈殿法により、ＰＬＧＡ、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＱＤ、コレステリルオレイン酸、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ラクトビオン酸、およびａｐｏＡ−１ペプチドの自己集合によって、ターゲテドハイブリッドＮＰを調製した。ＰＬＧＡ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤ、コレステリルオレイン酸を混合した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ラクトビオン酸を４重量％エタノール水溶液に溶解した。脂質溶液を６５℃まで加熱して、全ての脂質が非集合状態であることを確実にした。ＰＬＧＡ−コレステロール溶液を、予熱した脂質溶液に、穏やかに撹拌しながら滴加した。混合した溶液を勢いよく３分間、渦巻き撹拌し、続いて室温で２時間、穏やかに撹拌した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４遠心濾過機を、分子量カットオフ １００００Ｄａで使用して、ＮＰ溶液を３回洗浄することにより、残りの有機溶媒および遊離分子を除去した。非ターゲテドＮＰを調製するために、ナノ沈殿法の間、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰの代わりにＰＶＡを使用した。結果として生じるＮＰを、アミノ酸配列ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤを有する模擬ａｐｏＡ−１ペプチドと共に、４℃で１４時間インキュベートし、超遠心分離を使用してさらに精製した。ＮＰサイズ（直径、ｎｍ）、多分散性指数（ＰＤＩ）、および表面電荷（ゼータ電位、ｍＶ）は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ動的光散乱検出器を用いた動的光散乱法（ＤＬＳ）による３つの反復測定から取得した。ＮＰにおけるＱＤ負荷は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）で定量化し、ａｐｏＡ−１負荷は、２８０ｎｍでトリプトファン吸光度を追跡することによって測定した。

実施例１２：ミトコンドリア−ターゲティングナノ粒子の特性化
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して、実施例１１から得られるナノ粒子の粒径を測定した。図８は、ミトコンドリア取り込みに適切な粒径であることを示す、ＴＥＭの結果を表す。

ナノ粒子の粒径およびゼータ電位は、実施例６で上述した通りに評価した。結果を図９に提示し、粒径は左のパネルに示し、ゼータ電位は右のパネルに示す。

ＥＬＩＳＡ分析を使用して、ナノ粒子が免疫活性化を誘導するかどうかを決定した。ＲＡＷマクロファージを２，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、一晩培養した。細胞をＮＰ（０．５ｍｇ／ｍＬ）で処理し、１２時間インキュベートした。コントロールとして、未処理のＲＡＷ細胞および０．１２５ｍｇ／ｍＬのＬＰＳ処理を実施した。製造業者のプロトコールに従って、サイトカインＩＬ−６およびＴＮＦ−αに対してＥＬＩＳＡアッセイを実施した。簡単に記載すると、サイトカイン−ビオチンコンジュゲートおよびストレプトアビジン希釈標準溶液と共にインキュベートした、抗体被覆したプレートで、細胞溶解物を室温で２時間インキュベートした。安定化したクロマゲンを各ウェルに加え、続いて停止液を加え、４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。図１０に示す通り、ナノ粒子は免疫活性化を誘導しなかった。

実施例１３：ミトコンドリア−ターゲティングナノ粒子のミトコンドリア取り込み
共焦点蛍光検鏡法を使用して、ナノ粒子（実施例１０に従って調製した）がミトコンドリアに向けられるかどうかを決定した。ＲＡＷおよびＭＳＣ細胞を、６×１０⁷細胞／ｍＬの密度で顕微鏡カバーガラス（１．０ｃｍ）に播種し、ＤＭＥＭで一晩培養した。培地を変え、最終フルオロフォア濃度１０μＭまで、蛍光ターゲテドＮＰおよび非ターゲテドＮＰを加えた。細胞を、５％ＣＯ₂中、３７℃で４時間、インキュベートした。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ（１００ｎＭ）を加え、３７℃で４５分間インキュベートした。培地を除去し、冷メタノールを３０分間使用して細胞を固定した。次いでカバーガラスをＰＢＳ（３ｘ）、水（５ｘ）ですすぎ、封入剤を使用してスライドに固定した。ＦＩＴＣおよびＣｙ５チャネルに関して、ｘｘ ｍｓの画像を集めた（図１１Ａ〜Ｂ）。図１１Ａに示す通り、ミトコンドリア基質ターゲテドナノ粒子は、優先的にミトコンドリアに蓄積する。非ターゲテドナノ粒子は、サイトゾルに蓄積する（図１１Ｂ）。

実施例１４：コレステロール結合実験。
治療可能性を調査するために、蛍光ステロール、ＮＢＤ−コレステロール、２２−（Ｎ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−４−イル）−アミノ−２３，２４−ビスノル−５−コレン−３β−オル））を使用して、ＨＤＬ−模倣ＮＰ仲介コレステロール取り込みを試験した。極性環境におけるＮＢＤ−コレステロールの弱い蛍光は、非極性ＨＤＬ−ＮＰマトリックスの存在によって増強した（図ｘｘ）。この予備実験は、コレステロールがＴＰＰ−ＨＤＬ−ａｐｏＡ−１−ＮＰに不可逆的に結合できることを示しており、このプラットホームは、治療効果を提供するためのコレステロール逆輸送経路に参加できる。ＨＤＬ−ａｐｏＡ−１−ＮＰへのコレステロール結合は、様々な濃度のＤＭＦ中ＮＢＤ−コレステロール５μＬを、５ｍｇ／ｍＬの水中ＨＤＬ−ａｐｏＡ−１−ＮＰ９９５μＬに加えることによって測定した。溶液を渦巻き撹拌し、約２０分間インキュベートした。４７３ｎｍでの励起、および５００〜６００ｎｍの発光によって、溶液の蛍光を追跡した。ＮＢＤ−コレステロールのＨＤＬ−ａｐｏＡ−１−ＮＰへの結合は、蛍光強度の増加につながる（図１２）。

実施例１５：ミトコンドリアターゲテドＮＰの細胞毒性
全ＮＰの細胞毒性的挙動を評価した。ＲＡＷおよびＭＳＣ細胞に対してＭＴＴアッセイを使用して、ＲＡＷ細胞の場合には２００μＬのＤＭＥＭ培地中で、ＭＳＣ細胞の場合にはｘｘ培地中で、細胞（２０００細胞／ウェル）を、９６−ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。細胞を、様々な濃度（ＰＬＧＡに関して）のターゲテドＮＰおよび非ターゲテドＮＰで処理し、３７℃で１２時間インキュベートした。培地を変え、細胞をさらに６０時間インキュベートした。次いで細胞をＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬで５時間処理した。培地を除去し、細胞をＤＭＳＯ１００μＬで溶解し、紫色のホリマザンの５５０ｎｍにおける吸光度を記録した。各ウェルを三重に実施した。全ての実験を３回繰り返した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて、細胞毒性データをプロットした（図１３）。

このように、アポトーシス−ターゲティングナノ粒子（ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ）の実施態様が開示される。当業者は、本明細書に記述されているナノ粒子および方法を、開示されたもの以外の実施態様で実行できることを認識するであろう。開示された実施態様は、例示のために提示されており、限定するためのものではない。

Claims (8)

1. コレステリルオレイン酸；
   乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）を含む、ポリマー；
   ＰＬＧＡブロック、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックを含む、ブロックコポリマー；
   （ｉ）リン脂質に結合したＰＥＧ、及びＰＥＧに結合したターゲティング部分を含む、又は（ｉｉ）脂質部分とコンジュゲートしたターゲティング部分を含む、第一化合物、ここで前記ターゲティング部分は、亜鉛２，２’−ジピコリルアミン（Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ）配位化合物、ＬＩＫＫＰＦ（配列番号１）、ＰＧＤＬＳＲ（配列番号２）、及びＤＡＨＳＦＳ（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＰＳ−ターゲティングポリペプチド、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分、Ｓｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチド、及びローダミンカチオンからなる群から選択される；
   リン脂質に結合したマクロファージターゲティング部分を含む、第二化合物、ここで前記マクロファージターゲティング部分は、マンノース部分、ガラクトース部分、及びラクトビオン酸からなる群から選択される；並びに
   ａｐｏＡ−１ペプチド模倣物
   を含む、ナノ粒子であって、ここで、
   前記ＰＬＧＡを含むポリマー、及び前記ブロックコポリマーのＰＬＧＡブロックが、ナノ粒子の疎水性コアを形成し、
   前記ブロックコポリマーのＰＥＧブロックが、コアを囲む親水性の層を形成し、
   前記コレステリルオレイン酸が、前記コアに結合し、
   前記ａｐｏＡ−１ペプチド模倣物が、前記コアに結合し、
   前記ターゲティング部分が、前記コアから伸長し、
   前記マクロファージターゲティング部分が、前記コアから伸長している、ナノ粒子。
2. 前記第一、及び第二化合物のリン脂質が、ジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
3. アポトーシス細胞、又はアポトーシス細胞を示す製品をターゲティングするナノ粒であって、ここで前記ナノ粒子が、２０ナノメートル〜３００ナノメートルの直径を有し、そして以下：
   ポリマーコア；
   前記コアを囲むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む層；
   前記コア、及び前記ＰＥＧを含む層の間のリン脂質単分子層；及び
   前記ナノ粒子に結合した第一ターゲティング部分、ここで（ｉ）前記第一ターゲティング部分が、ホスファチジルセリンと選択的に結合する、
   を含む、ナノ粒子。
4. 前記第一ターゲティング部分が、ポリペプチドを含む、請求項３に記載のナノ粒子。
5. 前記第一ターゲティング部分が、亜鉛２，２’−ジピコリルアミン（Ｚｎ²⁺−ＤＰＡ）配位化合物、並びにＬＩＫＫＰＦ（配列番号１）、ＰＧＤＬＳＲ（配列番号２）、及びＤＡＨＳＦＳ（配列番号３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＰＳ−ターゲティングポリペプチドからなる群から選択される、請求項３又は４に記載のナノ粒子。
6. 前記ナノ粒子が、さらにコレステロール部分を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
7. 前記コレステロール部分が、コレステリルオレイン酸を含む、請求項６に記載のナノ粒子。
8. 前記ナノ粒子が、さらにａｐｏＡ−１ペプチド模倣物を含む、請求項３〜７のいずれか1項に記載のナノ粒子。