CN117942410A - 一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体及其制备方法 - Google Patents
一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体及其制备方法，包括通过超高速离心法收集永生化人脐带间充质干细胞的外泌体；用所述外泌体与相应胶束按比例混匀，在37‑42℃条件下共孵育2‑3h，冷却纯化得多肽‑Exo外泌体，向多肽‑Exo外泌体中载入miR‑133b获得相应多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体。本发明方法获得多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体具有很好的生物相容性和脑靶向性，同时不会被网状内皮系统识别和清除，能穿透血脑屏障对大脑进行给药，改善帕金森的改善运动功能和神经症状。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体涉及一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体及其制备方法。
背景技术
帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种慢性神经退行性疾病，由大脑黑质中多巴胺能神经元的特异性耗竭形成的运动障碍。
目前用药物、手术和运动疗法缓解帕金森氏病症，其中在药物治疗中左旋多巴是治疗PD最有效的药物，但长期使用可能会出现一些副作用，如症状波动和异动症。其中在药物疗法中，市面上的药物多采用脂质体和聚合物纳米颗粒作为载药体，一是因其属于外源性载体，在给药过程中会被人体的网状内皮系统(RES)识别并清除，造成部分药物失效；二是治疗PD的药物要穿透血脑屏障(BBB)向大脑给药，但脂质体和聚合物纳米颗粒难以实现穿透BBB向大脑给药。故开发一种不被RES识别且有效穿透血脑屏障的物质作载药体是缓解和控制帕金森病的关键。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体的制备方法，旨在克服现有给药载体在用于治疗帕金森载药体时，会被网状内皮系统识别并清除，且无法穿透血脑屏障向大脑给药的缺陷。
本发明还提供三种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体，所述给药载体分别是RVG29-Exo-133b、T-Exo-133b、A-Exo-133b。
为实现上述目的，本发明提供了一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1，通过超高速离心法收集永生化人脐带间充质干细胞的外泌体；
S2，用所述外泌体与预设多肽胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得多肽-Exo外泌体；
S3，在35-40℃温度条件下，先用Exo-Fect转染试剂盒孵育外泌体，再载入FAM-miR-133b模拟物，得Exo-133b复合体；
S4，混合所述多肽-Exo外泌体与所述Exo-133b复合体得混合液，将所述混合液与Exo-Quick试剂按预设比例在冰上混合30-40min，离心分离获多肽-Exo-133b。
优选地，上述技术方案中，在步骤S2中，所述外泌体与预设多肽胶束按1:1的比例混合；所述纯化指在4-7℃温度条件下，以120000-130000×g超速离心2-3h。
优选地，上述技术方案中，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-RVG29胶束、DSPE-PEG2K-TAT胶束和DSPE-PEG2K-Ang2胶束中的一种。
优选地，上述技术方案中，在步骤S4中，所述预设比例为1：3-6；所述离心分离指在4-7℃温度条件下，以13000-14000×g离心5-10min。
优选地，上述技术方案中，在步骤S2中，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-RVG29胶束时，用所述外泌体与DSPE-PEG2K-RVG29胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得RVG29-Exo外泌体。
优选地，上述技术方案中，在步骤S2中，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-RVG29胶束时，用所述外泌体与DSPE-PEG2K-RVG29胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得RVG29-Exo外泌体。
优选地，上述技术方案中，在步骤S2中，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-Ang2胶束时，用所述外泌体与DSPE-PEG2K-Ang2胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得Ang2-Exo外泌体。
一种如上所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法制备获得的多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体，其特征在于，所述多肽为RVG29。
根据上述技术方案，本发明给药载体RVG29-Exo-133b，用能与烟碱乙酰胆碱(nAChR)受体特异性结合的RVG29(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)多肽修饰永生化人脐带间充质干细胞的外泌体，避免网状内皮系统识别并清除，同时RVG29与神经元和穿透血脑屏障结合，将被载药物穿透血脑屏障向大脑给药。将抑制RhoA蛋白且促进轴突生长的miR-133b载入RVG29-Exo外泌体，携带miR-133b进入大脑并在大脑中表达，减轻6-OHDA诱导的帕金森病小鼠神经损伤，改善帕金森患者的运动功能和神经症状。
一种如上所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法制备获得的多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体，其特征在于，所述多肽为TAT。
根据上述技术特征，用高效、简便、安全的外泌体表面修饰方法获得T-Exo-133b，通过将能有效穿透细胞膜的多肽TAT(AYGRKKRRQRRR)修饰人脐带间充质干细胞的外泌体，使给药载体无需与配体受体特异性结合，就能将不同性质的药物输送到细胞中，并携带miR-133b穿透血脑屏障向大脑给药，改善帕金森患者的运动功能和神经症状。
一种如上所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法制备获得的多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体，其特征在于，所述多肽为Ang2。
根据上述技术方案，用与LRP-1有高结合亲和力的angiopep-2(Ang2)多肽修饰并载入miR-133b人脐带间充质干细胞的外泌体，增强外泌体脑靶向特性，从而提高大脑病灶的药物浓度，改善帕金森患者的运动功能和神经症状。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)首次将抑制RhoA蛋白且促进轴突生长的miR-133b导入人脐带间充质细胞源外泌体，增加miR-133b在脑中的表达，从而治疗帕金森病因神经元的特异性耗竭而导致运动障碍；
(2)首次用脑靶向肽RVG29修饰人脐带间充质细胞源外泌体，使外泌体具有脑靶向性，将被载药物送至病灶处，且提高外泌体穿透血脑屏障的能力，使药效提高；首次用TAT修饰人脐带间充质细胞源外泌体，具有很好的生物相容性，对生物体无毒、安全，同时给药载体穿透血脑屏障的能力增强，能将不同性质的药物输送到神经元细胞；首次用angiopep-2修饰人脐带间充质细胞源外泌体，具有很好的生物相容性，对生物体无毒、安全，同时给药载体具有脑靶向特性和穿透血脑屏障，进而提高大脑病灶处的药物浓度。
附图说明
图1是FITC-RVG29-PEG2K-DSPE和FITC-RVG29的核磁共振图谱；
图2是FITC-RVG29-PEG2K-DSPE和FITC-RVG29的质谱图；
图3是FITC-TAT-PEG2K-DSPE和FITC-TAT的核磁共振图谱；
图4是FITC-TAT-PEG2K-DSPE和FITC-TAT的质谱图；
图5是FITC-Ang2-PEG2K-DSPE和FITC-Ang2的核磁共振图谱；
图6是FITC-Ang2-PEG2K-DSPE和FITC-Ang2的质谱图；
图7是本发明某一实施例中的HUCMSC和HUCMSC-Exos标记蛋白Western印迹图像(左)与HUCMSC-Exos粒径大小(右)的图；
图8是本发明某一实施例中用TEM观察外泌体形态的图；
图9是本发明某一实施例中用SEM观察各种外泌体形态的图；
图10是本发明某一实施例中各种外泌体的粒径大小(左)和zeta电位(右)的图；
图11是本发明某一实施例中SH-SY5Y细胞的存活率柱状图；
图12是本发明某一实施例中光学显微镜下红细胞形态的图；
图13是本发明某一实施例中血液相容性实验的图；
图14是本发明某一实施例中关于血液相容性实验的溶血率数据的图；
图15是本发明某一实施例中脑、心、肺、肝、脾和肾的HE染色图；
图16是本发明某一实施例中体外细胞摄取的荧光情况的图；
图17是本发明某一实施例中体外细胞摄取的柱状图；
图18是本发明某一实施例中共聚焦显微镜下的小鼠脑组织切片图；
图19是本发明某一实施例中脑部靶向性的统计分析柱状图；
图20是本发明某一实施例中各器官的近红外荧光(NIRF)成像图；
图21是本发明某一实施例中大脑总辐射效率统计分析(右)和各器官的辐射效率统计分析(左)柱状图；
图22是本发明某一实施例中阿朴吗啡(APO)诱导旋转试验的统计分析柱状图；
图23是本发明某一实施例中强迫游泳试验的统计分析柱状图；
图24是本发明某一实施例中爬杆实验的统计分析柱状图；
图25是本发明某一实施例中小鼠脑黑质切片的Nissl染色图；
图26是本发明某一实施例中小鼠黑质中TH免疫组化的统计分析柱状图；
图27是本发明某一实施例中Nissl阳性中子的统计分析柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1，在含青霉素和链霉素溶液的无人类干细胞血清培养基中增殖HUCMSCs细胞，至第五阶段的HUCMSCs细胞融合度达80％后，用不含外泌体的FBS培养基培养HUCMSCs细胞48h，通过超高速离心法收集FBS培养基中永生化人脐带间充质干细胞的外泌体，具体步骤为：
(1)初步富集：在4℃温度条件下，将FBS培养基以800×g离心30min，再在4℃温度条件下，以3,000×g离心30min取上清液，完成初步富集；
(2)进一步富集：在4℃温度条件下，将所述上清液以10,000×g超速离心1h后，用0.22μm过滤器过滤，除去细胞和碎片，再以120,000×g超速离心两次，去除细菌、病毒等微生物，得HUCMSC细胞外泌体(HUCMSC-Exos)。
(3)保存：将HUCMSC-Exos重悬于200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
S2，用制备获得的HUCMSC-Exos与DSPE-PEG2K-RVG29胶束按1:1比例混匀，获得总体积为100-150μL的混合溶液，将所述混合溶液置于在40℃温度条件下培养2h，将混合溶液冷却至4℃后，以120,000×g超速离心2h，从游离胶束中纯化得RVG29-Exo外泌体；
S3，在37℃温度条件下，用Exo-Fect转染试剂盒孵育RVG29-Exo外泌体(1×109颗粒)10min，再载入FAM-miR-133b模拟物后，与Exo-Quick试剂按体积比为1：5在冰上混合30min后，在4℃温度条件下，以13,000×g离心5min，得RVG29修饰并含有miR-133b的外泌体(R-Exo-133b)。R-Exo-133b用去离子水稀释并冻干保持。
通过上述制备方法获得多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体为R-Exo-133b。
实施例2
一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1，与实施例1步骤完全相同；
S2，用制备获得的HUCMSC-Exos与DSPE-PEG2K-TAT胶束按1:1比例混匀，获得总体积为100-150μL的混合溶液，将所述混合溶液置于在40℃温度条件下培养2h，将混合溶液冷却至4℃后，以120,000×g超速离心2h，从游离胶束中纯化得TAT-Exo外泌体；
S3，在37℃温度条件下，用Exo-Fect转染试剂盒孵育TAT-Exo外泌体(1×109颗粒)10min，再载入FAM-miR-133b模拟物后，与Exo-Quick试剂按体积比为1：5在冰上混合30min后，在4℃温度条件下，以13,000×g离心5min，得TAT修饰并含有miR-133b的外泌体(T-Exo-133b)。T-Exo-133b用去离子水稀释并冻干保持。
通过上述制备方法获得多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体为T-Exo-133b。
实施例3
一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1，与实施例1步骤完全相同；
S2，用制备获得的HUCMSC-Exos与DSPE-PEG2K-Ang2胶束按1:1比例混匀，获得总体积为100-150μL的混合溶液，将所述混合溶液置于在40℃温度条件下培养2h，将混合溶液冷却至4℃后，以120,000×g超速离心2h，从游离胶束中纯化得Ang2-Exo外泌体；
S3，在37℃温度条件下，用Exo-Fect转染试剂盒孵育Ang2-Exo外泌体(1×109颗粒)10min，再载入FAM-miR-133b模拟物后，与Exo-Quick试剂按体积比为1：5在冰上混合30min后，在4℃温度条件下，以13,000×g离心5min，得Ang2修饰并含有miR-133b的外泌体(A-Exo-133b)。A-Exo-133b用去离子水稀释并冻干保持。
通过上述制备方法获得多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体为A-Exo-133b。
使用核磁共振(NMR)分析FITC-RVG29和FITC-RVG29-PEG2K-DSPE的结构，结果如图1所示，在δ3.75-4.62ppm处的特征峰证实FITC-RVG29和FITC-RVG29-PEG2K-DSPE的成功合成；再利用质谱图(MS)分析FITC-RVG29和FITC-RVG29-PEG2K-DSPE的质荷比，结果如图2所示，所述产物在m/z＝6618.78处的最高峰FITC-RVG29与FITC-RVG29-PEG2K-DSPE信号相对应，表明预设多肽胶束DSPE-PEG2K-RVG29胶束合成成功，化学式如下：
使用核磁共振(NMR)分析FITC-TAT和FITC-TAT-PEG2K-DSPE的结构，结果如图3所示在δ6.52-8.23ppm的观察到TAT的特征峰，证明FITC-TAT和FITC-TAT-PEG2K-DSPE的合成成功；再利用质谱图(MS)分析FIT C-TAT和FITC-TAT-PEG2K-DSPE的质荷比，结果如图4所示，在m/z＝5049.95处FITC-TAT与FITC-TAT-PEG2K-DSPE信号相对应，表明预设多肽胶束DSPE-PEG2K-TAT胶束合成成功，化学式如下：
使用核磁共振(NMR)分析FITC-Angipepe-2和FITC-Ang2-PEG2K-DSP E的结构，结果如图5所示，在δ6.50-7.41ppm范围内观察到Ang2的特征峰，证明FITC-Angipepe-2和FITC-Ang2-PEG2K-DSPE的合成成功；再利用质谱图(MS)分析FITC-Angipepe-2和FITC-Ang2-PEG2K-DSPE的质荷比，在m/z＝5739.38处FITC-Angipepe-2与FITC-Angipepe-2-PEG2K-DSPE的信号相对应，表明预设多肽胶束DSPE-PEG2K-Ang2胶束合成成功，化学式如下：
对获得的人多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体进行特异性蛋白检测，及NTA检测颗粒直径和TEM结构检测，结果如图7和图8所示，从图7得出HUCMSC-Exos具有特异性蛋白CD63和TSG101，且NTA结果显示外泌体颗粒直径为136.3nm；从图8中得出HUCMSC-Exos具有典型的杯状结构。
使用扫描电镜评估了实施例1、实施例2和实施例3所获外泌体的形态，结果如图9所示。
分别对HUCMSC-Exos(Exo)、Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b的颗粒直径和zeta电位，结果如图10所示这些外泌体的颗粒直径都在150到200nm之间，其中用多肽RVG29、TAT和Ang2修饰的外泌体的粒径相对于Exo和Exo-133b更大一些，说明用RVG29、TAT和Ang2修饰的外泌体提高外泌体粒径，而作为载药体粒径大可能载药量会更多；外泌体的zeta电位在-15到-3mV之间，说明R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b胶态分散的稳定性好。从几种人脐带间充质细胞源外泌体的形态、粒径大小和胶态分散稳定性检测结果显示，R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b保持了人脐带间充质细胞的外泌体特性，并且可能具有载药性能比人脐带间充质细胞的外泌体更好的特质。
一、试剂来源
FAM-miR-133b模拟物购自Anornor生物技术公司；Exo-Fect转染试剂盒购自System Biosciences公司；1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物(DiR)来自美国光大公司；红色荧光细胞连接试剂盒(PKH26)和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自Sigma-Aldrich公司；永生化人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)和SH-SY5Y细胞购自ProcellCo.公司；杜氏改良老鹰培养基(DMEM)和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；BasalMedium购自Cyagen公司；TSG101、CD63、RHOA、ROCK和酪氨酸羟化酶(TH)抗体购自Abcam公司；MAP2、TAU和ɑ-syn抗体购自Proteintech公司；Prime Script RT Reagent Kit和SYBRGreenPCR母液来自Takara Bio,Inc公司。
二、试验
1、细胞毒性检测
采用的检测方法是CCK-8检测法，所述检测方法的具体步骤如下：
(1)在含10％FBS的细胞培养基中培养的SHSY5Y细胞，将SHSY5Y细胞在96孔板中播种过夜，以促进细胞粘附；
(2)分别将PBS、外泌体(Exo)、Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b加入透孔插入物中，并与SHSY5Y细胞培养48小时后，在每个孔中加入CCK-8试剂，用微孔板阅读器(Synergy LX,BioTek,US)在450纳米波长处测量吸光度。
用上述CCK8法测定细胞存活率结果如图11所示，与对照组相比较，Exo、Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b等外泌体中的SH-SY5Y细胞存活率无显著差异，说明R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b对SH-SY5Y细胞的存活率无明显影响。
2、血液相容性试验
试验方法：从健康的C57BL/6小鼠身上采集血样，在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管中以500×g离心5min，去除上层血浆，用生理盐水洗涤红细胞(RBC)三次，至上清液清澈。弃上清液。提取0.1mL红细胞悬液与5mL生理盐水混合，得2％的红细胞悬液。将500μL红细胞悬液与500μL生理盐水(阴性)、2％Triton X-100(阳性)和Exo混合，将混合物在37℃摇床上培养3h。将Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b按上述方法制备相应样品，再取10μL各个样品放在光学显微镜下观察并拍照，如图12和图13所示。取各个样品以2500r/min的速度离心10min，取出100μL上清液，加入96孔板中。上清液通过540纳米酶谱检测，结果如图14所示。
从图12中看出，对照组(Negative)中TritonX-100处理的样本表现出明显的红细胞溶解现象，而Exo、Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b组中与Negative一样没有出现明显聚集或溶血现象，说明R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b与血液的相容性好，作为载药体不会出现溶血现象。进一步地，从图13中看出，离心后的阳性组(Positive)呈现明显的红色，管底没有细胞，而Negative和其他外泌体组中离心管底部均有的红细胞沉淀，且上清液变得无色透明，进一步说明R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b与血液的相容性好，作为载药体不会出现溶血现象。
从图14中看出用540纳米酶谱测定Negative、Positive、Exo、Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b各组的溶血率，结果发现Negative的溶血率为0，Positive的溶血率为100％，而Exo、Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b溶血率均低于1％，其中，R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b溶血率低于Exo-133b的溶血率，且小于0.5％，说明与Exo-133b相比较，用多肽修饰的外泌体与血液的相容性更好，更适合做载药体。
3、器官病理观察
实验方法：通过尾静脉注射的方式分别对帕金森病模型小鼠进行给PBS、外泌体、Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b处理，每天注射1×108粒。连续处理七天后，对帕金森病模型小鼠的心、肺、肝、脾和肾进行切片，用H&E染色后，在光学显微镜下观察，结果如图15所示。
在图15中，Brain是脑、Heart是心脏、Lung是肺、Liver是肝、Spleen是脾、Kidney是肾。从图15中看出，与PBS相比较，肉眼观察和病理分析均未发现Exo、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b处理的小鼠所获器官切片有任何病理异常或炎症细胞浸润现象，说明R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b性能安全好和无毒性，作为载药体不会对被给药体的器官造成损伤或引发炎症。
4、体外细胞摄取
实验方法：将1μL染料储存液与250μL的稀释剂C试剂(UR52303，中国优美宝公司)稀释制成4μM浓度的PKH26染料工作液，将250μL PK H26染料工作液加入250μL R-Exo-133b溶液中，在37℃温度条件下孵育5min后，加入500μL 1％牛血清白蛋白(BSA)反应2min。当混合物的体积增至25mL时，在120,000×g转速下离心120min。弃上清液后，将残留物(PKH26-R-Exo-133b)悬浮在PBS中。PKH26-Exo-133b、PKH26-T-Exo-133b和PKH26-A-Exo-133b也用上述方法获得。
分别将上述PKH26-R-Exo-133b等获得物与1×106个SH-SY5Y细胞/孔的六孔板共培养12h，用Cytation5细胞成像多模阅读器(BioTek Lionheart LX)观察SH-SY5Y细胞的荧光情况如图16和图17所示。
从图16中看出，在Exo-133b、R-Exo-133b、T-Exo-133b和A-Exo-133b处理的细胞中都检测到了外泌体信号。其中，R-Exo-133b的PKH26信号最高，表明R-Exo-133b被细胞吸收的效率最高。进一步地，图17中的ns表示P>0.05指无显著差异，*表示P<0.05指有显著差异，从图17中看出，R-Exo-133b和Exo-133b对体外细胞摄取有显著差异，说明添加R-Exo-133b和Exo-133b的数据具有统计学意义，而添加T-Exo-133b或A-Exo-133b的数据不具有统计学意义。
5、定量逆转录酶PCR
实验方法：在含有培养基的六孔板中将SH-SY5Y细胞以1×105个/孔的密度播种。使用TRIzol试剂(Thermo Fisher,Scoresby,VIC Australia)提取总RNA。为了测定miR-133b的表达，用miRNA Tailing Reaction First Strand cDNA Synthesis Kit合成miRNAFirst Strand cDNA，U6作为mRNA和mi R-133b的内部对照，用2-ΔΔCt方法测定表达水平。其中，miR-133b引物序列如下：正向引物5′-TTGTCCTTCAACCAGCTA-3′，反向引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，U6引物的序列如下：正向引物5′-GCTTCGGCACATAT ACTAAAAT-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-133b引物序列如下：正向引物5′-TTGTCCTTCAACCAGCTA-3′，反向引物5′-CAGT GCGTGTCGTGGAGT-3′。
6、脊髓灰质炎小鼠模型的建立与外泌体递送
实验小鼠：12周龄雄性C57BL/6J小鼠购自长沙天勤生物科技有限公司。将小鼠随机分为5组(n＝6)：对照组、6-OHDA组、Exos组、Exo-133b组和R-Exo-133b组。
实验方法：小鼠禁食12h后用1.25％三溴乙醇麻醉后，放置在立体定向仪上。从小鼠头皮的中间切开，在头骨左侧钻两个孔，将Nanoject III从孔中插入，单侧注射1μL盐酸6-OHDA(坐标：前0.3mm，后0.3mm)：前囟前0.3mm，外侧2.2mm，深3.0mm；前囟前1.1mm，外侧1.7mm，深2.9mm。6-OHDA以0.5μL/min的速度注入，浓度为3μg/μL，溶于0.9％氯化钠和0.2mg/mL抗坏血酸中，以建立PD模型。6-OHDA损伤3周后，给各组小鼠的尾静脉注射对应的PKH26标记的外泌体，每天1×108粒，连续治疗7d。
取各组小鼠脑组织切片并在共聚焦显微镜下观察结果如图18和外泌体的脑部靶向性进行统计分析如图19，在收获的大脑中检测到了PKH26信号，发现R-Exo-133b在大脑中的阳性信号高于其他外泌体，说明R-Exo-133b是将miR-133b运送到大脑的最有效载体。
用DiR染料标记外泌体后用近红外荧光(NIRF)成像测量了小鼠注射后18小时外泌体在小鼠体内的分布情况如图20和图21所示，从图20看出荧光强度从强到弱依次是R-Exo-133b、T-Exo-133b、A-Exo-133b和Exo，说明脑靶向性性能从高到低依次是R-Exo-133b、T-Exo-133b、A-Exo-133b和Exo，以R-Exo-133b、T-Exo-133b、A-Exo-133b更有效地将药物输送到脑部；进一步地，从图21(右)看出在小鼠大脑总辐射效率统计分析中，R-Exo-133b、T-Exo-133b、A-Exo-133b具有显著差异，具有统计学意义。从图21(左)看出在小鼠心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏和肌肉的辐射效率统计分析中，肝脏和肾脏的DIR信号较高，各组间未观察到显著差异。
7、阿朴吗啡诱导旋转试验
旋转试验在6-OHDA损伤后第4周和第5周进行。腹腔注射5μg/g阿朴吗啡溶液10min后，将每只小鼠置于边长为30cm的不透明盒子中，让小鼠自由活动，盒子上方设置摄像头记录20min，实验结果如图22所示。
根据图22得在6-OHDA病变治疗第四周后，所有治疗组的旋转圈数都显著减少。其中，RVG-Exo-133b组的下降最为明显，平均为307次/小时。
8、强迫游泳
在强迫游泳试验中，每只小鼠都被放入一个高25cm、直径13cm的玻璃圆筒中，在玻璃圆筒中注入15cm高的22℃自来水，当小鼠在玻璃圆筒中游泳10min时。之后将每只小鼠从圆筒中取出，一名与实验组无关的观察员对每只小鼠的游泳行为进行录像和分析，结果如图23所示。
根据图23得强迫游泳试验的结果表明，与6-OHDA组相比，各处理组小鼠被固定的时间明显减少；其中，RVG-Exo-133b组的固定时间减少得最明显。
9、爬杆实验(极点测试评估)
小鼠运动障碍的评估采用杆试验。具体为将小鼠被放置在直径10mm、高80cm的垂直杆顶端设置的小球上，头朝上。用计时器测量每只小鼠从开始运动到头部向下转动(T形转动)所需的时间及每只小鼠从杆顶爬到杆底所需的总时间(T-总时间)。实验结果如图24所示。
在各组小鼠在接受外泌体治疗后进行爬杆实验中根据图24得，与6-OHD A组相比，RVG-Exo-133b组的T-turn和T-total下降最为显著。
10、组织制备、组织病理学分析和免疫荧光染色
实验方法：用1.25％三溴乙醇麻醉小鼠。组织在4％多聚甲醛中固定过夜，然后用石蜡包埋，切成5μm厚的纵向切片，进行组织病理学分析。组织切片经脱蜡和梯度酒精脱水后，进行TH和Nissl染色。在显微镜下观察多巴胺能神经元和Nissl体的数量。收集大脑，用冷冻切片机制备冷冻切片，用于免疫荧光分析。使用DAPI对细胞核进行染色，并使用全景观察仪(Pannoramic DESK，3DHISTECH's Slide Converter，Magyarorszag)获取荧光图像。荧光图像如图25所示，TH阳性细胞检测数据如图26所示，Nissl阳性中子检测数据如图27所示。
TH和Nissl染色实验结果根据图25得，外泌体处理增加了左半球黑质区域所有组中TH阳性细胞的数量。根据图26的TH阳性细胞检测数据得在各给药组中RVG-Exo-133b对TH阳性细胞的改善最大，说明RVG-Exo-133b是最有效的治疗方法。根据图27的Nissl阳性中子检测数据得，RVG-Exo-133b在增加Nissl阳性中子数量方面的功效最高。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1，通过超高速离心法收集永生化人脐带间充质干细胞的外泌体；
S2，用所述外泌体与预设多肽胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得多肽-Exo外泌体；
S3，在35-40℃温度条件下，先用Exo-Fect转染试剂盒孵育外泌体，再载入FAM-miR-133b模拟物，得Exo-133b复合体；
S4，混合所述多肽-Exo外泌体与所述Exo-133b复合体得混合液，将所述混合液与Exo-Quick试剂按预设比例在冰上混合30-40min，离心分离获多肽-Exo-133b。
2.根据权利要求1所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述外泌体与预设多肽胶束按1:1的比例混合；所述纯化指在4-7℃温度条件下，以120000-130000×g超速离心2-3h。
3.根据权利要求2所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-RVG29胶束、DSPE-PEG2K-TAT胶束和DSPE-PEG2K-Ang2胶束中的一种。
4.根据权利要求1所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述预设比例为1：3-6；所述离心分离指在4-7℃温度条件下，以13000-14000×g离心5-10min。
5.根据权利要求3所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-RVG29胶束时，用所述外泌体与DSPE-PEG2K-RVG29胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得RVG29-Exo外泌体。
6.根据权利要求3所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-TAT胶束时，用所述外泌体与DSPE-PEG2K-TAT胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得TAT-Exo外泌体。
7.根据权利要求3所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述预设多肽胶束为DSPE-PEG2K-Ang2胶束时，用所述外泌体与DSPE-PEG2K-Ang2胶束按比例混匀，在37-42℃条件下共孵育2-3小时，冷却纯化得Ang2-Exo外泌体。
8.一种如权利要求1-4或5任一所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法制备获得的多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体，其特征在于，所述多肽为RVG29。
9.一种如权利要求1-4或6任一所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法制备获得的多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体，其特征在于，所述多肽为TAT。
10.一种如权利要求1-4或7任一所述多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的制备方法制备获得的多肽修饰人脐带间充质细胞源外泌体的给药载体，其特征在于，所述多肽为Ang2。
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