CN116763938A - 细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用 - Google Patents

细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116763938A
CN116763938A CN202210237024.3A CN202210237024A CN116763938A CN 116763938 A CN116763938 A CN 116763938A CN 202210237024 A CN202210237024 A CN 202210237024A CN 116763938 A CN116763938 A CN 116763938A
Authority
CN
China
Prior art keywords
siythdf1
extracellular
extracellular vesicle
nucleic acid
delivery system
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210237024.3A
Other languages
English (en)
Inventor
朱凌
余佳
游青
杨延莲
王芳
王琛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Center for Nanosccience and Technology China
Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Original Assignee
National Center for Nanosccience and Technology China
Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Center for Nanosccience and Technology China, Institute of Basic Medical Sciences of CAMS filed Critical National Center for Nanosccience and Technology China
Priority to CN202210237024.3A priority Critical patent/CN116763938A/zh
Publication of CN116763938A publication Critical patent/CN116763938A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1896—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes not provided for elsewhere, e.g. cells, viruses, ghosts, red blood cells, virus capsides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明提供一种细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，还提供其制备方法及应用。细胞外囊泡表面高表达CD47蛋白，可与单核巨噬细胞表面的SIRPα相结合，避免单核巨噬细胞系统的吞噬，延长循环时间。同时，利用工程化修饰的方法对细胞外囊泡进行归巢肽及核磁造影剂的修饰以实现对肿瘤组织的靶向递送及核磁成像追踪。该工程化细胞外囊泡还可通过电穿孔的方法包载能够敲降YTHDF1表达的siYTHDF1，并将其有效地递送到胃癌细胞中，靶向并调控胃癌细胞中的表观遗传调控因子实现高效、低毒的胃癌治疗策略。本发明构建的工程化细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统为靶向并调控m6A表观遗传因子的胃癌治疗提供了可行的方法和技术。

Description

细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米药物领域，具体涉及一种细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用。
背景技术
胃癌是严重威胁人类健康的一种疾病，其发病率和死亡率均居于前列，具有早期不易复发、预后较差的特点，并且在分子层面具有潜在的生物学和遗传异质性。现有的研究表明，表观遗传调控可能在胃癌的起因和发展过程具有重要作用。N6-甲基腺嘌呤核苷酸甲基化(m6A)是一种存在于真核生物中最普遍的RNA转录后修饰，参与DNA修复、细胞分化、及细胞周期凋亡等基本生命活动。现有研究表明，m6A识别蛋白YTHDF1在胃癌组织中过表达，且与胃肿瘤细胞的异常增殖、远端转移及发生进展等息息相关。因此利用siRNA等手段的基因治疗方法敲降YTHDF1蛋白的表达，进而通过调控m6A表观遗传的方式可实现对胃癌的抑制与治疗。目前常见的siRNA药物载体(主要包括病毒、聚乙烯基亚胺纳米颗粒以及脂质体等)存在选择性差、肿瘤靶向能力低、可导致严重的系统毒性和免疫原性等特点，限制了其临床应用。因此，利用合适的药物载体将能够敲降YTHDF1蛋白表达的核酸药物特异性地递送到胃癌细胞具有重要意义。
细胞外囊泡是细胞产生的一种具有磷脂双分子层结构的囊泡结构，它具有良好的生物相容性、低免疫原性和低毒性等特点。表面高表达CD47的细胞外囊泡(RsEVs)可与单核巨噬细胞表面的SIRPα相结合，避免单核巨噬细胞系统的吞噬，实现长循环。进一步利用工程化修饰的方法细胞外囊泡进行肿瘤靶向肽及核磁造影剂的修饰，可实现对肿瘤组织的靶向递送及核磁成像(MRI)追踪。利用工程化细胞外囊泡，可以将敲降YTHDF1表达的siYTHDF1基因有效地递送到胃癌细胞中，靶向并调控胃癌中的表观遗传调控因子来实现高效、低毒的胃癌治疗策略。目前尚未有研究将基于细胞外囊泡的纳米载药技术与m6A表观遗传调控方式相结合来实现对胃癌的治疗。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用。本发明可解决m6A表观遗传调控治疗相关的高系统毒性、低肿瘤靶向性和给药效率等问题，为通过靶向并调控m6A表观遗传因子的方式实现肿瘤治疗提供新思路，具巨大的临床应用潜力。
在阐述本发明之前，定义本文所使用的术语如下：
术语“RsEVs”是指CD47高表达细胞来源的细胞外囊泡。
术语“c(RGDyC)”是指环状RGD多肽。
术语“DSPE-DOTA”是指将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)连接而成的化合物。
术语“PGRsEVs”是指c(RGDyC)多肽和Gd核磁造影剂工程化修饰的细胞外囊泡。
术语“PGRsEVs-siYTHDF1”是指包载siYTHDF1的工程化修饰的细胞外囊泡。
术语“siYTHDF1”是指能敲降YTHDF1蛋白表达的siRNA，其序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3。
术语“m6A”是指N6-甲基腺嘌呤核苷酸甲基化。
术语“MRI”是指核磁成像。
术语“DMEM培养基”是指含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。
术语“PBS”是指磷酸盐缓冲盐溶液。
术语“HEPES”是指4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
术语“DAPI”是指4',6-二脒基-2-苯基吲哚。
术语“RAW264.7”是指小鼠单核巨噬细胞白血病细胞。
术语“YTHDF1”是指YTH结构域N6-甲基腺嘌呤(m6A)核苷酸结合蛋白1。
术语“CD47”是指各种细胞广泛表达的类Ig膜蛋白，可与多种细胞表面受体相互作用。
术语“SIRPα”是指信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα,SIRPα)。
术语“DSPE-PEG2000-c(RGDyC)”是指c(RGDyC)多肽连接的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
术语“Optiprep”是指一种分离液。
术语“RsVEs-NC-siYTHDF1”是指包载阴性对照(Negative control)siYTHDF1的细胞外囊泡。
术语“RsEVs-siYTHDF1”是指包载siYTHDF1的细胞外囊泡。
术语“NC-siYTHDF1”是指阴性对照(Negative control)siYTHDF1。
术语“Lipo”是指siRNA转染试剂Lipofectamine RNAiMAX。
术语“Lipo-NC-siYTHDF1”是指用Lipofectamine RNAiMAX转染siYTHDF1的阴性对照siRNA序列。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，所述细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统包括细胞外囊泡和siRNA；其中，所述siRNA被包载到表面由肿瘤靶向多肽及核磁造影剂修饰的细胞外囊泡中；
优选地，所述细胞外囊泡表面高表达CD47蛋白；
更优选地，所述细胞外囊泡的来源选自以下一种或多种细胞：巨噬细胞、CD47高表达的巨噬细胞稳转株和诱导多功能干细胞，进一步优选为巨噬细胞，最优选为Raw264.7细胞。
根据本发明第一方面的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，其中，
所述细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统中纳米颗粒的粒径为150nm～250nm，优选为150nm～200nm；
所述siRNA和所述细胞外囊泡的质量比为0.1～5:0.5～10，优选为0.5～1.5:0.5～4，最优选为1:1；和/或
所述siRNA为能够敲降YTHDF1蛋白表达的RNA序列siYTHDF1；
优选地，所述RNA序列siYTHDF1选自以下一种或多种：siYTHDF1-01、siYTHDF1-02、siYTHDF1-03，进一步优选为siYTHDF1；
更优选地，所述siYTHDF1-01的靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3’；所述siYTHDF1-02的靶序列为5’-GGAAACGTCCAGCCTAATT-3’；和/或所述siYTHDF1-03的靶序列为5’-GCTCAACCGCAGTATCAGA-3’。
根据本发明第一方面的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，其中，所述肿瘤靶向多肽为RGD多肽或其衍生序列，优选为环状RGD多肽；
优选地，所述环状RGD多肽选自以下一种或多种：c(RGDyC)、c(RGDyK)、c(RGDfC)和c(RGDfK)，最优选为c(RGDyC)。
根据本发明第一方面的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，其中，所述核磁造影剂为含有核磁成像功能金属元素的核磁造影剂；
优选地，所述核磁造影剂选自以下一种或多种：含有钆元素的核磁造影剂、含有锰元素的核磁造影剂、含有铁元素的核磁造影剂。
本发明的第二方面提供了制备第一方面所述的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取细胞外囊泡；
(2)对步骤(1)制备的细胞外囊泡进行肿瘤靶向多肽及核磁造影剂的修饰得到工程化细胞外囊泡；
(3)将siRNA包载到步骤(3)制备的工程化细胞外囊泡中得到所述工程化细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(1)中包括以下步骤：
(A)制备无胞外囊泡的培养基；
(B)分离提取细胞外囊泡。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(1)中：
所述步骤(A)中还包括：离心培养基后取上清液过滤，得到所述无胞外囊泡的培养基；所述离心的力优选为90,000～130,000g，进一步优选为100,000～120,000g；和/或所述过滤的滤膜直径优选为0.2～0.4μm，进一步优选为0.22μm；和/或
所述步骤(B)中还包括：待细胞外囊泡的来源细胞密度达到50～60％时，换用步骤(A)制备的无胞外囊泡的培养基培养并收集上清液，然后分离细胞外囊泡，保存在冰箱中；所述培养基培养的时间优选为18～36小时，进一步优选为24小时；和/或所述冰箱的温度优选为-80℃。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(2)中还包括以下步骤：
(C)合成DSPE-DOTA-Gd；
(D)制备表面由肿瘤靶向多肽及核磁造影剂修饰的工程化细胞外囊泡；
优选地，所述步骤(C)中还包括将所得产物进行离心并纯化；和/或
优选地，所述步骤(D)中还包括将制得的终产物离心，纯化去除未反应的试剂，得所述工程化细胞外囊泡。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(3)中：所述包载的方法选自以下一种或多种：电穿孔、超声、常温孵育，最优选为电穿孔；
优选地，当所述包载的方法为电穿孔时，电穿孔后还包括以下步骤：培养并离心，得到所述细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统或按照第二方面所述的方法制备的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统在制备用于胃癌治疗的医药产品中的应用；
优选地，所述胃癌治疗的方式为表观遗传调控的方式；
更优选地，所述胃癌治疗的方式为靶向并调控N6-甲基腺嘌呤核苷酸甲基化表观遗传因子的方式。
本发明的提供了一种siYTHDF1，所述siYTHDF1的靶序列如下：
siYTHDF1-01的靶序列：5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3’；
siYTHDF1-02的靶序列：5’-GGAAACGTCCAGCCTAATT-3’；
siYTHDF1-03的靶序列：5’-GCTCAACCGCAGTATCAGA-3’；(由于RNA序列表计算机可读载体无法识别标记5’-和-3’，siYTHDF1的序列以说明书此处记载的序列为准)。
根据本发明的一个具体实施例，本发明的第一方面提供了一种工程化细胞外囊泡纳米药物递送系统，所述工程化细胞外囊泡纳米药物递送系统利用工程化修饰的方法对CD47高表细胞来源的细胞外囊泡进行c(RGDyC)肿瘤靶向肽及核磁造影剂的修饰，并通过电穿孔的方法包载能够敲降YTHDF1蛋白表达的siYTHDF1。该工程化核酸纳米药物递送系统可在体循环时避免单核巨噬细胞细胞的吞噬，延长体内循环时间。同时该核酸纳米药物递送系统还具有增强的肿瘤靶向性及核磁成像的特点，可靶向并调控胃癌中的表观遗传调控因子实现高效、低毒的胃癌诊断治疗一体化研究。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的工程化细胞外囊泡纳米药物递送系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取CD47高表达细胞来源的细胞外囊泡(RsEVs)；
(2)对RsEVs进行c(RGDyC)肿瘤靶向肽及核磁造影剂的修饰得到工程化细胞外囊泡(PGRsEVs)；
(3)利用电穿孔的方法将siYTHDF1包载到工程化细胞外囊泡(PGRsEVs)中得到工程化细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统(PGRsEVs-siYTHDF1)。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)包括以下步骤：
(A)制备无胞外囊泡的培养基。
将含有20％-50％胎牛血清的DMEM培养基放入超速离心机离心12-14小时后收集上清，将所得上清液用滤膜进行过滤，加入DMEM培养基进行稀释得到去除胞外囊泡的含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基。
优选地，步骤(A)中所述超速离心的离心力为100,000-120,000g，使用的滤膜为0.22μm的滤膜。
(B)提取CD47高表达细胞的胞外囊泡。
待细胞密度达到50-60％时，换用无胞外囊泡的培养基培养24小时并收集上清液，然后进行以下步骤来分离细胞外囊泡：
a)将收集到的细胞上清液在4℃条件下，用程序化离心的方法去除坏死细胞及细胞碎片等，并用0.22μm滤膜进行过滤。
优选地，步骤a)所述的程序化离心方法优选地为800g的离心力离心5分钟，收集上清后再以2,000g离心力继续离心15-20分钟。
b)将步骤a)所得的细胞上清液分装到超速离心管中，配平后均匀放到超速离心机中，在4℃条件下，超速离心1.5-2小时去除上清，并收集离心管壁的细胞外囊泡样品。
优选地，步骤b)所述的超速离心的离心力为100,000-150,000g，所述的配平应使各离心管的质量差控制在0.05g以内。
c)用PBS重悬步骤b)所得的细胞外囊泡，在4℃条件下继续超速离心1.5-2小时，离心结束后去掉上清，向超离管中加入PBS分散并收集离心管壁的细胞外囊泡样品，分装后将其保存在-80℃冰箱中。
优选地，步骤c)所述超速离心的离心力为100,000-150,000g。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(2)包括以下步骤：
(A)DSPE-DOTA-Gd的合成：
将80-100mg的DSPE-DOTA(西安瑞禧)与30-50毫升的醋酸缓冲液混合，然后在45-55℃下加入的0.8mmol-1.2mmol的Gd(OAc)3溶液反应10-14小时，待混合物温度降到室温后离心纯化，得到的产物用醋酸缓冲液清洗3-5次，除去非螯合的Gd3+。
(B)PGRsEVs的制备：
将15-25mg的DSPE-PEG2000-c(RGDyC)(西安瑞禧)和60-100mg的DSPE-DOTA-Gd在55-65℃下溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，待体系温度降到37℃左右加入RsEVs继续反应1.5-2.5小时得到PGRsEVs终产物，随后采用超速离心的方法进行纯化去除未反应的试剂。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(3)包括以下步骤：
将PGRsEVs和siYTHDF1按照相同的重量比溶解于电穿孔缓冲溶液中，然后将体系加入4mm电穿孔比色皿中，并将比色皿置于4℃冰上半小时。随后将比色皿放于电穿孔仪中进行电穿孔，电穿结束后，将体系置于37℃培养箱中使RsEVs进行恢复，随后继续在4℃条件下超速离心以分离游离的siYTHDF1。
优选地，所述电穿孔缓冲溶液为磷酸缓冲液，含1-1.5mM磷酸钾(pH值7.2)，20-30mM氯化钾和18％-25％的Optiprep。所述电穿孔方法采用的电穿孔参数为：体积，400μL；电压，350-450V；电容，100-150μF。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的工程化细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统/或按照第二方面所述的制备方法而制得的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统通过靶向并调控m6A表观遗传因子的方式实现对胃癌诊断与治疗一体化研究。
本发明提供了一种工程化细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，所述细胞外囊泡表面高表达CD47蛋白，可与单核巨噬细胞表面的SIRPα相结合，避免单核巨噬细胞系统的吞噬，延长循环时间。同时，利用工程化修饰的方法对细胞外囊泡进行归巢肽及核磁造影剂的修饰以实现对肿瘤组织的靶向递送及核磁成像(MRI)追踪。该工程化细胞外囊泡还可通过电穿孔的方法包载能够敲降YTHDF1表达的siYTHDF1，并将其有效地递送到胃癌细胞中，靶向并调控胃癌细胞中的表观遗传调控因子实现高效、低毒的胃癌治疗策略。本发明构建的工程化细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统为靶向并调控m6A表观遗传因子的胃癌治疗提供了可行的方法和技术。
本发明的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统可以具有但不限于以下有益效果：
1.本发明选择了CD47高表达细胞来源的细胞外囊泡，并验证了其表面高表达CD47蛋白，能够与单核巨噬细胞表面的SIRPα相结合，在体循环时，避免单核巨噬细胞系统的吞噬；
2.本发明利用工程化修饰的方法对CD47高表达细胞来源细胞外囊泡进行了归巢肽c(RGDyC)及核磁造影剂的修饰，可以实现对肿瘤组织的靶向递送及核磁成像(MRI)追踪；
3.本发明的核酸细胞外囊泡纳米药物递送能有效地将敲降YTHDF1表达的siYTHDF1基因递送到胃癌细胞中，靶向并调控胃癌中的表观遗传调控因子m6A实现胃癌的治疗；
4.本发明的核酸纳米药物递送系统具有低免疫源性、低毒性及较高的siRNA递送效率。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例1中CD47高表达细胞来源的胞外囊泡的形貌图。
图2示出了实施例1中PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒的粒径分布图。
图3示出了实施例3中RsEVs和PGRsEVs-siYTHDF1两种纳米颗粒Hsp70，Flotillin-1,CD47和CD81蛋白的表达情况。
图4示出了实施例4中Raw264.7,CD47高表达的Raw264.7稳转株及诱导多功能干细胞来源的胞外囊泡CD47的表达情况。
图5示出了实施例5中MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞对RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1两种纳米颗粒的摄取情况。其中DAPI用来染细胞核；siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示工程化细胞外囊泡药物递送系统在胃癌细胞内的分布；Merge是将指示细胞核的DAPI荧光和指示工程化细胞外囊泡药物递送系统细胞分布的Cy5荧光进行合并分析。
图6示出了实施例6中Lipo-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1三种纳米颗粒在MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞中对siYTHDF1的递送效率(PBS，RsEVs和siYTHDF1作为对照)。
图7示出了实施例7中PBS，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，Lipo-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1分别给予MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞后，目标YTHDF1蛋白的表达情况。
图8示出了实施例1与2中得到的对照组以及三个siYTHDF1对应的RsVEs-siYTHDF1-01，RsVEs-siYTHDF1-02和RsVEs-siYTHDF1-03纳米颗粒分别给予MGC-803胃癌细胞后，目标YTHDF1蛋白的表达情况。
图9示出了实施例8中PBS，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1对MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞的毒性作用。
图10示出了实施例9中给予荷MGC-803肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒，在注射0h,6h,12h,24h,48h和72h后肿瘤部位的核磁成像图(MRI)。
图11示出了实施例10中给予荷MGC-803肿瘤细胞的的小鼠尾静脉注射生理盐水，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒后，小鼠肿瘤体积变化图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
DSPE-DOTA和DSPE-PEG2000-c(RGDyC)购自西安瑞禧有限公司；
5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3’(siYTHDF1-01)、5’-GGAAACGTCCAGCCTAATT-3’(siYTHDF1-02)和5’-GCTCAACCGCAGTATCAGA-3’(siYTHDF1-03)均购自广州锐博生物技术有限公司；
醋酸购自阿拉丁公司；
Gd(OAc)3购自希恩思有限公司；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、MTS细胞增殖试剂盒、BCA蛋白质测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；
蛋白酶抑制剂(87785)，磷酸酶抑制剂(A32957)和蛋白裂解液(87787)均购自ThermoFisher(美国)有限公司；
优质胎牛血清(FBS)、Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)细胞培养基购自Gibco公司(美国)。
仪器：
生物透射电镜，购自日本日立科技有限公司，型号HT7700；
纳米颗粒跟踪分析仪，购自英国马尔文仪器有限公司，型号NS300；
单光子激光共聚焦成像系统，购自德国蔡司有限公司，型号Zeiss 710；
流式分析仪，购自美国BD公司，型号C6；
酶标仪，购自美国分子仪器(上海)有限公司，型号Molecular Devices I3；
小动物核磁共振成像仪，购自德国布鲁克公司，型号BioSpec70/20USR；
X-cell电穿孔仪，购自美国伯乐公司，型号165-2081。
实施例1
本实施例用于说明本发明细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)Raw 264.7细胞来源的细胞外囊泡(RsEVs)的提取：
(A)制备无胞外囊泡的培养基。
将含有40％胎牛血清的DMEM培养基放入超速离心机在120,000g的离心力下离心12小时后收集上清，将所得上清液用0.22μm的滤膜进行过滤，并加入单纯的DMEM培养基进行稀释得到去除囊泡的含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基，放于4℃冰箱待用。
(B)提取Raw264.7细胞的胞外囊泡。
待Raw 264.7细胞密度达到50-60％时，换用无胞外囊泡的培养基培养24小时并收集上清液，然后进行以下步骤来分离Raw 264.7细胞的细胞外囊泡：
a)将收集到的Raw 264.7细胞上清液在4℃条件下，以800g的离心力离心5分钟并收集上清。将所得上清液在4℃条件下，以2,000g离心力继续离心15分钟，再次收集上清，并使用0.22μm滤膜进行过滤；
b)将步骤a)所得上清分装到26mL离心管中，装满保证无气泡，配平使所有离心管的重量差均在0.05g内，随后将其放入贝克曼超速离心机中，在4℃条件下，以150,000g的离心力离心1.5小时后去除上清，保留离心管壁的沉淀样品；
c)在各离心管中加入PBS，将沉淀冲洗下来，并将八管离心管的沉淀样品合并到一个离心管中，使沉淀重新悬浮于26mL的PBS中，于4℃条件下，以150,000g离心力继续离心1.5小时；
d)超离结束后去除上清，向超离管中加入200μL的PBS分散并收集离心管壁的细胞外囊泡样品，分装后将其保存在-80℃冰箱中。
(2)对步骤(1)所得的RsEVs进行肿瘤靶向多肽c(RGDyC)及核磁造影剂DEPE-DOTA-Gd的修饰得到PGRsEVs：
(A)DSPE-DOTA-Gd的合成。
将100mg DSPE-DOTA(西安瑞禧)与40mL醋酸缓冲液混合，然后在50℃下加入1mmol的Gd(OAc)3反应12小时，待混合物温度降到室温后用4500g离心力离心10分钟进行纯化，得到的产物用醋酸缓冲液清洗3次，除去非螯合的Gd3+。
(B)PGRsEVs的制备。
将20mg的DSPE-PEG2000-c(RGDyC)(西安瑞禧)和80mg的DSPE-DOTA-Gd在60℃下溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)并持续15分钟。待体系温度降到37℃左右加入RsEVs继续反应2小时得到PGRsEVs终产物，随后采用超速离心的方法进行纯化去除未反应的试剂。
(3)通过电穿孔的方法将siYTHDF1包载到对步骤(2)所得的PGRsEVs中得到PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒。
将PGRsEVs和siYTHDF1-01(靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，广州锐博生物技术有限公司)按照1：1的重量比溶解于400μL电穿孔缓冲溶液中(1.15mM磷酸钾(pH值7.2)，25mM氯化钾，21％的Optiprep)，使PGRsEVs的终浓度不超过0.5μg/μL。然后将体系放入4mm电穿孔比色皿中，并将比色皿置于4℃冰上半小时。随后将比色皿放于基因脉冲X-cell电穿孔仪(BioRad，165-2081)中进行电穿孔，电穿孔参数设置为：体积，400μL；电压，400V；电容，125μF。电穿孔后的脉冲时间约为12到18毫秒。电穿孔后，将体系置于37℃培养箱中半小时到1小时使RsEVs恢复，再将其悬于26mL无RNA酶的PBS中，继续超速离心(4℃，150,000g，90分钟)以分离游离的siYTHDF1得到最终的PGRsEVs-siYTHDF1。
图1示出了实施例1中CD47高表达细胞来源的胞外囊泡的形貌图。
图2示出了实施例1中PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒的粒径分布图。
实施例2
本实施例将按照实施例1的方法分别合成包载siYTHDF1-02和siYTHDF1-03的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统。本实施例所用的siYTHDF1-02靶序列为5’-GGAAACGTCCAGCCTAATT-3’；siYTHDF1-03的靶向序列为5’-GCTCAACCGCAGTATCAGA-3’，均购自广州锐博生物技术有限公司。
实施例3
本实施例用于测试RsEVs和PGRsEVs-siYTHDF1两种纳米颗粒Hsp70，Flotillin-1,CD47和CD81蛋白的表达情况。
首先，测定RsEVs和PGRsEVs-siYTHDF1细胞外囊泡的蛋白裂解浓度用于免疫印迹法分析的细胞外囊泡样品应加入尽量少的PBS进行重悬以得到较高的浓度。在20μL的细胞外囊泡悬浮液中加入含有1/100(v/v)蛋白酶抑制剂和1/10磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液。充分涡旋混匀后，将样品置于冰上裂解30分钟左右。之后样品放置于冰水浴中利用超声清洗仪超声三次，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Solarbio，PC0020)进行蛋白质定量并计算蛋白浓度。将裂解好的细胞外囊泡与5×loading buffer缓冲液(NuPAGETM LDS样品缓冲液、4X、NP0007)混合，在100℃下加热5分钟，储存在-20℃待用。
本实施例所用的siYTHDF1靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，购自广州锐博生物技术有限公司。
接下来，用蛋白质免疫印迹法分析RsEVs和PGRsEVs-siYTHDF1两种纳米颗粒不同蛋白的表达。将10μg总蛋白的细胞外囊泡加入10％的Tris-HCl胶板上(Invitrogen)，通过电泳分离总蛋白并利用湿转法将蛋白质从胶上转移到聚氯乙烯氟化物膜(Invitrogen)上。转移完毕后，用0.1％Tween 20-Tris(TBST)缓冲溶液清洗PVDF膜，然后用5％(w/v)的脱脂牛奶室温封闭2小时，再加入4mL的一抗抗体稀释缓冲液(抗体稀释液是用TBST溶液配置好的5％的脱脂奶粉)在4℃中孵育过夜。用TBST清洗膜三次(每次5分钟)，再加入连接HRP的二抗抗体稀释液(抗体稀释液和一抗相同)孵育2小时，再次用TBST清洗膜三次(每次5分钟)。最后，将PVDF膜放入凝胶成像仪(伯乐，美国)并在膜上加入显影液(索莱宝，Solarbio)进行曝光。
图3示出了实施例3中RsEVs和PGRsEVs-siYTHDF1两种纳米颗粒Hsp70，Flotillin-1,CD47和CD81蛋白的表达情况。如图3所示，RsEVs高表达Hsp70、Flottlin-1、CD81细胞外囊泡特征蛋白(GADPH作为内参对照)，同时其表面也高表达CD 47蛋白。将ReEVs工程化修饰后得到的PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒其表面Hsp70、Flottlin-1、CD81和CD47蛋白且未发生明显变化。说明将ReEVs工程化修饰后得到PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒的过程并没有改变RsEVs相关蛋白的表达水平。
实施例4
本实施例将按照实施例3的方法分别测定巨噬细胞、CD47高表达的巨噬细胞稳转株和诱导多功能干细胞来源的胞外囊泡其表面CD47的表达情况。
图4示出了实施例4中Raw264.7,CD47高表达的Raw264.7稳转株及诱导多功能干细胞来源的胞外囊泡CD47的表达情况。
实施例5
本实施例用于测试MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞对RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1两种纳米颗粒的摄取情况。
将MGC-803和HGC-27细胞分别培养于共聚焦培养皿中(4×105细胞/孔)，培养一晚上，再分别加入10μL的RsEVs和PGRsEVs-siYTHDF1(相同浓度的细胞外囊泡：1×1010颗粒/mL)孵育1小时和12小时(本实验所用的siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示工程化细胞外囊泡药物递送系统在胃癌细胞内的分布)。MGC-803和HGC-27细胞用PBS洗涤，DAPI染色15分钟，洗涤后用单光子共聚焦显微镜(Zeiss公司，德国)观察两株胃癌细胞对细胞外囊泡的摄取情况。分析摄取情况时，将指示细胞核的DAPI荧光和指示工程化细胞外囊泡药物递送系统细胞分布的Cy5荧光进行合并分析(Merge)。
图5示出了实施例5中MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞对RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1两种纳米颗粒的摄取情况。其中DAPI用来染细胞核；siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示工程化细胞外囊泡药物递送系统在胃癌细胞内的分布；Merge是将指示细胞核的DAPI荧光和指示工程化细胞外囊泡药物递送系统细胞分布的Cy5荧光进行合并分析。
如图5所示，MGC-803和HGC-27两种胃癌细胞在PGRsEVs-siYTHDF1孵育后均表现出更强的Cy5信号，说明更多的纳米颗粒被细胞摄取。该实验结果说明经c(RGDyC)多肽修饰的纳米颗粒可与肿瘤细胞表面的αvβ3整合素相结合，增强了纳米颗粒对胃癌细胞的靶向能力。本实施例所用的siYTHDF1靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，购自广州锐博生物技术有限公司。
实施例6
本实施例用于测试Lipo-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1三种纳米颗粒在MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞中对siYTHDF1的递送效率(PBS，RsEVs和siYTHDF1作为对照)。
将MGC-803和HGC-27细胞分别置于CLSM培养皿中(每孔4×105个细胞)，培养12小时后，分别加入PBS，RsEVs，siYTHDF1，Lipo-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒(所有样品的体积均为80μL，所含RsEVs的个数相同，为1×1010particles/mL)分别孵育1和12h。随后用PBS洗涤MGC-803和HGC-27细胞并用DAPI染色15分钟，最后采用流式细胞术检测siYTHDF1的摄取情况。
图6示出了实施例6中Lipo-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1三种纳米颗粒在MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞中对siYTHDF1的递送效率(PBS，RsEVs和siYTHDF1作为对照)。
图6的流式细胞结果显示，MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞对游离NC-siYTHDF1的摄取率可以忽略不计，Lipo转染试剂对siYTHDF1的递送率为35.7％-40.3％，RsEVs对siYTHDF1的递送率为64.4％-70.9％，证实了细胞外囊泡作为递送系统时可以显著提高siYTHDF1的递送效率。当对RsEVs进行工程化修饰后，其递送效率会被进一步增强可达88.6％-96.8％，这是由于归巢肽c(RGDyC)的修饰增强了两株胃癌细胞对纳米颗粒的摄取。本实施例所用的siYTHDF1靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，购自广州锐博生物技术有限公司。
实施例7
本实施例用于测试PBS，RsEVs，Lipo-siYTHDF1，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1分别给予MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞后，目标YTHDF1蛋白的表达情况。
将MGC-803和HGC-27细胞分别置于六孔细胞培养板里(每孔4×105个细胞)，培养一晚上后，分别加入PBS，RsEVs，Lipo-siYTHDF1，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒(所有样品的体积均为80μL，所含RsEVs的个数相同，为1×1010颗粒/毫升)分别孵育48小时，随后按照试验例1的步骤提取各组样品孵育后胃癌细胞的蛋白并用蛋白质免疫印迹法分析经Lipo及细胞外囊泡介导的药物载体递送siYTHDF1到MGC-803和HGC-27细胞后，其YTHDF1蛋白的表达水平。
图7示出了实施例7中PBS，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，Lipo-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1分别给予MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞后，目标YTHDF1蛋白的表达情况。
图7的Western blot结果显示，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1组的YTHDF1蛋白水平显著降低，说明构建的工程化细胞外囊泡药物递送系统可将siYTHDF1递送到两株胃癌细胞，并成功地敲降YTHDF1蛋白的表达水平。本实施例所用的siYTHDF1靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，购自广州锐博生物技术有限公司。
实施例8
本实施例将按照实施例7的方法测试PBS，RsEVs，PGRsEVs，PGRsVEs-siYTHDF1-01，PGRsEVs-siYTHDF1-02和PGRsEVs-siYTHDF1-03分别处理MGC-803胃癌细胞后，目标YTHDF1蛋白的表达情况。本实施例所用的siYTHDF1-01靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3’；siYTHDF1-02靶序列为5’-GGAAACGTCCAGCCTAATT-3’；siYTHDF1-03的靶向序列为5’-GCTCAACCGCAGTATCAGA-3’，均购自广州锐博生物技术有限公司。
图8的Western blot结果显示，siYTHDF1-01，siYTHDF1-02，siYTHDF1-03均可以成功地敲降YTHDF1蛋白的表达水平。
实施例9
本实施例用于测试PBS，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1对MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞的毒性作用。
将MGC-803和HGC-27细胞分别以1×104个/孔的密度接种到96孔板中并培养一晚上。随后在两株胃癌细胞中分别加入不同的样品(PBS、RsEVs、NC-siYTHDF1、Lipo-NC-siYTHDF1、RsEVs-NC-siYTHDF1和PGRsEVs-NC-siYTHDF1)(siYTHDF1的量均为每孔2pmol)，孵育0、24、48、72和96小时。孵育结束后分别向每孔加入20μL的CCK8再孵育2-3小时，用酶标仪在490nm处测定吸光度。
图9示出了实施例9中PBS，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1对MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞的毒性作用。
图9的结果显示，RsEVs和RsEVs-NC-siYTHDF1组对MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞均没有明显的毒副作用，而RsEVs-siYTHDF1纳米颗粒可以很好地抑制两株胃癌细胞的增殖，且PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒对肿瘤细胞增殖的抑制作用进一步被增强。本实施例所用的siYTHDF1靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，购自广州锐博生物技术有限公司。
实施例10
本实施例用于测试给予荷MGC-803肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒后，在注射0h,6h,12h,24h,48h和72h时肿瘤部位的核磁成像图(MRI)。
为了检测PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒在小鼠体内MR成像，给荷瘤小鼠静脉注射PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒(Gd为0.04mmol/kg)，并在注射后不同时间点(0h、6h、12h、24h、48h和72h)采用7.0T小动物核磁共振成像仪(BioSpec 70/20USR、Bruker、德国)采集MR图像。
图10示出了实施例10中给予荷MGC-803肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒，在注射0h,6h,12h,24h,48h和72h后肿瘤部位的核磁成像图(MRI)。
图10的结果显示了PGRsEV-siYTHDF1纳米颗粒静脉注射后在不同时间点(0h、6h、12h、24h、48h和72h)的核磁共振成像(MRI)效果。其中，T1的MR图像显示肿瘤轮廓明显，边界清晰，且核磁成像对比度良好。在注射PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒后，肿瘤部位PGRsEVs-siYTHDF1的MRI信号值逐渐增强，在24h时达到最大值，随后慢慢减弱，72h时仍可在肿瘤部位检测到，表明PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒具有良好的核磁共振成像特点和肿瘤靶向效果。本实施例所用的siYTHDF1靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，购自广州锐博生物技术有限公司。
实施例11
本实施例用于测试给予荷MGC-803肿瘤细胞的的小鼠尾静脉注射生理盐水，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒后，小鼠肿瘤体积变化图。
为了研究PGRsEVs-siYTHDF1的抗肿瘤效果，我们首先利用MGC-803细胞在Balb/c裸鼠上建立了皮下细胞系异种移植模型并随机对其进行分为5组(每组六只)。每组小鼠通过尾静脉的方式注射生理盐水(Control)、RsEVs、RsEVs-NC-siYTHDF1、RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1(每组注射的细胞外囊泡量为1×1011个/mL，120μl；siYTHDF1的用量为3μg)。隔天进行给药治疗，并用游标卡尺测量各组裸鼠肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积。体积计算公式：V＝ab2/2。本实施例所用的siYTHDF1靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3，购自广州锐博生物技术有限公司。
图11示出了实施例11中给予荷MGC-803肿瘤细胞的的小鼠尾静脉注射生理盐水，RsEVs，RsVEs-NC-siYTHDF1，RsEVs-siYTHDF1和PGRsEVs-siYTHDF1纳米颗粒后，小鼠肿瘤体积变化图。
图11结果显示，与其他治疗组相比，PGRsEVs-siYTHDF1对肿瘤体积的抑制作用最为明显，治疗28天后其肿瘤图片大小和重量均明显低于其他组，证明了细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统对胃癌的治疗作用。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaacaacat ctatcagca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaaacgtcc agcctaatt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctcaaccgc agtatcaga 19

Claims (10)

1.一种细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，其特征在于，所述细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统包括细胞外囊泡和siRNA；其中，所述siRNA被包载到表面由肿瘤靶向多肽及核磁造影剂修饰的细胞外囊泡中；
优选地，所述细胞外囊泡表面高表达CD47蛋白；
更优选地，所述细胞外囊泡的来源选自以下一种或多种细胞：巨噬细胞、CD47高表达的巨噬细胞稳转细胞和诱导多功能干细胞，进一步优选巨噬细胞，最优选为Raw264.7细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，其特征在于：
所述细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统中纳米颗粒的粒径为150nm～250nm，优选为150nm～200nm；
所述siRNA和所述细胞外囊泡的质量比为0.1～5:0.5～10，优选为0.5～1.5:0.5～4，最优选为1:1；和/或
所述siRNA为能够敲降YTHDF1蛋白表达的RNA序列siYTHDF1；
优选地，所述RNA序列siYTHDF1选自以下一种或多种：siYTHDF1-01、siYTHDF1-02、siYTHDF1-03，进一步优选为siYTHDF1；
更优选地，所述siYTHDF1-01的靶序列为5’-GGAACAACATCTATCAGCA-3’；所述siYTHDF1-02的靶序列为5’-GGAAACGTCCAGCCTAATT-3’；和/或所述siYTHDF1-03的靶序列为5’-GCTCAACCGCAGTATCAGA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，其特征在于：所述肿瘤靶向多肽为RGD多肽或其衍生序列，优选为环状RGD多肽；
优选地，所述环状RGD多肽选自以下一种或多种：c(RGDyC)、c(RGDyK)、c(RGDfC)、c(RGDfK)，最优选为c(RGDyC)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统，其特征在于：所述核磁造影剂为含有核磁成像功能金属元素的核磁造影剂；
优选地，所述核磁造影剂选自以下一种或多种：含有钆元素的核磁造影剂、含有锰元素的核磁造影剂、含有铁元素的核磁造影剂。
5.制备根据权利要求1至4中任一项所述的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取细胞外囊泡；
(2)对步骤(1)制备的细胞外囊泡进行肿瘤靶向多肽及核磁造影剂的修饰得到工程化细胞外囊泡；
(3)将siRNA包载到步骤(3)制备的工程化细胞外囊泡中得到所述工程化细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中包括以下步骤：
(A)制备无胞外囊泡的培养基；
(B)分离提取细胞外囊泡。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中：
所述步骤(A)中还包括：离心培养基后取上清液过滤，得到所述无胞外囊泡的培养基；所述离心的力优选为90,000～130,000g，进一步优选为100,000～120,000g；和/或所述过滤的滤膜直径优选为0.2～0.4μm，进一步优选为0.22μm；和/或
所述步骤(B)中还包括：待细胞外囊泡的来源细胞密度达到50～60％时，换用步骤(A)制备的无胞外囊泡的培养基培养并收集上清液，然后分离细胞外囊泡，保存在冰箱中；所述培养基培养的时间优选为18～36小时，进一步优选为24小时；和/或所述冰箱的温度优选为-80℃。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括以下步骤：
(C)合成DSPE-DOTA-Gd；
(D)制备表面由肿瘤靶向多肽及核磁造影剂修饰的工程化细胞外囊泡；
优选地，所述步骤(C)中还包括将所得产物进行离心并纯化；和/或
优选地，所述步骤(D)中还包括将制得的终产物离心，纯化去除未反应的试剂，得所述工程化细胞外囊泡。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中：所述包载的方法选自以下一种或多种：电穿孔、超声、常温孵育，最优选为电穿孔；
优选地，当所述包载的方法为电穿孔时，电穿孔后还包括以下步骤：培养并离心，得到所述细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统。
10.权利要求1至4中任一项所述的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统或按照权利要求5至9中任一项所述的方法制备的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统在制备用于胃癌治疗的医药产品中的应用；
优选地，所述胃癌治疗的方式为表观遗传调控的方式；
更优选地，所述胃癌治疗的方式为靶向并调控N6-甲基腺嘌呤核苷酸甲基化表观遗传因子的方式。
CN202210237024.3A 2022-03-11 2022-03-11 细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用 Pending CN116763938A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210237024.3A CN116763938A (zh) 2022-03-11 2022-03-11 细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210237024.3A CN116763938A (zh) 2022-03-11 2022-03-11 细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116763938A true CN116763938A (zh) 2023-09-19

Family

ID=87990203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210237024.3A Pending CN116763938A (zh) 2022-03-11 2022-03-11 细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116763938A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117165568A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 北京恩泽康泰生物科技有限公司 工程化改造的psd蛋白、细胞外囊泡及其制备方法和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117165568A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 北京恩泽康泰生物科技有限公司 工程化改造的psd蛋白、细胞外囊泡及其制备方法和应用
CN117165568B (zh) * 2023-11-03 2024-02-27 北京恩泽康泰生物科技有限公司 工程化改造的psd蛋白、细胞外囊泡及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10675244B2 (en) Microvesicles derived from nucleated, mammalian cells and use thereof
CN109666695B (zh) 一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用
Liu et al. An optimized ionizable cationic lipid for brain tumor-targeted siRNA delivery and glioblastoma immunotherapy
Ohno et al. Exosome-mediated targeted delivery of miRNAs
Li et al. A siRNA-induced peptide co-assembly system as a peptide-based siRNA nanocarrier for cancer therapy
CN113197880B (zh) 一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用
CN106890343B (zh) 一种靶向型多肽纳米基因载体复合物
Xie et al. Insight into the efficient transfection activity of a designed low aggregated magnetic polyethyleneimine/DNA complex in serum-containing medium and the application in vivo
Liu et al. Engineered superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) for dual-modality imaging of intracranial glioblastoma via EGFRvIII targeting
CN115975051A (zh) 靶向外泌体及制备方法、应用、药物和药物递送系统
CN116763938A (zh) 细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统、其制备方法及应用
CN115252582A (zh) 红细胞膜杂合pH脂质体包被溶瘤病毒制剂的制备及应用
Shao et al. Phenylboronic acid-functionalized polyaminoglycoside as an effective CRISPR/Cas9 delivery system
Du et al. Novel application of cell penetrating R11 peptide for diagnosis of bladder cancer
Jiang et al. Genetically Engineered Cell Membrane‐Coated Magnetic Nanoparticles for High‐Performance Isolation of Circulating Tumor Cells
US11951171B2 (en) Polypeptide EXP and its drug delivery system as well as extracellular vesicle extraction
CN115029320A (zh) 用于肿瘤放疗增敏的工程化外泌体、制备方法、应用
CN114410636A (zh) 改进型AS1411核酸适配体及利用其偶联的EVs
WO2018096457A1 (en) Nucleic acid condensing peptide, nucleic acid condensing peptide set, nucleic acid delivery carrier, nucleic acid delivery method, cell production method, cell detection method and kit
CN108403665B (zh) EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体、递送系统及其制备与应用
Wu et al. The MRI-Visible Nanocomposite Facilitates the Delivery and Tracking of siRNA Loaded DC Vaccine in the Breast Cancer Model
CN115998709B (zh) 一种膜融合纳米核酸载体及其制备方法与应用
CN110964086A (zh) 整合素β3受体高亲和力的多肽及应用
CN110628719B (zh) 一种诱导细胞快速产生囊泡的方法及其应用
Zhu et al. Preparation and Evaluation of Virus-Inspired Nanogenes for Host-Specific Transfection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication