CN117165568B

CN117165568B - 工程化改造的psd蛋白、细胞外囊泡及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117165568B
Application number: CN202311450629.1A
Authority: CN
Inventors: 赵立波; 张嘉珣; 孔关义; 赵航; 刘达; 李志�; 游栉铖
Original assignee: Beijing Echo Biotech Co ltd
Current assignee: Beijing Echo Biotech Co ltd
Priority date: 2023-11-03
Filing date: 2023-11-03
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2043-11-03
Also published as: CN117165568A

Abstract

本申请公开一种工程化改造的磷脂酰丝氨酸脱羧酶(PSD蛋白)及其应用、包含所述工程化改造的PSD蛋白的融合蛋白及其应用、编码所述工程化改造的PSD蛋白或所述的融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体、包含所述核酸分子或所述表达载体的工程化改造的细胞、制备工程化改造的细胞外囊泡的方法、工程化改造的细胞外囊泡及其应用。本申请通过工程化改造的磷脂酰丝氨酸脱羧酶对细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸进行催化，减少巨噬细胞的吞噬，进而减少体内清除，延长细胞外囊泡的循环时间。

Description

工程化改造的PSD蛋白、细胞外囊泡及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于生物工程领域，具体涉及一种工程化改造的PSD蛋白、工程化改造的细胞外囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)是由细胞分泌的，直径大约为30~1000nm，能够被受体细胞摄取的膜性囊泡小体。EV作为蛋白质、RNA、脂质等生物大分子在细胞间转运的载体，是细胞与细胞间通讯的重要媒介，因此也被认为是一种天然驯化的药物载体。

细胞外囊泡的药代动力学是开发细胞外囊泡药物递送系统的重要问题之一。据报道，静脉注射的细胞外囊泡药物半衰期小于10分钟，主要被肝脏中的巨噬细胞清除(Imai等, 2015; Morishita等, 2015)。而巨噬细胞主要通过识别磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰丝氨酸导致的细胞外囊泡表面负电荷被巨噬细胞识别，并与静脉注射后被巨噬细胞清除相关(Matsumoto等, 2017)。

目前有文章通过Tim4(一个特异性与磷脂酰丝氨酸结合的蛋白)胶珠来捕获PS(+)-EV，进而反向筛选出PS(-)-EV，其在天然细胞外囊泡中只占10%。PS(-)-EV经静脉注射后能够大大延长细胞外囊泡的半衰期(Matsumoto et al., 2021)。因此如何获取PS(-)-EV是一项改善细胞外囊泡循环时间的关键技术。

目前文献中常用的方法有：(1)通过Tim4偶联磁珠捕获PS(+)-EV，反向筛选出PS(-)-EV；(2)直接提取血浆中的细胞外囊泡，因为血浆中的细胞外囊泡已经经过巨噬细胞吞噬后残留的PS(-)-EV(Matsumoto等, 2021)；(3)通过原核表达纯化磷脂酰丝氨酸脱羧酶(PSD)，体外添加PSD与EV共孵育催化，获取PS(-)-EV(Kobayashi 等, 2022)。

然而，通过Tim4偶联胶珠反向筛选的方法，由于天然细胞外囊泡中PS(-)-EV仅占10%左右，细胞外囊泡的产量非常低。从血浆中提取PS(-)-EV的方法，成本高，产量低。体外PSD催化的方法由于需要表达纯化PSD蛋白，PSD蛋白可溶性较低，导致蛋白产量较低。表达后蛋白孵育容易引入其它污染。体外孵育反应速度慢，孵育时间过长容易对细胞外囊泡造成影响。体外孵育后需要进行再纯化，增加细胞外囊泡生产工序，存在细胞外囊泡产量的损失。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本申请提供了一种工程化改造的PSD蛋白和一种工程化改造的细胞外囊泡，通过工程化改造的PSD蛋白对细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸进行催化，减少巨噬细胞的吞噬，进而减少体内清除，延长细胞外囊泡的循环时间。

本申请的具体技术方案如下：

1. 一种工程化改造的磷脂酰丝氨酸脱羧酶(PSD蛋白)，其包含如下三个功能域：参照如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的第114~139位的X₁X₂X₃X₄(X₅)_mX₆(X₇)_nX₈X₉X₁₀、第191~120位的X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀和第307~309位的X₂₁X₂₂X₂₃；

其中，X₁、X₂各自独立地为Phe、Trp、Leu、Val、Ile或Tyr；

X₄、X₆各自独立地为Arg、Lys、Gln或Asn；

X₈、X₁₁、X₂₀为Pro；

X₁₀为Asp、Glu或Asn；

X₁₄为Tyr、Trp、Phe、Thr或Ser；

X₁₅、X₁₈、X₁₉各自独立地为His、Asn、Gln、Lys或Arg；

X₂₁为Gly；

X₂₂为Ser；

X₂₃为Ser、Thr或Val；

X₃、X₅、X₇、X₉、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇各自独立地为任意氨基酸，m、n分别表示m、n个重复的氨基酸，m=1-6、2-5、3-4，或该数值范围内的任意正整数，n=1-12、2-11、3-10、4-9、5-8、6-7，或该数值范围内的任意正整数；

优选地，所述PSD蛋白包含如下三个功能域：参照如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的第114~139位的FFXRX₆RX₁₂PXD、第191~120位的PXXYHXXHXP和第307~309位的GSS/GST，其中X各自独立地为任意氨基酸。

2. 根据项1所述的工程化改造的PSD蛋白，其为来源于诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)的PSD蛋白。

3. 根据项1或2所述的工程化改造的PSD蛋白，其为N端缺失1至45位氨基酸的截短的PSD蛋白，优选为N端缺失1至34位氨基酸的截短的PSD蛋白。

4. 根据项1~3中任一项所述的工程化改造的PSD蛋白，其包含在一个或两个位置的插入、缺失或替换突变，所述位置为相对于如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的第217位和第219位；

优选地，所述突变为替换突变；

优选地，所述替换突变为P217H和F219N；

优选地，所述工程化改造的PSD蛋白包含如SEQ ID NO: 3~SEQ ID NO: 5和SEQ IDNO: 10~SEQ ID NO: 12中任一个所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 3~SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 10~SEQ ID NO: 12中任一个所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。

5. 一种融合蛋白，其包含根据项1~4中任一项所述的工程化改造的PSD蛋白。

6. 根据项5所述的融合蛋白，其还包含促进PSD蛋白可溶性的序列，优选为GST序列。

7. 根据项5或6所述的融合蛋白，其还包含一种或多种信号肽；

优选地，所述信号肽为分泌型蛋白的信号肽；

优选地，所述分泌型蛋白选自抗体、细胞因子、蛋白质类激素和消化酶中的一种或两种以上；

优选地，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：8中任一个所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：8中任一个所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。

8. 一种编码项1~4中任一项所述的工程化改造的PSD蛋白或者项5~7中任一项所述的融合蛋白的核酸分子；

优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO: 9所示，或为具有与SEQ ID NO: 9至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的核苷酸序列。

9. 一种表达载体，其包含项8所述的核酸分子。

10. 一种工程化改造的细胞，其包含项8所述的核酸分子和编码货物蛋白的核酸分子；

优选地，所述货物蛋白选自治疗性肽、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、荧光蛋白、酶和连接治疗化合物的接头中的一种或多种；

优选地，所述治疗性肽是抗体和/或细胞因子，例如所述细胞因子选自如下的一种或多种：人白细胞介素家族成员、肿瘤坏死因子家族成员、干扰素和T细胞衔接器；

优选地，所述RNA结合蛋白选自如下的一种或多种：L7Ae、hnRNPA2B1、hnRNPC1、hnRNPG、hnRNPK、hnRNPQ、YBX1、HuR、AGO2、IGF2BP1、MEX3C、ANXA2、ALIX、NCL、FUS和MVP。

11. 一种制备工程化改造的细胞外囊泡的方法，其包括以下步骤：

培养项10所述的工程化改造的细胞，并从培养基中分离所述工程化改造的细胞分泌的细胞外囊泡。

12. 一种工程化改造的细胞外囊泡，其包含项5~7中任一项所述的融合蛋白和货物蛋白；

优选地，所述融合蛋白位于所述细胞外囊泡膜上；

13. 一种药物组合物，其包含项12所述的工程化改造的细胞外囊泡或项11所述的方法制备的工程化改造的细胞外囊泡，以及药学上可接受的载体。

14. 项5~7的融合蛋白、项12所述的工程化改造的细胞外囊泡或项11所述的方法制备的工程化改造的细胞外囊泡在制备诊断、治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

15. 一种诊断、治疗和/或预防疾病的方法，包括给予有需要的受试者有效量的项12所述的工程化改造的细胞外囊泡或项11所述的方法制备的工程化改造的细胞外囊泡。

发明的效果

与现有技术大部分真核生物中的PSD蛋白可溶性较低不同，本申请的工程化改造的PSD蛋白天然存在部分可分泌形式，可溶性较高，蛋白产量高。本申请通过构建能够表达工程化改造的PSD蛋白或通过构建能够表达包含工程化改造的PSD蛋白的融合蛋白的工程化细胞，使工程化改造的PSD蛋白或融合蛋白分泌至细胞培养上清，在细胞分泌细胞外囊泡过程中就能够同时完成PSD催化磷脂酰丝氨酸羧基裂解，在工程化改造的细胞外囊泡提取后即可获得表面PS含量极低的细胞外囊泡，能够显著减少巨噬细胞吞噬，增加细胞外囊泡在体内的循环时间。本申请的制备工程化改造的细胞外囊泡的方法简便、耗时短、成本低，同时还能够避免再纯化过程中细胞外囊泡的损失。

附图说明

图1A和图1B为PSD细胞和未转入质粒的HEK293F细胞的免疫印迹分析结果图。

图2为通过his亲和层析纯化his-GST-pkPSD_35_319蛋白的电泳鉴定结果图。

图3A和图3B分别为对照组细胞外囊泡和加入pkPSD催化的细胞外囊泡的纳米流氏细胞结果图。

图4A为将细胞外囊泡与pkPSD蛋白在37℃共孵育0min、10min、30min、60min、120min后的纳米流氏细胞结果图；图4B为将细胞外囊泡分别与0μL、10μL、30μL、50μL、70μLpkPSD蛋白在37℃共孵育3h后的纳米流氏细胞结果图。

图5 A和图5B为HEK293F提取细胞外囊泡293F EV、293F+PSD酶进行催化获得的细胞外囊泡293F EV+PSD、基于PSD工程化细胞提取的细胞外囊泡PSD EV的FlowJo流氏分析结果图。

图6为不同浓度的对照组的293F EV和实验组的PSD EV与RAW264.7巨噬细胞共孵育后的纳米流氏细胞结果图。

图7为通过小鼠尾静脉注射相同颗粒数的2293F EV(CK EV)、293F EV体外添加PSD催化后的EV(CK EV+PSD)和PSD EV后，不同时间点检测小鼠血清中的细胞外囊泡含量柱状图。

图8为将pkPSD、hPSD、mPSD瞬转至293F细胞中提取的细胞外囊泡的AnV-FITC阳性率/MFI检测结果图。

图9为诺氏疟原虫、人、小鼠、恶性疟原虫、大肠杆菌PSD的一致性和相似性分析结果。

图10为不同种属PSD蛋白的多序列比对图。

图11为保守基序点突变后提取的细胞外囊泡的AnV-FITC阳性率结果。

图12为pkPSD与PS相互作用蛋白口袋的三维结构示意图。

图13为突变的pkPSD(P217H)、pkPSD(V217H)、pkPSD(F219N)、pkPSD(Y255T)、pkPSD(Y217S、Y255T)、pkPSD(M306L)的AnV-FITC阳性率结果。

图14为PS(10：0/10：0)与pkPSD蛋白的结构平面示意图。

图15为向小鼠尾静脉注射相同颗粒数的293F EV(CK EV)、pkPSD(P217H)EV后，不同时间点小鼠血清中的细胞外囊泡含量柱状图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施方案。虽然附图中显示了本申请的具体实施方案，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施方案所限制。相反，提供这些实施方案是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方案，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

定义

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

在本申请中，所述工程化改造可以通过本领域已知的任意方法完成，且许多这样的方法对于熟练的技术人员而言是众所周知的和常规的，例如蛋白质的截短、融合，氨基酸的替换、缺失和/或插入。

本文所使用的术语“细胞外囊泡”(extracellular vesicles, EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等，主要形式为微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes, Exs)。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。

本文所使用的术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，意指当它存在于大自然中时，将其与突变体或变体区分开的、典型形式的生物体、菌株、基因或特征。它可以与自然界中的资源隔离开来，并没有被刻意修饰。

本文所使用的术语“工程化改造的细胞外囊泡”是指人工合成的细胞外囊泡，或经过人为干预后细胞产生的细胞外囊泡，或基因工程改造后细胞产生的细胞外囊泡。

本文所使用的术语“磷脂酰丝氨酸”(Phosphatidylserine，PS)为磷脂酸的磷酸基与丝氨酸的羟基生成酯键所构成的甘油磷脂。与磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺间可以互相转化。正常情况下位于质膜脂双层的膜内侧，细胞凋亡时外翻，使质膜外侧的磷脂酰丝氨酸明显增加。细胞外囊泡在形成过程中由于曲率变化，同样会导致膜表面还有磷脂酰丝氨酸。

本文所使用的术语“磷脂酰丝氨酸脱羧酶”(Phosphatidylserine decarboxylase，PSD，EC 4.1.1.65)，也称PSD蛋白，是一类催化磷脂酰丝氨酸羧基裂解形成磷脂酰乙醇和二氧化碳的酶类。其它常用名称包括PS脱羧酶和磷脂酰-L-丝氨酸羧基裂解酶。该酶参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，以及甘油磷脂代谢。它有两个辅助因子：磷酸吡哆醛和丙酮酸。本文中提到的pkPSD是来源与诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)物种中的PSD，hPSD为人(Homo sapiens)中的PSD，mPSD为小鼠(Mus musculus)中的PSD。

本文所使用的术语“膜联蛋白A5”(Annexin A5 or Annexin V，AnV)是膜联蛋白家族中的一个蛋白。由于其能够在钙离子存在下与磷脂酰丝氨酸特异性结合，常被用于在细胞凋亡流氏细胞检测中作为非定量探针来检测细胞表面的磷脂酰丝氨酸外翻。AnV-FITC是在AnV耦联FITC(异硫氰酸荧光素)方便用于流氏检测。

本文所使用的术语“相似性”是指将两条序列进行比对，根据一致及相似字符个数占比对长度的比例计算所得百分比即为相似性。比对算法可用BLAST，ClustalW等。

本文所使用的术语“货物蛋白”(cargo proteins)是指细胞外囊泡内携带的蛋白。

本文所使用的术语“信号肽”指的是指导蛋白质在细胞内的转运和定位的肽序列，例如导向某个细胞器(如内质网)和/或细胞表面。信号肽指导新生蛋白质进入内质网内。如果受体要被糖基化并锚定在细胞膜中，则这是必需的。一般地，使用天然地附着在氨基末端最大组分上的信号肽。

本文所使用的术语“抗体”是指特异性结合特定抗原或对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。抗体可以包含例如多克隆的、单克隆的和基因工程化的抗体及其抗原结合片段。抗体可以是例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合抗体、双特异性抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体。

本文所使用的术语“治疗性肽”是指具有治疗活性的蛋白或其变体，包括但不限于抗体或其抗原结合片段、受体、配体、细胞因子、激素，等等。

本文所使用的术语“连接治疗化合物的接头”是指将治疗化合物连接到融合伴侣上的物质。

在本文中使用的术语“白细胞介素”是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素(interleukin)缩写为IL，功能关系免疫反应的表达和调节，这种调节有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等的许多因子参与。来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同(例如巨噬细胞活化，促进T细胞繁殖等)，因子自身的物理化学性质多不清楚。

在本文中使用的术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA 插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。

在本文中使用的术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP 和互补序列，以及明确指出的序列。

本文所使用的术语“治疗”是指导致治疗的任何可观察到的有益效果的干预，或任何在治疗或改善疾病或病况方面具有统计学显著成功的指标，诸如改善疾病或病理状况的体征、症状或进展。例如，有益效果可以通过在受试者中减少疾病、推迟疾病发作或减轻疾病临床症状的严重程度、减少受试者经历疾病症状的频率、减缓疾病的进展、减少疾病复发的次数、改善受试者的整体健康状况，或通过对特定疾病具有特异性的其他参数来证明。

本文所使用的术语“预防”是施用于没有表现出疾病体征或只表现出早期体征的受试者的治疗，目的是降低病理发展或早期疾病进一步发展的风险。

本文所使用的术语“给予”是指向有需要的受试者的肠道外、静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、病灶内、鼻内或皮下给予、经口给予、以栓剂给予、局部接触、鞘内给予或植入缓释装置，例如微型渗透泵。

本文所使用的术语“有需要的受试者”是指处于疾病、病症或病况风险中或患有该疾病、病症或病况的个体，该个体可经受本申请所述的药物组合物或工程化改造的细胞外囊泡的治疗或改善。

本文所使用的术语“有效量”或“有效剂量”是指足以在接受该药物组合物或该工程化改造的细胞外囊泡治疗的受试者中达到所需(例如，有益)效果的药物组合物或工程化改造的细胞外囊泡的量，诸如足以以统计学显著的方式改善被治疗的疾病的一个或多个症状，以统计学显著的方式延缓进展性疾病的恶化，或以统计学显著的方式防止其他相关症状或疾病的发作或其任何组合的量。在一些实施方案中，药物组合物或工程化改造的细胞外囊泡的有效量是足以抑制或治疗疾病的量，在受试者中有最小毒性或无毒性，不包括存在一个或多个不良副作用。有效量或剂量可以在给定的时间段内施用一次或多次。有效量或剂量可以取决于治疗的目的，并且本领域的技术人员可以根据受试者的需要确定。当提到单独施用的单个活性成分时，有效量或剂量是指该单独成分。当提及组合时，有效量或剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论连续施用还是同时施用。

工程化改造的PSD蛋白

本申请提供了一种工程化改造的磷脂酰丝氨酸脱羧酶(PSD蛋白)，其包含如下三个功能域：参照如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的第114~139位的X₁X₂X₃X₄(X₅)_mX₆(X₇)_nX₈X₉X₁₀、第191~120位的X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀和第307~309位的X₂₁X₂₂X₂₃；

其中，X₁、X₂各自独立地为Phe、Trp、Leu、Val、Ile或Tyr；

X₄、X₆各自独立地为Arg、Lys、Gln或Asn；

X₈、X₁₁、X₂₀为Pro；

X₁₀为Asp、Glu或Asn；

X₁₄为Tyr、Trp、Phe、Thr或Ser；

X₁₅、X₁₈、X₁₉各自独立地为His、Asn、Gln、Lys或Arg；

X₂₁为Gly；

X₂₂为Ser；

X₂₃为Ser、Thr或Val；

X₃、X₅、X₇、X₉、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇各自独立地为任意氨基酸，m、n分别表示m、n个重复的氨基酸，m=1-6、2-5、3-4，或该数值范围内的任意正整数，n=1-12、2-11、3-10、4-9、5-8、6-7，或该数值范围内的任意正整数。

其中，SEQ ID NO: 1的氨基酸序列为：

MKKNGRDNNFYHLYKNKYLITGVTILSFILMFQYKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFPVFQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS

其中，编码野生型PSD蛋白的cDNA全长序列如SEQ ID NO: 2所示：

atgaagaagaatggaagagacaacaacttctaccacttgtacaagaacaagtacctgatcacgggtgtgacaatcctgtccttcatcctcatgtttcaatacaagtaccatgaagtgctaaccctacacgataatagtgaaaatgctgtacagagcagtaagcttttctgggcgcgactcctcttcggacgaacaaggagtcgaattacagggcaaatattaaaaatggaaatcccaaacacatacagattgttcattttcaattttttaattaaatacatgcacatcaataaggaagaaataaaatacccaatagagtcttacaaatccatcggagattttttctcccgttatattagagaggaaacgagacccattggagatgttagtgattactctatagtcagtccatgtgacagtgaactcatagattacggagaattaacctcagaatatctagaaaatattaagggagtcaaatttaatgtaaacactttcttgggatccaaattccagaagaagcataatgatggaagtaccaaatttttttatgccattttttatttaagtccaaaaaaataccaccattttcatgccccttttaatttcaagtacaaaattaggagacacatatctggagaattatttccagtttttcaaggcatgtttaaatttattaacaacctctttaatattaacgagagggtaatcctgtccggggaatggaaaggtggcaatgtgtattatgccgccattagtgcttacaatgtaggaaatattaaaattattaatgatgaagaattggttacgaataatttaaggcatcagttaagctacatgggaggagatatcaacaccaagattttcgactcctataaaagtgtcgaagttggagacgaaattggggaattcagaatgggctcatccattgttgtaatttttgaaaataaaaaggacttctcctggaatgtcaaccaaaatcaaactgtttccgtaggccagaggcttggcgggatcggtgaacccgtcaaggaggaaaacaggttcatcaaaattagaagctga

本文中的氨基酸可以是天然氨基酸或者非天然氨基酸，用本领域公知的三字母或单字母表示，例如：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸 (Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸 (Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸 (Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。结构、性质相近的一些氨基酸之间互相替换时往往对蛋白的结构和性质影响不大，可互换使用。

在一些实施方案中，m例如可为1、2、3、4、5或6，优选m为6。在一些实施方案中，n例如可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，优选为12。在一些实施方案中，m为6，n为12。

在一些实施方案中，所述PSD蛋白包含如下三个功能域：参照如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的第114~139位的FFXRX₆RX₁₂PXD、第191~120位的PXXYHXXHXP和第307~309位的GSS/GST，其中X各自独立地为任意氨基酸。

由于大部分真核生物中的PSD蛋白表达均在线粒体膜上，可溶性较低，而pkPSD天然存在部分可分泌形式，所以在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白为来源于诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)的PSD蛋白。

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白为相对于如SEQ ID NO：1所示的野生型PSD蛋白的N端第1-45位的缺失的截短的PSD蛋白，例如可为相对于如SEQ ID NO：1所示的野生型PSD蛋白的N端第1-44位、第1-43位、第1-42位、第1-41位、第1-40位、第1-39位、第1-38位、第1-37位、第1-36位、第1-35位、第1-34位的缺失的截短的PSD蛋白，优选为相对于如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的N端第1-34位的缺失的截短的PSD蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示：

MKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFPVFQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白包含如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白包含在一个或两个位置的插入、缺失或替换突变，所述位置为相对于如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的第217位和第219位。

本申请可以使用任何众所周知技术完成氨基酸替换、缺失和插入，例如基于PCR的技术。本申请还可以通过定位诱变完成氨基酸替换。

在一些优选实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白包含在相对于如SEQ ID NO:1所示的野生型PSD蛋白的第217位的替换突变，所述替换突变为P217H。在一些更优选的实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白包含如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。

其中，SEQ ID NO: 4的氨基酸序列为：

MKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFHVFQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS(下划线为突变位点)

在一些优选实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白包含在相对于如SEQ ID NO:1所示的野生型PSD蛋白的第219位的替换突变，优选地，所述替换突变为F219N。在一些更优选的实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白包含如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

其中，SEQ ID NO: 5的氨基酸序列为：

MKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFPVNQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS(下划线为突变位点)

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白，其为来源于人的PSD蛋白，所述工程化改造的PSD蛋白包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO: 10的氨基酸序列为：

MATSVGHRCLGLLHGVAPWRSSLHPCEITALSQSLQPLRKLPFRAFRTDARKIHTAPARTMFLLRPLPI LLVTGGGYAGYRQYEKYRERELEKLGLEIPPKLAGHWEVALYKSVPTRLLSRAWGRLNQVELPHWLRRPVYSLYIWT FGVNMKEAAVEDLHHYRNLSEFFRRKLKPQARPVCGLHSVISPSDGRILNFGQVKNCEVEQVKGVTYSLESFLGPRM CTEDLPFPPAASCDSFKNQLVTREGNELYHCVIYLAPGDYHCFHSPTDWTVSHRRHFPGSLMSVNPGMARWIKELFC HNERVVLTGDWKHGFFSLTAVGATNVGSIRIYFDRDLHTNSPRHSKGSYNDFSFVTHTNREGVPMRKGEHLGEFNLG STIVLIFEAPKDFNFQLKTGQKIRFGEALGSL

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示：

MLVTGGGYAGYRQYEKYRERELEKLGLEIPPKLAGHWEVALYKSVPTRLLSRAWGRLNQVELPHWLRRP VYSLYIWTFGVNMKEAAVEDLHHYRNLSEFFRRKLKPQARPVCGLHSVISPSDGRILNFGQVKNCEVEQVKGVTYSL ESFLGPRMCTEDLPFPPAASCDSFKNQLVTREGNELYHCVIYLAPGDYHCFHSPTDWTVSHRRHFPGSLMSVNPGMA RWIKELFCHNERVVLTGDWKHGFFSLTAVGATNVGSIRIYFDRDLHTNSPRHSKGSYNDFSFVTHTNREGVPMRKGE HLGEFNLGSTIVLIFEAPKDFNFQLKTGQKIRFGEALGSL

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白，其为来源于鼠的PSD蛋白，所述工程化改造的PSD蛋白包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO: 11的氨基酸序列为：

MAASGGRACVRSLRGGVLWRSSPCHYESTATRHFLGTLQKLPLQAGVRNFHTAPVRSLFLLRPVPILLATGGGYAGYRQYEKYRERKLEKLGLEIPPKLASHWEVSLYKSVPTRLLSRACGRLNQVELPYWLRRPVYSLYIWTFGVNMTEAAVEDLHHYRNLSEFFRRKLKPQARPVCGLHCVTSPSDGKILTFGQVKNSEVEQVKGVTYSLESFLGPRANTEDLPFPPASSSDSFRNQLVTREGNELYHCVIYLAPGDYHCFHSPTDWTISHRRHFPGSLMSVNPGMARWIKELFCHNERVVLTGDWKHGFFSLTAVGATNVGSIRIHFDRDLHTNSPRYSKGSYNDLSFVTHANKEGIPMRKGEPLGEFNLGSTIVLIFEAPKDFNFRLKAGQKIRFGEALGSL

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示：

MGLEIPPKLASHWEVSLYKSVPTRLLSRACGRLNQVELPYWLRRPVYSLYIWTFGVNMTEAAVEDLHHYRNLSEFFRRKLKPQARPVCGLHCVTSPSDGKILTFGQVKNSEVEQVKGVTYSLESFLGPRANTEDLPFPPASSSDSFRNQLVTREGNELYHCVIYLAPGDYHCFHSPTDWTISHRRHFPGSLMSVNPGMARWIKELFCHNERVVLTGDWKHGFFSLTAVGATNVGSIRIHFDRDLHTNSPRYSKGSYNDLSFVTHANKEGIPMRKGEPLGEFNLGSTIVLIFEAPKDFNFRLKAGQKIRFGEALGSL

在一些实施方案中，所述工程化改造的PSD蛋白，其为来源于大肠杆菌的PSD蛋白，所述工程化改造的PSD蛋白包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO: 12的氨基酸序列为：

MLNSFKLSLQYILPKLWLTRLAGWGASKRAGWLTKLVIDLFVKYYKVDMKEAQKPDTASYRTFNEFFVRPLRDEVRPIDTDPNVLVMPADGVISQLGKIEEDKILQAKGHNYSLEALLAGNYLMADLFRNGTFVTTYLSPRDYHRVHMPCNGILREMIYVPGDLFSVNHLTAQNVPNLFARNERVICLFDTEFGPMAQILVGATIVGSIETVWAGTITPPREGIIKRWTWPAGENDGSVALLKGQEMGRFKLGSTVINLFAPGKVNLVEQLESLSVTKIGQPLAVSTETFVTPDAEPAPLPAEEIEAEHDASPLVDDKKDQV

融合蛋白

本申请还提供一种包含如前任一项所述的工程化改造的PSD蛋白的融合蛋白。

在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含促进PSD蛋白可溶性的序列，优选为GST序列。本申请的包含GST序列的融合蛋白纯化纯度高、纯化条件温和、蛋白活性不受影响且可溶性高。

在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含一种或两种或三种以上分泌型蛋白的信号肽。本申请为了实现体内自分泌工程化改造的PSD蛋白，需要加信号肽使细胞把工程化改造的PSD蛋白分泌到细胞外与细胞外囊泡反应。

本申请对分泌型蛋白的种类不做限定，可以为任意分泌型蛋白，例如可选自抗体、细胞因子、蛋白质类激素和消化酶中的一种或两种以上。细胞因子是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。细胞因子（cytokine，CK）是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子例如可为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。蛋白质类激素例如可为胰岛素、胰高血糖素、生长素、甲状腺激素、促甲状腺激素等。消化酶例如可为淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等。

在一些实施方案中，白细胞介素例如可为IL-2、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23等；肿瘤坏死因子家族成员例如可为TNF、LTA、LTB、FASLG、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、EDA等；干扰素例如可为INF-α、INF-β、INF-γ等。

在一些实施方案中，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO: 6~SEQ ID NO: 8中任一个所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 6~SEQ ID NO: 8中任一个所示的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO: 6的氨基酸序列为：

MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDGSTSGSGHHHHHHSAGLVPRGSGSGSGSDYKDDDDKGGSSMKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFPVFQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS

SEQ ID NO: 7的氨基酸序列为：

MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDGSTSGSGHHHHHHSAGLVPRGSGSGSGSDYKDDDDKGGSSMKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFHVFQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS(下划线为突变位点)

SEQ ID NO: 8的氨基酸序列为：

MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAMSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDGSTSGSGHHHHHHSAGLVPRGSGSGSGSDYKDDDDKGGSSMKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFPVNQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS(下划线为突变位点)

核酸分子、表达载体和工程化改造的细胞

本申请还提供一种编码如前任一项所述的工程化改造的PSD蛋白或者如前任一项所述的融合蛋白的核酸分子。

在一些实施方案中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO: 9所示，或为具有与SEQID NO: 9至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO: 9的核苷酸序列为编码相对于如SEQ ID NO: 1所示的野生型PSD蛋白的N端第1-34位的缺失的截短的PSD蛋白的经密码子优化后的cDNA序列，SEQ IDNO: 9的核苷酸序列为：

ATGAAATACCACGAAGTCCTCACCCTCCATGACAACTCAGAAAACGCCGTCCAGTCTTCAAAACTGTTCTGGGCTAGGCTGTTGTTCGGCCGCACGAGAAGTCGGATCACTGGCCAGATATTGAAAATGGAAATACCGAATACCTATAGGTTGTTTATTTTCAATTTCCTGATCAAATACATGCACATCAATAAGGAGGAGATCAAATACCCTATCGAATCATATAAAAGCATCGGCGACTTTTTTTCTAGGTACATTAGAGAAGAAACACGGCCAATTGGTGACGTCAGCGATTACAGTATCGTGAGCCCTTGCGATAGCGAGTTGATTGACTATGGTGAACTCACAAGCGAATACCTCGAAAATATCAAAGGCGTGAAATTCAACGTTAACACCTTTCTGGGGTCAAAATTTCAAAAGAAGCACAACGATGGTAGCACGAAATTCTTCTATGCTATCTTCTACTTGTCCCCCAAGAAGTATCACCATTTCCATGCTCCATTTAACTTCAAATATAAGATCCGGAGACACATATCTGGCGAACTCTTCCCCGTTTTCCAAGGCATGTTTAAGTTTATCAATAACCTGTTCAATATTAACGAGAGAGTGATACTTAGTGGGGAGTGGAAGGGGGGTAATGTTTATTATGCTGCTATTAGCGCCTACAATGTTGGGAACATTAAGATTATCAATGACGAAGAGCTGGTCACCAACAATCTGAGACACCAGCTGTCTTATATGGGCGGGGACATTAACACAAAGATCTTTGATTCTTATAAGAGCGTTGAAGTAGGGGACGAGATTGGCGAGTTCAGGATGGGCTCTTCAATTGTGGTAATCTTCGAAAACAAAAAGGACTTTTCCTGGAATGTTAACCAGAATCAAACTGTGAGTGTAGGACAAAGATTGGGAGGGATCGGGGAGCCTGTGAAGGAAGAGAACCGCTTCATTAAGATCCGCTCCTAG

本申请还提供一种包含如前任一项所述的核酸分子的表达载体。

在一些实施方案中，所述表达载体可以是任何类型的质粒，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环，所述质粒例如可以为pET-42a、PX458、pcDNA3.1等。

本申请还提供一种包含前述任一种核酸分子和编码货物蛋白的工程化改造的细胞。

在一些实施方案中，所述货物蛋白选自治疗性肽、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、荧光蛋白、酶或连接治疗化合物的接头中的一种或两种或三种以上。

在一些实施方案中，所述治疗性肽可以是人白细胞介素家族成员(例如，IL-2、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23)，肿瘤坏死因子家族成员(例如，TNF、LTA、LTB、FASLG、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18和EDA)，干扰素(INF-α、INF-β和INF-γ)，T细胞衔接器(例如，4-1BB、OX40、CD28、CD40、CD40L、CD47、CD27、CD70、CD80、CD86、GITRL、ICOSL、CD155、CD112、TIM-3、BTLA)，和其他细胞因子(例如，G-CSF、EPO、TPO、GM-CSF、EGF、bFGF、FVIIa、ATⅢ、TNK、α-Glucosidase、BMP-2、hirudin)。

制备工程化改造的细胞外囊泡的方法和工程化改造的细胞外囊泡

本申请一种制备工程化改造的细胞外囊泡的方法，其包括以下步骤：

培养如前任一项所述的工程化改造的细胞，并从培养基中分离所述工程化改造的细胞分泌的细胞外囊泡。

在一些实施方案中，培养的条件为本领域已知的条件，包括适当的培养基、温度和二氧化碳浓度等。工程化改造的细胞的类型不特别限定，可以是动物细胞(例如猴细胞、鼠细胞等)或人细胞，其实例包括但不限于HEK293F细胞、HEK293T细胞、Vero细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HuH7细胞、HEK-293细胞和巨噬细胞等。

在一些实施方案中，所述培养基优选为培养上清。在一些实施方案中，所述分离有时也称作抽提或富集，其实例包括但不限于差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、磁珠免疫法等，所述分离还可通过使用已知的试剂盒进行。

本申请还提供一种工程化改造的细胞外囊泡，其包含如前任一项所述的融合蛋白和货物蛋白。

在一些实施方案中，所述货物蛋白为如前任一项所述的融合蛋白。

药物组合物、制药用途以及诊断、治疗和/或预防疾病的方法

本申请提供一种药物组合物，其包含如前任一项所述的工程化改造的细胞外囊泡或如前任一项所述的方法制备的工程化改造的细胞外囊泡，以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体可选自：水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3%甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。

在一些实施方案中，本申请的药物组合物还可包含润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、矫味物质和/或芳香物质等作为添加剂。

本申请的药物组合物可以是任何适宜的剂型。例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本申请的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本申请还提供如前任一项所述的融合蛋白、如前任一项所述的工程化改造的细胞外囊泡或如前任一项所述的方法制备的工程化改造的细胞外囊泡在制备诊断、治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

本申请还提供一种诊断、治疗和/或预防疾病的方法，包括给予有需要的受试者有效量的如前任一项所述的工程化改造的细胞外囊泡或如前任一项所述的方法制备的工程化改造的细胞外囊泡。

本申请的工程化改造的细胞外囊泡、药物组合物可用于治疗多种疾病，例如所述疾病为免疫性疾病或癌症。本申请的工程化改造的细胞外囊泡、药物组合物可用于预防受试者的疾病或用于对有需要的受试者的其他治疗性应用。

本申请所述的工程化改造的细胞外囊泡、药物组合物可给予多种不同的受试者，包含但不限于哺乳动物、人类、非人类哺乳动物、驯养动物(例如，实验动物、家庭宠物或牲畜)、非驯养动物(例如，野生动物)、狗、猫、啮齿动物、小鼠、仓鼠、牛、鸟、鸡、鱼、猪、马、山羊、绵羊、兔及其任何组合。在一些实施方案中，受试者是人。

本申请的工程化改造的细胞外囊泡、药物组合物可用作治疗剂，例如，可给予有需要的受试者的治疗品。本申请的工程化改造的细胞外囊泡、药物组合物的治疗效果可通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态(包含但不限于其症状)在受试者中获得。

向受试者施用有效量或剂量的本申请的工程化改造的细胞外囊泡、药物组合物可以通过一种或多种途径进行，并且可以在给定时间段内发生一次或多次。本领域的普通技术人员会理解，本申请的工程化改造的细胞外囊泡、其药物组合物对有需要的受试者的施用量、持续时间和频率取决于若干因素，包含例如受试者的健康状况、受试者的具体疾病或病况、受试者的具体疾病或病况的等级或水平、受试者正在接受或已经接受的额外治疗等。示例性施用途径包含全身、皮肤、皮下、静脉内、动脉内、硬膜下、肌肉内、颅内、胸骨内、瘤内、腹膜内。此外，本申请的工程化改造的细胞外囊泡、药物组合物可以通过其他施用途径施用于受试者，例如通过吸入，或经口、皮肤、鼻内或鞘内施用。

实施例

实施例1 构建工程化改造的细胞

通过下述方法构建工程化改造的细胞，将pkPSD蛋白分泌至细胞培养上清，在细胞分泌细胞外囊泡过程中同时完成pkPSD蛋白催化磷脂酰丝氨酸羧基裂解，具体步骤如下：

(1)质粒构建：设计pkPSD表达质粒，表达融合蛋白hIL12BSp-GST-his-Flag-pkPSD_35_319（氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示）；

(2) EV制备：将质粒转入HEK293(HEK293F)构建混合克隆细胞，命名为PSD细胞，作为实验组，对照组为未转入质粒的HEK293F细胞，培养实验组和对照组细胞并收获细胞上清提取EV，同时将细胞裂解液待用；其中，由PSD细胞提取出的细胞外囊泡为PSD EV(下文中的PSD EV均指实施例1制备的pkPSD EV)；

(3) 免疫印迹分析：将实验组细胞以及对照组细胞的细胞沉淀、上清、提取的细胞外囊泡，按照等蛋白上样进行免疫印迹分析实验，对每个样本中pkPSD的表达情况进行分析，分析结果如图1A和图1B所示。

(4) 纳米流式检测：使用纳米流式细胞仪对实验组细胞外囊泡以及对照组细胞外囊泡进行颗粒数检测以及粒径分析。

从图1A可以看出，将PSD瞬转至HEK293F细胞后，检测PSD融合表达的Flag标签，对照组的HEK293F细胞和EV中无目的蛋白，在实验组的PSD细胞以及EV中可检测到Flag融合蛋白的表达。图1B中的Actin蛋白为检测细胞以及EV中的看家基因，反应上样量一致。

实施例2 pkPSD能够降低细胞外囊泡表面磷脂酰丝氨酸含量

质粒构建以及蛋白纯化：以pET-42a作为质粒骨架，表达his-GST-pkPSD_35_319蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 15(MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDGSTSGSGHHHHHHSAGLVPRGSTAIGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTGGGSGMKYHEVLTLHDNSENAVQSSKLFWARLLFGRTRSRITGQILKMEIPNTYRLFIFNFLIKYMHINKEEIKYPIESYKSIGDFFSRYIREETRPIGDVSDYSIVSPCDSELIDYGELTSEYLENIKGVKFNVNTFLGSKFQKKHNDGSTKFFYAIFYLSPKKYHHFHAPFNFKYKIRRHISGELFPVFQGMFKFINNLFNINERVILSGEWKGGNVYYAAISAYNVGNIKIINDEELVTNNLRHQLSYMGGDINTKIFDSYKSVEVGDEIGEFRMGSSIVVIFENKKDFSWNVNQNQTVSVGQRLGGIGEPVKEENRFIKIRS)所示。将表达质粒转入至大肠杆菌中获得表达菌株。菌株培养至OD600为1.0左右，加入0.5mM IPTC 在37℃诱导3h。收集表达菌株菌体，并进行超声破碎，离心并收集含有重组融合蛋白的上清液，通过his亲和层析纯化his-GST-pkPSD_35_319蛋白，电泳鉴定结果如图2所示，图2可以看出，沉淀中有大量蛋白表达，上清存在可溶性重组蛋白，经过50 mM低浓度咪唑洗脱，可洗脱大量非目的蛋白，100mM和250mM咪唑洗脱后可获得纯的pkPSD蛋白(69.96kD)以及其成熟体蛋白(62kD)。

(1) pkPSD催化后，细胞外囊泡表面PS含量降低。

将细胞外囊泡与pkPSD蛋白或与pkPSD蛋白透析液在37℃共孵育3h后，通过AnV-FITC标记细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸，通过SEC(分子排阻色谱)去除未结合的游离染料，并用纳米流氏细胞仪进行颗粒数检测以及阳性率分析，结果如图3B所示，图3A为对照组分析结果，对比图3A和图3B可知，加入pkPSD催化后，细胞外囊泡表面AnV-FITC阳性率下降，表明细胞外囊泡表面磷脂酰丝氨酸含量减少。

(2) pkPSD酶活随着孵育时间以及酶量的增加而增加。

将细胞外囊泡与pkPSD蛋白37℃共孵育不同时间(0min、10min、30min、60min、120min)或加入不同量pkPSD蛋白(0μL、10μL、30μL、50μL、70μL) 37℃孵育3h。通过AnV-FITC标记细胞外囊泡表面的磷脂酰丝氨酸，通过SEC(分子排阻色谱)去除未结合的游离染料，并用纳米流氏细胞仪进行颗粒数检测以及阳性率分析，结果如图4A和图4B所示。

由图4A可看出，随着反应时间增加，细胞外囊泡AnV-FITC阳性率降低，表明细胞外囊泡表面磷脂酰丝氨酸减少。由图4B可看出，细胞外囊泡表面磷脂酰丝氨酸随着pkPSD加入量增加而减少。表明pkPSD具有减少细胞外囊泡表面磷脂酰丝氨酸的活性。

实施例3 工程化细胞提取细胞外囊泡具有天然PS含量低的优势

参照实施例2的AnV-FITC染色方法，对从HEK293F提取的细胞外囊泡293F EV，293FEV体外添加实施例2制得的pkPSD催化后的细胞外囊泡293F EV+PSD，以及实施例1的基于PSD工程化细胞提取的细胞外囊泡PSD EV这三种细胞外囊泡进行AnV-FITC染色后，通过纳米流氏检测技术检测细胞外囊泡FITC阳性率。将原始数据导入FlowJo流氏分析软件进行分析，结果如图5A和图5B所示，293F EV经过PSD体外催化(293F EV+PSD)相对于293F EV能够显著减少AnV-FITC强度，而PSD EV(自表达PSD)能够进一步减少AnV-FITC强度。说明PSD工程化细胞可在细胞外囊泡纯化过程中即获取PS含量低的细胞外囊泡，免去额外添加PSD催化，并且酶活性相对于体外催化更具优势(处理时间更长)。

实施例4 基于PSD工程化改造的细胞外囊泡能够显著减少体外巨噬细胞吞噬

通过细胞膜荧光染料分别对实施例1的293F EV和PSD EV染色，加入不同浓度的实验组和对照组细胞外囊泡与RAW264.7巨噬细胞37℃共孵育2h，PBS洗涤游离的细胞外囊泡三次，细胞重悬后进行细胞流氏检测，检测结果如图6所示，图中纵坐标表示巨噬细胞的平均荧光强度，反应细胞内吞噬的带有荧光标记细胞外囊泡的数量，由图6可看出，PSD EV能够显著降低RAW264.7的细胞平均荧光强度，表明PSD EV能够显著减少体外巨噬细胞吞噬。

实施例5 基于PSD工程化改造的细胞外囊泡能够延长在小鼠体内循环时间

通过小鼠尾静脉注射相同颗粒数的293F EV(CK EV)、293F EV体外添加实施例2制得的pkPSD催化后的EV(CK EV+PSD)和PSD EV，不同时间点检测小鼠血清中的细胞外囊泡含量，结果如图7所示。

图7中，CK EV为未经过任何处理的293F EV，CK EV+PSD为293F EV加入实施例2制得的pkPSD进行体外催化后的样品，PSD EV为PSD自分泌的样品，图中可看出，与CK EV组相比，CK EV+PSD组与PSD EV组在血清中的细胞外囊泡增加，表明这两组细胞外囊泡在小鼠体内的清除减少；同时，与CK EV+PSD组相比，PSD EV组在血清中的残留细胞外囊泡数量进一步增加，表明自分泌PSD相对于体外催化方式有优势，能够延长细胞外囊泡的循环时间。

实施例6 PSD家族蛋白保守序列突变影响其酶活

通过将诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)、人(Homo sapiens)、小鼠(Musmusculus)中的PSD(分别标记为pkPSD(hIL12BSp-GST-his-Flag-pkPSD_35_319)、hPSD(hIL12BSp-GST-his-Flag-hPSD_71_409)、mPSD(hIL12BSp-GST-his-Flag-mPSD_92_406))瞬转至293F细胞中，提取细胞外囊泡，通过AnV-FITC标记细胞外囊泡表面的PS，检测其AnV-FITC阳性率/MFI，结果如图8所示，相对于293F EV，表达PSD的EV表面PS显著减少。

各物种PSD的一致性(Identity，表示氨基酸序列相同氨基酸的比例)以及相似性(Positivity，表示氨基酸序列中相似氨基酸的比例)如图9所示。

通过对所有种属PSD蛋白进行多序列比对，发现PSD蛋白中含有三个保守基序FFXRX₆RX₁₂PXD，PXXYHXXHXP，GSS/GST，其中，X为任意氨基酸。将其中一部分代表物种列于图10中。

进一步，通过对上述保守序列进行点突变，证明上述三个基序为关键保守基序。具体突变位点如表1所示，且所述突变为相对于融合蛋白hIL12BSp-GST-his-Flag-pkPSD_35_319进行的突变。

表1

。

参照实施例1的方法，通过构建上述突变体质粒并瞬转至293F细胞中，提取细胞外囊泡后，进行AnV-FITC阳性率检测，结果如图11所示， pkPSD EV相对于293F EV细胞外囊泡表面PS含量显著降低，关键位点突变后(P593~P602)与293F EV没有显著差异，表明关键基序对PSD酶活功能的重要性。

实施例7 pkPSD突变位点能够增加酶活

通过对实施例1制得的pkPSD的底物口袋进行模拟，得到pkPSD与PS相互作用蛋白口袋的三维结构示意图，如图12所示，底物口袋附近的具体氨基酸范围为：pkPSD结构中的第64-78位，第82-94位，第110-116位，第189-196，第214-219位，第253-260位，第304-309位。基于底物口袋附近的具体氨基酸范围设计了多个突变位点：第217位、第218位、第219位、第255位、第306位，通过构建突变体质粒瞬转至293F细胞中，提取细胞外囊泡进行AnV-FITC检测，检测结果如图13所示，pkPSD野生型EV相对于293F EV，细胞外囊泡表面PS含量有所降低；pkPSD(P217H) EV和pkPSD(F219N) EV相对于野生型pkPSD EV，能够进一步降低细胞外囊泡表面PS。

对实施例1制得的pkPSD的底物口袋进行模拟得到的PS(10：0/10：0)与pkPSD蛋白的结构平面示意图如图14所示，10：0和10：0分别表示磷脂酰丝氨酸PS结构中两条侧链饱和键和不饱和键的比例，其中PS周围的蛋白质残基为灰色，PS为黑色，虚线示意PS与pkPSD可能存在相互作用。理论上图14中氨基酸进行突变，可能会改变与PS的结合能力，进一步改变蛋白质的酶活。

实施例8 pkPSD突变后仍具有增加小鼠体内循环时间的功能

通过小鼠尾静脉注射相同颗粒数的293F EV(CK EV)、pkPSD(P217H)EV，不同时间点检测小鼠血清中的细胞外囊泡含量，结果如图15所示。pkPSD(P217H)EV相对于CK EV，经尾静脉注射后，小鼠血清中残留的细胞外囊泡含量增加，即小鼠体内清除减少，循环时间增加。表示pkPSD突变后仍旧具有延长细胞外囊泡循环时间的功能。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims

1. 一种工程化改造的磷脂酰丝氨酸脱羧酶PSD蛋白，其为来源于诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)的PSD蛋白，所述工程化改造的PSD蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示。

2.一种融合蛋白，其包含根据权利要求1所述的工程化改造的PSD蛋白以及一种或多种信号肽，所述信号肽为分泌型蛋白的信号肽。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其还包含促进PSD蛋白可溶性的序列。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，所述促进PSD蛋白可溶性的序列为GST序列。

5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述分泌型蛋白选自抗体、细胞因子、蛋白质类激素和消化酶中的一种或两种以上。

6. 根据权利要求2~4中任一项所述的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。

7.一种编码权利要求1所述的工程化改造的PSD蛋白或者权利要求2~6中任一项所述的融合蛋白的核酸分子。

8.一种表达载体，其包含权利要求7所述的核酸分子。

9.一种工程化改造的细胞，其包含权利要求7所述的核酸分子和编码货物蛋白的核酸分子。

10.根据权利要求9所述的工程化改造的细胞，其中，所述货物蛋白选自治疗性肽、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、荧光蛋白、酶和连接治疗化合物的接头中的一种或多种。

11.根据权利要求10所述的工程化改造的细胞，其中，所述治疗性肽是抗体和/或细胞因子，其中所述细胞因子选自如下的一种或多种：人白细胞介素家族成员、肿瘤坏死因子家族成员、干扰素和T细胞衔接器。

12.根据权利要求10所述的工程化改造的细胞，其中，所述RNA结合蛋白选自如下的一种或多种：L7Ae、hnRNPA2B1、hnRNPC1、hnRNPG、hnRNPK、hnRNPQ、YBX1、HuR、AGO2、IGF2BP1、MEX3C、ANXA2、ALIX、NCL、FUS和MVP。

13.一种制备工程化改造的细胞外囊泡的方法，其包括以下步骤：

培养权利要求9~12中任一项所述的工程化改造的细胞，并从培养基中分离所述工程化改造的细胞分泌的细胞外囊泡。

14.一种工程化改造的细胞外囊泡，其包含权利要求2~6中任一项所述的融合蛋白和货物蛋白。

15.根据权利要求14所述的工程化改造的细胞外囊泡，其中，所述融合蛋白位于所述细胞外囊泡膜上。

16.根据权利要求14或15所述的工程化改造的细胞外囊泡，其中，所述货物蛋白选自治疗性肽、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、荧光蛋白、酶或连接治疗化合物的接头中的一种或多种。

17.根据权利要求16所述的工程化改造的细胞外囊泡，其中，所述治疗性肽是抗体和/或细胞因子，其中所述细胞因子选自如下的一种或多种：人白细胞介素家族成员、肿瘤坏死因子家族成员、干扰素和T细胞衔接器。

18.根据权利要求16所述的工程化改造的细胞外囊泡，其中，所述RNA结合蛋白选自如下的一种或多种：L7Ae、hnRNPA2B1、hnRNPC1、hnRNPG、hnRNPK、hnRNPQ、YBX1、HuR、AGO2、IGF2BP1、MEX3C、ANXA2、ALIX、NCL、FUS和MVP。

19.一种药物组合物，其包含权利要求14~18中任一项所述的工程化改造的细胞外囊泡或权利要求13所述的方法制备的工程化改造的细胞外囊泡作为药物载体，以及药学上可接受的载体。