CN114302743A - 用于治疗关节炎的hla-dr/cii肽复合体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及HLA‑DR/CII肽复合体，其在含有HLA‑DRα链和/或HLA‑DRβ链的多肽的C‑末端包含软骨素结合肽，其中所述CII肽通过接头肽与HLA‑DRα链或HLA‑DRβ链的N‑末端融合，用于治疗人类患者的慢性炎性疾病，如关节炎。所述CII肽中的赖氨酸，特别是CII肽中的第一赖氨酸，可以进行翻译后修饰。本发明还涉及在哺乳动物细胞中产生所述HLA‑DR/CII肽复合体的方法。

Description

用于治疗关节炎的HLA-DR/CII肽复合体
技术领域
本发明涉及HLA-DR/CII肽复合体，其在含有HLA-DRα链和/或HLA-DRβ链的多肽的C-末端包含软骨素结合肽，其中所述CII肽通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端融合，用于治疗人类患者的慢性炎性疾病，如关节炎。CII肽中的赖氨酸，特别是CII肽中的第一赖氨酸，可以进行翻译后修饰。本发明还涉及在哺乳动物细胞中产生所述HLA-DR/CII肽复合体的方法。
技术背景
类风湿性关节炎(RA)是一种常见的严重疾病，是欧洲4-7百万受影响人群的主要健康问题。它是由与疼痛、进行性软骨和骨骼破坏相关的异常自身免疫性关节炎症引起的，如果不进行充分治疗，会导致功能障碍和最终无法活动/病废。今天的药物治疗是在临床诊断成立后立即开始的，对60-70％的病例有效，但不能治愈疾病。药物治疗主要针对炎症的常见效应通路，从而引起与增加感染风险相关的广泛的免疫抑制作用。
RA的免疫遗传学表明T细胞活化的异常途径在疾病的发生和/或持续中起关键作用。在T细胞活化过程中，CD4+T细胞被与人类主要组织相容性复合体(MHC)II类(如人类白细胞抗原-DR同种型(HLA-DR))复合的抗原肽片段结合，导致它们的活化处在由专职抗原呈递细胞提供的共刺激信号的背景下。支持CD4+T细胞在疾病发病机制中作用的最有力证据是，RA与HLA-DRB1基因座的某些等位基因之间的遗传关联，该基因座编码MHC II类分子HLA-DR的肽结合口袋β链上的氨基酸共有基序Q/R R/K RAA(氨基酸位置70-74，所谓的“共享表位”)(Gregersen PK et al.,Arthritis Rheum.1987；30:1205-1213)。T细胞在RA中的致病作用令人信服的证据，进一步来自于它们在中度至重度疾病的炎性滑膜浸润中的频繁检测表明在局部免疫反应中它们与B细胞协作以促进特定自身抗体反应的成熟。此外，已表明受损的CD4+CD25(hi)调节性T细胞(Treg)功能参与了RA的发病机制。因此，RA中失调的慢性活化T细胞区室代表治疗性免疫调节干预的关键目标。
如今，人们认为RA开始于临床发病前多年。RA作为多基因疾病，在HLA-DRB1基因座具有上述共享表位编码等位基因作为最强的风险因素，分别在易感个体中发展。然而，尚不明确的环境和/或生活方式因素(吸烟)也参与引发与IgG(类风湿因子)和瓜氨酸蛋白(ACPA)抗体产生相关的自身免疫反应，这些抗体可在有关节炎倾向但仍然健康的个体中长达二十年的临床前阶段持续存在。在临床发作前后，可检测到对II型胶原蛋白(CII)和瓜氨酸化CII的免疫反应(Burkhardt H et al.,Eur J Immunol.2005；35:1643-52)。CII是关节软骨中的主要蛋白质成分。携带DRB1*0401等位基因的RA患者(50％的白种人RA患者)已被证明在其库中含有T细胞，这些T细胞特异性地响应与对应于三螺旋CII区的氨基酸序列259-273的主要CII表位。对T细胞受体(TCR)激活至关重要的T细胞决定簇，已被描述为依赖于264位的生理学上半乳糖基化羟赖氨酸残基(Baecklund J.et al.,Proc Natl Acad SciU S A.2002；99:9960-5)。然而，在人类中，与已建立的小鼠模型和识别裸露的、未经翻译后修饰的CII肽的自身反应性T细胞相比，这种依赖性可能不那么严格，而与CII免疫的小鼠相比，经翻译后修饰的CII肽似乎在人类RA患者中可检测到的相对程度更大。
RA最常用的动物模型是小鼠的胶原诱导性关节炎(CIA)。实验性关节炎取决于MHCII类，与鼠类II类等位基因Aq相关，并取决于T细胞对半乳糖基化259-273CII表位的识别(Holmdahl R.et al.Ageing Res Rev.2002；1:135-47)。CIA被用作测试在药物开发中具有抗关节炎潜力的新化合物的治疗效率的标准模型。因此已经开发了多种方案来诱导抗原特异性耐受性，并且通过疫苗接种来预防和治疗关节炎的候选抗原之一是CII。在成年小鼠中最有效的方案(至今没有任何观察到的副作用)是通过静脉注射重组蛋白复合体来诱导耐受，该重组蛋白复合体由MHC II类分子Aq的胞外域与结合口袋中的主要抗原CII肽组成，即半乳糖基化的CII259-273肽或Aq/galCII复合体(Dzhambazov B et al.J Immunol 2006；176:1525-1533)。在用CII免疫后但在关节炎发作之前注射Aq/galCII复合体，导致几乎完全预防关节炎的发展，并且对患有慢性复发性关节炎的小鼠的治疗导致炎症活性的下调。致耐受性的Aq/galCII效应占主导地位，因为其抗关节炎潜力可以随T细胞从治疗小鼠转移到空白(naive)受体。
在第264位没有半乳糖基化的含有CII肽的Aq复合体保持无效。这种显著选择性调节作用的原因，可能与半乳糖基化CII仅在软骨中表达的事实有关(Baecklund J.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99:9960-5)，而非糖基化CII也在胸腺中表达(ChinR.K.,et al.,J Immunol.2006；177:290-7)。因此，T细胞对非糖基化CII的反应受中枢耐受性调节，而T细胞对半乳糖基化抗原的反应受外周性耐受机制调节。因此，有人提出生理性外周自我耐受性的紊乱，特别是对动关节结构成分的干扰，是RA发病机制的主要驱动力，且其重建是制定耐受性治疗策略的基本原理。这种方法包括将DR4/CII复合体胃肠外施用于由生物标记物选择的人类RA患者，这些患者通过预先基因分型来诱导免疫调节性T细胞并鉴别为DRB1*0401等位基因携带者，这些免疫调节性T细胞通过旁观者抑制来下调致关节炎性T细胞反应。与传统治疗方法相比，其作用机制包括对致关节炎适应性免疫反应的选择性免疫调节，同时不影响保护性免疫。它是一种个性化或HLA限制性治疗方法，仅限于具有特定HLA等位基因的患者，如DRB1*0401阳性患者。此外，CIA治疗的临床前数据表明，DR4/galCII复合体有可能在已确诊的RA中实现治疗效果，并在有患RA风险的个体中(即在疾病表现之前)实现预防效果。因此，作用方式与RA中已经建立的疗法有根本的不同。
WO2007/058587A1涉及“包含自身抗原肽和具有MHC结合基序的载体的化合物”，并公开了包含(a)肽和(b)载体的化合物，其中所述肽至少具有基序X-X-X-X-X-X-X，并且其中在至少一个氨基酸残基X被糖基化。此外，肽与肽结合蛋白连接，并且所述载体至少包含MHC结合基序，其中所述连接可以是共价连接的。然而，该肽不会与MHC II蛋白一起被同一宿主细胞表达，或者通过接头肽与MHC II蛋白连接。
最近的证据支持在人类中，没有经翻译后修饰的MHC II/CII肽复合体也可能在诱导耐受方面具有活性。因此，虽然CII肽中赖氨酸的翻译后修饰最有可能在人类中也是有利的，但它可能不是严格要求的。
MHC II复合体已定期制备并带有聚组氨酸标签，以简化复合体纯化。聚组氨酸标签是用作蛋白质纯化工具的亲和标签，允许在不了解其生化特性的任何先验知识的情况下纯化几乎任何蛋白质。然而，对于治疗应用，通常必须从融合蛋白中去除标签，例如，使用蛋白酶和切割位点。因此，据我们所知，作为用于治疗人类慢性炎症疾病的治疗剂，MHC II/CII肽复合体中的聚组氨酸标签没有任何影响。
发明概述
本发明涉及一种包含重组HLA-DR/CII肽复合体的组合物，所述复合体包含：(a)包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；(b)包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；以及(c)胶原蛋白II肽(CII肽)，其任选地通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端融合，优选与HLA-DRβ链的N-末端融合；其中所述CII肽包含选自下组的氨基酸序列：AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG和AGFKXEQGPXG，并且其中所述HLA-DR/CII肽复合体在含有HLA-DRα链和/或HLA-DRβ链的多肽的C-末端包含软骨素结合肽，用于治疗人类患者的慢性炎性疾病，特别是慢性炎性关节病和/或关节炎。优选地，组合物用于治疗的慢性炎性疾病选自：类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、非放射学中轴型脊柱关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎、复发性多软骨炎、系统性红斑狼疮、莱姆病(Lymedisease)、梅尼埃病(Menierediseases)、自身免疫性内耳疾病(AIED)或斯蒂尔病(Still’s disease)。
在某些实施方案中，软骨素结合肽呈游离形式。这意味着重组HLA-DR/CII肽复合体未通过组合物中的软骨素结合肽多聚化和/或重组HLA-DR/CII肽复合体未通过组合物中的软骨素结合肽与其他分子结合。软骨素结合肽可包含5-20个氨基酸，优选6-12个氨基酸。在一个实施方案中，软骨素结合肽是聚组氨酸标签，优选至少是六组氨酸标签。
在某些实施方案中，HLA-DRα链的胞外区包含α1和α2结构域；和/或HLA-DRβ链的胞外区包含β1和β2结构域。在另一个实施方案中或另外，CII肽通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端，优选融合至HLA-DRβ链的N-末端。在某些实施方案中，CII肽包含AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX1G、AGFKGEX2GPKG、AGFKGX3QGPKG、AGFKX4EQGPKG、AGFKGEX2GPX1G、AGFKGX3QGPX1G和AGFKX4EQGPX1G的氨基酸序列，其中X1是除K之外的任何蛋白质氨基酸，优选R、A、G或Q，更优选R；X2是除Q之外的任何蛋白质氨基酸，优选A、R、H或G；X3是除E外的任何蛋白质氨基酸，优选A、D、Q或G；和X4是除G之外的任何蛋白质氨基酸，更优选A、S、V或L。优选X2、X3或X4不是K。在某些实施方案中，CII肽包含的氨基酸序列为AGFKGEQGPKG或AGFKGEQGPX1G，优选AGFKGEQGPKGEP或AGFKGEQGPX1GEP，更优选GIAGFKGEQGPKGEP或GIAGFKGEQGPX1GEP。
在根据本发明的用途的组合物中，至少α1结构域优选来自DRA*0101，并且至少β1结构域来自优选选自下组的HLA-DR等位基因：DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001、DRB1*1402和DRB1*1303，优选DRB1*0401。
包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；以及包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区，可以表达为单一融合多肽；并且任选地，胶原蛋白II肽(CII肽)通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端，优选融合至HLA-DRβ链的N-末端。或者，α链和β链可以表达为单独的多核苷酸，其中HLA-DR复合体包含：第一多肽，其含有包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；第二多肽，其含有包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；以及胶原蛋白II肽(CII肽)，其任选地通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端融合，优选与HLA-DRβ链的N-末端融合；以及其中HLA-DRα链在其C-末端融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第一功能域，并且HLA-DRβ链在其C-末端融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第二互补功能域。亮氨酸拉链异二聚化基序的第一和/或第二功能域后面是软骨素结合肽。第一功能域和第二互补功能域可以是酸性和碱性亮氨酸拉链异二聚化结构域，优选jun-fos亮氨酸拉链基序。
包含在根据本发明的用途的组合物中的重组HLA-DR/CII肽复合体，可包含具有未修饰的和/或一个或多个翻译后修饰的赖氨酸残基的CII肽。在一个实施方案中，CII肽由具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽组成，CII肽由第一赖氨酸为羟赖氨酸(Hyl)的CII肽组成，CII肽由第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽组成，或CII肽由具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽组成。在另一个实施方案中，CII肽包含第一赖氨酸是半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽；CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽；CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸和/或羟赖氨酸(Hyl)的CII肽；或者，CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为O-糖基化羟赖氨酸和/或羟赖氨酸(Hyl)的CII肽。翻译后修饰的CII肽中任选的第二赖氨酸可以是未修饰的羟赖氨酸、半乳糖-羟赖氨酸和/或葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸；优选未修饰的羟赖氨酸、半乳糖-羟赖氨酸，更优选未修饰的。在一个优选的实施方案中，所述组合物不含有包含具有葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸修饰的CII肽的HLA-DR/CII肽复合体。
附图说明
图1：HLA-DR/CII肽复合体的示意图。MHC II分子具有共价结合的CII259-273肽。BirA：生物素化位点，HIS：聚(6x)组氨酸标签，JUN/FOS：亮氨酸拉链的互补结构域(异二聚化结构域)，TEV：烟草蚀刻病毒(TEV)半胱氨酸蛋白酶切割位点，接头：Gly-Ser接头肽，凝血酶切割位点，Strep-标签，CII肽259-273。
图2：响应于HEK293细胞(上图)、S2昆虫细胞(中图)和抗-CD3抗体刺激(下图)中产生的Aq/rCII(259-273)复合体(重组，原位糖基化Aq/rCII)，Aq限制性T细胞杂交瘤克隆的IL-2(FU)分泌。使用的小鼠T细胞杂交瘤克隆具有以下特异性：HCQ3(CII,Gal-HK264)、HCQ.4(CII,未修饰和HK264)、HCQ.11(Glc-Gal-HK264)、HM1R.2(CII、Gal-HK264和Gal-HK264+270)、HP3(Aq-限制性胃蛋白酶肽)，其中K是赖氨酸的缩写，HK是羟赖氨酸的缩写。
图3：使用在小鼠CIA模型中的HEK293细胞中产生的原位糖基化Aq/rCII进行治疗性疫苗接种。A)剂量-反应曲线：用CII对空白(naive)小鼠进行免疫以诱发关节炎，并在第35天接受加强免疫。用不同剂量的HLA-DR/CII肽复合体治疗小鼠：10、50或100μg(n＝9)。与对照组相比，100μg治疗组中关节炎小鼠的数量显著减少(p<0.05，卡方)。B)为了施用HLA-DR/CII肽复合体，在第35天加强免疫后7天植入渗透泵，以确保持续施用疫苗(例如100μg：15μg/24h，持续7天)。
图4：糖基化限制性人T细胞杂交瘤的激活。人T细胞杂交瘤细胞在以抗原特异性方式被人HLA-DR/CII肽复合体(DR4/hCII)刺激后被激活。人T细胞杂交瘤mDR1.1和3H8的识别，取决于CII肽的糖基化特征。A)T细胞杂交瘤克隆mDR1.1被HLA-DR4呈递的半乳糖基化K264激活；B)而T细胞杂交瘤克隆3H8被HLA-DR4呈递的未修饰的CII表位激活。通过使用加载有合成的半乳糖基化或未修饰的CII肽(分别为DR4/galCII和DR4/nCII)的人HLA-DR/CII肽复合体和天然糖基化HLA-DR/CII肽复合体(DR4/hCII)，比较这两种不同T细胞杂交瘤克隆的反应性。通过ELISA测量IL-2的分泌。
图5：HLA-DRB1*0401类风湿性关节炎患者外周血中抗原特异性T细胞的检测。A)生物素化的DR4/galCII肽复合体与缀合有荧光染料(PE、APC)的链霉亲和素一起孵育。这些四聚体用于检测对在K264处半乳糖基化的CII259-273肽具有特异性的T细胞。使用流式细胞术检测RA患者和健康供体的PBMC中的抗原特异性(CII259-273,K264gal)T细胞。B)使用DR4/galCII肽四聚体、DR4/nCII肽四聚体或DR4/hCII肽四聚体，检测抗原特异性T细胞的频率比较。通过流式细胞术测量CD4+T细胞群中四聚体阳性T细胞的频率。
图6：人T细胞活化。HLA-DRB1*0401RA患者外周血中抗原特异性T细胞的检测。在有galCII时并在较小程度上通过未修饰的CII肽刺激，T细胞被激活。通过流式细胞术测量CD154的上调(显著性：p值＝0.0332，Mann-Whitney检验)。
图7：体外刺激的HLA-DRB1*0401阳性RA患者(n＝20)的PBMC释放的细胞因子的LegendplexTM分析。显示了与用标准TR1细胞分化条件(TR1)和阴性对照(CO)刺激相比，用DR4/nCII肽复合体或DR4/galCII肽复合体体外刺激对IL-2、IL-17f、IFN-γ、IL-10、IL-17a和TNF-α释放的特异性诱导。
图8：带有和不带有His-标签的复合体的比较。(A)使用DR4特异性抗体和过氧化物酶偶联的二抗，ELISA比较了DR4/nCII相对于DR4/nCII Tev切割的复合体的等摩尔溶液对微量滴定孔的包被功效。显示的是用于包被微量滴定板的DR4/nCII溶液在指定蛋白浓度下于405nm处的吸收[μg/ml]。(B)DR4/nCII相对于DR4/nCII Tev切割的复合体，以指定的浓度预包被到微量滴定孔中，对3H8杂交瘤细胞的激活。显示的是在用于包被微量滴定板的DR4/nCII溶液的指定蛋白浓度下活化后，上清液中的IL-2浓度[μg/ml]。
图9：DR4/hCII肽复合体中的His-标签及其与A)硫酸软骨素(CS)、B)乙酰透明质酸、C)硫酸乙酰肝素(HS)的相互作用对T细胞激活的影响：DR4/hCII相对于DR4/hCIIΔHis在3H8杂交瘤中诱导IL-2反应，以及在(A)中微量滴定孔中的溶质相中指示浓度的DR4/hCII_DED也用硫酸软骨素封闭或预包被。显示的是活化后上清液中的IL-2浓度。
图10：DR4/hCII相对于DR4/hCIIΔHis，相对于DR4/hCII_DED，以指定的浓度预包被到微量滴定孔中，对3H8杂交瘤细胞的激活。显示的是在用于包被微量滴定板的DR4/nCII溶液的指定蛋白浓度下活化后，上清液中的IL-2浓度[μg/ml]。
图11：DR4/hCII肽复合体中的His-标签及其与在溶质相中的硫酸软骨素(CS)的相互作用对刺激3H8杂交瘤细胞中的IL-10反应的影响：在具有封闭的塑料表面的微量滴定孔中具有或不具有(w/o)硫酸软骨素(2.5mg/ml)的溶质相中，指定浓度的DR4/nCII激活3H8杂交瘤细胞。显示的是在用于包被微量滴定板的DR4/nCII溶液的指定蛋白浓度下活化后，上清液中的IL-10浓度[μg/ml]。
图12：含有或缺乏His-标签的Aq/galCII肽复合体，对由体内对胶原蛋白II的DTH反应诱导的耳肿胀的治疗效果的比较。与在其结合槽中包含连接的小鼠突变CLIP肽(CLIPmt)的Aq/mCLIPmt对照构建体相比，显示了具有(His)和不具有聚组氨酸标签(w/oHis)的Aq/galCII构建体的效果(*表示<0.05的p值，**表示<0.01的p值)。
图13：重组DR4/hCII复合体中CII-肽翻译后修饰的异质性。显示了通过质谱分析所分析的在指定的K位置的相应位置处可检测修饰的百分比。[OH＝羟赖氨酸，Hex＝半乳糖基-羟赖氨酸，DiHex＝葡萄糖基-半乳糖基-羟赖氨酸，Ub＝泛素，POH＝羟脯氨酸。
图14：Plod3基因(LH3)敲低Expi293细胞的生成。(A)由多功能胶原修饰酶LH3介导的从赖氨酸至羟赖氨酸至Gal-羟赖氨酸和Glc-Gal羟赖氨酸的逐步转移的示意图。(B)通过蛋白质印迹检测PLOD3。将来自用1x106慢病毒编码Plod3特异性sh-RNA转导的不同Expi293HEK细胞克隆的裂解物，加载至SDS-PAGE上，并使用抗-PLOD3抗体在蛋白质印迹上检测到PLOD3。PLOD3的理论分子量为84kDa。将克隆#4、#18和#20用于进一步扩增。(C)通过质谱法分析聚糖。在用shRNA进行慢病毒转导以敲低plod3基因后，通过质谱法进行聚糖分析，以研究半乳糖基羟赖氨酰残基的糖基化减少。分析了顶部显示的II型胶原表位(SEQ IDNO:1)内的两种赖氨酸(K264和K270)。证明了葡糖-半乳糖基羟基赖氨酰残基(DiHex)的明显减少。Unmod＝未修饰，OH＝羟基化的，DiOH＝二羟基化的，Hex＝半乳糖基化羟基赖氨酰基，DiHex＝葡糖-半乳糖基羟基赖氨酰基。
图15：在包含β-链的序列的C-末端具有替代性带正电荷的氨基酸标签的Aq/gal264 CII构建体。A)显示了H2AN标签(N-末端H2A序列；组蛋白NT；SEQ ID NO:34)、H2AC标签(C-末端H2A序列；组蛋白CT；SEQ ID NO:40)和NH标签(修饰的His；SEQ ID NO:35)的序列。B)显示了人和小鼠组蛋白H2A的序列比对。匹配用(*)表示，不匹配用(:)表示。框表示组蛋白NT和CT序列的位置。
图16：用于测试在Aqβ链的C-末端具有替代性带正电荷的氨基酸标签的Aq/gal264CII构建体的杂交瘤测定。带有His-标签或替代性带正电荷的氨基酸标签的构建体显示在顶部，TCS代表凝血酶切割位点，随后是接头，然后是β-链，S-标签代表链霉亲和素标签，如图1。具有替代性带正电荷的氨基酸标签(Aq/galCII(修饰的His)、Aq/galCII(组蛋白CT)、Aq/galCII(组蛋白NT))的Aq/gal264 CII肽复合体，以不同浓度包被到微量滴定孔的塑料表面，加入HCQ.3T细胞杂交瘤，并通过ELISA测定IL-2分泌作为特异性细胞活化的量度。His标记的Aq/galCII(His)作为阳性对照，而没有任何标签的Aq/galCII(w/o His)作为阴性对照。
图17：带有或不带有His-标签的Aq/galCII肽复合体和带有组蛋白NT标签的Aq/galCII肽复合体，对由体内对胶原蛋白II的DTH反应诱导的耳肿胀的治疗效果的比较。与在其结合槽中包含连接的小鼠突变CLIP肽(CLIPmt)的Aq/mCLIPmt对照构建体相比，显示了具有(His)和不具有聚组氨酸标签(ΔHis)以及具有组蛋白NT标签的Aq/galCII构建体的效果。
优选实施方案详述
一般实施方案“包括……(comprising of)”或“由……组成(comprised of)”涵盖更具体的实施方案“由……组成(consisting of)”。此外，不以限制方式使用单数和复数形式。如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”表示单数和复数，除非明确说明仅表示单数。
术语“蛋白质”与“氨基酸序列”或“多肽”可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。这些术语还包括通过反应进行翻译后修饰的蛋白质，所述反应包括但不限于：糖基化(glycosylation)、乙酰化、磷酸化、糖化(glycation)或蛋白质加工。修饰和变化，例如与其他蛋白质的融合、氨基酸序列替换、缺失或插入，可以在多肽的结构中进行且同时该分子保持其生物功能活性。例如，可以在多肽或其潜在的核酸编码序列中进行某些氨基酸序列替换，并且可以获得具有相同特性的蛋白质。
术语“多肽”通常是指超过20个氨基酸的序列，而术语“肽”是指长度最多为20个氨基酸的序列。然而，这些术语可以互换使用。蛋白质可以形成多聚体如二聚体，其中二聚体可以是异源二聚体或同源二聚体。本发明的HLA-DR/CII肽复合体包含MHC II类α链的胞外区和MHC II类β链的胞外区，它们通常形成异二聚体，其形成结合槽以容纳融合至其中一条链N-末端的II型胶原肽。然而，本领域技术人员会理解，形成异二聚体的两种蛋白质也可以作为融合蛋白生成，以形成具有(任选地通过柔性接头)彼此连接的结构域的单个多肽链，即单链异二聚体。
“融合蛋白”被定义为包含两种或更多种最初分开的天然或修饰的蛋白的完整序列或序列的任何部分的蛋白。融合蛋白可以通过使用重组DNA技术的基因工程方法，通过融合最初编码两种或更多种最初分开的天然或异源蛋白或其部分的两种或更多种基因或cDNA或其部分来构建。这导致融合蛋白具有源自每个原始蛋白的功能特性。因此，肽或蛋白通过肽键或优选接头肽与另一种蛋白连接。
术语“基因组DNA”或“基因组”可互换使用，是指宿主生物体可遗传的遗传信息。基因组DNA包含细胞核的DNA(也称为染色体DNA)，以及其他细胞器(例如线粒体)的DNA。
如本文所用，术语“基因”是指可遗传基因组序列的DNA基因座，其通过表达为功能产物或通过调节基因表达来影响生物体的性状。基因和多核苷酸可包括基因组序列中的内含子和外显子，或仅包含在cDNA中的编码序列，如包含起始密码子(甲硫氨酸密码子)和翻译终止密码子的开放阅读框(ORF)。基因和多核苷酸还可以包括调节其表达的区域，如转录起始、翻译和转录终止。因此，还包括调控元件，如启动子。
如本文所用，术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指从5'到3'端读取，脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，包括双链链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、基因组DNA、cDNA、cRNA、重组DNA或重组RNA及其衍生物，如含有修饰骨架的那些。优选地，多核苷酸，特别是稳定整合到哺乳动物基因组中的多核苷酸，是DNA或cDNA。本发明的多核苷酸可以以不同方式(例如通过化学合成、通过基因克隆等)，并且可以采用多种形式(例如直链或直链、单链或双链、或其杂交体、引物、探针等)来制备。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为单独的单链或双链体的核酸的有义链和反义链。
如本文所用，术语“重组多核苷酸”是指源自与受体的不同细胞、生物体或不同物种的多核苷酸，例如CHO细胞或HEK293细胞，并使用重组技术引入受体。在本发明的背景下，技术人员会理解它是指DNA或cDNA。重组多核苷酸也可称为转基因或异源多核苷酸。因此，它可以是编码重组蛋白的基因或开放阅读框(ORF)。在哺乳动物细胞(如HEK293或CHO细胞)的背景下，“重组多核苷酸”是指源自不同细胞或人工合成的多核苷酸。术语“重组体”是指通过实验室基因重组方法如分子克隆形成的分子，如多肽或多核酸分子。此类方法将来自多个来源的遗传物质汇集在一起，或创建天然不存在的序列。当就核酸的部分使用时，“重组体”还包括包含两个或更多个在自然界中彼此不具有相同关系的序列的多核苷酸，或由所述多核苷酸编码的多肽。因此，重组体也可以指多核苷酸序列，如基因或转基因或其部分，源自相同的细胞系，但被插入至基因组中其通常不存在的位置，或把基因引入至其通常不存在的生物体的细胞中。
如本文所用，“重组多核苷酸”、“重组基因”或“重组序列”，可以直接或优选通过使用“表达载体”，优选哺乳动物表达载体，被引入至靶细胞或宿主细胞。用于构建载体的方法是本领域技术人员公知的。载体可以包括但不限于：质粒载体、粘粒、人工/微型染色体(例如ACE)，或病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒。真核表达载体通常还会包含促进载体在细菌中繁殖的原核序列，如用于在细菌中选择的复制起点和抗生素抗性基因。多种真核表达载体在本领域中是公知的，其包含可以可操作地连接多核苷酸的克隆位点。通常表达载体还包含编码可选择标记物的表达盒，允许选择携带所述表达标记物的宿主细胞。
术语“细胞因子”是指由细胞释放并充当细胞间介质的小蛋白，例如影响分泌细胞周围的细胞的行为。细胞因子可由免疫细胞或其他细胞分泌，如T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞。细胞因子可参与细胞间信号转导事件，如自分泌信号转导、旁分泌信号转导和内分泌信号转导。它们可介导一系列生物过程，包括但不限于：免疫、炎症和造血。细胞因子可以是趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子。
如本文所用，术语“表达”是指在宿主细胞内的核酸序列的转录和/或翻译。宿主细胞中目标基因产物的表达水平，可以基于细胞中存在的相应RNA的量或由所选序列编码的多肽的量来确定。例如，从所选序列转录的RNA，可以通过RNA印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA的原位杂交，或通过PCR如qPCR进行定量。由所选序列编码的蛋白，可以通过多种方法进行定量，例如通过ELISA、通过蛋白质印迹、通过放射免疫测定、通过免疫沉淀、通过测定蛋白的生物活性、通过蛋白的免疫染色后进行FACS分析，或通过均相时间分辨荧光(HTRF)测定。非编码RNA如miRNA或shRNA的表达水平，可以通过PCR如qPCR进行定量。
术语“基因产物”是指由基因或DNA多核苷酸编码的RNA多核苷酸和多肽。
如本文所用，术语“蛋白质氨基酸”是指在翻译过程中以生物合成方式并入蛋白质中的所有氨基酸。术语“蛋白质原性”是指产生蛋白质。在真核生物中有21种基因编码氨基酸(即蛋白质氨基酸)，标准遗传密码中的20种和硒代半胱氨酸。标准遗传密码的20个氨基酸为：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
如本文所用，术语“翻译后修饰”或“经翻译后修饰的”是指CII肽中赖氨酸残基的天然发生修饰，其在细胞中产生时可能发生。赖氨酸残基的翻译后修饰可产生羟赖氨酸(Hyl)或O-糖基化的Hyl，如半乳糖基-羟赖氨酸或葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸，优选半乳糖基-羟赖氨酸。
如本文所用，术语“结构域”是指折叠的蛋白质结构，其具有独立于蛋白质其余部分的三级结构。一般而言，结构域负责蛋白质的离散功能特性，并且在许多情况下可以添加、去除或转移到其他蛋白质，而不会损失蛋白质的其余部分和/或结构域的功能。例如，MHC IIα链的α1结构域和MHC IIβ链的β1结构域各自是折叠的多肽结构域，一起形成MHC II分子的肽结合槽。用于治疗慢性炎性疾病的含有包含软骨素-结合肽的重组HLA-DR/CII肽复合体的组合物是人类的
在一个方面，本发明提供了一种包含重组HLA-DR/CII肽复合体的组合物，所述复合体包含：包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；以及胶原蛋白II肽(CII肽)，其任选地通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端融合，优选与HLA-DRβ链的N-末端融合；其中所述CII肽包含选自下组的氨基酸序列：AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG和AGFKXEQGPXG，并且其中HLA-DR/CII肽复合体在含有HLA-DRα链和/或HLA-DRβ链的多肽的C-末端包含软骨素结合肽，用于治疗人类患者的慢性炎性疾病。在一个实施方案中，CII肽通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端。在一个实施方案中，CII肽融合至HLA-DRβ链的N-末端。
在一个实施方案中，软骨素结合肽在体内介导重组HLA-DR/CII肽复合体与软骨素的结合。不受理论束缚，软骨素结合肽可介导重组HLA-DR/CII肽复合体与软骨(优选关节软骨)中的软骨素的结合。或者，或此外，软骨素结合肽可介导重组HLA-DR/CII肽复合体与免疫细胞(特别是T细胞)上细胞表面和/或在淋巴结或其他组织(如滑膜)的基质中的带负电荷碳水化合物(如软骨素或软骨素样结构)结合。在关节中主动免疫介导的慢性关节炎期间，带电的糖胺聚糖以高浓度从软骨基质和/或滑膜内衬细胞释放到滑液中(约4mg/100ml；Seppala PO et al.Clin Chim Acta 1975；36:549-553)。
令人惊讶地表明，添加到包含如图1所示的HLA-DRβ链之一的多肽链的C-末端以及异二聚化结构域的C-末端的HLA-DR/CII肽复合体中的His-标签，促进了HLA-DR/CII肽复合体在体外的作用。进一步令人惊讶地发现，His-标签促进重组HLA-DR/CII肽复合体与细胞外基质成分软骨素的结合，并且在涂有硫酸软骨素的微量滴定板中，只有带有His-标签的复合体能够诱导T细胞杂交瘤中可溶性形式的足够的IL-2反应。不受理论束缚，重组HLA-DR/CII肽复合体与细胞外基质成分硫酸软骨素的结合，可导致空间定向和/或多聚化的改善，从而导致用于TCR识别的肽结合基团的呈递改善。体内数据证实了这一观察结果，表明与没有His-标签的复合体相比，施用有His-标签的复合体后在CII诱导的迟发型超敏反应(DTH)模型中的肿胀减少。因此，不受理论的束缚，His-标签可能对重组HLA-DR/CII肽复合体与TCR的结合很重要，因为与细胞表面或组织表面带负电荷的分子(如软骨素)相互作用而增加亲和力，从而导致复合体多聚化和/或正确定向，促进复合体与TCR的相互作用。此外，软骨素相互作用也可能有助于与T细胞膜上的共刺激分子结合，这些分子可以结合软骨素和/或本身含有软骨素部分，例如CD44或CD74、蛋白质酪氨酸磷酸酶RTR。
软骨素，本文中也称为硫酸软骨素，是由交替的糖、N-乙酰半乳糖胺和葡萄糖醛酸的链组成的硫酸化糖胺聚糖(GAG)。通常发现它作为蛋白聚糖的一部分附着在蛋白质上。蛋白聚糖是细胞外基质(ECM)的主要成分。硫酸软骨素也是软骨的重要结构成分。它进一步存在于细胞外体液(如滑液或淋巴液)以及组织(如关节软骨或滑膜)中。因此，His-标签可支持定位于关节结构、在关节炎期间主要受影响的身体部位或淋巴结，并因此介导复合体在体内的有利分布。本领域技术人员会理解，这种能力不限于聚组氨酸标签，如六组氨酸标签，或优选七组氨酸标签，而是可以由任何软骨素结合肽介导。
因此，根据本发明的用途的组合物包含HLA-DR/CII肽复合体，该复合体含有至少一种软骨素结合肽，优选软骨素和透明质酸(也称为玻尿酸)结合肽。优选地，软骨素结合肽位于复合体的至少一个多肽链的C-末端。在一个实施方案中，HLA-DR/CII肽复合体包含至少一个C-末端软骨素结合肽。软骨素结合肽是本领域已知的，并且包括但不限于具有以下氨基酸序列的肽：EKRIWFPYRRF(SEQ ID NO:31)、YKTNFRRYYRF(SEQ ID NO:32)或VLIRHFRKRYY(SEQ ID NO:33)(Butterfield KC et al.,Biochemistry.2010Feb 23；49(7):1549-55)。在一个实施方案中，软骨素结合肽包含5-20个氨基酸，优选6-20个氨基酸，优选6-12个氨基酸，更优选6-12个，甚至更优选6-12个氨基酸。在本文中还鉴定了带正电荷的组蛋白肽，特别是人H2A组蛋白的肽，如包含氨基酸序列SGRGKQGGKARAKAKTRSSR(SEQ IDNO:34)的肽。术语软骨素和硫酸软骨素在本文中可互换使用，因此软骨素结合肽也可称为硫酸软骨素结合肽。为了增加与透明质酸的结合，包含结合共有基序的示例性序列定义如下：B(X7)B，其中B是R或K，且X7不包含酸性残基和至少一个碱性氨基酸(Yang B et al.,EMBO J.1994Jan 15；13(2):286-96)。如本文所公开的，HLA-DR/CII肽复合体还可以通过His-标签结合硫酸软骨素。因此，软骨素结合肽可以是聚组氨酸标签，优选六组氨酸标签，或增加对软骨素的结合亲和力的任何其他氨基酸序列，如EKRIWFPYRRF(SEQ ID NO:31)、YKTNFRRYYRF(SEQ ID NO:32)或VLIRHFRKRYY(SEQ ID NO:33)。术语His-标签与聚组氨酸标签在本文中同义使用，并且指具有至少6个连续组氨酸残基的标签(至少是六组氨酸标签)。优选地，His-标签至少是七组氨酸标签。
在一个实施方案中，(a)C-末端软骨素结合肽处于其游离形式；(b)重组HLA-DR/CII肽复合体未通过组合物中的软骨素结合肽多聚化；(c)重组HLA-DR/CII肽复合体未通过组合物中的软骨素结合肽与其他分子结合；或(a)、(b)或(c)中任意项的组合。因此，软骨素结合肽在体内自由结合软骨素。
术语“HLA-DR/CII肽复合体”是指包含形成肽结合槽的人MHC II蛋白(HLA-DR同种型)胞外域或其部分和胶原蛋白II肽(CII肽)的可溶性复合体，其中所述肽任选地融合(即，连接)至α链或β链的N-末端。优选地，CII肽融合至α或β链的N-末端，更优选融合至MHC II类β链的N-末端。或者，HLA-DR蛋白可以用替代肽产生，如II类相关的不变链肽(CLIP)，其通过包含蛋白酶切割位点(例如，凝血酶切割位点)的接头肽，融合至β链或α链(优选β链)的细胞外部分的N-末端；使用识别所述蛋白酶切割位点的蛋白酶(例如凝血酶)切割掉CLIP；并用翻译后修饰或未修饰的CII肽加载HLA-DR蛋白以形成HLA-DR/CII肽复合体。HLA-DR蛋白包含形成α链的胞外域的α1结构域和α2结构域，以及形成β链的胞外域的β1结构域和β2结构域。术语“胞外域”和“胞外区”在本文中同义使用。α1结构域和β1结构域形成肽结合槽，即与肽(如CII肽)相互作用并结合的位点。因此，HLA-DR/CII肽复合体至少包含HLA-DR蛋白的α1结构域和β1结构域。优选地，HLA-DR/CII肽复合体包含HLA-DR蛋白的α1结构域、α2结构域、β1结构域和β2结构域。
对于人类的RA，与编码MHC II类分子HLA-DR的肽结合口袋的β链上的氨基酸共有基序(Q/R R/K RAA)(氨基酸位置70-74，所谓的“共享表位”)的HLA-DRB1基因座的某些等位基因存在遗传关联。RA关联HLADRB1等位基因的实例是QKRAA编码等位基因HLA_DRB1*0401和0409，QRRAA编码等位基因：HLA_DRB1*0404、0405、0408、0101、0102和1402，RRRAA编码等位基因：HLA_DRB1*1001和DKRAA编码等位基因：HLA_DRB1*1303。MHC II类α链的胞外区和MHC II类β链的胞外区因此衍生自HLA-DR，优选至少α1结构域来自DRA*0101，并且至少β1结构域来自选自下组的HLA-DR等位基因：DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001、DRB1*1402和DRB1*1303，优选DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001和DRB1*1402，更优选DRB1*0401、DRB1*0404和DRB1*0405。更优选α1结构域和α2结构域来自DRA*0101，并且β1结构域和β2结构域来自选自下组的HLA-DR等位基因：DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001、DRB1*1402和DRB1*1303,优选DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001和DRB1*1402，更优选DRB1*0401、DRB1*0404和DRB1*0405。
在根据本发明的用途的组合物中，重组HLA-DR/CII肽复合体包含未修饰的CII肽和/或翻译后修饰的CII肽，更具体地具有未修饰的或一种或多种翻译后修饰的赖氨酸的CII肽，优选第一赖氨酸被翻译后修饰。如本文所用，术语“翻译后修饰的”或“经翻译后修饰的CII肽”是指携带对选自羟赖氨酸(Hyl)、半乳糖基-羟赖氨酸或葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸的第一和任选的第二赖氨酸残基的修饰的CII肽，即通过细胞的胶原中赖氨酸残基的翻译后修饰可获得的修饰。因此，不要求所述修饰是通过翻译后修饰获得的，即在细胞中，但同样可以通过体外酶促或合成方式获得。
翻译后修饰的CII肽包含其中CII肽的至少一个赖氨酸残基是羟赖氨酸(Hyl)和/或O-糖基化Hyl的CII肽。优选地，CII肽的第一赖氨酸残基是羟赖氨酸(Hyl)和/或O-糖基化的Hyl。所述组合物中的HLA-DR/CII肽复合体可包含相同的CII肽。因此，在一个实施方案中，CII肽由具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽组成；或CII肽由第一赖氨酸为羟赖氨酸(Hyl)的CII肽组成；或CII肽由第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽组成。所述组合物中的HLA-DR/CII肽复合体还可包含CII肽的混合物。这可以通过用未修饰的CII肽和翻译后修饰的CII肽的混合物加载HLA-DR蛋白来实现，或者通过加载带有未修饰或翻译后修饰的CII肽的HLA-DR复合体并随后混合HLA-DR/CII肽复合体来实现。本领域技术人员会理解，翻译后修饰的CII肽通常会通过合成或酶促在体外生成。或者，这可以通过使用能够对胶原蛋白中的赖氨酸残基添加翻译后修饰的细胞系，在体内制备CII肽通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端的HLA-DR/CII肽复合体来实现。因此，在另一个实施方案中，CII肽由具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽组成；CII肽包含第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽；CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽；CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸和/或羟赖氨酸(Hyl)的CII肽；或CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为O-糖基化羟赖氨酸和/或羟赖氨酸(Hyl)的CII肽。在该实施方案中，在翻译后修饰的CII肽中任选的第二赖氨酸可以是未修饰的羟赖氨酸和/或O-糖基化的羟赖氨酸；更具体地，未修饰的羟赖氨酸、半乳糖-羟赖氨酸和/或葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸；优选未修饰的羟赖氨酸、半乳糖-羟赖氨酸，更优选未修饰的。在一个实施方案中，在CII肽或翻译后修饰的CII肽中，任选的第二赖氨酸不是葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸。在一个实施方案中，所述组合物不含有包含具有葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸修饰的CII肽的HLA-DR/CII肽复合体，即该修饰不在第一个或任选的第二赖氨酸处。
CII肽包含选自下组的氨基酸序列：AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG和AGFKXEQGPXG。在某些实施方案中，CII肽包含AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX1G、AGFKGEX2GPKG、AGFKGX3QGPKG、AGFKX4EQGPKG、AGFKGEX2GPX1G和AGFKGX3QGPX1G、AGFKX4EQGPX1G的氨基酸序列，其中X1是除K之外的任何蛋白质氨基酸，优选R、A、G或Q，更优选R；X2是除Q之外的任何蛋白质氨基酸，优选A、R、H或G；X3是除E外的任何蛋白质氨基酸，优选A、D、Q或G；X4是除G之外的任何蛋白质氨基酸，更优选A、S、V或L。优选X2、X3或X4不是K。在某些实施方案中，CII肽包含AGFKGEQGPKG或AGFKGEQGPX1G的氨基酸序列，优选为AGFKGEQGPKGEP或AGFKGEQGPX1GEP，更优选GIAGFKGEQGPKGEP或GIAGFKGEQGPX1GEP。CII肽GIAGFKGEQGPKGEP对应于三螺旋CII区的氨基酸259-273。适合结合到HLA-DR结合口袋中的CII肽的长度为10-20个氨基酸，优选地，CII肽的长度为11-15个氨基酸，更优选地，CII肽的长度为13-15个氨基酸。在一个实施方案中，CII肽包含氨基酸序列AGFKGEQGPKG，更优选AGFKGEQGPKGEP，并且甚至更优选GIAGFKGEQGPKGEP。或者，CII肽可包含GIAGFKGEQGPKGEP的11个，优选地12个，更优选地13个，且最优选地15个连续的氨基酸。在一个实施方案中，第二个K(K270)可以被突变，优选突变为R。因此，还涵盖这样的实施方案，其中CII肽包含氨基酸序列AGFKGEQGPXG、AGFKGEQGPXGEP和GIAGFKGEQGPXGEP，其中X可以是除K之外的任何蛋白质氨基酸，优选X是R、A、G或Q，更优选X是R。因此，在一个实施方案中，CII肽包含氨基酸序列AGFKGEQGPRG、AGFKGEQGPRGEP和GIAGFKGEQGPRGEP。本发明涵盖的CII肽公开于表1中：
表1
Figure BDA0003498788780000182
*其中X1是除K之外的任何蛋白质氨基酸，优选R、A、G或Q，更优选R；X2是除Q之外的任何蛋白质氨基酸，优选A、R、H或G；X3是除E外的任何蛋白质氨基酸，优选A、D、Q或G；X4是除G之外的任何蛋白质氨基酸，更优选A、S、V或L。
在根据本发明的用途的组合物中，HLA-DR/CII肽复合体包含未修饰的CII肽和/或翻译后修饰的CII肽。翻译后修饰的CII肽包含其中CII肽的至少第一赖氨酸残基是羟赖氨酸(Hyl)和/或O-糖基化Hyl的CII肽。优选地，羟赖氨酸(Hyl)和/或半乳糖基-羟赖氨酸，更优选地半乳糖基-羟赖氨酸。CII肽的第一赖氨酸(K)残基对应于三螺旋CII区氨基酸序列第264位，GIAGFKGEQGPKGEP中第一个K(对应于SEQ ID NO：1-12中第4位氨基酸和SEQ ID NO：13-15中第6位氨基酸)。因此，如本文所用，“第一赖氨酸残基”也可称为K264，或第264位赖氨酸。CII肽中任选的第二赖氨酸(K)残基对应于三螺旋CII区氨基酸序列第270位，GIAGFKGEQGPKGEP中第二个K(对应于SEQ ID NO:1、3-5中的第10位氨基酸，以及SEQ ID NO:13中的第12位氨基酸)。因此，如本文所用，“第二赖氨酸残基”或“另外的赖氨酸残基”也可称为K270，或第270位的赖氨酸。用于所述组合物中的HLA-DR/CII肽复合体可以是包含未修饰的CII肽和翻译后修饰的CII肽(Hyl、gal-Hyl和glc-gal-Hyl，优选Hyl和gal-Hyl，更优选gal-Hyl)的复合体混合物，即包含具有和不具有翻译后修饰的不同CII肽，或者可以由具有未修饰的CII肽或具有翻译后修饰的CII肽的HLA-DR/CII肽复合体组成，其中所述修饰的CII肽具有Hyl或gal-Hyl修饰，优选gal-Hyl修饰，即包含具有或不具有翻译后修饰的相同CII肽。在一个优选实施方案中，在根据本发明的用途的组合物中，HLA-DR/CII肽复合体包含未修饰的CII肽和翻译后修饰的CII肽，其中至少第一赖氨酸残基是羟赖氨酸和/或半乳糖基-羟赖氨酸。术语“半乳糖基-羟赖氨酸”也可称为G-Hyl或Gal-Hyl，并且不包括对葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸的修饰。
在本发明的CII肽序列中，赖氨酸残基的胶原特异性翻译后半乳糖基化，特别是第一赖氨酸残基，即第264位赖氨酸残基，可以参与通过TCR的T细胞识别，和由此产生的药理学作用。第270位赖氨酸残基位于DR4分子结合槽的边缘，其半乳糖基-羟赖氨酸修饰被认为对TCR识别不太重要。因此，第二个或另外的赖氨酸残基(对应于K270)可以是未修饰的、羟赖氨酸或半乳糖基-羟赖氨酸中的任一种，优选未修饰的。已经表明，识别gal264表位的T细胞杂交瘤的TCR不受K270R突变的影响。在一个优选的实施方案中，特别是当复合体在能够翻译后修饰胶原蛋白中赖氨酸残基的细胞系中体内产生时，CII肽仅包含第一赖氨酸残基，并且任何其他任选的K(如任选的第二个K)被突变，优选突变为R、A、G或Q，更优选突变为R。因此，本发明还涵盖包含氨基酸序列AGFKGEQGPRG，优选AGFKGEQGPRGEP，更优选GIAGFKGEQGPRGEP的CII肽。第二赖氨酸的突变具有降低产物异质性的优势，因此被正确修饰的肽的百分比更高。此外，半乳糖基-羟赖氨酸可在宿主生产细胞中被葡萄糖基化，以在体内形成葡萄糖基-半乳糖基-羟赖氨酸(Glc-Gal-Hyl，或GG-Hyl)，由于二糖(Glc-Gal)体积庞大，特别是在K270位，这可能对TCR识别产生负面影响。因此，K270突变，特别是K270R，进一步避免干扰结合，因为在该位置不能连接二糖修饰。
在一个实施方案中，II型胶原肽(CII肽)通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端，优选融合至MHC II类β链的N-末端链。这允许在宿主生产细胞中生产包括CII肽的分别的翻译后修饰的整个复合体。术语“接头肽”是指由多个氨基酸残基组成的多肽。接头肽可以是任何肽，只要它足够长并且足够灵活以允许肽结合到由MHC II复合体形成的肽结合口袋。合适的接头肽的实例是Gly-Ser接头。根据本发明，CII肽、接头肽以及MHC IIα链和MHC IIβ链的胞外区中至少一个被表达为一种多肽，并由一种多核苷酸编码。如本文所用，术语“融合至”是指“连接至”，其中该连接是通过肽键，任选地使用接头肽，因此生成融合蛋白。或者，HLA-DR蛋白用替代肽如CLIP肽产生，其通过包含蛋白酶切割位点如凝血酶切割位点的接头肽连接至HLA-DR链之一。因此，在生产后，肽被蛋白水解切割下来，并将通常在体外合成或酶促制备的未修饰或半乳糖基化的CII肽(即，在K264位携带gal-Hyl的CII肽)，在体外加载到复合体上。因此，在一个备选的实施方案中，未修饰和/或翻译后修饰的CII肽被加载到HLA-DR蛋白上，以形成HLA-DR/CII肽复合体。尽管这种合成的未修饰或半乳糖基化肽可以与HLA-DR分子共价连接，但这种连接不是通过接头肽。在本文中，翻译后修饰涉及将CII肽中的至少一个赖氨酸残基修饰为Hyl、gal-Hyl或glc-gal-Hyl，其中该修饰可以在宿主生产细胞内在体内添加到HLA-DR/CII肽复合体，所述宿主生产细胞能够对胶原蛋白中的赖氨酸残基进行翻译后修饰，或在体外合成或酶促地将该修饰添加到HLA-DR蛋白上的CII肽。
虽然在实施例中使用的HLA-DR/CII肽复合体(SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)以及如图1所示没有包含融合至HLA-DRβ链N-末端的CII肽的信号肽，在接头和CII肽之间仍包含酶切割位点(凝血酶切割位点，图1)，这不是必需的，并且优选从治疗产品中去除。接头肽可以提高产品的稳定性并防止肽损失。因此，优选地，本发明的HLA-DR/CII肽复合体在CII肽和HLA-DRβ链(或HLA-DRα链)的胞外区之间的氨基酸序列中不包含酶(蛋白水解)切割位点。此外，出于治疗目的，组合物中包含的HLA-DR/CII肽复合体不包含：(1)用于纯化的链霉亲和素标签(SAWSHPQFEK,SEQ ID NO:30)；(2)HLA-DRa/HLA-DRβ-链和异二聚化结构域之间的切割位点(例如，TEV切割位点；和/或(3)大肠杆菌(E.coli)生物素连接酶(BirA)(例如Avi标签)的识别位点，如图1中所示并在实施例中使用的示例性复合体中存在的。这些元件被证明对复合体的体外和体内功能没有影响(数据未显示)。根据本发明的示例性最小HLA-DR/CII肽复合体，可由SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的氨基酸序列编码。本领域技术人员会理解，肽序列可以如权利要求所涵盖的那样变化，并且His-标签可以被替代性带正电荷的肽替代，如本文公开的软骨素结合肽。
以下实例中使用的示例性复合体的序列如下：
1)DR4-构建体：
·DR4构建体α-链(SEQ ID NO:16)，序列包含：在DRA*0101细胞外α-链区(下划线)之前的信号肽、TEV切割位点(粗体)、cFos结构域(粗体和下划线)和生物素化位点(BirA，斜 体和下划线)。
Figure BDA0003498788780000211
·最小DR4构建体α-链(SEQ ID NO:18)，序列包含：在DRA*0101细胞外α-链区(下 划线)之前的信号肽和cFos结构域(粗体和下划线)：
Figure BDA0003498788780000212
·具有hCII259-273肽的DR4构建体β-链(SEQ ID NO:17)，序列包含：紧接在Strep-标签(粗体和双下划线)之前的信号肽和CII肽259-273(斜体和下划线)、由每个位点上的甘氨酸接头框入的凝血酶切割位点(粗体和虚线)、DRB*0401胞外区(下划线)、TEV切割位点(粗体)、cJun结构域(粗体和下划线)和His-标签(斜体)。
Figure BDA0003498788780000213
·具有hCII259-273肽的最小DR4构建体β-链(SEQ ID NO:19)，序列包含:紧接在CII肽259-273(斜体和下划线)之前的信号肽、DRB*0401胞外区(下划线)、cJun域(粗体和下 划线)和His-标签(斜体)。
Figure BDA0003498788780000221
2)DR4-hCLIPmut构建体：
·DR4构建体α-链如上(SEQ ID NO:16)
·具有hCLIPmut的DR4构建体β-链(SEQ ID NO:20)，序列包含：紧接在Strep-标签(粗体和双下划线)之前的信号肽和突变的hCLIP肽(斜体和下划线)、由每个位点上的甘氨酸接头框入的凝血酶切割位点(粗体和虚线)、DRB*0401胞外区(下划线)、TEV切割位点(粗体)、cJun结构域(粗体和下划线)和His-标签(斜体)。
Figure BDA0003498788780000222
3)Aq-rCII构建体：
·Aq构建体α-链(SEQ ID NO:21)，序列包含：在Aq胞外α-链区(下划线)之前的信号肽、TEV切割位点(粗体)、cFos结构域(粗体和下划线)和生物素化位点(BirA，斜体和下划 线)：
Figure BDA0003498788780000223
·具有大鼠CII259-273肽的Aq构建体β-链(SEQ ID NO:22)，序列包含：紧接在Strep-标签(粗体和双下划线)之前的信号肽和CII肽259-273(斜体和下划线)、由每个位点上的甘氨酸接头框入的凝血酶切割位点(粗体和虚线)、Aq胞外区(下划线)、TEV切割位点(粗体)、cJun结构域(粗体和下划线)和His-标签(斜体)。
Figure BDA0003498788780000231
·具有不带His-标签的大鼠CII259-273肽的Aq构建体β-链(SEQ ID NO:23)，序列包含：紧接在Strep-标签(粗体和双下划线)之前的信号肽和CII肽259-273(斜体和下划 线)、由每个位点上的甘氨酸接头框入的凝血酶切割位点(粗体和虚线)、Aq胞外区(下划 线)、TEV切割位点(粗体)和cJun结构域(粗体和下划线)：
Figure BDA0003498788780000232
4)Aq-mCLIPmt构建体：
·Aq构建体α-链如上(SEQ ID NO:21)
·具有mCLIP肽的Aq构建体β-链(SEQ ID NO:24)，序列包含：紧接在Strep-标签(粗体和双下划线)之前的信号肽和mCLIPmt肽(斜体和下划线)、由每个位点上的甘氨酸接头框入的凝血酶切割位点(粗体和虚线)、Aq胞外区(下划线)、TEV切割位点(粗体)、cJun结构域(粗体和下划线)和His-标签(斜体)。
Figure BDA0003498788780000233
·具有不带His-标签的mCLIP肽的Aq构建体β-链(SEQ ID NO:25)，序列包含：紧接在Strep-标签(粗体和双下划线)之前的信号肽和mCLIPmt肽(斜体和下划线)、由每个位点上的甘氨酸接头框入的凝血酶切割位点(粗体和虚线)、Aq胞外区(下划线)、TEV切割位点(粗体)、cJun结构域(粗体和下划线)：
Figure BDA0003498788780000234
下文提供了本文公开的构建体的各个元件的其他氨基酸序列：
·cFos结构域(SEQ ID NO:26)：LTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH
·cJun结构域(SEQ ID NO:27)：RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
·修饰的人CLIP肽(SEQ ID NO:28)：PVSKARMATGALAQA
·大鼠CII-肽259-273(SEQ ID NO:29)：GIAGFKGEQGPKGET
·链霉亲和素标签(SEQ ID NO:30)：SAWSHPQFEK。
在一个实施方案中，包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区和包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区，表达为单一融合多肽(单链异源二聚体)；并且任选地，胶原蛋白II肽(CII肽)通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端，优选融合至HLA-DRβ链的N-末端。在一个实施方案中，HLA-DR/CII肽复合体不含多聚化或异二聚化结构域，特别是不含IgG结构域。在一个实施方案中，每个HLA-DR/CII肽复合体仅包含HLA-DRα链的一个胞外区和HLA-DRβ链的一个胞外区。
在一个替代实施方案中，HLA-DR/CII复合体包含：包含HLA-DR/CIIα链的胞外区的第一多肽，所述胞外区包含至少一个α1结构域；包含HLA-DR/CIIβ链的胞外区的第二多肽，所述胞外区包含至少一个β1结构域；以及胶原蛋白II肽(CII肽)，任选地通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链(优选与HLA-DRβ链)的N-末端融合；并且其中HLA-DRα链在其C-末端融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第一功能域，并且MHC II类β链在其C-末端融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第二互补功能域。第一功能域和第二互补功能域可以是酸性和碱性亮氨酸拉链异二聚化结构域，优选jun-fos亮氨酸拉链基序。在一个实施方案中，jun-fos亮氨酸拉链基元包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:26的cFos结构域和具有氨基酸序列SEQ ID NO:27的cJun结构域。本领域技术人员将理解，第一和/或第二多肽在亮氨酸拉链异二聚化基序的功能域的C-末端包含软骨素结合肽，如聚组氨酸标签。在一个实施方案中，HLA-DR/CII肽复合体不包含进一步的多聚化或异二聚化结构域，特别是不包含IgG结构域。在一个实施方案中，每个HLA-DR/CII肽复合体仅包含HLA-DRα链的一个胞外区和HLA-DRβ链的一个胞外区。
本领域技术人员会理解，根据本发明的用途的组合物，特别是如果在能够翻译后修饰胶原中赖氨酸残基的宿主生产细胞中产生，可包含在HLA-DR/CII肽复合体的异质混合物中的HLA-DR/CII肽复合体，所述复合体包含CII肽的不同翻译后修饰，特别是CII肽的第一和任选的第二赖氨酸残基和未修饰的CII肽。异质混合物可包含HLA-DR/CII肽复合体，该复合体在第一赖氨酸处包含K、Hyl、G-Hyl或GG-Hyl，并且在任选的第二赖氨酸处独立地包含K、Hyl、G-Hyl或GG-Hyl(其中K＝赖氨酸，Hyl＝羟赖氨酸，G-Hyl＝半乳糖基-羟赖氨酸，GG-Hyl＝葡萄糖基半乳糖基-羟赖氨酸)。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物包含：包含CII肽的HLA-DR/CII肽复合体，其中CII肽的第一赖氨酸残基是半乳糖-羟赖氨酸；并且还包含：包含CII肽的HLA-DR/CII肽复合体，其中CII肽的第一赖氨酸残基是未修饰的羟赖氨酸(Hyl)或葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)，优选未修饰的或羟赖氨酸(Hyl)，并且CII肽的任选的第二赖氨酸残基独立的是未修饰的羟赖氨酸(Hyl)、半乳糖基-羟赖氨酸(G-Hyl)或葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)，优选未修饰的羟赖氨酸(Hyl)、半乳糖基-羟赖氨酸(G-Hyl)。在一个实施方案中，组合物不包含葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)修饰的HLA-DR/CII肽复合体，即包含O-糖基化的CII肽的HLA-DR/CII肽复合体，其中第一和/或任选的第二赖氨酸残基是葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸。
在根据本发明的用途的包含在HLA-DR/CII肽复合体的异质混合物中的HLA-DR/CII肽复合体的组合物，所述组合物优选包含这样的HLA-DR/CII肽复合体，其在所述混合物或组合物中总HLA-DR/CII肽复合体的CII肽的第一赖氨酸(K264)处包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的G-Hyl。此外，所述组合物包含这样的HLA-DR/CII肽复合体，其在所述混合物或组合物的总HLA-DR/CII肽复合体中包含不超过90％、不超过80％、不超过70％、不超过60％或不超过50％的未修饰CII肽。在某些实施方案中，组合物包含这样的HLA-DR/CII肽复合体，其在所述混合物或组合物的总HLA-DR/CII肽复合体的CII肽中包含优选小于20％、小于10％、小于5％并且更优选地小于1％的GG-Hyl。其中百分比是指HLA-DR/CII肽复合体中CII肽占HLA-DR/CII肽复合体中总CII肽的百分比。在一个特别优选的实施方案中，所述第二赖氨酸残基(K270)被突变，例如突变为精氨酸(K270R)。在进一步的实施方案中，(任选的)第二赖氨酸没有在翻译后修饰为葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)，并且作为未修饰的赖氨酸、羟赖氨酸或半乳糖基-羟赖氨酸存在。
本领域技术人员会理解，根据本发明的用途的组合物可备选地包含在HLA-DR/CII肽复合体的均质混合物中的HLA-DR/CII肽复合体，所述HLA-DR/CII肽复合体包含未修饰的CII肽或相同的翻译后修饰CII肽的，特别是CII肽的第一赖氨酸残基。均质混合物可包含这样的HLA-DR/CII肽复合体，其在CII肽的第一赖氨酸处包含K、Hyl、G-Hyl或GG-Hyl(其中K＝赖氨酸，Hyl＝羟赖氨酸，G-Hyl＝半乳糖基-羟赖氨酸，GG-Hyl＝葡萄糖基半乳糖基-羟赖氨酸)。优选地，HLA-DR/CII肽复合体在CII肽的第二赖氨酸(如果存在)处不包含修饰或至少不包含GG-Hyl。HLA-DR/CII肽复合体的均质混合物，可以通过将合成制备的未修饰或翻译后修饰的CII肽加载到HLA-DR蛋白上来实现。或者，HLA-DR/CII肽复合体可以使用能够翻译后修饰胶原蛋白中赖氨酸残基的宿主生产细胞系产生，并使用亲和层析纯化相应的HLA-DR/CII肽复合体，采用以对翻译后修饰敏感的方式识别该复合体的抗体，或采用对所述HLA-DR/CII复合体具有特异性的TCR(或其片段)作为亲和配体。
在另一方面，本发明提供了通过本文公开的方法获得或可获得的重组HLA-DR/CII肽复合体，用于治疗人类患者的慢性炎性疾病，其中产生HLA-DR/CII肽复合体的方法包括，用以下物质转染哺乳动物细胞：(i)编码这样的多肽的多核苷酸，该多肽含有包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；(ii)编码这样的多肽的多核苷酸，该多肽含有包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；以及(iii)编码通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端融合的胶原蛋白II肽(CII肽)的多核苷酸，其中CII肽包含选自下组的氨基酸序列：AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG和AGFKXEQGPXG，并且其中所述HLA-DR/CII肽复合体在含有HLA-DRα链和/或HLA-DRβ链的多肽的C-末端包含软骨素结合肽；(b)在适合产生HLA-DR/CII肽复合体的条件下培养哺乳动物细胞，以及(c)收获细胞上清液和任选的包含HLA-DR/CII肽复合体的细胞，所述HLA-DR/CII肽复合体包含未修饰的和/或翻译后的修饰的CII肽。在翻译后修饰的CII肽中，至少CII肽的第一赖氨酸残基可以是羟赖氨酸(Hyl)或O-糖基化Hyl。优选地，至少第一赖氨酸残基是羟赖氨酸或半乳糖基-羟赖氨酸，更优选半乳糖基-羟赖氨酸。特别包括的是包含翻译后修饰的CII肽的所述重组HLA-DR/CII肽复合体，其中CII肽的第一赖氨酸残基是羟赖氨酸(Hyl)或O-糖基化Hyl。因此，在一个实施方案中，包含O-糖基化CII肽的重组HLA-DR/CII肽复合体通过本文所述的方法获得。
在某些实施方案中，CII肽包含AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX1G、AGFKGEX2GPKG、AGFKGX3QGPKG、AGFKX4EQGPKG、AGFKGEX2GPX1G、AGFKGX3QGPX1G和AGFKX4EQGPX1G的氨基酸序列，其中X1是除K之外的任何蛋白质氨基酸，优选R、A、G或Q，更优选R；X2是除Q之外的任何蛋白质氨基酸，优选A、R、H或G；X3是除E外的任何蛋白质氨基酸，优选A、D、Q或G；以及X4是除G之外的任何蛋白氨基酸，更优选A、S、V或L。优选X2、X3或X4不是K。在某些实施方案中，CII肽包含氨基酸序列为AGFKGEQGPKG或AGFKGEQGPX1G，优选AGFKGEQGPKGEP或AGFKGEQGPX1GEP，更优选GIAGFKGEQGPKGEP或GIAGFKGEQGPX1GEP。
在又一方面，本发明提供包含重组HLA-DR/CII肽复合体的组合物，所述重组HLA-DR/CII肽复合体包含通过本文所述方法获得的CII肽。
根据本发明的用途的组合物是药物组合物。因此，本发明还公开了包含这样的组合物的药物组合物，该组合物包含如本文所述的重组HLA-DR/CII肽复合体和药学上可接受的赋形剂。所述组合物或药物组合物可以通过任何施用途径施用，优选皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)。在一个实施方案中，组合物或药物组合物使用皮下植入的渗透泵施用。根据本发明用途的包含重组HLA-DR/CII肽复合体的组合物或药物组合物，可以是冻干的或在水溶液中。药学上可接受的赋形剂可包括载体以及稳定剂。
根据本发明的用途的组合物用于治疗慢性炎性疾病，特别是关节炎或其他慢性炎性关节病。优选地，该组合物是进一步包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物用于治疗选自下组的慢性炎性疾病：类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、非放射学中轴型脊柱关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎、复发性多软骨炎、系统性红斑狼疮、莱姆病、梅尼埃病、自身免疫性内耳病(AIED)或斯蒂尔病。在一个实施方案中，根据本发明的用途的组合物用于治疗选自下组的关节炎类型：类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎或斯蒂尔病，优选类风湿性关节炎、骨关节炎或银屑病关节炎，更优选类风湿性关节炎。在特定实施方案中，根据本发明的组合物用于类风湿性关节炎的一线治疗，用于治疗对甲氨蝶呤和/或常规合成(小分子)改善疾病抗风湿药(DMARD)响应不充分的受试者，用于治疗对生物DMARD(例如，抗-TNF、抗-CTLA4(阿巴西普)、抗-IL-6、抗-CD20(利妥昔单抗)抗体)响应不充分的受试者，用于治疗对靶向的合成DMARD(例如JAK抑制剂)响应不充分的受试者。在备选的实施方案中，本发明的组合物用于处于患类风湿性关节炎的高风险中的患者的预防性治疗，如具有新出现的肌肉骨骼症状的抗ccp抗体阳性吸烟者。
优选地，所述组合物皮下或静脉内施用，更优选皮下施用。组合物可以约10μg至约250μg，优选20至200μg，更优选50μg至100μg的单剂量施用。在一个实施方案中，治疗包括加载和维持阶段。加载阶段可包括连续天数的3-10次，优选6次连续施用。维持剂量可以每周或每3-14天施用，优选每周、每两周、每月、每两个月或甚至更大的间隔。
产生重组HLA-DR/CII肽复合体的方法
根据本发明的用途的HLA-DR/CII肽复合体，可以在体内(即，在哺乳动物细胞系内)制备，其中CII肽融合至β链或α链的细胞外部分的N-末端；或者备选地，其中替代肽融合至β链或α链的细胞外部分的N-末端，随后切割替代肽并加载CII肽。如果在哺乳动物细胞中CII肽与HLA-DR蛋白一起表达，则取决于用于生产的哺乳动物细胞，CII肽可以是翻译后修饰的或未修饰的。如果将CII肽加载到HLA-DR蛋白上，则CII肽在体外合成或酶促制备，并且可以作为未修饰和/或翻译后修饰的CII肽加载到复合体上。
更具体地，根据本发明的用途的HLA-DR/CII肽复合体，可以通过产生包含CII肽的HLA-DR/CII肽复合体的方法来制备，包括用以下物质转染哺乳动物细胞：(i)编码这样的多肽的多核苷酸，该多肽含有包含至少α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；(ii)编码这样的多肽的多核苷酸，该多肽含有包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区，包含II类相关的不变链肽(CLIP)作为替代肽融合至β链或α链(优选β链)的细胞外部分的N-末端，通过包含蛋白酶切割位点(例如，凝血酶切割位点)的接头肽；其中HLA-DR蛋白在包含HLA-DRα链和/或HLA-DRβ链的多肽的C-末端包含软骨素结合肽；(b)在适合产生HLA-DR蛋白的条件下培养哺乳动物细胞；(c)收获细胞上清液和任选的包含HLA-DR蛋白的细胞；(d)使用识别所述蛋白酶切割位点的蛋白酶(例如凝血酶)切割掉CLIP；并且用未修饰和/或翻译后修饰的CII肽加载HLA-DR蛋白以形成HLA-DR/CII肽复合体，其中CII肽包含选自下组的氨基酸序列：AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG和AGFKXEQGPXG。在翻译后修饰的CII肽中，至少CII肽的第一赖氨酸残基可以是羟赖氨酸(Hyl)和/或O-糖基化Hyl。优选地，翻译后修饰的CII肽中至少第一赖氨酸残基是羟赖氨酸和/或半乳糖基-羟赖氨酸，更优选半乳糖基-羟赖氨酸。因此，在生产之后，所述肽被蛋白水解切割掉，并且合成制备的半乳糖基化肽(即，在位置K264处携带gal-Hyl的CII肽)和/或未修饰的CII肽在体外被加载到复合体上。虽然这种合成的半乳糖基化肽和/或未修饰的肽可以与HLA-DR蛋白共价连接，但这种连接不是通过接头肽。
或者，根据本发明的用途的组合物可以通过产生包含CII肽的HLA-DR/CII肽复合体的方法来制备，所述方法包括用以下物质转染哺乳动物细胞：(i)编码这样的多肽的多核苷酸，该多肽含有包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；(ii)编码这样的多肽的多核苷酸，该多肽含有包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；以及(iii)编码通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端融合的胶原蛋白II肽(CII肽)的多核苷酸，其中CII肽包含选自下组的氨基酸序列：AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG和AGFKXEQGPXG，并且其中所述HLA-DR/CII肽复合体在含有HLA-DRα链和/或HLA-DRβ链的多肽的C-末端包含软骨素结合肽；(b)在适合产生HLA-DR/CII肽复合体的条件下培养哺乳动物细胞，以及(c)收获细胞上清液和任选的包含HLA-DR/CII肽复合体的细胞，所述HLA-DR/CII肽复合体包含未修饰的和/或翻译后的修饰的CII肽。在翻译后修饰的CII肽中，至少CII肽的第一赖氨酸残基可以是羟赖氨酸(Hyl)或O-糖基化Hyl。优选地，至少第一赖氨酸残基是羟赖氨酸或半乳糖基-羟赖氨酸，更优选半乳糖基-羟赖氨酸。
所述方法还可包括分析HLA-DR/CII肽复合体的CII肽的糖基化特征的步骤。用于分析糖基化特征的方法是本领域公知的，并且包括诸如质谱法的方法。产生HLA-DR/CII肽复合体的方法是体外方法，在这种意义上，HLA-DR/CII肽复合体是在细胞培养皿或发酵罐中的细胞系中产生的。此外，所述方法包括使用哺乳动物细胞系，而不是原代细胞。
在某些实施方案中，CII肽包含AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX1G、AGFKGEX2GPKG、AGFKGX3QGPKG、AGFKX4EQGPKG、AGFKGEX2GPX1G、AGFKGX3QGPX1G和AGFKX4EQGPX1G的氨基酸序列，其中X1是除K之外的任何蛋白质氨基酸，优选R、A、G或Q，更优选R；X2是除Q之外的任何蛋白质氨基酸，优选A、R、H或G；X3是除E外的任何蛋白质氨基酸，优选A、D、Q或G；以及X4是除G之外的任何蛋白氨基酸，更优选A、S、V或L。优选X2、X3或X4不是K。在某些实施方案中，CII肽包含氨基酸序列为AGFKGEQGPKG或AGFKGEQGPX1G，优选AGFKGEQGPKGEP或AGFKGEQGPX1GEP，更优选GIAGFKGEQGPKGEP或GIAGFKGEQGPX1GEP。
优选地，至少α1结构域来自DRA*0101，并且至少β1结构域来自选自下组的HLA-DR等位基因：DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001、DRB1*1402和DRB1*1303，优选DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001和DRB1*1402，更优选DRB1*0401、DRB1*0404和DRB1*0405，甚至更优选DRB1*0401。更优选α1结构域和α2结构域来自DRA*0101(α1和2结构域：SEQ ID NO:16的氨基酸19-200)，并且β1结构域和β2结构域来自选自下组的HLA-DR等位基因：DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001、DRB1*1402和DRB1*1303,优选DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001和DRB1*1402，更优选DRB1*0401、DRB1*0404和DRB1*0405，甚至更优选DRB1*0401(β1和2结构域：SEQ ID NO:17的氨基酸60-250)。
实施例中使用的特定HLA-DR/CII肽复合体，缩写如下：DR4/hCII(天然糖基化的，人的)、DR4/nCII(裸露的或未修饰的，人的)、DR4/galCII(半乳糖基化的(在K264的Gal-Hyl)，人的)，其中所用的CII肽具有氨基酸序列GIAGFKGEQGPKGEP(SEQ ID NO:13)。实施例中使用的各个小鼠MHC II/CII复合体，缩写如下：Aq/rCII(天然糖基化的，大鼠CII)、Aq/nCII(裸露或未修饰的，大鼠CII)、Aq/galCII(半乳糖基化(在K264的Gal-Hyl)，大鼠的)，其中所用的大鼠CII肽具有氨基酸序列GIAGFKGEQGPKGET(SEQ ID NO:29)，
胶原蛋白II肽(CII肽)可以通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端，优选融合至HLA-DRβ链的N-末端。术语“接头肽”是指由多个氨基酸残基组成的多肽。接头肽可以是任何肽，只要它足够长并且足够灵活以允许该肽结合到由HLA-DR复合体形成的肽结合口袋。合适接头的一个实例是Gly-Ser接头。CII肽、肽接头以及HLA-DRα链和HLA-DR链的胞外区中的至少一个，可以表达为一种多肽并由一种多核苷酸编码。在此背景下，术语“融合至”是指“连接至”，其中连接是通过肽键，任选地使用接头肽，因此生成融合蛋白。
HLA-DR/CII肽复合体含有至少一种软骨素结合肽，优选软骨素-和透明质酸(也称为玻尿酸)结合肽。优选地，软骨素结合肽位于复合体的至少一个多肽链的C-末端。在一个实施方案中，HLA-DR/CII肽复合体包含至少一个C-末端软骨素结合肽。软骨素结合肽是本领域已知的，并且包括但不限于具有以下氨基酸序列的肽：EKRIWFPYRRF(SEQ ID NO:31)、YKTNFRRYYRF(SEQ ID NO:32)或VLIRHFRKRYY(SEQ ID NO:33)(Butterfield KC et al.,Biochemistry.2010Feb 23；49(7):1549-55)。本文还鉴定了带正电荷的组蛋白肽，特别是人H2A组蛋白的肽，如包含序列SGRGKQGGKARAKAKTRSSR(SEQ ID NO:34)的肽。在一个实施方案中，软骨素结合肽包含5-20个氨基酸，优选6-20个氨基酸，更优选6-12个氨基酸。优选地，软骨素结合肽包含5个或更多个，优选6个或更多个，更优选7个或更多个带正电荷的氨基酸。此外或独立地，软骨素结合肽包含至少两个连续的带正电荷的氨基酸，优选至少3个连续的带正电荷的氨基酸。此外，更碱性的氨基酸，如赖氨酸(pK为10.5)和精氨酸(pK为12.5)，似乎改善软骨素结合作用组氨酸(pK为6.0)，特别是对于交替带正电荷的氨基酸。然而，应注意避免通过包含非常碱性的肽来改变蛋白的生化特性。在一个实施方案中，软骨素结合肽是聚组氨酸标签，优选具有至少6个连续组氨酸残基(至少六组氨酸标签)，更优选具有至少7个连续组氨酸残基(至少七组氨酸标签)。
术语软骨素和硫酸软骨素在本文中可互换使用，因此软骨素结合肽也可称为硫酸软骨素结合肽。为了增加与透明质酸的结合，包含结合共有基序的示例性序列定义如下：B(X7)B，其中B是R或K，X7不包含酸性残基和至少一个碱性氨基酸(Yang B et al.,EMBOJ.1994Jan 15；13(2):286-96)。如本文所公开的，HLA-DR/CII肽复合体还可以通过His-标签结合硫酸软骨素。因此，软骨素结合肽可以是聚组氨酸标签，或增加对软骨素的结合亲和力的任何其他氨基酸序列，如EKRIWFPYRRF(SEQ ID NO:31)、YKTNFRRYYRF(SEQ ID NO:32)、VLIRHFRKRYY(SEQ ID NO:33)或SGRGKQGGKARAKAKTRSSR(SEQ ID NO:34)。聚组氨酸标签可以是六组氨酸标签(6xHis，HHHHHH；SEQ ID NO:41)，更优选七组氨酸标签(7xHis；HHHHHHH；SEQ ID NO:42)，包含至少7个连续组氨酸的组氨酸标签，或包含至少6个组氨酸的修饰的组氨酸标签，如包含交替的组氨酸和谷氨酰胺的HQ标签、包含交替的组氨酸和天冬酰胺的HN标签，或包含氨基酸序列KDHLIHNVHKEEHAHAHNK(SEQ ID NO:36)的HAT标签。在HLA-DR/CII肽复合体包含异源二聚化结构域的情况下，软骨素结合肽是异源二聚化结构域的C-末端。软骨素和透明质酸都是软骨的重要成分。
如本文所用，转染是指使用本领域已知的转染方法将DNA引入哺乳动物细胞。如本文所用，术语“转染(transfection/transfecting)”包括“转导(transduction/transducing)”，其通常用于描述病毒介导的基因转移到真核细胞中。多核苷酸可以是DNA或RNA，优选DNA。转染可以是瞬时转染或稳定转染。优选地，多核苷酸存在于载体，优选表达载体中。
稳定整合的方法是本领域公知的。简而言之，稳定整合通常通过将至少一种重组多核苷酸或含有该至少一种重组多核苷酸的载体瞬时引入哺乳动物宿主细胞来实现，这有利于所述重组多核苷酸稳定整合到哺乳动物细胞基因组中。一般地重组多核苷酸的侧翼是同源臂，即与整合位点上游和下游区域同源的序列。将重组多核苷酸引入哺乳动物细胞的载体，可以选自多种合适的载体系统，如质粒、逆转录病毒、粘粒、EBV衍生的附加体等。可以使用多种穿梭载体，例如可以在多种宿主微生物如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)中自主复制的载体。在将它们引入哺乳动物宿主细胞之前，可以将环状载体线性化以促进整合到哺乳动物细胞基因组中。将载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域公知的，包括用生物方法转染，如病毒递送；用化学方法，如使用阳离子聚合物、磷酸钙、阳离子脂质或阳离子氨基酸；用物理方法，如电穿孔或显微注射。
稳定整合到哺乳动物细胞基因组中的重组多核苷酸，可以是表达盒的一部分。表达盒包含至少一种编码基因产物如RNA和/或蛋白质的异源多核苷酸，其可操作地连接至启动子和任选地进一步控制基因产物表达的工具(means)。此类工具包括但不限于：增强子、终止信号、多聚腺苷酸化信号和3'非翻译区，通常包含多聚腺苷酸化位点。启动子可以是弱启动子，也可以是支持目标基因产物高水平表达的强启动子。所述启动子包括但不限于：CMV(巨细胞病毒)启动子、SV40(猿猴空泡病毒40)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒(RousSarcoma Virus))启动子、腺病毒启动子(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)、CHEF-1(CHO衍生的延伸因子-1)启动子、多瘤和强哺乳动物启动子，如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子或至少一种异源多核苷酸的天然启动子。优选地，启动子是CMV启动子或SV40启动子，最优选CMV启动子。聚腺苷酸化信号的实例是：BGH polyA、SV40晚期或早期polyA；或者，可以使用免疫球蛋白基因等的3'UTR。技术人员会进一步理解，3'非翻译区可被工程化以支持高水平表达，例如，通过去除不稳定性元件，如ARE(富含腺苷酸-尿苷酸的元件)。
基因产物可以进一步置于可扩增的遗传选择标记物如二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)的控制之下。可扩增的选择标记物基因，可以与分泌的治疗性蛋白表达盒位于同一表达载体上。或者，可扩增的选择标记物基因和分泌的治疗性蛋白表达盒可以位于不同的表达载体上，但紧密地整合到宿主细胞的基因组中。例如，同时共转染的两个或多个载体通常紧密地整合到宿主细胞的基因组中。然后通过将扩增剂(例如，用于DHFR的MTX，或用于GS的MSX)添加到培养基中，来介导包含分泌的治疗性蛋白表达盒的遗传区域的扩增。
例如，通过将异源多核苷酸的多个拷贝克隆到表达载体中，可以实现在宿主细胞或生产细胞中基因产物的足够高的稳定水平。如上所述，将重组多核苷酸的多个拷贝克隆到表达载体中，以及扩增分泌的治疗性蛋白表达盒(编码HLA-DR/CII肽复合体)可以进一步组合。
编码包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区的多核苷酸可以存在于一个载体(第一多核苷酸)中，而编码包含至少一个β1域的HLA-DR链的胞外区的多核苷酸(第二个多核苷酸)可以存在于另一个载体中，其中软骨素结合肽进一步由第一或第二个多核苷酸编码，以在包含HLA-DRα链和/或HLA-DRβ链的多肽的C-末端提供软骨素结合肽。或者，第一和第二多核苷酸可以是同一载体上不同表达盒的一部分。第一和第二多核苷酸也可以形成编码单一融合多肽的单一多核苷酸，该融合多肽含有：包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；以及任选地还有通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链(优选融合至HLA-DRβ链)的N-末端的胶原蛋白II肽(CII肽)，其中HLA-DR/CII肽复合体在融合多肽(单链异源二聚体)的多肽C-末端包含软骨素结合肽。
或者，在HLA-DR蛋白表达为两个多肽的情况下，HLA-DRα链在其C-末端(C端)融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第一功能域和HLA-DRβ链在其C-末端融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第二互补功能域。第一功能域和第二互补功能域可以是酸性和碱性亮氨酸拉链异二聚化结构域，优选jun-fos亮氨酸拉链基序。第一和/或第二多核苷酸在亮氨酸拉链异二聚化基序的功能结构域的C-末端进一步编码软骨素结合肽，如聚组氨酸标签。
在适合产生HLA-DR/CII肽复合体的条件下，培养哺乳动物细胞，收集细胞上清液和/或细胞，其中细胞上清液和/或细胞含有包含未修饰的和/或翻译后修饰的CII肽的HLA-DR/CII肽复合体。在翻译后修饰的CII肽中，CII肽的第一赖氨酸残基可以是羟赖氨酸(Hyl)或O-糖基化羟赖氨酸，优选地第一赖氨酸残基是羟赖氨酸或半乳糖基-羟赖氨酸，更优选半乳糖基-羟赖氨酸。所述方法还可包括分析HLA-DR/CII肽复合体的CII肽的糖基化特征的步骤。用于分析糖基化特征的方法是本领域公知的，并且包括诸如质谱法的方法。
原则上，适用于高产率蛋白生产的任何哺乳动物细胞，均可用于生产HLA-DR/CII肽复合体，包括HEK293细胞和CHO细胞。在CII肽通过接头肽融合至HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端，并且CII肽将被翻译后修饰的情况下，哺乳动物细胞系是合适的，只要它包含对胶原蛋白中赖氨酸残基进行翻译后修饰的酶，包括将赖氨酸羟基化为羟赖氨酸(Hyl)，以及将Hyl半乳糖基化为半乳糖基羟赖氨酸(Gal-Hyl)。如本文在赖氨酸的背景下使用的术语“半乳糖基化”，包括在半乳糖基化之前已被羟基化为羟赖氨酸的赖氨酸。酶可以内源地存在于细胞中，或可以在细胞中重组表达。优选地，哺乳动物细胞包含赖氨酰羟化酶(EC1.14.11.4)和胶原半乳糖基转移酶(EC2.4.1.50)，优选赖氨酰羟化酶1(LH1)和/或赖氨酰羟化酶2(LH2)和胶原半乳糖基转移酶GLT25D1和/或GLT2D2，优选GLT25D1。这些酶在翻译后修饰胶原蛋白。因此，这些酶可能存在于产生胶原蛋白的细胞系，如肾细胞、成纤维细胞或破骨细胞，特别是肾细胞如HEK293细胞或其衍生物。HEK293细胞可以作为贴壁细胞生长或悬浮生长。适用于本发明方法的HEK293细胞的一个实例是HEK293细胞或HEK293F细胞，如Expi293F细胞(Gibco，货号A14527，也可作为cGMP库货号100044202得到)。其他合适的HEK293细胞，包括HEK293T细胞和/或其悬浮细胞。令人惊讶的是，由MHC II蛋白呈递的小肽也可以在这些细胞中进行翻译后修饰。尽管肽源自胶原蛋白，但它们存在于MHC II复合体中完全不同(非自然)的环境中。在这方面，我们注意到天然MHC II蛋白装载了来自细胞外(翻译后修饰)蛋白的肽，这些蛋白在APC中被消化。因此，修饰已经存在于被内吞的蛋白上，并且没有在细胞内添加。此外，令人惊讶的是，原位糖基化时产生的异质产物适用于治疗。合适的细胞可以很容易地筛选出胶原蛋白中赖氨酸残基的翻译后修饰所需的酶，如通过使用合适的抗体的蛋白质印迹或通过RNA表达筛选，或通过它们糖基化II型胶原蛋白或HLA-DR/CII肽复合体的能力进行功能性筛选。检测基因或蛋白表达或酶活性和糖基化特性的方法是本领域公知的。合适的哺乳动物细胞的实例是肾细胞、成纤维细胞或成骨细胞，优选HEK293细胞或细胞系。先前已描述HEK293细胞表达赖氨酰羟化酶PLOD1和PLOD2(分别编码LH1和LH2)、半乳糖基转移酶GLT25D1和GLT25D2，以及另外的PLOD3(编码LH3)。
通常用于蛋白生产的CHO细胞已经过测试，并且不能在赖氨酸残基处充分添加翻译后修饰以得到本文所述的胶原蛋白或HLA-DR/CII肽复合体中的半乳糖基羟赖氨酸(Gal-Hyl)。然而，哺乳动物细胞也可以是基因工程化以表达赖氨酰羟化酶和胶原半乳糖基转移酶的细胞。优选地，哺乳动物细胞经基因工程改造以重组表达赖氨酰羟化酶1(LH1)和/或赖氨酰羟化酶2(LH2)和胶原半乳糖基转移酶GLT25D1和/或GLT25D2，优选GLT25D1。GLT25D2仅在少数细胞类型中表达，因此不太可能负责正常的胶原蛋白修饰。任何哺乳动物细胞可经基因工程改造以重组表达赖氨酰羟化酶和胶原半乳糖基转移酶，优选赖氨酰羟化酶1(LH1)和/或赖氨酰羟化酶2(LH2)和胶原半乳糖基转移酶GLT25D1和/或GLT25D2。优选地，所述基因工程改造的哺乳动物细胞是CHO细胞，更优选CHO-DG44细胞、CHO-K1细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-S细胞、CHO谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷细胞或任何这些细胞的衍生物。
本领域技术人员会理解，在哺乳动物细胞中产生的能够翻译后修饰胶原中赖氨酸残基的HLA-DR/CII肽复合体，即包含翻译后修饰胶原中赖氨酸残基的酶，是包含CII肽的不同翻译后修饰的HLA-DR/CII肽复合体的异质混合物，特别是在CII肽的第一和任选的第二赖氨酸残基处。异质混合物包含HLA-DR/CII肽复合体，其在第一赖氨酸处包含K、Hyl、G-Hyl或GG-Hyl，并且在任选的第二赖氨酸处独立地包含K、Hyl、G-Hyl或GG-Hyl(其中K＝赖氨酸，Hyl＝羟赖氨酸，G-Hyl＝半乳糖基羟赖氨酸，GG-Hyl＝葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸)。
因此，收获的细胞上清液和任选地收获的细胞含有包含CII肽的HLA-DR/CII肽复合体，其中CII肽的第一赖氨酸残基是Hyl或gal-Hyl，并且进一步含有包含CII肽的HLA-DR/CII肽复合体，其中CII肽的第一赖氨酸残基是未修饰的或葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)，优选未修饰的，并且CII肽的任选的第二赖氨酸残基独立地是未修饰的羟赖氨酸(Hyl)、半乳糖基-羟赖氨酸(G-Hyl)或葡萄糖基半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)，优选未修饰的、羟赖氨酸(Hyl)或半乳糖基-羟赖氨酸(G-Hyl)。优选地，收获的细胞上清液和任选收获的细胞不包含HLA-DR/CII肽复合体，其中第二赖氨酸残基是葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸。更优选地，收获的细胞上清液和任选地收获的细胞不包含葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)修饰的HLA-DR/CII肽复合体，即包含O-糖基化CII肽的HLA-DR/CII肽复合体，其中第一和/或任选的第二赖氨酸残基是葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸。HLA-DR/CII肽复合体的混合物，也可以通过将未修饰和翻译后修饰的CII肽加载到HLA-DR蛋白上来实现。本领域技术人员会理解可以实现不同的比率。
HLA-DR/CII肽复合体的异质混合物(通过CII肽加载或CII肽表达为与HLA-DR蛋白的融合蛋白制备)，在该混合物或组合物中总HLA-DR/CII肽复合体的CII肽的第一赖氨酸(K264)处包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的G-Hyl。此外，HLA-DR/CII肽复合体的异质混合物，在该混合物或组合物中包含总HLA-DR/CII肽复合体的不超过90％、不超过80％、不超过70％、不超过60％或不超过50％的未修饰CII肽。优选地，HLA-DR/CII肽复合体的异质混合物，在该混合物或组合物中的总HLA-DR/CII肽复合体的CII肽中单独地或另外地包含小于20％、小于10％、小于5％和更优选地小于1％的GG-Hyl。其中百分比是指HLA-DR/CII肽复合体中CII肽占HLA-DR/CII肽复合体中总CII肽的百分比。第二赖氨酸残基(K270)可以被突变，例如突变为精氨酸(K270R)。这避免了在表达为与HLA-DR蛋白的融合蛋白的CII肽的这个位置的翻译后修饰，并避免了对TCR结合的可能干扰。优选地，该(任选的)第二赖氨酸未被翻译后修饰为葡糖基半乳糖基-羟赖氨酸(GG-Hyl)，并且以未修饰的赖氨酸、羟赖氨酸或半乳糖基羟赖氨酸的形式存在，优选未修饰的。
为了减少HLA-DR/CII肽复合体混合物的异质性，以及大量葡糖基半乳糖基羟赖氨酸形成，如果哺乳动物细胞缺乏半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶(EC2.4.1.66)活性则更有利。在一种实施方案中，哺乳动物细胞因此缺乏半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶活性。优选哺乳动物细胞缺乏赖氨酰羟化酶3(LH3)。LH3是一种多功能酶，包括赖氨酰羟化酶(LH)、半乳糖基转移酶(GT)和半乳糖基羟赖氨酰葡萄糖基转移酶(GGT)活性，其中该酶的主要功能似乎是GGT活性。可以使用敲低或敲除方法删除或降低LH3活性。例如，可以使用RNA干扰，如siRNA或shRNA来降低酶表达。
术语“RNA干扰”(RNAi)是指对基因表达(蛋白合成)的序列特异性或基因特异性抑制，而不是对蛋白合成的普遍抑制。RNAi可能涉及通过RNA诱导的沉默复合体(RISC)降解信使RNA(mRNA)，阻止转录的mRNA的翻译。RNAi引起的基因表达抑制可能是短暂的，也可能是更稳定的，甚至是永久性的。RNAi可由miRNA、siRNA或shRNA介导。优选地，根据本发明的RNAi是基因特异性的(仅靶向一种基因)。基因特异性RNAi可由siRNA或shRNA介导。
如本文所用，术语“小干扰”或“短干扰RNA”或“siRNA”是指靶向所需基因并且能够抑制与其共享同源性的基因的表达的核苷酸RNA双链体。它由长双链RNA(dsRNA)或shRNA形成。RNA双链体通常包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸的两条互补单链RNA，它们形成了17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基对并具有两个核苷酸的3'悬垂，优选地，RNA双链体包含两个19-27个核苷酸的互补单链RNA，它们形成17-25个碱基对并具有两个核苷酸的3'悬垂。siRNA“靶向”于基因，其中siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶向的基因的mRNA的核苷酸序列互补。siRNA或其前体总是外源性地引入细胞，例如直接地或通过转染具有编码所述siRNA的序列的载体，并且利用内源性miRNA途径正确加工siRNA并切割或降解靶标mRNA。双链体RNA可以由单个构建体在细胞中表达。
如本文所用，术语“shRNA”(小发夹RNA)是指RNA双链体，其中siRNA的一部分是发夹结构(shRNA)一部分。shRNA可以在细胞内加工成功能性siRNA。除了双链体部分之外，发夹结构可以包含位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以变化。在一些实施方案中，环的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。发夹结构还可包含3'或5'悬垂部分。在一些方面，所述悬垂是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3'或5'悬垂。在本发明的一个方面，包含在载体中的核苷酸序列用作小发夹RNA表达的模板，包括有义区、环区和反义区。表达后有义和反义区形成双链体。shRNA总是外源性地引入的，例如通过转染具有编码所述shRNA的序列的载体，并且利用内源性miRNA途径来正确加工siRNA并切割或降解靶标mRNA。相比使用化学合成的siRNA，使用具有编码shRNA的序列的载体具有的优势在于，靶基因的抑制通常是长期和稳定的。
通常，siRNA和shRNA通过完整的序列互补性(即小干扰RNA的RNA双链体的反义链与靶标mRNA之间的完美碱基配对)介导mRNA抑制，因此对它们的靶标具有特异性。RNA双链体的反义链也可称为RNA双链体的活性链。如本文所用，完美碱基配对的完整序列互补是指，小干扰RNA的RNA双链体的反义链，与至少15个连续核苷酸、至少16个连续核苷酸、至少17个连续核苷酸、至少18个连续核苷酸以及优选至少19个连续核苷酸的靶标mRNA具有至少89％的序列同一性；或优选与至少15个连续核苷酸、至少16个连续核苷酸、至少17个连续核苷酸、至少18个连续核苷酸以及优选至少19个连续核苷酸的靶标mRNA具有至少93％的序列同一性。更优选地，小干扰RNA的RNA双链体的反义链，与至少15个连续核苷酸、至少16个连续核苷酸、至少17个连续核苷酸、至少18个连续核苷酸以及优选地至少19个连续核苷酸的靶标mRNA具有100％的序列同一性。
或者，不表达酶或基因可突变或缺失。因此，哺乳动物细胞缺乏半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶活性。在某些实施方案中，哺乳动物细胞缺乏多功能酶LH3。例如，基因可能被沉默或没有充分表达。在其他某些实施方案中，哺乳动物细胞包含缺乏半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶活性的突变LH3酶。
哺乳动物细胞也可经基因工程改造以具有降低的或没有半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶活性。编码LH3的PLOD3基因可发生突变或缺失；和/或LH3酶可以是缺乏半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶活性的突变LH3酶。删除或突变基因的方法是本领域公知的，并且可以包括使用序列特异性DNA编辑酶。如本文所用，“序列特异性DNA编辑酶”或“位点特异性核酸酶”是能够在确定的核苷酸序列(识别位点)处切割DNA的蛋白。所述切割可以发生在两条互补DNΑ链中的一条或两条上，因此允许例如靶向的诱变、特定基因组DNA序列的靶向的缺失，或导致切割的靶DNA与异源多核苷酸的定点重组。所述编辑酶的序列特异性，可由该编辑酶内的一个或多个序列特异性DNA结合蛋白结构域产生，或由酶结合引导多核苷酸(例如引导RNA)产生，该引导多核苷酸(例如引导RNA)将其引导至与所述引导多核苷酸具有至少部分互补性的DNA序列。因此，所述编辑酶的识别位点可以通过工程改造DNA结合蛋白结构域或使用替代性引导多核苷酸来改变。多种序列特异性DNA编辑酶是本领域已知的，其非限制性实例是锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶。
优选地，缺乏半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶活性的基因工程改造的哺乳动物细胞是HEK293细胞或细胞系。可从减少半乳糖基羟赖氨酰葡糖基转移酶以产生HLA-DR/CII复合体中获益的细胞系实例是Expi293F细胞(Gibco,货号A14527，也可作为cGMP库货号100044202获得)。在培养过程中使用胭脂红酸也可以抑制半乳糖基羟赖氨酰葡萄糖基转移酶活性。
哺乳动物细胞优选在无血清条件下和任选在不含任何动物来源的蛋白/肽的培养基中建立、适应和完全培养。市售培养基，如PreproGowTMHEK293培养基(PREPROTECH，USA)、Expi293TM表达培养基(ThermoFisher，USA))、HAM's F12(Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPPMI(Sigma)、杜伯克改良伊格尔培养基(DMEM；Sigma)、最低必需培养基(MEM；Sigma)、伊斯科夫改良杜伯克培养基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、无血清CHO培养基(Sigma)和无蛋白质CHO培养基(Sigma)，是示例性合适的营养液。任何培养基都可以根据需要补充多种化合物，其非限制性实例是重组激素和/或其他重组生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等效能源、抗生素和微量元件。也可以以本领域技术人员已知的合适浓度包括任何其他必要的补充剂。针对表达可选择基因的遗传修饰细胞的生长和选择，将合适的选择剂添加到培养基中。
实施例
测试物质和制剂
Aq/galCII或DR4/galCII(加载合成的Gal-肽：GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP)和Aq/nCII或DR4/nCII(加载未修饰的肽：GIAGFKGEQGPKGEP；SEQ ID NO:13)：Aq-mCLIPmt蛋白，通过瞬时转染在HEK293细胞系(Expi293F细胞，Gibco，货号A14527)或CHO细胞(图4)中表达，使用采用His-标签的固定化金属离子亲和层析(IMAC)并结合尺寸排阻色谱(SEC)进行纯化。然后，共价结合的前肽被凝血酶切割和添加过量的Gal肽或未修饰的肽所替换。最后，进行SEC以去除切割的前肽和过量的Gal肽或未修饰的肽。Gal-肽：GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP)被合成、纯化和表征，其描述于Diogo,D.et al.,Curr Opin Rheumatol.2014；26:85-92；Gregersen PK et al.,Arthritis Rheum.1987；30:1205-1213；Duke O et al.,Clin Exp Immunol.1982；49:22-30。
天然糖基化小鼠Aq/rCII和人DR4/hCII：天然糖基化小鼠Aq/rCII和人DR4/hCII蛋白在HEK293细胞系(Expi293F细胞，Gibco，货号A14527)通过瞬时转染并使用采用His-标签的固定化金属离子亲和层析(IMAC)结合尺寸排阻色谱(SEC)进行纯化。对于体内实验，将MHC II-肽复合体在无菌PBS(Gibco)中稀释至所需浓度，使用DynaGard 0.2pm注射器尖端过滤器过滤，并使用无菌技术将100pi蛋白溶液装入ALZET微渗透泵(DURECT公司，型号1007D,0.5pl/h,7天)。用外科手套处理泵。为确保立即泵送物质，在植入前将预装泵置于PBS中于4℃过夜。
更具体地，编码图1所示复合体两条链的cDNA在Eurofins合成，在5'和3'末端具有KpnI和XhoI限制性位点。使用限制酶KpnI和XhoI(FastDigestTM,ThermoFisherScientific)消化合成的cDNA。在用相同的限制酶消化后，将消化的DNA片段分别克隆到哺乳动物表达载体pCEP4(LifeTechnologies)。序列验证后，将编码复合体两条链的两个重组质粒，用FectoPROTMDNA转染试剂(Polyplus-transfection)共转染到Expi393FTM细胞中。转染后6天收获上清液。首先使用5ml HisTrap Excel(GE Healthcare Life Sciences)亲和柱捕获重组蛋白，然后在Superdex 200pg(GE Healthcare Life Sciences)上进行尺寸排阻色谱。重组蛋白纯化为单峰并浓缩、透析过滤到生物素化缓冲液(20mM Tris-HCl,50mMNaCl,pH8.0)中，使用具有10kDa MWCO的Amicon离心装置。根据制造商的说明(Avidity)，使用生物素-蛋白连接酶进行生物素化，反应在30℃下进行2小时。在Superdex 200pg柱上，通过尺寸排阻色谱去除游离生物素。
动物
雄性QB小鼠(B10.Q×BALB/c，n＝9)F1，12-16周龄，用于实验。B10.Q小鼠的创建者最初由J.Klein(Tubingen,Germany)提供，BALB/c小鼠购自杰克森实验室(The JacksonLaboratory)。所有小鼠都在卡罗林斯卡研究所医学炎症研究(Medical InflammationResearch of Karolinska Institute)的动物设施中饲养和居住。所有使用的动物都喂食标准啮齿动物饲料，并随意饮水。不同的实验组被安置在一起，以最小化实验偏差。当地伦理委员会批准了所有动物实验(Stockholms Norra Djurforsoksetiska Namnd,Stockholm,Sweden)。所有体内关节炎实验均由伦理编号N213/14和N35/16涵盖。动物的麻醉是通过吸入异氟醚完成的，而处死则是用CO2进行的。
关节炎的诱导和临床评价
通过有限的胃蛋白酶消化和进一步纯化，从Swarm软骨肉瘤(Swarm ratchondosarcoma，SRC)制备大鼠II型胶原蛋白(rCII)，其描述于Chavele KM andEhrenstein MR,FEBS Lett.2011；585:3603-10。制备的rCII储存在4℃直至使用。为了诱导胶原诱导性关节炎(CIA)，每只小鼠在尾部基部以100μl的总体积注射100μg在CFA(Difco)中以1:1乳化的rCII。35天后，给小鼠以50μl的总体积加强注射50μg在IFA(Difco)中以1:1乳化的大鼠CII。从免疫后2周开始并持续到实验结束，通过基于每个爪中发炎关节的数量对动物进行视觉评分来跟踪临床关节炎的患病。采用的扩展评分方案描述于Klareskog Let al.,Annu Rev Immunol.2008；26:651-75，每个爪子1-15不等，每只小鼠的最高得分为60。在免疫接种后的90天内，每周检查小鼠2-4次。
治疗方案
在免疫后第7天，将扩散不同量的天然糖基化Aq/rCII(n＝9)或PBS(对照组，n＝9)的ALZET微渗透泵皮下植入QB小鼠中。在手术植入过程中使用了无菌技术。对于皮下放置，在肩胛骨之间的皮肤中做一个小切口，形成一个小袋，将泵插入袋中，流量调节器指向远离切口方向。使用伤口夹闭合皮肤切口。
对临床关节炎的治疗，在小鼠中单个s.c.(皮下)注射100mg几乎与连续7天皮下泵输注15mg/天一样有效。然而，延长治疗似乎对诱导调节性TR1细胞更有效，如通过对治疗小鼠的淋巴结T细胞进行FACS分析所证明的。
DTH
在免疫后第8天，将用大鼠CII/CFA(rCII)预免疫的QB小鼠进行皮内注射溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中10μg的rCII到左耳。作为对照，右耳注射溶剂，24小时后由对该动物处理不知情的研究人员使用卡尺测量耳肿胀。使用rCII免疫后第4天植入的渗透泵，通过24小时应用100μg的Aq/肽复合体进行治疗。组别：Aq/mCLIPmt(n＝6)、Aq/galCII带有His-标签(His,n＝5)和不带His-标签(w/o His,n＝5)。
T细胞杂交瘤测定
MHC II/肽复合体在无菌PBS中稀释，并通过在4℃下孵育过夜包被到板上，或以可溶形式直接添加到T细胞杂交瘤中。然后将MHC II/肽复合体包被的板用无菌PBS洗涤两次以去除未结合的复合体，以及每孔添加在补充有5％FCS、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的200μl DMEM中的5x104个T-杂交瘤细胞。已使用分别对GalOK264和未修饰的CII259-273(K264)具有特异性的T细胞杂交瘤3H8和mDR1.1。24小时后，通过夹心ELISA(BioLegend)测量培养物上清液中的IL-2或IL-10(在一些实验中)。小鼠rIL-2或rI-10分别作为阳性对照和标准。
使用T-杂交瘤细胞在不同条件下在微量滴定孔中进行刺激实验：1)用重组DR4/CII-肽复合体预包被，2)用透明质酸(Sigma Aldrich(#H7630))或硫酸软骨素(SigmaAldrich(#C9819))包被，随后以流体相向其中添加DR4/CII-肽复合体。选择这种设计是为了研究两种成分的潜在相互作用对DR4/CII-肽复合体对T细胞活化的影响，并模拟DR4/CII-肽复合体与在组织的细胞外基质(ECM)和引流淋巴系统中生理表达的结缔组织成分的相互作用，或3)具有封闭表面，其中添加溶质ECM成分透明质酸、硫酸软骨素或硫酸肝素以及DR4/CII-肽复合体，以研究它们对T-杂交瘤细胞的影响，作为用于调节患病组织区室体液(例如关节积液或淋巴液)中T细胞功能的模型。
通过MHC II四聚体染色检测抗原特异性T细胞
通过将PE-标记的链霉亲和素和APC-标记的链霉亲和素(Biolegend)以1:4的摩尔比添加到重组蛋白中，并在+4℃孵育1小时来新鲜制备MHC II/肽四聚体复合体。为了鉴定肽特异性T淋巴细胞，在50nM达沙替尼(小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂)存在下，将细胞与DR4/肽四聚体复合体(20μg/ml)在+37℃下孵育1小时，然后将细胞表面标记物染色。恰好在采集前加入活力染色溶液(Zombie NIR；Biolegend)以从分析中排除死细胞。通过使用FacsDiVa软件(BDBiosciences)的LSRFortessa流式细胞仪采集样品，并使用FlowJo软件(v10,FlowJo LLC)分析数据。
CII肽刺激后人T细胞的活化
在TexMACS(Biolegend)中将PBMC以1.5x106个细胞/孔解冻并静置过夜。用浓度为50μg/ml的相应肽变体(GIAGFKGEQGPKGEP(SEQ ID NO:13)和GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP)与1μg/ml的抗-CD28(BioLegend)一起刺激细胞7小时。为了阳性对照和确定CD154测定灵敏度，将葡萄球菌肠毒素B(SEB)以1μg/ml(Sigma-Aldrich)添加到单独的培养物中。刺激后，细胞用LIVE/DEAD鉴别标记物(BioLegend)处理，然后染色以检测CD3和CD4的表面表达、阳性门控和CD19以排除B细胞。背景水平由未刺激的细胞(用抗-CD28处理)确定，并进一步从CII刺激的培养物中减去。通过使用FacsDiVa软件(BDBiosciences)的LSRFortessa流式细胞仪采集样品，并使用FlowJo软件(v10,FlowJo LLC)分析数据。
来自HLA-DRB1*0401阳性RA患者外周血的T细胞的体外刺激/分化
进行体外测定以分析调节性T细胞功能的诱导/分化，例如在DR4/CII单体刺激数天的延长潜伏期后，Tr1表型相关的细胞因子IL-10的上调。因此，通过密度梯度离心分离PBMC，并在TexMACS(MiltenyiBiotec,Cat#130-097-196)中将1.2x106个细胞/ml的细胞用1μg/mL抗-CD3(Biolegend，Cat#317304)和100ng/mL IL-27(Peprotech，Cat#200-38B)(阳性对照，Tr1)、3.6μg/mL DR4/nCII、3.6μg/mL DR4/galCII、3.6μg/mL DR4/hCII刺激或不刺激(阴性对照，w/o)刺激8天。刺激一式两份进行。在第8天，收集培养物上清液，并使用定制面板分析释放的细胞因子，以按照制造商的方案在基于多重微珠的LEGENDplexTM测定中检测人细胞因子。
结果：
实施例1：在HEK293细胞中产生功能活性Aq/rCII
在之前的实验中已经证实，两次静脉注射载有合成半乳糖基化CII259-273肽的Aq分子可以保护小鼠免于患有关节炎。然而，半乳糖基化CII259-273的合成既费时又费钱。此外，将合成肽装载到重组MHC II类分子上既不简单也不具有成本效益。因此，建立允许单步生产MHC II分子的生物合成过程将是一个显著的优势，该MHC II分子包含与宿主细胞中的MHC II链之一融合的共价结合的CII259-273肽(图1)，以确保通过羟基化和随后的原位半乳糖基化对CII肽中第264位赖氨酸侧链进行合适的翻译后修饰。然而，翻译后胶原肽修饰取决于相应酶活性的存在，即赖氨酰羟化酶活性和胶原蛋白β半乳糖基转移酶活性。例如，大肠杆菌产生的蛋白通常不会表现出这样的修饰，尽管一些昆虫细胞具有羟基化赖氨酸残基的能力，但它们不产生包含羟赖氨酸的O-连接糖基化的CII肽。此外，未知的是，提供所需酶活性的宿主细胞是否确实能够在非胶原MHC II蛋白质序列框架内的CII-肽的选择性氨基酸位置处提供所需修饰。
下面首次表明Aq/rCII(259-273)复合体可以在HEK293细胞中表达，并且纯化的复合体包含共价连接的CII肽(CII259-273)，其中对第264位赖氨酸进行翻译后修饰。我们分析了CII肽中赖氨酸侧链的修饰类型，以及纯化的原位半乳糖基化Aq/rCII(259-273)复合体在CIA小鼠模型中是否具有保护作用，其方式与针对装载有半乳糖基化CII1259-273肽的重组Aq分子观察到的方式相似。为了测试HEK293产生的Aq/rCII(259-273)复合体的治疗潜力，我们使用了免疫后一周皮下植入的渗透泵。渗透泵优于静脉注射，因为Aq/rCII(259-273)复合体在循环中保持恒定水平，并可在较长时间段内用于体内耐受诱导。当比较在24小时、7天或6周内释放其内容物的三种不同类型的泵时，发现当包含加载有合成半乳糖基化CII肽的Aq分子时，所有三种泵都介导了对关节炎的保护(数据未显示)。然而，发现与24小时泵相比，使用持续释放7天泵的泵介导的保护与具有调节能力的CII特异性T细胞的发展更密切相关(数据未显示)。不受理论的束缚，低剂量的缓慢释放速率可导致调节性T细胞的发育，而较高剂量的更快释放可导致致病性T细胞的耗竭。然而，观察到的差异也可以通过延长的暴露来解释，这增加了CII特异性T细胞(会以低频率发生)在Aq/rCII(259-273)复合体被从该循环中消除之前与它相互作用的可能性。下面描述的实验是使用渗透泵进行的，渗透泵在7天内释放其内容物。
为了评价在HEK293细胞中产生Aq/rCII(259-273)复合体时存在哪些翻译后修饰，用纯化的复合体在体外刺激了对CII259-273表位具有不同特异性的Aq限制性T细胞杂交瘤克隆(图2)。
对照MHC II/CII复合体在S2昆虫细胞中产生，就赖氨酸侧链的O-连接糖基化而言，其产生翻译后修饰的能力严重受损。正如预期的那样，只有HCQ.4克隆，它识别CII259-273肽，在第264位具有未修饰或羟基化的赖氨酸，对S2昆虫细胞中产生的Aq/rCII(259-273)复合体有反应。相比之下，所有CII特异性克隆都对HEK293细胞中产生的Aq/rCII(259-273)复合体有反应。使用的T细胞杂交瘤克隆的其他特异性如下：HCQ3(CII,Gal-HK264)，HCQ.4(CII,未修饰和HK264)，HCQ.11(Glc-Gal-HK264)，HM1R.2(CII,Gal-HK264和Gal-HK264+270)、HP3(Aq限制性胃蛋白酶肽)。这表明当在HEK293细胞中产生时，第264位确实可以成为被翻译后修饰。此外，所得复合体是异质的，其中第264位包括未修饰的和/或羟基化的赖氨酸以及具有单糖和二糖的糖基化赖氨酸。对胃蛋白酶肽具有特异性的Aq限制性克隆HP3，对任何Aq/rCII(259-273)复合体均无反应。
实施例2：小鼠CIA模型中的原位糖基化Aq/rCII
7天后(在初次免疫后35天再加强免疫后)，将用在佐剂中的CII免疫的小鼠植入装载有三种不同量的HEK293产生的Aq-rCII(259-273)复合体的渗透泵，并跟踪关节炎的患病。被植入仅装有PBS的泵的小鼠作为阴性对照。如图3A所示，Aq-rCII(259-273)复合体以剂量依赖性方式被赋予保护作用，用最高量的Aq-rCII(259-273)复合体(100μg)处理的小鼠完全免受患有关节炎。用中等量(50μg)Aq-rCII(259-273)复合体处理的小鼠显示出一定的保护作用，而用最低量(10μg)处理导致关节炎的频率与PBS处理的对照组相当。
实施例3：在HEK293细胞中产生功能活性的DR4/hCII
我们已经证明，可以使用宿主细胞的原位糖基化机制在HEK293细胞中制备功能性小鼠MHC II/CII复合体(Aq/rCII)。我们接下来研究了是否可以使用细胞的原位糖基化机制在HEK293细胞中制备人MHC II/CII复合体。在HEK293细胞中如上所述制备复合体。对照复合体在CHO细胞中表达，并加载未修饰的肽(DR4/nCII)或半乳糖基化肽(DR4/galCII)。将两种活化受限的人T细胞杂交瘤(3H8：未修饰的CII表位，mDR1.1：半乳糖基化的CII表位)用于检查与加载未修饰的肽或半乳糖基化肽的DR4/肽复合体相比，天然糖基化DR4/肽复合体(DR4/hCII)的半乳糖基化状态。如图4A所示，T细胞杂交瘤mDR1.1在用DR4/galCII复合体刺激后被激活，而用DR4/nCII刺激几乎保持阴性。与DR4/galCII和DR4/nCII相比，DR4/共价连接的CII(DR4/hCII)在半乳糖基化状态方面是异质产物。这意味着包含DR4/hCII复合体的组合物含有在第264位具有半乳糖基化和未修饰的赖氨酸残基的肽。与DR4/galCII复合体相比，用DR4/hCII刺激的细胞的活化水平略低，并且与DR4/nCII复合体非常相似(图4B，使用3H8细胞)。
实施例4：检测人体中的CII肽特异性T细胞
目的是建立一种基于四聚体的方法，以直接检测RA患者和健康供体的外周血(PBMC)中的抗原特异性T细胞。因此，将生物素化的DR4/CII肽复合体与链霉亲和素-PE或链霉亲和素-APC一起孵育。为了减少四聚体的非特异性结合，使用两种荧光染料进行双四聚体染色。使用DR4/galCII四聚体的抗原特异性T细胞(CII259-273,K264gal)可以在RA患者和健康供体中检测到(图5A)。此外，可以使用DR4/nCII四聚体检测对未修饰的CII肽具有特异性的T细胞(图5B)。与DR4/galCII四聚体或DR4/nCII四聚体相比，使用天然糖基化DR4/hCII四聚体的抗原特异性T细胞的平均频率更高(图5B)。由于外周血中抗原特异性T细胞的频率非常低(0.01-0.1％)，因此观察到的数量符合预期。
使用CD154(CD40L)表面染色作为T细胞活化的标记物，通过流式细胞术进行galCII肽刺激后，在HLA-DRB1*0401RA患者的PBMC中也检测到活化的CD4+T细胞(图6)。作为阳性对照，细胞也与超抗原SEB一起孵育，导致激活标记物CD154的强烈上调(数据未显示)。相比之下，仅用抗共刺激CD28的抗体孵育的细胞，主要是阴性的(数据未显示)。由于外周血中抗原特异性T细胞群的预期频率非常低，因此检测到0.01-0.1％CD154+T细胞(亲本群：CD3/CD4活T细胞)是令人满意的。值得注意的是，使用未修饰的(裸露的)CII肽，T细胞的活化程度较低。由于使用DR4/galCII或DR4/nCII四聚体染色的抗原特异性T细胞的数量，在HLA-DRB1*0401RA患者的PBMC中相似(图5)，肽激活后观察到的差异似乎是由于各个T细胞的活性或功能状态差异引起的。
实施例5：来自HLA-DRB1*0401阳性RA患者外周血的T细胞的体外刺激/分化
进行体外研究以调查研究调节性T细胞功能的诱导/分化，例如Tr1表型相关的细胞因子IL-10在用DR4/CII单体刺激长达8天的潜伏期后上调。因此，从基因分型的HLA-DRB1*0401阳性RA患者分离的PBMC，在Tr1细胞诱导条件下用抗-CD3和IL-27(阳性对照，Tr1)刺激，用DR4/nCII(3.6μg/mL)、DR4/galCII(3.6μg/mL)刺激，或不刺激(阴性对照，K1)8天。刺激一式两份进行。在第8天，根据制造商的方案，在基于多重珠的LEGENDplexTM测定格式中，使用定制的人类细胞因子面板收集培养物上清液并分析细胞因子的释放。图7中显示的结果清楚地证明了DR4/nCII和DR4/galCII诱导RA患者PBMC中抗炎细胞因子IL-10的释放的能力，与在常规TR1诱导条件下孵育8天的阳性对照相比其水平甚至略高。没有证据表明伴随的通路激活导致促炎细胞因子(例如TNF-α、IL-2、IL-17a、IL-17f或IFN-γ)产生增加。
实施例6：DR4/CII肽复合体中的His-标签：对药理作用的贡献
已经研究了对于MHC II/CII复合体不是直接必需的序列是否可以从构建体中省略，包括聚组氨酸标签(His-标签)、生物素化位点、TEV切割位点、凝血酶切割位点和重组复合体的T细胞活化特性的Strep-标签的贡献。一般地，在标准杂交瘤激活试验中，DR4/CII肽复合体以及抗-CD3抗体(阳性对照)被包被到微量滴定孔的塑料表面。在最初的实验中，我们使用DR4/nCII肽复合体的内部TEV切割位点来研究与包被到微量滴定孔的未切割DR4/hCII肽复合物相比，通过IL-2分泌测量的His标签的蛋白水解切割对T杂交瘤细胞(3H8)活化的影响。蛋白水解切割的功效由蛋白质印迹分析控制。此外，使用DR4特异性抗体和过氧化物酶偶联的二抗，通过ELISA证实了使用切割和未切割复合体的等摩尔溶液的微量滴定孔的等效包被功效(图8)。这也证实了复合体没有解离，并作为异源二聚体存在。我们的数据显示，尽管由T杂交瘤细胞的TCR识别的DR4/nCII复合体的功能结构域被包被有与塑料表面相似的功效，但切割的构建体在激活T杂交瘤细胞方面显著降低(图8)。拉链切割导致复合体解离的可能性很小。拉链主要是在生物合成过程中形成复合体所需要的，而形成的MHCII-肽-复合体本身至少在体外相当稳定，这是由于与两条链的可变区形成的结合槽结合的肽的稳定作用。
我们得出结论，未切割的DR4/nCII复合体中的His-标签是复合体以多聚化排列在表面上正确定向所必需的，从而通过优先接触塑料表面上的带电接触区域将肽结合槽暴露于T细胞。为了证实这一结论，产生的DR4/hCIIΔHis复合体仅在MHC II类β链的羧基末端缺少His-标签(6xHis)，但在其他方面与DR4/hCII复合体相同，即包含JUN/FOS异二聚化结构域(比较图1)。作为组氨酸的带正电荷功能性咪唑基团参与静电相互作用的额外对照，制备了DR4/hCII复合体的进一步突变重组变体，其中His-标签替换为带负电荷的氨基酸残基三联体Asp-Glu-Asp(DED)(DR4/hCII_DED)。此外，我们将非生理材料塑料与细胞表面、细胞外体液(如滑液或淋巴液)以及组织(如关节软骨或滑膜)中的带电细胞外基质(ECM)成分(硫酸软骨素、硫酸肝素、乙酰透明质酸)交换。为此，我们首先用高度浓缩的硫酸软骨素、硫酸肝素和透明质酸溶液(10mg/ml)包被微量滴定孔。彻底清洗包被的表面，并使用上清液中的IL-2浓度作为读数，通过将DR4/CII肽复合体添加到液相中进行3H8杂交瘤细胞的体外刺激实验。对于对照，在没有ECM-组分的情况下，在具有封闭表面的微量滴定板中进行平行实验。如图9A所示的结果证明在这些条件下，只有含有His-标签的复合体诱导了强IL-2反应，并且它激活T细胞的能力似乎关键取决于包被到微量滴定孔表面的硫酸软骨素，而透明质酸(HA)的影响仍然不那么明显(图9B)，并且几乎检测不到硫酸肝素(图9C)。可溶性DR4/hCII_DED对照复合体在硫酸软骨素包被的微量滴定孔表面存在时不诱导IL-2反应(图9A)。然而，观察到的His-标记的复合体的效果，不能简单地通过多硫酸化阴离子糖胺聚糖借助聚组氨酸标签的带正电荷的咪唑基团的静电相互作用来解释，因为硫酸乙酰肝素同样含有高度带负电荷的硫酸根基团，但似乎没有显著促进由溶质His标记的DR4/hCII复合体刺激的3H8杂交瘤细胞的IL-2反应。因此，结果表明聚组氨酸标签与硫酸软骨素基质的特异性相互作用增加了用溶解的DR4/hCII复合体刺激的3H8杂交瘤细胞的IL-2反应。
在以三种不同浓度(0.01mg/ml、0.1mg/ml和1mg/ml)将不同DR4/hCII构建体直接包被到塑料表面的平行T杂交瘤细胞刺激实验中，确认了用Tev-切割的DR4/nCII复合体获得的初始结果。使用0.1mg/ml和1mg/ml进行包被时，DR4/hCIIΔHis复合体以及突变的DR4/hCII_DED复合体诱导IL-2反应的能力显著降低。然而，以与低10倍的包被浓度的未修饰复合体(DR4/hCII)相当的水平，使用1mg/ml进行包被时观察到反应(图10)。
然而，实验还表明，所有构建体都在DR4结合槽中具有功能性肽作为3H8杂交瘤细胞TCR激活的必要条件。因此，我们的研究提供了明确的证据，表明DR4/CII复合体中的His-标签提高了复合体的活性。不受理论束缚，His-标签看来通过对与ECM组分硫酸软骨素的相互作用的影响为TCR识别提供了改善的肽结合槽的空间取向。此外，图11中显示的后续研究表明，包含His-标签的DR4/CII复合体与具有封闭塑料表面的微量滴定孔的固相中硫酸软骨素或透明质酸的相互作用，可以增强其刺激T杂交瘤细胞产生IL-10反应的能力。
体外数据支持His-标签在DR4/CII复合体中的关键功能作用，因为它具有免疫调节药理作用。此外，在表达Aq的QB小鼠中使用T细胞依赖性CII诱导的超敏反应模型进行了体内研究。通过向一只耳朵皮内注射CII进行免疫后第8天触发了CII预免疫小鼠而患有T细胞依赖性炎症肿胀，由施加到对侧耳朵的媒介物触发来进行对照。在诱导DTH反应之前，小鼠在免疫后第4天接受24小时皮下注射泵输注含His-标签的Aq/galCII复合体、不含His-标签的Aq/galCIIΔHis复合体或在其结合槽中含有连接的对照肽[II类相关不变链：CLIP]的对照Aq/CLIP复合体。图12中显示的结果为His-标签对实验性CII特异性DTH反应诱导的T细胞依赖性耳肿胀的治疗性减少的功能影响提供了明确的证据。因此，我们的研究一致证明了包含聚组氨酸序列的MHC II/CII肽复合体对T细胞的免疫调节治疗作用的改进功能，这很可能是通过其对与ECM成分相互作用的影响而介导的，所述ECM成分在体内细胞表面、组织成分和体液上的靶向的结构的背景下大量可用。
实施例7：在HEK细胞中重组产生DR4/qalCII复合体的障碍
重组DR4复合体结合槽中肽的CII序列的翻译后修饰，涉及不同酶的几个连续步骤。这些胶原蛋白特异性的翻译后修饰，优先影响第264和270位的赖氨酸残基。初始步骤是赖氨酰羟化酶介导的赖氨酰羟化，然后是半乳糖基转移酶介导的半乳糖基转移至羟基化赖氨酸。此外，可以将单个葡萄糖残基添加到半乳糖基化羟赖氨酸。所有这些步骤都发生在具有胶原蛋白翻译后机制的细胞的生物合成过程中，如在HEK细胞中，从而产生与体内软骨中的天然ECM蛋白相当的异源重组产物。在人类中，这种混合物可能有利于增加潜在T细胞的范围，这些T细胞可以从整个组库中募集用于转变为调节细胞，以产生抗炎介质如IL-10，以抑制免疫介导的关节疾病。对响应含有半乳糖基化(DR4/galCII)或非修饰CII(DR4)肽的重组DR4/CII复合体/nCII)的RA患者外周血T细胞中IL-2和IL-10反应的体外激活的研究，在这个方向上提供了实验支持。然而，对HEK细胞中产生的几批CR4/hCII的质谱分析表明，相当多的重组蛋白在两个赖氨酸残基上都表现出高度的二糖(Glc-Gal-Hyl)含量(图13)，由于肽结合槽被庞大的碳水化合物结构覆盖从而干扰TCR识别，因此这可能不利于TCR识别。
重组DR4/hCII构建体的CII肽序列中赖氨酸残基(尤其是在残基264)的胶原特异性翻译后半乳糖基化，对于通过TCR识别T细胞和由此产生的药理作用很重要。由于第270位赖氨酸残基位于DR4分子结合槽的边缘，一般认为其糖类修饰不参与TCR识别。为了减少异质性和通过碳水化合物连接至第270位羟基化赖氨酸残基(K270)对DR4结合槽中CII肽的TCR识别产生负面干扰的潜在风险，K270可以突变为精氨酸残基(R)。这种突变先前已被证明不会影响与抗原特异性T细胞杂交瘤的TCR的结合。
更重要的是防止葡萄糖残基最终转移到第264位的半乳糖基化羟赖氨酸。该碳水化合物部分可能对TCR识别产生负面影响，因为体积大且灵活的二糖(Glc-Gal)可能会干扰TCR结合。来自RA患者外周血的T细胞的体外刺激表明，可以识别未修饰的(nCII)以及单半乳糖基化肽(galCII)。催化葡萄糖残基转移到半乳糖基化羟赖氨酸的反应，是半乳糖基羟基赖氨酰葡萄糖基转移酶(同义词：原胶原赖氨酰水解酶3(LH3))。LH3是一种多功能酶，也能够催化上述赖氨酸修饰的初始步骤，即产生羟赖氨酸(Hyl)的羟基化和产生半乳糖基-羟赖氨酸(Gal-Hyl)的半乳糖基转移(图14A)。然而，它的非冗余活性是最终将葡萄糖转移到半乳糖基羟赖氨酸。
因此，我们对Expi293F细胞进行基因工程改造以敲低LH3酶。用于产生DR4/hCII复合体的HEK细胞系被预期有利于提高重组产生的DR4/hCII复合体的功效，该复合体被选择性地使得在最终向CII肽中的半乳糖基羟赖氨酸的葡萄糖基转移方面存在缺陷。这可以通过生成HEK293 LH3敲除细胞来实现，例如通过使用CRISPR/CAS基因编辑方法，将破坏基因的突变引入编码赖氨酰羟化酶3基因的plod3基因中。
在第一步中，我们通过慢病毒转染特定shRNA生成了具有plod3敲低的Expi293F细胞，以调查研究该策略通过改进重组表达系统获得具有增加的特异性T细胞激活活性的较少异质产物的潜力。对于转导Expi293细胞，以200,000个细胞/孔接种在12孔板中，然后在37℃、8％CO2和120rpm摇动所述板3小时。将200uL慢病毒颗粒(来自Sigma的定制慢病毒颗粒)与10uLPEIpro转染试剂(Polyplus)混合并添加到细胞中，并在37℃、120rpm和8％CO2振荡孵育另外4小时，添加1mL新鲜培养基并继续孵育3天，然后分析转导效率。
在用靶向Plod3的shRNA进行慢病毒转导后三天，细胞被分成两份。向一份中加入嘌呤霉素至终浓度为2ug/mL以杀死未转导的细胞，另一份通过流式细胞术分析以检查转导效率。细胞处于抗生素选择压力下，直到非转导细胞死亡，转导的细胞分裂约18天至存活率超过90％。将这些稳定的转导混合池扩大到500mL，并如上所述用DR4/hCII转染。纯化后，通过质谱法进行聚糖分析以研究在plod3敲低Expi293F细胞和Expi293F对照细胞中，半乳糖基羟赖氨酰残基的葡萄糖基化减少。分析了II型胶原表位内的两种赖氨酸(K264和K270)。在Expi293 KO细胞中可以看到葡萄糖-半乳糖基羟赖氨酰残基(DiHex)的明显减少(图14C)。
同时，将稳定转导的细胞稀释，并接种在96孔板上用于迷你池生成。在接种过程中，细胞在选择压力下生长，并分离出40个迷你池。扩增细胞并通过蛋白质印迹确定细胞裂解物中的PLOD3表达，以验证Plod3的有效敲低。将来自1x106个慢病毒转导的Expi293F迷你池的裂解物，加载到SDS-PAGE上。使用抗-PLOD3抗体(Thermo Fisher PAS-48435)和二抗兔HRP抗体，对成功敲低进行蛋白质印迹分析。PLOD3的理论分子量为84kDa。克隆#4、#18和#20显示出有效的Plod3敲低，因此用于进一步的扩增和实验。克隆18由于生存力下降而丢失，已选择克隆4和20进行进一步生产，同时也进行聚糖分析。
实施例8：在包含β-链的序列的C-末端具有替代性带正电荷的氨基酸标签的Aq/ qal264 CII构建体
如上所示，DR4/nCII复合体中的His-标签看来允许复合体在表面上以多聚化排列的方式正确定向，从而将肽结合槽暴露于T细胞，并且His-标签的有益作用已在体内于DTH模型中被证实。因此，我们搜索了介导类似效果的替代性标签。搜索的基本考虑是构建体中使用的6xHis序列是一种非天然结构，因此我们搜索了人类自身蛋白序列中可以替代免疫调节MHC II/CII肽复合体中His-标签的序列。因此，由功能等效的自身结构替代His-标签，旨在降低潜在的免疫原性。在具有相对高含量的功能相关碱性氨基酸残基和进化上保守的结构而使得自身免疫识别不太可能的候选自身蛋白中，是组蛋白家族的蛋白。
因此，在我们寻找可能与带负电荷的硫酸化碳水化合物结构(例如在硫酸软骨素中)相互作用的含碱性氨基酸残基的自身蛋白序列中，我们在人组蛋白2A1的序列中鉴定了在小鼠和人之间保守的N-末端(SGRGKQGGKARAKAKTRSSR；SEQ ID NO:34)以及羧基端(HKAKGK)相应候选区域(图15)。图16显示了使用替代性C-末端标签激活T细胞杂交瘤HCQ.3，其特异性识别AQ/gal264 CII-肽复合体。我们研究了连接至包含Aq复合体中β-链的序列的C-末端的不同替代性序列，如图16上部所示，作为His-标签的替代物对T细胞活化特性的影响。除了组蛋白NT标签(SGRGKQGGKARAKAKTRSSR)和组蛋白CT标签(HKAKGK)之外，还测试了包含6个交替NH基序(NHNHNHNHNHNH,SEQ ID NO:35)的修饰His-标签。为此目的，在标准条件下进行杂交瘤刺激测定：将Aq/gal264 CII肽复合体包被到微量滴定孔的塑料表面，通过ELISA测定IL-2分泌作为特异性细胞活化的量度。His标记的Aq/gal264 CII(His)用作阳性对照。如图16所示，在0.01-1μg/mL的浓度范围内，组蛋白NT标记的变体表现出与阳性对照相当的T细胞刺激活性。组蛋白CT-标签变体以及修饰的His-标签在激活HCQ.3细胞中的效果较差，但与缺少His-标签且没有任何替代物的构建体相比，仍显示出较小的效果。因此，在Aq/galCII复合体的融合构建体中的两个组蛋白2A1序列与分别的HIS标记的复合体比较的初步体外测试表明，N-末端序列(NT)：SGRGKQGGKARAKTRSSR的功能与His-标签相当，而组蛋白2A1的C-末端序列(CT)仅显示出较小的效果，而修饰的组蛋白标签则显示出中等的效果。我们推测带正电荷的氨基酸的数量很重要(至少6个带正电荷的氨基酸)，连续带正电荷的氨基酸更有益。在交替带正电荷的氨基酸的情况下，更碱性的氨基酸如赖氨酸(pK为10.5)和精氨酸(pK为12.5)，看来比组氨酸(pK为6.0)更优选。
一致地，在表达Aq的QB小鼠中T细胞依赖性CII诱导的超敏反应模型中的初步体内测试，证明了MHC II/CII复合体的功能等效免疫调节药理作用，其中His-标签被H2A1衍生的NT序列替换。通过向一只耳朵皮内注射CII进行免疫后第8天触发了CII预免疫小鼠而患有T细胞依赖性炎症肿胀，由施加到对侧耳朵的媒介物触发来进行对照。在诱导DTH反应之前，小鼠在免疫后第4天接受24小时皮下注射泵输注含His-标签的Aq/gal264 CII复合体(Aq/galCII-His)、不含His-标签的Aq/gal264 CII复合体(Aq/galCII-ΔHis)或含有H2A1-衍生序列的Aq/gal264 CII复合体(Aq/galCII-组蛋白NT)。在其结合槽中包含连接的对照肽[II类相关不变链：CLIP]的His标记的Aq复合体被包括在该研究中作为阴性对照。如图17所示的结果证明了治疗性Aq/gal264 CII复合体中具有His-标签的NT序列的功能等效性。
序列表：
SEQ ID NO:1 AGFKGEQGPKG
SEQ ID NO:2 AGFKGEQGPXG
SEQ ID NO:3 AGFKGEX2GPKG
SEQ ID NO:4 AGFKGX3QGPKG
SEQ ID NO:5 AGFKX4EQGPKG
SEQ ID NO:6 AGFKGEX2GPX1G
SEQ ID NO:7 AGFKGX3QGPX1G
SEQ ID NO:8 AGFKX4EQGPX1G
SEQ ID NO:9 AGFKGEQGPRG
SEQ ID NO:10 AGFKGEQGPKGEP
SEQ ID NO:11 AGFKGEQGPX1GEP
SEQ ID NO:12 AGFKGEQGPRGEP
SEQ ID NO:13 GIAGFKGEQGPKGEP
SEQ ID NO:14 GIAGFKGEQGPX1GEP
SEQ ID NO:15 GIAGFKGEQGPRGEP
SEQ ID NO:16 DR4构建体α-链
SEQ ID NO:17具有hCII259-273肽的DR4构建体β-链
SEQ ID NO:18最小DR4构建体α-链
SEQ ID NO:19具有hCII259-273肽的最小DR4构建体β-链
SEQ ID NO:20具有hCLIPmut的DR4构建体β-链
SEQ ID NO:21 Aq构建体α-链
SEQ ID NO:22具有大鼠CII259-273肽的Aq构建体β-链
SEQ ID NO:23 Aq构建体β-链，具有无His-标签的大鼠CII259-273肽
SEQ ID NO:24具有mCLIP肽的Aq构建体β-链
SEQ ID NO:25 Aq构建体β-链，具有无His-标签的mCLIP肽
SEQ ID NO:26 cFos结构域
SEQ ID NO:27 cJune结构域
SEQ ID NO:28修饰的人CLIP-肽
SEQ ID NO:29大鼠CII-肽259-273
SEQ ID NO:30链霉亲和素标签
SEQ ID NO:31 EKRIWFPYRRF
SEQ ID NO:32 YKTNFRRYYRF
SEQ ID NO:33 VLIRHFRKRYY
SEQ ID NO:34 SGRGKQGGKARAKAKTRSSR
SEQ ID NO:35 NHNHNHNHNHNH
SEQ ID NO:36 KDHLIHNVHKEEHAHAHNK
SEQ ID NO:37 H2A1_人
SEQ ID NO:38 H2A1P_小鼠
SEQ ID NO:39 SAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGEPSGGGS
SEQ ID NO:40 H2AC标签
SEQ ID NO:41 6xHis
SEQ ID NO:42 7xHis
序列表
<110> 弗劳恩霍夫应用研究促进协会
<120> 用于治疗关节炎的HLA-DR/CII肽复合体
<130> TPE01752A
<150> EP19191077.7
<151> 2019-08-09
<160> 42
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CII肽261-271
<400> 1
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CII肽261-271, Lys = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 10
<223> Xaa = 除Lys外的任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa =
Arg, Ala, Gly或Gln
<400> 2
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Xaa Gly
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-271; Gln = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 7
<223> Xaa = 除Gln外的任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa =
Ala, Arg, His或Gly
<400> 3
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Xaa Gly Pro Lys Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-271; Glu = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 6
<223> Xaa = 除Glu外的任何蛋白质氨基酸, 优选Xaa =
Ala, Asp, Gln或Gly
<400> 4
Ala Gly Phe Lys Gly Xaa Gln Gly Pro Lys Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-271; Gly = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 5
<223> Xaa = 除Gly外的任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa =
Ala, Ser, Val或Leu
<400> 5
Ala Gly Phe Lys Xaa Glu Gln Gly Pro Lys Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-271; Gln = Xaa和Lys = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 7
<223> Xaa = 除Gln外的任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa =
Ala, Arg, His或Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> 10
<223> Xaa = 除Lys外的任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa =
Arg, Ala, Gly或Gln
<400> 6
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Xaa Gly Pro Xaa Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-271; Glu = Xaa和Lys = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 6
<223> Xaa = 除Glu外的任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa =
Ala, Asp, Gln或Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> 10
<223> Xaa = 除Lys外的任何蛋白质氨基酸, 优选Xaa =
Arg, Ala, Gly或Gln
<400> 7
Ala Gly Phe Lys Gly Xaa Gln Gly Pro Xaa Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-271; Gly = Xaa和Lys = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 5
<223> Xaa = 除Gly外的任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa =
Ala, Ser, Val或Leu
<400> 8
Ala Gly Phe Lys Xaa Glu Gln Gly Pro Xaa Gly
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-271; Lys = Arg
<400> 9
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Arg Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CII肽261-273
<400> 10
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-273; Lys = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 10
<223> Xaa = 除Lys外的任何蛋白质氨基酸; 优选Lys =
Arg, Ala, Gly或Gln
<400> 11
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Xaa Gly Glu Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽261-273; Lys = Arg
<400> 12
Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Arg Gly Glu Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CII肽259-273
<400> 13
Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽259-273; Lys = Xaa
<220>
<221> UNSURE
<222> 12
<223> Xaa = 任何蛋白质氨基酸; 优选Xaa = Arg, Ala,
Gly或Gln
<400> 14
Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Xaa Gly Glu Pro
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CII肽259-273; Lys = Arg
<400> 15
Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Arg Gly Glu Pro
1 5 10 15
<210> 16
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR4构建体α链
<400> 16
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu
20 25 30
Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu
35 40 45
Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn
65 70 75 80
Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn
85 90 95
Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro Glu Val Thr Val Leu Thr Asn
100 105 110
Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp
115 120 125
Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys
130 135 140
Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp
145 150 155 160
His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu
165 170 175
Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu
180 185 190
Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Ser Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr
195 200 205
Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr
210 215 220
Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn
225 230 235 240
Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
260 265 270
Trp His Glu
275
<210> 17
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR4构建体β链具有hCII259-273肽
<400> 17
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ile Ala Gly
20 25 30
Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Thr Arg Pro
50 55 60
Arg Phe Leu Glu Gln Val Lys His Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr
65 70 75 80
Glu Arg Val Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Phe Tyr His Gln Glu Glu Tyr
85 90 95
Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu
100 105 110
Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu
115 120 125
Gln Lys Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val
130 135 140
Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val Tyr Pro Glu Val Thr Val
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu Val Cys
165 170 175
Ser Val Asn Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Arg Trp Phe Arg
180 185 190
Asn Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser Thr Gly Leu Ile Gln
195 200 205
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met Leu Glu Thr Val Pro
210 215 220
Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Pro Ser Leu Thr
225 230 235 240
Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser Gly Gly Gly Glu Asn
245 250 255
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu
260 265 270
Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala
275 280 285
Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
290 295 300
His His His His His His His
305 310
<210> 18
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 最小DR4构建体α链
<400> 18
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu
20 25 30
Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu
35 40 45
Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu
50 55 60
Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn
65 70 75 80
Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn
85 90 95
Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro Glu Val Thr Val Leu Thr Asn
100 105 110
Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp
115 120 125
Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys
130 135 140
Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp
145 150 155 160
His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu
165 170 175
Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu
180 185 190
Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys
210 215 220
Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
225 230 235 240
Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His
245
<210> 19
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 最小DR4构建体β链具有hCII259-273肽
<400> 19
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu
20 25 30
Pro Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Thr Arg Pro
35 40 45
Arg Phe Leu Glu Gln Val Lys His Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr
50 55 60
Glu Arg Val Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Phe Tyr His Gln Glu Glu Tyr
65 70 75 80
Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu
85 90 95
Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu
100 105 110
Gln Lys Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val
115 120 125
Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val Tyr Pro Glu Val Thr Val
130 135 140
Tyr Pro Ala Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu Val Cys
145 150 155 160
Ser Val Asn Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Arg Trp Phe Arg
165 170 175
Asn Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser Thr Gly Leu Ile Gln
180 185 190
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met Leu Glu Thr Val Pro
195 200 205
Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Pro Ser Leu Thr
210 215 220
Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala
245 250 255
Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val
260 265 270
Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His His His His His His His
275 280 285
<210> 20
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DR4构建体β链具有hCLIPmut
<400> 20
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Val Ser Lys
20 25 30
Ala Arg Met Ala Thr Gly Ala Leu Ala Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Thr Arg Pro
50 55 60
Arg Phe Leu Glu Gln Val Lys His Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr
65 70 75 80
Glu Arg Val Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Phe Tyr His Gln Glu Glu Tyr
85 90 95
Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu
100 105 110
Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu
115 120 125
Gln Lys Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val
130 135 140
Gly Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val Tyr Pro Glu Val Thr Val
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu Val Cys
165 170 175
Ser Val Asn Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Arg Trp Phe Arg
180 185 190
Asn Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser Thr Gly Leu Ile Gln
195 200 205
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met Leu Glu Thr Val Pro
210 215 220
Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Pro Ser Leu Thr
225 230 235 240
Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser Gly Gly Gly Glu Asn
245 250 255
Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu
260 265 270
Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala
275 280 285
Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
290 295 300
His His His His His His His
305 310
<210> 21
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Aq构建体α链
<400> 21
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Ile
20 25 30
Val Val Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe
35 40 45
Asp Gly Asp Glu Trp Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val
50 55 60
Trp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gln Leu Thr Ser Phe Asp Pro Gln Gly
65 70 75 80
Gly Leu Gln Asn Ile Ala Thr Gly Lys His Asn Leu Gly Gly Trp Thr
85 90 95
Lys Arg Ser Asn Phe Thr Pro Ala Thr Asn Glu Ala Pro Gln Ala Thr
100 105 110
Val Phe Pro Lys Ser Pro Val Leu Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile
115 120 125
Cys Phe Val Asp Asn Ile Phe Pro Pro Val Ile Asn Ile Thr Trp Leu
130 135 140
Arg Asn Ser Lys Ser Val Thr Asp Gly Val Tyr Glu Thr Ser Phe Leu
145 150 155 160
Val Asn Arg Asp His Ser Phe His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile
165 170 175
Pro Ser Asp Asp Asp Ile Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu
180 185 190
Asp Glu Pro Val Leu Lys His Trp Glu Pro Glu Ile Pro Ala Thr Met
195 200 205
Ser Glu Leu Thr Glu Thr Val Ser Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe
210 215 220
Gln Gly Gly Gly Gly Ser Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp
225 230 235 240
Gln Leu Glu Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu
245 250 255
Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp
275 280 285
His Glu
290
<210> 22
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Aq构建体β链具有大鼠CII259-273肽
<400> 22
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ile Ala Gly
20 25 30
Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Thr Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg His Phe Val
50 55 60
Ala Gln Leu Lys Gly Glu Cys Tyr Phe Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Trp Val Arg Phe
85 90 95
Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro
100 105 110
Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Asp Thr Val Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Val Glu Thr
130 135 140
His Thr Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu
145 150 155 160
Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val
165 170 175
Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly
180 185 190
Gln Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly
195 200 205
Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln
210 215 220
Gly Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro
225 230 235 240
Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser Lys Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ile
260 265 270
Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu
275 280 285
Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys
290 295 300
Gln Lys Val Met Asn His His His His His His His
305 310 315
<210> 23
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Aq构建体β链具有大鼠CII259-273肽无
His-标签
<400> 23
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ile Ala Gly
20 25 30
Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Thr Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg His Phe Val
50 55 60
Ala Gln Leu Lys Gly Glu Cys Tyr Phe Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Trp Val Arg Phe
85 90 95
Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro
100 105 110
Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Asp Thr Val Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Val Glu Thr
130 135 140
His Thr Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu
145 150 155 160
Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val
165 170 175
Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly
180 185 190
Gln Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly
195 200 205
Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln
210 215 220
Gly Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro
225 230 235 240
Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser Lys Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ile
260 265 270
Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu
275 280 285
Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys
290 295 300
Gln Lys Val Met Asn His
305 310
<210> 24
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Aq构建体β链具有mCLIP肽
<400> 24
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Val Ser Gln
20 25 30
Ala Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Arg Pro Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg His Phe Val
50 55 60
Ala Gln Leu Lys Gly Glu Cys Tyr Phe Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Trp Val Arg Phe
85 90 95
Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro
100 105 110
Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Asp Thr Val Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Val Glu Thr
130 135 140
His Thr Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu
145 150 155 160
Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val
165 170 175
Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly
180 185 190
Gln Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly
195 200 205
Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln
210 215 220
Gly Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro
225 230 235 240
Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser Lys Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ile
260 265 270
Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu
275 280 285
Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys
290 295 300
Gln Lys Val Met Asn His His His His His His His
305 310 315
<210> 25
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Aq构建体β链具有mCLIP肽无His-标签
<400> 25
Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Val Ser Gln
20 25 30
Ala Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Arg Pro Ser Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Arg His Phe Val
50 55 60
Ala Gln Leu Lys Gly Glu Cys Tyr Phe Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Trp Val Arg Phe
85 90 95
Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro
100 105 110
Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg
115 120 125
Ala Glu Val Asp Thr Val Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Val Glu Thr
130 135 140
His Thr Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu
145 150 155 160
Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val
165 170 175
Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly
180 185 190
Gln Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly
195 200 205
Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln
210 215 220
Gly Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro
225 230 235 240
Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser Lys Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ile
260 265 270
Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu
275 280 285
Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys
290 295 300
Gln Lys Val Met Asn His
305 310
<210> 26
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> cFos结构域
<400> 26
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
20 25 30
Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala His
35 40
<210> 27
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> cJun结构域
<400> 27
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His
35 40
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 突变的人CLIP-肽
<400> 28
Pro Val Ser Lys Ala Arg Met Ala Thr Gly Ala Leu Ala Gln Ala
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 大鼠CII-肽259-273
<400> 29
Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Thr
1 5 10 15
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链霉亲和素-标签
<400> 30
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 软骨素结合肽
<400> 31
Glu Lys Arg Ile Trp Phe Pro Tyr Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 软骨素结合肽
<400> 32
Tyr Lys Thr Asn Phe Arg Arg Tyr Tyr Arg Phe
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 软骨素结合肽
<400> 33
Val Leu Ile Arg His Phe Arg Lys Arg Tyr Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 组氨酸NT标签
<400> 34
Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Arg Ser Ser Arg
20
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的his-标签
<400> 35
Asn His Asn His Asn His Asn His Asn His Asn His
1 5 10
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HAT-标签
<400> 36
Lys Asp His Leu Ile His Asn Val His Lys Glu Glu His Ala His Ala
1 5 10 15
His Asn Lys
<210> 37
<211> 130
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Lys
130
<210> 38
<211> 130
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 38
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Lys
130
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCII259-273具有N-末端和C-末端序列
<400> 39
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ile Ala Gly Phe Lys
1 5 10 15
Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H2AC标签
<400> 40
His Lys Ala Lys Gly Lys
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6XHis
<400> 41
His His His His His His
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7xHis
<400> 42
His His His His His His His
1 5

Claims (14)

1.包含重组HLA-DR/CII肽复合体的组合物，所述复合体包含：
(a)包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；
(b)包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；以及
(c)胶原蛋白II肽(CII肽)，其任选地通过接头肽与HLA-DRα链或HLA-DRβ链的N-末端融合，优选与所述HLA-DRβ链的N-末端融合；其中所述CII肽包含选自下组的氨基酸序列：AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG和AGFKXEQGPXG，并且其中所述HLA-DR/CII肽复合体在含有所述HLA-DRα链和/或所述HLA-DRβ链的多肽的C-末端包含软骨素结合肽，用于治疗人类患者的慢性炎性疾病。
2.根据权利要求1所述用途的组合物，其中
(a)所述软骨素结合肽呈游离形式；
(b)所述重组HLA-DR/CII肽复合体未通过所述组合物中的所述软骨素结合肽多聚化；和/或
(c)所述重组HLA-DR/CII肽复合体未通过所述组合物中的所述软骨素结合肽与其他分子结合。
3.根据权利要求1或2所述用途的组合物，其中
(a)所述HLA-DRα链的所述胞外区包含α1和α2结构域；和/或
(b)所述HLA-DRβ链的所述胞外区包含β1和β2结构域。
4.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中所述CII肽通过接头肽融合至所述HLA-DRα链或所述HLA-DRβ链的N-末端，优选融合至所述HLA-DRβ链的N-末端。
5.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中至少所述α1结构域来自DRA*0101，并且至少所述β1结构域来自选自下组的HLA-DR等位基因：DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001、DRB1*1402和DRB1*1303，优选DRB1*0401。
6.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中所述CII肽包含氨基酸序列为AGFKGEQGPKG，优选AGFKGEQGPKGEP，更优选GIAGFKGEQGPKGEP。
7.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中所述软骨素结合肽包含5-20个氨基酸，优选6-12个氨基酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中所述软骨素结合肽是聚组氨酸标签，优选至少是六组氨酸标签。
9.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中
(a)包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；以及
(b)包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区表达为单一融合多肽；以及任选地
(c)所述胶原蛋白II肽(CII肽)通过接头肽融合至所述HLA-DRα链或所述HLA-DRβ链的N-末端，优选融合至HLA-DRβ链的N-末端。
10.根据权利要求1-8中任一项所述用途的组合物，所述组合物包含：
(a)第一多肽，其含有包含至少一个α1结构域的HLA-DRα链的胞外区；
(b)第二多肽，其含有包含至少一个β1结构域的HLA-DRβ链的胞外区；
(c)所述胶原蛋白II肽(CII肽)，其任选地通过接头肽与所述HLA-DRα链或所述HLA-DRβ链的N-末端融合，优选与所述HLA-DRβ链的N-末端融合；以及
(d)其中所述HLA-DRα链在其C-末端融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第一功能域，并且所述HLA-DRβ链在其C-末端融合至亮氨酸拉链异二聚化基序的第二互补功能域。
11.根据权利要求10所述用途的组合物，其中所述第一功能域和所述第二互补功能域是：
(a)酸性和碱性亮氨酸拉链异二聚化结构域；和/或
(b)jun-fos亮氨酸拉链基序。
12.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中所述重组HLA-DR/CII肽复合体包含具有未修饰的和/或一个或多个翻译后修饰的赖氨酸残基的CII肽，优选其中
(a)所述CII肽由具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽组成，
(b)所述CII肽由第一赖氨酸为羟赖氨酸(Hyl)的CII肽组成；
(c)所述CII肽由第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽组成；
(d)所述CII肽由具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽组成；
(e)所述CII肽包含第一赖氨酸是半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽；
(f)所述CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸是半乳糖基-羟赖氨酸的CII肽；
(g)所述CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸是半乳糖基-羟赖氨酸和/或羟赖氨酸(Hyl)的CII肽；或者
(h)所述CII肽包含具有未修饰的赖氨酸残基的CII肽和第一赖氨酸为O-糖基化羟赖氨酸和/或羟赖氨酸(Hyl)的CII肽；并且其中翻译后修饰的CII肽中任选的第二赖氨酸是未修饰的羟赖氨酸、半乳糖-羟赖氨酸和/或葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸；优选是未修饰的羟赖氨酸、半乳糖-羟赖氨酸，更优选是未修饰的。
13.根据权利要求12所述用途的组合物，其中所述组合物不含有包含具有葡糖基-半乳糖基-羟赖氨酸修饰的CII肽的HLA-DR/CII肽复合体。
14.根据前述权利要求中任一项所述用途的组合物，其中所述慢性炎性疾病是：类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、非放射学中轴型脊柱关节炎、强直性脊柱炎、青少年特发性关节炎、复发性多软骨炎、系统性红斑狼疮、莱姆病、梅尼埃病、自身免疫性内耳病(AIED)或斯蒂尔病。
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