JP7406620B2 - 関節炎治療のためのhla-dr/ciiペプチド複合体 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト患者における関節炎などの、慢性炎症性疾患を治療するための、HLA-DRα鎖及び/又はHLA-DRβ鎖を含むポリペプチドのC-末端にコンドロイチン-結合ペプチドを含むHLA-DR/CIIペプチド複合体であって、ここでCIIペプチドは、リンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖のN-端側へ融合されている複合体に関する。CIIペプチド中のリジン、特にCIIペプチド中の第一のリジンは、翻訳後修飾されてよい。本発明は更に、哺乳類細胞において該HLA-DR/CIIペプチド複合体を生成する方法に関する。
関節リウマチ(RA)は、欧州において400万~700万人が罹患している大きい健康上の懸念を呈する一般的な重度の疾患である。これは、疼痛、進行性の軟骨及び骨の破壊に関連した、関節の異常な自己免疫炎症により引き起こされ、機能障害に繋がり、適切に治療されない場合は、最終的に不動/疾病(invalidity)に至る。今日の薬物治療は、臨床診断の確定時に直ちに開始され、症例の60~70%において効果があるが、この疾患からの治癒は達成されない。薬物治療は、炎症の共通のエフェクター経路を主に標的化し、これにより感染症リスクの増大に関連した、広範な免疫抑制効果を引き起こす。
本発明は、ヒト患者における慢性炎症性疾患、特に慢性炎症性関節疾患及び/又は関節炎の治療における使用のための、(a)少なくともα1ドメインを含む、HLA-DRα鎖の細胞外領域;(b)少なくともβ1ドメインを含む、HLA-DRβ鎖の細胞外領域;及び、(c)リンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖、好ましくはHLA-DRβ鎖のN-端側へ、任意に融合された、コラーゲンIIペプチド(CIIペプチド):を含む組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体を含有する組成物であって;ここでCIIペプチドが、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びにここでHLA-DR/CIIペプチド複合体が、HLA-DRα鎖及び/又はHLA-DRβ鎖を含むポリペプチドのC-末端にコンドロイチン-結合ペプチドを含む、組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体を含有する組成物に関する。好ましくは、慢性炎症性疾患の治療において使用するための組成物は、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、X線基準を満たさない体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、再発性多発性軟骨炎、全身性紅斑性狼瘡、ライム病、メニエール病、内耳自己免疫病(AIED)、又はスチル病からなる群から選択される。
全般的態様「含んでいる」又は「含まれる」は、より具体的な態様「からなる」を包含する。更に、単数形及び複数形は、限定的な様式では使用されない。本明細書において使用される単数形「ある(a、an及びthe)」は、単数のみを指定することを明確に言及しない限りは、単数及び複数の両方を指定する。
一態様において、本発明は、ヒト患者における慢性炎症性疾患の治療において使用するための、少なくともα1ドメインを含むHLA-DRα鎖の細胞外領域;少なくともβ1ドメインを含むHLA-DRβ鎖の細胞外領域;及び、任意にリンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖、好ましくはHLA-DRβ鎖のN-端側へ融合されている、コラーゲンIIペプチド(CIIペプチド)を含む組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体を含有する組成物を提供し、ここでCIIペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びにここでHLA-DR/CIIペプチド複合体は、HLA-DRα鎖及び/又はHLA-DRβ鎖を含むポリペプチドのC-末端にコンドロイチン-結合ペプチドを含む。一実施態様において、CIIペプチドは、リンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖のN-端側に融合されている。一実施態様において、CIIペプチドは、HLA-DRβ鎖のN-端側に融合されている。
表1:
1)DR4-構築体:
・DR4構築体α鎖(配列番号:16)、シグナルペプチド、後続のDRA*0101細胞外α鎖領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、cFosドメイン(太字及び下線付き)、及びビオチン化部位(BirA、イタリック及び下線付き)を含む配列:
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・最小のDR4構築体α鎖(配列番号:18)、シグナルペプチド、後続のDRA*0101細胞外α鎖領域(下線付き)、及びcFosドメイン(太字及び下線付き)を含む配列:
MKLCILLAVVAFVGLSLGIKEEHVIIQAEFYLNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITNVPPEVTVLTNSPVELREPNVLICFIDKFTPPVVNVTWLRNGKPVTTGVSETVFLPREDHLFRKFHYLPFLPSTEDVYDCRVEHWGLDEPLLKHWEFDASGGGGGGSLTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH
・hCII259-273ペプチドを伴うDR4構築体β鎖(配列番号:17)、シグナルペプチド、その直後のStrep-タグ(太字及び二重下線付き)、及びCIIペプチド259-273(イタリック及び下線)、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位(太字及び点線)、DRB*0401細胞外領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、cJunドメイン(太字及び下線付き)、及びHis-タグ(イタリック)を含む配列:
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・hCII259-273ペプチドを伴う最小DR4構築体β鎖(配列番号:19)、シグナルペプチド、直後のCIIペプチド259-273(イタリック及び下線)、DRB*0401細胞外領域(下線付き)、cJunドメイン(太字及び下線付き)、及びHis-タグ(イタリック)を含む配列:
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2)DR4-hCLIPmut構築体:
・上記のDR4構築体α鎖(配列番号:16)
・hCLIPmutを伴うDR4構築体β鎖(配列番号:20)、シグナルペプチド、直後のStrep-タグ(太字及び二重下線付き)、及び変異したhCLIPペプチド(イタリック及び下線)、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位(太字及び点線)、DRB*0401細胞外領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、cJunドメイン(太字及び下線付き)、及びHis-タグ(イタリック)を含む配列:
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3)Aq-rCII構築体:
・Aq構築体α鎖(配列番号:21)、シグナルペプチド、後続のAq細胞外α鎖領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、cFosドメイン(太字及び下線付き)、及びビオチン化部位(BirA、イタリック及び下線付き)を含む配列:
MKLCILLAVVAFVGLSLGEDDIEADHVGFYGIVVYQSPGDIGQYTHEFDGDEWFYVDLDKKETVWMLPEFGQLTSFDPQGGLQNIATGKHNLGGWTKRSNFTPATNEAPQATVFPKSPVLLGQPNTLICFVDNIFPPVINITWLRNSKSVTDGVYETSFLVNRDHSFHKLSYLTFIPSDDDIYDCKVEHWGLDEPVLKHWEPEIPATMSELTETVSGGGENLYFQGGGGSLTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGGGSGLNDIFEAQKIEWHE
・ラットCII259-273ペプチドを伴うAq構築体β鎖(配列番号:22)、シグナルペプチド、直後のStrep-タグ(太字及び二重下線付き)、及びCIIペプチド259-273(イタリック及び下線)、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位(太字及び点線)、Aq細胞外領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、cJunドメイン(太字及び下線付き)、及びHis-タグ(イタリック)を含む配列:
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGETSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHHHHHHH
・His-タグを伴わずラットCII259-273ペプチドを伴うAq構築体β鎖(配列番号:23)、シグナルペプチド、直後のStrep-タグ(太字及び二重下線付き)、及びCIIペプチド259-273(イタリック及び下線)、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位(太字及び点線)、Aq細胞外領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、及びcJunドメイン(太字及び下線付き)を含む配列:
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGETSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
4)Aq-mCLIPmt構築体:
・上記のAq構築体α鎖(配列番号:21)
・mCLIPペプチドを伴うAq構築体β鎖(配列番号:24)、シグナルペプチド、直後のStrep-タグ(太字及び二重下線付き)、及びmCLIPmtペプチド(イタリック及び下線)、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位(太字及び点線)、Aq細胞外領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、cJunドメイン(太字及び下線付き)、及びHis-タグ(イタリック)を含む配列:
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKPVSQARMATPLLMRPSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHHHHHHH
・His-タグを伴わずmCLIPペプチドを伴うAq構築体β鎖(配列番号:25)、シグナルペプチド、直後のStrep-タグ(太字及び二重下線付き)、及びmCLIPmtペプチド(イタリック及び下線)、各部位でグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位(太字及び点線)、Aq細胞外領域(下線付き)、TEV切断部位(太字)、cJunドメイン(太字及び下線付き)を含む配列:
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKPVSQARMATPLLMRPSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
本明細書に開示された構築体の個々のエレメントの更なるアミノ酸配列を、以下に提供している:
・cFosドメイン(配列番号:26):LTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH
・cJunドメイン(配列番号:27):RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
・修飾されたヒトCLIP-ペプチド(配列番号:28):PVSKARMATGALAQA
・ラットCII-ペプチド259-273(配列番号:29):GIAGFKGEQGPKGET
・ストレプトアビジン-タグ(配列番号:30):SAWSHPQFEK。
本発明に従う使用のためのHLA-DR/CIIペプチド複合体は、β鎖又はα鎖の細胞外部分のN-端側に融合されたCIIペプチドにより、インビボにおいて(すなわち、哺乳類細胞株内で)、あるいは代わりにβ鎖又はα鎖の細胞外部分のN-端側へ融合された代理ペプチドにより、及びその後の代理ペプチドの切断及びCIIペプチドの負荷により、調製されてよい。CIIペプチドが、哺乳類細胞において、HLA-DRタンパク質と一緒に発現されるならば、生成に使用される哺乳類細胞に応じて、CIIペプチドは、翻訳後修飾されるか又は未修飾であってよい。CIIペプチドがHLA-DRタンパク質に負荷される場合、CIIペプチドは、インビトロにおいて合成的又は酵素的に調製され、並びに未修飾及び/又は翻訳後修飾されたCIIペプチドとして複合体上に負荷されてよい。
被験物質及び製剤
Aq/galCII又はDR4/galCII(合成Gal-ペプチド:GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEPが負荷された)及びAq/nCII又はDR4/nCII(未修飾のペプチド:GIAGFKGEQGPKGEP;配列番号:13が負荷された):Aq-mCLIPmtタンパク質は、一過性トランスフェクションにより、HEK293細胞株(Expi293F細胞、Gibco、カタログ番号A14527)又はCHO細胞において発現させ(図4)、His-タグを使用する固定された金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の組合せを用いて精製した。その後、共有結合したプレ-ペプチドを、トロンビン切断、及び過剰なGal-ペプチド又は未修飾ペプチドの付加により置き換えた。最後に、SECを行い、切断されたプレ-ペプチド及び過剰なGal-ペプチド又は未修飾ペプチドを除去した。Gal-ペプチド:GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP)は、論文Diogo, D.ら、 Curr Opin Rheumatol. 2014; 26: 85-92;Gregersen PKら、Arthritis Rheum. 1987;30:1205-1213;Duke Oら、Clin Exp Immunol. 1982;49:22-30に記載されたように、合成し、精製し、且つ特徴決定した。
雄のQBマウス(B10.Q×BALB/c、n=9)F1、12~16週齢を、この実験において使用した。B10.Qマウスの樹立系統は、J. Klein(テュービンゲン, 独国)により当初提供され、及びBALB/cマウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。全てのマウスは、Medical Inflammation Research(Karolinska Institute)の動物施設において繁殖させ且つ飼育した。使用した全ての動物は、標準齧歯類餌を摂食させ、水は自在に摂取させた。実験バイアスを最小化するために、異なる実験群を、一緒に飼育した。地域の倫理委員会は、全ての動物実験を承認した(Stockholms Norra Djurforsoksetiska Namnd、ストックホルム、スウェーデン)。全てのインビボ関節炎実験は、倫理に関する番号N213/14及びN35/16により対象とされた。動物の麻酔は、イソフルラン吸入により達成させたのに対し、屠殺は、CO2により行った。
ラットII型コラーゲン(rCII)は、論文Chavele KM及びEhrenstein MR、FEBS Lett. 2011;585:3603-10に記載されたように、Swarm軟骨肉腫(Swarmラット軟骨肉腫、SRC)から、限定されたペプシン消化、及び更なる精製により、調製した。調製したrCIIは、使用時まで4℃で貯蔵した。コラーゲン-誘導関節炎(CIA)を誘導するために、各マウスに、CFA(Difco)中に1:1で乳化したrCIIの100μgを総容積100μlで、尾の根元に、注射した。35日後、マウスに、IFA(Difco)中に1:1で乳化したラットCIIの50μgを総容積50μlで、ブースター注射した。臨床的関節炎の発症は、各脚中の炎症関節の数を基に、動物の目視によるスコア化により行い、これは免疫処置後2週間に開始し、実験終了時まで続けた。1匹のマウスにつき最大60のスコアになるよう各脚について1~15の範囲である、論文Klareskog Lら、Annu Rev Immunol. 2008;26:651-75に記載された拡大されたスコア化プロトコールを、使用した。マウスは、免疫処置後90日間にわたり、1週間に2~4回検査した。
様々な量の天然にグリコシル化されたAq/rCII(n=9)又はPBS(対照群、n=9)のいずれかを拡散するALZETマイクロ-浸透圧ポンプを、免疫処置後7日目に、QBマウスの皮下に埋め込んだ。外科的埋め込み手技時には、無菌技術を使用した。皮下留置のために、肩甲骨の間の皮膚に小さい切開を作製し、小さいポケットを形成し、切開から離れた流量モデレーターポインティングを備えるポンプを、ポケットに挿入した。皮膚の切開を、創傷クリップを用いて閉鎖した。
ラットCII/CFA(rCII)により予備免疫処置したQBマウスには、免疫処置後8日目に、左耳へ、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に溶解したrCIIの10μgを、皮内注射した。対照のために、右耳に、溶媒を注射し、且つ耳の膨潤を、動物の治療について盲検化された治験責任医師が、キャリパーを使用し、24時間後に測定した。治療は、rCIIによる免疫処置後4日目に埋め込まれた浸透圧ポンプを用い、Aq/ペプチド複合体100μgの24時間適用により行った。群:Aq/mCLIPmt(n=6)、His-タグを伴う(His、n=5)及び伴わない(w/oHis、n=5)Aq/galCII。
MHCII/ペプチド複合体を、無菌PBS中に希釈し、且つ4℃で一晩のインキュベーションによりプレート上にコーティングするか、又はT細胞ハイブリドーマへ可溶性型で直接添加した。次にMHCII/ペプチド複合体でコーティングされたプレートを、無菌PBSで2回洗浄し、未結合の複合体を除去し、並びに1個のウェルにつき、5%FCS、100IU/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEMの200μl中の5×104個T-ハイブリドーマ細胞を添加した。T細胞ハイブリドーマ3H8並びに各々GalOK264及び未修飾CII259-273(K264)に特異的なmDR1.1を、使用した。24時間後、培養上清中のIL-2又はIL-10(一部の実験において)を、サンドイッチELISA(BioLegend)により測定した。マウスrIL-2又はrI-10は各々、陽性対照及び標準として利用した。
MHCII/ペプチド四量体複合体は、PE-標識したストレプトアビジン及びAPC-標識したストレプトアビジン(Biolegend)の組換えタンパク質へのモル比1:4での添加、及び+4℃で1時間のインキュベーションにより、新たに調製した。ペプチド-特異性Tリンパ球を同定するために、細胞を、DR4/ペプチド四量体複合体(20μg/ml)と共に、小型-分子タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である50nMダサチニブの存在下、+37℃で1時間インキュベーションし、引き続き細胞表面マーカーについて染色した。生存度染色溶液(Zombie NIR; Biolegend)を、分析から死滅細胞を排除するために捕捉する直前に添加した。試料を、FacsDiVaソフトウェア(BD Biosciences)を使用し、LSR Fortessaフローサイトメーターを使用することにより捕捉し、データはFlowJoソフトウェア(v10, FlowJo LLC)により解析した。
PBMCを解凍し、TexMACS(Biolegend)中、1.5×106個細胞/ウェルで一晩安置した。細胞を、抗-CD28抗体1μg/ml(BioLegend)と一緒にした各ペプチド変種GIAGFKGEQGPKGEP(配列番号:13)及びGIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP)の濃度50μg/mlにより、7時間刺激した。陽性対照及びCD154アッセイ感度の決定のために、ブドウ球菌性エンテロトキシンB(SEB)を1μg/ml(Sigma-Aldrich)で、個別の培養物に添加した。刺激後、細胞を、LIVE/DEAD識別マーカー(BioLegend)により処理し、その後ポジティブゲーティングに関してCD3及びCD4の表面発現について、並びにB細胞の排除に関してCD19について染色した。バックグラウンドレベルを、刺激していない細胞(抗-CD28抗体で処理)により決定し、更にCII-刺激した培養物から減算した。試料を、FacsDiVaソフトウェア(BD Biosciences)を使用し、LSR Fortessaフローサイトメーターを使用することにより捕捉し、データはFlowJoソフトウェア(v10, FlowJo LLC)により解析した。
インビトロアッセイを行い、数日間の延長されたインキュベーション期間にわたるDR4/CII-モノマーにより刺激時の、制御性T細胞機能の誘導/分化、例えばTr1表現型関連サイトカインIL-10のアップレギュレーションを分析した。従ってPBMCを、密度勾配遠心分離により単離し、TexMACS(MiltenyiBiotec, カタログ番号130-097-196)中の1.2×106個細胞/mLの細胞を、1μg/mL抗-CD3抗体(Biolegend、カタログ番号317304)及び100ng/mLのIL-27(Peprotech、カタログ番号200-38B)(陽性対照、Tr1)、3.6μg/mLのDR4/nCII、3.6μg/mLのDR4/galCII、3.6μg/mLのDR4/hCIIにより、8日間刺激するか、又は刺激せずに放置した(陰性対照、w/o)。刺激は、2つ組で行った。8日目に、培養上清を収集し、製造業者のプロトコールに従い、マルチプレックスビーズ-ベースのLEGENDplex(商標)アッセイにおいてヒトサイトカインの検出のための特注のパネルを使用し、放出されたサイトカインについて分析した。
実施例1:HEK293細胞における機能活性Aq/rCIIの生成
先行する実験において、合成ガラクトシル化されたCII259-273ペプチドが負荷されたAq分子の2回の静脈内注射は、マウスを、関節炎の発症から保護することができることは証明されている。しかし、ガラクトシル化されたCII259-273の合成は、時間と経費の両方がかかる。加えて、この合成ペプチドの組換えMHCクラスII分子への負荷は、些細なことではなく、且つ費用効果も悪い。従って、インサイチュにおける水酸化その後のガラクトシル化によりCII-ペプチドの264位でのリジン側鎖の適切な翻訳後修飾を保証する、宿主細胞においてMHCII鎖の1本に融合された共有結合されたCII259-273ペプチドを含むMHCII分子(図1)の一工程生成を可能にする、生合成プロセスを確立することは、意味のある利点であろう。しかし、翻訳後コラーゲンペプチド修飾は、それぞれの酵素活性、すなわち、リジン水酸化酵素活性及びコラーゲンβガラクトシル基転移酵素活性の存在に左右される。例えば、大腸菌-産生したタンパク質は通常そのような修飾を示さず、並びに一部の昆虫細胞は、リジン残基を水酸化する能力を有する一方で、これらはヒドロキシリジンのO-結合型グリコシル化を含むCII-ペプチドを産生しない。更に、必要とする酵素活性を提供する宿主細胞は実際に、非-コラーゲン性MHCIIタンパク質配列のフレーム内のCII-ペプチドの選択的アミノ酸位置での必要とされる修飾を提供することが可能であるかどうかは不明であった。
アジュバント中のCIIにより免疫処置されたマウスは、3種の異なる量のHEK293-生成したAq-rCII(259-273)複合体を負荷した浸透圧ポンプを、7日後(初回免疫の35日後に追加免疫した後)、及び関節炎の発症後、埋め込んだ。陰性対照として、マウスには、PBSのみを負荷したポンプを埋め込んだ。図3Aに示したように、Aq-rCII(259-273)複合体は、投与量に依存した様式で、保護をもたらし、並びに最高量のAq-rCII(259-273)複合体(100μg)により治療されたマウスは、関節炎の発症から完全に保護された。中間量のAq-rCII(259-273)複合体(50μg)で治療されたマウスは、若干の保護を示したのに対し、最低量(10μg)の治療は、頻繁に関節炎を生じ、これはPBS-治療した対照と同等であった。
本発明者らは、宿主細胞のインサイチュグリコシル化機構を使用し、機能性マウスMHCII/CII複合体(Aq/rCII)を、HEK293細胞において調製することができることを証明した。本発明者らは次に、ヒトMHCII/CII複合体は、その細胞のインサイチュグリコシル化機構を使用し、HEK293細胞において調製することができるかどうかを調べた。これらの複合体は、HEK293細胞において先に説明したように調製した。対照複合体は、CHO細胞において発現され、並びに未修飾ペプチド(DR4/nCII)又はガラクトシル化されたペプチド(DR4/galCII)が負荷された。2つの活性化拘束性ヒトT細胞ハイブリドーマ(3H8:未修飾のCII-エピトープ、mDR1.1:ガラクトシル化されたCII-エピトープ)を使用し、未修飾ペプチド又はガラクトシル化されたペプチドのいずれかを負荷されたDR4/ペプチド複合体と比べ、天然にグリコシル化されたDR4/ペプチド複合体(DR4/hCII)のガラクトシル化状態をチェックした。図4Aに示したように、T細胞ハイブリドーマmDR1.1は、DR4/galCII複合体による刺激時に活性化を獲得したのに対し、DR4/nCIIによる刺激は、ほぼ陰性であり続けた。DR4/galCII及びDR4/nCIIとの比較において、DR4/共有結合したCII(DR4/hCII)は、ガラクトシル化状態に関して、異質性の生成物である。これは、DR4/hCII複合体を含有する組成物は、264位にガラクトシル化された及び未修飾のリジン残基を持つペプチドを含むことを意味する。DR4/hCIIで刺激された細胞の活性化レベルは、DR4/galCII複合体と比べわずかに低く、DR4/nCII複合体に非常に類似している(図4B、3H8細胞を使用)。
この目的は、RA患者及び健常ドナーの末梢血(PBMC)中の抗原特異性T細胞を直接検出する四量体ベースの方法を確立することであった。従って、ビオチン化されたDR4/CIIペプチド複合体を、ストレプトアビジン-PE又はストレプトアビジン-APCのいずれかと共にインキュベーションした。四量体の非特異的結合を減少するために、2種の蛍光色素による二重四量体染色を行った。DR4/galCII四量体を使用し抗原特異性T細胞(CII259-273、K264gal)を、RA-患者、並びに健常ドナーにおいて検出した(図5A)。更に、未修飾のCIIペプチドに対し特異性を持つT細胞を、DR4/nCII四量体を用いて検出することができる(図5B)。抗原特異性T細胞の平均頻度は、天然にグリコシル化されたDR4/hCII四量体を使用すると、DR4/galCII四量体又はDR4/nCII四量体と比べ、より高かった(図5B)。末梢血中の抗原-特異性T細胞の頻度は極めて低い(0.01~0,1%)ので、観察された数は、予想された通りである。
8日間の延長されたインキュベーション期間にわたるDR4/CII-モノマーによる刺激時の、制御性T細胞機能の誘導/分化、例えばTr1表現型関連サイトカインIL-10のアップレギュレーションを調べるために、インビトロ試験を行った。従って、遺伝子型判定されたHLA-DRB1*0401陽性RA患者から単離されたPBMCを、Tr1細胞誘導条件下、抗-CD3及びIL-27抗体で(陽性対照、Tr1)、DR4/nCII(3.6μg/mL)で、DR4/galCII(3.6μg/mL)で、又は刺激なし(陰性対照、K1)のいずれかで、8日間刺激した。刺激は、2つ組で行った。8日目に、培養上清を収集し、製造業者のプロトコールに従い、マルチプレックスビーズ-ベースのLEGENDplex(商標)アッセイフォーマットにおいてヒトサイトカインに関する特注のパネルを使用し、サイトカイン放出について分析した。図7において示した結果は、DR4/nCII及びDR4/galCIIの、RA患者由来のPBMC中の抗炎症性サイトカインIL-10の放出を誘導する能力、及び従来のTR1誘導条件で8日間インキュベーションした陽性対照と比べて更にわずかに高いレベルを明確に明らかにしている。前炎症性サイトカイン、例えばTNF-α、IL-2、IL-17a、IL-17f、又はIFN-γの増大した誘導に繋がる経路の同時の活性化の証拠は存在しない。
ポリヒスチジン-タグ(His-タグ)、ビオチン化部位、TEV切断部位、トロンビン切断部位及びstrep-タグの、この組換え複合体のT細胞活性化特性への貢献を含む、MHCII/CII複合体に直接的に必須ではない配列は、この構築体から省略することができるかどうかが調べられている。典型的には、DR4/CIIペプチド複合体、並びに抗-CD3抗体(陽性対照)は、標準ハイブリドーマ活性化アッセイにおいて、マイクロタイターウェルのプラスチック表面にコーティングされる。最初の実験において、本発明者らは、IL-2分泌により測定したT-ハイブリドーマ細胞(3H8)に対する活性化に対する、His-タグのタンパク質分解性の切断の作用を調べるために、マイクロタイターウェルにコーティングされた非切断のDR4/hCIIペプチド複合体と比べて、DR4/nCIIペプチド複合体の内部TEV-切断部位を使用した。タンパク質分解性切断の有効性は、ウェスタンブロット分析により管理した。更に切断及び非切断の複合体の等モル溶液を使用するマイクロタイターウェルの同等のコーティング有効性を、DR4-特異的抗体及びペルオキシダーゼ-結合した二次抗体を使用するELISAにより確認した(図8)。これはまた、この複合体は、解離せず、且つヘテロ二量体として存在することを確認している。本発明者らのデータは、Tハイブリドーマ細胞のTCRにより認識されたDR4/nCII複合体の機能ドメインは、プラスチック表面に対する類似の有効性でコーティングされるが、Tハイブリドーマ細胞の活性化において、切断された構築体の強力な低下を示している(図8)。ジッパー切断は、この複合体の解離に繋がる高い可能性がある。ジッパーは、生合成プロセス時のこの複合体の形成に、主に必要とされるのに対し、形成されたMHCII-ペプチド-複合体それ自身は、両鎖の可変領域により形成された結合溝に結合したペプチドの安定化作用のために、少なくともインビトロにおいてかなり安定している。
組換えDR4-複合体の結合溝中のペプチドのCII配列の翻訳後修飾は、異なる酵素によるいくつかの逐次工程に関与している。これらのコラーゲン-特異的翻訳後修飾は、264位及び270位のリジン残基に優先的に影響を及ぼす。最初の工程は、リジン水酸化酵素により媒介されたリジン水酸化であり、それに続けてガラクトシル基転移酵素により媒介される水酸化されたリジンへのガラクトシル転移である。更に、単独のグルコース残基が、ガラクトシル化されたヒドロキシリジンへ付加されてよい。これらの工程は全て、HEK細胞においてなど、コラーゲンの翻訳後機構により、細胞内で生合成プロセス時に起こり、これによりインビボにおいて軟骨中の天然のECM-タンパク質と同等の異質性組換え生成物に繋がる。ヒトにおいて、この混合物は、免疫が媒介した関節疾患を抑制するために、IL-10などの抗炎症性メディエーターを産生する制御性細胞への調節に関する全レパトアから動員することができる可能性のあるT細胞のスペクトルを増大する目的のために恐らく利点があるであろう。ガラクトシル化されたCII(DR4/galCII)又は未修飾CII(DR4/nCII)のいずれかのペプチドを含む組換えDR4/CII複合体に対する反応における、RA患者の末梢血由来のT細胞のIL-2及びIL-10反応のインビトロ活性化に関する研究は、この方向での実験的裏付けを提供する。しかし、HEK細胞において生成されたCR4/hCIIのいくつかのバッチの質量分析は、かなりの量の組換えタンパク質が、両方のリジン残基に高度な二糖(Glc-Gal-Hyl)含量を示すことを明らかにし(図13)、これは恐らく、それによりTCR認識が妨害される、嵩高な糖構造によるペプチド結合溝の占拠に起因したTCR認識の欠点であろう。
先に示したように、DR4/nCII複合体中のHis-タグは、T細胞に対しペプチド結合溝を露出している多量体化されたアラインメント中の表面上のこの複合体の正確な配向を可能にするように見え、並びにHis-タグの有益な作用は、DTHモデルでインビボにおいて確認されている。従って本発明者らは、類似の作用を媒介する代替タグについて探索した。この探索に関する基本的な考察は、この構築体中で使用した6×His-配列は、非天然構造であることであり、従って本発明者らは、免疫-調節性MHCII/CIIペプチド複合体においてHis-タグと置き換わることができるヒト自己-タンパク質における配列を探索した。従って、機能的に等効力の自己-構造によるHis-タグ置き換えは、可能性のある免疫原性の低下を目的としている。中でも、機能的に関連のある塩基性アミノ酸残基の比較的高い含有量及び自己免疫認識を恐らく減らす進化で保存された構造を持つ候補となる自己-タンパク質は、ヒストンファミリーのタンパク質であった。
配列番号:1 AGFKGEQGPKG
配列番号:2 AGFKGEQGPXG
配列番号:3 AGFKGEX2GPKG
配列番号:4 AGFKGX3QGPKG
配列番号:5 AGFKX4EQGPKG
配列番号:6 AGFKGEX2GPX1G
配列番号:7 AGFKGX3QGPX1G
配列番号:8 AGFKX4EQGPX1G
配列番号:9 AGFKGEQGPRG
配列番号:10 AGFKGEQGPKGEP
配列番号:11 AGFKGEQGPX1GEP
配列番号:12 AGFKGEQGPRGEP
配列番号:13 GIAGFKGEQGPKGEP
配列番号:14 GIAGFKGEQGPX1GEP
配列番号:15 GIAGFKGEQGPRGEP
配列番号:16 DR4構築体α鎖
配列番号:17 hCII259-273ペプチドを伴うDR4構築体β鎖
配列番号:18 最小DR4構築体α鎖
配列番号:19 hCII259-273ペプチドを伴う最小DR4構築体β鎖
配列番号:20 hCLIPmutを伴うDR4構築体β鎖
配列番号:21 Aq構築体α鎖
配列番号:22 ラットCII259-273ペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号:23 His-タグを持たないラットCII259-273ペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号:24 mCLIPペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号:25 His-タグを持たないmCLIPペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号:26 cFosドメイン
配列番号:27 cJuneドメイン
配列番号:28 修飾されたヒトCLIP-ペプチド
配列番号:29 ラットCII-ペプチド259-273
配列番号:30 ストレプトアビジン-タグ
配列番号:31 EKRIWFPYRRF
配列番号:32 YKTNFRRYYRF
配列番号:33 VLIRHFRKRYY
配列番号:34 SGRGKQGGKARAKAKTRSSR
配列番号:35 NHNHNHNHNHNH
配列番号:36 KDHLIHNVHKEEHAHAHNK
配列番号:37 H2A1_ヒト
配列番号:38 H2A1P_マウス
配列番号:39 SAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGEPSGGGS
配列番号:40 H2ACタグ
配列番号:41 6×His
配列番号:42 7×His
Claims (14)
- ヒト患者における慢性炎症性疾患の治療における使用のための、
(a)少なくともα1ドメインを含む、HLA-DRα鎖の細胞外領域;
(b)少なくともβ1ドメインを含む、HLA-DRβ鎖の細胞外領域;及び、
(c)コラーゲンIIペプチド(CIIペプチド)、当該CIIペプチドは、任意で、リンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖の、好ましくはHLA-DRβ鎖のN-端側へ融合される:
を含む、組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体を含有する組成物であって;
ここでCIIペプチドが、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに、
ここでHLA-DR/CIIペプチド複合体が、HLA-DRα鎖及び/又はHLA-DRβ鎖を含むポリペプチドのC-末端にコンドロイチン-結合ペプチドを含む、組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体を含有する組成物。 - (a)コンドロイチン-結合ペプチドが、その遊離型であり;
(b)組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体が、その組成物中のコンドロイチン-結合ペプチドを介して多量体化されず;及び/又は、
(c)組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体が、その組成物中のコンドロイチン-結合ペプチドを介して更なる分子に結合されていない:請求項1記載の組成物。 - (a)HLA-DRα鎖の細胞外領域が、α1及びα2ドメインを含み;並びに/又は、
(b)HLA-DRβ鎖の細胞外領域が、β1及びβ2ドメインを含む:請求項1又は2記載の組成物。 - 前記CIIペプチドが、リンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖、好ましくはHLA-DRβ鎖のN-端側へ融合されている、請求項1~3のいずれか一項記載の組成物。
- 前述の少なくともα1ドメインが、DRA*0101に由来し、並びに少なくともβ1ドメインが、DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0101、DRB1*0102、DRB1*1001、DRB1*1402及びDRB1*1303からなる群から選択されるHLA-DRアレルに、好ましくはDRB1*0401に由来する、請求項1~4のいずれか一項記載の組成物。
- 前記CIIペプチドが、AGFKGEQGPKG、好ましくはAGFKGEQGPKGEP、より好ましくはGIAGFKGEQGPKGEPのアミノ酸配列を含む、請求項1~5のいずれか一項記載の組成物。
- 前記コンドロイチン-結合ペプチドが、5~20個のアミノ酸、好ましくは6~12個のアミノ酸を含む、請求項1~6のいずれか一項記載の組成物。
- 前記コンドロイチン-結合ペプチドが、ポリヒスチジンタグ、好ましくは少なくともヘキサヒスチジンタグである、請求項1~7のいずれか一項記載の組成物。
- (a)少なくともα1ドメインを含むHLA-DRα鎖の細胞外領域;及び
(b)少なくともβ1ドメインを含むHLA-DRβ鎖の細胞外領域が、単独の融合ポリペプチドとして発現され;並びに、任意に
(c)コラーゲンIIペプチド(CIIペプチド)が、リンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖の、好ましくはHLA-DRβ鎖のN-端側へ融合されている、請求項1~8のいずれか一項記載の組成物。 - (a)少なくともα1ドメインを含むHLA-DRα鎖の細胞外領域を含む第一のポリペプチド;
(b)少なくともβ1ドメインを含むHLA-DRβ鎖の細胞外領域を含む第二のポリペプチド;
(c)コラーゲンIIペプチド(CIIペプチド)、当該CIIペプチドは、任意で、リンカーペプチドにより、HLA-DRα鎖又はHLA-DRβ鎖、好ましくはHLA-DRβ鎖のN-端側へ融合される;並びに
(d)ここでHLA-DRα鎖が、そのC-末端で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第一の機能ドメインへ融合され、及びHLA-DRβ鎖が、そのC-末端で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第二の相補的機能ドメインへ融合されている、請求項1~8のいずれか一項記載の組成物。 - 前記第一の機能ドメイン及び第二の相補的機能ドメインが:
(a)酸性及び塩基性ロイシンジッパーヘテロ二量体化ドメイン;並びに/又は
(b)jun-fosロイシンジッパーモチーフ:である、請求項10記載の組成物。 - 前記組換えHLA-DR/CIIペプチド複合体が、未修飾及び/又は1もしくは複数の翻訳後修飾されたリジン残基(複数可)を伴うCIIペプチドを含み、好ましくはここで
(a)CIIペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うCIIペプチドからなるか;
(b)CIIペプチドは、ヒドロキシリジン(Hyl)である第一のリジンを伴うCIIペプチドからなるか;
(c)CIIペプチドは、ガラクトシル-ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うCIIペプチドからなるか;
(d)CIIペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うCIIペプチド、及びガラクトシル-ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うCIIペプチドからなるか;
(e)CIIペプチドは、ガラクトシル-ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うCIIペプチドを含むか;
(f)CIIペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うCIIペプチド、及びガラクトシル-ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うCIIペプチドを含むか;
(g)CIIペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うCIIペプチド、並びにガラクトシル-ヒドロキシリジン及び/又はヒドロキシリジン(Hyl)である第一のリジンを伴うCIIペプチドを含むか;あるいは
(h)CIIペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うCIIペプチド、並びにO-グリコシル化されたヒドロキシリジン及び/又はヒドロキシリジン(Hyl)である第一のリジンを伴うCIIペプチドを含み;並びに
ここで、翻訳後修飾されたCIIペプチドにおける任意の第二のリジンは、未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース-ヒドロキシリジン及び/又はグルコシル-ガラクトシル-ヒドロキシリジン;好ましくは未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース-ヒドロキシリジン、より好ましくは未修飾である、請求項1~11のいずれか一項記載の組成物。 - 前記組成物が、グルコシル-ガラクトシル-ヒドロキシリジン修飾を伴うCIIペプチドを含むHLA-DR/CIIペプチド複合体を含まない、請求項12記載の組成物。
- 前記慢性炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、X線基準を満たさない体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、再発性多発性軟骨炎、全身性紅斑性狼瘡、ライム病、メニエール病、内耳自己免疫病(AIED)、又はスチル病である、請求項1~13のいずれか一項記載の組成物。
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