CN115916831A

CN115916831A - 包含抗lag-3抗体和il-2的融合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN115916831A
Application number: CN202180046803.9A
Authority: CN
Inventors: 张明浩; 曹英圭; 吴永珉; 沈艺仁
Original assignee: Gi Medical Micro New
Current assignee: Gi Medical Micro New
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-04-04
Also published as: EP4174088A1; KR20220002160A; KR102313505B1; EP4174088A4; TW202208437A; WO2022005174A1; US20230257438A1; TWI800861B; JP2023531876A

Abstract

本发明涉及包含抗LAG‑3抗体和IL‑2或其变体的融合蛋白。在本发明所述的融合蛋白中，抗LAG‑3抗体部分结合LAG‑3以控制LAG‑3和MHCII的结合。此外，所述IL‑2蛋白或其变体可控制T细胞的活性。因此，包含所述融合蛋白的药物组合物可增加体内的免疫活性，因而可用作抗癌药物，并且很有可能在工业规模上被使用。

Description

包含抗LAG-3抗体和IL-2的融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及包含抗LAG-3抗体和IL-2的融合蛋白及其用途。具体地，本发明涉及一种具有治疗或预防癌症功效的新型融合蛋白。

背景技术

癌症免疫疗法是一种利用体内免疫反应来治疗癌症的方法。癌症免疫疗法可以通过靶向抗原(如癌细胞的表面蛋白)来诱导免疫系统攻击癌细胞。特别是，据报道，可以通过阻断免疫检查点途径来激活抗癌免疫。免疫检查点是肿瘤细胞引起免疫规避的主要机制之一。因此，抑制或阻断免疫检查点可以增加T细胞的活化，从而增强抗肿瘤免疫。

同时，IL-2主要由活化的T细胞合成，特别是CD4+辅助T细胞。IL-2刺激T细胞的增殖和分化，并诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和外周血淋巴细胞分化为细胞毒性细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)。

然而，IL-2在免疫应答中具有双重功能，因为它不仅对介导免疫细胞数量的增加及其活性很重要，而且对维持免疫耐受也很重要。此外，据报道，IL-2可能不是抑制肿瘤生长的最佳选择。原因是在IL-2的存在下，所产生的细胞毒性T淋巴细胞中可能发生活化诱导的细胞死亡(AICD)，并且IL-2依赖的调节性T细胞(Treg)可能抑制免疫应答(Imai et al.,Cancer Sci 98,416 to 423,2007)。

同时，已知LAG-3具有与PD-1相似的机制。LAG-3是一种在T细胞和NK细胞中表达的免疫检查点抑制剂，具有与CD4相似的结构。然而，LAG-3在D1结构域中有30个附加的氨基酸，因此已知它与MHC II类(MHCII)具有高亲和力。

发明内容

技术问题

因此，本发明人研究开发了一种具有新组合的融合蛋白，它能增强免疫细胞的活性。结果，本发明人证实了包含抗LAG-3抗体和IL-2变体的融合蛋白能有效地调节免疫细胞。基于该结果，本发明人确认了所述融合蛋白作为抗癌剂是有效的，从而完成了本发明。

问题的解决方案

为了实现上述目的，在本发明的一个方面，提供了一种融合蛋白，其包含特异性结合LAG-3的抗体和IL-2蛋白或其变体。

在本发明的另一个方面，提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表达载体，以及已导入所述表达载体的转化细胞。

在本发明的另一个方面，提供了一种制备融合蛋白的方法，所述方法包括培养所转化的细胞和收集融合蛋白。

在本发明的另一个方面，提供了所述融合蛋白及其医学用途。

在本发明的又一个方面，提供了所述融合蛋白用于治疗或预防癌症的用途。

在本发明的又一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用所述融合蛋白。

在本发明的又一个方面，提供了所述融合蛋白在制造治疗或预防癌症的药物中的用途。

发明的效果

本发明所述的包含抗LAG-3抗体和IL-2变体的融合蛋白，不仅可以调节与LAG-3相关的机制，而且还具有与IL-2相同或相似的功能。也就是说，所述融合蛋白不仅能调节LAG-3和MHCII的结合，还能激活免疫细胞。因此，所述融合蛋白可以作为一种抗癌剂使用。

附图说明

图1示出了作为一个实施方案的抗hLAG-3抗体-hIgG4 Fc-hIL-2v2融合蛋白(GI-104E1)的结构。

图2示出了作为一个实施方案的抗hLAG-3抗体-hIgG4 Fc-hIL-2v3融合蛋白(GI-104E2)的结构。

图3为产生GI-104E1并随后通过SDS-PAGE确认的图。

图4为产生GI-104E2并随后通过SDS-PAGE确认的图。

图5为产生GI-104E1并随后通过western blot确认的图。

图6为产生GI-104E2并随后通过western blot确认的图。

图7示出了融合蛋白GI-104E1或GI-104E2的作用机制和实验方法。

图8为用LAG-3阻断实验验证GI-104E1是否与LAG-3结合并抑制LAG-3-MHCII介导的信号传递的图。

图9为用LAG-3阻断实验验证GI-104E2是否与LAG-3结合并抑制LAG-3-MHCII介导的信号传递的图。

图10为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v2、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v2的组合以及包含抗LAG-3抗体和IL-2v2的融合蛋白(GI-104E1)，每周一次，持续三周后观察到的肿瘤体积的图。

图11为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v2、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v2的组合以及包含抗LAG-3和IL-2v2的融合蛋白(GI-104E1)后受试者的肿瘤体积的图。

图12为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用载体(PBS)组的受试者的肿瘤体积的图。

图13为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用抗LAG-3抗体组的受试者的肿瘤体积的图。

图14为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用Fc-IL-2v2组的受试者的肿瘤体积的图。

图15为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠联合施用抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v2组的受试者的肿瘤体积的图。

图16为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用包含抗LAG-3和IL-2v2的融合蛋白(GI-104E1)组的受试者的肿瘤体积的图。

图17为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v2、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v2的组合，以及包含抗LAG-3和IL-2v2的融合蛋白(GI-104E1)，每周一次，持续三周后，以及第一次施用32天后，基于施用载体(PBS)组的平均肿瘤体积生长，各组肿瘤生长抑制率具有30％或更高，50％或更高，以及80％或更高的受试者数量的图。

图18为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v2、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v2的组合以及包含抗LAG-3和IL-2v2的融合蛋白(GI-104E1)，每周一次，持续三周后观察到的存活概率的图。

图19为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v3、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v3的组合以及包含抗LAG-3和IL-2v3的融合蛋白(GI-104E2)，每周一次，持续三周后观察到的肿瘤体积的图。

图20为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v3、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v3的组合以及包含抗LAG-3和IL-2v3的融合蛋白(GI-104E2)后，各施用组受试者的肿瘤体积的图。

图21为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用载体(PBS)组的受试者的肿瘤体积的图。

图22为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用抗LAG-3抗体组的受试者的肿瘤体积的图。

图23为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用Fc-IL-2v3组的受试者的肿瘤体积的图。

图24为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠联合施用抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v3组合的组的受试者的肿瘤体积的图。

图25为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠施用包含抗LAG-3和IL-2v3的融合蛋白(GI-104E2)组的受试者的肿瘤体积的图。

图26为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v3、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v3的组合，以及包含抗LAG-3和IL-2v3的融合蛋白(GI-104E2)，每周一次，持续三周后，以及第一次施用32天后，基于施用载体(PBS)组的平均肿瘤体积生长，各组肿瘤生长抑制率具有30％或更高，50％或更高，以及80％或更高)的受试者数量的图。

图27为示出对皮下移植CT26癌细胞的小鼠分别施用载体(PBS)、抗LAG-3抗体、Fc-IL-2v3、抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v3的组合以及包含抗LAG-3和IL-2v3的融合蛋白(GI-104E2)，每周一次，持续三周后观察到的存活概率的图。

具体实施方式

包含抗LAG-3抗体和IL-2的融合蛋白

在本发明的一个方面，提供了一种融合蛋白，其包含特异性结合LAG-3的抗体和IL-2蛋白。

在此，所述融合蛋白可以是至少一个IL-2蛋白与抗LAG-3抗体连接的形式。在一个实施方案中，所述融合蛋白可包含一个或两个IL-2蛋白或其变体。在此，抗LAG-3抗体和IL-2可以通过连接子相互连接。

如本文所用，术语“LAG-3，指CD223或淋巴细胞激活基因3。所述蛋白由LAG-3基因编码。已知LAG-3具有与PD-1相似的机制。此外，LAG-3为一种在T细胞和NK细胞中表达的免疫检查点抑制剂，并具有与CD4相似的结构。然而，LAG-3在D1结构域中有30个附加的氨基酸，因此与MHC II类具有高亲和力。由于这样的结构特征，LAG-3也被认为能抑制T细胞的活化。

本发明中的抗LAG-3抗体为能与LAG-3特异性结合的抗体。此外，所述抗体的片段可以以任何形式使用，只要所述片段含有能与LAG-3特异性结合的抗原结合结构域。在此，抗LAG-3抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3可以分别含有如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。此外，抗LAG-3抗体的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3可以分别含有如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，与LAG-3特异性结合的抗体可以包括含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的重链可变区和含有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。

如本文所用，除非另有说明，术语“IL-2”或“白细胞介素-2”是指从任意脊椎动物来源获得的任意野生型IL-2，包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。IL-2可以从动物细胞中获得，并且还包括从能够产生IL-2的重组细胞中获得。此外，IL-2可以是野生型IL-2或其变体。

在本说明书中，IL-2或其变体可由术语“IL-2蛋白”或“IL-2多肽”来统称。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽和IL-2变体与例如IL-2受体特异性结合。这种特异性结合可以通过本领域技术人员已知的方法来鉴定。

所述IL-2可以是成熟的形式。特别地，成熟的IL-2可以不包含信号序列，并且可能包含野生型IL-2的片段，其中野生型IL-2的N-端或C-端部分被截断。在此，IL-2可以具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。

如本文所用，术语“IL-2变体”是指全长IL-2或上述IL-2片段中的部分氨基酸被替换的形式。也就是说，IL-2变体可以具有不同于野生型IL-2或其片段的氨基酸序列。然而，IL-2变体可能具有与野生型IL-2相当或相似的活性。在此，“IL-2活性”例如可以指与IL-2受体的特异性结合，该特异性结合可以通过本领域技术人员已知的方法来测量。

具体地，IL-2变体可通过替换野生型IL-2中的部分氨基酸获得。通过氨基酸替换获得的IL-2变体的一个实施方案可以通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位、第61位和第72位氨基酸中的至少一个获得。

具体地，IL-2变体可通过用另一个氨基酸替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位、第61位或第72位氨基酸中的至少一个获得。根据一个实施方案，只要这种IL-2变体保持IL-2的活性，就可以替换一个、两个或三个氨基酸。

在一个实施方案中，IL-2变体可以是两个氨基酸被替换的形式。具体来地，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位和第42位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位和第45位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位和第61位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位和第72位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第42位和第45位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第42位和第61位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列中的第42位和第72位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第45位和第61位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第45位和第72位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第61位和第72位氨基酸获得。

此外，IL-2变体可以是三个氨基酸被替换的形式。具体地，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第42位和第45位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第42位和第61位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第42位和第72位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第45位和第61位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第45位和第72位氨基酸获得。在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第38位、第61位和第72位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第42位、第45位和第61位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第42位、第45位和第72位氨基酸获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的第45位、第61位和第72位氨基酸获得。

在此，由替换引入的“另一个氨基酸”可以为选自由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成的组中的任何一种。然而，关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第38位氨基酸不能被精氨酸替换，第42位氨基酸不能被苯丙氨酸替换，第45位氨基酸不能被酪氨酸替换，第61位氨基酸不能被谷氨酸替换，第72位氨基酸不能被亮氨酸替换。

关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第38位氨基酸，精氨酸，可以被精氨酸以外的氨基酸替换。优选地，关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第38位氨基酸，精氨酸，可以被丙氨酸(R38A)替换。

关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第42位氨基酸，苯丙氨酸，可以被苯丙氨酸以外的氨基酸替换。优选地，关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第42位氨基酸，苯丙氨酸，可以被丙氨酸(F42A)替换。

关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第45位氨基酸，酪氨酸，可以被酪氨酸以外的氨基酸替换。优选地，关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第45位氨基酸，酪氨酸，可以被丙氨酸(Y45A)替换。

关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第61位氨基酸，谷氨酸，可以被谷氨酸以外的氨基酸替换。优选地，关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第61位氨基酸，谷氨酸，可以被精氨酸(E61R)替换。

关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第72位氨基酸，亮氨酸，可以被亮氨酸以外的氨基酸替换。优选地，关于IL-2变体的氨基酸替换，在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中，第72位氨基酸，亮氨酸，可以被甘氨酸(L72G)替换。

具体地，IL-2变体可以通过替换在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中选自由R38A、F42A、Y45A、E61R和L72G组成的组中的至少一个得到。优选地，IL-2变体可以在选自由R38A、F42A、Y45A、E61R和L72G组成的组中的两个或三个位置替换。

IL-2变体可以是两个氨基酸被替换的形式。具体地，IL-2变体可以通过替换R38A和F42A获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换R38A和Y45A获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换R38A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换R38A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换F42A和Y45A获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换F42A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换F42A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换E61R和L72G获得。

此外，IL-2变体可以是三个氨基酸被替换的形式。具体地，IL-2变体可以通过替换R38A、F42A和Y45A获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换R38A、F42A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换R38A、F42A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换R38A、Y45A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换R38A、Y45A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可通过替换F42A、Y45A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换F42A、Y45A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换F42A、E61R和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过替换Y45A、E61R和L72G获得。

在一个实施方案中，IL-2变体可以具有如SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。

此外，IL-2变体的特点在于具有低体内毒性。在此，低体内毒性可能是由IL-2与IL-2受体α链(IL-2Rα)结合引起的副作用。已经开发了多种IL-2变体，以改善IL-2与IL-2Rα结合引起的副作用，并且这种IL-2变体可以如美国专利号5,229,109(US Patent No.5,229,109)和韩国专利号10-1667096(Korean Patent No.10-1667096)中公开的所述。特别是，本申请中描述的IL-2变体对IL-2受体α链(IL-2Rα)的结合能力较低，因此其具有比野生型IL-2更低的体内毒性。

所述融合蛋白可以包括免疫球蛋白Fc区。在此，免疫球蛋白的Fc结构域包括免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)。所述免疫球蛋白可以为IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，优选为IgG4。

此外，免疫球蛋白的Fc结构域可以是Fc结构域变体，以及野生型Fc结构域。此外，如本文所用，术语“Fc结构域变体”可指在糖基化模式方面与野生型F结构域不同，与野生型Fc结构域相比具有高糖基化，或与野生型Fc结构域相比具有低糖基化的形式或去糖基化的形式。此外，其中还包括一个糖基化的(aglycosylated)Fc结构域。Fc结构域或其变体可通过培养条件或对宿主的遗传操作，使其具有调整后的唾液酸、岩藻糖基化或糖基化的数量。

此外，免疫球蛋白的Fc结构域的糖基化可以通过常规方法，例如使用微生物的化学方法、酶法和基因工程方法进行修饰。此外，Fc结构域变体可以是免疫球蛋白、IgG、IgA、IgE、IgD或IgM的各自Fc区域的混合形式。此外，Fc结构域变体可以是Fc结构域的某些氨基酸被其他氨基酸替换的形式。

在一个实施方案中，Fc结构域可以具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

如本发明所述的融合蛋白可以包含融合蛋白，其包括抗LAG-3抗体的轻链可变区和轻链恒定区(CL1)，以及抗LAG-3抗体的重链可变区、重链恒定区(CH1)、Fc结构域和IL-2蛋白。在此，抗LAG-3抗体中可以包含至少一个IL-2蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白含有两个IL-2蛋白。此外，在一个实施方案中，IL-2蛋白可以以与抗LAG-3抗体的C端连接的形式出现。

具体地，含有Fc结构域和IL-2蛋白的融合蛋白可以是一个二聚体，其中由结构式(1)表示的两个融合蛋白被连接。

N’-X-[连接子(1)]o-Fc区片段或其变体-[连接子(2)]p-Y-C’(1)

在此，在结构式(1)中，

N’为融合蛋白的N端，

C’为融合蛋白的C端，

X为抗LAG-3抗体或其片段，

Y为IL-2蛋白，

所述连接子(1)和所述连接子(2)为肽连接子，并且

o和p各自独立地为0或1。

在此，抗LAG-3抗体和IL-2蛋白如上所述。此外，在融合蛋白中，IL-2或其变体可与抗LAG-3抗体的C端连接的Fc区域连接。在此，IL-2或其变体和Fc区可以通过连接子连接。

肽连接子(1)可以由1至50个连续的氨基酸、3至30个连续的氨基酸或5至15个氨基酸组成。在一个实施方案中，肽连接子(1)可以由12个氨基酸组成。此外，肽连接子(1)可以包含至少一个半胱氨酸。具体地，肽连接子(1)可以包含一个、两个或三个半胱氨酸。此外，肽连接子(1)可以来自于免疫球蛋白的铰链。在一个实施方案中，肽连接子(1)可以是由如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列组成的肽连接子。

肽连接子(2)可以由1至30个连续的氨基酸、2至20个连续的氨基酸或2至10个氨基酸组成。在一个实施方案中，肽连接子(2)可以是(G₄S)_n(在此，n为1至10的整数)。在此，在(G₄S)_n中，n可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9或10。在一个实施方案中，肽连接子可以是由如SEQID NO:19所示的氨基酸序列组成的肽连接子。

此外，结构式(1)表示的融合蛋白可以包括结构式(1-1)和结构式(1-2)所表示的蛋白。

N’-X’-[连接子(1)]o-Fc区域片段或其变体-[连接子(2)]p-Y-C’(1-1)

N’-X”-C’(1-2)

在此，在结构式(1-1)和(1-2)中，

N’为融合蛋白的N端，

C’为融合蛋白的C端，

X’为抗LAG-3抗体的重链区，包括一个重链可变区和CH1,

X”为抗LAG-3抗体的轻链区，包括轻链可变区和CL,

Y为IL-2蛋白，

所述连接子(1)和所述连接子(2)为肽连接子，并且

o和p各自独立地为0或1。

此外，重链可变区和轻链可变区如上所述。

构成融合蛋白的各区域的氨基酸序列如以下表1和表2所示。具体地，表1显示了抗HLAG-3(1E09)VL-kappa+CL的氨基酸序列。表2显示了抗hLAG-3(1E09)VH+CH1、hIgG4Fc和hIL-2v2/hIL-2v3的氨基酸序列。

[表1]

[表2]

编码融合蛋白的多核苷酸

在本发明的另一个方面，提供了一种编码融合蛋白的多核甘酸。

在此，多核苷酸可包含编码由结构式(1-1)和结构式(1-2)表示的融合蛋白的核苷酸序列。

具体地，多核苷酸中编码重链区的多核苷酸可以包含如SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:23所示的核苷酸序列。此外，编码轻链区的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:18。

如果多核苷酸编码相同的多肽，则一个或多个核苷酸可以通过替换、删除、插入或其组合而改变。当核苷酸序列通过化学合成制备时，可使用本领域公知的合成方法，例如Engels和Uhlmann(Angew Chem Int Ed Engl.,37:73-127,1988)中所述的方法。此类方法可包括三酯、亚磷酸酯、磷酰胺和H-磷酸酯、PCR和其他自聚体方法、固体载体上的寡核苷酸合成等。

根据一个实施方案，所述多核苷酸可包含具有识别的核酸序列，以SEQ ID NO:17、18或23的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％。

所述多核苷酸可进一步包含编码信号序列或前导序列的核酸。如本文所用，术语“信号序列”是指导目标蛋白分泌的信号肽。所述信号肽在宿主细胞中被翻译，然后被切割。具体地，信号序列是一个氨基酸序列，其启动了蛋白质跨越内质网(ER)膜的迁移。

信号序列的特点在本领域中是众所周知的。这种信号序列通常含有16至30个氨基酸残基，也可能含有比这种氨基酸残基更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽由三个区域组成，即一个碱性的N端区域，一个中间疏水区域和一个更极性的C端区域。中间疏水区包含4至12个疏水残基，这些疏水残基使信号序列在未成熟的多肽通过膜脂双层迁移时被固定下来。

启动后，信号序列在ER的腔内被细胞酶(通常称为信号肽酶)切割。在此，信号序列可以是tPa(组织纤溶酶原激活剂)、HSV gDs(单纯疱疹病毒糖蛋白D)、IgG信号序列或生长激素的分泌信号序列。优选地，可以使用包括哺乳动物等的高等真核细胞中使用的分泌信号序列。此外，可以使用包括在野生型IL-2中的信号序列，或可以使用在宿主细胞中具有高表达频率的密码子替换的信号序列。其一个实施方案可包括14.18抗体的轻链信号序列(Gillies等人，J.Immunol.Meth，1989，125:191-202)，MOPC141抗体的重链信号序列(Sakano等人，Nature，1980，286:676-683)，以及本领域已知的其他信号序列(参见，例如Watson等人，Nucleic Acid Research，1984，12:5145-5164)。

携带编码融合蛋白的多核苷酸的载体

在本发明的又一个方面，提供了一种包括多核苷酸的载体。

在此，编码重链区的多核苷酸和编码轻链区的多核苷酸可以包含在不同的载体上。或者，编码重链区的多核苷酸和编码轻链区的多核苷酸可以包含在一个载体上。

如上所述的多核苷酸。在此，编码重链区的多核苷酸可以包含如SEQ IDNO:17或23所示的核苷酸序列，编码轻链区的多核苷酸可以包含如SEQ IDNO:18所示的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码重链区的多核苷酸和编码轻链区的多核苷酸可以各自含有如SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码重链区的多核苷酸和编码轻链区的多核苷酸可以各自含有如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。在此，载体可以是两个含有所述重链和所述轻链的每一个多核苷酸组合的载体，或是含有这两种组合的多核苷酸的双顺反子表达载体。

所述载体可被引入宿主细胞，与宿主细胞的基因组重组并插入其中。或者，所述载体可以理解为含有多核苷酸序列的核酸手段，该序列作为一个外显体被自主复制。在此，所述载体可以与适当的启动子可操作地连接，以便该多核苷酸可以在宿主细胞中表达。载体包括线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒(cosmid)、RNA载体、病毒载体、小染色体及其类似物。病毒载体的例子包括但不限于，逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。

具体地，载体可以包括质粒DNA、噬菌体DNA等，以及商业开发的质粒(pUC18、pBAD、pIDTSAMRT-AMP等)、大肠杆菌衍生的质粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草芽孢杆菌衍生的质粒(pUB110、pTP5等)，酵母衍生的质粒(YEp13、YEp24、YCp50等)，噬菌体DNA(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)，动物病毒载体(逆转录病毒、腺病毒、疫苗病毒等)，昆虫病毒载体(杆菌病毒等)。由于载体根据宿主细胞的不同表现出不同的蛋白质表达水平和修饰，因此最好选择和使用最适合该目的的宿主细胞。

如本文所用，目标蛋白的“基因表达”或“表达”一词被理解为DNA序列的转录、mRNA转录物的翻译以及融合蛋白产物或其片段的分泌。有用的表达载体可以是RcCMV(Invitrogen，Carlsbad)或其变体。所述表达载体可进一步包含人巨细胞病毒(CMV)启动子，其用于促进哺乳动物细胞中靶基因的连续转录，以及牛生长激素多腺苷酸化信号序列，其用于增加转录后RNA的稳态水平。

表达融合蛋白的转化细胞

在本发明的另一个方面，提供了一种将载体引入其中的转化细胞。

转化细胞的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真核细胞以及哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。作为原核细胞的一个例子，可以使用大肠杆菌。此外，作为真核细胞的一个例子，可以使用酵母。此外，对于哺乳动物细胞，可以使用CHO细胞、F2N细胞、COS细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、SP2/0细胞、人淋巴母细胞、NSO细胞、HT-1080细胞、PERC.6细胞、HEK 293细胞、HEK293T细胞等。然而，哺乳动物细胞并不限于此，本领域技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞都可以使用。

此外，为了将表达载体引入宿主细胞，可以使用CaCl₂沉淀法、Hanahan法，其效率通过在CaCl₂沉淀中使用还原剂如二甲基亚砜(DMSO)而得到提高，电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质体融合、使用碳化硅纤维搅拌、农杆菌介导的转化、使用PEG、硫酸葡聚糖、脂质体胺(lipofectamine)和干燥/抑制介导的转化等方法。此外，可以使用感染作为手段，并使用病毒颗粒将目标传递到细胞中。此外，还可以使用将载体引入宿主细胞、基因轰击等方法。

如上所述，为了优化作为治疗剂的融合蛋白的性质，或为了其他目的，可以通过本领域技术人员已知的方法操纵宿主细胞所具有的糖基化相关基因来调节融合蛋白的糖基化模式(例如唾液酸、岩藻糖基化和糖基化)。

制备融合蛋白的方法

在本发明的另一个方面，提供了一种制备包含抗LAG-3抗体和IL-2或其变体的融合蛋白的方法，所述方法包括培养转化的细胞；以及从培养基中收集上述融合蛋白。

如本文所用，术语“培养”是指在适当控制的环境条件下人工培养微生物的方法。

培养转化的细胞可以用本领域公知的方法进行。具体地，只要本发明的融合蛋白可以通过表达产生，培养就没有特别限制。具体地，培养可以在分批过程中进行，或在进料分批或重复进料分批过程中连续进行。

此外，从培养物中收集融合蛋白可以通过本领域中已知的方法进行。具体地，只要可以收集根据本发明产生的融合蛋白，收集方法就没有特别限制。优选地，收集方法可以是诸如离心、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分次溶解(例如硫酸铵沉淀)或色谱(例如离子交换、亲和、疏水和尺寸排除)等方法。

融合蛋白的用途

在本发明的又一个方面，提供了一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含所述融合蛋白。

如本文所用，术语“癌症”被归类为正常组织细胞因某种原因无限增殖并持续快速发展的疾病，而不考虑活体的生存现象或周围组织状态。本发明中的癌症可以是选自人体各种癌症组成的组中的任一种癌症，例如胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓系白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌和淋巴瘤，但不限于上述类型。此外，就本发明的目的而言，它可以是对辐射有抵抗力的癌症，但不限于此。

如本文所用，术语“预防”是指通过施用药物组合物抑制癌症的发生或推迟癌症的发生的任何行动。如本文所用，术语“治疗”是指通过施用药物组合物改善或有益地改变癌症症状的任何行动。

所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是任何载体，只要该载体是适合给病人施用的无毒物质。蒸馏水、酒精、脂肪、蜡和惰性固体都可以作为载体。药剂组合物中也可包含药学上可接受的佐剂(缓冲剂或分散剂)。

具体地，通过包括药学上可接受的载体，所述药物组合物可以根据其给药途径，使用本领域已知的常规方法制备成肠外制剂。在此，术语“药学上可接受的”是指该载体的毒性不超过待施用(处方)的受试者所能适应的程度，同时不抑制活性成分的活性。

当药物组合物被制备成肠外制剂时，根据本领域已知的方法，它可以被制成注射剂、透皮贴剂、鼻腔吸入剂或栓剂等形式的制剂，并具有合适的载体。在制成注射剂的情况下，可使用无菌水、乙醇、多元醇例如甘油或丙二醇或其混合物作为合适的载体，优选使用等渗溶液，例如林格氏溶液(Ringer'ssolution,)、含三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或注射用无菌水和5％葡萄糖等。所述药物组合物的配制在本领域是已知的，可具体参考Remington'sPharmaceutical Sciences(第19版，1995)等。该文件可被视为本说明书的一部分。

另一方面，本发明的药物组合物是以药学有效量施用的。如本文所用，术语“施用”是指通过适当的方法将预定的物质引入受试者体内，并且组合物的施用途径可以是通过任何一般途径，只要它可以到达目标组织。它们可以是腹腔内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、局部施用、鼻内施用或直肠内施用，但不限于此。

术语“受试者”是指所有动物，包括人、大鼠、小鼠、牲畜等。优选地，可以是包括人的哺乳动物。

术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理效益/风险比治疗疾病的量，并且不会引起副作用，有效剂量水平可由本领域的普通技术人员根据包括患者的性别、年龄、体重以及健康状况、疾病的类型和严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、施用方法，施用时间，施用途径，排泄率，治疗持续时间，联合或同时使用的药物，以及其他在医学领域公知的因素。日剂量可在0.01μg/kg至10g/kg范围内，或在0.01mg/kg至1g/kg范围内。施用可以一天一次或一天几次。这样的剂量不应被理解为在任何方面限制了本发明的范围。

在本发明的另一个方面，提供了一种融合蛋白用于治疗或预防癌症的用途。在此，融合蛋白、癌症、治疗和预防都如上所述。

在本发明的又一个方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将融合蛋白施用于受试者。在此，融合蛋白、施用、癌症、治疗和预防都如上所述。所述受试者可以是哺乳动物，优选为人。此外，受试者可能是患有癌症的患者，或更可能是患有癌症的受试者。

融合蛋白或融合蛋白二聚体的施用途径、剂量和施用频率可以根据患者的情况和是否有副作用而变化，因此融合蛋白或融合蛋白二聚体可以以各种方式和数量给受试者服用。最佳的施用方法、剂量和施用频率可以由本领域的技术人员在适当的范围内选择。此外，所述融合蛋白或融合蛋白二聚体可与其他药物或生理活性物质联合施用，这些药物或生理活性物质对要治疗的疾病的治疗效果是已知的，或者可以与其他药物配制成联合制剂的形式。

本发明的实施方式

下面，将通过以下实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅用于说明本发明，并且对于本领域的普通技术人员来说，本发明的范围不应被理解为受到这些例子的限制。

I.融合蛋白的制备

制备实施例1.抗hLAG-3抗体-hIgG4 Fc-hIL-2v2融合蛋白：GI-104E1的制备

为了产生包含抗HLAG-3抗体和hIL-2v2的融合蛋白，通过GenScript的表达和优化服务，将多核苷酸插入pcDNA3_4载体(Invitrogen)。具体地，所述多核苷酸(SEQ ID NO:18)含有核苷酸序列(SEQ ID NO:16)，所述序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N端开始依次含有抗hLAG-3VL(抗hLAG-3(1E09)VL-kappa+CL)；以及多核苷酸(SEQ ID NO:17)含有核苷酸序列(SEQ ID NO:27)，所述序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N端依次含有抗hLAG-3VH(抗hLAG-3(1E09)VH+CH1)、Fc结构域(F02(hIgG4Fc))、连接子(G₄S连接子)和人IL-2v2。所述载体被引入CHO细胞(HD CHO-S)。载体引入后，在37℃、8％ CO₂浓度的无血清HD CHO-S^TM表达培养基中培养14天。然后，收获培养物，用含有MabSelect SuRe^TMLX的亲和层析(亲和纯化柱)纯化融合蛋白。

将分离和纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE和Western Blot检测，并通过HPLC分析确认其分子量和纯度(图3和图5)。通过Bradford试验测量其浓度，鉴定出融合蛋白的浓度为0.69mg/ml。

制备实施例2.对照抗体的制备(抗hLAG-3抗体和α-LAG-3)

为了制备作为对照的抗hLAG-3抗体，通过GenScript的表达和优化服务将多核苷酸插入pcDNA3_4载体(Invitrogen)中。具体地，所述多核苷酸(SEQ ID NO:18)含有核苷酸序列(SEQ ID NO:16)，所述序列编码融合蛋白，从N端开始依次含有抗hLAG-3VL(抗HLAG-3(1E09)VL-kappa+CL)；以及多核苷酸(SEQ ID NO:29)含有核苷酸序列(SEQ ID NO:15)，所述序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N端开始依次含有抗hLAG-3VH(抗hLAG-3(1E09)VH+CH1)和Fc结构域(F02(hIgG4Fc))。所述载体被引入CHO细胞(HD CHO-S)。载体引入后，在37℃、8％ CO₂浓度的无血清HD CHO-S^TM表达培养基中培养14天。然后，收获培养物，用含有MabSelect SURE^TMLX的亲和层析(亲和纯化柱)纯化融合蛋白。

制备实施例3.hIgG4 Fc-hIL-2v2:Fc-IL-2v2的制备

为了产生包含Fc结构域和IL-2变体的融合蛋白二聚体，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸(SEQ ID NO:25)含有核苷酸序列(SEQ ID NO:11)，其编码的融合蛋白从N端开始依次含有Fc结构域(SEQ ID NO:14)、连接子(SEQ ID NO:19)和具有两个氨基酸替换的IL-2变体(2M)(R38A和F42A)(SEQ ID NO:20)。所述多核苷酸被插入pcDNA3_4载体(Invitrogen)。此外，所述载体被引入CHO细胞(EXPI-CHO^TM)以表达SEQ ID NO:11的融合蛋白。在引入所述载体后，在37℃、125RPM和8％ CO₂浓度的环境中培养7天。然后，收获培养物并从中纯化融合蛋白。

制备实施例4.hIgG4 Fc-hIL-2v3:Fc-IL-2v3的制备

为了产生包含Fc结构域和IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸(SEQ ID NO:26)含有核苷酸序列(SEQ ID NO:24)，其编码的融合蛋白从N端开始依次含有Fc结构域(SEQID NO:14)、连接子(SEQ IDNO:19)和具有三个氨基酸替换的IL-2变体(3M)(R38A、F42A和E61R)(SEQ ID NO:21)。所述多核苷酸被插入pcDNA3_4载体(Invitrogen)。此外，所述载体被引入CHO细胞(Expi-CHO^TM)以表达SEQ ID NO:24的融合蛋白。引入所述载体后，在37℃、125RPM、8％ CO₂浓度的环境中培养7天。然后，收获培养物并从中纯化融合蛋白。

制备实施例5.抗hLAG-3抗体-hIgG4 Fc-hIL-2v3融合蛋白：GI-104E2的制备

为了产生包含抗LAG-3抗体和hIL-2v3的融合蛋白，通过GenScript的表达和优化服务将多核苷酸插入pcDNA3_4载体(Invitrogen)。具体地，所述多核苷酸(SEQ ID NO:18)含有核苷酸序列(SEQ ID NO:16)，其编码融合蛋白，所述融合蛋白从N端开始依次含有抗hLAG-3VL(抗hLAG-3(1E09)VL-kappa+CL)；以及多核苷酸(SEQ ID NO:23)含有核苷酸序列(SEQ IDNO:28)，所述序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N端开始依次含有抗hLAG-3VH(抗hLAG-3(1E09)VH+CH1)、Fc结构域(F02(hIgG4Fc))、连接子(G₄S连接子)和人IL-2v3。所述载体被引入CHO细胞(HD CHO-S)。引入所述载体后，在37℃、8％ CO₂浓度的无血清HD CHO-S^TM表达培养基中培养14天。然后，收获培养物，用含有MabSelect SURE^TMLX的亲和层析(亲和纯化柱)纯化融合蛋白。

将分离和纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE和Western blot检测，并通过HPLC分析确认其分子量和纯度(图4和图6)。通过Bradford试验测量其浓度，鉴定出融合蛋白的浓度为0.51mg/ml。

II.鉴定融合蛋白的免疫活性

实施例1.通过LAG-3阻断试验鉴定融合蛋白的T细胞活化功能

实施例1.1.鉴定GI-104E1对T细胞功能的影响

LAG-3是一种在T细胞和NK细胞中表达的免疫检查点抑制剂，其结构与CD4相似。然而，LAG-3在D1结构域有30个附加的氨基酸，因此与MHC II类具有高亲和力。由于这样的结构特征，LAG-3被认为能抑制T细胞的活化。

本实验尝试用LAG-3阻断生物测定系统(Promega，JA1115)来评估融合蛋白的T细胞活化功能。具体地，将一小瓶保存在液氮中的MHCII APC细胞在37℃恒温水浴中解冻2分钟，然后加入到14.5ml含有TCR活化抗原的细胞恢复培养基(90％ DMEM+10％ FBS)中，并将所得物充分混合。在96孔白细胞培养板(Corning cat no.3917)的每个孔中加入MHCII APC悬液，每孔100μl，在37℃和5％ CO₂的培养箱中培养24小时。

取出含有培养24小时的MHCII APC细胞的96孔白细胞培养板，并移除板中的培养基。然后，每孔加入40μl GI-104E1和1E09(Relatlimab代用品)作为阳性对照，以不同的浓度进行处理，并加入40μl测定缓冲液作为阴性对照。然后，覆盖白细胞培养板并放置在室温下，直到LAG-3效应细胞制备完成。

将一小瓶保存在液氮中的LAG-3效应细胞在37℃恒温水浴中解冻2分钟，然后加入7ml的测定缓冲液(90％ RPMI+10％ FBS)，并将所得物混合均匀。在室温下储存的96孔白细胞培养板的每个孔中加入40μl混合悬浮液，并在37℃和5％ CO₂的培养箱中反应5小时。反应完成后，将所得物在室温下静置10分钟，然后在每个孔中加入80μl Bio-Glo试剂，同时注意避免产生气泡。在最外层的两个孔中也加入了Bio-Glo试剂，这些孔被用作空白以校正背景信号。使反应在室温下进行10分钟，然后用

发现系统(Promega,USA)测量发光。

结果证实，GI-104E1可以通过与效应T细胞中表达的LAG-3结合并抑制LAG-3的功能来激活T细胞功能(图8)。

实施例1.2.GI-104E2对T细胞功能影响的鉴定

由于以与实施例1.1相同的方式对GI-104E2进行LAG-3阻断试验，证实GI-104E2可以通过与效应T细胞中表达的LAG-3结合并抑制LAG-3的功能来激活T细胞功能(图9)。

实施例2.鉴定融合蛋白的抗癌作用

实施例2.1.鉴定GI-104E1在小鼠源性结肠癌细胞移植小鼠中的抗癌作用

从Orient Bio Inc.获得的BALB/c小鼠(雌性，7周龄)进行了7天的适应期。然后，用1ml PBS稀释CT26癌细胞系(ATCC，U.S.A.)的5×10⁶个细胞，并通过皮下注射的方式在小鼠的右背区进行异体移植，每个受试者100μl。癌细胞移植后的一定时间段，测量肿瘤体积，选择达到约50mm³至120mm³的受试者，然后根据肿瘤大小和体重将所选小鼠平均分组，每组8只。此后，按表3所示组成试验组，并腹腔施用试验物质。第一次施用后，每周一次，共施用三次。关于移植肿瘤的大小，所有病例的肿瘤体积均每周测量两次，持续4周。

[表3]

测定结果用各组的平均值和标准差(SD)值显示为图表。此外，使用双向方差分析和Dunnett T3检验分析了与载体相比肿瘤体积减少的统计学意义(#p≤0.05，####p≤0.0001)，以及与GI-104E1给药组相比肿瘤体积差异的统计学意义(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001)。

结果，在CT26癌细胞系移植小鼠中，与阴性对照组相比，GI-104E1以3mg/kg的剂量施用的组在观察中期和实验结束时，肿瘤生长受到明显抑制(#p≤0.05，####p≤0.0001，双向方差分析(ANOVA))。此外，即使与施用摩尔数与GI-104E1相当的抗LAG-3抗体或Fc-IL-2v2相比，GI-104E1的施用也显著抑制了肿瘤的生长。特别是，GI-104E1在观察中期和实验结束时显示出显著的肿瘤抑制作用，甚至与共同施用抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v2的实验组相比也是如此(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001，双向方差分析(ANOVA))(图10至16)。

在试验结束时观察肿瘤增长率的变化，在阴性对照组中，显示肿瘤增长率下降50％或更多的受试者数量为1名，在施用抗LAG-3抗体的组中为1名，在施用Fc-IL-2v2的组中为0名，在共同施用抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v2的组中为0名。同时，在施用GI-104E1的实验组中，证实有7名受试者的肿瘤增长率下降了50％或更多，且显示肿瘤增长率下降了80％或更多的受试者为5名(图17)。

此外，根据实验受试者的死亡或在受试者中产生2000mm³的肿瘤体积，分析了施用GI-104E1的实验组和施用其他实验对照和阴性对照的实验组的存活概率，并通过Mantel-Cox检验分析了各实验组存活概率差异的统计学意义。结果证实，与施用其他实验对照和阴性对照的实验组相比，施用GI-104E1的实验组显示出更高的存活概率，而且这种实验组之间存活概率的差异具有统计学意义(****p≤0.0001)(图18)。

实施例2.2.鉴定GI-104E2在小鼠来源的结直肠癌细胞移植小鼠中的抗癌作用

从Orient Bio Inc.获得的BALB/c小鼠(雌性，7周龄)进行了7天的适应期。用1mlPBS稀释CT26癌细胞系(ATCC，U.S.A.)的5×10⁶个细胞，并通过皮下注射的方式在小鼠的右背区进行异体移植，每个受试者100μl。癌细胞移植后的一定时间段，测量肿瘤体积，选择达到约50mm³至120mm³的受试者，然后根据肿瘤大小和体重将所选小鼠均匀分组，每组包含3只小鼠。此后，按表4所示组成试验组，并腹腔施用试验物质。第一次施用后，每周一次，共施用三次。关于移植肿瘤的大小，所有病例的肿瘤体积均每周测量两次，持续4周。

[表4]

结果，在CT26癌细胞系移植小鼠中，与阴性对照组相比，以6mg/kg的剂量施用GI-104E2的组在观察中期和实验结束时，肿瘤生长受到了抑制。此外，即使与施用6mg/kg GI-104E2摩尔数相当的抗LAG-3抗体或Fc-IL-2v3相比，GI-104E2施用组也表现出优异的肿瘤生长抑制作用。特别是，在观察的中期和实验结束时，GI-104E2显示了优异的肿瘤抑制效果，甚至与共同施用抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v3的实验组相比也是如此(图19至图25)。

此外，在试验结束时观察肿瘤增长率的变化，显示肿瘤增长率下降50％或更多的受试者的数量在阴性对照组中为1名，在施用抗LAG-3抗体的组中为0名，在施用Fc-IL-2v3的组中为1名，在共同施用抗LAG-3抗体和Fc-IL-2v3的组中为1名。同时，在施用GI-104E2的实验组中，确认所有受试者的肿瘤增长率下降了50％或更多，且显示肿瘤增长率下降了80％或更多的受试者数量为1名(图26)。

根据实验受试者的死亡或在受试者中产生2000mm³的肿瘤体积，分析了施用GI-104E2的实验组和施用其他实验对照和阴性对照的实验组的存活概率。结果证实，与施用其他实验对照和阴性对照的实验组相比，施用GI-104E2的实验组显示出更高的存活概率(图27)。

SEQUENCE LISTING

<110> GI 医诺微新

<120> 包含抗LAG-3抗体和IL-2的融合蛋白及其用途

<130> P22118995WP

<150> KR 10-2020-0079978

<151> 2020-06-30

<160> 29

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的VH-CDR1

<400> 1

Gly Phe Ser Phe Ser Asp His Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的VH-CDR2

<400> 2

Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的VH-CDR3

<400> 3

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的可变重链

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的VL-CDR1

<400> 5

Gln Glu Ile Ser Ile Tyr

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的VL-CDR2

<400> 6

Asp Ala Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的VL-CDR3

<400> 7

Gln Gln Thr Tyr Ile Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的可变轻链

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Ser Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ile Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的重链可变基因

<400> 9

caggttcagt tggttcagtc tggcggcgac ctggttaagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt ctccttctcc gaccactaca tgaactggat cagacaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtcgcctac atcgatacct ccgccaccta catctactac 180

gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctccagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagataac 300

tggggctccc tggattattg gggccagggc gctctggtca cagtgtcctc t 351

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）的轻链可变基因

<400> 10

gacattcaga tgacccagtc tccatcctct ctgagcccat ccgtgggcga cagagtgacc 60

attacctgcc aggccagcca agagatctcc atctacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgac gcctccaatc tggaaacagg cgtgccctcc 180

agattctccg gctctggctc tggcacagac tttaccctga ccatctccag cctccagcct 240

gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag acctacatca ccccttacac ctttggccag 300

ggcaccaagc tggacatcaa g 321

<210> 11

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> Fc-hIL-2v2

<400> 11

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 12

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）VH+CH1

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 连接子1

<400> 13

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 14

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> hIgG4Fc

<400> 14

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

210 215

<210> 15

<211> 443

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）重链

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3（1E09）VL-kappa+ CL

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Glu Ile Ser Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ile Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 17

<211> 1746

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 编码抗hLAG3HC（1E09, hIgG4Fc）_hIL2v2的多核苷酸

<400> 17

caggttcagt tggttcagtc tggcggcgac ctggttaagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt ctccttctcc gaccactaca tgaactggat cagacaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtcgcctac atcgatacct ccgccaccta catctactac 180

gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctccagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagataac 300

tggggctccc tggattattg gggccagggc gctctggtca cagtgtcctc tgcttctacc 360

aagggaccca gcgtgttccc tctggctcct tgctccagat ccacctccga gtctacagct 420

gctctgggct gcctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480

ggcgctctga catctggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tccagtcctc cggcctgtac 540

tctctgtcct ctgtcgtgac cgtgccttcc tctagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600

aatgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gcgtggccga gtctaagtat 660

ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca gaagctgctg gcgggccctc cgtgtttctg 720

ttccctccaa agcctaagga ccagctgatg atctctcgga cacccgaagt gacctgcgtg 780

gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 840

gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg 900

gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960

gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020

cctagggaac cccaggttta caccctgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag 1080

gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc tacccttccg acattgccgt ggaatgggag 1140

agcaatggcc agcctgagaa caactacaag accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc 1200

tccttctttc tgtactcccg cctgaccgtg gacaagtcca gatggcaaga gggcaacgtg 1260

ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg cacaatcact acacccagaa gtccctcagc 1320

ctgtcccttg gcggaggcgg tggatccgct cctacctcct ccagcaccaa gaaaacccag 1380

ttgcagctgg aacatctgct gctggacctc cagatgatcc tgaacggcat caacaactac 1440

aagaacccca agctgaccgc catgctgacc gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc 1500

gagcttaagc acctccagtg cctggaagag gaacttaagc ccctggaaga agtgctgaat 1560

ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg cctcgggacc tgatctccaa catcaacgtg 1620

atcgtgctgg aactcaaggg ctccgagaca accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca 1680

gctaccatcg tggaatttct gaatcggtgg atcaccttct gccagtccat catcagcacc 1740

ctgacc 1746

<210> 18

<211> 642

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 编码抗hLAG3（1E09）轻链的多核苷酸

<400> 18

gacattcaga tgacccagtc tccatcctct ctgagcccat ccgtgggcga cagagtgacc 60

attacctgcc aggccagcca agagatctcc atctacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgac gcctccaatc tggaaacagg cgtgccctcc 180

agattctccg gctctggctc tggcacagac tttaccctga ccatctccag cctccagcct 240

gaggatttcg ccacctacta ctgccagcag acctacatca ccccttacac ctttggccag 300

ggcaccaagc tggacatcaa gagaaccgtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360

tccgacgagc agcttaagtc tggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420

cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tccagtccgg caactcccaa 480

gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccaggga 600

ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 642

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 连接子2

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 20

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> hIL2v2

<400> 20

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 21

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> hIL2v3

<400> 21

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 22

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> IL-2

<400> 22

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 23

<211> 1746

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 编码抗hLAG3HC（1E09, hIgG4Fc）_hIL2v3的多核苷酸

<400> 23

caggttcagt tggttcagtc tggcggcgac ctggttaagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt ctccttctcc gaccactaca tgaactggat cagacaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtcgcctac atcgatacct ccgccaccta catctactac 180

gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctccagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagataac 300

tggggctccc tggattattg gggccagggc gctctggtca cagtgtcctc tgcttctacc 360

aagggaccca gcgtgttccc tctggctcct tgctccagat ccacctccga gtctacagct 420

gctctgggct gcctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480

ggcgctctga catctggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tccagtcctc cggcctgtac 540

tctctgtcct ctgtcgtgac cgtgccttcc tctagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600

aatgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gcgtggccga gtctaagtat 660

ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca gaagctgctg gcgggccctc cgtgtttctg 720

ttccctccaa agcctaagga ccagctgatg atctctcgga cacccgaagt gacctgcgtg 780

gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 840

gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg 900

gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960

gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc gaaaagacca tctccaaggc caagggccag 1020

cctagggaac cccaggttta caccctgcct ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag 1080

gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc tacccttccg acattgccgt ggaatgggag 1140

agcaatggcc agcctgagaa caactacaag accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc 1200

tccttctttc tgtactcccg cctgaccgtg gacaagtcca gatggcaaga gggcaacgtg 1260

ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg cacaatcact acacccagaa gtccctcagc 1320

ctgtcccttg gcggaggcgg tggatccgct cctacctcct ccagcaccaa gaaaacccag 1380

ttgcagctgg aacatctgct gctggacctc cagatgatcc tgaacggcat caacaactac 1440

aagaacccca agctgaccgc catgctgacc gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc 1500

gagcttaagc acctccagtg cctggaacgt gaacttaagc ccctggaaga agtgctgaat 1560

ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg cctcgggacc tgatctccaa catcaacgtg 1620

atcgtgctgg aactcaaggg ctccgagaca accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca 1680

gctaccatcg tggaatttct gaatcggtgg atcaccttct gccagtccat catcagcacc 1740

ctgacc 1746

<210> 24

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> Fc-hIL-2v3

<400> 24

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 25

<211> 1101

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 编码GI-101C2（hIgG4Fc-hIL2v2）的多核苷酸

<400> 25

gccgagtcta agtatggccc tccttgtcct ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcggc 60

ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggaccagc tgatgatctc tcggacccct 120

gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg 180

tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagttcaac 240

tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 300

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc 360

aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa 420

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt 480

gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac acctcctgtg 540

ctggactccg acggctcctt ctttctgtac tcccgcctga ccgtggacaa gtccagatgg 600

caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 660

cagaagtccc tgtctctgtc ccttggcgga ggcggaggat ccgcccctac cagctcctct 720

accaagaaaa cccagctcca gttggagcat ctgctgctgg acctccagat gattctgaac 780

gggatcaaca actataagaa ccccaagctg accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg 840

cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg 900

gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc 960

agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag 1020

tacgccgacg agacagccac catcgtggaa tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag 1080

agcatcatct ccacactgac c 1101

<210> 26

<211> 1101

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 编码GI-101C3（hIgG4Fc-hIL2v3）的多核苷酸

<400> 26

gccgagtcta agtatggccc tccttgtcct ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcggc 60

ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggaccagc tgatgatctc tcggacccct 120

gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg 180

tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagttcaac 240

tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 300

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc 360

aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa 420

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt 480

gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagaccac acctcctgtg 540

ctggactccg acggctcctt ctttctgtac tcccgcctga ccgtggacaa gtccagatgg 600

caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 660

cagaagtccc tgtctctgtc ccttggcgga ggcggaggat ccgctcctac ctccagctcc 720

accaagaaaa cccagttgca gctggaacat ctgctgctgg acctccagat gatcctgaat 780

ggcatcaaca attacaagaa ccccaagctg accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg 840

cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc cagtgcctgg aacgggaact gaagcctctg 900

gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag aacttccacc tgaggcctcg ggacctgatc 960

tccaacatca acgtgatcgt gctggaactc aagggctccg agacaacctt catgtgcgag 1020

tacgccgacg agacagctac catcgtggaa tttctgaatc ggtggatcac cttctgccag 1080

tccatcatca gcaccctgac c 1101

<210> 27

<211> 582

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3HC（1E09, hIgG4Fc）_hIL2v2

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

450 455 460

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

465 470 475 480

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

485 490 495

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu

500 505 510

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

515 520 525

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

530 535 540

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

545 550 555 560

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser

565 570 575

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580

<210> 28

<211> 582

<212> PRT

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 抗hLAG3HC（1E09, hIgG4Fc）_hIL2v3

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Asp Thr Ser Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu

450 455 460

His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr

465 470 475 480

Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro

485 490 495

Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu

500 505 510

Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His

515 520 525

Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu

530 535 540

Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr

545 550 555 560

Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser

565 570 575

Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580

<210> 29

<211> 1329

<212> DNA

<213> Artificial sequence（人工序列）

<220>

<223> 编码抗HLAG-3VH（抗HLAG-3(1E09)VH+CH1）和Fc结构域（F02（hIgG4Fc））

的多核苷酸

<400> 29

caggttcagt tggttcagtc tggcggcgac ctggttaagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt ctccttctcc gaccactaca tgaactggat cagacaggcc 120

cctggcaaag gcctggaatg ggtcgcctac atcgatacct ccgccaccta catctactac 180

gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctccagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagataac 300

tggggctccc tggattattg gggccagggc gctctggtca cagtgtcctc tgcttctacc 360

aagggaccca gcgtgttccc tctggctcct tgctccagat ccacctccga gtctacagct 420

gctctgggct gcctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480

ggcgctctga catctggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tccagtcctc cggcctgtac 540

tctctgtcct ctgtcgtgac cgtgccttcc tctagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600

aatgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gcgtggagtc taagtatggc 660

cctccttgtc ctccatgtcc tgctccagaa gctgctggcg ggccctccgt gtttctgttc 720

cctccaaagc ctaaggacca gctgatgatc tctcggacac ccgaagtgac ctgcgtggtg 780

gtggatgtgt ctcaagagga ccctgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840

gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagttca actccaccta cagagtggtg 900

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960

tccaacaagg gcctgccttc cagcatcgaa aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct 1020

agggaacccc aggtttacac cctgcctcca agccaagagg aaatgaccaa gaaccaggtg 1080

tccctgacct gcctggtcaa gggcttctac ccttccgaca ttgccgtgga atgggagagc 1140

aatggccagc ctgagaacaa ctacaagacc acacctcctg tgctggactc cgacggctcc 1200

ttctttctgt actcccgcct gaccgtggac aagtccagat ggcaagaggg caacgtgttc 1260

tcctgctctg tgctgcacga ggccctgcac aatcactaca cccagaagtc cctcagcctg 1320

tcccttggc 1329

Claims

1.一种融合蛋白，其包含

特异性结合LAG-3的抗体；和

IL-2蛋白。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合LAG-3的抗体包括

含有如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3的重链可变区；和

含有如SEQ ID NO:5所示的LCDR1、如SEQ ID NO:6所示的LCDR2和如SEQ ID NO:7所示的LCDR3的轻链可变区。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合LAG-3的抗体包括

含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含两个IL-2蛋白。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-2蛋白为IL-2变体。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-2变体在选自由R38A、F42A、Y45A、E61R、L72G及其组合组成的组中的位置被替换。

7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-2变体具有如SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。

8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合LAG-3的抗体和所述IL-2蛋白通过连接子相互连接。

9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子为肽连接子。

10.一种编码如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。

11.一种表达载体，其包含如权利要求10所述的多核苷酸。

12.一种转化细胞，其中已引入如权利要求11所述的表达载体。

13.一种制备融合蛋白的方法，包括：

培养如权利要求12所述的转化细胞；和

从培养基中收集融合蛋白。

14.一种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述癌症为选自由胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性髓系白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌和淋巴瘤组成的组中任一。

16.如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白在治疗或预防癌症方面的用途。

17.如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白在制造治疗或预防癌症的药物方面的用途。

18.一种治疗或预防癌症的方法，包括向受试者施用如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白。