KR20140069222A - 교차 제시 수지상 세포를 표적으로 하는 백시바디 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수지상 세포를 표적으로 하는 재조합 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항체 성분 및 표적화 성분을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 면역 반응을 촉발시키기 위한 이러한 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2012년 9월 23일자로 출원된 미국 가출원 제 61/538,186 호 (이의 전문이 본원에 참조로서 포함되어 있음) 를 우선권 주장한다.
기술 분야
본원은 수지상 세포를 표적으로 하는 재조합 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 표적화 성분, 항원, 링커 영역 및 항체 성분을 포함하는 융합 단백질 (백시바디) 및 면역 반응을 촉발하기 위한 이러한 동형이량체성 융합 단백질의 용도, 또는 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 에 관한 것이다.
DNA 백신화는 면역 반응을 유도하는 기술적으로 단순한 방법이다. 그러나, 작은 동물에서의 실험 성공은 임상 시험 단계에서는 아직 성공적이지 못하다. 현재, DNA 백신의 효능을 증가시키기 위한 수많은 전략들이 연구되고 있다.
단백질 항원을 항원-제시 세포 (APC) 로 표적화하는 것은 T- 및 B-세포 반응을 향상시킬 수 있다. 재조합 면역글로불린 (Ig) 분자는 이러한 목적에 매우 적합하다. 예를 들어, 짧은 항원성 에피토프는 Ig 불변 도메인에서 β-가닥 사이에서 루프를 대체할 수 있는 반면, 표적화 항원 전달은 재조합 Ig 가 APC 상의 표면 분자에 대해 특이적인 가변 (V) 영역을 가짐으로써 수득된다. 그러나, 이러한 전략은 확인되지 않는 에피토프를 함유하는 더 큰 항원에 대해서는 부적합하며, 더욱이 짧은 T 세포 에피토프를 갖는 재조합 Ig 분자는 형태적 에피토프에 대항하는 항체를 도출해내지 못한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 표적화 Ig-기재 동형이량체성 DNA 백신 (백시바디) 는 형태적 에피토프를 유지하는 550 개 이상의 aa 크기를 갖는 전염성 또는 종양 항원을 발현하도록 생성된 것이다.
지금까지 어떠한 DNA 백신도 효능 부족으로 인해 인간에 사용되는데 승인되지 않았다. 또한, 여러 전염성 질병에 대해 이용가능한 효과적인 백신이 없었다. 특히, 인간에게 사용되는 것이 승인된 치료학적 DNA 암 백신이 없다.
개선된 효능을 갖는 DNA 백신이 요망된다.
발명의 개요
본 발명은 수지상 세포를 표적으로 하는 재조합 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 표적화 성분, 항원, 링커 영역 및 항체 성분을 포함하는 융합 단백질 (백시바디) 및 면역 반응을 촉발하기 위한 이러한 동형이량체성 융합 단백질의 용도, 또는 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 구현예에서, 융합 폴리펩티드, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 및 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터를 포함하는 세포 및 벡터가 제공되며, 이때 융합 폴리펩티드는 인간 또는 마우스 Xcl1 또는 Xcl2 의 아미노산 서열 (예를 들어, SEQ ID NO 1, 2 또는 3 으로 기술됨) 에 대해 80 % 이상 서열 동일성 (예를 들어, 85% 이상, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상동성) 을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 단위 및 항원 단위를 포함하며, 상기 표적화 단위 및 항원 단위는 이량체화 모티프를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 바람직하게는 교차-제시 DC 상에서 Xcr1 에 결합한다. 일부 구현예에서, 인간 또는 마우스 Xcl1 또는 Xcl2 의 변이체 또는 상동체는 천연 인간 또는 마우스 Xcl1 또는 Xcl2 보다 Xcr1 에 대해서 더욱 높은 친화도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 항원 단위는 항원성 scFv, 박테리아 항원, 바이러스 항원 또는 암 연계된 또는 암 특이적 항원이다. 일부 구현예에서 링커, 예컨대 (G4S)3 링커는 항원성 scFv 내에서 VH 및 VL 를 연결한다. 일부 구현예에서 항원성 scFv 는 골수종 또는 림프종 세포에 의해 생산되는 모노클로날 Ig 에서 유래한다. 일부 구현예에서 항원 단위는 텔로머라아제, 또는 이의 관능성 부분이다. 일부 구현예에서 텔로머라아제는 hTERT 이다. 일부 구현예에서 항원 단위는 흑색종 항원이다. 일부 구현예에서 흑색종 항원은 티로시나아제, TRP-1, 또는 TRP-2 이다. 일부 구현예에서 항원 단위는 전립선 암 항원이다. 일부 구현예에서 전립선 암 항원은 PSA 이다. 일부 구현예에서 항원 단위는 자궁경부 암 항원이다. 일부 구현예에서 자궁경부 암 항원은 E1, E2, E4, E6, E7, L1 및 L2 로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 일부 구현예에서 항원 단위는 박테리아로부터 유래한다. 일부 구현예에서 박테리아 유래된 항원 단위는 결핵 항원이다. 일부 구현예에서 박테리아 유래된 항원 단위는 브루셀라병 항원이다. 일부 구현예에서 항원 단위는 바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서 바이러스 유래된 항원 단위는 HIV 로부터 유래된다. 일부 구현예에서 HIV 유래된 항원 단위는 gp120 또는 Gag 으로부터 유래된다. 일부 구현예에서 항원 단위는 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 (HA), 핵단백질, 및 M2 항원; 및 단순 포진 2 항원 당단백질 D 로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 이량체로서 존재한다. 일부 구현예에서 이량체화 모티프는 경첩 영역 및 임의적으로는 이량체화를 촉진하는 또다른 도메인, 예컨대 면역글로불린 도메인 (임의적으로는 링커를 통해 연결됨) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 이량체화 도메인은 인간 IgG3 이량체화 도메인 (hCH3) 을 포함한다. 일부 구현예에서 경첩 영역은 1 개, 2 개 또는 수 개의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서 공유 결합은 디술피드 브릿지이다. 일부 구현예에서 이량체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 카르복시말단 C 도메인이거나, 또는 상기 C 도메인에 실질적으로 상동인 서열이다. 일부 구현예에서 카르복시말단 C 도메인은 IgG 로부터 유래된다. 일부 구현예에서 이량체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 동형이량체화하는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서 이량체화 모티프의 면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용을 통해 동형이량체화하는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서 비공유 상호작용은 소수성 상호작용이다. 일부 구현예에서 이량체화 도메인은 CH2 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서 이량체화 모티프는, 링커를 통해 인간 IgG3 의 CH3 도메인에 연결되는 경첩 엑손 h1 및 h4 로 이루어진다. 일부 구현예에서 경첩 영역 및 이량체화를 촉진하는 또다른 도메인, 예컨대 면역글로불린 도메인을 연결하는 링커는 G3S2G3SG 링커이다. 일부 구현예에서 항원 단위 및 이량체화 모티프는 링커, 예컨대 GLSGL 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 바람직한 변이체 동형이량체성 단백질은 천연 동형이량체성 단밸질의 친화도와 비교시 Xcr1 케모카인 수용체에 대해 증가된 친화도를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 백시바디를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 환자에서 동형이량체성 단백질의 제조를 유도하기 위해 환자에게 투여되기 위해 제형화된다.
일부 구현예에서 본 발명에 따른 백신은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 애쥬번트를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 면역학적으로 유효량의 동형이량체성 단백질 또는 상기 기술된 바와 같은 동형이량체성 단백질을 형성할 수 있는 단량체성 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 암 또는 전염성 질병에 대항하는 백신을 제공하며, 이때 백신은 T-세포- 및/또는 B-세포 면역 반응 (바람직하게는 둘 모두) 을 촉발할 수 있고 이때 동형이량체성 단백질은 상기 암 또는 전염성 질병에 대해 특이적인 항원 단위를 함유한다.
일부 구현예에서 본 발명에 따른 백신 또는 약학 조성물에 의해 치료되는 암은 다중 골수종 또는 림프종, 악성 흑색종, HPV 유도된 암, 전립선 암, 유방암, 폐암, 난소암, 및/또는 간암이다. 일부 구현예에서 본 발명에 따른 백신 또는 약학 조성물에 의해 치료되는 전염성 질병은 인플루엔자, 헤르페스, CMV, HPV, HBV, 브루셀라병, HIV, HSV-2 및 결핵으로 이루어진 목록으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 융합 폴리펩티드를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
본 발명의 추가 구현예는 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체가 항원 단위에 대한 면역 반응을 일으키도록 하는 조건 하에서 대상체에게 본원에 기술된 백신 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 동형이량체성 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 전술된 동형이량체성 단백질을 형성할 수 있는 단량체성 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 세포 개체군에 도입하는 것; 세포 개체군을 배양하는 것; 및 세포 개체군으로부터 발현되는 동형이량체성 단백질을 수집하고 정제하는 것을 포함한다.
추가의 구현예가 본원에 기술된다.
도 1 은 Xcl1 표적화된 백시바디의 기능 및 구조를 나타낸다. (A) 표적화 단위, 이량체화 도메인, 및 바이러스 항원 단위로서 마우스 Xcl1 을 갖는 백시바디 구조. (B) 본 발명의 구현예의 융합 단백질을 사용하는 표적화를 도식적으로 나타낸 도면. Xcl1-백시바디는 MHC-I 상의 바이러스 항원의 펩티드를 CD8+ T-세포에 후속적으로 제시하는 DC 서브셋을 발현하는 Xcr1 에 결합하고, 따라서 바이러스 감염된 세포를 살생시킬 수 있는 세포독성 T-세포 반응을 유도한다.
도 2 는 비-림포이드 및 림포이드 기관으로부터 DC 서브셋에 의한 XCR1 발현을 나타낸다. A, 각 기관에서 DC 서브셋을 한정하는 게이팅 전략. B-J, C57BL/6J 및 XCR1-bGal 마우스의 다양한 기관의 DC 서브셋에서 XCR1 발현의 bgal 효소 활성 표시를 나타낸 히스토그램 (E 제외, 이때 재조합 XCL1-mCherry 를 사용함). B, 표피. C, 피부. D-F, CLN. F, bGal+ 세포의 백분율을 XCR1-bGal 마우스에서 bGal+ 세포의 백분율에 대해 C57BL/6J 마우스에서 bGal+ 세포의 백분율을 차감함으로써 계산하였다. G, CLN-고유 CD11b+ 및 CD8a+ DC (좌측 패널) 에서 CADM1 발현 및 CLN-mig CD11b+, CD1032, 및 CD103+ DC (우측 패널) 에서 CADM1 발현. H, 간, 폐 및 장. I, Mig-DC 서브셋 (MedLN 및 MLN 로부터). J, 비장으로부터의 LT-고유 DC 서브셋, MedLN 및 MLN.
도 3 은 Xcl1 표적화된 백시바디의 특징화를 나타낸다. A) 백시바디는 표적화 단위 (Xcl1), 이량체화 단위 (hCH3) 및 항원 단위 (mCherry) 로 이루어진 이량체 단백질로서 생체내에서 발현된다. Xcr1 에 결합하지 않는 것으로 추정되는 돌연변이체를 생성하기 위해, 본 발명자들은 돌연변이화된 Xcl1 을 생성하였으며, 이때 시스테인 11 은 알라닌 (C11A) 으로 돌연변이화되었다. Xcl1-표적화된 및 추정되는 비-표적 C11A 돌연변이체 백시바디는 293E 세포에서 발현되었으며, B) mCherry 에 직접 대항하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅 및 C) Xcl1 에 직접 대항하는 항체를 이용하는 ELISA 로 분석하였다. D) Xcl1- 및 Xcl1(C11A)-mCherry 백시바디의, 비장으로부터 단리된 고유 CD8α+ DC (좌측 패널) 및 CD11b+ DC 로의 결합. DC 를 Xcl1-mCherry, Xcl1(C11A)-mCherry 를 이용하여 인큐베이션하였고, DC 는 백시바디를 이용하여 인큐베이션하지는 않았다. E) Xcl1- 및 Xcl1(C11A)-mCherry 의 Xcr1-/- 마우스로부터 단리된 CD8α+ DC 로의 결합 부족.
도 4 는 Xcl1 표적화된 HA-백시바디로의 체액성 면역 반응을 나타낸다. HA 단독, NIP-HA (합텐 NIP 에 특이적인 비-표적화된 백시바디) 및 C11A 돌연변이체를 비교하였다. a) 면역화 14 일 후 혈청 샘플을 채취하고 항-HA 항체에 대해 분석하였다. b) 면역화 14 일 후 혈청 면역글로불린 반응을 IgG1 및 IgG2a 아이소타입에 대해 추가로 분석하였다. Balb/c 마우스에서 IgG2a c) 및 IgG1 d) 에 대한 혈청 수준을 18 주 동안 모니터링하였고, 혈청 샘플을 제 1, 3, 5, 7, 10, 14 및 18 주에 수집하였다. e) Balb/c 마우스에서 Xcl1-HA 백시바디 DNA 를 적정할 때 IgG2a 혈청 반응. 괄호안의 수치는 마우스를 면역화하는데 사용되는 총 DNA 의 양을 나타낸다.
도 5 는 MHC-I 분자 Kd 상에 제시되는 HA 펩티드 IYSTVASSL 에 특이적인 CD8+ T-세포의 오량체 염색을 나타낸다. a) 배출 림프절로부터 단리된 세포를 CD8 발현 (R1) 에 대해 게이팅하고 PE-접합 IYSTVASSL 오량체의 결합에 대해 분석하였다. 사분면의 상부 우측 (제 2 사분면) 에서의 수치는 오량체 양성 CD8+ T-세포의 백분율을 나타낸다. b) 모든 대조군이 포함된 오량체 염색의 요약. NIP-HA 또는 C11A-HA 백신화된 마우스 (Mann-Whitney) 비해 Xcl1-HA 백신화된 마우스에서 오량체 양성 CD8+ t-세포에서의 현저한 증가가 관찰되었다.
도 6 은 Xcl1-HA 백시바디가 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) (PR8) 의 치사에 대해 마우스를 보호함을 나타낸다. a) 마우스를 면역 14 일 후 PR8 의 5x 치사량으로 시험하고, Xcl1-HA, C11A-HA, HA 또는 NaCl 로 면역화한 후 체중 감소에 대해 모니터링하였다. 실험을 제 7 일에 종결하였다. b) NIP-HA 대조군 또한 포함하는 제 7 일 동안 a) 에서의 체중 데이터의 요약. Xcl1-HA 를 이용한 마우스 백신과 비표적화된 대조군 NIP-HA 및 C11A-HA 사이에서, 체중에 있어서의 현저한 차이점이 관찰되었다. c) Xcl1-HA DNA 의 적정을 사용하여 마우스를 면역화하고, 면역화 14 일 후 5x 치사량으로 실험하였다. 괄호안의 수치는 마우스를 면역화하는데 사용되는 DNA 의 총량을 나타낸다. d) 마우스를 면역화 26 주 후 PR8 바이러스를 이용하여 실험하고, 실험 9 일 후 체중 감소를 모니터링하였다.
도 7 은 표 1 을 제공한다.
도 8 은 쥐과 및 인간 Xcl1 및 인간 Xcl2 백시바디의 발현 및 분비를 비교한 그래프이다.
도 9a 및 9b 는 Xcl1 및 Xcl2 백시바디로 면역화한 후 면역 반응을 비교한 그래프이다.
도 10a 및 10b 는 Xcl1 및 Xcl2 백시바디를 이용하여 면역화한지 14 일 후 인플루엔자 바이러스로 실험한 후 체중 감소를 비교한 그래프이다.
도 2 는 비-림포이드 및 림포이드 기관으로부터 DC 서브셋에 의한 XCR1 발현을 나타낸다. A, 각 기관에서 DC 서브셋을 한정하는 게이팅 전략. B-J, C57BL/6J 및 XCR1-bGal 마우스의 다양한 기관의 DC 서브셋에서 XCR1 발현의 bgal 효소 활성 표시를 나타낸 히스토그램 (E 제외, 이때 재조합 XCL1-mCherry 를 사용함). B, 표피. C, 피부. D-F, CLN. F, bGal+ 세포의 백분율을 XCR1-bGal 마우스에서 bGal+ 세포의 백분율에 대해 C57BL/6J 마우스에서 bGal+ 세포의 백분율을 차감함으로써 계산하였다. G, CLN-고유 CD11b+ 및 CD8a+ DC (좌측 패널) 에서 CADM1 발현 및 CLN-mig CD11b+, CD1032, 및 CD103+ DC (우측 패널) 에서 CADM1 발현. H, 간, 폐 및 장. I, Mig-DC 서브셋 (MedLN 및 MLN 로부터). J, 비장으로부터의 LT-고유 DC 서브셋, MedLN 및 MLN.
도 3 은 Xcl1 표적화된 백시바디의 특징화를 나타낸다. A) 백시바디는 표적화 단위 (Xcl1), 이량체화 단위 (hCH3) 및 항원 단위 (mCherry) 로 이루어진 이량체 단백질로서 생체내에서 발현된다. Xcr1 에 결합하지 않는 것으로 추정되는 돌연변이체를 생성하기 위해, 본 발명자들은 돌연변이화된 Xcl1 을 생성하였으며, 이때 시스테인 11 은 알라닌 (C11A) 으로 돌연변이화되었다. Xcl1-표적화된 및 추정되는 비-표적 C11A 돌연변이체 백시바디는 293E 세포에서 발현되었으며, B) mCherry 에 직접 대항하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅 및 C) Xcl1 에 직접 대항하는 항체를 이용하는 ELISA 로 분석하였다. D) Xcl1- 및 Xcl1(C11A)-mCherry 백시바디의, 비장으로부터 단리된 고유 CD8α+ DC (좌측 패널) 및 CD11b+ DC 로의 결합. DC 를 Xcl1-mCherry, Xcl1(C11A)-mCherry 를 이용하여 인큐베이션하였고, DC 는 백시바디를 이용하여 인큐베이션하지는 않았다. E) Xcl1- 및 Xcl1(C11A)-mCherry 의 Xcr1-/- 마우스로부터 단리된 CD8α+ DC 로의 결합 부족.
도 4 는 Xcl1 표적화된 HA-백시바디로의 체액성 면역 반응을 나타낸다. HA 단독, NIP-HA (합텐 NIP 에 특이적인 비-표적화된 백시바디) 및 C11A 돌연변이체를 비교하였다. a) 면역화 14 일 후 혈청 샘플을 채취하고 항-HA 항체에 대해 분석하였다. b) 면역화 14 일 후 혈청 면역글로불린 반응을 IgG1 및 IgG2a 아이소타입에 대해 추가로 분석하였다. Balb/c 마우스에서 IgG2a c) 및 IgG1 d) 에 대한 혈청 수준을 18 주 동안 모니터링하였고, 혈청 샘플을 제 1, 3, 5, 7, 10, 14 및 18 주에 수집하였다. e) Balb/c 마우스에서 Xcl1-HA 백시바디 DNA 를 적정할 때 IgG2a 혈청 반응. 괄호안의 수치는 마우스를 면역화하는데 사용되는 총 DNA 의 양을 나타낸다.
도 5 는 MHC-I 분자 Kd 상에 제시되는 HA 펩티드 IYSTVASSL 에 특이적인 CD8+ T-세포의 오량체 염색을 나타낸다. a) 배출 림프절로부터 단리된 세포를 CD8 발현 (R1) 에 대해 게이팅하고 PE-접합 IYSTVASSL 오량체의 결합에 대해 분석하였다. 사분면의 상부 우측 (제 2 사분면) 에서의 수치는 오량체 양성 CD8+ T-세포의 백분율을 나타낸다. b) 모든 대조군이 포함된 오량체 염색의 요약. NIP-HA 또는 C11A-HA 백신화된 마우스 (Mann-Whitney) 비해 Xcl1-HA 백신화된 마우스에서 오량체 양성 CD8+ t-세포에서의 현저한 증가가 관찰되었다.
도 6 은 Xcl1-HA 백시바디가 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) (PR8) 의 치사에 대해 마우스를 보호함을 나타낸다. a) 마우스를 면역 14 일 후 PR8 의 5x 치사량으로 시험하고, Xcl1-HA, C11A-HA, HA 또는 NaCl 로 면역화한 후 체중 감소에 대해 모니터링하였다. 실험을 제 7 일에 종결하였다. b) NIP-HA 대조군 또한 포함하는 제 7 일 동안 a) 에서의 체중 데이터의 요약. Xcl1-HA 를 이용한 마우스 백신과 비표적화된 대조군 NIP-HA 및 C11A-HA 사이에서, 체중에 있어서의 현저한 차이점이 관찰되었다. c) Xcl1-HA DNA 의 적정을 사용하여 마우스를 면역화하고, 면역화 14 일 후 5x 치사량으로 실험하였다. 괄호안의 수치는 마우스를 면역화하는데 사용되는 DNA 의 총량을 나타낸다. d) 마우스를 면역화 26 주 후 PR8 바이러스를 이용하여 실험하고, 실험 9 일 후 체중 감소를 모니터링하였다.
도 7 은 표 1 을 제공한다.
도 8 은 쥐과 및 인간 Xcl1 및 인간 Xcl2 백시바디의 발현 및 분비를 비교한 그래프이다.
도 9a 및 9b 는 Xcl1 및 Xcl2 백시바디로 면역화한 후 면역 반응을 비교한 그래프이다.
도 10a 및 10b 는 Xcl1 및 Xcl2 백시바디를 이용하여 면역화한지 14 일 후 인플루엔자 바이러스로 실험한 후 체중 감소를 비교한 그래프이다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응" 은 대상체의 면역 시스템에 의한 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 반응은 Toll 수용체 활성화, 림포카인 (예를 들어, 사이토카인 (예를 들어, Th1 또는 Th2 유형 사이토카인) 또는 케모카인) 발현 및/또는 분비, 마크로파지 활성화, 수지상 세포 활성화, T 세포 활성화 (예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포), NK 세포 활성화, 및/또는 B 세포 활성화 (예를 들어, 항체 생성 및/또는 분비) 에서 검출가능한 변경 (예를 들어, 증가). 면역 반응의 추가적인 예는 하기를 포함한다: 면역원 (예를 들어, 항원 (예를 들어, 면역원 폴리펩티드)) 의 MHC 분자로의 결합 및 세포독성 T 림프구 ("CTL") 반응, 예를 들어 B 세포 반응 (예를 들어, 항체 생산), 및/또는 T-헬퍼 림프구 반응, 및/또는 면역원 폴리펩티드 유래된 항원에 대항하는 지연된 유형 과민증 (DTH) 반응, 면역 시스템 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포) 의 팽창 (예를 들어, 세포 개체군의 성장), 예를 들어 임의의 발달 단계의 세포 (예를 들어, 혈장 세포), 및 증가된 가공 및 항원 제시 세포에 의한 항원 제시. 면역 반응은 면역원을 외래물질로서 인식하는 대상체의 면역 시스템일 수 있다 (예를 들어, 미생물 (예를 들어 병원체) 로부터의 비-자가 항원, 또는 외래물질로서 인식되는 자가 항원). 따라서, 본원에 사용되는 바와 같은 "면역 반응" 은 하기를 포함하는 (이에 한정되지는 않음) 임의의 유형의 면역 반응을 지칭하는 것으로 한다: 선척적 면역 반응 (예를 들어, Toll 수용체 신호화 케스케이드의 활성화), 세포-중재된 면역 반응 (예를 들어, T 세포에 의해 중재된 반응 (예를 들어, 항원-특이적 T 세포) 및 면역 시스템의 비-특이적 세포) 및 체액성 면역 반응 (예를 들어, B 세포에 의해 중재된 반응 (예를 들어, 항체의 혈장, 림프, 및/또는 조직 플루이드로의 생성 및 분비). 용어 "면역 반응" 은 획득된 면역 반응 (예를 들어, 적응 면역 반응의 결과인 기억 반응) 뿐만 아니라 항원 및/또는 면역원에 반응하는 대상체의 면역 시스템의 모든 능력을 포함하는 것으로 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역" 은 질병을 야기할 수 있는 미생물 (예를 들어, 병원체) 에 노출시, 질병으로부터의 보호 (예를 들어 질병의 증상, 징후 또는 병태의 예방 또는 약화 (예를 들어 억제)) 를 지칭한다. 면역은 선천적 (예를 들어 이전에 항원에 대한 노출이 없이 존재하는 비-적응 면역 (예를 들어 비-획득 면역)) 이고/이거나 획득된 (예를 들어, 항원에 대한 이전 노출에 따른 B 및 T 세포 중재된 면역 반응 (예를 들어, 항원에 대해 증가 및 반응성을 나타냄)) 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역원" 은 대상체에서 면역 반응을 도출할 수 있는 물질 (예를 들어, 박테리아, 바이러스 또는 균류) 및/또는 이의 일부 또는 이의 성분을 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역원 (예를 들어, 미생물 (예를 들어, 병원체 또는 병원체 산물)) 은 면역원에 대항하는 면역 반응을 도출한다.
용어 "시험 화합물" 은 임의의 화학물질 독립체, 약학 제제, 약물 등을 지칭하며, 이는 질병, 질환, 통증, 신체 기능 장애를 치료하거나 예방하기 위해 사용되거나, 또는 샘플의 생리적 상태 또는 세포적 상태를 변경하기 위해 사용될 수 있다. 시험 화합물 비교는 둘 모두의 공지된 것 및 잠재적 치료 화합물을 비교하는 것이다. 시험 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하는 스크리닝에 의해 치료학적으로 결정될 수 있다. "공지된 치료 화합물" 은 이러한 치료 또는 예방에 효과적인 것으로 나타난 (예를 들어, 인간에게 투여된 경험 전 또는 동물 실험을 통해) 치료학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "샘플" 은 폭넓은 의미로 사용된다. 하나의 의미에서, 이는 조직 샘플을 지칭할 수 있다. 또다른 의미에서, 이는 생물학적 임의의 공급원으로부터 수득된 표본 또는 배양물을 포함하는 것으로 한다. 생물학적 샘플은 동물 (인간 포함) 로부터 수득될 수 있으며, 플루이드, 고형물, 조직 및 기체물질을 포함한다. 생물학적 샘플은 혈액 산물, 예컨대 혈장, 혈청 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 예는 본 발명에 적용될 수 있는 샘플 유형을 한정하고자 함이 아니다. 인간 크로모좀 또는 인간 크로모좀 연계된 서열을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 세포, 세포로부터 단리된 크로모좀 (예를 들어, 중기 크로모좀 스프레드), 게놈 DNA (예를 들어 사우던 블롯 분석을 위한 고체 지지체에 결합된 형태 또는 용액 형태), RNA (예를 들어 노던 블롯 분석을 위한 고체 지지체에 결합된 형태 또는 용액 형태), cDNA (고체 지지체에 결합된 형태 또는 용액 형태) 등을 포함할 수 있다. 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 세포, 조직 부분, 하나 이상의 단백질을 함유하는 추출물을 포함할 수 있다.
"아미노산 서열" 이 자연 발생 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하여 인용되는 경우, "아미노산 서열" 등의 용어, 예컨대 "폴리펩티드" 또는 "단백질" 은 인용된 단백질 분자와 연계된 완전한 천연 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열을 한정함을 의미하는 것이 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드" 는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합을 통해 연결되는 둘 이상의 아미노산 중합체를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "디펩티드" 는 펩티드 또는 변형된 펩티드 결합을 통해 연결되는 2 개의 아미노산 중합체를 지칭한다.
용어 "야생형" 은 자연 발생 공급원으로부터 단리될 때 유전자 또는 유전자 산물의 특징을 갖는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 야생형 유전자는 개체군에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이고 따라서 임의대로 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태로 지정된다. 대조적으로, 용어 "변형된", "돌연변이체", 및 "변이체" 는 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교시 서열 및/또는 기능 특성에 있어서 변형 (즉, 변경된 특성) 을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 자연-발생 돌연변이체가 단리될 수 있으며; 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교시 변경된 특성을 나타내는 것으로 확인된 것임을 주목한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단편" 은 천연 단백질과 비교시 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실을 갖는 폴리펩티드를 지칭하며, 이때 남아 있는 아미노산 서열은 전장 cDNA 서열로부터 밝혀진 아미노산 서열 내 상응하는 위치와 동일하다. 단편은 전형적으로는 4 개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 20 개 이상의 아미노산 길이, 통상적으로는 50 개 이상의 아미노산 길이 또는 그 이상의 아미노산길이이며, 다양한 리간드 및/또는 기질과 조성물의 분자간 결합에 요구되는 폴리펩티드의 부분일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된" 또는 "정제하다" 는 샘플로부터 오염물을 제거하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 항원은 단백질 오염을 제거함으로써 정제된다. 오염의 제거는 샘플에서 항원 (예를 들어, 본 발명의 항원) 의 백분율에서의 증가를 야기한다.
용어 "변이체" 는 용어 "돌연변이체"와 호환하여 사용할 수 있다. 변이체는 각각 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 위치에서 삽입, 치환, 역전, 절단을 포함한다. 구절 "변이체 폴리펩티드", "폴리펩티드", "변이체" 및 "변이체 효소" 는 천연 Xcl1 의 아미노산 서열로부터 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드/단백질을 의미한다. 변이체 폴리펩티드는 Xcl1 과 특정 백분율로 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%로 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
"변이체 핵산" 은 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 하이브리드할 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 본원에 제시되는 뉴클레오티드 서열에 대해, 엄격 조건 (예를 들어, 50℃ 및 0.2X SSC (1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 구연산나트륨, pH 7.0)) 하에서 하이브리드할 수 있는 서열에 상보적이다. 더욱 특히, 용어 변이체는 본원에 제시되는 뉴클레오티드 서열에 대해 고도의 엄격 조건 (예를 들어, 65℃ 및 0.1X SSC) 하에서 하이브리드할 수 있는 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 변이체 핵산의 용융점 (Tm) 은 야생형 핵산의 Tm 보다 약 1, 2, 또는 3℃ 낮을 수 있다. 변이체 핵산은 본 발명에 다른 동형이량체성 단백질을 형성할 수 있는 단량체성 단백질을 인코딩하거나 Xcl1 을 인코딩하는 핵산과, 특정 %, 예를 들어 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "동형이량체성 단백질" 은, 수소 결합, 이온성 (하전되어 있는) 상호작용, 실제 공유 디술피드 결합, 또는 이들 상호작용의 몇몇 조합에 의해 단일, 이량체성 단백질로서 함께 뵤유되어 있는 아미노산 또는 서브유닛의 2 개의 동일한 개별 가닥을 포함하는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "이량체화 모티프" 는, 이량체화에 기여할 수 있는 임의적 제 2 도면인 및 경첩 영역을 포함하는 표적화 단위 및 항원 단위 사이의 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 제 2 도메인은 면역글로불린 도메인, 임의적으로는 경첩 영역일 수 있으며, 제 2 도메인은 링커를 통해 연결된다. 따라서, 이량체화 모티프는 항원 단위 및 표적화 단위를 연결하기 위해 제공되나, 또한 2 개의 단량체성 단백질을 본 발명에 따른 동형이량체성 단백질로 이량체화하는 것을 촉진하는 경첩 영역을 함유한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "표적화 단위" 는 표적 세포로 이의 항원을 갖는 단백질을 전달하는 단위를 지칭한다 (예를 들어, 교차제시 수지상 세포).
용어 "경첩 영역" 은 예를 들어 사슬간 공유 결합(들), 예를 들어 디술피드 브릿지(들)의 형성을 통해 이량체화를 촉진하는 동형이량체성 단백질의 펩티드 서열을 지칭한다. 경첩 영역은 IgG3 과 같은 Ig 의 경첩 엑손 h1+h4 과 같이 유래된 Ig 일 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 수지상 세포를 표적으로 하는 재조합 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 표적화 성분, 항원, 링커 영역 및 항체 성분을 포함하는 융합 단백질 (백시바디) 및 이러한 동형이량체성 융합 단백질의 용도, 또는 면역 반응을 촉발하기 위한 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 에 관한 것이다.
수지상 세포 (DC) 는 상이한 해부학 지점에서 면역 센티넬의 기능을 발휘한다. 비림포이드 조직 (NLT) 의 유조직에 고유하는 DC 는 소위 간질성 DC (int-DC) 로서 지칭된다. 이들 DC 는 조직 항원과 배출 림프절 (LN) 을 왕복하는데, 이들은 소위 이동성 DC (mig-DC) 로서 지칭된다. 마우스 피부에서, DC 는 표피 랑게르한스 세포 (LC) 를 구성하고 피부 DC 의 주요한 3 개의 주요 서브셋이 존재하며: CD11bhiCD24 DC, CD11b-CD24+CD1032 DC, 및 CD11bCD24+CD103+ DC (1), 이하에서 이를 CD11b+ DC, CD103 DC, 및 CD103+ DC (표 I) 로 지칭한다. LC 및 모든 피부 DC 서브셋은 피부로부터 피부의 LN (CLN) 으로 구성요소로서 이동하지만, CD103+ DC 는 CLN (1) 에서 CD8 T 세포에 대한 케라티노사이트-유래된 Ag 를 제시하기 위한 가장 유력한 서브셋을 나타낸다. 이러한 수용력은 교차-제시 (1) 을 위한 림포이드 조직 (LT)-고유 CD8a+ DC 의 고효율을 연상시킨다. CD103+ int-DC 는 또한 다른 해부학적 지점, 예컨대 폐 및 장에서 발견된다. CD103+ int-DC 및 LT-고유 CD8a+ DC 의 발달은 선택적으로 공통 전사 인자 세트 (2, 3) 에 의존적이다. 그러므로, 이들 마우스 DC 개체군은 CD8a+- 유형 DC (1) 의 독특한 카테고리에 속할 수 있다.
CD8a+-유형 DC 은 인간 및 양에서 존재하며, 이의 확인은 마우스 비장 CD8a+ DC (4, 5) 과 공유하는 독특한 전사 핑거프린트의 발현 및 Ag 교차-제시를 위한 이의 효율을 기초로 한다 (5-9). 각각의 조직 및 종의 5 가지의 주요 서브셋으로 DC 를 전반적으로 분류할 수 있으며: 단핵세포 유래된 염증성 DC, LC, 혈장사이토이드 DC, CD11b+-유형 DC, 및 CD8a+-유형 DC 가 발표되어 있다 (1). 케모카인 수용체 XCR1 은 마우스 비장, 인간 혈액, 및 양 림프에서 CD8a+-유형에 의해 특이적으로 발현된다 (4-7, 10). Xcr1 의 기능은 우선 R. Kroczek (10) 그룹에 의해 밝혀졌는데, 이들은 CD8+ T 세포 교차-프라이밍이 실험 모델에서 Xcr1 리간드 XCL1 을 분비하는 능력에 의존적임을 나타냈으며, 이때 항-CD205 Ab 에 커플링되는 양쪽의 OVA 또는 OVA-발현 알로제닉 예비-B 세포는 생체 내에 투여된다. CD8a+ DC 상의 Xcr1 발현은 또한 리스테리아 모노사이토젠 감염시 최적의 CD8+ T 세포 반응을 유도하는데 있어서 결정적인 것으로 밝혀졌다 (6).
융합 단백질 백신의 예로는 예를 들어 하기 문헌이 포함되며: WO 2004/076489, US20070298051, EP920522, Fredriksen AB et al. (Mol Ther 2006;13:776-85) and Fredriksen AB and Bogen B (Blood 2007;110: 1797-805); 이의 각각은 본원에 그 전체가 참조로서 포함되어 있다. 본 발명의 구현예는 Xcr1 를 표적으로 하는 Xcl1 또는 Xcl2 케모카인을 비롯한 재조합 융합 단백질 (예를 들어, 백시바디) 을 제공한다. 본 발명의 구현예에서 백시바디는 항원에 대항하는 면역 반응, 특히 CD8+ T 세포 반응이 증강된다는 이점을 제공한다.
수많은 연구가 항원 제시 세포 (APC) 에 대한 표적 항원이 면역 반응을 증강시킨다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 모든 APC 가 CD8+ T-세포를 유도하는 능력을 갖는 것은 아니다. 최근 공보문헌은 Xcr1 가 이러한 능력을 갖는 교차-제시 DC 상에서 배제적으로 발현됨을 나타낸다. 교차-제시 DC 에 대한 항원을 표적으로 하기 위해 (예컨대 표적 DEC205 을 향함) 다른 표적화 방법을 추구하는 동안, 이들 수용체는 종종 APC 의 다른 개체군 상에서도 발현된다. 따라서, Xcl1 또는 Xcl2 를 통한 표적은 매우 특이적인 표적 접근법을 보장한다.
따라서, 본 발명의 구현예는 면역글로불린 및/또는 면역원에 융합된 인간 또는 마우스 Xcl1 또는 Xcl2 를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. Xcl1 및 Xcl2 는 수용체 Xcr1 으로의 융합 폴리펩티드를 표적으로 한다. Xcl1 는 유전자은행 (Genbank) 수납 번호 NM_002995 (인간 핵산) 및 NM_008510 (마우스 핵산) 에 의해 기술되어 있다. 본 발명의 구현예는 Xcl1 의 변이체, 상동체 및 모방체 (하기 상세히 기술됨) 를 추가로 이용한다.
인간 및 마우스 Xcl1 폴리펩티드의 서열은 다음과 같이 기재된다:
인간 Xcl2 의 아미노산 서열은 다음과 같이 기재된다:
핵산 서열
천연 Xcl2 는 21 개의 아미노산 신호 서열로 발현된다:
MRLLILALLGICSLTAYIVEG (SEQ ID NO: 5).
본 발명의 융합 단백질의 예를 도 1 에 나타낸다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 표적화 단위로서 Xcl1 을 포함하고 (Xcl2 가 Xcl1 대신 대체될 수 있음), 인간 IgG3 이량체화 도메인 (hCH3) 및 항원 단위는 항원으로 이루어지나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이량체화는 백신 분자가 둘 모두의 표적화 단위 (Xcl1 또는 Xcl2) 및 항원에 대하여 2가가 되게 한다. 본 발명은 특정 기전에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 기전의 이해는 본 발명을 실시하는데 반드시 필요한 것은 아니다. 그럼에도 불구하고, 교차-제시 DC 상에서 Xcr1 로 백시바디를 표적화하는 것은 CD8+ T-세포로 MHC-I 상에서의 바이러스 펩티드의 제시를 유도하는 것으로 이해된다. 후자는 일단 활성화되면, 바이러스 감염된 세포 또는 동일 펩티드/MHC 복합체를 제시하는 다른 표적화 세포를 살생시킬 수 있다.
본 발명의 구현예의 개발 과정 동안 수행된 실험은, 항원 단위로서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 을 이용하는 비-표적화된 백시바디와 비교시, Xcl1/2-표적화된 백시바디가 DNA 백신으로서 보다 양호하게 수행될 수 있음이 입증되었다. Xcl1/2-표적화된 백시바디는 더욱 강력한 IgG2a 항체 반응을 유도하였고, 치사 인플루엔자 감염에 대항하여 마우스에서 보다 양호한 보호를 제공하였다 (예를 들어, 실시예 1 및 도 4-6 참조).
본원에 기술된 실험으로, 인플루엔자 바이러스로부터의 바이러스 항원 헤마글루티닌 (HA) 뿐만 아니라 형광 단백질 mCherry 와 조합된 표적화 단위로서 Xcl1 을 함유하는 백시바디 구축물을 생성하였다. 초기에, Xcl1-mCherry 백시바디의 발현 및 분비를 평가하였다. 림프절 또는 피부에서 풍부한 DC 상에서 결합을 분석하였다. Xcl1-mCherry 는 CD8+ 고유 DC 및 CD103+ 이동성 DC 로 결합하기 위해서만 관찰되었으며, 이들 둘 모두는 MHC-I 상에서 교차-제시 항원으로 공지된 것이다 (도 2-3). 백신 셋팅에서 Xcl1 표적의 효과를 평가하기 위해, 마우스 백신화용으로 Xcl1-HA 를 사용하였으며, 이어서 수확 혈청 샘플에 대해 IgG 수준을 평가하였다. Xcl1-HA 는 강력하고 지속되는 IgG2a 반응을 유도하였다. 다음으로, 인플루엔자 바이러스 치사로부터 마우스를 보호하기 위한 Xcl1-HA 의 능력을 평가하였다. Xcl1-HA 을 이용하여 백신화된 마우스를 바이러스로부터 완전하게 보호하였으며 (25 ㎍ DNA 를 이용한 단일 백신화 후), 마우스를 면역화하기 위해 사용한 DNA 의 양을 4.16 ㎍ 으로 감소시켰으나 여전히 완전한 보호를 제공하였다. 이는 Xcl1/2-표적이 보호성 면역 반응을 유도하기 위한 유력한 방법임을 나타내는 것이다.
본 발명에 따른 융합 단백질 백신 (예를 들어, 백시바디) 은 재조합 Ig-기재 동형이량체성 백신일 수 있으며, 각 사슬은 Ig 경첩 및 CH3 에 직접 부착되는 표적화 단위로 이루어져 있으며, 이의 조합은 동형이량체화를 유도한다.
Xcl1/2 폴리펩티드, 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질, 및 상이한 항원 단위는 바람직하게는 기능성 단백질로서 구축되고 발현된다. 특히, 본 발명은 항원 제시 세포로의 항원 전달을 표적으로 하는 융합 백신으로 Xcl1/2 및 이의 천연 아이소형태를 이용하는 것에 관한 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 항원 제시 세포는 Xcr1 에 존재하는 교차-제시 수지상 세포 또는 다른 APC 이다. 실제로, 전문적인 항원-제시 세포 (APC) 상의 Xcl1/2 수용체 (Xcr1) 로 항원 전달을 목표로 하는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 백신이 본 발명 이내이다. 바람직한 구현예에서, 교차-제시 DC 상의 Xcr1 에 대한 표적화 백시바디는, MHC-I 상의 바이러스 펩티드를 CD8+ T-세포에게 제시하는 것을 유도한다. CD8+ T-세포는, 일단 활성화되면 동일한 펩티드/MHC 복합체를 제시하는 바이러스 감염된 세포를 살생시킬 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 단백질은 암 백신을 비롯한 백신에서 유용한 인간 항체-유사 분자일 수 있다. 이들 분자 (또한 백시바디로 지칭됨) 은 APC 에 결합하고 T 세포 및 B 세포 면역 반응을 둘 모두 촉발한다. 더욱이, 강한 면역 반응을 더욱 효율적인 유도를 촉진하기 위해 백시바디는 APC 에 2가적으로 결합하는 것으로 이해된다. 백시바디는 바람직하게는 단량체 단위의 이량체를 포함하고, 이는 이량체화 모티프, 예컨대 경첩 영역 및 Cγ3 도메인을 통해 항원 단위에 연결되는, APC 상의 표면 분자에 특이적인 표적화 단위로 이루어지며, 후자는 COOH-말단 또는 NH2-말단에 존재한다. 또한, 본 발명은 이러한 재조합 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 이들 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터, 백시바디 DNA, 백시바디 RNA, 또는 백시바디 단백질에 의한 면역화로 포유동물을 치료하는 방법 및 최종적으로는 이러한 분자를 포함하는 약학 제제 및 키트에 관한 것이다.
구축될 수 있는 본 발명에 따른 단백질에서 이량체화 모티프는 경첩 영역 및 면역글로불린 도메인 (예를 들어 Cγ3 도메인), 예를 들어 카르복시말단 C 도메인 (CH3 도메인), 또는 서열 (이는 상기 C 도메인에 대해 실질적으로 상동임) 을 포함한다. 경첩 영역은 Ig 유래될 수 있으며 사슬간 공유 결합(들), 예를 들어 디술피드 브릿지(들)의 형성을 통한 이량체화에 기여한다. 또한, 이는 2 개의 표적화 단위가 가변 거리로 발현되는 APC 상의 2 개의 표적 분자에 동시에 결합하도록 도메인 사이에서 유연한 스페이서로서 기능한다. 면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용, 예를 들어 소수성 상호작용을 통해 동형이량체화에 기여한다. 바람직한 구현예에서, CH3 도메인은 IgG 로부터 유래한다. 이들 이량체화 모티프는 다른 다량체화 부분 (예를 들어 다른 Ig 아이소타입/하위클래스로부터의 것) 과 교환될 수 있다. 바람직하게는 이량체화 모티프는 천연 인간 단백질, 예컨대 인간 IgG 로부터 유래한다.
이량체화 모티프는 항원 단위 및 표적화 단위에 대해 임의의 기원을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 하나의 구현예에서 항원 단위는 이량체화 모티프의 N-말단에서 표적화 단위를 갖는 이량체화 모티프의 COOH-말단 내에 존재한다. 또다른 구현예에서, 항원 단위는 이량체화 모티프의 COOH-말단에서 표적화 단위를 갖는 이량체화 모티프의 N-말단 내에 존재한다.
국제 출원 WO 2004/076489 (이는 참조로서 포함됨) 는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 핵산 서열 및 벡터를 개시하고 있다.
본 발명에 따른 단백질은 임의의 기원의 폴리펩티드에 대항하는 면역 반응의 유도에 적합할 수 있다. 충분한 길이의 항원성 서열은 본 발명에 따른 단백질 내에서 항원 단위로서 사용될 수 있는 특이적 에피토프를 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 항원 단위는 이러한 항원 단위를 인코딩하는 핵산 서열에서 약 27 개 이상의 뉴클레오티드에 상응하는 9 개 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 항원성 서열은 암 단백질 또는 전염성 작용제로부터 유래할 수 있다. 이러한 암 서열의 예는 텔로머라아제, 더욱 구체적으로는 hTERT, 티로시나아제, TRP-1/ TRP-2 흑색종 항원, 전립선 특이적 항원 및 이디오타입이다. 전염성 작용제는 다음과 같다: 박테리아, 예를 들어 결핵 항원 및 OMP31 (브루셀라병으로부터), 또는 바이러스 기원, 더욱 구체적으로는 HIV 유래된 서열, 예를 들어 gp120 유래된 서열, 당단백질 D (HSV-2 로부터), 및 인플루엔자 바이러스 항원 예를 들어 혈구응집소, 핵단백질 및 M2. 백시바디 포맷에서 이러한 서열의 삽입은 또한 면역 반응의 둘 모두의 암의 활성화를 초래한다. 대안적으로는, 항원 단위는 항체 또는 이의 단편, 예컨대 C-말단 scFv (골수종 또는 림프종 세포에 의해 생산되는 모노클로날 Ig 유래) (소위 B 세포 림프종 또는 다중 골수종을 갖는 환자에서 골수종/림프종 M 성분으로 지칭됨) 일 수 있다.
백시바디 단백질, 백시바디 DNA, 또는 백시바디 RNA 또는 본 발명이 대상체의 면역화를 위해 이용될 수 있으며, 예를 들어 후속 전기천공법의 존재 또는 부재 하에서 근내 또는 피부내 주입에 의해 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질의 표적화 단위는 케모카인 수용체로의 결합을 통해 단백질을 APC 로 표적화한다. 특히 바람직한 구현예에서, 케모카인 수용체는 Xcr1 이다.
본 발명에 따른 융합 단백질의 다양한 단위는 표준 분자 생물학 방법을 통해 작동가능하게 연결될 수 있으며, DNA 는 적합한 숙주 세포, 예컨대 NS0 세포, 293E 세포, CHO 세포 또는 COS-7 세포로 이동된다. 감염체는 재조합 단백질을 생산하고 분비한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단백질, DNA/RNA 서열, 또는 발현 벡터 기재의 전술된 재조합을 포함하는 약학 제제에 관한 것이다. 적절한 경우, 이러한 약학 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 이러한 약학 제제의 적합한 담체 및 제형은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 담체는 예를 들어, 인-완충작용의 공통 염 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어 오일/물 에멀젼, 습윤화제, 무균 용액 등이다. 약학 제제는 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여의 방법은 국소, 동맥내, 근내, 경피, 테칼내, 심실내, 정맥내, 복막내 또는 비강내 투여를 포함한다. 적합한 투여량은 환자의 나이, 성별 및 체중, 투여 종류와 같은 다양한 인자에 의존적이며 전문의에 의해 결정된다. 또한, 본 발명은 면역학적 유효량의 본 발명의 분자를 인코딩하는 핵산 또는 이의 변이체를 포함하는, 암 또는 전염성 질병에 대항하는 백신 조성물에 관한 것이며, 이때 상기 조성물은 T-세포- 및 B-세포 면역 반응 둘 모두를 촉발시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 진단, 의료 또는 연구용 백시바디 DNA, RNA, 또는 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 본 발명의 분자를 포함하는 벡터를 세포 개체군에 트랜스펙션시키는 것; 세포 개체군을 배양하는 것; 세포 개체군으로부터 발현되는 재조합 단백질을 수집하는 것; 및 발현된 단백질을 정제하는 것을 포함하는, 본 발명의 재조합 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 기술된 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 특이적 프로모터의 제어 하에서 바람직하게는 유전자 요법에 적합한 벡터로 삽입되고 세포에 도입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 DNA 서열을 포함하는 벡터는 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 또는 아데노-연계된 바이러스이다. 레트로바이러스가 특히 바람직하다. 적합한 레트로바이러스의 예는 예를 들어 MoMuLV 또는 HaMuSV 이다. 유전자 요법의 목적을 위해, 본 발명에 따른 DNA/RNA 서열은 콜로이드 분산액의 형성에 있어서 표적 세포로 수송될 수 있다. 이들은 예를 들어 리포좀 또는 리포플렉스를 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 특정 특성을 갖는 폴리펩티드와 또는 본원에 정의된 아미노산 서열(들)과 서열 동일성 또는 서열 상동성 정도를 갖는 폴리펩티드를 갖는 모티프 또는 도메인 또는 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 특히, 본 발명은 Xcl1/2 와 서열 동일성 정도를 갖는 펩티드 또는 이의 상동체를 포함한다. 이때, 용어 "상동체" 는 대상 아미노산 서열 또는 대상체 뉴클레오티드 서열과 서열 동일성을 갖는 독립체를 의미하며, 이때 대상 아미노산 서열은 바람직하게는 Xcl1/2 의 아미노산 서열이다.
하나의 양태에서, 상동 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열은 Xcl1/2 폴리펩티드의 활성을 증강시키고/시키거나 기능적 활성도를 보유하는 폴리펩티드를 제공하고/제공하거나 이를 인코딩해야만 한다.
본 문맥에서, 상동 서열은 대상 서열에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 한다. 전형적으로는, 상동체는 대상 아미노산 서열로서 다른 기능적 서열 및 동일 활성 부위를 포함할 것이다. 상동성이 또한 유사성 측면에서 고려되나 (예를 들어, 유사한 화학 특성/기능성을 갖는 아미노산 잔기), 본 발명의 문맥에서, 서열 동일성 측면에서 상동성을 발현하는 것이 바라직하다. 서열 동일성 비교는 육안으로 수행될 수 있거나, 또는 통상적으로는 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 시판되는 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 사이의 차이점(들) 을 야기하는 최선의 발전 경우를 반영하는 둘 이상의 서열을 정렬하기 위한 복합 비교 알고리즘을 사용한다. 따라서, 이들 알고리즘은 비-유사 아미노산의 갭 삽입, 갭 확장 및 정렬의 패널라이징 및 동일하거나 유사한 아미노산의 정렬을 리워딩하는 스코어 시스템으로 작동된다. 비교 알고리즘의 스코어 시스템은 하기를 포함한다:
i) 갭이 삽입되는 매회 패널티 스코어 할당 (갭 패널티 스코어)
ii) 기존 갭이 별도 위치로 확장되는 매회 패널티 스코어 할당 (확장 패널티 스코어)
iii) 동일한 아미노산 정렬시 높은 스코어 할당, 및
iv) 동일하지 않은 아미노산의 할당시 가변 스코어 할당.
대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되게 한다. 그러나, 서열 비교를 위한 이러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다.
동일하지 않은 아미노산의 정렬에 대해 주어진 스코어는 치환 매트릭스로 불리는 스코어 매트릭스에 따라 할당된다. 이러한 치환 매트릭스에서 제공되는 스코어는, 발달 동안 아미노산이 다른 아미노산과 치환될 가능성은 다양하며 치환되는 아미노산의 물리적/화학적 성질에 의존적임을 반영한 것이다. 예를 들어, 극성 아미노산이 또다른 극성 아미노산과 치환될 가능성이 소수성 아미노산으로 치환되는 것에 비해 더욱 높다. 따라서 스코어 매트릭스는 동일한 아미노산에 대해 가장 높은 스코어를 할당하며, 동일하지 않은 아미노산에 대해서는 낮은 스코어를 할당하고, 동일하지 않은 비-유사 아미노산에 대해서는 심지더 더욱 더 낮은 스코어를 할당한다. 가장 빈번하게 사용되는 스코어 매트릭스는 PAM 매트릭스 (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), BLOSUM matrices (Henikoff 및 Henikoff (1992)) and Gonnet matrix (Gonnet et al. (1992)) 이다.
이러한 정렬을 수행하는데 적합한 컴퓨터 프로그램은 하기를 포함한다 (이에 한정되지는 않음): 벡터 NTI (Invitrogen Corp.) 및 ClustalV, ClustalW 및 ClustalW2 프로그램 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007)). 상이한 정렬 툴을 ExPASy Proteomics 서버를 통해 입수할 수 있다. 서열 정렬을 수행할 수 있는 또다른 소프트웨어는 예를 들어 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 이며, 이는 'Center for Biotechnology Information'의 웹페이지로부터 입수할 수 있다 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410).
소프트웨어가 일단 정렬을 생성하면, % 유사성 및 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 서열 비교 파트로서 이를 수행하며 결과 수치를 생성한다.
하나의 구현예에서, 서열 정렬을 수행하는데 ClustalW 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, ClustalW 를 이용한 정렬은 쌍별 정렬 방식으로 정렬을 위한 하기 매개변수로 수행된다:
ClustalW2 는 예를 들어 'European Bioinformatics Institute' 의 인터넷 상의 툴 - 서열 분석 - ClustalW2 하의 EMBL-EBI 웹페이지에서 입수할 수 있다.
또다른 구현예에서, 서열 정렬을 수행하기 위해 벡터 NTI (Invitrogen) 에서 프로그램 Align X 를 사용하는 것이 바람직하다. 하나의 구현예에서, Exp10 는 디폴트 셋팅 하에 사용될 수 있다:
갭 오픈 패널티: 10
갭 확장 패널티: 0.05
갭 분리 패널티 범위: 8
스코어 매트릭스: blosum62mt2
따라서, 본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 단백질, 폴리펩티드, 모티프 또는 도메인의 임의의 아미노산 서열의 변이체, 상동체 및 유도체의 용도를 포함하며, 특히 Xcl1/2 의 용도를 포함한다.
서열, 특히 Xcl1/2 의 변이체, 상동체 및 유도체의 서열은 사일런트 변경을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있으며, 이는 기능적으로는 등가의 물질을 생성한다. 아미노산 치환은 물질의 2차 결합 활성이 보유되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질을 기초로 하여 신중하게 행해질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아르파르트산 및 글루탐산을 포함하며; 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
또한, 본 발명은 발생할 수 있는 보존적 치환 (본원에 사용되는 치환 및 대체 둘 모두는 기존 아미노산 잔기를 대안적인 잔기로 교체하는 것을 의미함) 을 포함하며, 예를 들어 염기성 대신 염기성, 산성 대신 산성, 극성 대신 극성 등과 같은 유사 치환이 발생할 수 있다. 비-보존적 치환이 발생할 수 있으며, 즉, 하나의 부류의 잔기가 또다른 대안적인 자연적이지 않은 아미노산의 포함과 관련된 잔기로 대체되는 것이며, 예를 들면 오르니틴 (이하 본원에서 Z 로 지칭됨), 디아미노부티르산 오르니틴 (이하 본원에서 B 로서 지칭됨), 노르류신 오르니틴 (이하 본원에서 O 로 지칭됨), 피리일알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신이다.
예를 들어, 염기성 아미노산 그룹 (아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산 그룹 (글루탐산 및 아스파르트산), 지방족 아미노산 (알라닌, 발린, 류신, 이소류신), 극성 아미노산 (글루타민, 아스파라긴, 세린, 트레오닌), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 히드록실 아미노산 (세린, 트레오닌), 큰 아미노산 (페닐알라닌 및 트립토판) 및 작은 아미노산 (글리신, 알라닌) 그룹 내에서 보존적 치환이 행해질 수 있다.
또한, 자연적이지 않은 아미노산에 의해 행해질 수 있는 대체는 하기를 포함한다: 알파* 및 알파-이치환된* 아미노산, N-알킬 아미노산*, 락트산*, 자연 아미노산의 할라이드 유도체 예컨대 트리플루오로티로신*, p-Cl-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, p-I-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-α-아미노 부티르산*, L-γ-아미노 부티르산*, L-α-아미노 이소부티르산*, L-ε-아미노 카프로산#, 7-아미노 헵타노산*, L-메티오닌 술폰#*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린#, L-티오프롤린*, 페닐알라닌 (Phe) 의 메틸 유도체, 예컨대 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe (4-아미노)#, L-Tyr (메틸)*, L-Phe (4-이소프로필)*, L-Tic (1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복시산)*, L-디아미노프로피온산 # 및 L-Phe (4-벤질)*. '*' 표시는 상기 논의된 목적을 위해 유도체의 수소성 성질을 나타내기 위해 이용한 것이며 (상동 또는 비-보존적 치환에 대해), '#' 표시는 유도체의 친수성 성질을 나타내기 위해 이용한 것이며, '#*' 는 양친매성 특징을 나타내는 것이다.
변이체 아미노산 서열은 메틸, 에틸 또는 프로필 기와 같은 알킬 기를 포함하는 서열의 임의의 2 개의 아미노산 잔기 사이에 또한 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서로 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기를 포함할 수 있다. 펩토이드 형태로 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재와 관련된 추가의 변이체 형태는 당업자에게 널리 이해될 것이다. 의심의 여지 없이, "펩토이드 형태" 는 α-탄소 치환기가 α-탄소 보다는 잔기의 질소 원자 상에서 존재하는 변이체 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용된 것이다. 펩토이드 형태로 펩티드를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Simon RJ et al. (1992), Horwell DC. (1995)] 참조).
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 동형이량체성 단백질에서 사용되는 변이체 표적화 단위는 Xcl1/2 서열을 갖고 이들과 적어도 65%, 70%, 75%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체이다.
하나의 양태에서, 바람직하게는 본 발명에 사용되는 단백질 또는 서열은 정제된 형태로 존재한다. "변이체" 또는 "변이체들" 은 단백질, 폴리펩티드, 단위, 모티프, 도메인 또는 핵산을 지칭한다.
실험
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구현예 및 양태를 추가로 설명하기 위해 제공된 것이며 본 발명의 범주를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1
재료 및 방법
세포주, 바이러스 및 항체:
HEK293E 세포를 HA-백시바디의 발현 및 Xcr1-eGFP 트랜스펙션시키는데 사용하였다. Xcl1 에 대한 항체를 Lifespan Biosciences (C-16241) 로부터 수득하였고, 항체 α-HA (H-36-4-52), α-인간 IgG3 (HP-6017) 및 α-mCherry 를 실험실에서 정제하였다. 혈청 면역글로불린 ELISA α-마우스 IgG1-bio (BD Pharmingen, 클론 10.9) 에 대해서, α-마우스 IgG2a-bio (BD Pharmingen, 클론 8.3), α-마우스 IgG2b-bio (BD Pharmingen, 클론 R12-3) 를 사용하였다. 인플루엔자 바이러스 균주 A/PR/8/34(H1N1) 를 'Norwegian Institute of Public Health' 로부터 수득하였다.
Xcl1-mCherry 백시바디의 정제:
안정적인 감염체를 Xcl1-mCherry 또는 Xcl1(C11A)-mcherry DNA 40 ㎍ 을 이용하여 PBS 중에서 2x107 NS0 세포를 전자작동시켜 생성시켰다. 세포를 신선한 RPMI 배지에 이동시키고 방치하여 24 시간 동안 37℃ 에서 T-25 플라스크에서 선별 없이 회수하였다. 다음 날, G418 를 800 ㎍/ml 의 최종 농도로 첨가하고 웰 당 5x104 세포 밀도로 96-웰 플레이트에서 시딩하였다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포의 콜로니는 2-3 주 후 나타났다. 안정적인 감염체를 이후 롤러보틀에서 팽창시키고, 5 일 후 상청액을 수집하고 Aktaprime Plus (GE Healthcare) 에 연결되는 α-mCherry 상에 적용하였다. 결합된 백시바디를 PBS 를 이용하여 세척하고, 0.1 M 글리신-HCl 중에서 용리하고 (pH 10.5), PBS 에 대항하여 즉시 투석하였다.
ELISA:
96-웰 ELISA 플레이트 (Costar) 를 2 ㎍/ml 의 불활성화된 PR8 인플루엔자 바이러스 (공급처) 로 코팅하고, 4℃ 에서 인큐베이션을 시작하였다. 이어서, 플레이트를 150 ㎕/웰 차단 버퍼 (0.02% (w/v) NaAzide 를 이용한 PBS 중 1% (w/v) BSA) 를 이용하여 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 혈청 샘플을 1:50 으로 희석하고, 이어서 ELISA 버퍼 (0.02% (w/v) NaAzide 를 이용한 PBS 중 0.1% (w/v) BSA) 중에서 1:3 으로 연속 희석하였다. ELISA 플레이트를 4℃ 에서 혈청 샘플을 이용하여 밤새 인큐베이션하였다. 다음으로, 플레이트를 세척하고 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 (BP Pharmingen) 에 특이적인 1 ㎍/ml 비오틴화 항체를 이용하여 인큐베이션하고, 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 45 분 동안 스트렙타비딘-ALP (GE Healthcare (RPN1234V) 를 이용하여 인큐베이션하였다. 100 ㎕/웰의 기질 버퍼 (1 ㎍/ml 포스페이트 기질 (Sigma, P4744) 을 첨가함으로써 ELISA 를 진행시키고, 30 분 후 OD405 를 Tecan Sunrise 상에서 측정하였다. 총 혈청 면역글로불린을 분석하기 위해, 플레이트를 ALP 접합된 항-마우스 Fc (sigma) (1:300) 를 이용하여 인큐베이션하였다. 항체 역가를 NaCl 백신화된 마우스의 OD 값 > (평균 + 5xSD) 을 이용하여 혈청 샘플의 최대 희석으로 결정하였다.
마우스
Deltagen 에 의해 생성시킨 Xcr1tm1Dgen 마우스 (Xcr1-bGal) (6, 10) 를 Centre d'Immunologie Marseille-Luminy 동물 케어 시설에서 사육하였다. C57BL/6J Q:8 마우스를 Charles River Laboratories (France) 로부터 구입하였다. 동물 케어 및 사용을 규제하는 제도적 협약에 따라 연구를 수행하였다.
DC 단리 및 분류 전략
DC 를 효소 소화, 기계적 붕괴 및 구배 밀도 강화 (11) 에 의해 다양한 기관으로부터 단리하였다. CLN DC 의 분류를 전술한 바와 같이 수행하였다 (12).
Ab 및 유세포분석
대부분의 Ab 를 eBioscience 또는 BD Biosciences 로부터 구입하였다. CD11c 및 MHC 클래스 II 발현의 특이적 패턴을 기초로 하여 mig-DC 를 확인하였다. 염소의 항-닭 IgG 로 밝혀진 닭의 항-SynCAM/TSLC1 Ab (클론 3.E.1) 를 이용하여 CADM1 염색을 수행하였다. b-갈락토시다아제 (bGal) (6) 에 대한 플루오로제닉 기질로서 디-b-D-갈락토피라노시드 중에서 플루오레세인을 사용하여 XCR1 발현을 검출하였다. CLN 에서, 적색 형광 단백질 mCherry 에 공유적으로 커플링된 재조합 마우스 XCL1 을 사용함으로써 XCR1 발현을 또한 검출하였다.
결과
XCR1 발현의 고 수준은 CD103+ int-DC (피부에서) 및 CD103+ mig-DC (CLN 에서) 에 대해 선택적이다.
어느 DC 서브셋이 피부 및 CLN 에서 XCR1 을 발현하는지를 조사하기 위해, XCR1 대신 b-갈락토시다아제 (bGal) 를 발현하는 리포터 돌연변이체 마우스 모델을 조사하였다. 피부에서, int-DC 서브셋은 표피 LCs 및 피부 서브셋 CD103+ DC, CD1032 DC, CD11b+ DC, 및 CD11bCD24 T1 DC (표 I) 을 포함한다. 피부에서 int-DC, bGal 활성은 CD103+ DC 에서 높았고, CD103 DC 에서 낮았고, CD11bCD24 DC, CD11b DC, 및 LC 에서는 검출 불가능했다 (도 2A, 2B). CLN 에서, 오직 LT고유 CD8a+ DC 및 CD103+ mig-DC 가 XCR1 을 발현하였다 (도 2C, 2E). CLN 세포를 염색하기 위한 형광 라벨링된 재조합 마우스 XCL1 의 사용으로, 야생형 마우스로부터 LT-고유 CD8a+ DC 및 CD103+ mig-DC 에 대한 강력하고 매우 특이적인 신호가 생성되었다 (도 2D). 이들 데이터로, 단백질 XCR1 가 LT-고유 CD8a+ DC 및 CD103+ mig-DC 에 대해 특이적으로 발현되고 XCR1 발현의 충실한 리포터로서 bGal 활성의 사용이 유효함을 확인되었다. 따라서, 피부 및 CLN 에서, XCR1 발현의 고 수준은 CD8a+-유형 DC 에 대해 선택적이다.
XCR1 발현은 내장 기관 및 이의 배출 LN 에서 CD8a+-유형 DC 를 규정한다. 다음으로, 상이한 조직에서 존재하는 DC 상의 XCR1 발현을 분석하였다. 피부 및 CLN 에서와 같이, 3 개의 주요 개체군을 간, 폐 및 소장에서 규정하였다: CD11b+ DC, CD103+ DC, 및 CD103 DC (표 I). 이들 기관에서, XCR1 발현은 CD103+ int-DC 에서 높았고, CD103 int-DC 에서 중간이었고, 피부에서 관찰되는 바와 같이 CD11b+ int-DC 에서 검출되지 않았다 (도 2G). 장간막 LN (MLN) 및 종격동 LN (MedLN) 배출로부터 mig-DC 에서 (각각의 장 및 폐), XCR1 발현은 CD103+ 서브셋에서 여전히 최고였다 (도 2H). 내인성 Gal 활성의 저해제의 사용에도 불구하고, CD103+ int-DC (장) 및 CD103+ mig-DC (MedLN) 은 야생형 마우스에서 bGal 활성의 상당한 수준을 나타냈다. 그러나, XCR1-bGal 마우스로부터 단리된 상응하는 서브셋에서 검출될 수 있었던 백그라운드 신호를 넘어서 뚜렷하게 증가하였다. LT-고유 DC 내에서, XCR1 발현은 CD8a+ 서브셋에 한정된채 남아 있었다 (도 2I).
DC 를 발현하는 Xcr1 를 표적으로 하는 백시바디를 생성하기 위해, 본 발명자들은 Xcl1 의 내인성 신호 펩티드를 인간 IgG3 에 의해 대체하였고, 이는 본래 백시바디 유전적 구축물에 포함된 것이었다. 모델 항원으로서, 실험실에서 생성된 특이적 항체를 통해서 뿐만 아니라 형광에 대한 이의 고유 능력에 의해 검출될 수 있는 mCherry 를 사용하였다 (도 3a). 또한 Xcl1-mCherry 에 대해, 본 발명자들은 Xcl1 의 돌연변이화된 버젼을 생성하였으며, 이때 Cys11 는 알라닌으로 돌연변이화되었다 (C11A-mCherry). Cys48 이외에도 Cys11 이 Xcl1 에서 오직 시스테인 브릿지를 형성하는 것에 연관되어 있기 때문에, 돌연변이체는 기능2 가 결여되어 있는 것으로 여겨진다. 2 개의 백시바디를 α-mCherry 컬럼에 대해 정제하고, 크기에 대해 평가하고 SDS-PAGE 에 의해 이량체화하였다.
β-메르캅토에탄올의 존재 하에서 2 개의 백시바디는 ~ 60 kd 의 크기를 갖는 반면, 비-환원 조건 하에서 크기는 ~ 148kd 이었고, 이는 정제된 백시바디가 주로 이량체로 이루어짐을 나타낸다 (도 3b). 표적화 단위의 상대적인 작은 크기로 인해, Xcl1 및 C11A 가 ELISA 검정에서 백시바디 중에 존재함이 확인되었으며, 이때 α-Xcl1 은 주 항체로서 사용되었다 (도 3c).
CD8α+ DC 개체군에 결합된 Xcl1-표적화된 백시바디가 Xcr1 를 발현하도록 공지되었는지를 평가하기 위해, 비장으로부터 DC 를 단리하고 Xcl1-mCherry 또는 C11A-mCherry 를 이용하여 이를 인큐베이션하였다 (도 3d). Xcl1-mCherry 는 오직 CD8+ DC 에 결합되고 CD11b+ DC 는 결합되지 않으며, 이는 백시바디가 Xcr1+ DC 를 특이적으로 표적으로 함을 나타낸다. 결합이 Xcr1 에 특이적인지를 보장하기 위해, DC 를 Xcr1-/- 마우스로부터 단리하고 Xcl1- 및 C11A-mCherry 로 염색하였다 (도 3e). Xcr1-/- 마우스에서 임의의 DC 개체군에 대해 결합이 관찰되지 않았으며, 이는 CD8α+ DC 로의 결합이 Xcr1 에 의해 중재됨을 나타낸다. 어느 정도 (비록 Xcl1-mCherry 보다 현저히 미만이지만) 의 결합이 또한 C11A-mCherry 백시바디로 관찰되었으며, 이는 시스테인 11 을 알라닌으로 돌연변이화하는 것이 결합을 완전히 끝내지 않음을 나타낸다. C11A-mCherry 결합이 Xcr1-/- 마우스에서 손실되었기 때문에, 이는 Xcr1 에는 특이적이고 백그라운드에는 비특이적인 것으로 보인다.
다음으로, Balb/c 마우스를 Xcl1-HA 백시바디를 인코딩하는 25 ㎍ 의 DNA 를 이용하여 면역화한다. C11A-HA 외에도 추가적인 대조군으로서, PR8 HA 를 단독으로 발현하는 플라스미드로 면역화된 하나의 마우스 그룹, 0.9 % NaCl 로 면역화된 하나의 그룹, NIP-HA (합텐 NIP 에 특이적인 scFv) 를 이용하여 면역화된 하나의 그룹을 포함시켰다. 혈청 샘플을 면역화 14 일 후 수집하고 HA 특이적 혈청 IgG 에 대해 분석하였다 (도 4a). IgG 를 가장 강력하게 도입한 것은 Xcl1-HA 로 면역화된 마우스에서 관찰되었다. 흥미롭게도, IgG 서브클래스 반응을 분석할 때, Xcl1-HA 가 주로 IgG2a 를 유도했음을 관찰하였으며, 이들 수준은 임의의 다른 그룹보다 현저하게 높았다 (도 4b). 이는, 둘 모두의 표적화된 백시바디 및 비-표적화된 백시바디로 면역화된 마우스에 필적할만한 IgG1 수준과는 대조적인 것이다 (도 4b). 시간에 따른 체액성 반응을 모니터링할 때, 면역화 후 대략 7-10 주에 IgG2a 역가 피크를 관찰하였으며, 약 15 주 후 안정적인 수준에 도달할 때까지 후속적으로 감소하였다 (도 4c). IgG1 에 대해서, 면역화 후 10 주 까지 역가에서의 증가가 비-표적화된 백시바디 (NIP-HA 및 C11A-HA) 로 관찰되었다 (도 4d). 이는 Xcl1-HA 백시바디와는 대조적인 것이며, 이때 IgG1 역가에서의 증가는 제 3 주 후 관찰되었다.
세포를 발현하는 Xcr1 에 대해 표적 항원의 효능을 평가하기 위해, 세포를 Xcl1-HA DNA 의 양을 감소시켜 Balb/c 마우스를 면역화하였다. 혈청 샘플은 면역화 2 주 후 채취하였으며 IgG1 및 IgG2a 뿐 아니라 총 IgG 에 대해서 분석하였다. 오직 최소한의 IgG2a 반응이 0.46 및 1.39 ㎍ 의 DNA 로 면역화한 마우스에서 관찰되었으며, IgG2a 의 보통 수준이 4.16 ㎍ 의 DNA 를 수용한 마우스의 혈청에서 관찰되었다 (도 4e).
교차-프라이밍 Xcr1+ DC 서브셋으로의 표적 항원이 CD8+ T-세포를 유도하는 것으로 여겨진다. 이를 시험하기 위해, Xcl1-HA 로 면역화하고 면역화 14 일 후 배출 림프절 (서혜부 및 보조부) 을 수확하고 IYSTVASSL 오량체를 이용하여 HA-특이적 CD8+ T-세포에 대해서 단리 세포를 염색하였다 (도 5a). Xcl1-HA 백시바디로 수득된 오량체 양성 CD8+ T-세포의 백분율을 비-표적화된 대조군 (NIP-HA 또는 C11A-HA) 를 이용하여 수득된 백분율과 비교시, Xcl1-표적화된 백시바디 (Mann-Whitney) 를 이용한 HA-특이적 CD8+ t-세포의 현저하게 높은 수가 관찰되었다 (도 5b).
다음으로, Xcr1 발현 DC 로 항원을 표적화하는 것이 인플루엔자 감염에 대항하여 마우스를 보호하는데 충분한지를 평가하였다. Balb/c 마우스를 25 ㎍ 의 DNA 를 이용하여 면역화하고 면역화 14 일 후 5x 치사량의 인플루엔자 A/PR/8/34(H1N1) 로 실험하였다. 질병 진행의 징후로서 체중 손실을 모니터링하였다. Xcl1-HA 로 백신화된 마우스는 초기에 어느정도 체중 감소가 있었으나, 실험 4 일후 회복하였다 (도 6a). HA 단독으로 백신화된 마우스는 보호 반응을 유도하지 못했고 실험을 제 7 일에 종료할 때까지 체중이 지속적으로 감소하였다. 개별 마우스에 대해 제 7 일 후 데이터를 평가했을 때 (모든 대조군 포함), 비-표적화된 백신 (HA, NIP-HA 및 C11A-HA) 과 Xcl1-HA (Mann-Whitney) 를 비교시 체중에서의 현저한 차이점이 관찰되었다 (도 6b).
발생할 수 있는 하나의 잠재적인 장애물은, DNA 백신화 기술을 대동물에 적용할 때 보호를 유도하는 DNA 의 필요량이 동물의 크기에 따라 증가한다는 점이다. 따라서, 상대적으로 낮은 농도에서 보호를 유도할 수 있는 백신이 바람직하다. Xcr1 발현 CD8α+ DC 로의 표적화 백시바디의 효능을 평가하기 위해, 마우스를 백신화하기 위해 사용되는 DNA 의 양을 적정하고, 면역화 2 주 후 PR8 로 실험하였다. 총 4.16 ㎍ 의 Xcl1-HA DNA 를 이용하여 면역화한 후 마우스는 지속적으로 보호되었다 (도 6c). 이는, 혈청 IgG 역가로 측정시 지속적인 면역반응을 유도하기 위해 필요한 DNA 의 양과 상호관련된 것이다 (도 6c).
Xcl1-HA 백시바디가 장기간 보호를 유도하는 능력을 가졌는지 여부를 결정하기 위해, PR8 로 마우스를 실험하였고 (면역화 26 주 후) 체중 감소에 대해 모니터링하였다 (도 6d). Xcl1-HA 로 면역화한 마우스는 초기에 제충이 감소되었으나, 5 마리의 마우스 중 1 마리를 제외한 모든 마우스는 감염 6 일 후 회복하기 시작하였다. 대조적으로, NaCl 로 면역화한 마우스는 지속적으로 체중이 감소했으며, 제 9 일에 4/6 마리의 마우스를 안락사시켜야 했다. 돌연변이화된 C11A-HA 로 면역화한 마우스는 일반적으로 체중이 더욱 감소했으나, 감염 6 일 후 회복되기 시작하였다.
실시예 2
표적화 단위로서 Xcl1 을 Xcl2 로 치환했다는 점을 제외하고는, 백시바디를 상기 기술된 바와 같이 제조하였다.
HEK293E 세포를 쥐과 Xcl1-HA (mXcl1), 인간 Xcl1-HA (hXcl1) 또는 인간 Xcl2-HA (hXcl2) 백시바디를 인코딩하는 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 상청액을 48 시간 후 수확하고 ELISA 에 의해 백시바디의 분비를 분석하였다. 모든 3 개의 백시바디는 효율적으로 발현되고 분비되었으며, mXcl1 보다는 hXcl1 및 hXcl2 가 더욱 양호하게 발현되었다. 결과를 도 8 에 나타냈다. 다음으로, Balb/c 마우스를 mXcl1, hXcl1 또는 hXcl2-HA 백시바디를 인코딩하는 DNA 25 ㎍ 으로 면역화하였다. 면역화 14 일 후 혈액 샘플을 수집하고 IgG1 및 IgG2a 의 혈청 역가를 ELISA 에 의해 결정하였다. 둘 모두의 hXcl1 및 hXcl2 는 mXcl1 보다 더욱 높은 IgG1 및 IgG2a 반응을 유도했다. 결과를 도 9a 및 9b 에 나타냈다. 이어서, Balb/c 마우스를 mXcl1, hXcl1 또는 hXcl2-HA 백시바디를 인코딩하는 DNA 25 ㎍ 으로 면역화하고, 백신화 14 일 후 인플루엔자 바이러스의 치사량으로 실험하였다. 결과를 도 10(a) 에 나타내었으며, 이는 7 일 동안 체중 감소를 모니터링한 것이며, 이를 질병 진행의 징후로서 사용하였다. HA 단독 또는 NaCl 로 백신화된 마우스를 바이러스 감염시켰고 mXcl1, hXcl1 또는 hXcl2 로 백신화된 마우스는 실험에서 생존하였다. 도 10(b) 은 감염 7 일 후 모든 마우스에 대한 체중 감소를 나타낸다.
참고 문헌
상기 언급된 모든 공보 및 특허 문헌은 본원에 참조로서 포함되어 있다. 본 발명의 범주 및 취지 이내에서 본 발명의 방법 및 시스템에 대해 다양한 변형 및 변경을 가할 수 있음은 분명한 일이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 연계되어 기술되더라도, 본 발명은 이러한 특정 구현예에 한정되지 않는다. 실제로, 하기 첨부된 특허청구범위 이내에서, 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방식에 대해서 다양한 변형이 가능함은 당업자게 자명하다.
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20
Claims (14)
- SEQ ID NO 1, 2 또는 3 에 대해 80 % 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적화 단위 및 항원 단위를 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항에 있어서, 표적화 단위 및 항원 단위가 이량체화 모티프를 통해 연결되는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항원 단위가 항원성 scFv, 박테리아 항원, 바이러스 항원 및 암 연계된 항원 또는 암 특이적 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단위가 SEQ ID NO 1, 2 또는 3 에 대해 90 % 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단위가 SEQ ID NO 1, 2 또는 3 에 대해 95 % 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단위가 SEQ ID NO 1, 2 또는 3 의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체로서 존재하는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체화 도메인이 인간 IgG3 이량체화 도메인 (hCH3) 을 포함하는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 교차-제시 DC 상의 Xcr1 에 결합하는 융합 폴리펩티드.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드 또는 이러한 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 백신.
- 제 11 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 백신.
- 대상체가 항원에 대한 면역 반응을 일으키도록 하는 조건 하에서 제 11 항 또는 제 12 항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 유도하는 방법.
- 대상체에서 면역 반응을 일으키기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제 11 항 또는 제 12 항의 백신의 용도.
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