JP6975716B2 - 樹状細胞標的化ペプチド、当該ペプチドを利用したペプチド融合体、及び当該ペプチド融合体を利用したワクチン - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Description
項1. 以下の(i)及び(ii)に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも1個有するペプチド:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列、
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列における1位及び2位のアミノ酸残基の少なくともいずれかがアラニン残基に置換されたアミノ酸配列。
項2. 前記(i)に示すアミノ酸配列からなるモチーフ配列を1〜5個有している、項1に記載のペプチド。
項3. 項1又は2に記載のペプチドをコードしているDNA分子。
項4. 抗原タンパク質又は抗原ペプチドに、項1又は2に記載のペプチドが結合している、ペプチド融合体。
項5. 抗原タンパク質又は抗原ペプチドのC末端側に、項1又は2に記載のペプチドのN末端が結合している、項4に記載のペプチド融合体。
項6. 前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、癌抗原タンパク質又は癌抗原ペプチドである、項4又は5に記載のペプチド融合体。
項7. 前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原ウイルスの抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、項4又は5に記載のペプチド融合体。
項8. 前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原細菌の抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、項4又は5に記載のペプチド融合体。
項9. 項4〜8のいずれかに記載のペプチド融合体を含む、ワクチン製剤。
項10. 経肺投与用である、項9に記載のワクチン製剤。
[アミノ酸配列]
本発明のペプチドは、以下の(i)及び(ii)に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも1個有するペプチドである:
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列(以下、当該アミノ酸配列を「(i)のモチーフ配列」と表記することがある)
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列における1位及び2位のアミノ酸残基の少なくともいずれかがアラニン残基に置換されたアミノ酸配列(以下、当該アミノ酸配列を「(ii)のモチーフ配列」と表記することがある)。
本発明のペプチドの製造方法については、特に制限されず、アミノ酸を所定の配列となるように結合させることにより化学的に合成してもよく、また、後述する本発明のペプチドをコードしているDNA分子を使用して遺伝子工学的手法を用いて製造してもよい。
本発明のペプチドは、抗原タンパク質又は抗原ペプチドと融合させた状態で投与すると、樹状細胞に結合して効率的に取り込まれるため、優れたワクチン効果を奏する。よって、ワクチンに用いる抗原タンパク質又は抗原ペプチドの樹状細胞へのキャリアーペプチドとして使用される。
本発明のペプチド融合体は、抗原タンパク質又は抗原ペプチドに前記ペプチドを結合させた融合体である。
本発明のワクチン製剤は、前記ペプチド融合体を含む。本発明のワクチン製剤は、前記ペプチド融合体の他に、薬学的に許容される担体や賦形剤を適宜組み合わせて配合し、公知の製剤化手法に従って製剤化することにより調製することができる。
ランダムな7個以下のアミノ酸からなる約10億種類のランダムペプチドを提示しているファージライブラリーを用いて、以下に示すパニング操作を行った。
(1)ペプチド融合体の製造
前記試験例1で同定されたFL4、FL5、FL8、及びFL20のアミノ酸配列をタンデムに3個直接結合しているペプチドのN末端を、PspAのC末端に結合させたペプチド融合体を製造した。なお、製造したペプチド融合体のアミノ酸配列は、例えば、FL4の場合には、[PspAのアミノ酸配列]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR]である。
7週齢のC57BL/6JJmsSlcマウス(以下、C57BL/6マウスと略すこともある)の尾根部に、PspA量換算で1μgの前記ペプチド融合体又はPspAを含む生理食塩水50μLをDay 0及びDay 10に投与し、Day 17に血液を回収した。コントロールとして、生理食塩水のみを同様に投与した場合についても試験を行った。更に、PspA量換算で1μgの前記ペプチド融合体又はPspAと共に、10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド(K3型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製)を含む生理食塩水50μLを同様に投与した場合についても試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。
前記試験例2で作成したFL4のアミノ酸配列をタンデムに3個直接結合しているペプチドのN末端をPspAのC末端に結合させたペプチド融合体(FL4-PspA、アミノ酸配列:[PspAのアミノ酸配列]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR])を用いて、以下の試験を行った。
(1)ビオチン化ペプチド/ストレプトアビジン複合体の製造
前記試験例1で同定されたFL4のアミノ酸配列からなるペプチド並びにFL39のアミノ酸配列からなるペプチド又はそのスクランブルペプチド(アミノ酸配列:RPSVSRA)にビオチンを結合させたビオチン化ペプチドを合成した。次いで、得られたビオチン化ペプチドにストレプトアビジンを結合させることにより、ビオチン化ペプチド/ストレプトアビジン複合体を製造した。
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、ストレプトアビジン量換算で5μgの前記複合体又はストレプトアビジンを含む生理食塩水50μLをDay 0及びDay 10に投与し、Day 17に血液を回収した。コントロールとして、生理食塩水のみを同様に投与した場合についても試験を行った。更に、5μgのストレプトアビジンと共に、10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド(K3型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製)を含む生理食塩水50μLを同様に投与した場合についても試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。
R/K-X-X-R/Kからなるモチーフ配列を有するペプチドはNeuropilin-1に結合することが知られているので、樹状細胞におけるNeuropilin-1の発現を検討した。
前記試験例1において、骨髄由来の樹状細胞に対する結合が確認されたファージクローン(FL4及びFL8)を使用して、脾臓細胞への結合能を評価した。具体的には、マウスから回収した脾臓細胞1×105 cellsと1.6×1010 pfu/mLの各ファージクローンを混合した後、ファージに対するビオチン化抗体を加え、更に蛍光色素で修飾されたストレプトアビジンを加えて、フローサイトメトリー解析により、ファージの脾臓細胞への結合性を評価した。また、陰性コントロールとして、前記試験例1において、骨髄由来の樹状細胞に対する結合が確認されなかったファージクローン(FL44)を用いて、同様に試験を行った。
(1)ビオチン化ペプチド/ストレプトアビジン複合体の製造
前記試験例1で同定されたFL4のアミノ酸配列からなるペプチド及びそのスクランブルペプチド(アミノ酸配列:YRSIVKA)を用いて、前記試験例4と同様の方法で、ビオチン化ペプチド/ストレプトアビジン複合体を製造した。また、従来、Neuropilin-1への結合性が報告されている陽性コントロールペプチド(アミノ酸配列:RPARPAR)を使用して、前記と同様の方法でビオチン化ペプチド/ストレプトアビジン複合体を製造した。なお、ストレプトアビジンは、蛍光(PE)標識を付したものを使用した。
対象となる各種細胞と0.6μgの各種複合体を混合した後、フローサイトメトリー解析により、各種複合体の細胞への結合性を評価した。使用した細胞は、FL-DCが1×105 cells、脾臓からMACSを用いて精製したCD11c陽性細胞(脾臓由来樹状細胞)が1×106 cells、及びマウス脾臓細胞が1×106 cellsである。
(1)ペプチド融合体の製造
FL4のアミノ酸配列からなるペプチドのN末端を、ニワトリ卵白アルブミン(OVA)中のMHCクラスIエピトープペプチドであるSL8(SIINFEKL)のC末端に結合させたペプチド融合体(SL8-FL4)を作製した。当該ペプチド融合体のアミノ酸配列は、具体的には、[SL8のアミノ酸配列(SIINFEKL)]-[VSYKAIR]であり、当該ペプチド融合体の製造方法は、SL8をコードしているDNA分子を使用したこと以外は、PspA-FL4の場合と同様である。また、FL8、及びFL4のスクランブルペプチド(FL4Scr、アミノ酸配列:YRSIVKA)を用いて、同様にSL8と融合させたペプチド融合体(SL8-F8、及びSL8-FL4Scr)をそれぞれ作製した。
7週齢のC57BL/6マウスの耳部の皮下に、SL8量換算で50μgの各ペプチド融合体及び10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド(K3型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製)を含む生理食塩水50μLを、Day 0に投与し、Day 7に所属リンパ節を採取して、テトラマーアッセイを行った。また、SL8 50μgを単独で含む生理食塩水50μLを投与した場合、SL8 50μgとCpGオリゴデオキシヌクレオチド50μgを含む生理食塩水50μLを投与した場合、並びに生理食塩水のみを投与した場合(コントロール)についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。
本試験では、SL8-FL4で誘導されるSL8特異的CD8+CTLにより、がんの退縮効果が認められるかを評価した。本試験では、がん細胞として、EG7細胞(C57BL/6マウスの胸腺種に由来するEL4細胞にOVAタンパク質を発現させたがん細胞)を使用した。具体的試験方法は、以下の通りである。
Kras遺伝子は、肺がん、膵がん、大腸がん等の多くのがんで変異が認められるドライバー遺伝子である。特に、KrasのN末端側から12番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたG12D変異は多く認められる。そのため、G12D変異を含むKrasの部分配列は、がん特異的抗原としてがんワクチンの開発の標的になり得るものとして期待されている。そこで本試験では、G12D変異を含むKrasの部分ペプチドを使用して、FL4の抗原特異的CD8+CTL誘導能を評価した。
FL4のアミノ酸配列からなるペプチドのN末端を、G12D変異を含むKrasの部分ペプチド(G12D由来ペプチド;LVVVGADGV;G12D変異を含むKrasのN末端側から6〜14番目のアミノ酸配列)のC末端に結合させたペプチド融合体(G12D-FL4)を作製した。当該ペプチド融合体のアミノ酸配列は、具体的には、[G12D変異を含むKrasの部分配列(LVVVGADGV)]-[VSYKAIR]であり、当該ペプチド融合体の製造方法は、G12D由来ペプチドをコードしているDNA分子を使用したこと以外は、PspA-FL4の場合と同様である。
7週齢のC57BL/6マウスの耳部の皮下に、G12D由来ペプチド量換算で50μgのG12D-FL4及び10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド(K3型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製)を含む生理食塩水50μLを、Day 0に投与し、Day 7に所属リンパ節を採取して、免疫細胞を回収した。次いで、回収した免疫細胞1 ( 106 cellsを、RPMI培地100 μLに加え、37℃で24時間培養した後に、培養液中のIFN-γ濃度を測定した。また、G12D由来ペプチド50μgとCpGオリゴデオキシヌクレオチド10μgを含む生理食塩水50μLを投与した場合、並びに生理食塩水のみを投与した場合(コントロール)についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。
(1)ビオチン化ペプチドの製造
前記試験例1で同定されたFL4のアミノ酸配列からなるペプチド及びその1番目のアミノ酸残基をアラニン残基に置換したペプチドMut 1(アミノ酸配列:ASYKAIR(配列番号2))それぞれのN末端にビオチンを結合させたビオチン化ペプチドを合成した。
マウス樹状細胞(DC2.4細胞)1×105 cellsに、0.6μgの各種ビオチン化ペプチドを4℃条件下で加えた後、蛍光(PE)標識ストレプトアビジンを加えることによってビオチン化ペプチド/ストレプトアビジン複合体を得て、フローサイトメトリー解析により、各種複合体の細胞への結合性を評価した。
(1)ビオチン化ペプチド/NA複合体の製造
前記試験例1で同定されたFL4、その1番目のアミノ酸残基をアラニン残基に置換したペプチドMut 1(アミノ酸配列:ASYKAIR(配列番号2))、及びその2番目のアミノ酸残基をアラニン残基に置換したペプチドMut 2(アミノ酸配列:VAYKAIR(配列番号3))、並びに、その3番目のアミノ酸残基をアラニン置換したペプチドMut 3(アミノ酸配列:VSAKAIR)、及びその5番目のアミノ酸残基をアラニン置換したペプチドMut 4(アミノ酸配列:VSYKAAR)それぞれのN末端にビオチンを結合させた、ビオチン化ペプチドを合成した。次いで、得られたビオチン化ペプチドとニュートラアビジンとを混合させることにより、ビオチン化ペプチド/ニュートラアビジン複合体を製造した。
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、ニュートラアビジン量換算で5μgの前記複合体又はニュートラアビジンを含む生理食塩水50μLをDay 0及びDay 10に投与し、Day 17に血液を回収した。コントロールとして、生理食塩水のみを同様に投与した場合についても試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。
従来の注射型ワクチンでは、肺組織等の粘膜面での免疫応答を効率的に誘導できないことが知られている。そのため、肺がん等を標的とした治療薬の開発では、肺組織で強く抗原特異的CD8+CTLを誘導できるワクチンが待望されている。そこで、本試験では、SL8-FL4を使用して、経肺投与による抗原特異的CD8+CTL誘導能を評価した。
本試験では、SL8-FL4を使用して、経肺投与と皮下投与によるCD8+細胞傷害性T細胞誘導能の比較を行った。7週齢のC57BL/6マウスに、SL8量換算で50μgのSL8-FL4及び10μgのCpGオリゴデオキシヌクレオチド(K3型、製品名「K3 Et-Free」、製品番号「CN-65003」、ジーンデザイン社製)を含む生理食塩水40μLを、Day 0及びDay 7に経肺投与又は皮下投与し、Day 14に所属リンパ節、及び脾臓を採取して、前記試験例8と同様の手法でテトラマーアッセイを行った。また、生理食塩水のみを皮下投与した場合(コントロール)についても、同様に試験を行った。なお、本試験では、各群5匹のマウスを使用した。
Claims (10)
- 配列番号1〜3に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも2個有するペプチド。
- 前記モチーフ配列を2〜5個有している、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1又は2に記載のペプチドをコードしているDNA分子。
- 抗原タンパク質又は抗原ペプチドに、配列番号1〜3に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも1個有するペプチドが結合している、ペプチド融合体。
- 抗原タンパク質又は抗原ペプチドのC末端側に、配列番号1〜3に示すアミノ酸配列から選ばれるモチーフ配列を少なくとも1個有するペプチドのN末端が結合している、請求項4に記載のペプチド融合体。
- 前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、癌抗原タンパク質又は癌抗原ペプチドである、請求項4又は5に記載のペプチド融合体。
- 前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原ウイルスの抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、請求項4又は5に記載のペプチド融合体。
- 前記抗原タンパク質又は抗原ペプチドが、病原細菌の抗原タンパク質又は抗原ペプチドである、請求項4又は5に記載のペプチド融合体。
- 請求項4〜8のいずれかに記載のペプチド融合体を含む、ワクチン製剤。
- 経肺投与用である、請求項9に記載のワクチン製剤。
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