CN109415410A - 靶向树突细胞的肽、利用了该肽的肽融合体、及利用了该肽融合体的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供一种将抗原有效地递送到树突细胞、可提高抗原的疫苗效果的肽。通过使具有至少1个模体序列的肽与抗原蛋白或抗原肽结合，从而该抗原蛋白或抗原肽被有效地递送到树突细胞，能够发挥特别优异的疫苗效果，其中，所述模体序列包含由序列号1构成的氨基酸序列或该氨基酸序列的第1位及第2位的氨基酸残基中的至少任一者变异的氨基酸序列。

Description

靶向树突细胞的肽、利用了该肽的肽融合体、及利用了该肽融 合体的疫苗
技术领域
本发明涉及一种将抗原有效地递送到树突细胞、可提高抗原的疫苗效果的肽。另外，本发明涉及一种该肽结合于抗原蛋白或抗原肽而成的肽融合体、及使用了该肽融合体的疫苗。
背景技术
利用疫苗预防传染病或癌的基本原理在于，通过人为的疑似感染而诱导获得性免疫，诱导针对特定的病原体的抗体的产生或细胞性免疫。近年来，在利用疫苗预防传染病时重现安全性，期待由使用弱毒株等的活疫苗转为不使用病原体本身而是使用源自病原体的蛋白质或肽作为抗原来开发疫苗。
但是，单独给药成为抗原的蛋白质或肽则几乎不转移至作为免疫诱导位置的淋巴节，也不被摄入作为免疫担当细胞的树突细胞，因此，难以诱导免疫应答。因此，在开发疫苗方面抗原的体内动态控制变得不可缺少。进而，为了充分地诱导针对病原体的防御免疫，并用免疫激活剂(佐剂)变得重要，但可诱导充分的免疫应答的佐剂不足已成为疫苗开发中的巨大障碍之一。
以往也尝试过利用肽作为用于将抗原有效地递送到树突细胞的载体。例如，非专利文献1中公开有：肽WH(氨基酸序列：WPRFHSSVFHTH)能够与树突细胞中表达的Clec9a选择性地结合，因此，可以作为面向树突细胞的载体肽使用。另外，非专利文献2中公开有，NW肽(氨基酸序列：NWYLPWLGTNDW)对树突细胞的结合能力高，可以在对树突细胞的抗原的递送中使用。但是，非专利文献1及2中公开的载体肽存在如下缺点：如果不与佐剂并用，则不能充分地发挥疫苗效果。
另一方面，非专利文献3中报道有：神经纤毛(Neuropilin)-1在癌细胞中表达，具有由R/K-X-X-R/K(X为任意的氨基酸)构成的模体序列的肽与癌细胞表面的神经纤毛-1结合，被摄入于癌细胞内，尝试了使用具有该模体序列的肽进行向癌组织的药物递送。
另外已知，一部分免疫细胞(树突细胞、调节性T细胞)也表达神经纤毛-1。但是，目前关于具有由R/K-X-X-R/K构成的模体序列的肽，没有进行应用于免疫控制的研究。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Zhongyi et al.A novel peptide targeting Clec9a ondendritic cell for cancer immunotherapy.Oncotarget,Vol.7,No.26,40437-40450
非专利文献2:Sioud et al.A novel peptide carrier for efficient targetingof antigens and nucleic acids to dendritic cells.FASEB J.,Vol.27,3272-3283
非专利文献3:Sugahara et al.,Tissue-penetrating delivery of compounds andnanoparticles into tumors.Cancer cell,Vol.16,No.5,510-520
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供一种将抗原有效地递送到树突细胞、可提高抗原蛋白或抗原肽的疫苗效果的肽(载体肽)。进而，本发明的目的在于，提供一种该肽结合于抗原蛋白或抗原肽而成的肽融合体、及使用了该肽融合体的疫苗制剂。
用于解决问题的技术方案
本发明人为了解决所述课题，进行了深入研究。具体而言，本发明人首先利用使用在表面展示由随机的7个以下的氨基酸构成的约10亿种随机肽的噬菌体文库的网罗性筛选法，鉴定了约30种可选择性地结合树突细胞的肽。鉴定出的肽中有多个具有由R/K-X-X-R/K(X为任意的氨基酸)构成的模体序列。接着，使鉴定出的肽与抗原蛋白或抗原肽结合并免疫小鼠，结果，仅在使用具有由序列号1构成的氨基酸序列的肽时诱导特别优异的免疫应答，其与使用其它具有由R/K-X-X-R/K构成的模体序列的肽具有不同的作用。进而确认：使具有由序列号1构成的氨基酸序列的肽与抗原蛋白或抗原肽结合而成的肽融合体有时即使不使用佐剂也可发挥优异的疫苗效果。本发明是基于这些见解，进一步重复进行了研究而完成的。
即，本发明提供下述中揭示的形态的发明。
项1.一种肽，其具有至少1个选自以下的(i)及(ii)所示的氨基酸序列中的模体序列：
(i)序列号1所示的氨基酸序列；
(ii)序列号1所示的氨基酸序列中的第1位及第2位的氨基酸残基中的至少任一者被置换为丙氨酸残基的氨基酸序列。
项2.根据项1所述的肽，其具有1～5个由所述(i)所示的氨基酸序列构成的模体序列。
项3.一种DNA分子，其编码项1或2所述的肽。
项4.一种肽融合体，其在抗原蛋白或抗原肽上结合有项1或2所述的肽。
项5.根据项4所述的肽融合体，其中，在抗原蛋白或抗原肽的C末端侧结合有项1或2所述的肽的N末端。
项6.根据项4或5所述的肽融合体，其中，所述抗原蛋白或抗原肽为癌抗原蛋白或癌抗原肽。
项7.根据项4或5所述的肽融合体，其中，所述抗原蛋白或抗原肽为病原病毒的抗原蛋白或抗原肽。
项8.根据项4或5所述的肽融合体，其中，所述抗原蛋白或抗原肽为病原菌的抗原蛋白或抗原肽。
项9.一种疫苗制剂，其含有项4～8中任一项所述的肽融合体。
项10.根据项9所述的疫苗制剂，其为经肺给药用。
发明效果
本发明的肽可以与树突细胞选择性地结合，因此，通过与抗原蛋白或抗原肽融合，可以将该抗原蛋白或抗原肽有效地递送到树突细胞。另外，本发明的肽诱导由其所结合的抗原蛋白或抗原肽引起的免疫应答的作用特别高，即使不使用佐剂，也可看到发挥优异的疫苗效果的情况。这样，本发明的肽可以发挥将抗原蛋白或抗原肽向树突细胞有效递送、及优异的疫苗效果，因此，也可以使抗原蛋白或抗原肽的给药量减少。这样的效果在使用具有由R/K-X-X-R/K构成的模体序列的其它肽的情况下无法看到，是本申请发明的肽所特有的。
附图说明
图1是表示在试验例1中为了得到树突细胞所结合的噬菌体而进行3次淘洗操作、求出在各操作次数中所回收的噬菌体的数的结果的图。
图2是表示试验例1中将进行了克隆化的噬菌体和源自小鼠的树突细胞进行混合、通过流式细胞计分析而评价噬菌体对树突细胞的结合性的结果的代表例的图。
图3是在试验例2中测定了给药各种肽融合体的小鼠血清中的PspA特异性IgG量的结果。
图4是在试验例2中测定了给药各种肽融合体的小鼠血清中的PspA特异性IgG1量的结果。
图5是在试验例2中测定了给药各种肽融合体的小鼠血清中的PspA特异性IgG2c量的结果。
图6是在试验例3中对用肽融合体进行了免疫的小鼠给药肺炎链球菌、经时地观察了体重变化及生存率的结果。
图7是在试验例4中测定了给药生物素化肽/链霉亲和素复合体的小鼠血清中的链霉亲和素特异性抗体(总IgG、IgG1及IgG2c)量的结果。
图8是在试验例5中通过流式细胞计分析评价了树突细胞及脾脏细胞的神经纤毛-1的表达的结果。
图9是在试验例6中评价了噬菌体克隆(FL4及FL8)对脾脏细胞中所含的树突细胞的结合性的结果。
图10是在试验例6中评价了噬菌体克隆(FL4及FL8)对脾脏细胞中所含的B细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞的结合性的结果。
图11是在试验例7中评价了生物素化肽/链霉亲和素复合体对源自骨髄的树突细胞(FL-DC)的结合性的结果。
图12是在试验例7中评价了生物素化肽/链霉亲和素复合体对由脾脏纯化的树突细胞的结合性的结果。
图13是在试验例7中评价了生物素化肽/链霉亲和素复合体对脾脏细胞的结合性的结果。
图14是在试验例8中对给药各种肽融合体的小鼠的所属淋巴节进行了四聚物分析的结果。
图15是在试验例9中对移植了EG7细胞的小鼠给药SL8和FL4的肽融合体或SL8、经时地测定了肿瘤尺寸的结果。
图16是在试验例10中使用从给药源自G12D的肽和FL4的肽融合体、或源自G12D的肽的小鼠的所属淋巴节回收的免疫细胞、评价了抗原特异性CD8+CTL的诱导能力(IFN-γ产生能力)的结果。
图17是在试验例11中评价了生物素化肽/链霉亲和素复合体对树突细胞的结合性的结果。
图18是在试验例12中测定了给药生物素化肽/中性抗生物素蛋白复合体的小鼠血清中的中性抗生物素蛋白特异性抗体(总IgG)量的结果。
图19是在试验例13中对经肺给药SL8和FL4的肽融合体的小鼠的肺所属淋巴节、肺组织、及脾脏进行了四聚物分析的结果。
图20是在试验例14中对经肺给药或皮下给药SL8和FL4的肽融合体的小鼠的脾脏及肺所属淋巴节进行了四聚物分析的结果。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。需要说明的是，在序列表以外，氨基酸序列中的20种氨基酸残基有时用单字符缩写来表示。即，甘氨酸(Gly)为G，丙氨酸(Ala)为A，缬氨酸(Val)为V，亮氨酸(Leu)为L，异亮氨酸(Ile)为I，苯丙氨酸(Phe)为F，酪氨酸(Tyr)为Y，色氨酸(Trp)为W，丝氨酸(Ser)为S，苏氨酸(Thr)为T，半胱氨酸(Cys)为C，甲硫氨酸(Met)为M，天冬氨酸(Asp)为D，谷氨酸(Glu)为E，天冬酰胺(Asn)为N，谷氨酰胺(Gln)为Q，赖氨酸(Lys)为K，精氨酸(Arg)为R，组氨酸(His)为H，脯氨酸(Pro)为P。
另外，本说明书中，就所示出的氨基酸序列而言，左端为N末端，右端为C末端。
1.肽(载体肽)
[氨基酸序列]
本发明的肽为具有至少1个选自以下的(i)及(ii)所示的氨基酸序列中的模体序列的肽：
(i)序列号1所示的氨基酸序列(以下，有时将该氨基酸序列记为“(i)的模体序列”)
(ii)序列号1所示的氨基酸序列中的第1位及第2位的氨基酸残基中的至少任一者被置换为丙氨酸残基的氨基酸序列(以下，有时将该氨基酸序列记为“(ii)的模体序列”)。
(i)的模体序列为由VSYKAIR(序列号1)构成的氨基酸序列。序列号1所示的氨基酸序列中的第7位的精氨酸残基被认为与对树突细胞的选择性结合或疫苗效果有关。关于序列号1所示的氨基酸序列中的第4位的赖氨酸残基，也被认为与对树突细胞的选择性结合或疫苗效果有关。
(ii)的模体序列只要是在(i)的模体序列中、第1位及第2位的氨基酸残基中的至少任一者被置换为丙氨酸残基的氨基酸序列，就没有特别限定，从优选发挥对树突细胞的选择性结合或疫苗效果的观点出发，优选举出第1位的氨基酸残基被置换为丙氨酸残基的由ASYKAIR(序列号2)构成的氨基酸序列、及第2位的氨基酸序列被置换为丙氨酸残基的由VAYKAIR(序列号3)构成的氨基酸序列，更优选举出由序列号2构成的氨基酸序列。
本发明的肽可以仅具有1个所述(i)或(ii)的模体序列，另外，也可以为所述(i)及(ii)的模体序列中的2个以上模体序列重复结合而成的序列。从发挥更进一步优异的疫苗效果的观点出发，作为本发明的肽中所含的所述模体序列的数，可举出1个以上、优选为1～10个、进一步优选为1～5个、更优选为1～3个。
在本发明的肽中，2个以上的模体序列重复结合的情况下，就各模体间的结合而言，可以是一个模体序列的C末端和另一个模体序列的N末端直接利用肽键进行结合，另外，也可以是一个模体序列的C末端和另一个模体序列的N末端经由由1～15个左右、优选1～12个左右、进一步优选1～10个左右的任意的氨基酸构成的接头序列而利用肽键进行结合。对该接头序列的氨基酸序列，没有特别限制，可举出例如GGGGS等。
作为本发明的多肽，从更进一步有效地发挥疫苗效果的观点出发，可举出优选具有1个以上(i)的模体序列的肽、进一步优选具有1～5个(i)的模体序列的肽、特别优选含有1～3个(i)的模体序列的肽。
本发明的肽可以为由1个以上的模体序列和根据需要设置于各模体序列间的接头序列构成的肽。这样的肽的氨基酸序列成为[模体序列]1－[(接头序列)0～1－(模体序列1)]0～X-1(X为本发明的肽中所含的模体序列的数)。
另外，本发明的肽也可以为：除1个以上的模体序列和根据需要设置的所述接头序列以外还在N末端和/或C末端侧添加了1～100个、优选1～20个、进一步优选1～5个任意的氨基酸的肽。这样的肽的氨基酸序列成为[添加的序列]0～1－[模体序列]1－[(接头序列)Y－(模体序列1)]0～X-1－[添加的序列]Z(X为本发明的肽中所含的模体序列的数，Y及Z为1或0，Y及Z中的至少一个为1)。但是，优选本发明的肽的C末端成为模体序列的C末端(即，在C末端不具有所述添加的序列)。
[制造方法]
关于本发明的肽的制造方法，没有特别限制，可以使氨基酸以成为给定的序列的方式结合从而化学合成，另外，也可以使用后述的编码本发明的肽的DNA分子利用基因工程方法而制造。
以下，对通过基因工程方法制造本发明的肽的方法进行说明。
为了通过基因工程方法制造本发明的肽，将产生本发明的肽的转化体进行培养即可。
产生本发明的肽的转化体可以如下得到：制作含有编码本发明的肽的DNA分子的表达载体，使用其转化宿主，从而得到。
关于编码本发明的肽的DNA分子的碱基序列，只要是本领域技术人员，就可以按照本发明的肽的氨基酸序列适当设计。例如，作为编码由序列号1所示的氨基酸序列构成的肽的碱基序列，可举出序列号4所示的碱基序列。另外例如，作为编码3个序列号1所示的氨基酸序列不经由接头而直接结合的肽的碱基序列，可举出序列号5所示的碱基序列。
关于编码本发明的肽的DNA分子，可以通过化学合成而得到，另外，也可以通过将编码本发明的肽的DNA分子用作模板并使其扩增而得到。
编码本发明的肽的DNA分子优选使密码子利用频率最适合于宿主。例如，如果是使用大肠杆菌作为宿主的情况，则使密码子利用频率最适合于大肠杆菌的DNA分子是优选的。
在含有编码本发明的肽的DNA分子的表达载体中，包含与该DNA分子可工作地连结的启动子等控制因子。作为控制因子，代表而言可举出启动子，进一步根据需要可以含有增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI部位等的转录要素。另外，可工作地连结是指：调节编码本发明的肽的DNA分子的启动子、增强子等各种控制因子和本发明的DNA分子在宿主细胞中以可工作的状态连结。该表达载体优选在所述DNA分子的下游含有转录终结信号。该表达载体进一步可以含有用于选择转化体的选择标记基因。另外，作为表达载体，优选在宿主内可独立地增殖的噬菌体、质粒、或由病毒构建的作为基因重组用途的表达载体。
作为转化体的制造中所使用的宿主，只要所述表达载体稳定、且可独立增殖且能够表达外源基因的性状，就没有特别限制，作为优选的实例，可举出例如属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等假单胞菌属等的细菌；酵母等，此外，也可以为动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。这些中，特别优选大肠杆菌。
该转化体可以通过将所述表达载体导入于宿主而得到，将所述表达载体导入于宿主的条件只要根据宿主的种类等而适当设定即可。如果宿主为细菌的情况，则可举出例如使用钙离子处理而得的感受态细胞的方法及电蚀孔法(电穿孔法)等。如果宿主为酵母的情况，则可举出例如电蚀孔法、原生质球法及醋酸锂法等。如果宿主为动物细胞的情况，则可举出例如电蚀孔法、磷酸钙法及脂质体转染法等。
所述转化体的培养条件只要考虑宿主的营养和生理性质而适当设定即可，优选举出液体培养。另外，如果为进行工业制造的情况，则优选通气搅拌培养。
将所述转化体进行培养，将培养液通过离心分离等方法回收培养上清液或菌体。如果为本发明的肽蓄积于菌体内的情况，则将菌体利用超声波、弗氏压碎器压等机械方法或溶菌酶等溶解菌体的酶实施处理，根据需要通过使用蛋白酶等的酶或十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂而进行可溶化，可以得到含有本发明的肽的水溶性组分。
将这样得到的培养液或水溶性组分根据需要进行浓缩后，使用凝胶过滤、疏水性色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等进行纯化，由此可以得到本发明的肽。
[用途]
本发明的肽以与抗原蛋白或抗原肽融合的状态进行给药时，结合于树突细胞而被有效地摄入，因此，发挥优异的疫苗效果。因此，作为用于疫苗的抗原蛋白或抗原肽面向树突细胞的载体肽被使用。
另外，使本发明的肽与CpG寡聚脱氧核苷酸等佐剂复合化而提高佐剂对树突细胞的递送能力，从而可期待使佐剂活性增强的效果，因此，也可以作为佐剂进入树突细胞的载体肽使用。
2.肽融合体
本发明的肽融合体为在抗原蛋白或抗原肽上结合有所述肽的融合体。
在本发明的肽融合体中，关于结合所述肽的抗原的种类，只要是在生物体内可诱导免疫应答的蛋白质或肽即可，根据成为防御对象的传染病或疾病的种类等适当设定即可，可举出例如：流感病毒、禽流感病毒、副流感病毒、腺病毒、SARS病毒、AIDS病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘·带状疱疹病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、人乳头瘤病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、霍乱病毒、狂犬病病毒、病毒性出血热(埃博拉出血热、马尔堡病、拉沙热、克里米亚-刚果出血热等)的原因病毒等的病原病毒(优选流感病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘·带状疱疹病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒等病原病毒)的抗原蛋白或抗原肽；白喉、破伤风、结核菌、肺炎链球菌、脑膜炎球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、百日咳杆菌、炭疽菌、立克次氏体、沙门杆菌等病原菌(优选为白喉、破伤风、肺炎链球菌、脑膜炎球菌、百日咳杆菌等病原菌)的抗原蛋白或抗原肽；隐球菌病·曲霉菌病等病原真菌的抗原蛋白或抗原肽；疟原虫等的病原性生物的抗原蛋白或抗原肽；恶性黑素瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、肝癌、大肠癌、舌癌、甲状腺癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、胆道癌、皮肤癌、咽喉癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髄瘤、白血病癌等的癌抗原蛋白或癌抗原肽等。
在本发明的肽融合体中，在抗原蛋白或抗原肽的N末端及C末端的一方或两者上结合所述肽(载体肽)即可。从更进一步有效地发挥疫苗效果的观点出发，优选举出在抗原蛋白或抗原肽的C末端结合所述肽(载体肽)的形态。
在本发明的肽融合体中，就在抗原蛋白或抗原肽的N末端结合有所述肽(载体肽)的形态而言，可以是抗原蛋白或抗原肽的N末端和所述肽(载体肽)C末端利用肽键直接结合，另外也可以经由由1～15个、优选为1～12个、进一步优选为1～10个任意的氨基酸构成的接头序列而利用肽键进行结合。关于该接头序列的氨基酸序列，没有特别限制，可举出例如GGGGS等。
另外，在本发明的肽融合体中，就在抗原蛋白或抗原肽的C末端结合有所述肽(载体肽)的形态而言，可以是抗原蛋白或抗原肽的C末端和所述肽(载体肽)N末端利用肽键直接结合，另外也可以经由由1～15个、优选1～12个、进一步优选1～10个任意的氨基酸构成的接头序列而利用肽键进行结合。关于该接头序列的氨基酸序列，没有特别限制，可举出例如GGGGS等。
关于本发明的肽融合体的制造方法，没有特别限制，可举出例如：通过使抗原蛋白或抗原肽和所述肽(载体肽)根据需要经由所述接头序列进行结合而制造的方法；制作编码本发明的肽融合体的DNA分子，使用该DNA分子通过基因工程方法制造的方法等。
本发明的肽融合体可以利用所述肽(载体肽)将抗原蛋白或抗原肽有效地递送到树突细胞，而且，有时即使不使用佐剂，也发挥优异的疫苗效果，因此，可作为疫苗使用。
3.疫苗制剂
本发明的疫苗制剂含有所述肽融合体。本发明的疫苗制剂可以通过除所述肽融合体之外还适当组合并配合药学上允许的载体或赋形剂、按照公知的制剂化方法进行制剂化而制备。
所述肽融合体有时即使不使用佐剂，也发挥优异的疫苗效果，因此，在本发明的疫苗制剂中可以不含有佐剂。在本发明的疫苗制剂中不含有佐剂的情况下，可以根据需要在疫苗给药之前或之后给药佐剂，谋求疫苗效果的进一步提高。另一方面，通过在本发明的疫苗制剂中含有CpG寡聚脱氧核苷酸、弗氏佐剂、氢氧化铝(Alum)、明矾等的佐剂，可以谋求疫苗效果的进一步提高。
关于本发明的疫苗制剂的剂型，没有特别限制，可举出例如：注射剂、片剂、栓剂、胶囊剂、糖浆剂、微胶囊剂、贴剂、气溶胶剂、喷雾剂等。
关于本发明的疫苗制剂的给药对象，只要是要求利用所述肽融合体进行免疫诱导的动物，就没有特别限制，可举出例如：人、猴子、小鼠、大鼠、狗、兔、猫、牛、马、山羊等哺乳动物；鸡、驼鸟等禽类。
关于本发明的疫苗制剂的给药方式，可以为非经口给药或经口给药中的任一种，根据利用所述肽融合体中所含的抗原蛋白或抗原肽所诱导的防御免疫的种类等适当设定即可。作为非经口给药，具体而言，可举出：静脉内给药、肌肉内给药、腹腔内给药、皮内给药、皮下给药、关节内给药、粘膜给药等。作为粘膜给药，可举出经肺给药、经鼻给药等。在上述给药方式中，从更进一步提高疫苗效果的观点出发，可举出优选非经口给药、进一步优选优选皮内给药、皮下给药、或粘膜给药，进一步优选举出粘膜给药，在粘膜给药中，特别优选举出经肺给药。
关于本发明的疫苗制剂的给药量，根据所述肽融合体中所含的抗原蛋白或抗原肽的种类、给药对象的年龄和体重、期待的作用等适当设定，给药对象动物为人的情况下，通常1日1次～数次、优选1日1次给药相当于0.01～40000μg/kg的量的所述肽融合体即可(初次免疫)。另外，本发明的疫苗制剂可以距初次免疫通常2～6周后在与初次免疫同样条件下再次给药(追加免疫)。
实施例
以下，举出实施例说明本发明。但是，本发明并不限于以下的实施例而解释。
需要说明的是，在以下的试验例中，只要没有特殊说明，源自小鼠的树突细胞使用通过将小鼠的骨髄细胞在Flt3-L(终浓度100ng/ml)存在下培养1周而进行了分化诱导的树突细胞(FL-DC)。另外，在以下的试验例中，FL-DC有时分为类浆细胞DC(Plasmacytoid DC，pDC)、CD11b阳性树突细胞(CD11b+DC)、及CD11b阴性树突细胞(CD11b-DC)而进行分析。pDC为源自小鼠的树突细胞中的CD11c阳性且B220阳性的细胞群；CD11b+DC为源自小鼠的树突细胞中的CD11c阳性、B220阴性、且CD11b阳性的细胞群；CD11b-DC为源自小鼠的树突细胞中的CD11c阳性、B220阴性、且CD11b阴性的细胞群。
试验例1：与树突细胞选择性地结合的肽的一次筛选
使用展示由随机的7个以下的氨基酸构成的约10亿种随机肽的噬菌体文库，进行了以下所示的淘洗操作。
将5×1010pfu/mL的噬菌体文库200μL和1×108cells的EL4细胞(源自小鼠淋巴瘤的细胞)进行混合，在25℃下孵育60分钟后，进行离心并回收上清液，由此回收没有结合于EL4细胞的噬菌体克隆。然后加入到在6孔板上培养的1×106cells的B16F10细胞(小鼠黑色素瘤细胞)中，在25℃下孵育60分钟后，回收上清液，由此回收没有结合于B16F10细胞的噬菌体克隆。然后，在6孔板上培养的2×106cells的源自小鼠的树突细胞中加入噬菌体，在4℃下静置60分钟。然后，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗10次，加入含有1％NP40的PBS，回收噬菌体。使回收的噬菌体感染大肠杆菌并进行扩增。
使用回收的噬菌体，再次实施2次所述淘洗操作时，所回收的噬菌体数增加(参照图1)。由此暗示：通过进行所述淘洗操作合计3次，展示可结合于树突细胞的肽的噬菌体克隆被浓缩。
将通过3次的淘洗操作所回收的噬菌体进行单克隆化并扩增。将源自小鼠的树突细胞1×105cells和1.6×1010pfu/mL的各噬菌体克隆进行混合后，通过使用针对噬菌体的抗体的流式细胞计分析来评价噬菌体与树突细胞的结合性。将代表性结果示于图2。确认了FL9不与任何树突细胞结合，而FL4(序列号1)与所有的树突细胞结合。
相对于得到的噬菌体克隆约60个，进行了上述的流式细胞计分析，结果，作为可结合于树突细胞的克隆，鉴定出了表1所示的37个克隆。然后，为了鉴定可结合于树突细胞的噬菌体克隆的表面所展示的肽的氨基酸序列，将各噬菌体的基因组中插入有肽的部位通过PCR扩增后，进行测序。将得到的结果示于表1。结果确认，在可结合于树突细胞的噬菌体克隆中，大多展示的是N末端起第4位及第7位的氨基酸为赖氨酸或精氨酸的肽。
[表1][表1]
克隆名 所展示的肽的氨基酸序列
FL1 VRKVAVR
FL3 RDMPVR
FL4 VSYKAIR
FL5 ASAKGR
FL7 ESHRLVR
FL8 GGSKPVR
FL11 KLARRS
FL12 RISAREPR
FL13 FLEEDAVX
FL16 AMGKVAR
FL17 RSQVSVR
FL20 ASARGPR
FL21 GRSVR
FL22 GMPAKRE
FL24 GNRLGMD
FL25 GSAKMSR
FL26 IGSRPIR
FL27 NRTSQAR
FL28 PVGRSVR
FL29 VKGRER
FL30 SARALVR
FL31 NGVKQAR
FL32 GLGKGLR
FL33 DVPKKLR
FL35 VRLPR
FL38 GTSHRLR
FL41 AVRMPLR
试验例2：与树突细胞选择性地结合的肽的二次筛选
(1)肽融合体的制造
制造将使所述试验例1中所鉴定的FL4、FL5、FL8、及FL20的氨基酸序列中的3个随机直接结合而成的肽的N末端结合于PspA的C末端的肽融合体。需要说明的是，制造的肽融合体的氨基酸序列例如在FL4的情况下为[PspA的氨基酸序列]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR]。
具体而言，在编码PspA的DNA分子(序列号6)上，利用磷酸二酯键结合使FL4、FL5、FL8、及FL20的氨基酸序列中的3个随机直接结合而成的肽的DNA分子，制作编码肽融合体的DNA分子。接着，使用该DNA分子导入大肠杆菌BL21DE3株，得到将该DNA分子导入于大肠杆菌的转化体。接着，使用该转化体，用异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导蛋白质表达之后，收集细菌并破碎。然后，利用镍柱及凝胶过滤柱纯化蛋白质，由此得到具有给定的氨基酸序列的肽融合体。
(2)给药肽融合体的小鼠血清中的PspA特异性抗体效价的测定
在7周龄的C57BL/6JJmsSlc小鼠(以下，有时简称为C57BL/6小鼠)的尾根部将含有以PspA量换算计为1μg的所述肽融合体或PspA的生理盐水50μL于Day0及Day10给药，在Day17回收血液。作为对照，对仅同样地给药生理盐水的情况也进行了试验。进而，对与以PspA量换算计为1μg的所述肽融合体或PspA一起同样地给药含有10μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水50μL的情况也进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
从Day17回收的血液得到血清，利用ELISA测定血清中的PspA特异性抗体效价(IgG、IgG1、IgG2a)。将得到的结果示于图3～5。图3～5中，“PspAWT”是指PspA，“PspA-FL4”是指使3个FL4的氨基酸序列随机直接结合而成的肽的N末端结合于PspA的C末端的肽融合体，“PspAWT+CpG”是指给药PspA和CpG寡聚脱氧核苷酸的情况。另外，在图3～5中，与“PspA-FL4”及“PspAWT+CpG”相同的表示形式也为同样的意思。另外，在图3～5中，“cont”是指给药生理盐水的情况。另外，图3～5中示出血清的每一稀释倍数(8×102倍、40×102倍、及200×102倍)的抗体效价(OD值450-570)。
由图3～5可知：在与树突细胞可选择性地结合的肽中，FL4的氨基酸序列结合于PspA的肽融合体可以特别提高PspA特异性抗体的产生能力。特别确认：该肽融合体与同时给药PspA和佐剂(CpG寡聚脱氧核苷酸)的情况相比，PspA特异性抗体效价特别高，如果使用该肽融合体，即使不使用佐剂，也发挥优异的疫苗效果。
由以上的结果可知：含有FL4氨基酸序列的肽可以特别显著地发挥由抗原蛋白或抗原肽引起的疫苗效果，作为抗原蛋白或抗原肽的载体肽是有用的。
试验例3：肽融合体所带来的疫苗效果的评价
使用所述试验例2中制作的、使3个FL4的氨基酸序列随机直接结合而成的肽的N末端结合于PspA的C末端的肽融合体(FL4-PspA、氨基酸序列：[PspA的氨基酸序列]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR]-[VSYKAIR])，进行了以下的试验。
在7周龄的C57BL/6小鼠的尾根部，将含有以PspA量换算计为1μg的FL4-PspA或PspA的生理盐水50μL于Day0及Day10给药而进行了免疫诱导。接着，在Day18经鼻给药肺炎链球菌(1.7×109cfu/ml:5.1×107cfu/mouse)(单鼻15μL)，求出肺炎链球菌给药后的小鼠的体重和生存率。另外，作为对照，对不进行免疫而仅同样地给药生理盐水的情况也进行了试验。进而，对与以PspA量换算计为1μg的FL4-PspA或PspA一起同样地给药含有10μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水50μL的情况也进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
将得到的结果示于图6。需要说明的是，图6中，给药肺炎链球菌的日期作为Day0表示。另外，图6中的缩写的意思如所述试验例2部分所示。该结果确认：在给药肽融合体(FL4-PspA)的小鼠中，即使在肺炎链球菌给药后也不能看到体重的减少，即使肺炎链球菌给药起的10天，生存率也为100％，具有强的感染防御能力。
试验例4：肽所带来的疫苗效果的评价
(1)生物素化肽/链霉亲和素复合体的制造
合成使生物素结合于所述试验例1中所鉴定的FL4的氨基酸序列所构成的肽以及FL39的氨基酸序列所构成的肽或其杂序肽(氨基酸序列：RPSVSRA)而成的生物素化肽。接着，通过使链霉亲和素与得到的生物素化肽结合，制造生物素化肽/链霉亲和素复合体。
(2)给药所述复合体的小鼠血清中的链霉亲和素特异性抗体效价的测定
在7周龄的C57BL/6小鼠的尾根部，将含有以链霉亲和素量换算计为5μg的所述复合体或链霉亲和素的生理盐水50μL在Day0及Day10进行给药，在Day17回收血液。作为对照，对同样地仅给药生理盐水的情况也进行了试验。进而，对与5μg的链霉亲和素一起同样地给药含有10μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水50μL的情况也进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
由在Day17回收的血液得到血清，利用ELISA测定血清中的链霉亲和素特异性抗体效价(IgG、IgG1、IgG2a)。将得到的结果示于图7。图7中，“ST”是指给药链霉亲和素的情况，“ST-FL4”是指给药包含FL4的氨基酸序列的生物素化肽/链霉亲和素复合体的情况。“cont”是指给药生理盐水的情况。另外，图7中示出血清的每一稀释倍数(8×102倍、40×102倍、及200×102倍)的抗体效价(OD值450-570)。
由图7可知：与所述试验例2的结果同样地，在给药含有FL4的氨基酸序列的复合体的组中，链霉亲和素特异性抗体的产生能力特别优异。
试验例5：树突细胞中的神经纤毛-1的表达的确认
已知具有由R/K-X-X-R/K构成的模体序列的肽与神经纤毛-1结合，因此，研究了树突细胞中的神经纤毛-1的表达。
具体而言，对通过将小鼠的骨髄细胞在Flt3-L(终浓度100ng/ml)存在下培养1周而进行了分化诱导的FL-DC、和使用MACS由脾脏纯化的CD11c阳性细胞(源自脾脏的树突细胞)，分为pDC、CD11b+DC、及CD11b-DC，进行了神经纤毛-1的表达的分析。另外，对小鼠的脾脏细胞，分为B细胞、CD4+T细胞、及CD8+T细胞，进行了神经纤毛-1的表达的分析。各细胞中的神经纤毛-1的表达通过使用荧光标记的抗神经纤毛-1抗体将各细胞进行流式细胞计分析而确认。
将得到的结果示于图8(横轴：荧光强度、纵轴：细胞数)。由该结果可知，在FL-DC中，在全部的树突细胞中可看到神经纤毛-1的强表达，但源自脾脏的树突细胞中仅在pDC中可看到神经纤毛-1的强表达。另一方面，在脾脏细胞中，在CD4+T细胞中可看到一些神经纤毛-1的表达。有报道指出调节性T细胞中表达神经纤毛-1，因此认为，在脾脏细胞的CD4+T细胞中看到的神经纤毛-1的表达源自调节性T细胞。
试验例6：使用进行肽展示的噬菌体评价对脾脏细胞的结合能力
使用已在所述试验例1中确认了与源自骨髄的树突细胞结合的噬菌体克隆(FL4及FL8)，评价了对脾脏细胞的结合能力。具体而言，将从小鼠中回收的脾脏细胞1×105cells和1.6×1010pfu/mL的各噬菌体克隆混合之后，加入针对噬菌体的生物素化抗体，进一步加入用荧光色素修饰的链霉亲和素，通过流式细胞计分析评价了噬菌体对脾脏细胞的结合性。另外，作为阴性对照，使用所述试验例1中没有确认到与源自骨髄的树突细胞结合的噬菌体克隆(FL44)，同样地进行了试验。
将得到的结果示于图9及10(横轴：荧光强度、纵轴：细胞数)。由图9确认：FL4及FL8的噬菌体克隆与脾脏细胞中所含的全部的树突细胞进行结合。另外，由图10确认：这些噬菌体克隆也与脾脏细胞中所含的CD4+T细胞结合，认为其原因在于CD4+T细胞中表达神经纤毛-1(所述试验例5的结果)。
FL4的噬菌体克隆对树突细胞的结合能力虽然与FL8的情况同等，但是，在所述试验例2及4中，含有FL4的氨基酸序列的肽与含有FL8的氨基酸序列的情况相比，可看到优异的疫苗效果。由这些结果证明：含有FL4的氨基酸序列的肽与具有由R/K-X-X-R/K构成的模体序列的其它肽具有不同的作用。
试验例7：使用生物素化肽/链霉亲和素复合体评价对树突细胞的结合能力
(1)生物素化肽/链霉亲和素复合体的制造
使用所述试验例1中所鉴定的FL4的氨基酸序列所构成的肽及其杂序肽(氨基酸序列：YRSIVKA)，用与所述试验例4同样的方法制造生物素化肽/链霉亲和素复合体。另外，使用已报道具有神经纤毛-1结合性的阳性对照肽(氨基酸序列：RPARPAR)，用与所述同样的方法制造生物素化肽/链霉亲和素复合体。需要说明的是，链霉亲和素使用添加有荧光(PE)标记的物质。
(2)对树突细胞及脾脏细胞的结合能力的测定
将成为对象的各种细胞和0.6μg的各种复合体混合之后，通过流式细胞计分析评价各种复合体对细胞的结合性。就使用的细胞而言，FL-DC为1×105cells，使用MACS由脾脏纯化的CD11c阳性细胞(源自脾脏的树突细胞)为1×106cells，及小鼠脾脏细胞为1×106cells。
将对FL-DC的结合性的评价结果示于图11，将对使用MACS由脾脏纯化的树突细胞的结合性的评价结果示于图12，及将对小鼠的脾脏细胞的结合性的评价结果示于图13(横轴：荧光强度、纵轴：细胞数)。由图11及12可知：对于源自骨髄的树突细胞，生物素化肽/链霉亲和素复合体即使在使用任一种肽的情况下，也可看到结合能力。另外，由图13可知：对于脾脏细胞，使用任一种肽的复合体仅对CD4阳性细胞可看到弱结合，确认了与所述试验例6的结果相同的倾向。
即，由本试验结果也显示：由FL4的氨基酸序列构成的肽对树突细胞的结合能力与由FL8的氨基酸序列构成的肽同等。在所述试验例2及4中，含有FL4的氨基酸序列的肽与含有FL8的氨基酸序列的情况相比，可看到优异的疫苗效果，因此，由本试验结果也证明：含有FL4的氨基酸序列的肽与具有由R/K-X-X-R/K构成的模体序列的其它肽具有不同的作用。
试验例8：CD8+细胞杀伤性T细胞(CTL)诱导能力的评价
(1)肽融合体的制造
制作使由FL4的氨基酸序列构成的肽的N末端结合于作为鸡蛋白白蛋白(OVA)中的MHCI类表位肽的SL8(SIINFEKL)的C末端的肽融合体(SL8-FL4)。该肽融合体的氨基酸序列具体而言为[SL8的氨基酸序列(SIINFEKL)]-[VSYKAIR]，该肽融合体的制造方法除使用编码SL8的DNA分子之外，与PspA-FL4的情况同样。另外，使用FL8及FL4的杂序肽(FL4Scr、氨基酸序列：YRSIVKA)，同样地分别制作与SL8融合的肽融合体(SL8-F8、及SL8-FL4Scr)。
(2)CD8+CTL诱导能力的评价
在7周龄的C57BL/6小鼠的耳部的皮下，将含有以SL8量换算计为50μg的各肽融合体及10μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水50μL在Day0给药，在Day7采取所属淋巴节，进行了四聚物分析。另外，对给药单独含有SL8 50μg的生理盐水50μL的情况、给药含有SL8 50μg和CpG寡聚脱氧核苷酸50μg的生理盐水50μL的情况、以及仅给药生理盐水的情况(对照)，也同样地进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
四聚物分析通过以下方法进行：从所属淋巴节回收淋巴细胞之后，用针对CD44、CD8的荧光标记抗体及识别被提呈至H-2Kb的SL8肽的荧光标记四聚物进行染色，然后，使用流式细胞仪进行分析。
将得到的结果示于图14(横轴：荧光强度、纵轴：细胞数)。在给药SL8及CpG寡聚脱氧核苷酸的情况下，不能诱导抗原特异性CD8+CTL。另外，关于SL8-FL8、及SL8-FL4Scr，即使与CpG寡聚脱氧核苷酸同时给药也不能诱导抗原特异性CD8+CTL。与此相对，在给药SL8-FL4和CpG寡聚脱氧核苷酸的情况下，可看到抗原特异性CD8+CTL的强诱导。
试验例9：CD8+细胞杀伤性T细胞诱导能力的评价
本试验中，评价利用由SL8-FL4诱导的SL8特异性CD8+CTL是否可看到癌萎缩的效果。本试验中，作为癌细胞，使用EG7细胞(使源自C57BL/6小鼠的胸腺瘤的EL4细胞表达OVA蛋白的癌细胞)。具体的试验方法如下所述。
在7周龄的C57BL/6小鼠的腹部移植EG7细胞1(106cells，制作荷瘤小鼠。移植EG7细胞后，在肿瘤的直径成为约5mm左右的时刻(移植后约5天)，在耳部的皮下给药含有以SL8量换算计为50μg的SL8-FL4及50μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水50μL。然后，一边饲养小鼠，一边经时地计测肿瘤尺寸。另外，关于给药含有SL8 50μg和CpG寡聚脱氧核苷酸50μg的生理盐水50μL的情况、以及仅给药生理盐水的情况(对照)，也同样地进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
将得到的结果示于图15。同时给药SL8和CpG寡聚脱氧核苷酸的情况与给药生理盐水的情况相比，可看到一些肿瘤萎缩效果，但在同时给药SL8-FL4和CpG寡聚脱氧核苷酸的情况下则看到完全治癒小鼠等非常强的肿瘤萎缩效果。即，由本结果可知：FL4的肽融合体即使在肿瘤着生的状态下也较强地诱导抗原特异性CD8+CTL，可以进一步诱导肿瘤的萎缩效果。
试验例10：使用源自Kras变异体的肽评价CD8+细胞杀伤性T细胞诱导能力
Kras基因为在肺癌、胰腺癌、大肠癌等的许多癌中可看到变异的驱动基因。特别是常见到Kras的N末端侧起第12位的甘氨酸被置换为天冬氨酸的G12D变异。因此，含有G12D变异的Kras的部分序列作为癌特异性抗原、作为可成为癌疫苗开发的标靶的序列而备受期待。因此，本试验中，使用含有G12D变异的Kras的部分肽，评价FL4的抗原特异性CD8+CTL诱导能力。
(1)肽融合体的制造
制作使由FL4的氨基酸序列构成的肽的N末端结合于含有G12D变异的Kras的部分肽(源自G12D的肽；LVVVGADGV；从含有G12D变异的Kras的N末端侧起第6～14位的氨基酸序列)的C末端的肽融合体(G12D-FL4)。该肽融合体的氨基酸序列具体而言为[含有G12D变异的Kras的部分序列(LVVVGADGV)]-[VSYKAIR]，该肽融合体的制造方法除使用编码源自G12D的肽的DNA分子之外与PspA-FL4的情况同样。
(2)抗原特异性CD8+CTL反应的测定
在7周龄的C57BL/6小鼠的耳部的皮下，将含有以源自G12D的肽量换算计为50μg的G12D-FL4及10μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水50μL在Day0给药，在Day7采取所属淋巴节，回收免疫细胞。接着，在RPMI培养基100μL中加入回收的免疫细胞1(106cells，在37℃下培养24小时后，测定培养液中的IFN-γ浓度。另外，对给药含有源自G12D的肽50μg和CpG寡聚脱氧核苷酸10μg的生理盐水50μL的情况、以及仅给药生理盐水的情况(对照)，也同样地进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
将得到的结果示于图16。在给药源自G12D的肽和CpG寡聚脱氧核苷酸的情况下，完全不能看到抗原特异性CD8+CTL的诱导。与此相对，在给药G12D-FL4和CpG寡聚脱氧核苷酸的情况下，非常强烈看到抗原特异性CD8+CTL的诱导。由以上的结果可知：FL4不仅对于OVA等的模型抗原、而且对于应用于癌疫苗的抗原也可诱导强的疫苗效果。
试验例11：使用生物素化肽/链霉亲和素复合体评价树突细胞结合能力
(1)生物素化肽的制造
合成使生物素结合于所述试验例1中所鉴定的FL4的氨基酸序列所构成的肽及将其第1位的氨基酸残基置换为丙氨酸残基的肽Mut1(氨基酸序列：ASYKAIR(序列号2))各自的N末端的生物素化肽。
(2)对树突细胞的结合能力的测定
在小鼠树突细胞(DC2.4细胞)1×105cells中，在4℃条件下加入0.6μg的各种生物素化肽之后，通过加入荧光(PE)标记链霉亲和素而得到生物素化肽/链霉亲和素复合体，通过流式细胞计分析评价各种复合体对细胞的结合性。
将对小鼠树状性细胞的结合性的评价结果示于图17。在图17中，“FL4”及“Mut1”分别是指生物素化FL4/链霉亲和素复合体及生物素化Mut1/链霉亲和素复合体。另外，在图17中，“cont”是指取代生物素化肽而加入有生理盐水的情况。进而，在图17中，示出平均荧光强度“MFI”。由图17可知：使用任一种肽的情况下均可看到结合能力。
试验例12：肽所带来的疫苗效果的评价
(1)生物素化肽/NA复合体的制造
合成使生物素结合于所述试验例1中所鉴定的FL4、将其第1位的氨基酸残基置换为丙氨酸残基的肽Mut1(氨基酸序列：ASYKAIR(序列号2))、及将其第2位的氨基酸残基置换为丙氨酸残基的肽Mut2(氨基酸序列：VAYKAIR(序列号3))、以及将其第3位的氨基酸残基置换为丙氨酸的肽Mut3(氨基酸序列：VSAKAIR)、及将其第5位的氨基酸残基置换为丙氨酸的肽Mut4(氨基酸序列：VSYKAAR)各自的N末端的生物素化肽。接着，通过使得到的生物素化肽和中性抗生物素蛋白进行混合，制造生物素化肽/中性抗生物素蛋白复合体。
(2)给药所述复合体的小鼠血清中的NA特异性抗体效价的测定
在7周龄的C57BL/6小鼠的尾根部，在Day0及Day10给药含有以中性抗生物素蛋白量换算计为5μg的所述复合体或中性抗生物素蛋白的生理盐水50μL，在Day17回收血液。作为对照，对同样地仅给药生理盐水的情况也进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
从Day17回收的血液中得到血清，利用ELISA测定血清中的中性抗生物素蛋白特异性抗体效价(IgG)。将得到的结果示于图18。图18中，“NA”是指给药中性抗生物素蛋白的情况，“NA-FL4”是指给药生物素化FL4/中性抗生物素蛋白复合体的情况。关于其它肽，也以相同的表示形式表示。另外，在图18中，“cont”是指给药生理盐水的情况。进而，在图18中，示出血清的每一稀释倍数(8×102倍、40×102倍、及200×102倍)的抗体效价(OD值450-570)。
由图18可知：在给药含有FL4的氨基酸序列、Mut1的氨基酸序列、及Mut2的氨基酸序列的复合体的组中，确认了优异的链霉亲和素特异性抗体产生能力。在含有这些FL4、Mut1及Mut2的氨基酸序列的情况下，与含有Mut3及Mut4的氨基酸序列的情况不同，可看到优异的抗体产生能力，因此，由本试验结果证明：含有FL4、Mut1及Mut2的氨基酸序列的肽与含有Mut3及Mut4的氨基酸序列的肽具有不同的作用。
试验例13：经肺给药所带来的CD8+细胞杀伤性T细胞诱导能力的评价
已知现有的注射型疫苗不能有效地诱导肺组织等的粘膜面上的免疫应答。因此，在以肺癌等为标靶的治疗药的开发中，期待可以在肺组织中强烈地诱导抗原特异性CD8+CTL的疫苗。因此，本试验中，使用SL8-FL4，评价了经肺给药所带来的抗原特异性CD8+CTL诱导能力。
在7周龄的C57BL/6小鼠中，在Day0及Day7经肺给药含有以SL8量换算计为50μg的SL8-FL4及10μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水40μL，在Day14采取所属淋巴节、肺组织及脾脏，用与试验例8同样的方法进行了四聚物分析。另外，对经肺给药单独含有SL8 50μg的生理盐水40μL的情况、经肺给药含有SL8 50μg和CpG寡聚脱氧核苷酸10μg的生理盐水50μL的情况、以及仅经肺给药生理盐水的情况(对照)，也同样地进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
将得到的结果示于图19。给药SL8-FL4和CpG寡聚脱氧核苷酸的情况下，肺所属淋巴节、肺组织、及脾脏中的任一者中均可以较强地诱导抗原特异性CD8+CTL。即，由本结果可知：FL4的肽融合体即使经粘膜给药，也可较强地诱导抗原特异性CD8+CTL。
试验例14：经肺给药和皮下给药所带来的CD8+细胞杀伤性T细胞诱导能力的比较 评价
本试验中，使用SL8-FL4，进行了经肺给药和皮下给药所带来的CD8+细胞杀伤性T细胞诱导能力的比较。在7周龄的C57BL/6小鼠中，在Day0及Day7经肺给药或皮下给药含有以SL8量换算计为50μg的SL8-FL4及10μg的CpG寡聚脱氧核苷酸(K3型、制品名“K3Et-Free”、制品编号“CN-65003”、Genedesign社制)的生理盐水40μL，在Day14采取所属淋巴节、及脾脏，用与所述试验例8同样的方法进行了四聚物分析。另外，对仅皮下给药生理盐水的情况(对照)，也同样地进行了试验。需要说明的是，本试验中，各组使用5只小鼠。
将得到的结果示于图20。脾脏中的抗原特异性CD8+CTL的诱导在皮下给药的情况下强烈看到，与此相对，肺所属淋巴节中的抗原特异性CD8+CTL的诱导在经肺给药的情况下强烈看到。由以上的结果认为：通过FL4的肽融合体的经肺给药，可以较强地诱导肺组织或肺所属淋巴节中的抗原特异性CD8+CTL，可大大有助于今后的肺癌疫苗的开发。
序列表
<110> 一般财团法人阪大微生物病研究会（The Research Foundation forMicrobial Diseases of Osaka University）
<120> 靶向树突细胞的肽、利用了该肽的肽融合体、及利用了该肽融合体的疫苗
<130> 17096WO
<150> JP 2016-183942
<151> 2016-09-21
<150> JP 2017-129202
<151> 2017-06-30
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模体序列的氨基酸序列
<400> 1
Val Ser Tyr Lys Ala Ile Arg
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模体序列的氨基酸序列
<400> 2
Ala Ser Tyr Lys Ala Ile Arg
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模体序列的氨基酸序列
<400> 3
Val Ala Tyr Lys Ala Ile Arg
1 5
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码具有模体序列的肽的碱基序列
<400> 4
gtgagctata aagcgattcg t 21
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码具有3个模体序列的肽的碱基序列
<400> 5
gtgagctata aagcgattcg tgtgagctat aaagcgattc gtgtgagcta taaagcgatt 60
cgt 63
<210> 6
<211> 1140
<212> DNA
<213> 肺炎菌属（Pneumococcus）
<400> 6
atggaagaat ctcccgtagc tagtcagtct aaagctgaga aagactatga tgcagcagtg 60
aaaaaatctg aagctgctaa gaaggcttac gaagaagcta aaaaagcttt agaggaagca 120
aaagttgcgc aaaaaaaata tgaagacgat caaaagaaaa ctgaagagaa agcagagcta 180
gaaaaagaag cttctgaagc gatagctaag gcaacagaag aagttcaaca agcgtaccta 240
gcttatcaac gagctagcaa caaagccgaa gcagctaaga tgatagaaga ggctcagaga 300
cgcgaaaatg aggcgagagc taaatttact actattcgaa caacaatggt agttcctgaa 360
ccagaacagt tagctgagac taagaaaaaa gcagaagaag ctaaagcaaa agaaccaaaa 420
cttgctaaaa aagcagcaga agctaaagca aaattagaag aggctgagaa aaaagctact 480
gaagccaaac aaaaagtgga tgctgaagaa gtcgctcctc aagctaaaat cgctgaattg 540
gaaaatcaag ttcatagact agaacaagag ctcaaagaga ttgatgagtc tgaatcagaa 600
gattatgcta aagaaggttt ccgtgctcct cttcaatcta aattggatgc caaaaaagct 660
aaactatcaa aacttgaaga gttaagtgat aagattgatg agttagacgc tgaaattgca 720
aaacttgaag atcaacttaa agctgctgaa gaaaacaata atgtagaaga ctactttaaa 780
gaaggtttag agaaaactat tgctgctaaa aaagctgaat tagaaaaaac tgaagctgac 840
cttaagaaag cagttaatga gccagaaaaa tcagctgaag agccatcgca accagagaag 900
ccagctgaag aagctccagc cccagagcaa ccaactgagc caactcaacc agaaaaacca 960
gctgaagaaa ctccagcacc aaaaccagag aagccagctg aacaaccaaa agcagaaaaa 1020
acagatgatc aacaagctga agaagactat gctcgtagat cagaagaaga atataatcgc 1080
ttgactcaac agcaaccgcc aaaagcagaa aaaccagctc ctgcaccaca accagagtaa 1140

Claims (10)

1.一种肽，其具有至少1个选自以下的(i)及(ii)所示的氨基酸序列中的模体序列：
(i)序列号1所示的氨基酸序列；
(ii)序列号1所示的氨基酸序列中的第1位及第2位的氨基酸残基中的至少任一者被置换为丙氨酸残基的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，
具有1～5个由所述(i)所示的氨基酸序列构成的模体序列。
3.一种DNA分子，其编码权利要求1或2所述的肽。
4.一种肽融合体，其在抗原蛋白或抗原肽上结合有权利要求1或2所述的肽。
5.根据权利要求4所述的肽融合体，其中，
在抗原蛋白或抗原肽的C末端侧结合有权利要求1或2所述的肽的N末端。
6.一种权利要求4或5所述的肽融合体，其中，
所述抗原蛋白或抗原肽为癌抗原蛋白或癌抗原肽。
7.根据权利要求4或5所述的肽融合体，其中，
所述抗原蛋白或抗原肽为病原病毒的抗原蛋白或抗原肽。
8.根据权利要求4或5所述的肽融合体，其中，
所述抗原蛋白或抗原肽为病原菌的抗原蛋白或抗原肽。
9.一种疫苗制剂，其含有权利要求4～8中任一项所述的肽融合体。
10.根据权利要求9所述的疫苗制剂，其用于经肺给药。
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