CN105481985A

CN105481985A - 一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物

Info

Publication number: CN105481985A
Application number: CN201610015946.4A
Authority: CN
Inventors: 王小平; 蔺焕萍; 王巧侠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2016-04-13

Abstract

本发明公开了一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物，由热休克蛋白70功能肽和甲胎蛋白抗原表位肽偶联构成，所述的复合物的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，所述的热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽按照摩尔比为1:1，所述的热休克蛋白70功能肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，所述的甲胎蛋白抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明复合物合成操作简单，成本低，合成量多，反应快，产物相对稳定，为抗瘤免疫提供新的技术内容。

Description

一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物。

背景技术

甲胎蛋白(AFP)作为一种肿瘤胚胎抗原，免疫原性很弱，AFP对肝癌生长的促进作用以及对免疫细胞的抑制作用，提示其可以成为一种靶点在肝癌的生物治疗中发挥作用。近来的研究证实甲胎蛋白存在不同的抗原表位为肝细胞癌的免疫治疗提供了解决问题的途径。Butterfield等研究发现在小鼠的免疫系统中也找到了诱发T细胞反应的甲胎蛋白抗原表位肽，不但可以在体诱发针对表达AFP肿瘤细胞的免疫反应，而且产生的保护性免疫效应可以克服AFP的免疫抑制，为肝癌的防治提供新的策略。但是AFP在患者体内不能被有效地递呈和激活免疫细胞是防治策略实施的瓶颈所在。通过增强AFP的免疫原性使免疫细胞对其产生强而有效的主动识别对于肝癌的治疗有重要意义。目前增强AFP特异性免疫反应的策略集中于AFP核酸疫苗，基因重组AFP载体介导DC细胞免疫和AFP质粒与腺病毒多基因重组联合免疫，动物实验结果显示上述免疫策略可以检测到一定水平的特异性T细胞反应，但是相对有限的体内保护效应，复杂的基因技术操作程序，可能产生的耐性疫苗及重组基因的安全性问题局限了之后的深入研究。增强AFP免疫原性的另一个重要而简便的方法就是应用有效的免疫佐剂，而热休克蛋白70的“分子伴侣”和“内在佐剂”作用成为解决的有效策略。

已证实热休克蛋白70具有良好的“免疫佐剂”效应，其与不同的肿瘤抗原肽相伴可诱发肿瘤特异性主动免疫。研究表明对某个抗原的保护性细胞反应可以通过HSP70偶联抗原肽复合物免疫而实现，尤其对于抗原弱或难以诱发免疫的抗原，HSP70呈现了良好的内在免疫佐剂效应。本研究在前期工作基础上通过简便实用的氨基酸偶联法构建HSP70功能肽-AFP表位肽复合物，合成多肽能较好的保持肽的结构，具有成本低，合成量多，反应快，产物相对稳定等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热休克蛋白70与甲胎蛋白抗原表位肽的复合物及其制备方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物，由热休克蛋白70功能肽和甲胎蛋白抗原表位肽偶联构成，所述的复合物的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明所述的热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽按照摩尔比为1:1。

本发明所述的热休克蛋白70功能肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的甲胎蛋白抗原表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

本发明所述的复合物在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。

一种治疗肝癌的药物组合物，包括上述所述的热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物及一种或多种药学上可接受的辅料。

所述辅料包括：水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等。

所述的水溶性填充剂辅料为选自以下的一种或一种：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。

所述的PH调节剂为选自以下的一种或几种：枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵、碳酸钠或碳酸钾或碳酸铵盐、碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐等。

所述的稳定剂为选自以下的一种或几种：EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷。

所述的渗透压调节剂是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。

所述药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。

本发明的有益效果为：通过简便实用的氨基酸偶联法构建HSP70功能肽-AFP表位肽复合物,合成多肽能较好的保持肽的结构，具有操作简单，成本低，合成量多，反应快，产物相对稳定等优点。

附图说明

图1是HSP70-P/AFP-P复合物的高效液相色谱图；

图2是HSP70-P/AFP-P复合物质谱分析图；

图3是实施例2体内H22肝癌荷瘤小鼠治疗实验数据；

图4是实施例3淋巴细胞毒性试验实验数据。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1多肽的合成及鉴定

根据热休克蛋白70(HSP70)功能肽TKDNNLLGRFELSG和甲胎蛋白(AFP)FMNKFIYEI合成所需的氨基酸，采用固相多肽合成技术，以N-α-Fmoc保护的氨基酸为原料，Fmoc-AA-Wang树脂为载体，HBTU方法偶联。

具体步骤为：

1.将树脂Fmoc-AA-Wang树脂(1mmol)用哌啶-DMF(V:V＝1:5)脱除Fmoc保护基，15分钟。

2.DCM和DMF洗涤后，分别加入Fmoc保护基-氨基酸(3mmol)、HBTU(3mmol)、DIEA(3mmol)进行偶联，30分钟。

3.DCM和DMF洗涤后，循环以下步骤：脱除Fmoc保护基-洗涤-偶联-再洗涤，直至最后一个氨基酸偶联结束，完成整条肽链的合成，按照IEYIFKNMFGSLEFRGLLNNDRT顺序依次偶联。

4.以切肽试剂TFA：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇：双蒸水(82.5:5:5:2.5:5)将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，2小时。

5.加入4℃预冷的乙醚100ml使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤3遍，真空抽干，得到多肽粗品。

纯化：将得到的粗品多肽分析鉴定，粗品用制备型反相液相色谱(RP-HPLC)法纯化，以HPLC和MS分析鉴定。色谱柱为SymmetrixODS-R,4.6*250mm,5μm；流动相A：0.1％TFA/乙腈,流动相B：0.1％TFA/H2O；线性洗脱梯度：18％A-43％B；流速为1ml/min,检测波长为220nm；一次检测进样量为20μl。经冷冻干燥机后得到精品多肽。

其中AA＝AminoAcid氨基酸

TRDNNLLGRFELSGFMNKFIYEI23肽(苏氨酸精氨酸天冬氨酸天冬酰胺天冬酰胺亮氨酸亮氨酸甘氨酸精氨酸苯丙氨酸谷氨酸亮氨酸丝氨酸甘氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸天冬酰胺赖氨酸苯丙氨酸异亮氨酸酪氨酸谷氨酸异亮氨酸)。

HBTU:苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐。

Fmoc:N-芴甲氧羰基。

DCM:二氯甲烷。

DMF：二甲基甲酰胺。

DIEA：N,N-二异丙基乙胺。

如图1和图2和表1所示，热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物(HSP70-P/AFP-P)经反相液相色谱(RP-HPLC)法纯化，以HPLC和MS分析鉴定。HPLC证实HSP70-P/AFP-P复合物纯度98.17％，MS分析证实纯化的HSP70-P/AFP-P复合物分子结构正确，证实HSP70-P/AFP-P复合物构建成功。

表1.纯化HSP70-P/AFP-P复合物特点

实施例2荷瘤小鼠治疗实验

HSP70-P/AFP-P复合物免疫BALB/C小鼠。雌性BALB/C小鼠，6-8周龄，18-22g，随机分为HSP70-P/AFP-P复合物免疫组，AFP表位肽免疫组(AFP-P)，热休克蛋白70功能肽免疫组(HSP70-P)及平衡盐水免疫组(PBS)，每组10只小鼠。将各组多肽以平衡盐水稀释至1μg/1μl。每组多肽注射在小鼠左上肢皮下，每只小鼠每次注射10μg。每间隔2周加强免疫一次，连续2次，共3次，最后一次免疫后1周，取脾制备脾细胞悬液，进行脾淋巴细胞毒性实验。

为证实HSP70-P/AFP-P复合物对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制效应，如上述将BALB/C小鼠分为4组免疫，每组10只，免疫前每只小鼠左上肢皮下接种5×10⁵个H22肝癌细胞，然后在接种肝癌细胞后第3天，第10天，第17天，在各分组小鼠右上肢皮下分别接种HSP70-P/AFP-P复合物，AFP表位肽(AFP-P)，热休克蛋白70功能肽(HSP70-P)及平衡盐水(PBS)，每只小鼠每次注射10μg多肽，PBS作为空白对照。瘤块的生长隔日检测一次，肿瘤大小以游标卡尺测量其短径(a)与长径(b)，瘤块体积计算公式：V＝(a²b)/2。连续检测4周，每组瘤块的大小取均值计算。计算每组小鼠肿瘤的发生情况及生存时间。

结果如图3示，AFP表位肽(AFP-P)，热休克蛋白70功能肽(HSP70-P)及平衡盐水(PBS)免疫组的每只小鼠在接种H22细胞后的第7天检测到瘤块的生长，HSP70-P/AFP-P复合物免疫组仅有1只小鼠在接种H22细胞后的第10天检测到瘤块的生长，并且在4周内瘤块平均体积小于其他各免疫组。HSP70-P/AFP-P复合物免疫组小鼠在H22接种后60天仍旧存活，而AFP-P和HSP70-P免疫组小鼠在H22细胞接种后49天内均死亡。实验结果证实HSP70-P/AFP-P复合物产生了有效的治疗作用，抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间，诱发了明确而显著的抑瘤效应。

实施例3淋巴细胞毒性实验

BALB/C小鼠按上述分组和免疫，最后一次免疫后7天，取脾制备脾淋巴细胞悬液。各组脾淋巴细胞(效应细胞)与H22肝癌细胞(靶细胞)按照10:1,20:1和40:1的细胞数量比例混合培养，以细胞内琥珀酸脱氢酶释放试验检测混合脾淋巴细胞对H22肝癌细胞的杀伤效应。细胞抑瘤率＝1-实验组OD/对照组OD。实验重复3次，每组3个复孔，取均值计算。

具体实验步骤如下：

1.收集各免疫组混合脾淋巴细胞，调节脾淋巴细胞悬液浓度分别为4×10⁶/ml，2×10⁶/ml，1×10⁶/ml，调节H22肝癌细胞悬液浓度1×10⁴个细胞/孔，脾淋巴细胞悬液各取100μl加入96孔板中，使脾淋巴细胞与H22肝癌细胞比例分别为40:1，20:1，10:1，补足无血清1640培养液至每孔200μl。每板设置调零孔(1640培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(不同比例H22肝癌细胞，不同比例脾淋巴细胞)，每组各设3复孔。

2.置37℃，5％CO2孵育24小时，倒置显微镜下观察。

3.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。

4.离心(1000转x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm测量各孔的吸光值。

实验结果如图4所示，与HSP70-P,AFP-P免疫组相比，HSP70-P/AFP-P复合物免疫后的脾淋巴细胞对H22肝癌细胞产生了明确而显著地杀伤效应，抑瘤率达80％。上述研究结果表明HSP70功能肽与AFP表位肽偶联后使AFP表位肽诱导了针对肝癌细胞显著的淋巴细胞毒性效应，体内外细胞毒性实验表明构建的热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物具有潜在的应用价值和开发前景。

Claims

1.一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物，其特征在于：由热休克蛋白70功能肽和甲胎蛋白抗原表位肽偶联构成，所述的复合物的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物，其特征在于：所述的热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽按照摩尔比为1:1。

3.根据权利要求1所述的一种热休克蛋白70功能肽与甲胎蛋白抗原表位肽复合物，其特征在于：所述的热休克蛋白70功能肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的甲胎蛋白抗原表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.权利要求1所述复合物在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。

5.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的复合物。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物制成冻干粉或溶液注射剂。