JPS59501866A

JPS59501866A - 腸内ウイルスに対するワクチン接種に有用なポリペプチド

Info

Publication number: JPS59501866A
Application number: JP58503282A
Authority: JP
Inventors: ア−モンド・ジエフリ−・ウイリアム; マイナ−・フイリツプ・デイヴイツド; エバンス・デイヴイツド・ミユ−リグ・アシユトン; シルド・ジエフリ−・クリストフア−
Original assignee: ナショナル・リサ−チ・ディベロップメント・コ−ポレイション
Priority date: 1982-10-11
Filing date: 1983-10-11
Publication date: 1984-11-08
Also published as: DK284684A; GB8327154D0; AU584305B2; EP0120906B1; AU2073483A; DK284684D0; EP0107436A1; NZ205924A; DE3378054D1; WO1984001575A1; GB2128621B; US4694071A; CA1271717A; US4810491A; EP0120906A1; GB2128621A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】腸内ウイルスに対するワクチン接種に有用なポリペプチド技術分野本発明は、腸同ウィルス、時に灰白炎ウィルスにより引起こさｎる病気に対し特にワクチンとして使用するための生物学的活性を有するポリペプチドに関するものである。

従来技術従来、腸内ウィルスにＬ９引起こさｎる病気のためめワクチンは、失活させたウィルスまたは減毒生ウィルスのいず扛かに基づいていた。これは、ソーク（５ａｌｌｃ　）　ワクチンについて１９５０年代に始まった灰臼髄灸に対するワクチンの歴史ｋｇ照して示すことができ、このワクチンは灰白炎ウィルスケ組織培養で増殖させかつこｎｔホルムアルデヒドで失活させて製造される。

得らｒしる失活ウィルスｌたは死滅ウィルスは注射により投与さｎてウィルスｔＩ：Ｆ和しうる循櫨抗体を刺戟すると忠わｎる。失活させたｌ型、２型２工ひ３型の灰日灸ウィルスを含有するいわゆる三価のワクチン勿一般に注射して、こ扛ら全ての型の灰日灸ワイルスに対して完投化する。このワクチンを製造スる一賃の地、ざらに典型的にｌま、匣めてＭ４なワイルス盆用いて作成プル、かつワイルスケ非感染性にすると同時にその兎授原注會保博するには微妙な限界が存在するという欠点も有する。辛いなことに、ワクチンウィルスが実際に灰日炎を引起こし得るのは稀れである。

その鎌、代替ワクチン、丈ビン（Ｓａｂｉｎ　）ワクチンが開発さｎｌこｎは病気？引起丁能力全景失するまで、すなわち減毒さｎるまでウィルス’Ｔｈ１ｌｉｌｆｌ座培養吻中に通して装造さｎた。この激毒生ウィルスを経口投与すると、消化管内で増殖して保護抗体反応全誘発する。さらに、このワクチンは高価であるという欠点ヶ有する。何故なら、このワクチンは各バッチ全徹底的に動物試験せねばならないからである。さらに、生ワイルスｔワクチンに使用することから生ずる３つの主要な欠点がめる。第ｌにワクチンウィルスは極めてしばしば有播注となシ患首およびその接触者に麻痺を引起しつる。前記３棟のり）最も安定性の低い３型灰白炎ウイルスがこの面で最もｍ＠である。第２に、サビンワクチンは先進国に３いて広く使用さｎているが、熱情諸国では明らかに作用しない。何故なら、このウィルスｌまこ扛ら気候条注丁で湖殖せず兎疫反応全生じない刀）、或いは実際に投与ざｎるウィルスがもはや生でないからでるる。破波に生りイルスがこのようにしてワクチン中に使用さ扛ているが、灰日炎ウィルスを完全に消滅きせることは決してできない。

したがって簡単かつ安価に製造さｎ、ウィルス全体を使用せずかつ適当な免役反応を誘発するにも狗わつず対応する病気音発生する危険がないようなワクチンが硬水さｎてさた。

サビンによシ開発ざｎた戎毒生灰白炎ワクチンは２０年以上にわたって使用さｎているが、その神経病因性の減少の分子的基礎は不明のま互である。ワクチン株？その神経発病性の原棟と比較する多くの研究が行なゎｎている。最近、ノモト寺は、減毒灰白炎ウィルス１型丈ビン株のＲＮ’Ａ配列全決定しＣＰｒｏｃ。

Ｎａｔｎ、　Ａｃａｄ、、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　４７９巻、第５７９３　＝５７９７頁、（１’９８２）］、かつこの配列を灰白炎ウィルス１型マホニー（Ｍａｈｏｎｅｙ　）株につき、キタムラ等により侍らｎたｇ己タリ［Ｎａｔｕｒｅ、（１９８ｊ）、第２９１巻。第５４７−５５３　＠〕と比較し之。かｎらは、荷にＶＰ１カグシド蛋白蛋白質−コード領域に２ける塩梨直侯を確−することがでさ、このコード領域におびる塩基置洟がウィルスの楓毎に符与し、すなわｂこの領域に２Ｖプる変化がウィルスを無４５：にするが、１友同寺の兄反反応？示しつることを示唆した。この仮説はいかなる来捩粕果からも文愕さγしていない。

灰白炎ウィルスの抗原性におけるＶＰＩの６　’ｐｉＮについても、マイナー号により炭討さｊＬ　ＣＬｑａｔｕｒｅ　、第２９９巷、第１０９−１１０頁〕、単ｙｔ　８　Ａ　７ｊ全ポリペプチドＶＰ１．ＶＰ２２−ＬびＶＦ６は動物に２いて中和性抗体を低レベルにしか誘発しえないと報告さ′ｎた。夾験粕来が示すところでｌよ、抗原決定子は複雑でろろと思わｎ１間単心アミノ鍍配タリで、・まなくポリペプチドの３次配列によって時定化さｎる。

発明の開示本発明；・１腸内ウイルスの講造カプシド蛋白質ｖｐｉ２コードするゲノム領域内のＲＮ　Ａ配列によりコードさｎる抗原的に有意義、なポリペプチドの同定に丞づいている。

本＠明は腸内ウィルスにより引起こさｎる病気に対するワクチン接種ま之・よその診断に１更用するのに適した守成ポリペプチドケ提供し、このペプチドは灰白炎ワイルス３型サビン株の構盾カグシド計白質ＶＰ１ｉコードする１（ＮＡ配列におけるコドン９３〜９８にエリコードざ几るヘキサペプチド、好”、ｆＬ＜はコドン９３〜１００に、ｒ、９コードざルるオクタペプチドでろ９．１之は他の、腸内ウィルスの同等コドンにニジコードざｎるものでδす、或いはこの檀のへ千すペプテド％シ＜はオクタペプチドの抗涼注均４物でりジ、コドンの制欲はＶＰＩカプシドぼ白貞了コードするヌクレオチド配列の５′木端刀１ら数えろ■る。

木兄・男のポリペプチドはｆ　ｒ”ＪＸポリペプチドでわる。これらは上記したようにコードさｎた抗原的ｌこ有効なヘキサペプチド単位、好ましくはオクタペプチド単位からなる。こｎらポリペプチドは、たとえばｖＰｌカプシド蛋白質目牙のような適当な純枠型で回収されている天然酸のポリペプチドではない。換言すｎば、本発明のポリペプチドを作成するには人間の手が関与してへ託っ本発明のポリペプチドは天然型のポリペプチドの減成を行ない、たとえばＶＰＩカプシド蛍白蛍白−素的な切断にニジ得ら扛、或いは単一アミノ酸もしくは予備生成さ扛た小型ポリペプチドからのポリペプチドの化学合成にニジ、或いは回収可能な形態でポリペプチドを産生ずる生吻’ｔｔ’ｆニジ出す遺伝子工学の力演の１更用により得ら扛る。

「均等コドン」という用語Ｉ工灰白炎つィルス３型サビン株のｇ造カプシド蛋白質ＶＰ１會コードする１（ＮＡ配列に２げるコドン配列９３〜９８に対応した他の腸内ウィルスの構造刀プシト蛋白寅ＶＰＩ勿コードするルＮＡ配タリにおσる８１固のコドンのｄじ列ｔｔ体する。したがって、「均等コドン」は灰白炎りイルス３型丈ビン株に対すゐコドン９３〜９８に相当する、他の腸内ウィルスの構遁カフ゛シト直白員ＶＰＩ：コードするＲ　ＮＡ配列におσる対応する８個のコドンでめる。こｎは灰白灸ワイルス３型丈ビン体の対応塩基ｑ己列に４するＶＰＩ蛋白Ｊｔｔコードする佃の腸内ウィルスのＲＮ　Ａυ己列に２’ｒｆる堰基目己列を長日させて容易に決定することができる。個の腸内ウィルスに２ける「均等コドン」は５′禾端力）ら数えて第９３〜９８番目とすることもできるが、こｎは必らずしも必要でない。減磁サピン株の脣勇性原棟である灰臼炎ウィルス３型レオン（Ｌｅｏｎ　）株に２いて均等コドンは５′末端から数えて第９３〜９８番目であるが、灰白炎ウィルス１型サビンおよびマホニー株においては均等コドンは５′末端から数えて第９５〜１．ｏ　ｏ　＠目でめる。

現存する腸内ウィルス（野性型でも突然変異型でもよい）によジコードさｎる任意特定の「天然」ポリペプチド配列の「抗原性均婦物」はそｎ目体免役原性でなくても、こ′ｎを免役原注にするような吻質に結曾すると「天然」ポリペプチドと同僚のあるいは極めて類似した抗体反応を誘発しつるポリペプチドで必ジ、丁なわち生成さ扛る抗体は必らずしも正確には同一でないこともめるが同じ坤２工ひ型の腸内ワイルス’ａ−ＩＩＦ和ししたがって抗原性は効果上均等でめる。

「天然」ポリペプチド配列の抗原性ＰＪ咎物ｌまヘキサペプチドｌたはオクタペプチド″ｃ、ｖってもよいが、こｎうは封圧型または公理の尖然変典１腸内ワイルスによりコードさ扛ず、その配列中の抗原性に形督を与えないアミノ酸につさ１１固もしくは七〇以上の変化ｔさむ。たとえば、「天然」へキサペプチドもしくはオクタペプチド配列の１個もしくはぞｎ以上のアミンｖｔ原物の物理化学荷匡、すなわち亀荷田度、観水注／疎水注、大きさ＞、ｃひ構造を保持し、したがって兄投学的構造ｔも保持する１個もしくはそｎ以上の他のアミノ酸で各々置換することができる。たとえば、セリシンまスレオニンで置換することがでさくその逆も可能）、グルタミン酸とアスパラ千ン設で置換することかで＠（その逆も町ｎＣ）かつグルタミンはアスパラギンで置換することができる（その逆も”ＩＴｆ＠）。

さつに仇原均尋物は「天然」へキサペプチドもしくｃまオクタペプチド配列からなるがまだ均等な抗原性？有するより長いポリペプチドとすることもできる。したがって、「天然」へキサペプチドもしくはオクタペプチド配列はこの長いポリペプチド甲に露出きＣて過当な兎反反応に、Ｎ元することができ、かつ長いポリペプチドの円部に埋込まｎず、したがってそれ自身兜役反７石（！″起こすこと（さでさない。

さっに、抗原注拘寺吻は、天然ＪＣ列日の反応基を改変することにより、或いはＮ−木端アミノ基２Ｌひ／ｌたにＣ−末端カルボキシル丞を収変することにょジ生成丁ゐことがでさる。この棟の均等１勿はよ２工び／ｌたは塩基にニジ形成さｎた埴、符に生４学上ｔｆ谷しつる無機２工ひ・ぼ載のば２工ひ塩基にょ９形成さｔた塩を損金できる。その曲の均等物はエステルまたはアミドを虫取する改変カルボキシル基を言むことができ、或いはたとえばＮ　−ｔ−ブトキシカルボニルのような典型的なアミノ酸保護基を含むこともできる。この型の好適な改変は担立！で酵素的に分解する傾向の少ない、より安定かつ活性なポリペプチドを産生しうるものである。

上記「天然」配列の２種もし・くは３種の変化を組付せて本発明の抗原性均等ポリペプチドに到達することもできる。しかしながら、灰白炎ウィルス３型サビン株のＶＰＩカプシド蛋白質をコードするヌクレオチド配列が実際に添付図面に示し７Ｃ工うにコドンＧＧＵ　ＡＵＵ・・・・・・に工って開始するのか、或いは図面に２ける第１２番目のコドンであるコドンＧＧＣに工って開始するのかｌままだ明確には９Ｎ餡さｎていない。しかしながら、ここでは灰白炎ウィルス３型プゼン株のＶＰＩカグシド蛋白貞のヌクレオチド配列に対するコドンは図面に２ σる最初のコドンＧＧＵη為ら数えらｎる。

以Ｆ、不発明を灰白炎ウィルスにエリコードさ扛るポリペプチドを特に参照して説明するが、本発明の概念は他の腸同ワイルス、す７よりり腸内で見りｒｌ−ゐワイルス、たとえばｇｃｉ−ｉｏ　（腸内画側４注ヒトオーファン（ｅｎｔｅｒｉｃ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｈｕｍａｎ　ｏｒｐｈａｎ　）　）およびコックス丈ツキ−（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ　）　Ｂ型ウィルスにも同等に適用しつると考えらｎると認めらｎよう。慣例にしたがって本明ａ簀中に使用する塩基７ま次の通りでめる：同様に、慣例にしたがって１ミノ戚については次の記号全使用アスパラギン＝Ａｓｎアスパラギン酸：　Ａｓｐシスティン　＝Ｃｙｓグルタミン　＝Ｇ１ｎグルタミン鍍＝Ｇｌｕグリシン　＝　Ｇ１７ヒスチジン　＝　Ｈｌｓインロイシン＝Ｉｌｅロイシン　＝　Ｌｅｕリ　ジ　ン　＝Ｌｙｓメチオニン　”＝Ｍｅｔフェニルアラニン　”’　Ｐｈｅスレオニン　＝Ｔｈｒ（こｎらのアミノ酸を記載する場合、こｎらはＤ型およびＬ型装置の両者を担含するが、本発明にょｎばアミノ酸は天然配置、すなわちＬ型装置ｔとることが好ましい）。

上記の説明に３いて、サビン３型灰白炎ウィルスによりコードされる適当なＲＮ　Ａ目己列お工び対応するオクタペプチドは次の１１１！！＃）である：９３　１００ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＡＣＣＡＣＣＣＧＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧＭ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｉｎ　−ＯＲこのオクタペプチド２工びぞの抗原性均等物であるこのオクタペプチドｄ己列ｔざひＪニジ長いポリペプチドが本発明の好適なポリペプチドである。

上記したように本発明のポリペプチドは公知の楊（ハ）ワイルスにニジコードさｎるものと正確に一致する必要がなく、ポリペプチドの従属活性に対し作用を示ざないアミノ酸に変化を与える塩基の変化も可能でるる。後記第１表はその第１＠に上記のサビン３型灰日炎ワイルスボリペプチド全示し、第２掴お工び第３欄にそｎぞｎ１型丈ビンお工ひマホニー灰白炎ウィルスのポリペプチド全示し、かつ他の欄には３型丈ビン灰白炎ワイルスの突然変異株のポリペプチドを示している。

第１表に２けるブランクはアミノ酸が３型サビン灰白炎ウイルスについて示したものと変化していないことケ示す。３型サビン灰白炎ウイルス？コードするＲ　Ｎ　Ａ配列はＶＰＩゲノムの５′末端から数えてコドン８６〜１０３であるのに対し、１型丈ピンおよびマホニーボリペプチドｔコードするＲ　ＮＡ配列はＶＰＩゲノムの５′末端がｇ）数えてコドン８８〜１０５であることに注目丁べきである。

丈ビン灰日炎ワイルス３型に２いてポリペプチドの電型な領域ｔｉ　コト；ｚ　９３〜１００ｉＣニジコードされるポリペプチドであり、他の腸内ウィルスにおいてはろ寺コドンに１９コードサわるポリペプチドである。３型灰白炎ワイルスに対するワクチンとして、ぼたはその診断に使用するのに迩する好適なポリペプチドは人（１）：ｆ（−Ａｏ−Ａ、−）’ｓａ　Ａ３　Ａ４−ノｙ　Ａａ　Ａｔ　ＯＨ（１１〔式中Ａ。はＧｌｕ　′ｃｈす、丸はＴｈｒもしくはＳｅｒでろ９、かっ々はＡｒｇでめる〕のオクタペプチドでめる。第１表を参照して本発明のポリペプチドは）：′６己式１１）のいずｔか１つとすることができる：（Ａ）　ＡＯがＧｌｕ　、　ＡＨがＧｌｎ、ＡａがＰｒｏ　、　ＡａがＴｈｒＸＡ、がＴｈｒ　。

ＡｌＬがｋｒｇ　Ｓｉ２がＡｌａかつＡりがＧｉｎであ・るか、または（Ｂ）　ｔＡ）に規定さｎているＡａ””　Ａｔ以外のものは次の通りでめる：（ａ）　ＡｏがＧ１７　、またはｔｂｌ　ＡｍがＩｌｅ　、　ＡｌａまたはＡｓｎ、または［ｅ）　Ａ４がＡｓｎ　、ＳｅｒまたはＩｌｅ、または（ｄｌ　ＡｓがＧｌｎまたはＴｒｐ　、または（ｅｌ　ＡａがｒｈｒまたはＶａｌ、または（ｆ）　ＡｙがＬｅｕ　、Ｐｒｏ　、　ＡｒｇまたはＨｉｓ　、またはｔｇｌ　Ａ、がＧｌｙ　、または（ｈ）　Ａ３がＳｅｒ　、Ｉｌｅ　ｉたはＡｓｎかつムはＴｈｒ、　ｔｆＣは（ｉ）　Ａ３がＩｌｅ　、　４がＡｓｎもしくはＡｌａかつＡａがＴｈｒでめるか、−ｆたはその抗原性均等物である。

１型灰白炎ウイルスのワクチンとして、またはその診断に使用するのに迩する好適なポリペプチドは、式ｔｌ）に２いてＡ、がＡｌａ、ＡｌがＳｅｒ　、　Ａ３がＴｈｒ　％　ＡａがＡｓｎ　ｘ　ＡｓがＬｙａ　、　Ａ７がＡｓｐであるポリペプチド、および囚Ａ０がＳｅｒかつ＾がＬｙｓでろるか、または（Ｂ）ＡｏがＰｒｏかつムがＴｈｒであるポリペプチドまたはその抗原性均等物でめる。

さらに、本発明は８個のアミノ酸よジなるポリペプチド以上のポリペプチドｔも損金する。さらにアミノ酸および／またはペプチドが８個のアミノ酸よりなるポリペプチド鎖の一端部または両端部に結合して、たとえば１８個のアミノ酸からなるポリペプチド以上成することができる。或いは存在する８個のアミノ酸からなるポリペプチド配列自身かまたはこｎ６配列を含Ｍするそｎニジ長いポリペプチドが一端部または両端部にて蓋白質お工び／または他のキャリヤに結合することもできる。

たとえば「天然」オクタペプチドまたはそのオクタペプチド抗原性均等物の８個のアミノ戚配列がそｎニジ長いポリペプチドに含２ｎる場合、この８個のアミンばカらなるポリペプチドに結甘さｆ′Ｌ７′ｃ追訓アミノ酸は好ましくは対応する天然ＶＰＩカプシド黴臼買に２いて「天然」ポリペプチドに箱汗さｎたアミノ酸に対応する。３型サビン灰臼炎ウイルスに２いて、１８１ｖＡのアミノｖＲ配列に付加しうるｄ４１ＧＯＮ−末端アミノばはＡｓｎでめ９（頚骨図面から判る工うにＡＡσに工りコードさｎる）、η為つこの場合に付加しつる第１のＣ−末端アミノ酸はＬｙｓである（ＡＡＡによジコードさｎる）。この場合他の迩するアミンばは図面から決定でさる。

したがって、この８個のアミノ収配列全１８１面のアミン酸からなるポリペプチド中に構成することができ、後者は３個丈ビン灰白炎ウィルス株の構造カグシド蛋白Ｊ［Ｐ１ｉコードスルＲＮＡ配列におけるコドン８６〜１０’３により、或いは他の腸内ウィルスすなわらこの種のポリペプチドの抗原性ＦＪ等物の均号コドン＜、！：５コードされる。この穂のオクタデカペプチドは式ｆｉｌ）　：ｄＡ−７−Ｌ６　Ａ−５Ａ−４−Ｌ３　Ａ−２−Ｌ□−Ａａ　ＡＨ％　Ａ３−４ −ムＡ６　Ａｔ　Ａｇ　Ａｇ　Ａｌｏ　ＯＨ（Ｉｆｆにニジ示すことができる。

するオクタデカペプチドは式（ＩＩ）においてＡ−３がｖａｌ。

Ｌ２がＡｓｐ〜Ａ−１がＡｓｎであり、Ａ（ｆ’　Ａｔが３型灰白炎ウイルスのワクチンについて、ｃ＜（１）のポリペプチドに関して上記した通りであり、絢がＬｙｓ、ＡｔがＬａｕかつＡＩＯがＰｈｅであるもの、或いはその抗原性均等物である。

１型灰白炎ウイルスに対するワクチンとして使用するのに：ｉするオクタデカペプチドは、式ｔｉｔ）においてＡ−□がＡｓｎであり、Ａ、＃Ａ３お工ひ氏〜Ａ７が１型灰白炎ウイルスに対するワクチンについて式（１）のポリペプチドに関して上記した通ジであり、ＡＩｏがＰｈｅでめるもの、亜υＩｃ　ＩＡ）　Ａ−ｒがＡｌａ、　Ａ−６がＩｌｅ。

Ｌ、がｉｌｅ　％　ＡａがＳａｒ　；Ｑ＞っＡ４がＬｙｓでめるη為、ｌたは（ＢＩＡ−７がＴｈｒＸ７Ｌ６がＴｈｒ　、　−’Ｌ５がｉ・＋ｉｅｔ　％　ＡａがＰｒｏ　ｖｓっ＾がｆ’ｈｒでめるもの、或いはその抗原性均等物でおる。

３型灰臼炎ワイルスに対するワクチンとして使用するのに適した好適へキサペプチドは、式（Ｉｌａ）：ｆ（Ａｏ　Ａ１Ａｔ　、Ａ３　Ａ４　Ａ６−ＯＨ（Ｉｌａ）’に一’ｆｒＬ、ここでＬＡＩＡｏはＧｌｕ、Ａ４はＪｌｎ　Ｎ　Ａ２はＰｒｏ、Ａ、はＴｈｒ　。

潟はＴｈｒまたは痴はＡｒａで６５、或いは（Ｂ）（Ａ）に規定し７ｃ　Ａｏ” ’、　Ａｓ以外のものにつ＠　（ａｌＡｏがＧ１７または（ｂ）ＡａがＩｌｅ　、　Ｓｅｒ　、　ＡｌａもしくはＡｓｎ　、またはｔｃ１４がＡａｎ　、Ｓｅｒ　′！！たはＩｌｅ　Ｘ　または（ｄ）Ａ６がＧｌｎ　、　ＴｒｐもしくはＧ１７　、または（ｅｌＡａがＩＬｅ　、、　Ａ４がＡｓｎもしくはＡｌａであるものである。

１型灰白炎ウイルスに対するワクチンとして使用するのに適する好適へキサペプチドは式（Ｉｌａ）’に！Ｌ、ここでＡ１はＡｌａ。

Ａ１１はＳｅｒ　ｓ　ＡＪはｒｈｒＳＡｓはＡｓｎでおり、かつ（Ａ）ＡｏがＳｅｒであジかつ＾がＬｙｓであるか、′よ７ζはＩＢＩＡＯがＰｒｏでありかつ丸がＴｈｒでおる。

上記しｆｃＬう・ｔこ不発−Ａまさらに広義に２いて上記した「天然」ヘキサペプチドもしくはそのへキサペプチド抗原注向咎吻とオクタデカペプチドとの間、たとえばヘキサペプチド（１１ａ）もしくはオクタペプチド（１）とオクタデカペプチドｌｊｌとの間の７〜１７制のアミノ酸エリなる中間ポリペプチド頭τも損金し、すなわちそ扛ぞｎは８個のアミン戚配列を言むが連鎖の一端部もしくは両端部にノー次に蓄積さＣる。

より大型の化合物は、ヘヤサー２工ひ符にオクタペプチドが適当な免役反応？容易に誘発しうるＬうに位置したもの、特に分子の内部に「埋込ｎＪないよう位置したものである。従って、たとえば、ポリペプチドの反復単位を非共有結合に工 υ、或いは好ましくは共Ｍｉａ会によって互いに結合することができる。

本発明のポリペプチド配列に適当なアミノ酸が含まれていない楊さ、この目的で一刀の末端に付加的醸、時にＣｙｓ　ｆ結合することができ、こｎはジスルフィド結合の生成全弁して共有粘会することができる。

或いは本発明のポリペプチドｋａ含するより長いポリペプチド紫連鎖の各木端で納会しうる基を言１せることにエフルーズとして形成することもできる。勿論、ループはこねら木端におけるアミノ酸とは無関係に生じうるＮ−床端とＣ−床端との間のアミド結合の形成にニジもたらさ扛る。

本発明の合成ポリペプチドはでｎ目オでンよ免役原注に活性でなくても、キャリヤと結合さｎ免役原注に活性となる粕曾体を生成することρ）でさる。この場合キャリヤはたとえば十皿溝アルフ゛ミン、チログロフ゛りン、オボアルフ゛ミンもしくはキーホールランベット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　）ヘモシアニンのようなｆＥＩｊｔ、或いはパルミチン酸とすることができる。ヒトの完投化にはこのキャリヤはヒトに対し計容できでユつ安全である生理学上許容しつるキャリヤでなければならない。しかしながら好ましくはポリペプチドは破湯ノ虱毎寂工び／またはジフテリャ毎と納会して免疫原と多価ワクチンとｔ同時に生成するものである。或いはこのポリペプチドを不活性キャリヤに化学的に結会すせ、こｎすを使用してアフイニテイクロマトグラフイーにエフ適当なウィルスに対する抗体を分析しかつ／葦たは単離することができる。この種の不活性キャリヤの例はテキストラン、たとえばセファロースである。

ざらに本発明は不発・男の合成ポリペプチドの製造方法ｔも提供し、この方法は（ａ）３型灰白炎つイルスブピン株に対するコドン９３〜９８でめるかまたはそれに均等である構内ウィルスの構造カプシド蛋日買ＶＰ　ｌｉコードするＲ　ＮＡ配列に２げるコドン、’ＥｆｃＩまｔｂｌ削記３ＮＡ配列Ｖこ対応するｉ）　Ｎ　Ａ配列の対応コドンのい丁ｎ刀）の同定と、この工９に同定ざｎたコドンに対応するヘキプベグチドｄ己列からなるポリペプチドｌたはでの抗原性均等物の産生とかＩ；）なる。

腸内ウィルスのｇ逅カプシド着日ｇＶＰｌ’ｚコードＴ　ルＲＮＡ配列に２σるコドンによりコードさする不発明の合成ポリペプチドは、腸内ウィルスからのウイルスカグシド蛋白員ＶＰＩの分解、たとえば遅硯的なｄ素的切断７ｒ−より得ることができる。

しかしながら、こｎうポリペプチドは化学合成、たとえば一般公知の方法で製造するのがより便利であろっこｎらの方法においてポリペプチドは一般に単一アミノ酸ケ用いて或いは２個以上のアミノ戚残基を言有する予備生成さ′ｔ′したベグチド全用いてＮ−末端からまたはエリ一般的にはＣ−木端から構成される。

ポリペプチドを合成するための符別な技術は谷アミノ酸もしくは予備生成ペプチドの付加の前に太さす？増大したポリペプチド紫単離するという古典市方法ｋａ含する。或いは、同相のペプチドｉ＃ニーｔｆ用することもでき、この場合ペプチドは一般に、南側、たとえばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）樹脂に結合さｎる。

こｎらの構成に２いて一般にアミノば上の基はたとえばＬ−ブトキシカルボニルの工うな憬＄沫衰基ｖ℃ニジ上記したように保護される。必安７よらば、こｎも保護基ｔ♂成が完結した後に部会良く除去することができ、ただしこｎりは適当な免役反応を引き起こアボリベグチドｔさむ化合物のｎと力に＃４”Ｋ及ぼきない限り床付することもでさる。合成の庭にぼたはその終ジにポリペプチドの曲の収液を導入することかでさる。

さらに本発明のポリペプチドの可能な製造方法は遺伝子工学の技術愛用いるものであり、この場合ポリペプチド上コードするり、ＮＡもしくはＲＮ　Ａ　配列ｔプラスミド中へ導入し、このプラスミド自身を微生吻、たとえば細菌甲へ導入し、回収しうる形で“ポリペプチドｋｍ生しうるよう誘導することができる。かくして本発明はポリペプチドだけでなくこの・合成に１更用しつるポリベグチドケコードするＤＮＡもしくはＡＮＡ配列？包含する。しかしながら本発明のポリペプチド鎖には少数のアミン服しか存在しないため、最も適する製造方法は上記の連鎖を構成するための甘酸法である。

本発明のポリペプチドは腸内ウィルス、特に灰白灸ワイルス。

にニジ引起こきｎる病気に対し患者にワクチン接種するための付足用途ｔゼする。ワクチン接種は有効量の本発明の合成ポリペプチド？その２まで或いはキャリヤに結合したものとして患者に対し投与することに工ρ達成ざちる。典型的には、ｌｏ。

μｑ〜１１ｎ９のポリペプチドンヒトに投与する。

この目的に便ＦＦｊする揚台、物質は死没反応を引起しうる工うな物質、時に寸法としなげｎばならない。したがって一般にポリペプチドはたとえば上β己蛋白質のような免役涼的に活性なキャリヤに結合さｎ１或いはポリペプチド配列を言 ′０−長いポリペプチドの形態とすることができ、こｎはポリペプチド（１−たとえばボ１７−１ｙｓＯ工うなぜ成ポリペプチドに結合して達成することができる。本発明のポリペプチドは免役原型である場合、適当な抗体の生成ケ誘発することにＪ：　＃）！ｆＡ者を保護するよう作用しうると指摘さｎてさたが、さらにこのポリペプチドは化学療法効果ｔも有することができる。すなわち、適当な抗体の生成を誘発しつる同じポリペプチド配列がウィルスのＣａｙ　−１７ｓに２ける配列であってもよいと思わｎる。本発明のポリペプチドは免役原型でめる場オ、適当な抗体の生成ｔＳ発することに１９患者を保護するよう作用しうることが示さｎてさたが、さらにこのペプチドは化学療法幼果を有することもできる。すなわ−ら適当な抗体の生成全誘発しうる同じポリペプチド配列はウィルス茫患者の則施へ結合させて感染を起こさせうるウィルス性カグシド着白貞に２げる目己列−Ｃめってもよいと思わｎる。したがって本発明のポリペプチドは朋合作用を示すことができ、適当な、１ｔ１１７個り七プメ部位を占めることにエフ、ウィルスが患者に感染するの？助出することが出来る。一般に、本発明のポリペプチドを含ひ免侵原は注ｄｖＣエリ投与さｎ、この注射は一般にＳ腸内に行なわするが、たとえば榎腔内ｌたは反Ｆ江射のようなｄ４とすることもでさる。

さらに本発明のポリペプチドを使用して腸内ウィルスにニジ引起こさｎる病気に対するワクチン接種に対し高められた反応を示すように患者の免役系を刺戟することもできる。Ｍ動量（典型的には１００μ’！−１ｍｇ）　）の本発明のポリペプチドを患者に投与することができ、適当な時間の経過後に対応腸内ウィルスにニジ引起こさｎる病気に対し常法で患者にワクチン接種することができる。本発明のポリペプチドおよび慣用のワクチン接種に必要とさｎるポリペプチドの両者につき必要な物質はより少なくでき、かつ効果的ワクチン接徨を達成するにはより少ない接種でよい。

さらに、本発明は医薬上計容しつるキャリヤもしくは希釈剤と共に活性成分として本発明の合成ポリペプチド全台む医薬組成物を提供する。この組成物に２（ｆるペプチドの笑顔の形態すなわ）こｎが他の化合物に精片ざｎているかとりρ）は組成物の使用状態に依存する。

本発明のポリペプチドの他の用途は腸内ウィルスによる。感染症の診断でめる。

患者において適当なウィルスに対する抗体が存在する７Ｊ＞どうかｋ　灰量することに工９この診断は行なわｎる。

この目的では、一般にペプチドを上記した工つな不活性キャリヤに結合させ、この工うな形態でさらにこｎうｔアフィニティークロマトグラフィー媒体としてウィルスに対する抗体の単離に使用することができる。したがって本発明の脅威ポリペプチドは局内ウィルスに対する抗体上測定する際使用するのに通すル試験キットの成分ヲ渭成し、このキットはさらにポリペプチドに結合ざｎた抗体？測定する手段を言む。任意の適当な免役検定システム、たとえばラジオイムノアッセイシステム’ｋｆ用して抗体上測定することができる。

（以下余白）したがって、他の面において本発明は、人間または動物の治療法もしくは診断法に使用するための本発明のポリペプチドを提供する。

一般に治療法は、ワクチン接種して抗体反応を誘発させてそれだよシ後にウィルスにより感染されないよう患者を予防することを含み、また診断法は感染の結果生ずるウィルスに対する抗体の検出を含む。このポリペプチドの化学療法作用に鑑み、治療法はさらにポリペプチドを含む物質を既にウィルスに露呈されそして既に徴候が出はじめた後でさえ患者に投与することも含むことができる。

好ましくは患者に投与するワクチンは、本発明によるポリペプチド１種だけでなく少なくとも２種、好ましくはそれ以上を含む。

数謹の異なるポリペプチド、たとえば３種の異なる種類の灰白炎ウィルスのそれぞれにつき１種を含ませることによシ、これは患者を３種の灰白炎ウィルスの全部に対しワクチン接種することができ、かつこのワクチンは同じ型の異なるウィルス間でのポリペプチドの変化を考慮に入れることもできる。さらに他の抗原、特にたとえば破傷風、ジフテリャおよび百日咳のような幼児ワクチンに一般に使用されるものを含む物理的混合物として組成物を調合するのが好適である。しかしながら、上記したように、所望に応じこれらの抗原を本発明のポリペプチドに化学的に結合させて、これを免疫原性にすることもできる。

図面の簡単な説明添付図面は、本発明者等により決定された灰白炎ウィルス３型サビン株（レオン）におけるＶＰ１カプシド蛋白質に対するＲＮＡ配列を示している。この配列内において、コドン９３〜１００　（Ｄオ’）ゴヌクレオチドを下線で示す。

下記実施例１および２は、灰白炎ウィルス３型サビン株（レオン）のＶビニカプシド蛋白質をコードするＲＮＡ配列におけるコドン９３〜９８によシコードこれる領域を含む、コドン９３〜１００によりコードされる８個のアミノ酸領域が腸内ウィルス中和の際関与する主抗原部位として本発明の発明者によシどのように同定されたかを示している。

実施例３〜６は、本発明を実施するだめの最適具体例を含む具体例を示しているう実施例　１３型灰白炎ウイルス（Ｐ３−レオンーＵＳＡ−１９３７）に特異的なモノクローナル抗体を作成した。単一の親灰白炎ウィルス３型株の突然変異種を、数種の個々のウィルス中和性モノクローナル抗体の存在下で選択した。モノクローナル抗体に対する耐性の明確な、ｅターンによシ１６種の突然変異群をじ）定した。

それらの反応パターンを第２表に示す。この表は、さらに突然変異ウィルスの各群を選択するのに使用したモノクローナル抗体をも示し、これらはこれらの突然変異種が選択モノクローナル抗体および数種のその他の抗体により全く中和されないという事実によシ証明される。これら突然変異種がモノクローナル抗体のコレクションの少なくとも１種によシ中和されうる能力を喪失したという事実は抗原部位において少なくとも１つの塩基変化が恐らく生じたという事実を支持する。これらの知見は、抗体による灰白炎ウィルスの中和が単一の抗原部位に関係することを示すと解釈された。各突然変異種からの代表的株のＲＮＡを配列決定して、耐性を示すＶＰＩにおけるアミノ酸置換の位置をよシ正確に規定した。これは、クローン化した灰白炎ウィルス　ｃＤＮＡから調製したプライマー制限断片を用いてジデオキシ配列決定法により行なった。

各突然変異群の代表様のＲＩＪＡを、ダノムのＶＰＩコード領域の５′末端から下流に位置する３９３から約２４０塩基の領域で配列決定した。ジデオキシ配列決定法を使用したが、この際クローン化した灰白炎ウィルスｃ−ＤＮＡから調製した制限断片プライマーを使用した。このプライマーは、プラスミドＤＮＡをＥｃｏｒ　ＲＩおよびＳｐｈ　１で切断しかつＤＮＡポリメラーゼｌからのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片１単位および（、ニア−３２Ｐ）　ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／　ｒｒｍｏｌ　；アメルシャム・インターナショナル社）１００μＣｉと共に培養して標識した。これら生成物を変性させ、調製用ポリアクリルアミドダルスラブに充填した。電気泳動の後、オートラジオグラフィーによライフ塩基制限断片を検出し、切除し、かつゲルから溶出させた。このプライマーを、排出クロマトグラフィーによシ精製し、次いでウィルスＲＮＡに融合させかつ適幽割合のノブオキシリポヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドと共に５単位の烏筋原細胞逆転写酵素（ＡｖｉａｎＭ５’ｅｌｏｂｌａｓｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ライフ・サイエンス・社）と−緒に培養した。

３７℃にて２５分間培養した後、反応生成物を変性させ配列決定用ゲルに充填した。電気泳動の後、これらデルを１０チ酢酸に固定し洗浄し、乾燥させ、オートラジオグラフィーにかけた。

全突然変異種の配列は、第３表に示した単一の点突然変異以外には同じであった。突然変異が検出された場合、突然変異種１個当り１個のみ存在しかつ全てでアミノ酸置換を生じた。

１６種の突然変異群のうち１５種のウィルスで塩基変化が検出され、これらの変化は８個のコドンのみの領域、すなわち第３表において親灰白炎ウィルス３型サビン株のコドン９３〜１００に対応する位置４〜１１に集中した。したがってコドン９３〜１００によシコードされるアミノ酸配列が抗原部位を示すと結論された。

ＶＰ　１　ｆツムの完全な配列を添付図面に示す。

さらに、第３表は灰白炎ウィルス１型（マホニー株）に対する抗原部位のアミノ酸配列およびコドン配列を示している。関係する位置は位置４〜１１である。これらはコドン９５〜１０２に対応する。

実施例１の突然変異種を、抗体２５−１−１４によシ中和されたかどうかにしたがって分類した。その結果を第４表に示す。

これから判るように位置４．７および９（コドン９３．９６および９８に対応する〕における置換全ては、この抗体によシ中和されないウィルスを生成した。逆に、位置１０（コドン９９）における置換は中和に対し作用を示さなかった。さらに、ヒドロキシル基をもたないアミノ酸による位置８（コドン９７）にお１〕３置換は中和の欠如を伴なった。位置１１（コドン１００）における置換の効果は不明である。したがって、抗体２５−１−１４は、その中和活性のために位置４ではグルタミン酸を、位置７ではスレオニンを、位置８ではスレオニンもしくはセリンを、位置９ではアルギニンを必要とすると結論された。

突然変異種の分析に使用した全部で１１種のモノクローナルに、特に位置４および９におけるアミノ酸が突然変異ウィルスの中和に効果があった。さらに、６腫の抗体は位置８にスレオニンの代シにセリンを有する突然変異種を中和したが、この位置に他の置換を有するウィルスは中和しなかった。第７番目の抗体（２０８）は、この位置にどんな置換をもつウィルスをも中和しなかったつこれは、ウィルスに中和抗体を結合する際にヒドロキシアミノ酸が重要であるという知見と一致する。抗体と抗原との反応に関与する残基から予想されるように必要とされるアミノ酸の大部分は性質上：画性であった。このことは、ＶＰＩにおける８個のアミノ酸配列が中和性抗体の結合するウィルスにおける部位を示すという知見を支持する。

実施例　３本発明による次のポリペプチドＳｌ、８２．Ｓ５およびＳ６を、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂を用いる標準法によって合成した：Ｈ−Ａｌ　ａ−Ｉ　１　ｅ　−Ｉ　ｌ　ｅ　−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ４ｓｎ− Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ　−Ａｌ　ａ　−Ｇｌ　ｎ、−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−ＯＨ＊Ｈ−Ｇｌ　ｕ　−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｎ−Ｌ７ｓ　−ＯＨ；Ｈ −Ａｓｎ　−Ｇｌ　ｕ　−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ｔｈ　ｒ　−Ａｒｇ −Ａｌ　ａ−Ｇｉｎ　−Ｌ７ｓ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−１ｋｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｃ７ｓ−ＯＨ；および３００μモルの樹脂は１８０■の８１と２５０■の８２と１９０■の８５と２４０〜の８６とを生成した。これらの、１′ ？ＩＪペプチドは、セファデックスカラムを介し５０％（Ｖ／Ｖ）酢酸を用いて洗浄することにより精製した。

実施例　４：　オリゴペプチドＳＩＯおよび５１０ａの製造Ｈ−Ｇｌ　ｕ　−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｎ−Ｌ７ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｃ７ｓ−ＯＨ（ＩＩＩ）Ｈ−Ｃｙｓ　−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−Ａｓｎ−Ｇｌｕ　−Ｇｉｎ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ａｌ　ａ　−Ｃｙｓ　−０Ｈ（ａ）　固相支持体の作成ポリジメチルアクリルアミドダル樹脂（ジメチルアクリル匍５アミド−エチレンビスアクリルアミド−アクリロイルコシンメチルエステルの共重合体；樹脂１ｇ当り０．３ミリ当量のサルコシンを含有する）をエチレンジアミンで１晩処理した。

充分洗浄した後、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ　）−バリンを内部標準として添加した。Ｐｍｏｃ　基を除去した後、酸感受性結合剤４ −ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸をその対称性無水物として加えた。充分洗浄した後、これは低充填の酸感受性樹脂（ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルス社、バトン・エンド・インダストリャル・ニステート・ハーストン、ケンブリッジシー、ＵＫ）を与えた。

（ｂ）　式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の保護オリゴペプチドの作成（ｆｆ）：部分保護されたペプチド（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を、上記で作成したポリアミド２ル樹脂を用いて、固相ペプチド合成の脂Ｏｅ−ポリアミド法によシ合成した〔アーシャディー等、Ｊ、Ｃ５Ｓ、パーキン　エ、第５２９頁（１９８１）；アサニトン等、Ｊ、Ｃ０Ｓ、ノ髪−キンエ、第５３８頁（１９８１）；アサ−トン等、Ｊ、Ｃ６Ｓ、パーキンエ、第６５頁（１９８３年）；ブラウン等、Ｊ、Ｃ０Ｓ、ノ髪−キンエ、第７５頁（１９８３年）；ブラウン等、Ｊ、Ｃ１Ｓ、／ぜ一キンエ、第１１６１頁（１９８３））。

Ｆｍｏ　ｃ−アミノ酸は、それらの予備生成した対称性無水物として結合させた（１２倍過剰）。

Ｆ′ｍｏｃ−アミノ酸（２当量〕を必要に応じ溶解を助ける数滴のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド＜ＤＭＦ）−Ｊ＝含むジクロルメタン中に溶解させた。Ｎ、Ｎ −ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１当量）を加え、混合物を室温で１０分間攪拌した。沈澱したＮ、Ｎ−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ、）を炉別し、炉液を蒸発乾固させ、残渣をＤＭＦ中に溶解させた。この溶液を保護されていない洗浄した樹脂へ加え、結合反応を進行させた。誘導された樹脂に対する第１の残基の結合は、触媒として作用するＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１当量）の存在下で行なった。

アス・髪うギンおよびグルタミンの残基は次のように加えた：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（１当量）およ、びＤＣＣ（ｌｉ量）をＤＭＦ’ 中に０℃で溶解させたっ０℃にて１０分間攪拌した後、Ｆ＋ｒｎｏｃ−アスノ髪うギン（もしくはグルタミン）（１当量）のＤＭＦ溶液を加えた。この混合物をさらに０℃で１０分間攪拌し、次いで全混合物を樹脂に加え、そして結合を進行させた。典型的な合成サイクルは次の通シである：ＤＭＦ　５　Ｘ　１分　洗浄１０％ピペリジン／ＤＭＦ　ＩＸ３Ｘ３分区１×７　脱保護ＤＭＦ　１０　Ｘ　１分　洗浄ステル　６０〜１２０分　結合ＤＭＦ　５　Ｘ　１分　洗浄各段階における結合の完了は、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験によシ監視した。

使用した量は次の通シである：酸感受性樹脂（１，０！！：　０．３　ミ！７モル）およびＦ）ｎｏ　ｃ−アミノ酸（３，６ミリモル）、、各サイクルは次の基１７、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−０Ｈ１，５３，！９　；　３．６ミリモル　１　時間Ｃ−末端へブタデカペプチド配列はオリゴペプチド（ＩＤおよび（ＩＶ）の両者に共通であるので、この樹脂を脱保護の後にサイクル１７の終シに半分に分割し、そして半分に加えた：１８、Ｍｎｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕ　）−ＯＨＯ，７２Ｊ　；　１．８ミリモル　１　時間脱保護および洗浄の後、両ペプチド樹脂をジクロルメタンとジエチルエーテルとによる洗浄で収縮させた。室温にて１時間、９０チのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で処理し、後処理の後にペプチＩ’（ＩＩ［）および（ＩＶ）を得た（それぞれ１３８および１５９■）。

両ペプチド（ＩＩＩ　’）およびＣＮ）を高性能液体クロマトグラフィー（ｈｐｌｃ）および迅速原子衝突質量分光光度法（’ＦＡＢ　−ＭＳ　）によッテ検査した。ｈｐｌｃ　（μボンダ’　ツクＣ＋ｓ　ｔ　２５％ＣＨ３ＣＮ　；７５％０．０１モルＮＨ４ＯＡ　ｃ　、　ｐＥ（４，５：インクラチック）は、ペプチドの純度が９０−以上であることを示した。２０５０におけるペプチド＜ＩＩＩ）および２２０９におけるスプチド（ＡＶ）に対するＦ’ＡＢ−ＭＳ　の分子イオンは、両ペプチドが正確な分子量、すなわちそれぞれ２０４９および２２０８を有することを示した。爆らに、両スペクトルは、後に続く再プロトン化によりアルギニン残基からニトロ基が失われることによシイ５質量単位だけ低いジグペプチドＣＴｆｌ）およびＣ■）をポリアミド樹脂から開裂させ、掃除剤としてのア二ンールの存在下で液体弗化水素を用いて完全に脱保護した。これによυ、後処理の後にそれぞれペプチドｓｌｏ　＜７８ｍｑ）およびＳ　１０　ａ　（８５ｍｇ）が得られた。更に精製は行なわなかった。ｈｐｌｃ　（μボンダ／ＶツクＣｔ８：　２０　％ＣＨ３ＣＮ；　８０％　０．０１モル　ＮＬＯＡｃ、ＰＨ４ −５インクラチック）において、両化合物につき単一の主成分が示され、推定純度は８０チ以上であった。種々の系における薄層クロマトグラフィーは、これら生成物が実質的に均質であることを示した。

ペプチドＳＩＯに対し１９４９　、ペプチド５１０ａに対し２０５２　においてＦＡＢ−ＭＳを用い分子イオンを観察した。これは、それぞれペプチドが１９４８および２０５１　の分子量を有することと一致した。はぼ等しい強さのシグナルが、両はプチドに対する分子イオンよシ１８質量単位低い所で観察さｎた。この現象は説明できないが、恐らく両ペプチドに共通する不純物を示すよシむしろ断片シグナルを示すものと思われる。還元状態においてのみではほとんど存在しないシスティン成分を両ペプチドが含有するので、存在する全てのダイ７が観察されうるようにＦＡＢ−ＭＳを高視野で行なった。これはいずれかのペプチドについては行なわなかった。

実施例　５：　オリゴペプチド８１１およびＳ１２の作成：Ｈ−Ａｌａ−Ｉ　ｌｅ　−工１ｅ　−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇ　ｌｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＯＨＨ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　１ｎ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ｔｂｒ　−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｙｓ　− Ｌ、ｅｕ−Ｐｈｅ　−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−１１ｅ−ＯＨこれらのペプチドは、実施例４に記載したと同様に合成した。

使用した量は次の通りである：酸感受性樹脂（０，５ｆ；０．１５ミリモル）、ｐｍｏｃ−アミノ酸（１，８ミリモル）、ＤＣＣ（０，１９ｔ；　０．９ミリモル）、ＤＭＡＰ（０，１１？、０．９ミリモル）およびＨＯＢＴ（０，１２ｒ、０，９ミリモル）。

合成の完結後、ペプチド樹脂をジクロルメタンとジエチルエーテルとで洗浄して収縮させた。

ペプチド全樹脂ρ）ら開裂させペプチド樹脂（ｉ−９０’１６）リフルオロ酢酸水浴液で室温にて１時間処理することにより酸感受性側鎖保獲基全除去した。濾過後、溶剤を蒸発させて残渣を得、これ全ジエチルエーテルでトリチル化してオリゴペプチド（Ｖ）を白色固体として得た（１５２■）。ｈｐｌｃ　（μポンダノＱツクＣ１８２厘線勾配５〜９５％ＣＨ３ＣＮ−０，０１モルＮ　Ｈ４０Ａ　Ｃ。

ｐＨ４，５，１５分間）は生成物が実質的に均質であることを示した。

この物質を８０チ酢酸（１５ゴ）中に溶解させ、１０チＰＶＣ（１５０■）を加え、そして攪拌懸濁物中に水素′ｆｒ：１５時間バブリングさせた。触媒をｆ別し、Ｐ液を蒸発させ、残渣をジエチルエーテルでトリチル化してＳｌｌの淡黄色固体を得た（１０２■）。

上記と同じ条件下におけるこの物質のｈｐｌｃは、実質的に均質な化合物であることを示した。ＦＡＢ−質量分光光度測定は分子量１８１１に一致するｍ／ｅ　１８１２において明確な分子イオンを与えた。

Ｈ−Ａｌａ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｇ　１ｕ−Ｖａｌ　−Ａｓ　ｐ　−Ａｓｎ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ　（Ｎ０２）−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＯＨ（Ｖ）（ｂ）８１２の作成使用した量は次の通りである：酸感受性樹脂（０，５Ｐ　；　０．２５ミリモル）　、　ｐｍｏｃ　−アミノｆｉ（１，８ミリモル）、ＤＣＣ（０，１（１；０．９　ミリモル）；　ＤＭＡＰ　（０，１１り；０．９ミリモル）およびＨＯＢＴ　（０，１２ｔ　；　０．９ミリモル）。

最終的脱保護の後、樹脂を洗浄し、前記と同様に収縮させた。

樹脂からのペプチドの開裂は、数滴のア二ンールを含有する９０％トリフルオロ酢酸水溶液金用いて行なった。オリゴペプチド（Ｖｌ）　’に淡黄色固体として得た（１１７η）。ｈｐｌｃ　（μポンダパック０１ｓ％　３５％ＣＨ３ＣＮ　６５％０．０１モルＮＨ４０Ａ　（！、ｐＨ４，５）は単一ピークを示した。生成物は薄層クロマトグラフィーにおいても均質であった。

前記と同様に行なった水素化で、後処理の後にペプチド８１２生成物■を淡黄色固体として得た（９３■）。ｈｐｌｃ（μボンダノ？ツクＣ１８，直線勾配５− ９５％　ＣＨ２ＯＨｌｏ、０１モルＮＨ４０Ａｃ、ｐＨ４，５１５分間）は生成物が実質的に均質であることを示した。ＦＡＢ−質量分光光度測定は分子量１９７４に一致するｍ／ｅ　１９７５　におけるシグナルを与えた。

Ｈ−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｐｒ　ｏ　−Ｔｈ　ｒ　−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（Ｎｏ２）−ＡＬａ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｐｎｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ（ＮＯｚ）−１１ｅ−ＯＨ（Ｖｌ）実施例　６：　特異抗体反応の測定ペプチドＳＩＯおよびＳ　１０ａに対する実験ウサギの特異抗体反応を次の事項に関し測定した：１、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）試験により検出される未結合ペプチド（Ｓ１０または８１０ａ　）に対する抗体。

２．１型、２型および３型の灰白炎ウィルスに対する抗体。これらは、以下により検出される：（ａ）　ゲルにおける単−一うシアルー拡散（ＳＲＤ）にて測定される灰白炎ウィルスＤおよびＣ抗原に対する抗原遮断検定。

（ｂ）　ゲルにおける免疫二重拡散試験。

（ｃ）　免疫電子顕微鏡。

（ｄ）　組織培養におけるウィルス中和試験。

１ゴの０．１モル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）を、３０■の牛チログロブリン（ＢＴＧ、シグマ社）を含有するガラスのバイアルに加えた。溶解した物質を、１１１Ｌｔの燐酸ナトリウム緩衝液で洗浄しながら１０ｍｇのペプチド（Ｓ１０．５１０ａ）’に含有する別のバイアルに移して最終容量２ゴのペプチド −ＢＴＧ溶液を得た。このバイアルをアルミニウム箔で覆って光音遮断した。

２％グルタルアルデヒドの溶液全０．１モル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中に作成し、そしてその２００μＪを５０μｊづつ４回に分けてペプチド−ＢＴＧ溶液に振とうしながら添加し、次いで間けつ的に振とうしながら室温で１時間放置した。次いで。

この溶液を１１の燐酸緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）に′対し１晩４０時間透析し、次いで新鮮なＰＢＳ　Ｉ　Ｊに対しさらに８時間透析した。結合したペプチドは必要とされるまで一７０℃にて貯上記と同様に合成オリゴペプチドＳ１０および１９１０ａｋ別々に牛チログロブリン（ＢＴＧ）に結合さぜた。免疫化に使用した調製物は５００ｐｔ／ｍｌのペプチドＳＩＯまたは５１０ａと１５００μ ｆ／ゴのＢＴＧ　、！：を燐酸緩衝塩（ｐＨ７，２）に懸濁して含有し若い（５ｍ６ケ月令）の健康なウサギに初回投与量０．５−の結合ペプチドを等容量のフロイント完成アジュパン）（ＦＣＡ、パクト社）と混合して筋丙内注射し、次いでブースター投与量（０，５ｍｔ）の結合ペプチドもしくは未結合ペプチド’ｔ　ｋｌ　（０Ｈ）３（０，５ｍ）に吸着させて次のスケジュールにしたがって注射した。分析用の血清試料は第１回目の注射後に６２日１”ｊｌまで間隔全おいて採取した。

０８目　０．５ゴ績合ペプチド十ＦＣＡ　血清試料１４日８　血清試料１７日８　０．５Ｍ話合ペプチド　− ２７日目８　血清試料３０日８　０．５４結合ペプチド　− ４１日目８　血清試料４８日８　示結合ペプチド＋ＡＪ（ＯＨ）３血清試料　−５５日８Ｇ２日目　皿 χｒ＃５（科オリゴペプチドに対する抗体の＃素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）ペプチドに対するウサギの免役反応を倹討するため、鉢索免疫分析を行なった。グルタルアルデヒドによタポリビニル板に結合されたオリゴペプチドに結合する抗体についてウサギ血清を検査した。結合した抗体は酵素、β−ガラクトシダーゼに結合した抗ウサギ抗体を加えて検出した。β−ガラクトシダーゼに対する基質（オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）を加えると比色変化が起こり、その強さはペプチドに結合した抗体の量に比例する。

９６大のミクロエリサ板（ダイナチク社）ｉＰＢｓ中の０．２％グルタルアルデヒドで３３時間処理した。これらプレートヲＰＢＳ中で２回洗浄しオリゴペプチドを加えた（　１０ｐｆ／ｍｌ　）。

室温にて１晩インキユベートした後、プレートを０．５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０　（コツホ−ライト・ラボラドリース社、コルンブルック、パークシャー州）を含有するＰＢＳで５回洗浄した。０．０１％す）　ＩＪウムアジドを含有するＰＢＳ中のウサギ血清の希釈物を穴に加え、そして室温にて１晩培養した。プレー　）　ｋ　０．５％ツイーン２０を含有する燐酸緩衝した生理食塩水で５回洗浄し、０．１％ツイーン２０と１０ミリモルＭｇＣＪ２と１ミリモル２−メルカプトエタノールとを含有するＰＢＳ（１）Ｈ７，５）で希釈したβ− ガラクトシダーゼ（アメルシャムーインターナショナル社）に結合したロバ抗− ウサギＩｇを加えた。

３７℃にて３時間の後結合した抗体を除去し、プレー）１−ツイーン２０を含有する燐酸緩衝した生理食塩水で５回洗浄した。

基質、オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（１０ミリモルのＭｇＣ１，と０．１モルの２−メルカプトエタノールとを含有する燐酸緩衝した生理食塩水（ｐＨ７，５）中に３ミリモル）を各穴に加え、プレートを３７℃にて発色するまでインキュベートした。光学密度ｔ−４１０ｎｍに設定したチターテク・マルチスカｙ　（’ｌ’１ｔｅｒｔｅｋ　ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　）装置で測定した。この装置は基質を用いて「ブランク調製」し、光学密度がペプチドの免疫化前の動物から採取した正常ウサギ血清の１：１００希釈物におけるよりも大きい場合に血清希釈物は陽性であると考えられた。

ゲルにおける単一ラシアル拡散（ＳＲＤ）ｋ用いた灰白炎ウィルスＤおよびＣ抗原に対する抗体の抗原遮断検定ウサギ血清ｔ　ＳＲＤ抗原−遮断試験で試験し、灰白炎ウィルス３型のｒＤＪおよび「Ｃ」抗原との反応性を測定した。使用した方法はどこにでも記載されているシャイルド等（１９８０）のオートラジオグラフＳＲＤ法の変法とした（７エルグンン等、１９８２）。要するに、シュークロース勾配からの灰白炎ウィルス抗原の［Ｓ”）−メチオニン標識した１５５ＳｒＤＪまたは８０８「Ｃ」ピークを試験モノクローナル抗体と混合した後に、低濃度の超免疫性抗灰白炎ウィルス３型血清を含有するアガロースゲルにて穴に加えた。２４〜４８時間後のこの穴における放射線標識した抗原の拡散をオートラジオグラフィーにより検出した。燐酸緩衝した生理食塩水のみで処理しん対照抗原と比較して、ｒＤＪおよび／または「ｃ」抗原と反応する試験抗体はゲル中へのその拡散全阻止する。燐酸緩衝した生理食塩水と混合した対照抗原で得られた帯域と比較してその帯域の寸法を著しく減少させる血清の希釈率として抗原遮断タイター全測定する。

免疫−二重−拡散検定これらはシャイルド等（１９７１）およびシャイルド（１９７２）により記載された方法を用いてアガロースゲルで行なった。使用した抗原はシャイルド等（１９８０）により記載されたように調整した灰白炎ウィルスｌ型、２型および３型の濃縮物とした。

ウィルス中和試験これらはドモクおよびマグラス（１９７９）の標準法により、９６穴マイクロタイター板の穴の中のＨｅｐ　２　ｃ細胞の単一層において行なった。ウィルスの投与量は穴１個当り１００組織培養感染投与量５０％とした。

免疫電子顕微鏡マイナー等（１９８０’）により記載されたように作成した濃縮および精製した灰白炎ウィルス３型（Ｐ３／レオン／ＵＳＡ／３７）のＤ抗原を等容量の無希釈または１：１０希釈のウサギ血清と混合し、３７℃に４５分間保った。１０μｌの混合物全炭素膜被覆した電子顕微鏡のグリッドに載置し２分間浸入させた。過剰の混合物ｋＦ紙で吸取り除去し、この試料をシリコタングステートナトリウムの４％水溶液（ｐＨ７，４）で１５秒間ネガティブ染色した。これらのグリッドを乾燥させ、フィリップ２０１型電子顕微鏡下で検査した。ウィルスの凝集物の存在を記録した。

均質ペプチドに対する抗体の誘導ＥＬＩＳＡ分析により測定したオリゴペプチド８１０に対する抗体のタイター全代表的動物につき第６表に示す。８１０またはＳ　１０ａによυ最初に免疫化してから１４日後、全ての動物はペプチドＳＩＯに対する容易に証明しうる抗体を有した。タイターは２７日目まで上昇し、またその後のオリゴペプチドのブースター投与後血清試料でも上昇した。ペプチド５ＩＱａを用いたＥＬＩＳＡ試嫉において、抗体タイターはＳ１０’に用いて得られたものと極めて類似していた。

ＢＴＧのみで免疫化した（すなわち、結合オリゴペプチドを含まない）対照動物においては抗ペプチド抗体は検出されなかった。

灰白炎ウィルスに対する抗体の誘導（ａ）　抗原遮断抗体感染性灰白炎ウィルス粒子（Ｄ抗原）または空白ピリオン（Ｃ抗原）に対し特異的な抗体は単一ラシアル拡散試験（シャイルド等、１９８０．フェルグソン等　１９８２）ｔ−用いた抗原遮断検定により検出することができる。ＢＴＧＫ結合したオリゴペプチドＳＩＯおよび３１０ａで免疫化した動物から得られた血清にこの方法を適用した。

（以下余白）第７表は、上記免疫化スケジュールにてオリゴペプチドｓ１゜および５１０ａを注射したウサギにおける灰白炎ウィルス３型りおよびＣ抗原に対する遮断抗体の誘導を示している。灰白炎ウィルス３型り抗原と反応しかつその拡散を遮断する抗体が、免疫化を開始してから（すなわち、抗原を２回投与した後）１４日−目と２７日目との間に最初に現われた。１匹（ウサギ／１６５２）ではＣ抗原のみに対する抗体を生成し、表に示した４匹の動物では同様なタイターまでＤ抗原とＣ抗原との両者に対する抗体を生成した。この抗体は灰白炎ウィルス３型に対し特異的なものであり、いずれの動物でも灰白炎ウィルス１型または２型のＤもしくはＣ抗原に対する遮断活性は示さなかった。

（ｂ）　免疫−二重−拡散試験免疫二重拡散試験は、ウィルス抗原および抗体の特異反応を検出するためにウィルス学において広く使用される（シャイルドおよびダウドル１９７５）。これらの試験は、灰白炎つィルスＤ抗原および特異抗血清に適用されてきた（ビールおよびメイソン１９６２）。オリゴペプチド８１０および５１０ａで免疫化したウサギからの血清を、ウィルス性抗原に対し試験した。

観察された沈降素反応を第８表に示す。

主としてＤ抗原粒子を含有する灰白炎ウィルス３型（Ｐ３／サウケット（Ｓａｕｋｅｔｔ）　／　Ｕ　Ｓ　Ａ　／　５０　）のａ編物で試、験した場合、免疫化開始後、４１日、５５日および６２日目にウサギから採取した血清はえ明な沈降素反応を示した。（第８表）（マイナー等１９８０．シャイルド等１９８０）。

これらは、１型または２型の灰白炎ウィルスの濃縮物とは反応しなかった。

免疫化開始前或いはその１４日後に採取した血清はこの種の反応を示さなかったのに対し、２７日目に採取した血清の一部はこれらの反応を示した。反応の特異性を試験するためにウサギ５３．５５および５７から５５日目に採取した血清を広範囲の灰白炎ウィルス３型株に対して試験した。それらの結果を第９表に示す。

これらの血清は試験した全ての灰白炎ウィルス３型株と反応したが、１型または２型灰白炎ウイルスとは反応しなかった。

したがって、これらの抗体は灰白炎ウィルス３型に特異性であるが、３型ウイルスの種々の株に対し広く反応性であった。

沈降素ラインの同一性を更に試験するために、免疫化開始後５５日および６２日目にウサギ５５および５７から採取した抗血清を、ｆ？ｆＪした灰白炎ウィルス３籾（サビンワクチン株）に対する。ｌ−？　ＩＪクローナルな山羊抗血清が加えられている容器に隣接した容器で試験した。ウサギ血清から得られたラインはポリクローナルな山羊血清から得−られたものに対し連続性を示した。

使用した抗原調製物（Ａ／サウケツｌ−／ＵＳＡ１５０ウィルス）が主としてＤ抗原粒子を含有していたため、ウサギはＤ抗原と反応すると結論された。この結論は沈降素試筆で抗原としてＳ３５メチオニンで標識した精製したＤおよびＣ抗原を用いるこきにより確認された（マイナー等、１９８０）。Ｍ製したＤ抗原は、オートラジオグラフィーにより明確に示される沈降素ラインを与えた。

灰白炎つィルスＤ抗原粒子を５６℃にて５分間加熱すると、その抗原特性はＣ抗原の特性に定量的に変化することが知られている（ル・ブービニール、１９’５５）。適当に加熱したＰ３／サウケット／ＵＳＡ１５０およびＰ３／レオン（Ｌｅｏｎ、）　／ＵＳＡ／３７のｆｌｋ縮物編物いて免疫二重拡散反応を行なった。

灰白炎ウィルス３型り抗原に対応する免疫沈降素ラインを与えた血清をさらに加熱ウィルスに対して試験した場合、Ｃ従属に対応するラインをも与えた。これらの知見はウサギ血清でＤ抗原およびＣ抗原の両者に対し特異的な抗体が検出されたＳＲＤ抗原遮断試験の結果と一致する。

ｆｃｌ　免疫電子顕鍼鏡オリゴペプチドによる免疫化開始後５日月にウサギ５５および５７から採取した血清は、ウィルスＰ３／レオン／ＵＳＡ／３７ウイルス粒子の純粋な凝集物を生成した。燐酸で緩衝した生理食塩水のみで、或いはウィルス粒子が広く分散している時点で同じ動物（Ａ５５および５７）から０日月に採取した血清で処理したウィルスの対照調製物では上記のような；凝集物は見られなかった。これらの知見は、ウサギ血清がウィルス粒子を架橋しかつ凝集しうる灰白炎つィルス３型に対する抗体を含有することを示すと解釈された。凝集物における個々の粒子間の間隔（１０〜ｌ　５　ｎｍ　）は免疫グロブリン分子の寸法と一致した。多くの粒子が、結合抗体と解釈される物質の「ハロ」により包囲されることが畿祭された。公知の特異抗体、たとえば、灰白炎ウィルス３型に対するモノクローナル抗体をウィルスに加えた場合、同じ現象が観察された。

（ｄ）　ウィルス中和試験辱１０表は、オリゴペプチド８１０および５１０ａで免疫化した４匹のウサギにおける灰白炎ウィルス３型株に対するミクロタイターアッセイで検出された中和タイターを示している。

中和活性は免疫化の４１日後における動物の一部で検出され、５５日目に採取した全血清中に存在した。２種の灰白炎ウィルス３型株に対するタイターは同じであったが、これらはモノクローナル抗体との反応性で示されるように抗原性において異なることが知られている（マイナー等、１９８２）。したがってこれらの知見は、オリゴペプチドにより誘導された灰白炎ウィル”ス３型に対する抗体がこの型の中で広く反応することを示す免疫二重拡散試験の結果と一致する。中和活性は型特異性であった。すなわち灰白炎ウィルス１型および２型株の中和はどの血清についても検出されなかった。

結論として、オリゴペプチド８１０および５１０ａを注射したウサギでは特異的な抗ペプチド抗体が発生した。さらに、これらは灰白炎ウィルス３型りおよびＣ抗原と反応する抗体も発生し、これは（ａ）抗原遮断検定、（ｂ）免疫沈降素試験、（ｃ）免疫電子顕微鏡によって示された。これらの抗体は灰白炎ウィルス３型に対し型特異性であった款　１型または２型の灰白炎ウィルスとは反応しなかった。試験したいずれの場合にも（たとえば、免疫沈降素試験および中和試験）、これらの抗体は検査した全ての３型灰白炎ウイルス株と広く反応した。　この血清は灰白炎ウィルス３型の感染性を中和した。この中和は灰白炎ウィルス３型に対し特異性であったが、試験した全ての３型灰白炎ウイルスについて検出された。

実施例７オリゴペプチドＳ１がモルモットを刺戟して少量の灰白炎ウィルス３型り抗原に対し反応する中和抗体を産生ずる証実施例６に記載した方法によりオリゴペプチドＳ１を牛チログロビリンに結合させた。５００ａｇの牛チログロブリンに結合した２５０ａｇのオリゴペプチドの腹腔内投与によりモルモ゛ントを免疫化した。この免疫化は０日月、１４日目、２８日目および４２日目に行なった。最初の２つの免疫化においては結合ベプチじはＦＣＡ（パクト社）と共に投与し、後者の２つの免疫化についてアジュバントを使用しなかった。オリゴペプチドを最後に投与してから６０日目に、動物に精製したＤ抗原として調饅した少量の失活灰白炎ウィルス３型レオン／Ｕ　Ｓ　Ａ／３７を注射した。（マイナー等１９８０ ’）。注射した抗原の量は単一ラシアル拡散試１験（シャイルド等１９８１）により記載されるように検定してＩＤ抗原単位であった。

オリゴペプチドを投与せずＢＴＧ５００μｇを投与して同様に免疫化し、対照動物を調靭した。灰白炎ウィルス３型を注射する直前およびその１週間後にこれら動物を出血させ、その血清をＰ３／レオン／Ｕ　Ｓ　Ａ／３７に対する中和抗体につき試験した。

いずれの動物も、ウィルスの注射時点においてタイター１：２０にて中和抗体を持たなかった。ウィルスの注射１週間後、オリゴペプチドを用いて調雪した動物は２００〜２４０００の範囲のタイターを有した。対照動物における対応するタイターは、３〜２００の範囲であった。

それらの結果を第１１表に示す。ＢＴＧと結合したオリゴペプチドＳ１を事前注射した動物は、ＢＴＧのみを注射した対照動物よりも高い抗体タイターを示し、かつこれは合成オリゴペプチドＳ１の事前注射のプライミング効果によるものと結論された。

参考文献ニー、：）ニー・ビールおよびピー・ジェー・メイソン（１９６２）ジャーナル・オブ・ハイジェーン、第６０巻、第１１３−１２０頁；ジー・ル・プールビニール（１９５５）、ランセット、第２巻、第１０１３−１０１６頁；アイ・トモツクおよびディー・アイ・マグラス、（１９７９）、ＷＨＯ・オフセット出版、第４６号：エム・フェルグソン、タイ・イー・ファ、ピー・ディー・マイナー、ディー・アイ・マグラス、エム・スピッツおよびノー。

シー・シャイルド、（１９８２）、　ランセット、第２巻、第１２２−１２４頁；ピー・ディー・マイナー、ジー・シー・シャイルド、ジエー・エム・ウッドおよびシー・エヌ・ダンダウエイト、（１９８０）、ジャーナル・ジェネラル・ピロロジー、第５１巻、第１５７−１７０頁；２御・ディー・マイナー、ジー・シー・シャイルド、エム・７エルグソン、デー・アイ・マグラス、ピー・ジエー・イエーツおよびエム・スピラン、（１９８２）、Ｅ、７ヤーナル・ジェネラル・ピロロジー、・第６１巻、第１６７−１７６頁ニジ−・シー・シャイルド、ジエー・エム・ウッド、ピー、ディー・マイナー、シー・エヌ・ダンダウエートおよびディー・アイ・マグラス（１９８０）、ジャーナル、：）エネラル・ピロロジー、第５１巻、第１５７−１７０頁；ジー、シー・シャイルドおよびダブリュ・アール・ダウドル。

（１９７５）、［インフルエンザウィルスの特性化および診断血清学］。［インフルエンザウィルスおよびインフルエンザ」イー・ディー・キルホルン編、アカデミツク・プレス・ＮＹ社、第６−３６８頁；ノー・シー・シャイルド、ダブリュ・ディー・ウインタースおよびシー・エム・ブランド、（１９７１）、プレテン、ワールド・ヘルス・オーガニゼイション、ｇ４５Ｌ　第４６５　−４７１頁；ジー・シー・シャイルド、（１９７２）、ジャーナル、ジェネラル・ノ々イロロジー、第１５巻、第９９−１０３頁。

ジー・シー・シャイルド、ジエー・エム・ウッド、ピー・ディー、マイナー、シー・エヌ・ダンダウエイト、およびディー・アイ・マグラス％　（１９８１）、デイベロツプト、バイオロジカル・スタンダード、第４７巻、第７７−８５頁（ニス、カルガー、バーゼル）。

第　１　表　（続き）第　２　表変異種との反応１　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　２５−１−１４．２５−４−１２．２５−５−５．）８２　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　２５−１−１４．ト伺２，１９９，１６５．２５− ５−５３　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　２５＋−１２，２７−６ −＋ｄ、１７５．２ＦＭ、２５−５−５４　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　２５＋１２．２７−＋１！、２０４，１６５，１３２５　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　１９９，１３ｉ１，１３２，１６５，１７５．Ｚ）４６　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　１９９，１６５，１３２７　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　１５Ｉ！、１６５ｇ　ｒ　ｒｒ　ｒ２トＨ９ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　２７＋Ｉ１１，１９９，１７５，２０４１０　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　２７−ｊｋ−４， ’１５ｄ、１７５１１　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　１９９，１７５，２０４，１６５１２　ｒ　ｒｒｒｒｒ　ｒ１７５１３　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　１７５，２０４１４ｒｒ　ｒｒｒ１７５１５　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　１７５，２［Ｍ１６　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　ｒ　１９９．２Ｍ、１６５単位を中和して反応を評価した。

ｒ＝耐性、　野性型は全ての抗体により中和された。

第　３　表ジオン３型灰白炎ウィルス由来の突然変異ウィルスの群における点突然変異およびアミノ酸置換第４表Ａ。モノクローナル抗体２５−１−１４により中和されるレオン由来の３型灰白炎ウィルス突然変異種の提案抗原部位におけるアミノ酸置換。

Ｂ。２５−１−１４により中和されていないものを生ずる突然、変異ウィルスの抗原部位におけるアミノ酸置換。

抗原部位の臨界位置におけるアミノ酸としての個々のモノクローナル抗体による突然変異３型ウイルスの中和に対する要求の☆：これら抗体は、この位置にセリン以外の置換を有するウィルスと反応しない。

空白欄：この部位には突然変異が検出されなかった。すなわち、これらのアミノ酸は全体として保持された。

＋：このモノクローナル抗体は、この位置における親アミノ酸に対する明確な要求を有する。

ｍ：この位置における親アミノ酸に対する積極的な要求なし。

？：この位置におけるアミノ酸置換は、ウィルス中和に対しその効果が不明確であった。

血清試料ウサギ免疫化　０日　１４日　２７日　５５日　６２日５２Ｓ１０〈１００８００☆　５２００　２５０００　２５０００５５　Ｓ１０　（ｉｏｏ　３２００　１２８００　２５０００　２５０００５４　ＳｉＯ（１００４００３２００５５５１０ａ　（１００８００３２００☆　最終金沢率の逆数。

第８表オリ！ベプチｒｓｘｏおよび５１０ａで免疫化したウサギからの血清の灰白炎ウィルス１型、２型および３型（Ｄ抗原）に対−二沈降素反応検出できず＋：弱い沈降素ライン＋＋：中庸強度の沈降素ライン＋＋＋：強い沈降素ラインＰｌ：灰白炎ウィルス１型／マホニー／ＵＳＡ／４１の濃縮物Ｐ２：灰白炎ウィルス２型１５１４８／ＵＫ／６５のａ；ａ物Ｐ３：灰白炎ウィルス３型／サウケット／ＵＳＡ１５０の＠結物（ａ）０日月に採取した血清（ｂ１５５日目に採取した血清第　１１　表オリゴはプチドＳ１で刺戟したモルモットにおけるＰ３／２Ｒオリゴ〈プチド３ｌ−ＢＴＧ　２００２Ｙ　ｔｔ　１５，０００２Ｐ　ｔｔ　６Ｇ）７Ｒｌ／　１５，０００７Ｙ　ｐ　１７ρ００７Ｂ　／／　２４，０００７Ｇ　ｔｔ　２０，０００２０Ｇ　ＢＴＧのみ　２０２０Ｒｔｔ　２００２０Ｙ　ｔｔ　２００ＧＧＵ”　ＡＵＵ　ＧＡＡ　ＧＡＵ　ＵＵＧ　ＡＵＵ　ＵＣＵ　ＧＡＡ　ＧＵＵ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＧＧＣＧＣＣＣＵＡ　ＡＣＵ　ＵＵＧ　ＵＣＡ　ＣＵＣＣＣＧ　ＡＡＧ　（１’ＡＡ、ＣＡＧ　ＧＡＵ　ＡＣＣ軒ＵＵＡ　ＣＣＵ　ＧＡＵ　ＡＣＵ　ＡＡＧ　ＧＣＣＡＧＯＧＧＣ（：ＣＧ　ＧＣＧ　（ＪＵ　ｔＪｃｃＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＵＡ　ＣＣＵ　ＧＣＡ　ＣＵＣＡＣＵ　ＧＣＡ　９υＣＧＡＧ　ＡＣＵ　ＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＵ　ＣＣＵ　ＣＵＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＵＣＣＧＡ！：　ＡＣＡ　ＧＵＵ　ＣＭＡＣＧ　ｃａｃ　ＣＡＣＧＵＡ　ＧＵＣＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＧＣＡＧＣＡＧＧ　ＵＣＡ　ＧＡＧＵＣＣＡＣＡ　ＡＵＡ　ＧＡＡ　ＵＣＡ　ＵＬＪＣＵＬＪＣＧＣＡ　ＣＧＣＧＧＧ　ＧＣＧ　ＵＧＣＡＣＡ　ＵＡＣＡＡＡ　ＧＡＵ　−ＡＣＡ　ＧＵＧ　ＣＡＧ　ｔｙｕｃ　６ＧＣＣＧＵ　ＡＡＧ　ｕｕｃＧＡＧ　ｕｕｖ　ｕｕｃ　ＡＣＡ　ＵＡＣＵＣＵ　ＣＧＵ　ＵＵＵ　ＧＡｃ　ＡＵＧ　ＧＡＡ　ｔｒｕｃＡＣＣｔＪｌＪｃ　ＧＵＧ　ＧｔＪＡ　ＡＣＣＧＣＣＡＡＣＵＵＣＡＣＣ’、ＡＡＣＧＣ：Ｕ　ＡＡＴＪＡＡＵ　ＧＧＧ　ＣＡＵ　ＧＣＡ、ＣＬＩＣＡＡＣＣＡＧ　ＧＩＧ　ｔ］Ａｃ　ＣＡＧ　ＡＵＡ　ＡＵＧＵＡＣＡＵＣＣＣＣＣＣＡ　ＧＧＧ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ｔＪｃ！Ａ　ＵＧＧＧＡＣＧＡＣＵＡＣＡＣＵ　ＵＧＧ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＵＣＵ　ＵＣＣＡＡＣＣＣＧ　ＴＪＣＣＡＵＡ　ＴＪｔＪｔＪ　ＵＡＣＡＣＣＵＡＵ　ＧＧＧ　ＧＣｔＪ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＣＧ　ＣＧＡ　ＡＵＣＵＣＡ　ＧＩＪＧ　ＣＣＡ　ＵＡＣ（ＵＧ　ＧＧＧ　ＵＯ３−、ＧＣＣＭＵ　ＧＱＪ　ＵＡＣｔＪｃＧＣＡＣＩＪＵＵ　ＵＡＣＧＡＣＧＧＣＩＪＩＪＣＧＣＣＡＡＧ　ＧＵＧ　ＣＣＡ　ＬＴＵＧ　ＡＡＧＡＣＡ　、ＧＡＵ　ＧＣＣＡＡＵ　ＧＡＣＣＡＧ　ＡＵＵ　ＧＧＵ　ＧＡＩＪ　（ＩＣＣＩＪＬＩＧ　ＬｊＡＣＡＧＣＧＣＣＡＵＧ　ＡＣＡ　ＧｔＪｔＪ　ＧＡ、’Ｊ　ＧＡ、ＣｔＪＬＪｔＪ　ＧＧＵ　ＧＵＡ　ｔＪｔＪＧ　ＧＣＡＧＵＩＪ　ＣＧＵ　ＧＵＵ　ＧＵＣＡＡＵ　ＧＡＵ　ＣＡＣＡＡＣｃｃｃ　ＡＣＵ　ＡＡＡ　ＧＵＡＡＣＣＵＣＣＡＡＡ　ＧＵＣＣＧＣＡＩＪＯＵＡＣＡＬＩＧ　ＡＡＡ　ＣＣＣＡＡＡ　ＣＡＣＧＵＡ　ＣＧＵ　ＧＵＣＵＧＧ　ＵＧＣＣＣＵ　ＡＧＡ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣＧＣＧＣＧ　ＧＵＩ−ＣＣＬＪ　ＵＡＵ　ＵＡＵ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＧＩＪＧ　ＧＡＣＵＡＵ　ＡＡＧ　ＡＡＣＡＡＣｌＪＵＧ　ＧＡＣＣＣＣｔＪＵＡ　ＵＣＵ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＧＧＵ　ＬＴｔＪＧ　ＡＣＣＡＣＡ　ＵＡｔＪ☆　ｎｏ　１国際調査報告１０電＊ｍｓ＋＋ａｎａｌ＾ｐｐＨｃａａａｎＮａ、ｐ（Ｔ／にＢ８３１００２５４１ｍｕ＋＋ａｌａ＋＋＋＋１ｈｏｏ−、ｃａ＋＋ｏｎＮｏ、ＰＣＴ／Ｇ１１１８３１００２５４ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔｈｘ、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＴＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＧＢ　８３１００２５４　（ＳＡ　５９０７）ＷＯ −Ａ−０３６３２Ｎｏｎｅ第１頁の続き優先権主張　＠１９８３年６月２４日■イギリス（ＧＢ）［有］８３１７２４２０発　明　者　エバンス・デイヴイツド・ミューリグ・・ピー２３６エイ・エックス・トリング・アルバート・ストリート２３ミル・ヒル・サニーフィールド１７６

Claims

【特許請求の範囲】

１．腸内ウィルスにより引起こされる病気に対するワクチン接種またはその診断に使用するのに適した合成ボリハプチドであって、灰白炎ウィルス３型サビン株の構造カプシＶ蛋白質ｙＰ１をコードするＲＮＡ配列におけるコドン９３−ｇ８により、もしくは他の腸内ウィ゛ルスの均等コドンによりコードすれるヘキサはブチｒであるか、またはこのヘキサペプチドの゛抗原均等物であり、コドンの数がＶＰＩカプシド蛋白質をコードするヌクレオチｆ配列の５′　末端から数えることを特徴とする合成ポリペプチド。２、灰白炎ウィルス３をサビン株の構造カシシト蛋白質ＶＰＩをコードするＲＮＡ配列におけるコト９ン９３−１００によりもしくは他の腸内ウィルスの均等コドンによりコート９されるオクタペプチド、またはこのオクタペプチドの抗原均等物である請求の範囲第１項に記載のポリはブチＦ０３、灰白炎ウィルス３型サビン株のＶＰＩカプシド蛋白質をコードするＲＮＡ配列における７〜１８個のコドンの連続列によりコードされ、該連続列はコドン９３〜９８を含み、かつ８６以上の番号のコドンで出発し得かつ１０．３以下の番号のコドンで終り得るものであり、または他の腸内ウィルスの均等コト９ンによりコードされるポリペプチド°またはその抗原均等物である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド９゜４、（ａ）腸内ウィルスの構造カプシド蛋白質ＶＰＩをコードするＲＮＡ配列において灰白炎ウィルス３型サビン株に対するコドン９３〜９８であるかまたはそれに均等なコドン、または（ｂｌ前記ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列における対応コドンのいずれかの同定、及びこのように同定されたコドンに対応するヘキサはプチト９またはこのポＩＪ　、、）ブチｒの抗原均等物を産生させることを特徴とする請求の範囲ｍ１項に記載の合成ポリはプチドの製造方法。５、単一のアミノ酸および／または２種もしくはそれ以上のアミノ酸残基よりなる予備生成ペプチドからポリはブチＦを化学合成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の合成ポＩＪ　Ｏプチト°の製造方法。６、腸内ウィルスにより引起こされる病気に対しワクチン接種する際に使用するのに適した結合体が生理学上許容しうるキャリヤに結合された請求の範囲第１項に記載の合成ポリペプチドからなることを特徴とする結合体。７、請求の範囲第１項に記１；戊の合成ポリペプチド９を活性成分とし、これを医薬上許容しうるキャリヤまたは希釈剤と共に含んでいるワクチンとして使用するのに適する医薬組成物。８、患者から得られた試料を請求の範囲第１項に記載の合成ポリペプチド９と接触させ、このようにしてポリペブチ白こ結合された腸内ウィルスに対する抗体が存在するか否かを検定することを特徴とする腸内ウィルスにより引起こされる病気の診断方法。９、請求の範囲第１項に記載の合成ポリペプチドとこのポリは徴とする、腸内ウィルスに対する抗体の測定に使用するのに適した試験キッド。１０、患者に対し有効量の請求の範囲第１項に記載の合成ポリペプチドを投与することを特厳とする、腸内ウィルスにより引起こされる病気に対する患者へのワクチン接種方法。