FI83662C - Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. - Google Patents

Description

1 83662

Diagnostinen vasta-aine ja menetelmä sen valmistamiseksi Diagnostisk antikropp och förfarande för dess framställning

Oheisen keksinnön kohteena on uusien synteettisten antigeenien valmistaminen DNA-sekvensseistä saadun informaation perusteella diagnostisiin tarkoituksiin. Tarkemmin sanoen tämän keksinnön kohteena ovat tällaiset antigeenit, jotka on muodostettu kytkemällä kantajaan synteettinen antigeenideterminantti, joka immu-nologisesti vastaa luonnonproteiinin osaa (antigeeni).

Antigeenit on alalla aikaisemmin saatu usealla tavalla mukaanlukien johtamalla luonnonaineista, kytkemällä hapteeni kantajaan ja rekombinanttiin DNA-teknologian avulla. Sela et ai (Proc. Nat. Acad. Sei.. USA, Voi. 68, no. 7, sivut 1450-1455, heinäkuu 1971; Science, Voi. 166, sivut 1365-1374, joulukuu 1969; Adv. Immun., Voi. 5, sivut 29-129, 1966) ovat myös kuvanneet eräitä synteettisiä antigeenejä.

Luonnonaineista saatuihin antigeeneihin kuuluu lukematon määrä tunnettuja luonnossa esiintyviä antigeenejä, kuten veriryhmän antigeenit, HLA-antigeenit, differentiaatioantigeenit, virus-ja bakteeriantigeenit ja vastaavat. Näiden antigeenien tunnistamiseen ja tutkimiseen on käytetty viimeisen vuosisadan aikana huomattava määrä ponnistuksia.

Tiettyjä ’’synteettisiä” antigeenejä on valmistettu kytkemällä pieniä molekyylejä (kuten esimerkiksi dinitrofenolia) kantaja-molekyyleihin (kuten esimerkiksi häränseerumialbumiiniin), jolloin muodostuu antigeenejä, jotka aiheuttavat vasta-aineen muodostumisen mainitulle kytketylle pienelle molekyylille.

Kantajamolekyyli on tarpeen, koska eläimen, johon se injisoi-tiin, immuunisysteemi ei "tunnista” itse tätä pientä molekyyliä. Tätä tekniikkaa on myös käytetty erillisissä tapauksissa 2 83662 antigeenien valmistamiseen kytkemällä tunnettujen proteiinien peptidipalasia kantajiin, kuten on kuvattu edellä viitatuissa Sela'n et ai artikkeleissa.

Vaikkakin tämä hapteeni-kantaja-tekniikka on palvelut hyvin tutkijakuntaa, sen immuunireaktion luonnetta koskevissa tutkimuksissa, sillä ei ole ollut merkittävää hyötyä sellaisten antigeenien valmistuksessa, joilla olisi merkitystä diagnostiikassa. Tähän puutteeseen on olemassa useita syitä.

Ensiksikin, jotta tällä tekniikalla voitaisiin valita ja konstruoida hyödyllinen antigeenideterminantti patogeenistä (esimerkiksi hepatiitti B-virus), on kohtalaisen onnistumismahdollisuuden takaamiseksi määritettävä patogeenin koko proteiini-sekvenssi. Tämän tehtävän vaikeuden vuoksi sitä on harvoin, jos koskaan, tehty.

Toiseksikin, vaikka oltaisiin halukkaita määrittämään patogeenin koko proteiinisekvenssi, jää muita ongelmia. Erityisesti monet mielenkiintoiset antigeenit ilmentyvät harvoin tai ei lainkaan tavallisissa patogeenien populaatioissa. Esimerkiksi gonokokki ilmentää patogeenisen antigeenisen determinanttinsa kanssa. Siten mielenkiintoista antigeeniä ei ehkä saada viljelemällä tavanomaisesti gonokokkia in vitro. Tunnettujen RNA- ja DNA-virusten onkogeeniset proteiinit eivät myöskään ole läsnä virushiukkasissa vaan ilmentyvät vain, kun virus- ja isäntäsolu ovat vuorovaikutuksessa. Näin muodoin näitä proteiineja ei voida saada tavanomaisilla virusten eristys- ja proteiinien puhdistusmenetelmi1lä.

Hybridoma-teknologiaa käyttämällä voidaan valmistaa vasta-aineita virusten geenituottei11 e. Periaatteessa on hybridoma-teknol ogial1 a mahdollista alkaa monimutkaisella antigeeniseok-sella ja muodostaa myöhemmin prosessissa spesifisiä vasta-aineita.

3 83662 Tätä vastoin oheinen keksintö on päinvastainen menetelmä sikäli, että aloitamme lopullisesta, erittäin puhtaasta antigeenideterminantista, jolloin haluttua antigeenituotetta ei tarvitse puhdistaa.

Hybridoma-vasta-ainei11 a tiedetään olevan alhainen aviditeetti ja alhainen sitoutumisvakio, joten niiden arvo on rajoitettu.

Hybridoma-teknologiassa on viime kädessä luotettava siihen, että pahanlaatuiset solut tuottavat vasta-aineen, mihin kaikkeen liittyy luonnollisesti huoli erotustekniikasta, puhtaudesta ja turvallisuudesta.

Hybridoma-tuotto perustuu kudosvi1jelmään tai hiirien viemiseen. Tämän ilmeisenä seurauksena on, että tuottaminen on kallista ja erien välillä esiintyy luontaista vaihtelevuutta.

Lisäksi on vaikeaa valmistaa hybridi molekyyleille, jotka ovat vain pieni prosenttimäärä siitä monimutkaisesta seoksesta, josta on lähdettävä.

Se, että jäljempänä kuvatulla menetelmällä onnistuttiin muodostamaan vasta-aineita, jotka reagoivat hiiri-leukemiaan ja hepatiittiin B-virusten natiivien proteiinien kanssa, oli itse asiassa varsin yllättävää ja myös vastoin molekyylibiologian tämänhetkistä ajatustapaa. Yllätys oli kaksinkertainen. Ensiksikin koe muodostui joukosta peräkkäisiä tapahtumia, jotka kaikki oli suoritettava onnistunnesti, vaikka vain muutamat niistä olivat rutiinia. Monet näistä vaiheista tarvittiin tuottamaan DNA-sekvenssit, jotka muodostivat peptidisynteesin perusrungon. Yllättävää oli, että voitiin suorittaa näin monta peräkkäistä vaihetta, joista kukin oli biologisen luonteensa vuoksi oikullinen. Toiseksi oli varsin yllättävää, että lyhyet suorat peptidiketjut toivat esiin vasta-ainereaktiota eläimissä 4 83662 ja että nämä esiintul1eet vasta-aineet pystyivät tunnistamaan paljon suurempia ja monimutkaisempia natiiveja proteiinira-kentei ta.

Mitä tulee edelliseen kohtaan, seuraavat vaiheet oli suoritettava. Seuraavat näkökohdat tekevät loppumenestyksen todennäköisyyden pieneksi ja jopa kaukaiseksi. Ensiksikin DNA-molekyy1 in cDNA-kopion kloonauksessa käytetään DNA-1ähtöaineen komplementtien nukleotidien polymeroimiseen retroviruksen käänteis-trans-kriptaasi-entsyymiä. Tällaisen kopiointitapahtuman luotettavuus on sellainen, että viidestäsadasta nukleotidistä kopioituu väärin noin yksi. Toinen virhelähde muodostuu lisäksi siitä, että RNA-polymeraasientsyymi, joka itsessään on jokseenkin epätarkka jäljentävä entsyymi, kopioi RNA-1ähtöaineiden elävässä solussa tämän geenistä. Sen jälkeen kytketään cNDA-kopio plasmidivektoriin, jossa tapahtumassa on osoitettu usein tapahtuvan toisiin-tumisia kloonatussa DNA-pa1asessa. Sen jälkeen plasmidi viedään bakteeriin ja valitaan muuntuneet pesäkkeet, joissa on rekombi-nanttiplasmidi. Muuntuneiden bakteereiden pesäke hajotetaan sivelemällä kasvualustalle ja massan kasvua ja DNA:n valmistusta varten valitaan yksi ainoa eriste. Koska tässä prosessissa on tapahtunut useita jäijentämiskierroksia, ei ole mitään varmuutta siitä, etä yksi tai useampi nukleotidiä muuttavista tapahtumista ei olisi vahingoittanut geeniä, jonka eristämisessä ei ole ollut mitään seiektiopainetta. Tällainen vaurio saattaa tehdä tällaisen geenin DNA-sekvenssin sisällöttömäksi tai suuresti vähentää sen käyttökelpoisuutta peptidien valinnan ja niiden synteesin sinikopiona. Nämä tähän mennessä kootut haitat ovat samoja, jotka liittyvät DNA:n eristämiseen sekvenssianalyysiä varten siten, että tämä DNA täsmälleen esittäisi alkuperäistä virusgeeniä.

Seuraava toimenpideryhmä johtaa virusgeenin DNA-sekvenssiin. Näiden tutkimusten alussa oli juuri tulossa esiin mahdollisuus,

II

5 83662 että tiedemiehet kykenisivät tarkasti ratkaisemaan geeniko-koiset nukleotidisekvenssit rutiinimaisella tavalla. 1977 Sanger ja hänen työtoverinsa (Sanger et ai, 1977, Nature 265: 687) kuvasivat yrityksiään ratkaista pienen bakteeriviruksen /6X174 nukleotidisekvenssi. Heidän ratkaisunsa, jossa 5300 nukleotidissä oli yli 30 virhettä, perustui voimakkaasti siihen, että proteiinin ja RNA:n sekventoinnin avulla tutkittiin DNA:n sekventointitulokset. Tässä työssä oli kiinni yli 10 ammattitaitoista tiedemiestä noin 5 vuoden ajan. Nämä tutkijat, joista eräälle myönnettin työstään Nobelin palkinto, päättelivät, että "Kuten muissakin nukleiinihappojen sekventointi-menetelmissä, ei käytettyä plus- ja miinus-tekniikkaa sinänsä voida pitää täysin luotettavana, vaan virheitä voi silloin tällöin esiintyä. Nämä virheet ja epävarmuudet voidaan poistaa vain vieläkin enemmän työtä vaativilla kokeilla. Vaikkakin suuri osa sekvenssistä on vahvistettu, kuluu luultavasti vielä pitkä aika ennen kuin koko järjestys voidaan vahvistaa. Emme ole vakuuttuneita, että jokaisen yksityiskohdan vahvistaminen on tieteellisesti oikeutettua...". Geenin ratkaistun DNA-sek-venssin perusteella ennustettu proteiinisekvenssi pysyy siten hypoteettisena, kunnes sen tarkkuus on todistettu. Tällaisia todistuksia on nyt kolmea muotoa - joko geenin proteiinituotteen osittainen aminohappojärjestyksen analyysi tai havainto, että DNA-sekvenssin ennustaman proteiinin synteettisten peptidien vastavirta-aineet reagoivat natiivin proteiinin kanssa tai kloonatun geenin funktionaalisen proteiinin todellinen ilmentyminen (suhteellisen harvinainen tapahtuma).

Nämä tekijät ovat tulkinneet Arnon'in et ai. (1971, Proc. Nat. Acad. Sei. 68: 1450) Atassain (1975, Immunochemistry 12: 423) ja Vyas'in et ai. (1972 Science 178:1300) aikaisemmat tutkimukset ja osoittaneet, että yleisesti ottaen on epätodennäköistä, että lyhyet suorat aminohapposekvenssit synnyttävät vasta-aineita, jotka reagoivat natiivin proteiinirakenteen kanssa. Useimpien molekyylien useimmilla alueilla uskottiin 6 83662 antigeenideterminanttien johtuvan aminohappotähteistä, jotka olivat selvästi erillään suorassa sekvenssissä mutta lähellä toisiaan kääntyneessä proteiinissa. Vasta-aineiden tuottamiseen käytettyjen peptidien täsmällisen kolmidimensionaalisen konformaation uskottiin olevan useimmissa tapauksissa kriittinen, myös niillä antigeeneillä, joissa aminohapot ovat lähellä toisiaan sekvenssissä. Esimerkiksi Sela uskoi, että anti-lysotsyymi-reaktion tuottamiseen täytyi syntetisoida melko monimutkainen siImukkarakenne; Atassi valmisti useita monimutkaisia molekyylejä, joiden kunkin oli tarkoitus jäljitellä kohdeproteiinin tertiääristä rakennetta, ja Vyas päätteli, että hepatiitti B-viruksen pinnan antigeenin kolmidimensionaalinen konformaatio oli kriittinen tekijä tuotettaessa vasta-aineita, jotka reagoivat tämän natiivin rakenteen kanssa. Tässä hakemuksessa esitetty havainto osoittaa, että muita tutkijoita huolestuttaneet seikat, joiden perusteella he uskoivat, että nämä kokeet eivät toimisi, olivat perusteettomia. Olemme kuitenkin havainneet, että suorien peptidien vasta-aineet reagoivat natiivien molekyylien kanssa ja että monimutkaiset synteesit ovat tarpeettomia, epätaloudellisia ja vanhanaikaisia tämän keksinnön esiintuoman edistysaskeleen valossa.

Tämän keksinnön mukaisesti mielenkiintoinen proteiiniosa organismissa ei ole erityisen tärkeä, koska voidaan lähteä geenistä, joka tuottaa proteiinin ja kaikkia geenejä on yleensä mukana enemmän tai vähemmän yhtä suuret määrät. Siten voidaan valmistaa angigeeneja, jotka indusoivat vasta-ainereaktion jopa organismin pienimmillekin proteiinikomponentei11 e.

Koska tässä keksinnössä saadaan antigeeni, joka ei sisällä lainkaan kilpailevia ja häiritseviä proteiineja, valmiste tuottaa suojaavia tai taiteenotettavia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä mielenkiinnon kohteena olevan antigeenideterminantin suhteen; täten ei esiinny mitään ristireaktiivisuutta minkään muun antigeenideterminantin kanssa.

I! 7 83662

Koska tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan kasvattaa käytännöllisesti katsoen missä tahansa mielenkiintoisessa isän-täeläimessä, suurissa eläimissä, kuten lampaissa, hevoseläimissä jne., voidaan hyvin helposti ja halvalla saada käytännöllisesti katsoen täysin identtisten ja luotettavien vasta-aineiden pitkäikäinen lähde tai "varasto" yksinkertaisesti vain aika ajoin ottamalla vasta-aineet talteen tästä isäntäeläimestä.

Tämä on suuri etu, kun verrataan vasta-aineiden kasvattamisen kustannuksia ja epäluotettavuutta alan aikaisempien oppien mukaisesti.

Tämän keksinnön periaatteiden avulla on mahdollista suunnitella ja tuottaa antigeeni käytettäväksi vasta-aineina, joilla ei lainkaan ole sitä erittäin vakavaa moniin antigeeneihin kohdistuvaa autoimmuunireaktiota, joka on estänyt tai suuresti rajoittanut kokonaisten proteiini-vasta-aineiden käyttöä diagnoosissa .

Tämän keksinnön avulla voidaan valmistaa uusia vasta-aineita, jotka koskaan ennen eivät ole olleet mahdollisia.

Lyhyesti sanottuna alan kaikki aikaisemmat vasta-aineiden valmistusmenetelmät, mukaanlukien viimeaikaiset rekombinantti DNA-ja hybridoma-menetelmät ovat oheiseen keksintöön verrattuna teknillisesti monimutkaisempia ja kalliimpia, enemmän aikaa vieviä ja niiden saannot ovat sekä määrällisesti että laadullisesti alhaisemmat. Lisäksi niissä kaikissa on jonkin verran turvallisuus- ja luotettavuusvaikeuksia, joita aina esiintyy menetelmässä, jossa haluttu komponentti on erotettava ei-toivo-tuista komponenteista. Alan aikaisemmilla menetelmillä ei myöskään ole mahdollista poistaa tietyn antigeenin autoimmuno-logiset reaktiot, kun taas oheinen keksintö avaa tien näihin uusiin tuloksiin. Tämä keksintö tarjoaa uusia, odottamattomia tuloksia yksinkertaisemmalla, halvemmalla ja suoremmalla ja 8 83662 tuottavammalla tavalla kuin alalla aikaisemmin on ollut mah-dollista.

Oheisen keksinnön avulla vältetään alan aikaisempien uusien synteettisten antigeenien valmistusmentelmien nämä ja muut esteet ja haitat. Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat spesifisiä halutulle antigeenille eivätkä ristireagoi vääriin antigeenideterminantteihin, joita voi esiintyä antigeenin epärelevanteissa osissa.

Yleisesti sanoen synteettinen antigeeni (joka vastaa immunolo-gisesti luonnon, spesifisen antigeenideterminantin sisältävää antigeeniä) voidaan muodostaa seuraavien vaiheiden avulla: (a) määritetään genomista (joko DNA tai RNA) koko mielenkiintoisen peptidialueen tai sen osan aminohapposekvenssi; (b) ennustetaan peptidialueet, jotka ovat potentiaalisia antigeeni determinant te ja; (c) valmistetaan synteettinen antigeenideterminanttipeptidi, joka immunologisesti duplikoi yhden tai useamman luonnon-antigeeniä vastaavan antigeenideterminantin; ja tarvittaessa (d) kytketään vaiheessa (c) muodostettu synteettinen determinantti farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, jolloin on saatu haluttu synteettinen antigeeni.

Vasta-aineen valmistuksesa käytetty rokote valmistetaan siten, että kyseessä olevan organismin DNA-sekvenssistä (tai pienestä cDNA-sekvenssistä, jos genomi on RNA) määritetään proteiini-antigeenin antigeenideterminanttiosan aminohapposekvenssi, syntetisoidaan peptidi, joka antigeenisesti on toisinto tai 9 83662 oleellisesti toisinto proteiinin determinanttiosasta, ja tarvittaessa kiinnitetään synteettinen peptidi kantajaan tai muodostetaan kantajan muodostama antigeeni, jossa peptidi on spesifinen antigeenideterminantti ja joka isäntäeliöön vietäessä käynnistää vasta-aineiden tuoton proteiiniantigeenin suhteen.

Vasta-aineiden valmistusmenetelmässä injisoidaan edellä kuvattu rokote isäntäeliöön ja isännän nesteistä otetaan talteen proteiiniantigeenin vasta-aineet, joita käytetään tavanomaisissa diagnostisissa toimenpiteissä proteiinivasta-aineen havaitsemiseen .

Vaikkakin keksinnössä on monia menetelmällisiä vaiheita, joissa käytetään monia aineita tämän keksinnön mukaisten vasta-aine-valmisteiden valmistuksessa ja toteutettaessa tämän keksinnön mukaisia menetelmiä, kuten jäljempänä tullaan yksityiskohtaisemmin tarkastelemaan, on huomattava, että keksintö ei rajoitu minkään tiettyjen vaihdeiden tai reagenssien tai olosuhteiden hyväksikäyttöön. Keksintö on pikemminkin käsiteltävä edellä kuvatulla tavalla käsitteelliseksi keksinnöksi, joka on määritelty oheisissa patenttivaatimuksissa.

: Diagnoosia, jolloin indusoidaan väliaikainen immuniteetti, ja muita käyttötarkoituksia varten tehdyt vasta-ainevalmisteet, - ; jotka ovat muodostuneet isäntäeliön edellä kuvattuihin rokotteisiin kohdistuvan immuunireaktion avulla ja jotka on otettu talteen tavalliseen tapaan, ovat myös tärkeitä tämän keksinnön yleisajatuksen ja spesifisten sovellutusten kannalta.

Tämän keksinnön eri puolia voidaan käyttää hyödyksi muodostettaessa yhden vasta-aineen sisältävä tuote, jossa peptidin spesifinen antigeenideterminantti-luonne on merkittävä tai vähintään pääasiallinen tekijä sikäli kuin on kysymys tuotteen 10 83662 biologisesta toiminnasta. Esimerkiksi liposomit voivat sisältää rasvahappopeptidiosia, joissa peptidiosaan kuuluu kaksi tai useampia, kahdelle tai useammalle organismille spesifisiä anti-geenideterminantteja. Kokonaisuuteen kuuluvat antigeenikanta-jat, jotka on muodostettu useasta synteettisestä peptidispesi-fisestä antigeenideterminantista, voivat olla syntetisoidut päästä päähän, yhdistetty synteesin jälkeen tai valmistettu näiden kahden tavan yhdistelmällä. Myös muut yhdistelmät ovat mahdollisiä.

Kuvio 1 kuvaa Mo-MuLV-proviruksen 3'-pään nukleotidisekvenssiä.

Kuvio 2 esittää leimatun SCRF 60A soluiisaattia, joka on saatettu reagoimaan erilaisten antiseerumien, mukaanlukien tämän keksinnön mukaisen uuden synteettisen rokotteen antiseerumin kanssa, SDS-PAGE-erotuksen autoradiogra-fiaa.

Kuvio 3 on Mo-MuLV // proviruksen uusittu geenikartta.

Kuvio 4 on leimatun SCRF 60A soi uiisaatin, johon on viitattu kuviossa 2, SDS-PAGE-erotuksen autoradiograafi.

Kuviossa 6 on verrattu Mo-MuLV- ja AKV-virusten geenikarttojen osia.

Kuvio 6 on pyyhkäisyelektronimikroskoopin fotomikrograafi virushiukkasen pinnasta, jossa on vasta-aineita, jotka on kasvatettu tämän keksinnön mukaista R-synteettistä antigeeniesimerkkiä vastaan ja konjugoitu näkemisen helpottamiseksi ferritiinin kanssa.

Kuviossa 7 on esitetty HBeAg:n 226 aminohapon sekvenssi, jonka Pasek et ai on tulkinnut nukleiinihapposekvenssistä. Yksikirjaimisella koodilla (A ala, C cys, D asp, E glu, li 83 6 62 F phe, G gly, H his, I ile, K lys, L leu, M met, N asn, P pro, Q gin, R arg, S ser, T thr, V vai, W trp, Y tyr) on osoitettu synteesiin valitut proteiinialueet. Näitä peptidejä vastaavat lihavasti alleviivatut alueet on numeroitu 1-8 tai 3a-6a, 8a. Lihavan alleviivauksen lopussa C tai Y osoittaa, missä teknillisistä syistä lisättiin kysteeniä tai tyrosiinia, jota on löydetty primäärisessä sekvenssissä. Ryhmät, jotka eivät ole samoja kaikissa kolmessa nukleotidisekvenssin määrityksessä on alleviivattu ohuella. Monet näistä ovat kerääntyneet välille 110-140.

Kuviossa 8 on esitetty peptidisekvenssi ja sen asema (vastaa kuviossa 1 alleviivattuja ryhmiä). Alleviivatut ryhmät eivät olleet primäärisessä proteiinisekvenssissä vaan ne lisättiin, jotta olisi mahdollista suorittaa kytkentä kantajaan tai radiojodata. Lukuunottamatta pepti-deitä 1, 3a ja 7 kytkettiin kaikki peptidit kantajaproteiiniin KLH kohdassa "menetelmät" kuvatulla tavalla. Peptidi 1 käytettiin kytkemällä KLH-kantajaan. Peptidit 3a ja 7 olivat liukenemattomia eikä niitä käytetty.

Kuvio 9 on autoradigraafikuva radioaktiivisesti leimatuista, puhdistetuista Dane-hiukkaista, jotka oli saatettu reagoimaan 5 μΐ kanssa normaalista anti-peptidi 3 seerumia tai anti-peptidi 4 seerumia. Sakat otettiin talteen ja valmistettiin elektroforeaasia varten kohdassa "menetelmät" kuvatulla tavalla. Näytteet elektroforesoitiin 5-17 % SDS-polyakryyliamidigeeli1lä ja autoradiografoitiin.

Kuviossa 10 on kuvattu infulenssa X-47 kannan genomi ja genomin tulkinta. Kystiiniä lisätään kytkentää varten i2 83662 peptidialueel1 e, jonka arvellaan olevan potentiaalisen antigeenideterminantin, ja leiman, esimerkiksi radio-leiman, kiinnittämiseksi peptidiin lisätään tyrosiinia.

Kuviossa 11 kuvaa suu- ja sorkkataudin genomia ja alueita, jotka peptidisekvensseiksi tulkittuina ovat todennäköisesti spesifisiä antigeenideterminanttialueita.

Kuviossa 12 on kuvattu poly(spesifinen antigeenidetermi-nantti-peptidi) kopolymeeriantigeeni.

Menetelmä ia materiaalit Tälle keksinnölle ainutlaatuiset menetelmät ja materiaalit on kuvattu jäljempänä erityisesti huomioiden itse menettelytapa. Itse 1aboratoriotekniikat, menetelmät ja materiaalit ovat yleisesti kuitenkin samoja, joita käytetään yleisesti molekyylibiologiassa ja biokemiassa.

Mielenkiinnon kohteena olevien yleisten materiaalien ja menetelmien suhteen viitataan erityisesti seuraaviin teoksiin: METHODS IM ENZYMOLOGY. toim.: Colowick, S.P. ja Kaplan, N.0., .Academic Pres, New York; METHODS IN IMMUNOLOGY AND IMMUNO-: CHEMISTRY. Academic press, ja HANDBOOK OF BIOCHEMISTRY AND

MOLECULAR BIOLOGY, Chemical Rubber Publishing Company.

Hapteenien ja antigeenien valmistaminen kiinnittämällä determinantti kantajaan on erittäin yleisesti tunnettu tekniikka, ja lukuisia kantajia on kuvattu. Yleisesti tunnettuja kantajia ovat maljakotilon hemosyaniini (keyhole limpet Hemocyanin, (KLH)), häränseerumialbumiini (BSA), lampaan erytrosyytit (SRBC), D-glutamiinihappo:D-lysiini.

• · Mikään yksittäinen laboratoriotekniikka ei ole sinänsä uusi; .keksintö piilee pikemminkin tuotteissa, joita ei koskaan aikai- i3 83662 semmin ole ollut olemassa ja jotka merkitsevät suurta funktionaalista edistysaskelta verrattuna alan viimeaikaisiin tuotteisiin, ja kokonaisuutena menetelmissä, joilla tämän keksinnön mukaiset tuotteet valmistetaan. Seuraava lähdeluettelo on annettu taustatiedoksi ja viitteiksi: Lähdeluettelo 1. Baltimore, D., Cold Spring Harbor Symp., Quant.Biol. 39, 1187-120;0 (1974).

2. Oskarsson, M.K., Elder, J.H., Gautsch, J.W. Lerner, R.A. ja Vande Woude, G.F., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A. 75, 4694-4698 (1978).

3. Gautsch, J.W., Elder. J.H., Schindler, J., Jensen, F.C., ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei.. U.S.A. 75, 4170-4174 (1978).

4. Jamjoon, G.A., Naso, R.B. ja Arlinqhaus, R.B., Virol. 78, 11-34 (1977).

5. Famulari, N.C., Buchhagen, D.L., Klenk, H.D., ja Fleissner, E., J. Virol. 20. 501-508 (1976).

6. Witte, O.N., Tsukamoto-Adey, A. ja Weissman, L.L., Virol .

76. 539-553 (1977).

7. Fan, H. ja Verma, I.H., J. Birol. 26. 468-478 (1978).

8. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Lerner, R.A., Johnson, P. ja Verma, I.M., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44. painossa (1979).

9. Sutcliffe, J.G., Shinnick. T.H., Verma. I.M. ja Lerner, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei.. U.S.A., painossa (1980).

10. Marglin. A. ja Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem. 39, 841-866 (1970).

11. Pederson, F.S. ja Haseltine, W.A., J. Virol. 33, 349-365 (1980).

12. Atlas of Protein sequence and Structure. Voi. 5, Sup. 3, M.0. Dayhoff, toim., Natl. Biomed. Res. Found., julk. Washington, D.C. (1978).

i4 83662 13. Dayhoff, M.0., Schwartz, R.M. ja Orcutt, B.C., s. 352 op. cit.

14. Fisher, R.A., The Genetical Theory of Natural Selection. Clarendon Press, Oxford (1930).

15. Elder. J.H., Gautsch, J.W. Jensen, F.C., Lerner, R.A., Harley, J.W. ja Rowe, W.P., Proc. Natl. Acad. Sci.. U.S.A. 74, 4676-4680 (1977).

16. Lerner, R.A., Jensen, F.C., Kennel, S.J., Dixon, F.J., Roches, G.D. Francke, U., Proc. Nat. Acad. Sci.. U.S.A. 69, 2965-2969 (1972).

17. Niman, H.L. ja Elder, J.H., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., painossa (1980).

18. Edwards, S.A. ja Fan, H., J. Virol. 30, 551-563 (1979).

19. Kitaga#a, T. ja Ailawa, T., J. Biochem. (Tokyo) 79. 233 (1976).

20. Liu, F., Zinnecker, H., Hamaoka, T. ja Katz, D.H.

Biochem. 18. 690 (1979).

21. Katz, David H., U.S.-patentti n:o 4,191,668, 4.3.1980.

22. J. Exp. Med.. 134: 201-203 (1971).

23. J. Exo. Med.. 136: 426-438, 1404-1429 (1972).

: 24. J. Exp. Med., 138: 312-317 (1973).

25. J. Exp. Med.. 139: 1446-1463 (1974).

26. Proc. Natl. Acad. Sci.. U.S.A., 71: 3111-3114.

27. Proc. Natl, Acad. Sci.. U.S.A., 73: 2091-2095 (1976).

. 28. J, Immunol. 114: 872-876 (1975).

29. J. Immunol. 120: 1824-1827 (1978).

30. J. Exp. Med.. 139: 1464-1472 (1974).

31. Humphrey, J.H. ja White, R.G., Immunology for Students of Medicine, Blackwell, Oxford (1970).

.. 32. Katz, David H. ja Benacerraf, Baruj, Immunological

Tolerance. Mechanisms and Potential Therapeutic Applications. Academic Press (1974).

33. Newsweek. 17.3.1980, sivut 62-71.

34. Chemical & Engineering News. 23.6.1980, s. 10.

is 83662 35. Milstein, C., Differentiation 13: 55 (1979).

36. Howard, J.C., Butcher, G.W. Galfre’, G., Milstein. C. ja Milstein, C.P., Immunol. Rev. 47: 139 (1979).

37. Hammerling. G.J., Hammerling, U., ja Lemke, H., Immunogenetics 8: 433 (1978).

38. Shulman. M., Wilde, C.D., ja Köhler, G., Nature 276: 269 (1978) .

39. Köhler, G. ja Milstein, G., Nature 256: 495 (1975).

40. Ledbetter, J.A. ja Herzenberg. L.A., Immunol. Rev. 47: 63 (1979) .

41. Gefter, M.L., Margulies. D.H. ja Scharff, M.D., Somatic Cell Genetics 3: 231 (1977).

42. Köhmler. G. ja Milstein. C., Eur. J. Immunol . 6: 511 (1976).

43. J. Biol. Chem., 241: 2491-2495 (1966).

44. J. Biol. Chem., 242: 555-557 (1967).

45. Kprowski, Hilary et al. US-patentti nro 4,196,265, huhtikuu 1980.

46. Science 209. nro 4463, sivut 1319-1438 (syyskuu 1980 koko numero).

47. Davis, B.D., Dulbecco. R., Eisen, H.N., Ginsberg, H.S., Wood, W.B. Jr., ja McCarty, M., Microbiology,

Harper & Row, Hagerstown, Md., 1973.

48. Morgan, J. ja Whelan, W.J., Recombinant DNA And Genetic Experimentation. Pergamon Press, New York, 1979.

49. Goldstein, L. ja Prescott, D.M., Cell Biology. A Comprehensive Treatise. Vois. 1, 2 & 3, Academic Press,

San Francisco.

50. Scott, W.A. ja Werner, R., Molecular Cloning of Recombinant DNA. Academic Press, New York, 1977.

51. Wu, Ray (Ed.), Colowick, Sidney P., ja Kaplan, Nathan 0.,

Methods in Enzymoloqy, yleisesti ja Vol. 68, "Recombinant DNA" erityisesti, Academic Press, New York.

52. Cooper, Terrance G., The Tools of Biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977.

ie 8 3 6 6 2 53. Sela, Michael, Science 166: 1365-1374 (1969).

54. Arnon, R., Elchanan, M., Sela, M. ja Anfinsen, C.B.,

Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 68: 1450 (1971).

55. Sela, M., Adv. Immun. 5: 29-129 (1966).

56. Sela. M., Arnon, R., ja Chaitchik, S., US-patentti 4,075,194, 21.2.1978.

57. Cohen. S.N., ja Boyer, H.W., US-patentti 4,237,224, 2.12.1980.

58. Lerner, T.A., Sutcliffe, J.G. ja Shinnick, T.M. (1981)

Cell 23: 109-110.

59. Wilson, I.A., Skehel. J.J. ja Wilev, D.C. (1981),

Nature 289: 366-373.

60. Sutcliffe. J.G., Shinnick, T.M., Green, N., Liu, F-T,

Niman, H.L., ja Lerner, R.A. (1980), Nature 287: 801-805.

Vuoteen 1970 mennessä kykenivät Marglin ja Merrifield ilmoittamaan, että "Kykymme syntetisoida keskikokoisia peptideitä on nyt hyvin osoitettu." Chemical Synthesis of Peptides and Proteins. A. Marglin ja R.B, Merrifield, Ann. Rev. Biochem. 39:841-866, sivulla 862 (1970)). Merrifield et ai synteesiä ' käytettiin osoittamaan oheisen keksinnön käytännöllisyyspuoli. Synteesitekniikka sinänsä ei kuitenkaan ole kriittinen.

DNA-kartoitus, genomien yleinen karakterisointi ja proteiinin aminohapposekvenssin ennustaminen geneettisestä koodista ovat kaikki hyvin vakiintuneita tekniikoita.

Oheisen keksinnön toistamiseksi valittiin yhdeksi välittäjäksi ... hyvin tutkittu virus, jotta voitaisiin välttää tulosten mahdolliset moniselitteisyydet. Kuitenkin on ilmeistä, että tämä valinta ei vähäisessäkään määrin ole rajoittava ja että keksintöä voidaan yleisesti soveltaa mihin tahansa systeemiin, jossa halutaan valmistaa rokote suojaamaan miltä tahansa sellaiselta proteiinipitoiselta antigeeniltä, joka sisältää i7 83662 peptidin, joka on antigeenin spesifinen antigeenideterminantti tai sisältää sellaisen. Mielenkiinnon kohteena oleva antigeeni voi siten olla peräisin viruksesta, bakteerista tai somaattisten solujen palasista edellyttäen, että spesifinen antigeeni-determinanttipeptidi immunologisesti karakterisoi antigeenin.

Tekniikat ja materiaalit, joilla antigeenideterminantit sidotaan kantajiin, ovat yleisesti tunnettuja eikä tähän yksittäiseen vaiheeseen sinänsä sisälly mitään erityistä uutuutta. Keksintö on pikemminkin monospesifisen antigeenin luominen synteettisestä spesifisestä antigeenideterminanttipeptidistä ja kantajasta niin, että saadaan rokote, jolla vältetään alalla aikaisemmin esiintyneet ongelmat ja rajoitukset.

Keksinnöllisen menetelmän aikana suoritetaan useita vaiheita ja toimenpiteitä, joiden avulla erotetaan eri materiaalit ja rea* genssit, tunnistetaan komponentit ja osoitetaan, että halutut reaktiot ja tulokset ovat tapahtuneet.

Yleiskäyttöön sopivia tekniikoita on kuvattu standarditeksteissä ja tutkielmissa. Mainittakoon esimerkiksi seuraavat viitteet: METHODS IN ENZYMOLOGY. suora: METHODS IN IMMUNOLOGY

AND IMMUNOCHEMISTRY. suora: HANDBOOK OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY. supra: Dyson, Robert D., "Cell biology -A Molecular Approach". 2. painos, Allyn ja Bacon, Boston (1978); Pelczar, Michael J., Jr., Reid, Roger D., Chan, E.C.S., "Microbiology". 4. painos. McGraw-Hill (1977); Bohinski, R.C., "Modern Concepts in Biochemistry". 2. painos, Allyn ja Bacon, Boston (1976). Ilman mitään merkittävää muutosta on käytetty julkaistuja erityismenetelmiä (viiteet 1-20, 21-30, 32, 35-43).

Keksinnön menetelmät

Keksinnön mukaisten menetelmien vaiheet, joita voidaan soveltaa mihin tahansa tiettyyn keksinnön hyödyntämiseen, riippuvat i8 83662 siitä, mitä tiedetään mielenkiinnon kohteena olevasta anti-geenilajista ja sen saatavuudesta. Menetelmiä on tarkoituksenmukaista tarkastella vaiheittain.

I. Antigeenideterminantin karakterisointi ia tunnistaminen

Jos antigeenideterminantti tunnetaan ja peptidiketjun aminohapposekvenssi, joka muodostaa spesifisen antigeenideterminantin tai sisältää sen, on tunnettu, niin välittömästi voitaisiin valmistaa synteettinen peptidi, joka immunologisesti on toisinto mielenkiinnon kohteena olevan antigeenin spesifisestä antigeenideterminantista.

Tämä lähestymistapa voi tulla tulevaisuudessa mielenkiintoisemmaksi, mutta tällä hetkellä on tavallisesti tunnistettava peptidi, joka on determinantti tai sisältää sen ja määritettävä peptidin aminohappojärjestys. Aminohappojärjestys voidaan määrittää suoraan tai epäsuorasti DNA-kartoittamalla genomi, joka ohjaa mielenkiintoisen peptidiosan muodostumista. Tässä keksinnössä käytetyt menetelmät ovat tunnettuja teoreettiselta kannalta ja mielenkiintoisen peptidiosan muodostumista ohjaavan genomin DNA-kartoitus on niin hyvin määritelty, että siitä voi nyt tulla käytännön työkalu. Aminohappojärjestyksen määrittäminen suoraan proteiinista on niin työläs ja epävarma menetelmä, että sillä on vain vähän akateemista arvoa ja että sillä ei käytännöllisesti katsoen ole mitään käytännöllistä arvoa tällä hetkellä. Vaikkakin aminohapposekvenssin suora määrittäminen peptidiproteiineista voi jonakin päivänä tulla käytännön työkaluksi, tällä hetkellä käytettävissä olevat tavat eivät ole sellaisia, että tätä menetelmää voitaisiin suositella valmis-tustoimenpiteisiin tai synteettisten peptidispesifisten antigeenideterminanttien syntetisoimiseen. Keksinnön lähtökohtana on loppujen lopuksi genomi, joka määrittää peptidiosan sen aminohapposekvenssin, joka sisältää spesifiset antigeeni-determinanttialueet.

is 83662

Kun aminohappojärjestys on tunnettu tai ennustettu, peptidi syntetisoidaan Merrifield'in et ai tekniikalla tai millä tahansa muulla tekniikalla, joka voi olla käytettävissä tai tulla sellaiseksi. Abstraktisssa mielessä voitaisiin peptidi-synteesistä edetä suoraan rokotteeseen, mutta varovaisuus määrää ainakin nykyisellä tiedontasolla, että näin syntetisoidun peptidin on oltava ristiriidatta sama kuin mielenkiinnon kohteena oleva antigeenin spesifinen antigeenideterminantti tai ainakin sen kanssa immunologisesti ekvivalentti. Tämä todistus tehdään kemiallisen ja fysikaalisen karakterisoinnin kautta ja lopulta saamalla aikaan synteettisen determinantin vasta-aineiden ja luonnon antigeenin välinen immuunireaktio. Tässä karakterisoinnissa käytetään yleisesti tunnettuja menetelmiä, joilla määritetään molekyy1ipaino, varaus, sitomisaffiniteetti jne. Näitä karakterisointimenetelmiä on yleisesti kuvattu julkaisuissa: "Modern Concepts in Biochemistry’* supra. kappale 2 otsikolla "Methods of Biochemistry" ja "Cell Biology", supra. liite "Tools of the Cell Biologist". Näissä on myös mainittu menetelmien ja tekniikoiden täydelliset kuvaukset. Radioimmuno-määritysmenetelmiä käytetään laajalti, ja niitä on kuvannut Hunter. W.M. "Preparation and Assessment of Radioactive Tracers". British Medical Bulletin. 30:18-23. Jäljempänä on annettu esimerkkejä näistä karakterisoinneista.

II. Antigeenin valmistaminen

Sen jälkeen, kun käytettävissä on synteettinen peptidi, jonka on osoitettu olevan mielenkiinnon kohteena oleva antigeenin spesifinen antigeenideterminantti, niin tunnetuilla sitomis-tekniikoilla sidotaan determinantti kantajaan antigeeniksi tilanteissa, joissa tällainen kantaja tarvitaan. Tämä vaihe voidaan luonnollisesti suorittaa pienessä mitassa silloin, kun osoitetaan peptidin immunologinen identiteetti antigeenideter-minantille. Esimerkiksi, kun keksintö ensin todistettiin 2o 8 3 662 laboratoriossamme, Dr. Fu-Tong Liu auttoi kiinnittämään valmistamamme synteettisen proteiinin tunnettuun KLH-kantajaan käyttämällä julkaistuja materiaaleja ja menetelmiä. (Liu, Fu-Tong et ai , "New Procedures for Preparation and Isolation of Conjugated of Proteins and a Synthetic Copolymer of D-amino cids an.d Immunochemical Characterization of such Conjugates" , Biochemistry 18.‘ 690-697 (1979).

Kantajan valinta riippuu enemmän antigeenin lopullisesta aiotusta käyttötarkoituksesta kuin antigeenin determinantista perustuen kriteereihin, jotka eivät erityisesti liity oheiseen keksintöön. Esimerkiksi, jos valmistetta tullaan käyttämään eläimissä, valitaan kantaja, joka ei aiheuta tässä eläimessä kiusallista reaktiota. Jos valmistetta on tarkoitus käyttää ihmisessä, niin tärkeimmät seikat koskevat kantajan ja/tai saadun antigeenin immunokemikaalisten tai muiden sivureaktioiden puutetta, turvallisuutta ja tehokkuutta - samat näkökohdat, jotka koskevat kaikkia ihmiskäyttöön aiottuja valmisteita. Käytännössä on tarkoitus, että oheista keksintöä sovelletaan ensin laajasti eläimissä, esimerkiksi lemmikkieläimissä ja maatilaeläimissä.

III. Immuuni reaktio-vasta-aineen valmistus

Erittäin usein on toivottavaa määrittää, onko mukana jotain tiettyä antigeeniä, esimerkiksi jonkin tietyn taudin diagnoosin apukeinona. Koska synteettinen antigeeni on monospesifinen mielenkiinnon kohteena olevalle yhdelle ainoalle spesifiselle antigeenideterminantille, myös antigeenin vasta-aineet ovat monospesifisiä mielenkiintoisen antigeenin suhteen. Aina ei voida täydellistä monospesifisyyttä toteuttaa, mutta risti-reaktio antigeenin muille antigeeniosi11 e vältetään, koska vasta-aineen kautta on mahdollista vain yksi immuunireaktio. Vasta-aineet otetaan talteen ja valmistetaan millä tahansa tavanomaisella menetelmällä, joita käytetään diagnostisissa 2i 8 3 662 testeissä. Esimerkiksi on tavallista, että vasta-aine leimataan tunnistamista ja kvantitatiivista määritystä varten. Immuno-määrityksissä käytetään yleisesti radioieimausta esimerkiksi Greenwood'in menetelmällä (kts. Hunter, Br, Med. Bul1. 30:18 (1974)) ja leimaamista fluoresoivalla värillä.

IV. Esimerkkimenetelmä - antiaeenideterminantti on tuntematon Yhteenveto:

Repiikoitumiskykyisten hiirten 1eukemiavirusten, kuten Moloney-, Rauscher-, Friend- ja AKV-virusten hyväksyttyyn geneettiseen rakenteeseen sisältyy kolme geeniä. Nämä geenit, qaq pol ja env ovat sijoittuneet vastaavassa järjestyksessä pitkin yksisäikeistä RNA-genomia. Ne jäljentyvät integroidusta kaksisäikeisestä DNA-proviruksesta. Näiden kolmen geenin proteiinituotteet ymmärretään huomattavan yksityiskohtaisesti. Gaq-geeni koodaa noin 65 kilodaltonin polyproteiinia, joka proteolyyttisesti käsitellään 15, 12, 30 ja 10 kilodaltonin, amino-karboksi-päätteisiksi proteiineiksi. Näitä proteiineja on virionin ytimessä ja yksi näistä, p30, on yhdistetty virus-tropismiin. Toinen geeni, pol, ilmentyy pag-geenin näennäisenä jatkeena siten, että havaitaan noin 180 kilodaltonin polypro-teiini, joka sisältää sekä qaq- että pol-komponentit. Polypro-teiini prosessoituu 70 kilodaltonin proteiiniksi, joka on kään-teistranskriptaasi. Tämä entsyymi vastaa infektoivan viruksen yksisäikeisen RNA-genomin kopioimisesta kaksisäikeiseksi RNA-rakenteeksi, joka voi integroitua isäntäeläimen DNA:an. Kolmas geeni, env, koodaa polyproteiinin, joka glykosyloidaan ja käsitellään komponenteiksi gp70 ja pl5E. Gp70 on kuoren pääkompo-nentti ja sen mukaan määräytyy viruksen isäntäalue. Sen havaitaan joskus kytkeytyneen disulfidin kautta pl5E-komponenttiin, joka on hydrofobinen proteiini, joka voi ankkuroida gp70-kompo-nentin viruksen membraaneihin ja solumembraaneihin. Näiden kolmen geenin ilmentymisestä vastaavia lähetti-RNA-molekyylejä on kuvattu.

22 83662

Aloitimme tutkimuksemme Moloney Murine Leukemia-viruksen (Mo-MuLV) 3'-päästä, koska olimme erityisen kiinnostuneita env-geenistä, jonka uskottiin olevan kaikkein 3’ läheisin geeni. Tällöin löysimme uuden geneettisen koodialueen, joka sijaitsee env.-geenin 3'-puolella. Alustavasti nimitimme tämän R-alu-eeksi, koska se on koodialue, joka genomissa on kaikkein kauim-pana oikealla. Olemme myös kemiallisesti syntetisoineet osan R-proteiinistä, muodostaneet vasta-aineita synteettiselle peptidille ja löytäneet infektoiduissa soluissa immunologisesti ristireaktiivisen materiaalin.

DNA-sekvenssi:

Kuviossa 1 on kuvattu Mo-MuLV-proviruksen 3’-pään nukleotidi-sekvenssi. 1123 nukleotidisen plus-säikeen sekvenssi, joka oli 3'-LTR- ja karboksipäisel1ä viruksen koodausalueel1 a, ratkaistiin 1108 emäsparin pituisesta cDNA-klOonista ja sitä jatkettiin hieman sekventoimal1 a infektoivasta kloonista. Nukleotidi-järjestyksen päällä on esitetty DNA:sta tulkittu proteiinisek-venssi. Ensimmäiset pääteasemassa sijaitsevaa 34 aminotähdettä määritettiin Copeland'in ja Oroszlan'in mukaan, ja asemat 10-34 vastaavat meidän sekvessiämme. Asemassa 103 sijaitsevan aminohapon (vai) jälkeen oleva nuoli tarkoittaa pl5E-komponentin karboksipäätettä. Muu osa aminohapposekvenssistä kuuluu R-pro-teiiniin. Numeroidut oligonukleotidit (25, 42, 57 ja 98B) esittävät niitä oiigonukleotideja, jotka vastaavat AKV-virusta ja jotka on esitetty yksityiskohtaisesti kuviossa 5. R-koodi-alueen jälkeinen alleviivattu alue on plus-säikeisen DNA-syn-teesin alkukohta. Alueet, joista on käytetty merkintöjä IRl ja . IRr, ovat pääteasemassa sijaitsevia invertoituja toistuvia kohtia, joiden välissä LTR:t ovat. LTR:n sisällä on 17 emäksen pitkä palindrooma (alleviivattu) ja 3 suoraa toistuvaa kohtaa (DR 1, 2 ja 3), jotka ovat juuri ennen virusjäijennöksen 5'-pään Hogness-box promoottoria (p). Edempänä molekyyliä sijaitsee jäljennöksen 3’-pään poly A additiosignaali.

23 83662

Olemme myös sekvensoineet tämän täysipituisen virusklooni-alueen, jonka transfektio-kokeilla voidaan osoittaa sisältävän kaikki biologisesti aktiiviset Mo-MuLV-koodisekvenssit. Tämä uusi DNA-sekvenssi vastaa alkuperäistä lukuunottamatta kuvattuja vähäpätöisiä eroja. Uskomme näiden erojen merkitsevän joko biologissti aktiivisten genomien populaatiossa tapahtuvaa muuttuvuutta tai artifakteja, jotka johtuvat sen käänteistrans-kriptaasi-reaktion tunnetusta pienestä epätarkkuudesta, joka muodosti alkuaan tutkimamme kloonin.

Orientoitumista varten osoitamme useita tämän sekvenssin ominaisuuksia, jotka ovat tärkeitä viruksen elinkierrolle. Kun kuljemme 5'-päästä 3'-päähän pitkin genomi-RNA vastaavaa DNA-säiettä, näemme pl5E-komponentin pääosan koodialueen (karboksipäinen env-koodialue); toisen (positiivinen) säikeen DNA-replikoitumisen alkukohdan; invertoidut toistuvat kohdat IRl ja IRr, joiden välissä ovat ne virussekvenssien osat, jotka toisiintuvat integroidun proviruksen 5'- ja 3’-päissä (nk.

LTR:t) ja jotka tekevät viruksen DNArsta transposonin; ja poly • A additiosignaalin ja poly A häntää edeltävät todennäköiset viimeiset 3'-nukleotidit. Merkittyjä ovat myös kohdat, jotka ovat aktiivisia LTR:n 5’-kopiossa, nimittäin genomi-ilmentymän promoottori ja ensimmäinen jäljennetty emäs sekä hieman ennen Hogness box-promoottoria sijaitseva sekvenssi, jossa on kolme suoraa toistuvaa kohtaa, joiden sekvenssi on 7 emäksen pituinen. Nämä toistokohdat voivat (väite perustuu sijaintiin) liittyä jäijentymisen säätelyyn. Pääteasemassa sijaitsevassa, - 515 emäksen pituisessa toistokohdassa havaitaan myös 17 emäksen sekvenssi, joka muodostaa itsenäisen invertoidun toistokohdan (palindrooma), mutta jonka tehtävää (jos sellainen on) ei . tunneta.

DNA-sekvenssin ennustama uusi proteiini: Löytämämme uusi geenialue voidaan parhaiten ymmärtää vertaa 24 83662 maila siihen, jonka aikaisemmin uskottiin olevan proviruksen kauimpana oikealla sijaitseva geeni-virusproteiinin pl5E koodi-alue. pl5E-komponentin aminopääte voidaan tarkalleen paikallistaa siitä päällekkäisyydestä, joka on DNA-sekvenssimme ennustaman proteiinisekvenssin ja muiden saaman proteiinisekvenssin välillä. pl5E-komponentin karboksipääte määräytyy kohtaan 103 kolmea tietä. Copeland ja Oroszlan määrittivät pl5E-komponen-tin kahden C-päätteisen aminohappotähteen olevan leu-val. Tällaisen parin löydämme 103-asemassa pl5E aminopäätteistä. pl5E-komponetin ennustettu aminohappokoostumus, joka saadaan sijoittamalla karboksipääte valiiniin tässä kohden, vastaa erinomaisesti havaittua koostumusta. SDS-geeleil lä määritetty pl5E-komponentin näennäinen molekyylikoko on lisäksi noin 15 kilo-daltonia. Tämä kokoarvio sopii yhteen 103 tähteisen hydrofobisen proteiinin liikkuvuuden kanssa.

Yllättäen emme ole asemassa 104 löytäneet translationaalista päätekodonia. Sen sijaan avoin translationaalinen lukurunko ulottuu vielä 92 triplettiä ennen pysäytysmerkkiä. Aminohappo-koostumus, joka saadaan ottamalla nämä 92 triplettiä mukaan, ei lainkaan sovi pl5E-komponentin koostumukseen. Tämän johdosta päättelemme, että primäärinen env-geeniproteiinituote sisältää itse asiassa kolme peptidiä: gp70, pl5E ja tämä juuri identi fioitu proteiini. R (asemat 104 - 195 kuviossa 1). Tästä syystä etsimme R-proteiinia.

R-proteiinin kemiallinen synteesi ja sen löytäminen infektoi-duissa soluissa:

Solid state-menetelmillä syntetisoimme useita ennustetun • ; Mo-MuLV-R-proteiinin peptidejä ja muodostimme näille synteettisille peptideille vasta-aineita. Tarkemmin sanoen 15 C-päätetähdettä (LTQQFHQLKPIECEP) kiinnitettiin KLH-kantaja-molekyyliin ja injisoitiin 6 kaniinin ja 4 hiireen. Seerumeista 25 83662 määritettiin niiden kyky saostaa immunologisesta 36-tähteinen synteettinen substraatti, jossa on 125-tyrosiinin (125-yilnRLVQFVKDRISVVQALVLTQQFHQLKPIECEP) edeltämä R-prote-iini, joka sisältää 35 CC-päätetähdettä. Kaikkien immunisoitujen kaniinien ja hiirten seerumeilla oli positiivinen.

10-70-kertainen vaste normaaliin seerumiin verrattuna, kuten on esitetty taulukossa 1.

TAULUKKO 1

Lukema (0,1 min.) saos-Immunisoin- tetulla 125I-36 amino-Eläin nro ti tapa_ happo-pol ypeptidi 11 ä

Normaali kaniininseerumi - 432 rb 02809 A 4.867 rb 02810 A 15.359 rb 02623 B 13.243 rb 02623 21.200 veri vaihdettu myöhemmin rb 02624 B 16.434 rb 02624 18.436 veri vaihdettu myöhemmin rb 02625 C 5.548 rb 02625 4.030 veri vaihdettu myöhemmin rb 02626 C 9.121 rb 02626 19.799 veri vaihdettu myöhemmin rb 02618 D 599 rb 02619 D 566 26 83662 TAULUKKO 1 (jatk.)

Tapa A: päivä 1-1 mg/kg Freund’in apuaineessa (Freunds complete adjuvant) subkutaanisti 4 jalkapohjaan ja ja pitkin selkää

CT15-KLH

päivä 7 - injektiot toistettiin - Freund'in apuaine päivä 14 - injektiot toistettiin - Freund'in apuaine päivä 21 - veri valutettiin

Tapa B: päivä 1 - 200 mg/kaniini Freund’in apuaineessa subkutaanisti (kaniinit painoivat noin 2,5 - 3 kg, joten tämä merkitsti huomattavaa annostuksen pienentämistä)

CT14-KLH

päivä 7-50 mg/kaniini Freund'in epätäydellisessä apuaineessa subkutaanisti päivä 14 - 50 mg/kaniini alunassa (4 mg/kaniini) veri vuodatettiin päivinä 21 ja 28 tehostusruiske CT15-KLH-kantajal1 a alunassa, 50 mg/kaniini, veri vuodatettiin 7 päivän kuluttua tehostusruiskeesta

Tapa C; Sama kuin tapa B paisti, että alkuannos pienennettiin 50 mg/kaniini myös myöhemmät annokset olivat 50 mg/kaniini

CT15-KLH

Tapa D: Sama kuin tapa C paitsi, että käytettiin CT15-biotiini-avidi inia

Sen jälkeen yritimme löytää R-proteiinin MuLV-viruksia muodostavien SCRF 60A solujen, jotka oli leimattu kaksituntisella 33g-metioniinipulssilla, Lysaateista (R-proteiini ei sisällä lainkaan tyrosiinia, eikä sen siten odotettu leimautuvan jodi 11a).

Kuviossa 2 on kuvattu 1ogaritmi f aasissa olevia SCRF 60A soluja, jotka muodostavat Mo-MuLV-viruksista erottamattomia viruksia (16) ja joita oli kasvatettu Eagle'n MEM-a1ustal1 a, joka 27 83662 sisälsi 10 % vasikansikiöseerumia. Solut leimattiin 37°C:ssa 2 tunnin aikana konsentraatiossa 2 x 10® solua/ml 35S-metio-niinilla (940 ci/mi11imooli, 100uCi/ml) Hank’in suolaliuoksessa (Hank's Balanced Saltn), joka sisälsi 10 % Eagle'n MEM-kasvatusalustaa. Solut jäädytettiin, pestiin 0,15M natrium-kloridilla. lOmM natriumfosfaati1 la (pH 7,5), uutettiin 20 minuuttia 0°C:ssa seuraavilla: 0,15M NaCl, lOmM natriumfos-faatti (pH 7,5), 1 % NP40, 0,5 % natriumdeoksikolaatti.

0,1 % SDS, 2 % Trasylol, minkä jälkeen solut käsiteltiin ultraäänellä ja sentrifugoitiin 5 minuuttia voimalla 12.000 x g. Lysaatti esikirkastettiin saattamalla se reagoimaan 20 μΐ kanssa normaalia kaniiniseerumia ja 20 μΐ kanssa normaalia vuohenseerumia 30 minuutin ajan 0°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 30 minuutiksi formaliinilla kiinnitettyä Staph A ja sentrifugoitiin 15 minuuttia 12.000 x g voimalla. Lysaatista otetut osat saatettiin reagoimaan 0°C:ssa 1 tunnin ajan 5 μΐ kanssa seuraavia aineita: A) normaali kaniininseerumi, B) kaniinin anti-synteettinen R pentadekapeptidi-seerumi, C) vuohen anti-gp70-seerumi, D) vuohen anti-p30-seerumi tai E) normaali vuohenseerumi tai F) anti-gp70 hybridoma (nro R1-16G07, viite 17)-kasvatusalusta. Kompleksit otettiin talteen Staph A:lla ja pestiin 2 kertaa 500mM litiumkloridilla. lOOmM Tris (pH 8,5) puskurilla ja liuotettiin täyttöpuskuriin, josta Staph A oli poistettu, ja täytettiin 11 % SDS-polyak-ryyliamidigeelille. Geeliä kostutettiin ENHANCE (NEN)-geeli1lä 90 minuuttia, vedellä 60 minuuttia, kuivattiin ja laitettiin kalvolle. Kuviossa esitetyt vyöhykkeet on aikaisemmin tunnistettu tässä laboratoriossa ja muiden toimesta.

Anti-R-seerumi valmistettiin seuraavasti. Karboksipäätteinen R pentadekapeptidi (LTQQFHQLKPIECEP) konjugoitiin (KLH)-kantajaan (keyhold limpet haemocyanin) kysteiini-sulfhydryylin kautta.

63 μΐ 15 mg/ml m-malimidobentsoyyli-N-hydroksisukkin-imidi-esteriä N,N'-dimetyyliformamidissa lisättiin tipottain ja 28 83662 samalla sekoittaen KLH-kantajaan (10 mg/ml) lOmM kaliumfosfaatissa (pH 7,0). Seosta sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen se suodatettiin ja vietiin Sephadex G-25 pylvääseen (0,1M fosfaatti, pH 6,0). Aktivoidun proteiinin (2,3 ml) kanssa sekoitettiin 0,1 ml R pentadekapeptidiä (10 mg/ml 0,1M kalium-fosfaatissa, pH 7,3, 5mM EDTA) ja liuos säädettiin pH-arvoon 6,5, sekoitettiin 4 tuntia huoneen lämpötilassa ja kromato-grafoitiin Sephadex G-100 hartsilla (0,1M ammonium-bikarbo-naatti, pH 9,5). Konjugoitu proteiini otettiin talteen ja käytettiin suoraan immunisoinnissa.

Kuten kuviosta 2 nähdään, anti-R-seerumi havaitsee infektoi-duissa soluissa proteiinin, jonka näennäinen molekyy1ipaino on noin 80 ki1odaltöniä. Kaikki kaniinin ja hiiren yksittäiset immuuniseerumit havaitsevat molekyylikooltaan samanlaiset proteiinit. Koska nuk1eotidisekvenssit osoittivat, että pl5E ja R olivat samassa 1ukurungossa, odotimme tämän molekyylin olevan itse asiassa env-prekursori. Gp70-komponentin, mukaanlukien anti-gp70 hybridoman vasta-aineet havaitsevat molekyylin, jolla on sama näennäinen molekyylikoko kuin anti-R:llä saostetulla molekyylillä, mikä vahvistaa, että todellakin on kysymyksessä env-prekursori. Sen mahdollisuuden eliminoimiseksi, että kyseessä oli kaksi eri molekyyliä, joiden molekyy1ikoot sattumalta vastasivat toisiaan, teimme kaksi koetta. Ensiksi, kun lysaatit esikirkastetaan anti-R-seerumi11 a, poistetaan anti-gp70:n 80 kilodaltonin kohde. Sen sijaan lysaatin kirkastaminen anti-gp70-seerumi1 la poistaa R-determinantit. Toiseksi, kahden 80 kilodaltonin molekyylin, jotka on saostettu anti-R:llä ja anti-gp70:1lä, proteolyyttinen peptidien vertaaminen osoittaa näiden olevan identtisiä. Olemme näin identifioineet 80 kilodaltonin vyöhykkeen täydelliseksi env-geeni-polyproteiinituot-teeksi, joka sisältää gp70:n. p!5E:n (kuten muut tutkijat ovat osoittaneet) ja R-determinantit, jolloin saadaan kuviossa 3 ehdotettu rakenne.

29 83662

Kuviossa 3 on uusi Mo-MuLV-proviruksen geenikartta. 515 nukleotidin pituiset LTR:t ovat viruksen proteiini-koodialueen kummallakin puolen. Miinus-säikeen (tRMA-käynnistäjän sitoutumiskohta) ja plus-säikeen DNA-replikoinnin lähtökohdat sijaitsevat kummassakin päässä LTRrstä katsoen hieman kohti virus-runkoa. Primäärinen gag-geenin tuote (Pr65«a®) prosessoituu komponenteiksi N - C, pl5, pl2, p30 ja plO. Pol-geenin lopputuote on 70 ki1odaltöniä. Env-polyproteiini, josta käytetään nimitystä Pr80*nv, muodostuu komponentista N - C, gp70, pl5E ja juuri identifioitu R-proteiini.

R-proteiinin ensimmäinen aminohappo, joka välittömästi seuraa pl5E-komponentin vaiiini-karboksipäätettä, on arginiini. Koska emäksisiä tähteitä usein havaitaan proteolyyttisissä katkaisu-kohdissa, on mahdollista, että tässä kohden R muodostuu proteol yyttisesti env-polyproteiinista. Käyttämällä geelielektro-foreesissa erilaisia olosuhteita kykenimme havaitsemaan anti-R-seerumin spesifisesti seostaman proteiinin, jonka arvioitu molekyylikoko oli 12 ki1odaltöniä.

Kuviossa 4 on kuvattu R-proteiinin havaitseminen. SCRF 60A-solujen 35S-metioniini1 la leimattu lysaatti (kuten kuvion 2 kuvauksessa) jaettiin neljään yhtä suureen osaan ja seostettiin immunologisesti A) normaalilla vuohenseerumi11 a, B) vuohen anti-gp70-seerumi11 a. C) normaalilla kaniininseerumi1 la tai D) kaniinin anti-R-seerumi11 a, kerättiin Staph A:11 a ja elektro-foresoitiin 5-17,5% SDS polyakryyliamidi-gradienttigeeli11ä.

·. Epä suoran immunof1uoresenssin avulla olemme myös havainneet • R-proteiini-determinantteja SCRF 60A solujen plasmarnembraa-nissa. Kokeittemme perusteella ei voida määrittää, minä hetkenä pl5E-komponentin lohkeaminen tapahtuu, ja on mahdollista, että todellinen gp70 membraaniankkuri on 22 kilodaltonin proteiini, joka sisältää pl5E- ja R-peptidit. Tässä tapauksessa pl5E- ja R-peptidit muodostava proteolyyttinen katkaisu tapahtuu niiden eristämisen aikana. Emme ole havainneet 22 kilodaltönin pro teiinia, jossa on R-determinantteja.

30 8 3 6 6 2 R-geeni on läsnä toisessa viruksessa. Pederson ja Haseltine määrittivät AKV-viruksen suurten ribonukleaasi-Tl-palasten nukleotidisekvenssit (AKV-virus on AKR-hiirten endogeeninen leukemiavirus). Tietokonetutkimuksen avulla kykenimme osoittamaan, että useissa näistä palasista oli osittaisia homologeja Mo-MuLV-sekvenssiryhmiemme kanssa. Määrittel emämme järjestys sopii kohtuullisen hyvin Pederson’in. Crowthere'n ja Haseltine'n kokeel1isesti saamaan järjestykseen. Nämä yhteensopivuudet R-alueen sisälle on osoitettu kuviossa 1 ja yksityiskohtaisemmin kuviossa 5.

Kuviossa 5 on verrattu kahden viruksen R-geeniä. Pederson'in ja Haseltine'n määrittämät AKV-viruksen oligonukleotidisekvenssit sovitetiin Mo-MuLV-sekvenssiimme tietokoneen avulla. Sivussa annetut numerot ovat Pederson'in ja Haseltine'n käyttämiä. Nukleotidien erot on alleviivattu. Palasessa 98B oli fenyyli-. . alaniinikodoni infektoivan kloonin cDNA-sekvenssissämme tyro-siinikodoni ja tyrosiini AKV:ssä. Palan 98B kohtaa X ei ole AKV:llä ratkaistu.

Näistä sovituksista voidaan havaita kaksi seikkaa. Ensiksikin havaitsemme, että verratut palaset eivät ole täysin samanlaisia, vaikkakin parittaisuus ei ole sattuma. Tämä ehkä varoittaa meitä siitä, mitä on odotettavissa, kun tulevaisuudessa vertaamme lähisukuisten virusten sekvenssejä. Toiseksi havaitsemme, että R-alueen sisäiset yhteensopivuudet osoittavat, että AKV luultavasti koodaa R-proteiinin hyvin paljon samalla tavoin kuin Mo-MuLV. Erityisesti todettakoon, että 1) yksikään AKV-eroista ei tuo mukaan nukleotidejä, jotka aiheuttavat ennenaikaisen translaation pysähtymisen, 3i 83662 2) useat (9) AKV:n ja Mo-MuLV:n nukleotidierot ovat triolettien kolmannessa asemassa eivätkä siten muuta koodattua proteiini-järjestystä , 3) eräät nukleotidierot tosin muuttavat R-proteiinin aminohapot, mutta nämä korvaukset ovat usein konservatiivisia tai synonyymejä (kuten on osoitettu kuviossa 5), kuten fenyyliala-niinin vaihtuminen tyrosiiniin palassa 98B, asn-gln-arg-osan vaihtuminen lys-oln-gln-osaan palassa 25 tai metioniinin vaihtuminen leusiiniin palassa 57. Dayhoff'in mutaatiomatriisi laskee kaikki nämä substituutiot positiivisiksi korrelaatioiksi. Lisäksi Winship Herr'in alustavasti selvittämä AKV-viruksen R-alueen 217 nukleotidin sekvenssi näyttää avoimen lukurungon, jossa on 56 nukleotidieroa verrattuna Mo-MuLV-sekvenssiimme. Nämä 56 eroa merkitsevät vain kuuden aminohapon, jotka kaikki ovat neutraaleja, vaihtumista. Nämä havainnot osoittavat, että R-proteiinisekvenssi on erittäin hyvin säilynyt näissä kahdessa viruksessa.

Kommentteja R-proteiinistä R-proteiinin koko aminohappojärjestys ei vastaa tarkalleen mitään Dayhoff'in Atlaksen proteiinisekvenssiä. Eräät R-proteiinin ala-alueet kuitenkin muistuttavat tunnettujen proteiinien, kuten dehydrogenaasien ja proteaasien ala-alueita ja mahdollisesti ovat merkki R-proteiinin alueista, jos tapahtuu nukleotidin sitoutumista tai proteiinien keskinäisiä vuorovaikutuksia.

R-proteiini saattaa toimia yksinkertaisesti viruksen rakenne-proteiinina. Tässä suhteessa asemien 32 ja 61 välinen erittäin hydrofobinen alue saattaa merkitä, että R liittyy solumembraa-neihin tai virusmembraaneihin, joissa se toimii muiden virus-proteiinien ankkurina. Kuten edellä mainittiin, olemme jo osoittaneet f 1uoresenssimikroskopian avulla, että R-proteiinia on mukana infektoitujen solujen plasmamembraanissa.

« 83662

Vaihtoehtoisesti R-proteiini saattaa liittyä muunlaatuisiin toimintoihin. Kuten alkuaan Fisher huomautti, geenit ja niiden vaikutusalueet näyttävät kasautuvan. R-alue sijoittuu tiiviisti pl5E-koodausalueen ja positiivisen säikeen replikoinnin ja LTR:n alkukohdan väliin. Sen vuoksi on mahdollista, että R toimii replikoinnissa tai transpositiossa (integroinnissa). Toisaalta R-proteiini 11 a saattaa olla merkitys viruksen aiheuttamassa muutoksessa. Leukemiavirusten eräs hämmentävä arvoitus on ollut, että vaikkakin ne muuttavat 1ymfoii1ikudoksia, niillä ei ole mitään ilmeisiä transformaatiogeenejä.

Transformaatioproteiinina R saattaisi toimia suoraan tai se voisi vaikuttaa toisen proteiinin kanssa. Kummassakin tapauksessa on selitettävä kaksi tärkeää seikkaa. Ensiksikin, vaikka ne replikoivat hiiressä käytännöllisesti katsoen kaikkia solutyyppejä, nämä virukset muuttavat vain spesifisiä soluja. Toiseksi muutokset gp70-proteiinissa, joka on koodattu ennen R-proteiinia, korreloivat hyvin eri virusten, erityisesti MCF-virusten leukemiaa aiheuttavan vaikutuksen. Sen vuoksi uskomme, että joko gp70 ja R vaikuttavat toisiinsa suoraan (mahdollisesti disulfidisidoksen kautta) ja niillä on moloniviruksen tapauksessa T-solu-spesifinen vaikutus tai että gp70 laukaisee jonkin solutyyppisen spesifisen tapahtuman, joka tekee T-solun herkäksi R-proteiinin leukemiaa aiheuttavalle vaikutukselle. Tuntematonta on, mikä mahdollisesti saa säilyttämään tämän geenin.

Edellä kuvattu työmme ei anna ainoastaan uutta tietoa systeemistä, jonka avulla pyrimme osoittamaan keksintömme oikeaksi . tai vääräksi, vaan myös yleismenetelmän, jolla nukleotidi-sekvenssien avulla voidaan valmistaa proteiineja.

Menetelmän ensimmäisessä todistuksessamme käytimme seuraavia vaiheita: 33 83662 (a) Jos lähdetään mielenkiinnon kohteena olevasta antigeenistä, jossa antigeenideterminantti-peptidiä ei ole karakterisoitu, ensimmäisenä vaatimuksena on tämän peptidin tunnistaminen ja karakterisointi. Esimerkissä ei edes tiedetty determinantti-alueen olemassaoloa vaan se todistettin. Koska virus muodostui RNArsta, esimerkissä oli myös kopioitava se DNAthan transkription avul1 a.

(b) Tarkoituksenmukaiseen käsittelyyn riittävän määrän saamiseksi antigeeni cDNA vietiin tunnettuun plasmidiin ja geeniä kasvatettiin suuret määrät. Tätä vaihetta ei luonnollisesti tarvita, jos DNA:ta on saatavissa riittävät määrät tai jos DNA:n tai peptidin rakenne on tunnettu. Vaihe tehtiin vain työskentelyn helpottamiseksi.

(c) cDNArn nukleotidisekvenssi määritettiin. Tämä vaihe ei ole tarpeen, jos mielenkiintoinen peptidi on karakterisoitu. Vaihetta ei samoin tarvita, jos proteiini karakterisoidaan suoraan eikä sen genomin avulla. Tämä tutkimus, johon sisältyi havainto, että proteiini oli lohjennut tai hajonnut ja että yksi antigeenideterminantin paikka puuttui, vahvistaa keksinnön erittäin yleisen soveltuvuuden ja avaa mahdollisuuden valmistaa - - rokotteita ja diagnostisia tuotteita antigeeneille, joita ei lainkaan esiinny infektoivassa organismissa! (d) Kun nukleotidi järjestys on tunnettu, genomin geneettinen koodi määrää proteiinin aminohappojärjestyksen, ja voidaan valita peptidi, josta on tarkoitus tehdä synteettisesti kaksoiskappale. Mikä tahansa proteiinin alue on sopiva lähtökohta. Synteesin aloittamiselle on edullinen kohta se alue, jossa ei ole reaktiivisuutta isäntäsolui 11 e. Valinnan tapahduttua syntetisoidaan halutun pituinen peptidi käyttämällä edellisessä -· esimerkissä mainittua Merryfield'in et ai menetelmää. Peptidin pituuden tulisi olla vähintään 4 mer, yleensä vähintään 8 mer.

34 83662

Pidemmät peptidiketjut ovat spesifisempiä, mutta vaativat myoS pidemmän synteesiä jän. Yleisesti sopivia ovat peptidit, joiden pituudet ovat kahdeksasta aina useaan sataan mer:iin asti-Huomionarvoista on, että immuunireaktio 15 mer antigeenideter* minantille oli spesifinen sekä 35 mer:in (plus radioleima) determinantille että 1uonnonantigeeni11 e.

(e) Synteettisesti valmistettu spesifinen antigeenidetermi-nantti, joka ei siten sisältänyt ulkoisia proteiineja, endo-toksiineja, solupalasia, virusgenomeja jne., konjugoitiin sen jälkeen sopivan kantajan kanssa niin, että saatiin valmiste, jossa spesifinen antigeenideterminantti on synteettinen peptidi.

(f) Isäntäeliöön immunisoitu rokote immunisoi isäntäeliön ja käynnisti vasta-aineiden tuoton.

(g) Vasta-aineet osoittautuivat oiigospesifisiksi suuremmalle synteettiselle antigeenideterminanti11 e ja 1uonnonantigeeni11 e.

(h) Vasta-aineet sitoutuivat virukseen ja inaktivoivat sen.

• .· Keksintö onnistui siten (i) ennustamaan ja syntetisoimaan sitä ennen tuntemattoman antigeenideterminantin, ja (ii) valmistamaan vasta-aineen, joka monospesifisesti sitoutui luonnon-antigeeniin ja neutralisoi viruksen.

Hepatiitti- ia influensa-valmiste Yhteenveto;

Kolmetoista peptidiä, jotka vastasivat hepatiitti B pinta-antigeenin (HBsAg) nukleotidisekvenssistä ennustettua amino-. happojärjestystä, syntetisoitiin kemiallisesti. Kaniineihin injisoitiin vapaita tai kantajaan sidottuja synteettisiä 35 83662 peptideitä, ja seitsemän peptidiä kolmestatoista aiheutti peptidinvastaisen reaktion. Kuudesta liukoisesta, yli kymmenen aminohapon pituisesta peptidistä neljän peptidin antiseerumit reagoivat natiivin HBeAg-antigeenin kanssa ja saostivat spesifisesti Dane'n hiukkasista 23.000 ja 28.000 daltonin HBsAg-muodot. Koska hepatiittimolekyyliä ei oltu valittu tutkimuksiin minkään rakenteellisen ominaisuuden vuoksi, joka mahdollisesti olisi tarjonnut ainutlaatuisia onnistumismahdollisuuksia, nämä tulokset osoittavat strategian olevan yleisluontoisen ja että se tulee toimimaan millä tahansa molekyylillä, mikäli alueita tutkitaan riittävästi.

Valittiin kaksi geeniä, joiden nukleotidisekvenssit tunnettiin ja joiden kummankin proteiinituotteet olivat mielenkiintoisia sekä teoreettiselta että käytännölliseltä kannalta. Ensimmäinen näistä oli hepatiitti B genomin pääasiallinen kuori-proteiini, molekyyli, joka äärimmäisen hydrofobisuutensa vuoksi tarjosi tekniikalle mielenkiintoisen haasteen. Toiseksi geeniksi valittiin influensaviruksen humaglutiniini, koska sen täydellinen kristallograafinen rakenne tunnetaan (Wilson. I.A., Skehel, J.J. ja Wiley, D.C. (1981) Nature, sivut 366-73), ja näin voidaan korreloida, kuinka molekyylien asemaltaan tunnettujen proteiinialueiden vasta-aineet häiritsevät viruksen infektoivuutta ja itse asiassa, miten molekyylin rakenne korre-loituu antigeenisyyteen.

Hepatiitti B pinta-antigeeni

Hepatiitti B-viruksen pinta-antigeeni on glykosyloitu proteiini ja hepatiitti B viruksen 42 nanometrin hiukkasten (Dane'n hiukkanen) pääasiallinen pinta-antigeeni (5-7). HBsAg sisältää ryhmä- ja tyyppispesifisiä determinantteja, ja sen uskotaan olevan neutraloivan vasta-aineen pääkohde. Puhdistetut HBsAg-valmisteet ovat fysikaalisesti heterogeenisiä ja muodostuvat 36 83662 vähintään seitsemästä polypeptidistä, joiden molekyylikoko on välillä 23.000 - 97.000 daltonia. Massan perusteella pääasiallisen HBsAg-komponentin molekyy1ipaino on 23.000 daltonia. (Peterson, D.L., Roberts, I.M. ja Vyas, G.N. (1977) Proc. Mat. Acad. Sei. U.S.A., 74, 1530-1534). Immunologiset tutkimukset osoittivat, että eri kokoisilla proteiineilla on yhteisiä determinantteja, minkä vuoksi on mahdollista, että fysikaalinen polymorfismi heijastaa erilaisia glykosylaatio- ja aggregaatio-asteita. Kuviossa 7 on annettu 226 aminohappoa pitkän HBsAg:n aminohappojärjestys, joka on päätelty julkaistuista nukleotidi-sekvensseistä. Kokonaisuudessaan HBsAg on erittäin hydrofobinen molekyyli, joka sisältää runsaasti proliini- ja kysteiinitäh-teitä. HBsAg tutkittiin Kyte'n ja Doolittle'n julkaisemattoman tietokoneohjelman avulla, joka laskee liukuvan keskiarvon paikallisesta hydrofobisuudesta ja jonka on osoitettu erittäin hyvin ennustavan rakenteeltaan tunnettujen proteiinien sisäiset ja ulkoiset ryhmät. Jos HBsAg tarkastellaan alueittain, voidaan havaita molekyylissä kolme hydrofobista ja kaksi "hydrofii-lista" aluetta. Yksinkertaisuuden vuoksi viitataan hvdrofii-lisiin alueisiin, mutta itse asiassa molekyyli on niin hydrofobinen, että on luultavasti täsmällisempää käyttää nimityksiä hydrofobinen alue ja vähemmän hydrofobinen alue. Suurin ja hydrofobisin alue on noin asemien 80-110 välillä. Tämän hydrofobisen alueen sivuilla on kaksi "hydrofii1istä" aluetta, jotka käsittävät asemat 45-80 ja 110-150. Muut kaksi hydrofobista aluetta löydetään N- ja C-päätteistä. Useimmat kysteiineistä ovat ryhmittyneet kahteen "hydrofii1iseen" alueeseen. Kokonaisuutena näillä on siten kuva hydrofobisesta molekyylistä, joka mahdollisesti voi esiintyä monimutkaisina konformaatioina, jotka määräytyvät prolineissa sijaitsevista, useista taivutus-kohdista ja kysteiinissä sijaitsevista ketjun sisäisistä disulfidisidoksista. Tällainen rakenne vastaa molekyylin tunnettua kykyä kestää denaturoitumista ja proteolyyttisten entsyymien vaikutusta. (Millman, I., Loeb, L.A., Baver, M. ja 37 83662

Blumberg, B.S. (1970) J.. Exp. Med. 131, 1190-1199). Näin ollen voitaisiin odottaa, että suurin osa tämän molekyylin antigeeni-determinanteista muodostuisi suorassa proteiinisekvenssissä etäällä sijaitsevista aminohapoista ja että molekyylin tertiää-rinen rakenne pitäisi niitä avaruudellisesti lähellä toisiaan. HBeAg on siten erinomainen testi, kun halutaan yleisesti osoittaa jatkuvien aminohapposekvenssien käyttömahdollisuus suunniteltaessa tämän keksinnön mukaisia synteettisiä antigeenejä.

Materiaalit ia menetelmät

Peptidien synteesi Tässä tutkimuksessa syntetisoitiin peptidit käyttämällä Merrifield'in ja hänen koileegoittensa kehittämiä solid-phase-menetelmiä. Jokainen synteettinen peptidi hydrolysoitiin hapolla tyhjössä (6N, HCl, 110°C, 72 tuntia) ja määritettiin aminohappokoostumus. Multimeerisiä muotoja ei yritetty poistaa, koska peptidien ainoa käyttö oli immunogeeneina.

Synteettisten peptidien kytkeminen kantajaproteiiniin

Kaikki peptidit lukuunottamatta peptideitä 1, 3a ja 7 kytkettiin KLH-kantajaproteiiniin (kevhole limoet haemocyanin) peptidin kysteiinin kautta käyttämällä kytkentäaineina MBS (m-maleimidobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidi-esteri). Yleensä 5 mg peptidiä, PBS (pH 7,5) tai Na-boraatti-puskuria (pH 9,0) liuotettua peptidiä kytkettiin 3-4 mg KLH-MBS:ään. Peptidin liuotus-pH valittiin siten, että voitiin optimoida peptidin liukoisuus ja Ellman'in menetelmällä (Ellman, G.L. (1959),

Arch, biochem. Biophys. 82, 70-93) määritetty vapaan kysteiinin pitoisuus. Jokaisella peptidillä saatettiin 5 mg KLH-kantajaa 0,25 ml:ssa PBS-puskuria reagoimaan dimetyyliformamidiin liuotetun MBS:n kanssa KLH:MBS-moolisuhteessa 1:40 ja seosta sekoi- 38 83662 tettiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. KLH-MBS johdettiin sen jälkeen Sephadex G-25 geelin läpi ja vapaa MBS poistettiin pesemällä PBS:llä. KLH-kantajaa saatiin talteen noin 80 %, kun määrä arvioitiin pylvään eluaatin huippujakeista optisella tiheydellä 280. KLH-MBS saatettiin sen jälkeen reagoimaan 5 mg kanssa peptidiä, pH säädettiin arvoon 7-7,5 ja seosta sekoitettiin 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Kytkentätehokkuutta seurattiin radioaktiivisen peptidin avulla. Yleensä peptidiin kytkeytyy 25-50 molekyyliä KLH-kantajan 100.000 daltonia kohti.

Anti-peptidi vasta-aineiden valmistaminen

Kaniinit immunisoitiin seuraavalla aikataululla.

1) 200 pg peptidiin sidottua KLH-kantajaa Freund'in täydellisessä apuaineessa (1:1) subkutaanisti päivänä 0, 2) 200 pq epätäydellisessä Freund’in apuaineessa (1:1) subkutaanisti päivänä 14, 3) 200 pg ja 4 mg alunaa intraperitoneaalisesti päivänä 21. Eläimistä valutettiin verta 4 viikkoa ja 15 viikkoa ensimmäisen injektion jälkeen. Peptidi 1 injisoitiin ilman KLH-kantajaa (1 mg/injektio) samalla aikataululla.

Synteettisten peptidien immuunisaostus

Eri anti-peptidiseerumien reaktiivisuus määritettiin niiden kyvystä immunologisesti saostaa radiojodattuja kohdeproteii-neja. Peptidit leimattiin 125l:llä kloramiini T reaktion avulla, jos ne sisälsivät tyrosiinia, tai Bolton-Hunter’in reagenssilla. Erittäin puhtaat kuoripreparaatit (lahja J. Gerin'lta) leimattiin kloramiini T:llä. Radiojodatut kohteet joko suspendoitiin PBS- tai RIPA-puskuriin (0,15M NaCl, lOmM natriumfosfaatti pH 7,5, 1% NP40, 0,5% natriumdeoksikolaatti. 01% SDS) ja saatettiin 0°C:ssa reagoimaan (5 x 106 cpm/reaktio) 5 pl kanssa testiseerumia tai normaalia kaniinin seerumia li 39 83662 1 tunnin aikana ja sakat otettiin talteen Staphylococcus aureus avulla. Pelletit pestiin RIPA:11a, sen jälkeen kaksi kertaa 500mM litiumkloridi1 la, lOOmM tris (pH 8,5) puskurilla ja radioaktiivisuus laskettiin. Kaksoismääritysten vaihtelu oli noin 20%.

Immuunisakkoien polyakryyliamidi-geelielektroforeesi

Puhdistetut Dane'n hiukkaset (lahja W. Robinson'1 ta) suspen-doitiin RIPA-puskuriin ja radiojodattiin kloramiini T:llä. Valmiste esikirkastettiin kaksi kertaa inkuboimalla 0°C:ssa 30 minuuttia normaalin kaniininseerumin kanssa ja 30 minuuttia formaliinilla kiinnitetyn S. aureus kanssa, minkä jälkeen sentrifugoitiin (5 minuuttia voimalla 12.000 g) ja sen jälkeen sitä inkuboitiin 5 μΐ kanssa normaaliseerumia, anti-peptidi 3 seerumia tai anti-peptidi 4-seerumia. Sakat otettiin talteen ja pestiin kuten edellä, suspendoitiin geelintäyttöpuskuriin, kiehautettiin, sentrifugoitiin S. aureus poistamiseksi ja elek-troforesoitiin 5-17-prosenttisella akryyliamidi SDS-geelillä ja autoradiografoitiin.

Tulokset

Peptidien valinta synteesiin HBsAg:n fysikaalista rakennetta sekä kolmen julkaistun nukleo-tidisekvenssin keskeisiä eroja koskevat näkökohdat määräsivät, mitkä peptidit valittiin kemialliseen synteesiin. Yleisesti ottaen yritimme valita alueet niin, että mahdollisimman suuri osa proteiinisekvenssiä käsittäisi peptidejä, joissa on kyste-iinitähde, jotta kytkeytyminen kantajaproteiiniin olisi mahdollinen. Jos nukleotidisekvenssin perusteella mielenkiinnon kohteena olevalla alueella ei ollut kysteiiniä, sellainen lisättiin kytkentää varten C-päätteseen. Syntetisoidut peptidit on alleviivattu kuviossa 1 ja luetteloitu kuviossa 8.

40 8 3 662

Koko molekyyliä ei syntetisoitu, koska osa alueesta arvioitiin sellaiseksi, että onnistuminen ei ollut yhtä todennäköistä kuin muualla. Asemien 81 ja 94 välinen alue vältettiin sen äärimmäisen hydrofobisuuden vuoksi. Tätä sekvenssiä vastaavien synteettisten peptidien ei voitu olettaa olevan liukoisia, ja vaikka niille voitaisiin muodostaa vasta-aine, ei voitaisi odottaa tämän alueen sijaitsevan natiivin molekyylin pinnalla. Samanlaisista syistä ei tutkittu hydrofobisen C-päätealueen yhtä suurta osaa (asemat 164-211). Asemien 110-140 välistä aluetta vältettiin, koska kolme julkaistua nukleotidisekvenssiä eivät tällä alueella olleet sopusoinnussa. (Valenzuela, P., Gray, P., Quiroga, M., Zaldivar, J., Goodman, H.M. ja Rutter, W.J. (1979), Nature 280. 815-819. Pasek. M., Goto, T.,

Gilbert, W., Zink. B., Schaller, H., MacKay, P., Leadbetter, G. ja Murray. K. (1979), Nature 282, 575-579. Galibert, F., Mandart, E., Fitoussi, F., Tiollais, P. ja Charnay, P. (1979), Nature 281, 646-650). Molekyylien äärimmäisiä N- ja C-päätteitä vastaavat peptidit otettiin mukaan, koska aikaisemmin oli onnistuttu käyttämään näitä molekyy1ialueita, joiden täydellinen tertiäärinen rakenne on tuntematon. (Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N., Liu, F-T, Niman, H.L. ja Lerner, R.A. (1980), Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A. 5179-5200). Loput peptidit valittiin niin, että ne vastasivat molekyylin hydro-fiilisia alueita sekä hydrofiilisten ja hydrofobisten alueiden proliinia sisältäviä liittymäkohtia, joissa molekyylin voitiin odottaa kääntyvän ja paljastavan "kulmia". Peptidien 3a ja 7 havaittiin olevan liukenemattomia eikä niitä sen vuoksi käytetty .

Eräiden synteettisten peptidien vasta-aineet reagoivat natiivin HBsAa:n kanssa

Ennen kuin testattiin reaktiivisuus natiivia HBeAg kohtaan, oli tärkeää varmistua, että synteettisen peptidin suhteen oli li 4i 8 3 662 tapahtunut vasta-ainereaktio. Kuten taulukon 2 arvoista voidaan havaita, kymmenestä peptidistä kuusi peptidiä, kun ne oli kytketty KLH-kantajaan, olivat immunogeenisia sen perusteella, että antiseerumit pystyivät saostamaan radiojodatut peptidit. Vain peptideillä 4a, 8 ja 8a ei onnistuttu tuottamaan antipep-tidireaktiota.

TAULUKKO 2

Antipeptidiseerumien reaktiivisuus peptidi- ja viruskuorta vastaan _Vasta-ainetiitteri·*· VS:_

Peptidit Viruskuori

Peptidi Kaniini 4 viikkoa 15 viikkoa 4 viikkoa 15 viikkoa 1* 03288 6,4 8,4 8,3 13,4 1* 03289 8,6 7,6 28,0 52 1** 03300 3,7 - 1,0 2 03370 2,1 1,3 2,4 1,0 2 03371 2,7 1,7 1,1 0,9 3 03302 1,6 20 2,0 5,8 3 03303 5,2 15,8 14,0 36 3a NT(liukenematon) 4 03220 7,9 7,5 32,5 92 4 03221 4,8 6,1 7,2 71 4a 03211 1,0 - 1,0 4a 03213 1,0 - 1,0 5 03308 8,5 - 1,0 5 03310 5,9 - 1,0 5a 03305 5,3 - 1,0 5a 03307 5,8 - 1,0 6 03306 51,0 85 75,6 113 6 03309 17,7 83 9,5 37 6a 03169 12,3 - 1,0 6a 03212 11,0 25 1,0 1,0 7 NT(liukenmaton) 8 03219 1,0 - 1,0 8 03210 1,0 - 1,0 8a 03215 1,0 - 1,0 8a 03216 1,0 - 1,0 + Vasta-ainetiitteri on ilmoitettu testiseerumin saostamina lukemina jaettuna normaalin seerumin saostamilla lukemilla.

* injisoitu pH-arvossa 5,3 ** injisoitu pH-arvossa 8,5 42 83662

Peptidi 2 aiheutti vain marginaalisen reaktion. Peptidi 1 oli tehokas immunogeeni ilman, että sitä oli kytkettävä KLH-kanta-jaan. Vaikkakin voimakkuus heikkeni ajan kuluessa, aikaiset verenvalutuskohdat osoittivat reaktioiden suunnan.

Sen määrittämiseksi, kykenevätkö eri peptidejä vastaan muodostetut vasta-aineet reagoimaan HBsAg-molekyylien kanssa, tutkimme niiden kykyä immunosaostaa radiojodattua HBsAg, joka oli puhdistettu hepatiitti B Dane'n hiukkasista. Kun HBsAg suspen-doitiin RIPA-puskuriin, seitsemästä vasta-aineesta, jotka reagoivat kyseistä peptidiä vastaan, neljä saosti myös HBsAgrn. Tarkemmin sanoen peptidien 1, 3, 4 ja 6 vasta-aineet reagoivat puhdistetun HBsAgrn kanssa, kun taas peptidien 5, 5a ja 6a vasta-aineet eivät reagoineet kuten eivät myöskään ne anti-seerumit, jotka eivät nähneet kohdepeptidiä (4a, 8 ja 8a). Peptidi 2 antiseerumi reagoi jälleen marginaalisesti. Taulukossa 2 esitetystä tutkimuksesta on selvää, että identtisesti käsiteltyjen kaniinien seerumeiden välillä esiintyy vaihtelua. Kaikissa eläimissä lukuunottamatta yhtä eläintä nro 03302 aikaiset verenvalutukset ennustivat kolmen kuukauden reaktion. Peptidi nro 8 ei liuennut kovin hyvin ja siten kahden kaniinin reagoimattomuutta sen suhteen on pidettävä alustavana ottaen huomioon, että emme liukoisuuden vuoksi kyenneet määrittämään, kuinka tehokkaasti se kytkeytyi KLH-kantajaan.

Taulukosta 2 käy ilmi useita mielenkiintoisia, yksittäisiä peptidejä koskevia piirteitä. Peptidi nro 6 on erittäin immu-• nogeeninen ja indusoi vasta-aineen, joka reagoi sekä itsensä että natiivin HBsAgrn kanssa. Kuitenkin peptidi nro 6a (peptidin 6 C-päätteinen 6 aminohappoa) ei indusoi natiivin HBsAgrn kanssa reaktiivista vasta-ainetta, vaikka se pystyy indusoimaan vasta-aineen itselleen. Toisaalta peptidi nro 4 kykenee indusoimaan vasta-aineen itselleen ja natiiville HBsAg:lie, kun taas C-päätteinen heksameeri (peptidi nro 4a) ei tee kumpaakaan. Peptidi nro 1 on erityisen mielenkiintoinen

II

43 8 3 6 6 2 kahdelta kannalta. Ensiksikin sen immunogeenisuus ei riipu kantajasta, mahdollisesti, koska se on riittävän pitkä indusoimaan itse vasta-aineen. Vieläkin mielenkiintoisempaa on kuitenkin se, että sen kyky indusoida natiivin HBgAg:n kanssa reaktiivinen vasta-aine riippuu pH-arvosta, jota käytetään immunogeenin 1iuentamiseen. Peptidi nro 1 on täysin liukoinen pH-arvossa 5,3 ja ilmentää 62 % vapaata kysteiiniä. Tässä pH-arvossa liuennettua peptidiä vastaan muodostetut vasta-aineet tunnistavat kohdepeptidin sekä natiivin HBsAg:n. Sen sijaan peptidi liukenee tuskin lainkaan (alle 15 %) pH-arvossa 8,5 eikä ilmennä vapaata kysteiiniä. Tässä pH-arvossa indisoituna peptidi aiheuttaa huonon reaktion itseään kohtaan eikä lainkaan reaktiota HBsAg:lle.

Vaikkakin RIPÄ-puskurin ei voida odottaa denaturoivan HBsAg, halusimme tutkia molekyylin immuunireaktiivisuutta enemmän fysiologisissa olosuhteissa. Antigeeni suspendoitiin siten PBS-puskuriin (0,15m NaCl , lOmM natriumfosfaatti, pH 7,5) ja saatettiin reagoimaan erilaisen anti-peptidiseerumien kanssa. Kaikki seerumit reagoivat PBS-puskurissa HBsAg:n kanssa samalla tehokkuudella kuin RIPA-puskurissa (arvoja ei ole esitetty). Vasta-aineet tunnistavat siten molekyylin olosuhteissa, jotka approksimoivat sen natiivia tilaa. Tällaisten peptidien vasta-aineiden voidaan siten odottaa toimivan sekä in vivo että in vitro.

Sen määrittämiseksi, mikä Dane'n hiukkasten molekyyli (molekyylit) reagoi näiden synteettisten peptidien vasta-aineiden kanssa, puhdistetut Dane'n hiukkaset (serotyyppi adw) hajotettiin detergentillä ja proteiinit radiojodattiin. Leimatut proteiinit saostettiin erilaisilla antipeptidiseerumei11 a ja sakoissa olevat komponentit analysoitiin SDS-polyakryyli-amidigeeleillä. Natiivin HBsAg:n kanssa reaktiiviset vasta-aineet saostivat Dane'n hiukkasista spesifisesti kaksi pää-komponenttia, joiden molekyylikoot olivat suurin piirtein 44 8 3 6 6 2 28.000 ja 23.000 daltonia, kuvio 9. 28.000 ja 23.000 daltonin komponentit vastaavat aikaisemmin kuvattuja (Dane, D.S., Cameron, C.H. ja Briggs, M. (1970) Lancet 695-698. Peterson, D.L., Roberts, I.M. ja Vyas, G.N. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei, U.S.A. 74, 1530-1534. Shih, J., ja Gerin, J.D. (1977) J. Virol. 21, 347-357) HBsAg:n kahta päämuotoa (I ja II), jotka eroavat glykolysaatioasteensa suhteen. Lisäksi peptidin 3 (kuvio 3) ja peptidin 6 (arvoja ei esitetty) vastaiset antiseerumit reagoivat myös proteiinien kanssa, joiden liikkuvuudet ovat noin 47.000 ja 170.000 daltonia ja jotka luultavasti merkitsevät multimeerimuotoja tai prekursorimolekyylejä. 47.000 daltonin komponentti on mitä todennäköisimmin HBsAg:n dimeerimuoto (Mishiro, S., Imai, M., Takahashi, K. Machida, A., Gotanda, T., Miyakawa, Y ja Mayumi, M., (1980), J. Virol. 124, 1589-1593. Koistinen, V., (1980), J. Virol. 35, 20-23. Vasta-aineet suuntautuvat siten proteiinia vastaan, jota löydetään tunnetussa hepatiitti B etiologisessa aineessa.

Käsitys molekyyleistä, jotka ovat HBsAg:n prekursoreita, sopii yhteen Robinson'in tietojen kanssa, joissa tryptiset tunnis-tamisalueet osoittavat, että molekyylipainoltaan suurempien muotojen eräät täplät vastaavat HBsAg-täpliä, kun taas toiset eivät näin tee (Robinson, W., henkilökohtainen tiedonanto).

Kun taas kaikki HBsAg:n kanssa reaktiiviset vasta-aineet havaitsevat HBeAg:n 23.000 ja 28.000 daltonin muodot tämän hiukkasissa, vain jotkut havaitsevat molekyylipainoltaan suuremmat muodot. Suurempien muotojen konformaatio ja/tai glykosylaatioaste ovat oletettavasti sellaisia, että kyseinen peptidi on kätkettynä. Vaihtoehtoisesti prekursorin käsittelyssä voi tapahtua sitoutumista proteiineihin tai solurakenteisiin, mikä piilottaa kohdepeptidin.

Edellä olevan perusteella seuraavilla peptideillä todettiin samoilla menetelmillä olevan spesifisiä antigeenideterminantti-ominaisuuksia hepatiitti B:n suhteen: il 45 83662

PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArg

ThrCysMetThrThrAlaGlnGlyThrSerMetTyrProSerCys

Vasemmat ja oikeat puoliskot olivat myös spesifisiä antigeeni-determinantteja ja, kuten erikseen tarkasteltiin, tunnetuista antigeenideterminanteista valitut, kuuden tai useamman aminohapon peptidialueet toimivat myös spesifisinä antigeenideter-minantteina, kun ne on valmistettu ja todistettu tässä yhteydessä kuvatulla menetelmällä.

Suu- ia sorkkatauti

Samalla menetelmällä johdettiin ja valmistettiin myös suu- ja sorkkatautivirukselle synteettiset peptidispesifiset anti-geenideterminantit, joilla on seuraavat sekvenssit.

ACCACTTCTGCGGGCGAGTCAGCGGATCCTGTCACCACCACCGTTGAAAACTACGGTGGC ThrThrSerAlaGlyOluSerAlaAspProValThrThrThrValGluAsnTyrGlyGly GAAACACAGATCCAGAGGCGCCAACACACGGACGTCTCGTTCATCATGGACAGATTTGTGAAG GluThrGlnl1eGlnArgArgGlnHisThrAspValSerPhel1eMetAspArgPheValLys sekä luonnollisesti koko genomin koodaama peptidi, (Kupper, H., Keller. W., Kunz, C., Forss, S., Scholler, H., Franze, R., Strohmair, K., Marquardt, 0., Zaslovsky, V.G., ja Hofschneider, P.H., "Cloning of cDNA of major antigen of foot and mouth disease virus and expression in E. coli.," Nature 289: 555-559 (1981), kts. kuvio 10).

Influenssa

Yleismenetelmää sovellettiin valmistukseen, jossa lähdettiin influenssakannan X-47 genomista (M. Verhoeyen, R. Fong, W. Min jou, R. Devos, D. Heijlebroek, E. Samon & W, Fiers, (1980) Nature 286. 771; A.G. Porter, C. Barber, N.H. Carey, R.A. Hallevell, G. Therlfall, J.S.Emtage, (1979) Nature 282, 46 83662 471) ja käyttämällä lähisukuisista aineista saatua informaatiota. Näiden avulla ennustettiin potentiaaliset spesifiset antigeenideterminanttialueet (I.A. Wilson, J.J. Skehel, D.C. Wiley (1981) Nature 289, 366). Joukko peptidialueita, jotka on koodattu kuviossa 11 merkityistä genomialueista, on syntetisoitu ja osoitettu y1eismenetelmä oikeaksi. Lisätodisteita hankitaan parhaillaan eikä ole epäilystäkään, että menetelmä yleisesti tuo esiin keinon lähestyä tässä kuvatun tyyppisten antigeenien ja antigeeni- ja vasta-ainevalmisteiden valmistusta.

Itsenäiset antiqeeni-kantaiat

Yleensä on välttämätöntä kiinnittää spesifinen antigeenideter-minantti-peptidi kantajaan, jotta voitaisiin käynnistää isäntäeliössä vasta-ainereaktio. Eräissä tapauksissa, jos peptidi on riittävän suuri peptidi voi toimia kantajana. Vaikkakin laboratoriokäyttöön on saatavissa monia kantajia, kliinisiin valmisteisiin hyväksyttyjen kantajien lukumäärä on todella hyvin rajoitettu. Nämä ongelmat vältetään oheisen keksinnön erään puolen avulla: Poly(peptidi)polymeerien ja kopolymeerien valmistaminen.

Sen jälkeen, kun spesifiset antigeenipeptidit on tunnistettu ja on osoitettu, että ne tuottavat vasta-aineita mielenkiinnon kohteena olevalle organismille, voidaan valmistaa antigeeni, joka muodostuu oleellisesti spesifisistä antigeenidetermi-nantti-peptideistä, jotka on yhdistetty toisiinsa saman peptidin toistuvien yksiköiden homopolymeereinä, kahden tai useamman spesifisen antigeenideterminantti-peptidin (jotka voivat käynnistää vasta-aineita luonnossa esiintyvälle samalle tai eri organismille) kopolymeereinä tai kopolymeereinä muiden peptidien kanssa, joista osa, tai ei mikään, ehkä ole anti-geenideterminantti. Peptidiketjujen yhdistämistekniikka on yleisesti tunnettu; tähän mennessä ei kuitenkaan ole ollut li 47 83662 mahdollista päästä kuvattuun tuotteeseen, mikä on uusi tulos, eikä myöskään ole ehdotettu poly(peptidispesifinen antigeeni-determinantti) polymeerien tai kopolymeerien valmistusta.

Tällaisesta antigeenistä on esimerkkinä kuviossa 12 esitetty hepatiitti B:n poly(spesifinen antigeenideterminanttipeptidi).

Liposomit

Liposomeja, jotka sisältävät spesifisiä antigeenideterminantti-pintaosia, valmistetaan yhdistämällä useita peptidispesifisien antigeenideterminantteja rasvahappo-osaan, esimerkiksi stea-ryyliosaan, ja saattamalla saadut stearyylipeptidit reagoimaan runsaslipidisen tuman kanssa. Stearyyliosat orientoivat itsensä ytimiä kohti ja "liukenevat" niihin, jolloin saadaan liposomi, jossa on useita spesifisiä antigeenideterminantti-peptideitä. Kaikki peptidit voivat olla samoja spesifisiä antigeenidetermi-nantteja tai spesifisen antigeenideterminantti-liposomin osana voidaan kiinnittää joukko saman tai eri organismien samojen tai erilaisten luonnossa esiintyvien antigeenien spesifisiä antigeenideterminantte ja. Edellä viitatun tyyppisiä antigeeni 1ipo-someja ei ole aikaisemmin ehdotettu eivätkä ne ole olleet mahdollisia.

Tarkastelu

Laajasti käsitettynä oheiset tutkimukset osoittavat, että voidaan valita tietty nukleotidisekvenssi, syntetisoida kemiallisesti useita peptidejä ennustetun proteiinin eri alueista ja eräillä näistä tuottaa natiivin rakenteen kanssa reagoivia vasta-aineita. Koska hepatiittimolekyyliä ei valittu tutkimukseen minkään, sellaisen rakenteellisen ominaisuuden vuoksi, joka olisi viitannut ainutlaatuisiin onnistumismahdol-lisuuksiin, tuloksemme viittaavat siihen, että käytetty 48 83662 strategia on yleinen ja että se toimii mille tahansa molekyylille, mikäli tutkitaan riittävän paljon alueita. Tähän mennessä oppimiemme "sääntöjen" perusteella huonoja valintoja ovat peptidit, joilla on rajoitettu liukoisuus tai jotka sisältävät vähemmän kuin kuusi aminohappoa. Kaikki tuottokykyiset peptidit sisälsivät yhden proliinin tai useampia, mikä seikka sopii yhteen proliinin tunnettuun esiintymiseen käännöskohdassa.

Tässä tutkimuksessa osoittautui hyödylliseksi kuudesta liukoisesta peptidistä neljä peptidiä, joissa oli 10 - 34 tähdettä. Näin on nyt mahdollista soveltaa yleisesti tätä tekniikkaa tuntemattomien proteiinien löytämiseen geeniensä tunnetuista nukleotidisekvensseistä.

Hepatiitti B pinta-antigeenin aikaisempien tutkimuksien perusteella on päätelty, että se oli molekyyli, joka kriittisesti riippui konformaatiosta valmistettaessa natiivin rakenteen kanssa reagoivia vasta-aineita. Vyas ja hänen kolleegansa ehdottivat, että hepatiitti B antigeenin disulfidisidosten pelkistäminen ja alkylointi hävitti kokonaan antigeenisyyden (Vyas, G.N., Rao, K.R. ja Ibrahim, A.B. (1972) Science 178: 1300-1301). Oheiset tulokset sitä vastoin osoittavat, että HBsAg:ssä on determinantteja, jotka eivät riipu mistään muusta konformaatiosta kuin mikä voidaan saavuttaa lyhyillä peptideillä. Kun näitä kahta tutkimusta tarkastellaan yhdessä, voidaan päätellä, että suuremman denaturoidun rakenteen osana oleva suora sekvenssi, vaikkakin se olisi alkyloitu, ei tuota natiivin molekyylin kanssa reagoivia vasta-aineita, kun taas sama sekvenssi, jota vierekkäiset aminohapot eivät kahlehdi, tuottaa tällaisia vasta-aineita.

HBsAg:ssä on alueita, joita ei vielä ole tutkittu käyttämällä synteettisiä polypeptidejä. Tiedämme hyvin vähän asemien 110 - 140 ja 162 - 210 välissä sijaitsevasta molekyylistä. Erityisen mielenkiintoinen on välillä 110 ja 140 sijaitseva il « 83662 hydrofii1inen alue, koska eri sekvenssit vaihtelevat huomattavasti. Mielenkiintoista on, että Pasek'in et ai tutkimuksessa Dane'n hiukkasten lähteenä käytetty plasma oli kompleksinen serotyyppi (adw ja agw) ja että nämä tekijät havaitsivat mikroheterogeenisuutta HBsAgrtä vastaavan sekvenssin alueella. Asemien 110 - 135 välinen sekvenssin vaihtelu vastaa mahdollisesti molekyylialuetta, joka antaa HBsAgrlle tyyppispesi-fisyyden. Myös asemien 40 - 50 välisessä alueessa esiintyy merkittävää heterogeenisyyttä mainitun kolmen nukleotidisek-venssin kesken. Tässä suhteessa on mielenkiintoista, että peptidiä nro 5, joka vastaa Pasek'in et ai nukleotidisekvens-sistä ennustettua aluetta, vastaan valmistetut vasta-aineet eivät reagoi testikuoremme (serotyyppi adw) kanssa. Tämä voi johtua siitä, että tällä alueella, joka mahdollisesti on toinen alue, jossa esiintyy tyyppispesifistä vaihtelua, valitsemamme peptidit eivät vastaa käyttämämme kuoren peptideitä.

Tässä esitetyt tulokset vahvistavat, että yleisesti voidaan syntetisoida nukleiinihapposekvensseistä ennustettuja peptidejä ja tuottaa natiivin molekyylin kanssa reagoivia vasta-aineita. Nämä vasta-aineet ovat ainutlaatuisia reagensseja sikäli, että ne reagoivat kokeen tekijän jo etukäteen tunteman natiivin molekyylin pienen alueen kanssa. Tällä tavoin valmistetut vasta-aineet eroavat siten hybridonista, jotka, vaikkakin ne ovat hyödyllisiä kokonaisten molekyylien tutkimusten alussa, on vielä karakterisoitava analysoimalla proteiinialueiden hienorakenne .

Synteettiset peptidit, jotka on valmistettu käyttämällä nukleo-tidisekvenssejä sinikopioina, tulevat varmasti osoittautumaan ihanteellisiksi rokotuskäytössä. Esimerkiksi polypeptidien · yhdistelmä (esimerkiksi tämän tutkimuksen nrot 1, 3, 4 ja 6) suojaa laajasti hepatiitti B virusta vastaan ja välttää sellaiset biologiset muuttujat, kuten serotyyppien erilaisuudet so 83 662 ja infektoivan aineen antigeenin hidas muuttuminen sekä isäntä-eliön immuunireaktion yksilöllisyys.

On selvästi ymmärrettävä, että yksittäisiä aminohappoja voidaan korvata ja päästä ekvivalentteihin, kuten yleisesti tunnetaan, spesifisiin antigeenideterminantteihin, ja että täysin ekvivalenttien antigeenideterminanttien, kun ne on valmistettu ja todistettu tässä yhteydessä esitetyllä tavalla, peptidisek-venssin aminohapoissa voi esiintyä rajoitettu määrä erilaisuuksia. Kaikki tämä sisältyy tämän keksinnön piiriin.

Yleinen sovellutus Tämän keksinnön mukaista yleistä lähestymistapaa voidaan soveltaa kaikkiin patogeeneihin, joihin liittyy oiikopeptidi-antigeenideterminantti, joka käynnistää isäntäeliössä immunologisen reaktion.

. · Esimerkki - bakteerit

Esimerkiksi kun patogeeni on bakteeri, ja bakteerin vieminen isäntäeliöön käynnistää siinä bakteereita sitomaan ja neutraloimaan pyrkivien vasta-aineiden muodostumisen, se osa bak-teerigenomista, joka koodaa todennäköisen antigeenidetermi-nantin, identifioidaan käyttämällä tunnettua geenitekniikkaa. Tämän jälkeen kloonataan mielenkiinnon kohteena oleva geeni ja sen nukleotidisekvenssi määritetään käyttämällä tunnettua DNA:n -- kartoitustekniikkaa. Todennäköisen antigeeniproteiinialueen aminohapposekvenssi määritetään nukleotidisekvenssistä ja - geneettisestä koodista. Sen jälkeen syntetisoidaan kemiallisesti suuri joukko mahdollisia antigeenideterminantteja, kytketään nämä kantajaan mahdolliseksi antigeeniksi ja viedään sopivaan isäntäeliöön. Tunnetuilla immunokemiallisilla menetelmillä määritetään näin muodostettu potentiaalinen antigeeni, li si 83662 joka käynnistää bakteereita sitovien ja neutraloivien ja isän-täeliölle haitattomien vasta-aineiden muodostumisen. Näin määritettyä antigeeniä, joka indusoi halutun immunologisen suojavaikutuksen, valmistetaan sen jälkeen missä tahansa halutussa mitassa ja sitä voidaan käyttää tuottamaan isäntäeliössä suojaavia vasta-aineita. Vasta-aineet voidaan ottaa talteen ja valmistaa oiikospesifinen vasta-aine, jota voidaan esimerkiksi käyttää diagnoosissa.

Esimerkki - taudit

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää valmistettaessa diagnostisia vasta-ainevalmisteita, joilla eläimissä tunnistetaan bakteeritauteja, kuten pernarutto (Bacillus anthracis), ritinerutto (Clostridium chauvoei) ja sikarutto (Erysipelothrix rhusiopathiae) sekä virustauteja, kuten viruksen aiheuttama sikarutto, suu- ja sorkkatauti ja vesikauhu. Keksinnön mukaisella menetelmällä tai menetelmillä voidaan valmistaa vasta-aineita bakteeritaudeille, kuten kurkkumätä (Corynebacterium diphtheriae), tulirokko (Streptococcus pyogenes), tuberkuloosi . (Mycobacterium tuberculosis), ja hinkuyskä (Bordetella pertussis), ja lavantauti (Salmonella typhi) ja virustaudeille, kuten isorokko (Variola major, Variola minor), tuhkarokko (rubeola), vihurirokko (rubella), sikotauti (epideeminen parotiitti), infulenssa ja polyomyeliitti. Edellä kuvattujen bakteeri- ja virustautien diagnosointia varten tarkoitettujen vasta-ainevalmisteiden valmistus on luonnollisesti vain esimerkki tämän keksinnön laajemmasta piiristä ja sovellettavuudesta .

Sienet, hiivat, somaattiset solut Tämän keksinnön mukaista käsitettä ja menetelmiä voidaan soveltaa myös silloin, kun halutaan estää patogeeninen reaktio 52 83 662 muille organismeille, kuten sienille, hiivoille ja patogeenisille somaattisten solujen palasille, kun tässä reaktiossa vasta-aineen ja antigeenin välinen sitomisreaktio inaktivoi organismin tai neutraloi tai estää organismin isäntäeliössä aiheuttaman patogeenisen reaktion. Täysin samaa menetelmää sovelletaan sieniin ja hiivoihin; tunnistetaan se organismin genomin osa, joka koodaa polaarisen proteiinin. Sen jälkeen mielenkiinnon kohteena oleva geeni kloonataan ja määritetään sen nukleotidisekvenssi. Nukleotidisekvenssin avulla määritetään tämän jälkeen todennäköisen antigeeniproteiinin aminohappojärjestys ja syntetisoidaan kemiallisesti suuri määrä mahdollisia antigeenideterminantteja, kytketään nämä kantajaan ja injisoidaan sopivaan isäntäeliöön. Kuhunkin tällaiseen "antigeeniin" kohdistuva immunologinen reaktio määritetään ja tunnistetaan kyseinen, immunologisen mielenkiinnon kohteena oleva spesifinen antigeenideterminantti, joka liittyy kyseiseen antigeeniin ja joka on tuottanut vasta-aineita organismille ja joka ei reagoi isäntäeliölle haitallisesti. Sen jälkeen syntetisoidaan kemiallisesti näin tunnistettu peptidi, joka sisältää spesifistä antigeenideterminanttia, haluttu määrä. Diagnostisiin tai muihin tarkoituksiin voidaan myös ottaa talteen oligo-spesifisiä vasta-aineita.

Esimerkki - diagnostiset tekniikat

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää sellaisten diagnostisten testien, kuten immunomääritys-testien valmistamiseen, joissa on oltava vasta-aineita etsittävälle organismille tai synteettinen antigeeni, joka matkii etsittävän organismin determinanttia. Tällainen diagnostinen tekniikka voi esimerkiksi olla entsyymi-immuunimääritys, radioimmuuni-määritys, fluoresenssi-immuunimääritys tai jokin muu tekniikka, jossa joko vasta-aine tai antigeeni leimataan jollakin havaittavalla leimalla.

53 83662

Keksinnön mukaisen menetelmän soveltuvuus diagnostisten testien valmistamiseen määritettiin käyttämällä Voller'in et ai. hahmottelemaa kaksoisviivavasta-ainetekniikkaa "Enzyme Immune Assays in Diagnostic Medicine", Bulletin of the World Health Organization, Volume 53, sivut 55-65 (1976), an ELISA Test. Käytettiin anti-R-seerumia ja R pentadekapeptidi-antigeeniä (valmistettu edellä kuvatulla tavalla). Osa vasta-aineesta konjugoitiin Nakana'n ja Kawaoi'n perjodidimenetelmäl1ä Journal of Histochemistry and Cytochemistry. Volume 22, sivut 1084-1091 (1974) horseradishperoksidaasientsyymin kanssa. Tunnetun entsyymi-immuunimääritystekniikan mukaisesti päällystettiin Linbro'n levy puhdistetulla vasta-aineella ja pestiin. Levyn joihinkin syvennyksiin lisättiin sen jälkeen R-proteiinia, minkä jälkeen inkuboitiin ja pestiin toisen kerran. Lopuksi kaikkiin syvennyksiin lisättiin vasta-aineen ja peroksidaasin konjugaattia ja inkuboitiin toisen kerran ja pestiin kolmannen kerran. Lisättäessä syvennyksiin substraattiaksaatiin positiivinen reaktio (värireaktio) niissä syvennyksissä, joihin antigeeniä oli lisätty, mutta ei niissä syvennyksissä, joihin antigeeniä ei oltu lisätty, mikä osoitti testin käyttökelpoisuuden.

Samalla tavoin voidaan tehdä muita immuunimääritystestejä käyttämällä tuotteita, jotka on valmistettu oheisen keksinnön mukaisella menetelmällä.

Esimerkki - passiivinen immunisointi

Useilla taudeilla suojavaikutus saadaan aikaan injisoimalla suojattavaan kohteeseen rokotetta (joka sisältää heikennettyä organismia, jolloin kohde muodostaa vasta-aineita rokotteen sisältämää heikennettyä organismia vastaan. Vaikkakin tätä tekniikkaa käytetään monilla taudeilla, on olemassa muita tauteja, joilla parhaana suojaustapana pidetään taudin vasta- 54 83662 aineen injisointia eikä itse sen aineen injisointia, joka saa kohteen tuottamaan tätä vasta-ainetta. Tämän tyyppistä immunisointia kutsutaan "passiiviseksi immunisoinniksi".

Niissä tapauksissa, joissa toivotaan passiivista immunisointia, oheisen keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää tuottamaan kyseisen tautiorganismin determinanttien vasta-aineita, joita voidaan sen jälkeen käyttää passiiviseen immunisointiin.

Edellä kuvatulla tavalla valmistettua R-pentadekapeptidi-antigeeniä vastaan tuotettuja vasta-aineita on konjugoitu ferritiinin kanssa (Singer, S.J. ja Schick, A.F., J. Biophvs. Biochem. Cvtol. 9:519 (1961)) ja saatettu reagoimaan niin, että virushiukkasten antigeenikohdat ovat sitoutuneet, jolloin virus on saatu passivoitua. Kuvion 6 valokuvassa on esitetty ferritiinin avulla visualisoitu virushiukkasen pinta, jonka antigeenikohdat on sidottu vasta-aineilla indusoidun synteettisen antigeenin avulla.

Vastaavalla tavalla saadaan keksinnön mukaisesti valmiste, joka indusoi antigeenin tuoton isäntäeliössä. Geenitekniikan avulla identifioidaan se genomiosa, joka koodaa isäntäeliössä antigeenin tuoton. Alustavasti voidaan identifioida useampi kuin yksi osa ja viedä kukin osa lopulliseen vaiheeseen asti, jossa osoitetaan, mikä osa todella koodaa indusoidun antigeenin antigeenideterminantin. Sen jälkeen kloonataan jokainen mielenkiintoinen geeni ja määritetään se nukleotidisekvenssi ja tästä määritetään tavanomaisella geenikoodauksel1 a mielenkiinnon kohteena olevan peptidin aminohapposekvenssi. Vastaavat peptidit syntetisoidaan ja sidotaan kantajiin potentiaalisiksi antigeeneiksi, joissa antigeenideterminantti on peptidiketju. Nämä antigeenit viedään isäntäeliöön ja tavanomaisin immuno-kemiallisin menetelmin identifioidaan antigeeni, joka käyn-^ nistää indusoidun antigeenin vastafeineiden tuoton. Kun tätä 55 83662 antigeeniä injisoidaan isäntäeliöön, muodostuu vasta-aineita, jotka sitovat ja inaktivoivat organismin muodostaman mutta organismissa ilmentymättömän patogeenisen antigeenin ja estävät isäntäeliössä patogeenisen vaikutuksen tai rajoittavat sitä. Vasta-aineet voidaan luonnollisesti ottaa talteen. Esimerkki oheisen keksinnön tästä sovellutuksesta on Rous'in sarkooma-viruksen indusoiman syövän diagnostisen oiigospesifisen vasta-aineen valmistaminen.

Myös muut patogeenit, mukaanlukien kemialliset patogeeniset aineet voivat indusoida antigeenisten proteiinien muodostumisen isäntäeliössä. Oheinen keksintö käsittää antigeenistä proteiinia koodaavan geenin tunnistamisen, riippumatta, onko se patogeenisessä organismissa tai isäntäeliössä, geenin sekvens-soinnin, spesifisen antigeenideterminantin sisältävän peptidin syntetisoinnin ja vasta-aineen valmistamisen, kuten tässä yhteydessä on kuvattu.

Teollinen soveltaminen

Kyvyllä valmistaa antigeenejä, jotka indusoivat vain yhden ainoan immunologisen reaktion, patogeenin vasta-aineiden valmistamisella ja sellaisten vasta-aineiden valmistamisella, jotka sitovat ja inaktivoivat vain yhden antigeenideterminantin, on valtava teollinen ja taloudellinen merkitys esimerkiksi karjataloudessa puhumattakaan näiden menetelmien tärkeydestä yksittäisten ihmisten elämässä. Oheista keksintöä voidaan soveltaa valmistettaessa vasta-aineita eläinten ja ihmisten tautien diagnosointia varten.

Claims (8)

1. 56 8 3662
2. 1. Diagnostinen vasta-aine, joka on muodostettu ja otettu talteen isäntäeliöstä, jolle on annettu tehokas määrä anti-geenipeptidia tai -peptidejä, tunnettu siitä, että antigeenipeptidi sisältää aminohapposekvenssin, joka pääasiassa vastaa luonnollista, patogeeniin liittyvän proteiinin anti-geeniaminohapposekvenssiä, kun mainittu peptidi on liitetty kantajaan ja annettu animaaliselle isäntäeliöl1 e, joka indusoi vasta-aineiden muodostuksen, jotka reagoi mainitun luonnollisen patogeeniin liittyvän proteiinin kanssa, ja peptidi, luettu vasemmalta oikealle ja pääteaminoryhmästä päätekarboksiryhmän suunnassa, on jokin seuraavista kaavoista (a) LeuThrGlnGlnPheHisGlnLeuLysProI1eGluCysGluPro; (b) IleLeuAsnArgLeuValGlnPheValLysÄspArgl1eSerValValGlnAlaLeu VaiLeuThrGlnGlnPheHisGlnLeuLysProI1eGluCysGluPro; (c) PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArgThrCysMetThrThrAla GlnGlyThrSerMetTyrProSerCys; (d) PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArgThr; (e) GlnAspLeuProGlyAsnAspAsnAsnSerThrAlaThrLeuCysLeuGlyHisHis AiaValProAsnGlyThrLeuValLysThrIIeThrAsnAspGlnl1eGlu; (f) AsnAlaThrGluLeuValGlnSerSerSerThrGlyLysI1eCysAsnAsnProHis ArgI1eLeuAspGlyI1eAsnCys; (g) CysAsnAsnProHisArgl1eLeuAspGlyI1eAsnCysThrLeul1eAspAlaLeu LeuGlyAspProHisCysAspGlyPheGlnAsnOluLysTrpAspLeuPhe; : :(h) AspTyrAlaSerLeuArgSerLeuValAlaSerSerGlyThrLeuGluPhelleAsn GluGlyPheAsnTrpThrGlyValThrGlnAsnGlyGlySerSerAlaCys; (i) SerGlyLysValThrValSerThrLysArgSerGlnGlnThr11 el 1eProAsnVal OlySerArgProTrpValArgGlyLeu; j) CysProLysTyrValLysGlnAsnThrLeuLysLeuAlaThrGlyMetArgAsnVal ProGluLysGlnThrArg; ·(H) G1nAspLeuProGlyAsnAspAsnAsnSerThrAlaThrLeuCys; :(1) CysLeuGlyHisHisAiaValProAsnGlyThrLeuValLysThrI1eThrAsnAsp GinileGluValThrAsnAlaThrGlULeuValGlnSerSerSerThrGlyLysIle Cys; 57 8 3 6 6 2 (m) CysAsnAsnProHisArgI1eLeuAspGlylleAsnCys; (n) CysAsnAsnProHisArglleLeu; (o) HisCysAspGlyPheGlnAsnGluLysTrpAspLeuPheValGlu; (p) HisCysAspGlyPheGlnAsnGluLysTrpAspLeuPheValGluArgSerLysAla PheSerAsnCyrTyrProTyrAspValProAspTyrAlaSerLeuArgSer; (q) ValThrGlnAsnGlyGlySerSerAlaCysLysArgGlyProAspSer; (r) CysLysArgGlyProAspSerLysArgGlyProAspSerGlyPhePheSerArgLeu AsnTrpLeuTyr; (s) CysLysArgGlyProAspSerLysArgGlyProAspSerGlyPhePheSerArgLeu AsnTrpLeuTyrLysSerGlySerTrpTyrProValGlnAsnValTrpMetProAsn AsnAspAsnSer; (t) ÄsnSerAspLysLeuTyrI1eTrpGlyValHisHisProSerThrAspLysGluGln ThrAsnLeuTyrVal; (u) HisHisProSerThrAspLysGluGlnThrAsnLeuTyrVal; (v) AspProValThrThrThrValGluAsnTyrGlyGlyGluThrGlnlle; (w) AsnTyrGlyGlyGluThrGlnl1eGlnArgArgGlnHisThrAspVal; (x) GlnArgArgGlnHisThrAspValSerPhelleMetAspArgPheValLys; (y) ThrThrSerAlaGlyGluSerAlaAspProValThrThrThrValGluAsnTyr GlyGlyGluThrGlnlleGlnArgArgGlnHisThrAspValSerPhel1eMet AspArgPheValLys; (z) CysLeuGlyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHisSerProThrSerAsnHis SerProThrSerCysProProThrCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArg Phelle; ' -Caa) Gl uAsnl 1 eThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuVal LeuGl n; "·'(bb) LeuThrArglleLeuThrIleProGlnSerLeuAspSerTrp; : : (cc) SerLeuAsnPheLeuGlyGlyThrThrValCysLeuGlyGlnAsn; (dd) ValCysLeuGlyGlnAsn; (ee) LeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeu; ja (ff) mikä tahansa peptidi, joka sisältää ainakin vähintään .kuusi aminohappoa sisältävän sekvenssin, jotka aminohapot on ;esitetty sekvensseissä (a)-(ee). : 2..' Patenttivaatimuksen 1 mukainen vasta-aine, tunnettu •siitä, että peptidit, luettuna vasemmalta oikealle ja pääte- 58 83662 aminoryhmästä päätekarboksiryhmän suuntaan, vastaavat jotakin seuraavista kaavoista: (a) LeuThrGlnGlnPheHisGlnLeuLysProIleGluCysGluPro; (b) IleLeuAsnArgLeuValGlnPheValLysAspArgIleSerValValGlnAlaLeu ValLeuThrGlnGlnPheHisGlnLeuLysProIleGluCysGluPro; (c) PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArgThrCysMetThrThrAla GlnGlnThrSerMetTyrProSerCys; (d) PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArgThr; (e) GlnAspLeuProGlyAsnAspAsnAsnSerThrAlaThrLeuCysLeuGlyHisHis Ai aVaiProAsnGlyThrLeuValLysThr11eThrAsnÄspGlnl1eGlu; (f) AsnAlaThrGluLeuValGlnSerSerSerThrGlyLysIleCysAsnAsnProHis ArgIleLeuAspGlylleAsnCys; (g) CysAsnAsnProHisArglleLeuAspGlyl2 eAsnCysThrLeuIIeAspAla LeuLeuGlyAspProHisCysAspGlyPheGlnAsnGluLysTrpAspLeuPhe; (h) AspTyrAlaSerLeuArgSereuValAiaSerSerGlyThrLeuGluPhel1eAsn GluGlyPheAsnTrpThrGlyValThrGlnAsnGlyGlySerSerAlaCys; (i) SerGlyLysValThrValSerThrLysArgSerGlnGlnThrFlel 1eProAsnVal GlySerArgProTrpValArgGlyLeu; (j) CysProLysTyrValLysGlnAsnThrLeuLysLeuAlaThrGlyMetArgAsn ValProGluLysGlnThrArg, ja (k) peptidi, joka sisältää ainakin yhden vähintään kuusi amino-happoa sisältävän sekvenssin, jotka hapot on valittu sekvens- ;· seistä (a) - (j) ,
3. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen vasta-aine, t u n -n e t t u siitä, että synteettinen peptidi on sidottu kantajaan.
4. 4. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vasta-aine, tunnettu . •siitä, että kantaja on lipidiryhmä.
5. 5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen vastaaine, tunnettu siitä, että synteettiset peptidit on liitetty toisiinsa toistuvina yksikköinä. 59 83662
6. 6. Patenttivaatimuksen 7 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että se pääasiassa sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista kahta erilaista synteettistä peptidiä, jotka on liitetty toisiinsa kopolymeerina.
7. 7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen vastaaine, tunnettu siitä, että se pääasiassa sisältää lipirikasta ydinryhmää, joka sisältää useita jonkin vaatimuksen 1-3 mukaista synteettistä peptidiä liitettynä rasvahapporyhmään.
8. 8. Menetelmä valmistaa diagnostinen vasta-ainevalmiste, joka jäljittelee luonnollisessa, eläinpatogeeniin liittyvässä esiintyvää antigeenistä determinattia, tunnettu siitä, että (a) syntetisoidaan kemiallisesti määrätty määrä peptidiä, joka ei sisällä (1) luonnossa esiintyvää proteiinia ja sen fragmentteja, (2) kilpailevia ja häiritseviä proteiineja, ja (3) viraalisia genoomeja, bakteerinukeliini-happoja ja endotoksiineja, jolla peptidillä on ainakin neljän aminohapon sekvenssi, joka jäljittelee luonnollisessa, patogeeniin liittyvässä proteiinissa esiintyvää antigeenideterminantin aminohapposekvenssiä ja jonka molekyy1ipaino on pienempi kuin luonnollisen, patogeeniin liittyvän proteiinin, (b) sidotaan antigeenipeptidi kemiallisesti kantajaan konju-gaatin muodostamiseksi, (c) annetaan isäntäeliöl1 e sellainen määrä kemiallisesti syntetisoitua peptidiä, joka määrä on riittävä indusoimaan vasta-aineiden muodostusta isäntäeliössä, (d) analysoidaan näin muodostuneiden vasta-aineiden kyky reagoida mainitun luonnollisen, animaaliseen patogeeniin liittyvän proteiinin kanssa ja suojata isäntää, 60 83662 (e) tuotetaan suurempia määriä kuin vaiheessa (a) kemiallisesti syntetisoitua peptidiä, joka indusoi vasta-aineita, jotka reagoivat luonnollisen, animaalipatogeeniin liittyvän proteiinin kanssa ja suojaa isäntää, ja (f) otetaan vasta-aineet talteen isäntäeliöstä. Il 6i 8 3662