NO812341L - Syntetisk peptid-, spesifikk antigenisk determinant og fremgangsmaate til fremstilling av antigeniske materialer derfra - Google Patents

Abstract

Et spesifikt- syntetisk peptid av høy renhets-. grad, fremstilles ved å bestemme ut fra en DNA-sekvens og deretter syntetisere et peptid som svarer til en mulig antigenisk determinant,. som kan være kjent eller ukjent, hos et naturlig antigenisk protein og binde det syntetiske pep-. tid til en bærer. Det syntetiske antigen kan brukes til å fremstille en vaksine som, når den innføres i en vert, initierer produksjon i verten av antistoffer mot det naturlige protein, eller. celleformidlet respons mot det naturlige protein, eller begge deler, idet peptidet utgjør den spesifikt antigeniske determinant i det således fremstilte antigen.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av

nye syntetiske antigener basert på informasjon utledet fra DNA sekvenser og til bruken av disse antigenene i fremstilling av vaksiner, diagnostiske reagenser o.l. Oppfinnelsen ved-rører nærmere bestemt slike antigener som dannes ved å binde den syntetiske antigeniske determinant som immunologisk tilsvarer endel av et naturlig protein (antigen) til en bærer.

Tidligere er antigener blitt oppnådd på forskjellige måter, inkludert avledning fra naturlige materialer, binding av et hapten til en bærer og ved rekombinant DNA teknikk.

Sela et al., (Proe. Nat. Acad. Sei., USA, bind 68, nr. 7. sidene 1450-1455, juli 1971; Science, bind 166, sidene 1365-1374. desember 1969; Adv. Immun., bind 5, sidene 29-129,

1966) har også beskrevet visse syntetiske antigener.

Antigener avledet fra naturlige materialer er det uendelige antall av kjente antigener som opptrer naturlig,

slik som blodgruppe-antigener, HLA antigener, differensier-ings-antigener, virale og bakterielle antigener o.l. Betyde-lige anstrengelser er blitt nedlagt for å identifisere og studere disse antigenene i løpet av det siste århundre.

Visse "syntetiske" antigener er blitt fremstilt

ved å binde små molekyler (slik som f.eks. dinitrofenol)

til bærermolekyler, (slik som f.eks. serumalbumin fra okse),

og på denne måten fremstille antigener som vil forårsake fremstillingen av antilegemer til de bærerbundne små molekyler. Bærermolekylet er nødvendig fordi at det lille molekylet

selv ikke vil bli gjenkjent av immunsystemet i dyret som det er innført i. Denne teknikken har også vært utnyttet i iso-lerte tilfeller for å fremstille antigener ved å binde pep-tidfragmenter fra kjente proteiner til bærere, slik som beskrevet i de ovenfor nevnte artikler av Sela et al.

Mens denne hapten-bærerteknikken har vært til stor nytt for forskningen i dens undersøkelser av immunresponsens natur, har den ikke vært av betydningsfull nytte for fremstilling av antigener som kunne spille en rolle i diagnose eller terapi. Grunnene for denne mangel er flere.

For det første må en, for å kunne velge og bygge

opp en brukbar antigenisk determinant fra et patogent stoff (f.eks. hepatitis B virus) ved denne teknikken, bestemme hele proteinsekvensen hos det patogene stoffet, for å ha en rimelig sjanse til å lykkes. På grunn av vanskelighetene ved denne oppgaven, har det sjelden,' hvis noen gang, vært gjort.

For det andre, selv om en er villig til å bestemme hele proteinsekvensen hos det patogene stoffet, er det andre problemer. Særlig det at mange antigener, som er av interesse i denne sammenheng, er sjeldent eller ikke i det hele tatt, uttrykt i den vanlige patogene populasjonen. F.eks. fremtrer den patogene, antigeniske determinant hos gonococcer bare når de er i direkte kontakt med vertceller. Følgelig hender det at den vanlige måten å dyrke gonococcer på in vitro ikke gir det ønskede antigen. På samme er de onkogene proteiner hos kjente RNA og DNA virus ikke tilstede i virale partikler, men er bare å finne når viruset opptrer sammen med vertcellen. Følgelig kan man ikke oppnå disse proteinene ved de vanlige teknikker for isolering av virus og proteinrensing. Vaksiner fremstilles på den klassiske måten ved å innføre drepte eller svekkede organismer i verten sammen med egnede hjelpestoffer for å initiere den normale immunresponsen hos organismene, mens man unngår den patogene effekten av organismen i verten. Anvendelsen lider av de vel kjente begrensninger idet at det er knapt nok mulig å unngå patogenresponsen på grunn av kompleksiteten av vaksinen som ikke bare omfatter den ønskede antigeniske determinant, men mange beslektede og ubeslektede skadelige materialer som hos noen eller alle individer kan indusere eri uønsket reaksjon hos verten. F.eks. kan vaksiner fremstilt på den klassiske måten omfatte konkurrerende antigener som er skadelige for den ønskede immunrespons, antigener som omfatter ubeslektede immunresponser, nucleinsyre fra organismen eller kul-turen, endotoksiner og bestanddeler av ukjente sammensetninger og opprinnelse. Disse vaksinene, som er fremstilt fra komplekse materialer, har naturlig nok en relativt høy mulighet for å indusere konkurrerende autoimmune responser, selv fra

det ønskede antigen.

Rekombinant DNA teknikk har åpnet nye muligheter for vaksineteknologi som har den fordelen at fremstillingen begynner med et monospesifikt gen, mange av disse fordelene går imidlertid tapt ved fremstilling av antigen i E-coli eller andre organismer. Ved denne fremgangsmåten, innføres genet i et plasmid som igjen innføres i E-coli, som frem-stiller det ønskede protein sammen med andre metabolisme-produkter, alt i blanding med næringsmediet. Denne måten kompliseres ved usikkerheten om det ønskede protein vil være å finne blant produktene fra E-coli. Dette problemet viser seg ved vanskeligheten i fremstilling av interferon. Videre er det, selv om det ønskede protein blir fremstilt, usikkert hvorvidt det kan høstes eller ikke, eller hvorvidt det vil bli ødelagt under vekstprosessen til E-coli. Det er f.eks. vel kjent at fremmede eller endrede proteiner blir nedbrutt av E-coli. Selv om proteinet er tilstede i tilstrekkelige mengder til å være av interesse, må det like fullt separeres fra alle de andre produktene av metabolismen til E-coli, inkludert slike skadelige substanser som uønskede proteiner, endotoksiner, nucleinsyrer, gener og ukjente eller ubestemmelige substanser. Endelig, selv om det var mulig eller ble mulig med avanserte, nødvendigvis svært dyre, teknikker, å separere det ønskede protein fra alle andre produkter av metabolismen til E-coli, omfatter vaksinen fremdeles et helt protein som kan inkludere uønskede antigeniske determinanter, hvorav noen er kjent for å initiere svært alvorlige autoimmune responser. Det er således kjent at visse proteiner som ellers ville kunne være ansett som vaksiner, omfatter en antigenisk determinant som induserer slike alvorlige krossforbindelser eller bireaksjoner som forhindrer bruken av materialet som en vaksine. F.eks. ville en vaksine frembragt ved den nylige beskrevne rekombinante DNA teknikk, fra klonede streptococcer i et protein som kunne inkludere en antigenisk determinant som kan forårsake hjertesykdom, i tillegg til den ønskede antigeniske determinant. Et slikt materiale ville ha lite, om

noe, terapeutisk potensiale som vaksine.

Det er også mulig, ved å bruke hybridomateknikk,

å fremstille antilegemer til virale gen-produkter. Prinsip-pielt tillater hybridomateknikken en å begynne med en kompleks blanding av antigener og å fremstille spesifike antilegemer senere i prosessen.

Foreliggende oppfinnelse er derimot den motsatte fremgangsmåte, på den måten at vi starter med den antigeniske determinanten.i høyest oppnåelige renhet, og således unngår nødvendigheten av å rense det ønskede antigeniske produkt.

Hybridomaantilegemer er kjent for å ha lav til-trekningsgrad og lav bindingskonstant, og har derfor begrenset verdi.

I hybridomateknikk må man stole på fremstillingen av antigelemet av celler som er ondartede, med alle de derav følgende bekymringer med hensyn til separasjonsteknikker, renhet og sikkerhet.

Hybridomafremstilling er basert på vevkultur eller innføring i mus med den opplagte følge at fremstillingen er kostbar og at der er arvemessige variasjoner fra parti til parti.

Dessuten er det vanskelig å lage et hybrid til molekyler som utgjør bare en liten prosent-del av den komplekse blandingen som man må starte med.

Det var svært overraskende, og faktisk i strid med vanlig oppfatning i den molekylære biologien, at fremgangsmåten beskrevet nedenfor lyktes ved fremstilling av antilegemer som reagerte med naturlige proteiner fra urinlevkemi og hepatitis B virus. Overraskelsen var tosidig. For det første omfattet eksperimentet en mengde eventuelle hendelser som hver og en måtte utføres med hell, men hvor få var rutinemessige. Mange av disse trinnene var nødvendige ved fremstillingen av DNA sekvensene som utgjorde skjemaene for peptidsyntesen. Det var en overraskelse av så mange på hverandre følgende trinn, hvert og ett utsatt for tilfeldige hendelser forårsaket av deres biologiske natur, kunne gjen-nomføres. For det andre, var det en stor overraskelse at korte, lineære peptidkjeder kunne frembringe antilegemere-sponser hos dyr, og at de frembragte antilegemer ville gjen-kjenne de mye større og mer komplekse, naturlige proteinstruk-turer .

Når det gjelder det siste punkt, måtte følgende trinn utføres, og følgende overlegninger gjorde sannsynlig-heten for suksess til slutt liten, om ikke fjern. For det første, brukes det under kloning av en cDNA kopi av et RNA molekyl, det retrovirale enzymet reverse transkriptase for å polymerisere nucleotider som er komplementære til oppstartings-DNA. Påliteligheten ved en slik kopieringshendelse er slik at omkring et nucleotid av 5 00 feilkopieres. Videre innføres det en annen feilkilde, ettersom oppstartings RNA kopieres i den levende celle fra dens gen ved hjelp av enzymet RNA polymerase, et annet replikasjonsenzym som rime-ligvis er unøyaktig. cDNA kopien bindes deretter til en plasmidvektor, en prosess som ofte har vist seg å medføre omdannelse i det klonede DNA fragment. Plasmidet innføres så i en bakterie og transformerte kolonier som inneholder det rekombinante plasmidet velges ut. En koloni av transformerte bakterie fragmenteres ved utstrykning på en vekst-plate, og et enkelt isolat plukkes ut for vekst i stor skala og DNA fremstilling. Ettersom mange omganger med replikasjon har funnet sted ved denne fremgangsmåten, er det ingen garanti for at ikke en eller flere nucleotidpåvirkende hendelser har ødelagt genet som det ikke har vært noe selektivt press på under isoleringen. En slik skade kunne gjøre DNA sekvensen til et slikt gen meningsløs eller i stor grad minske dens evne til å virke som et skjema for utvelgelse av peptider og deres syntese. De hindringer som er oppsummert så langt, er de som er involvert i isoleringen av DNA for sekvenseanalyser, slik at DNA<1>et er eksakt representativt for det originale virusgen.

Det neste sett av fremgangsmåtetrinn fører til en DNA sekvens for virusgenet. Ved oppstartingen av disse undersøkelsene, "ble det akkurat kjent at det ville være mulig for vitenskapsmenn å klare nøyaktige nucleotidsekven ser på genstørrelse ved rutinemetoder. I 1977 beskrev Sanger og medarbeidere (Sanger et al., 1977, Nature 26 5: 687) sine forsøk på å klare nucleotidesekvensen til det lille bakterievirus ø"Xl7 4. Løsningen deres, som inneholdt mer enn 30 feil på 5300 nucleotider, var i det vesentlige basert på fastleggelse av rekkefølgen i proteiner og RNA for å fortolke resultatene av fastleggelsen av rekkefølgen i DNA, og opptok mer enn 10 vitenskapsmenn i 5 år. Disse forfatterne, hvorav en ble belønnet med Nobel prisen for arbeidet, konkluderte med at "Som med andre metoder for fastleggelse av rekkefølgen av nucleinsyrer, kan pluss og minus teknikken brukt alene ikke anses som et fullstendig pålitelig system, og enkelte feil kan oppstå. Slike feil og unøyaktigheter kan bare elimineres ved mer arbeidskrev-ende eksperimenter og selv om mye av sekvensen er blitt fastlagt, vil det sannsynligvis gå lang tid før den fullstendige sekvensen kan fastslås. Vi er ikke sikre på at finnes noe vitenskapelig forsvar for å fastslå hver detalj". En proteinsekvens utledet fra en fastslått DNA sekvens hos et gen forblir derfor hytotetisk inntil beviset for dens nøyaktighet er frembragt. Slike bevis er nå av 3 typer - enten den partielle aminosyresekvensanalysen av genets proteinprodukt, eller observasjonen at antilegemer til syntetiske peptider fra proteinet fortolket av DNA sekvensen reagerer med naturlige proteiner, eller aktuell ekspresjon av det funksjonelle proteinet av det klonede gen, (en relativt sjelden hendelse).

Tidligere undersøkelser av Arnon et al., (1971, Proe. Nat. Acad. Sei, 68: 1450), Atassi (1975, Immunochemistry 12:423) og Vyas et al., (1972 Science 178:1300) er av disse forfatterne blitt tolket dithen, at korte, lineære aminosyresekvenser vanligvis ikke er i stand til å frembringe antistoffer som reagerer med naturlige proteinstruk-turer. Man mente at i de fleste avsnitt hos de fleste molekyler, besto antigeniske determinanter av aminosyre-rester som i den" lineære sekvensen var klart adskilt, men som lå tett sammen i det sammenfoldede protein. Den nøy- aktige tredimmensjonale konformasjonen til peptidene som ble brukt til å frembringe antistoffer, ble antatt å være kritisk i de fleste tilfeller, selv for slike antigener hvor aminosyrene lå tett sammen i sekvensen. Sela mente f.eks.

at det var nødvendig å syntetisere en svært nøyaktig sløyfe-struktur for å frembringe en anti-lysozymrespons, Atassi fremstilte mange forseggjorte molekyler som alle var ment å skulle etterligne tertiærstrukturer til målproteinet, og Vyas konkluderte med at den tredimmensjonale konformasjonen til overflaten hos hepatitis B antigenet var en kritisk faktor for frembringelsen av antistoffer som kunne reagere med den naturlige strukturen. Foreliggende oppdagelse viser at bekymringene som fikk andre til å anta at disse forsøkene ikke ville føre frem, var uberettigede. Vi har således oppdaget at antistoffer til lineære peptider reagerer med naturlige molekyler og at raffinerte synteser er unødvendige, uøkonomiske og avlegs på bakgrunn av det fremskritt som foreliggende oppfinnelse representerer.

Mengden av det aktuelle protein i organismen er ifølge foreliggende oppfinnelse, ikke av spesiell betydning, ettersom man kan starte med genet som generer proteiner, og alle gener er vanligvis tilstede i mer eller mindre like mengder. Man kan således fremstille antigener som induserer den antistoffrespons på selv små proteinbestanddeler i en organisme.

Etter som man ved foreliggende oppfinnelse oppnår et antigen som er fri for alle konkurrerende og samvirkende proteiner, produserer vaksinen beskyttende eller gjenoppret-tende antistoffer spesifike for den aktuelle antigeniske determinant, følgelig er det ingen kryssreaktivitet med noen annen antigenisk determinant.

Etter som antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan dyrkes i praktisk talt enhver vert av interesse,

i store dyr som sauer, hester etc., kan man på en svært lett og billig måte opprette en langvarig kilde for antistoffer med praktisk tart perfekt identitet og pålitelighet, ganske enkelt ved jevne mellomrom å høste antistoffer fra verten.

Dette er et stort fremskritt sammenlignet med det man i den tidligere kjente teknikk mente forelå av kostnad og mangel på pålitelighet ved dyrking av antistoffer.

Det er mulig ved hjelp av prinsippene ifølge foreliggende oppfinnelse, å skissere og produsere antigener for bruk som en beskyttende vaksine eller å produsere antistoffer for ethvert ønsket formål eller bruk som helt overvinner de svært alvorlige autoimmune responser mot mange antigener som har forhindret eller i stor grad begrenset bruken av hele proteinantistoffer i terapi og diagnose. F.eks. kan man lett fremstille en vaksine som omfatter bare den spesifike antigeniske determinant som initierer produksjonen av antistoffer som igjen binder antigenproteinet, fri for kryss-virkende determinanter som forårsaker svært alvorlige bireaksjoner, f.eks. hjertesykdom i tilfellet med streptococcer og den alvorlige nevrologisk manifesterte autoimmunreaksjon mot den nylig gjennomførte, omfattende vaksinasjon mot svinein-fluensa med dens tidvise katastrofale konsekvenser.

I tillegg , og av stor betydning, kan man fremstille vaksiner som beskytter mot organismer som ikke i seg selv oppviser proteinet av immunologisk interesse. F.eks. hos RNA tumor virus kommer ikke proteinene som er ansvarlige for celletransformasjonen til uttrykk i det viruset som sådant, selv om de selvfølgelig spesifiseres av det genetiske materiale. Det er derfor ikke mulig å fremstille vaksine ved de hittil brukte metoder i vaksineproduksjonen, som er basert på innføringen av drepte eller svekkede virus. På samme måte er det ikke mulig ved de klassiske metoder å fremstille en vaksine mot virusindusert levkemi eller lymfoma hos katter. Foreliggende oppfinnelsen åpner derfor nye veier ved fremstilling av vaksiner som er artsforskjellige og langt mer avansert enn metodene ifølge teknikkens stand. Nye vaksiner og antistoffer som aldri tidligere har vært mulige, er frembragt ved anvendelsen av denne oppfinnelsen.

Kort sagt, er alle de tidligere kjente metoder, inkludert de nyere rekombinant DNA og hybriboma metoder, ved fremstilling av vaksine og antistoffer, sammenlignet med foreliggende oppfinnelse, mere kompliserte og teknisk kost-bare, mere tidkrevende, har et lavt kvantitativt og kvalita-tivt utbytte, og alle medfører en viss grad av tvil med hensyn til sikkerhet og pålitelighet innebygget i enhver metode hvor den ønskede komponent må separeres fra uønskede komponenter. De tidligere kjente metoder gir ikke en rute til fremstillingen av visse vaksiner eller til eliminering av auto-immunologiske reaksjoner av et gitt antigen, mens foreliggende oppfinnelsen åpner veien til disse nye resultater. Foreliggende oppfinnelse gir nye, uforutsette resultater ved en enklere, mindre kostbar og mer direkte og produktiv måte enn det som ses ved teknikkens stand.

Foreliggende oppfinnelse overvinner disse og andre hindringer og ulemper ved metodene ifølge teknikkens stand for fremstilling av nye syntetiske antigener. Disse antigenene kan brukes ikke bare til å fremstille vaksiner og diagnostiske antistoffer, men også for å frembringe celle-påvirkede immunresponser, store mengder antistoffer for passiv immunprofylakse og for andre formål som det vil frem-gå av foreliggende beskrivelse. Vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse, er helt fri for virale genomer, bakterielle nucleinsyrer og endotoksiner. Vaksinene og antistoffene ifølge denne oppfinnelsen, er spesifike til det ønskede antigen og kryssvirker ikke med falske antigeniske determinanter som kan oppstå på ikke-passende deler av antigenet.

Vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter en antigenbærer, som kan være en av et stort antall anerkjente bærere, til hvilken et syntetisk peptid som tilsvarer en antigenisk determinant-del av et naturlig protein, er bundet, idet peptiden virker som dets spesifike antigeniske determinant hos det resulterende antigen, så når antigenet er inn-ført i den ønskede vert, starter opp produksjonen av antistoffer eller gir en cellebundet respons hos verten mot den ovenfor nevnte antigeniske determinantdel hos det naturlige protein.

Det er av stor betydning, som det vil bli redegjort for nedenunder, at oppfinnelsen også tar i betraktning mulig heten av å benytte antigener hvor hele bæreren er antigenisk.

Det syntetiske antigen dannet ved å binde den syntetiske, antigeniske determinantenhet til en antigenbærer og fremgangsmåten for fremstilling av dette syntetiske antigen, er spesifike aspekter ved foreliggende oppfinnelse.

Generelt kan det syntetiske antigen (som immunologisk tilsvarer det naturlige antigen som inneholder den spesifike antigeniske determinant), dannes ved følgende trinn: (a) å fastlegge ut fra et genom (enten DNA eller RNA) aminosyresekvensen for hele eller deler av en peptidregion av interesse, (b) å forutsi regioner hos peptidet som er potensielle antigeniske determinanter, (c) å fremstille et syntetisk, antigenisk determinantpeptid som immunologisk duplikerer en eller flere av de antigeniske determinantene hos peptidet som tilsvarer et naturlig antigen, og om nødvendig, (d) binde den syntetiske determinanten fremstilt under trinn (c) til en farmasøytisk akseptabel bærer, hvorved detønskede syntetiske antigen er fremstilt.

Som en fremgangsmåte for fremstilling av vaksiner, omfatter fremgangsmåten trinnene med å bestemme ut fra DNA sekvensen (eller liten cDNA sekvens dersom genomet er RNA)

hos den aktuelle organisme aminosyresekvensen av en antigenisk determinant del av et protein antigen, fremstille et peptid som antigenisk er duplikatet eller delvis duplikat av de-terminantdelen av proteinet, og, om nødvendig, binde det syntetiske peptidet til en bærer eller fremstille en bærer for å oppnå et antigen hvor peptidet er den spesifike antigeniske determinant og som, når den innføres i en vert, starter opp produksjonen av antistoffer mot proteinantigenet.

Som en" fremgangsmåte for å fremstille antistoffer, injiseres vaksinen beskrevet ovenfor i en vert, og antistoffer til protein antigenet høstes fra vertsvæsker for bruk i konvensjonelle diagnostiske fremgangsmåter for å bestemme nærværet av proteinantistoffet eller som terapeutiske midler for passiv immunoprofylakse.

Det er mulig å fremstille vaksiner som induserer beskyttende antistoffproduksjon eller en cellestyrt immunrespons hos en vert mot patogene midler som ikke i seg selv frembringer den aktuelle antigeniske determinant. F.eks. frembringes ikke proteinene som er ansvarlige for celletransformasjonen hos RNA tumor virus i de virale partikler som så-danne, til tross for at de er spesifisert i det genetiske materiale. Det er derfor ikke mulig med vaksineproduktsjon fra drepte eller svekkede virus. En lignende situasjon oppstår ved viralindusert kattelevkemier og lymfoma. Man var aldri tidligere i stand til å frembringe et slikt resultat.

Det vil forstås at mens der er mange fremgangsmåtetrinn hvor det benyttes mange materialer i fremstillingen av vaksinene, og antistoffpreparatene ifølge oppfinnelsen, og ved utførelsen av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, som omtalt i detalj nedenfor, er oppfinnelsen ikke begrenset til utnyttelsen av noen bestemte trinn eller reagenser eller betingelser, men oppfinnelsen er heller idémessig som fastlagt ovenfor og som definert med bestemthet i de medfølgende krav.

Således er, generelt sett, et aspekt ved oppfinnelsen en generell fremgangsmåte for fremstilling av vaksiner som har alle de immunologiske virkninger hos tidligere kjente vaksiner, men som er totalt fri for konkurrerende eller kryss-virkende immunologiske bivirkninger.

Oppfinnelsen er også en generell fremgangsmåte for fremstilling av vaksiner for organismer som ikke selv inneholder den antigeniske determinant.

Vaksiner som omfatter kjente immunologisk signifi-kante antigeniske determinanter, som i naturen er tilknyttet et protein med en determinant som initierer en motsatt reaksjon, slik som en autoimmunreaksjon, men som er fri for den motsatte determinant, fremstilles også ifølge metodene ved denne oppfinnelsen.

Vaksiner mot virus sykdommer som er spesifike for

en bestemt antigenisk determinant hos viruset, eller indusert av viruset i verten, er viktige aspekter, trekk og produkter omfattet av oppfinnelsen, men oppfinnelsen omfatter også vaksiner som er spesifike mot bestemte antigeniske determinanter i eller indusert av slike aukarioter og prokario-ter som bakterier, fungi, somatiske celler og gjær, hvorav elle er av like stor betydning i den for sine virkningsfelt som virus vaksinene.

Antistoffpreparater, anvendelsen for diagnose, frembringelse av midlertidig immunitet og andre anvendelser frembragt ved immunresponsen hos en vert for de ovenfor nevnte vaksiner og utnyttet på de vanlige måter, er også viktige deler av den generelle idé og de spesifike anvendelser av denne oppfinnelsen.

Vaksiner fremstilles ved å identifisere en peptidsekvens, kjemisk og syntetisere peptidsekvensen, og binde det resulterende syntetiske peptid til en bærer, og derved danne et antigen, og selvfølgelig ved hjelp av immunokjemiske teknikker å stablere initieringen av beskyttende eller utvinn-bare antistoffer i vertsystemet, eller mutasjonen ved en celleformidlet immunrespons. Peptidsekvensen kan være ethvert oligopeptid som omfatter en antigenisk determinant som er spesifik for den aktuelle patogen eller organisme, enten den er inneholdt i organismen eller indusert av organismeen aller patogenet i verten. Antistoffpreparater, vaksiner og fremgangsmåten for fremstilling av de samme utgjør alle hele og viktige nyanser ved oppfinnelsen, likevåvel som det syntetiske antigen og fremgangsmåten for fremstilling derav.

Oppfinnelsen omfatter en rekke nyanser, alle med tilknytning til fremstillingen, sammensetningen og bruken av syntetiske peptider som utgjør spesifike antigeniske determinanter. Flere av disse nyansene er oppregnet nedenunder, men uten forsøk på å omfatte hver og en bestemt nyanse ved oppfinnelsen i dette sammendraget.

Oppfinnelsen vedrører fremstilling av antigener ved å identifisere den delen av et genom hos en organisme som ko der for et potensielt antigenisk peptid, å klone det således identifiserte genet og bestemme nucleotidsekvensen hos et klonet gen. Aminosyresekvensen hos antigenpeptidet ut-ledes fra nucleotidsekvensen hos genet, og den således bestemte aminosyresekvens syntetiseres kjemisk til i det minste et peptid som deretter bindes til en antigenbærer eller gjø-res til en del av et antigen og innføres i ehvert. Antistoffer, hvis produksjon er initiert av innføringen av antigenet i verten, undersøkes immunologisk for å bestemme hvilket antigen som induserer antistoffer mot organismen hvis genom ble brukt for å fremskaffe peptidsekvensen. Så snart det er påvist at antigenet produserer antistoffer mot det naturlig forekommende antigen i organismen, fremstilles det antigeniske peptid i tilstrekkelige mengder til å brukes sammen med eller som en del av en bærer, som en vaksine mot patologisk inntrengning av organismen. Vanlig må peptidet ha minimum 4-6, vanligvis 6, aminosyrer, og ofte kreves det så mye som 8 aminosyrer for å starte opp produksjonen av antistoff mot et korresponderende, naturlig forekommende antigen. Peptider som har omkring eller flere aminosyrer i sekvensen, er foretrukket, og bevirker en mye høyere grad av spesifisi-tet og antigenisk respons.

Antistoffsammensetninger som kan brukes for terapeutisk og diagnostisk anvendelse, fremstilles ved å bruke de tidligere beskrevne teknikker, "men med det ytterligere trinn, at antistoffene produsert mot det beskrevne syntetiske antigen, høstes fra hvert.

Som en metode for å lage antigen som omfatter en peptidantigenisk region og bæreren, bestemmes strukturen av peptidantigenregionen ved å kartlegge genomet som dirigerer produksjonen av i det minste en antigenisk determinant hos et naturlig forekommende antigen, og så bestemme fra genomkartet sekvensen for peptidet som nevnte genom koder for, fulgt av kjemisk å syntetisere den peptidantigeniske region hvis sekvens var således bestemt å danne antigen fra denne antigeniske region.

Antigener fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse består vesentlig av den kjemiske syntetiserte peptidantigeniske region og en bærer, idet peptidet har en sekvens som ble fastslått ut fra genomet som dirigerer produksjonen av i det minste en antigenisk determinant hos et naturlig forekommende antigen, det således syntetiserte antigen er fri for naturlige forekommende proteiner og proteinfragmenter,

den syntetiske peptidantigeniske region er i det vesentlige et suplikat av en naturlig forekommende antigenisk determinant, og i stand til å initiere fremstillingen av antistoffer mot nevnte naturlig forekommende antigeniske determinant, når den injiseres i en vertorganisme.

Antigen som i det vesentlige består av en bærerdel og en kjemisk syntetisert peptiddel som i det vesentlige er et duplikat av en naturlig forekommende antigenisk region i et protein som induserer enn immunologisk respons hos verten, infisert med en organisme i hvilken et slik protein ikke uttrykkes, fremstilles ved å bestemme sekvensen for det kjemiske syntetiserte peptid ut fra genomet hos organismen som styrer produksjonen av den naturlig, forekommende antigeniske region. Denne typen antigener er selvfølgelig ikke i stand til å bli produsert av organismen selv. Antistoffer kan dyrkes i en vert som respons på innføringen av slike antigener i verten, fulgt av høsting av antistoffene for terapeutiske eller diagnostiske formål.

Det er åpenbart en generell fremgangsmåte for fremstilling av entigensammensetninger som i det vesentlige består av en syntetisk peptidantigenisk determinantregion, og en bærerdel, ved ut fra genomet hos en organisme å bestemme peptidregionen koder for av dette genomet, de regioner av nevnte peptid som sannsynligvis har spesifike antigeniske determinantdeler, eller å fastlegge de samme, kjemisk syntetisere i det minste en av disse peptidregioner, danne et potensielt antigen fra disse syntetiserte regioner og injisere det potensielle antigen i en vert, fulgt av fastlegging av hvorvidt det potensielle antigen induserer antistoffer i verten mot organismen fra hvis genom peptidsekvensen ble utledet, og så fremstille antigen fra kjemisk syntetiserte peptidregioner som i de foregående trinn er vist å indusere i verten antistoffer mot naturlig forekommende spesifike antigeniske determinanter hos nevnte organisme.

Oppfinnelsen vedrører også fremstilling av antigener ved å danne poly(peptidfragment)polymerer eller kopolymerer ved å binde sammen et antall kjemisk syntetiserte peptidregioner, hvorav i det minste flere er påvist å indusere antistoffer mot organismen i verten. Ved å bruke denne veien, er det mulig å fremstille antigener hvor alle, eller i det minste en vesentlig del av, antigenene utgjør spesifike antigeniske determinantregioner. Alle disse antigeniske determinantregioner kan være identiske eller de kan være alternerende, f.eks. kan to eller flere antigeniske determinanter syntetiseres eller kopolymeriseres sammen og gi et antigen som har et antall spesifike antigeniske determinantregioner forskjellige fra hverandre. Om ønsket, kan ikke-antigeniske peptidregioner være inkludert i antigenet,

og det er forutsatt at oppfinnelsen vil omfatte i det minste noen ikke-antigeniske peptid-sekvenser i slike antigener, selv om dette ikke vil være nødvendig. Denne anvendelsen åpner til og med veien til å frembringe et enkelt antigen som f.eks. kan immunisere mot mer enn en organisme. Hvis det f.eks. fremstilles et antigen av en syntetisk peptidspe-sifik antigenisk determinant hos organisme A, og en ulik syntetisk peptid spesifik antigenisk determinant hos organisme B, så er et antigen som vil indusere fremstillingen av antistoffer mot både organisme A og organisme B inkludert i en enkelt antigenisk struktur, som er fri for alle proteiner og proteinfragmenter som følger av andre metoder for antigenfremstilling. Ifølge prinsippene ved denne oppfinnelsen, fremstilles et nytt antigen som er fri for eller i det vesentlige fri for deler som bare virker som bærer, og som i det vesentlige består av en eller flere syntetiske peptid spesifike antigendeterminantregioner, polymerisert eller kopolymerisert sammen, hvorav i det minste noen regioner i det vesentlige' er duplikater av naturlig forekommende spesifike antigen determinantregioner, og som induserer antistof-

fer mot naturlig forekommende spesifike antigeniske determinantregioner når de innføre i en vert. Ingen slike antigener har tidligere vært fremstilt.

Oppfinnelsen vedrører også spesifike antigener som er syntetiske peptider med definert aminosyresekvens. F.eks. er det blant andre spesifike antigeniske determinanter identifisert og krevet spesifike antigener som initierer produksjonen av antistoffer mot hepatitis B og influensa.

I denne sammenheng skal det med hele eller nesten hele antigeniske determinantregioner, særlig ved lange antigeniske determinantregioner, forstås at enkelte aminosyrer kan være erstattet av andre aminosyrer, uten å ødelegge peptidets karakter, og som er helt ekvivalent med det spesifikt nevnte peptid. Slike spesifike antigeniske determinanter er betraktet som ekvivalenter i forbindelse med denne oppfinnelsen, og er inkludert og omfattet når det refereres til eller defineres spesifike peptidsekvenser.

Et ytterligere formål ved oppfinnelsen, er å frembringe et lymfosom som i det vesentlige består av en lipid-lik kjerne del som har i det minste et syntetisk peptid som utgjør en spesifik antigenisk determinant, knyttet til seg ved hjelp av en lipid-del bundet til peptidet, idet det syntetiske peptid som utgjør spesifike antigeniske determinanter i det vesentlige duplikerer en naturlig forekommende antigenisk determinant. Slike lysosomer kan ha mange identiske eller mange forskjellige syntetiske peptider som utgjør spesifike antigeniske determinanter bundet til seg på samme måte.

De forskjellige nyansene ved oppfinnelsen kan benyttes til å frembringe et enkelt antigen eller antistoff eller et annet peptid inneholdende produkt hvor det spesifike antigeniske determinanttrekk hos peptidet er den be-tydningsfulle, eller i det minste en hovedsakelig, faktor når det gjelder den biologiske virkning av produktet.

F.eks. kan liposomer inneholde hver sin halvdel av fettsyre og peptid, hvor"peptiddelen inkluderer to eller flere spesifike antigeniske determinantregioner som er spesifike for to eller flere organismer ved at de etterligner en naturlig ■ forekommende spesifik antigenisk determinant hos de aktuelle organismene. Hele antigeniske bærere dannet av flere syntetiske peptider som utgjør spesifike antigeniske determinant ter, kan syntetiseres i sin helhet, binde sammen etter syntesen, eller fremstilles ved en kombinasjon av disse utfør-elsene. Andre kombinasjoner er også omfattet. Fig. 1 viser nucleotidsekvensen ved 3' enden hos Mo-MuLV provirus. Fig. 2 viser et autoradiogram av en SDS-PAGE separasjon av merket SCRF 60A cellelysat omsatt med forskjellige antisera, inkludert antisera til den nye syntetiske vaksinen ifølge oppfinnelsen. Fig. 3 er et revidert genetisk kart for Mo-MuLV provirus. Fig. 4 viser et autoradiogram av SDS-PAGE separasjon av merket lysat av SCRF 60A celler omtalt i forbindelse med fig. 2. Fig. 5 viser en sammenligning av deler av de genetiske kart for Mo-MuLV og AKV virus. Fig. 6 er et scanning elektronfotomikrogram av overflaten hos en viruspartikkel dekorert med antistoff dyrket mot R-syntetisk antigenprøven ifølge oppfinnelsen, og konjugert med ferritin for synliggjøring. Fig. 7 viser aminosyresekvensen 226 hos HBgAg som den er blitt oversatt av Pasek et al., fra nucleinsyre-sekvensen fremstilt i en bokstavkode (A ala, C cys, D asp,

E glu, F phe, G gly, H his, I ile, K lys, L leu, M met,

N asn, P pro, Q gin, R arg, S ser, T thr,' V val, W trp,

Y tyr) for å indikere hvilke regioner i proteinet som ble valgt for syntese. De understrekede regioner som tilsvarer disse peptidene, er nummerert 1-8, eller 3a til 6a, 8a. C eller Y ved enden av en understrekning indikerer hvor

en cystein eller tyrosinrest som ikke er å finne i den primære sekvensen, ble tilføyd av tekniske grunner. Rester som ikke er de samme' i alle tre nucleotidsekvensbestemmelsene, er lett understreket. Mange av disse er samlet mellom 110

140. Fig. 8 viser peptidsekvens og posisjon (svarende til de understrekede rester i fig. 1). De understrekede rester var ikke i den primære proteinsekvens, men ble til-føyd for å tillate sammenkobling med bærer eller radioioder-ing. Alle peptider med unntak av peptid 1, 3a og 7 ble bundet til bærerprotein KLH som beskrevet nedenunder. Peptid 1 ble brukt uten sammenkobling med KLH. Peptidene 3a og 7 var uoppløslige og ble ikke brukt. Fig. 9 er et autoradiografisk foto av radioaktivt merkede, rensede Dane-partikler som ble omsatt med 5 mikro-liter normalt, anti-peptid 3, eller antipeptid 4 serum. Bunnfallet ble samlet og klargjort for elektroforese som beskrevet nedenunder. På prøver ble det foretatt elektroforese på en 5 til 17% SDS-polyakrylamidgel og autoradiografi. Fig. 10 viser genomet og oversettelsen av genomet hos influensa X-47 stammen og potensielle, spesifike antigeniske regioner. Cystin tilføres for sammenkobling med peptidregionen som er antatt å være en potensiell antigenisk determinant, og tyrosin tilføres for å feste en merkelapp, f.eks. en radioaktiv merkelapp, til peptidet. Fig. 11 viser genomet for munn- og klovsyke, og regionene som, når de oversettes til peptidsekvenser, sannsynligvis er spesifike antigeniske determinante regioner. Fig. 12 viser et poly(spesifikt antigenisk determinantpeptid)kopolymer antigen.

JMetoder og materialer som er enestående for denne oppfinnelsen er beskrevet nedenunder med tilknytning til de særskilte fremgangsmåter. Generelt sett, er imidlertid de spesifike laboratorieteknikker, metoder og materialer de samme som brukes vanligvis i molekylærbiologi og biokjemi.

Det vises spesielt til "Methods in enzymology", Colowick, S.P. og Kaplan, N.O., Utgiver, Academic Press,

New York; "Methods in Immunology and Immunochemistry", Academic Press, og "Handbook of Biochemistry and Molecular Biology", Chemical Rubber Publishing Company, for en omtale av de vanlige materialer og teknikker av interesse.

Fremstillingen av haptener og antigener ved sammenknytning av en determinant til en bærer er en svært godt kjent teknikk og mange bærere er beskrevet. Vanlig kjente bærere omfatter såkalte keyhold limpet Hemocyanin (KLH), serumalbumin fra okse (BSA), erythrocytter fra sau (SRBC), D-glutaminsyre:D-lysin.

Ingen enkelt laboratorieteknikk er som sådan ny, oppfinnelsen ligger heller i produktene som aldri tidligere har eksistert, og som utgjør et stort funksjonelt framsteg sammenlignet med de tidligere kjente produkter, og i fremgangsmåtene som et hele for fremstilling av produktene ifølge oppfinnelsen. Det gis følgende litteraturreferanser som bakgrunn for disse fremgangsmåtene: 1. Baltimore, D., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol 39, 1187-1200 (1974). 2. Oskarsson, M.K., Elder, J.H. Gautsch, J.W., Lerner, R.A. og Vande Woude, G.F., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 75, 4694-4698 (1978. 3. Gautsch, J.W. Elder, J.H. Schindler, J., Jensen, F.C., og Lerner, R.A., Proe, Nati. Acad. Sei., USA 75, 4170-4174 (1978). 4. Jamjoon, G.A., Naso, R.B. og Arlinghaus, R.B., Virol.78, 11-34 (1977). 5. Famulari, N.C., Buchhagen, D.L., Klenk, H.D., og

Fleissner, E., J. Virol. 20, 501-508 (1976)'.

6. Witte, O.N., Tsukamoto-Adey, A. og Weissman, L.L., Virol. 76, 539-553 (1977).

7. Fan, H. og Verma, I.M., J. Virol.26, 468-478 (1978).

8. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Lerner, R.A., Johnson, P. og Verma, I.M., Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol. 44, (1979).

9. Sutcliffe, J.G. Shinnick, T.M., Verma. I.M. og Lerner,

R.A., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, (1980).

10. Marglin, A. og Merrifield. R.B., Ann. Rev. Biochem. 39, 841-866 (1970). 11. Pederson, F."S. og Haseltine, W.A., J. Virol. 33, 349-365 (1980).

12. Atlas of Protein Sequence and Structure, bind 5, sup.

3, M.O. Dayhoff, ed., Nati Biomed. Res. Found,. utgitt

Washington, D.C. (1978).

13. Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M. og Orcutt, B.C., side 352, op.eit. 14. Fisher, R.A., The Genetical Theory of Natural Selection,

Clarendon Press, Oxford (1930) .

15. Elder, J.H., Gautsch, J.W., Jensen, F.C., Lerner, R.A., Harley, J.W. og Rowe, W.P., Proe.Nati.Acad.Sei., USA

74, 4676-4680 (1977).

16. Lerner, R.A., Jensen, F.C., Kennel, S.J., Dixon, F.J., Roches, G.D. og Francke, U., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, 69, 2965-2969 (1972). 17. Niman, H.L. og Elder, J.H., Proe. Nat. Acad. Sei., USA,

(1980). 18. Edwards, S.A. og Fan, H., J. Virol. 30, 551-563 (1979).

19. Kitagawa, T. og Ailawa, T., J. Biochem. (Tokyo) 79,

233, (1976). 20. Liu, F., Zinnecker, M., Hamaoka, T. og Katz, D.H.,

Biochem. 18, 690 (1979) . 21. Katz, David H., US patent nr. 4.191.668, Mars 4. 1980. 22. J.Exp. Med., 134: 201-203 (1971). 23. J.Exp. Med., 136: 426-438, 1404-1429 (1972). 24. J.Exp.Med., 138: 312-317 (1973). 25. J.Exp. Med., 139: 1446-1463 (1974).

26. Proe.Nati Acad. Sei., USA 71: 3111-3114.

27. Proe Nati Acad. Sei., USA, 73: 2091-2095 (1976).

28. J. Immunol. 114: 872-876 (1975). 29. J. Immunol. 120: 1824-1827 (1978). 30. J.Exp. Med., 139: 1464-1472 (1974). 31. Humphrey, J.H. og White, R.G., Immunology for Students of Medicine, Blackwell, Ocford (1970). 32. Katz, David H og Benacerraf, Baruj, Immunological Tolerance, Mechanisms and Potential Therapeutic Appli-cations, Academic Press (1974).

33. Newsweek, March 17, 1980, sidene 62-71.

34. Chemical & Engineering News,Juni 23. 1980, side 10.

35. Mil stein, C, Dif f erentiation 13: 55 (1979).

36. Howard, J.C., Butener, G.W., Galfre', G., Milstein, C. og Milstein, C.P., Immunol. Rev. 47:139 (1979). 37. Hammerling, G.J., Hammerling, U., og Lemke, H.,

Immunogenetics 8: 433 (1978).

38. Shulman, M., Wilde, C.D., og Kohler, G., Nature 276: 269 (1978).

39. Kohler, G. og Milstein, G., Nature 256:495 (1975).

40. Ledbetter, J.A. og Herzenberg, L.A., Immunol. Rev. 47: 63 (1979). 41. Gefter, M.L., Margulies, D.H. og Scharff, M.D., Somatic

Cell genetics 3: 231 (1977).

42. Kohler, G. og Milstein, C., Eur. J. Immunol. 6: 511

(1976). 43. J. Biol. Chem., 241: 2491-2495 (1966). 44. J. Biol. Chem., 242: 555-557 (1967). 45. Koprowski, Hilary et al., US patent nr. 4.196.265, april 1980. 46.Science 209, nr. 4463, sidene 1319-1438 (sept. 1980 - hele nr.) . 47. Davis, B.D., Dulbecco, R., Eisen, H.N., Ginsberg, H.S., Wood, W.B. Jr., og McCarty, M., Microbiology, Harper

&Row, Hagerstown, Md., 1973.

48. Morgan, J. og Whelan, W.J., Recombinant DNA og Genetic

Experimentation, Pergamon Press, New York, 1979.

49. Goldstein, L og Prescott, D.M., Cell Biology, A Com-prehensive Treatise, Bind 1,2 og 3, Academic Press,

San Francisco.

50. Scott, W.A. og Werner, R., Molecular Cloning of Recombinant DNA, Academic Press, New York, 1977. 51. Wu, Ray (Ed.), Colowick, Sidney P., og Kaplan, Nathan 0., Methods in Enzymology, generelt og bind 68, "Recombinant DNA" i særdeleshet, Academic Press, New

York.

52. Cooper, Terrance G., The Tools of Biochemistry, John

Wiley&Sons, New York, 1977.

53. Sela, Michael, Science 166: 1365.1374 (1969).

54. Arnon, R., Elchanan, M., Sela, M. og Anfinsen, C.B.,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 68: 1450 (1971).

55. Sela, M., Adv. Immun. 5: 29-129 (1966).

56. Sela, M., Arnon, R., og Chaitchik, S., US patent nr. 4.075.194, 21. februar 1978. 57. Cohen, S.N., og Boyer, H.W., US patent nr. 4,237.224,

2. desember 1980.

58. Lerner, R.A., Sutcliffe, J.G. og Shinnick, T.M. (1981),

Cell 23: 109-110. 59. Wilson, I.A., Shehel, J.J. og Wiley, D.C., (1981),

Nature 289: 366-373.

60. Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N., Liu,

F-T, Niman, H.L., og Lerner, R.A. (1980), Nature 287: 801-805.

Det vises spesielt til "Methods in Enzymology", Colowick, S.P. og Kaplan, N.O.,m Utgivere, Academic Press, New York; "Methods in Immunology og Immunochemistry", Academic Press, og "Handbook og Biochemistry and Molecular Biology", Chemical Rubber Publishing Company, for en omtale av de generelle materialer og teknikker av interesse.

Ingen enkelt laboratorieteknikk er som sådan ny, oppfinnelsen ligger heller i produktene som aldri tidligere har eksistert, og som utgjør et stort fremskritt sammenlignet med de nærmeste, tidligere kjente produkter, og i fremgangsmåtene som et hele for fremstilling av produktene ifølge oppfinnelsen.

Fremstillingen av av haptener og antigener ved sammenknytning av en determinant til en bærer er en svært godt kjent teknikk og mange bærere er beskrevet. Vanlig kjente bærere inkluderer såkalte keyhold limpet Hemocyanin (KLH), serumalbumin fra okse (BSA), erythrocytter fra sau (SRBC), D-glutaminsyre:D-lysin.

I 197 0 kunne Marglin og Merrifield rapportere at: "Vår mulighet til å syntetisere peptider av intermediær størrelse er nå-svært godt etablert". (Chemical Synthesis of Peptides and Proteins, A. Marglin og R.B. Merrifield, Ann. Rev. Biochem. 39:841-866, til 862 (1970)). Syntesen til Merrifield et al. ble brukt til å bevise hvor praktisk den foreliggende oppfinnelse er, synteseteknikkene som så-danne er imidlertid ikke kritiske.

DNA kartlegging, den generelle karakterisering av genomer,og fastleggingen av proteinaminosyresekvenser ut fra den genetiske koden er alle svært godt etablerte teknikker .

Et velstudert virus ble valgt ut'som et redskap for å bevise foreliggende oppfinnelse i et forsøk på å unngå enhver mulig tvil om resultatene. Det er imidlertid åpenbart at denne utvelgelsen ikke er det minste begrensende og at oppfinnelsen har generell anvendbarhet på ethvert system hvor det er ønsket å fremstille en vaksine for å beskytte mot et antigen av protein-natur, som inkluderer et peptid som er eller omfatter en spesifik antigenisk determinant mot antigenet. Det aktuelle antigen kan således være av viral eller bakteriell natur, eller være fragmenter av somatiske celler, under forutsetning av at et spesifikt antigenisk determinantpeptid immunologisk karakteriserer antigenet .

Teknikken av materialene for å binde antigeniske determinanter til bærere er godt kjente, og ikke noen spesiell nyhet er knyttet til dette individuelle trinn som sådant, men oppfinnelsen ligger heller i skapelsen av et monospesifikt antigen fra et syntetisk, spesifikt antigenisk determinantpeptid og en bærer for å frembringe en vaksine som imøtekommer problemene og begrensningene som hører med til teknikkens stand.

Det tas mange trinn og mange fremgangsmåter utføres ved den oppfinneriske metode for å skille ut de forskjellige materialer og reagenser, for å identifisere bestanddeler og for å bevise at de søkte reaksjoner og resultater har in-truffet.

Vanlig brukte teknikker er beskrevet i standard tekster og avhandlinger. Det vises eksempelvis til "MEthods in Enzymology", supra; "Methods in Immunology and Immunochemistry", supra; "Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology", supra; Dyson, Robert D., "Cell Biology - A Molecular Approach", 2. utg., Allyn og Bacon, Boston

(1978), Pelczar, Michael, J., Jr., Reid, Roger D., Chan, E.C.S., "Micorbiology", 4. utg., McGraw-Hill (1977); Bohinski, R.C., "Modern Concepts in Biochemistry", 2. utg., Allyn og Bacon, Boston (1976) . Spesifike fremgangsmåter er publisert (referansene 1-20, 21-30, 32, 35-43) og brukt uten forandringer av betydning.

Hvilke trinn i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen som egner seg for en gitt utnyttelse av oppfinnelsen, avhenger av kunnskapsnivået om og tilgjengeligheten av prøver av det aktuelle, bestemte antigen. Det er hensiktsmessig å omtale fremgangsmåtene trinnvis.

I. Karakterisering og identifisering av antigenisk

determinant.

Dersom den antigeniske determinant er kjent og aminosyresekvensen for peptidkjeden som inkluderer eller ut-gjør den spesifike antigeniske determinant, er kjent, så ville man fortsette umiddelbart med å fremstille et syntetisk peptid som, immunologisk, duplikerer den spesifike antigeniske determinant for det aktuelle antigen.

Denne vei kan bli mer attraktiv i fremtiden, men for tiden vil det vanligvis være nødvendig å identifisere peptidet som er eller inkluderer determinanten, og å bestemme aminosyresekvensen til peptidet. Aminosyresekvensen kan bestemmes direkte eller indirekte ved DNA kartlegging av genomet som styrer produksjonen av den aktuelle peptiddel. Fremgangsmåtene som brukes ved denne oppfinnelsen, er kjente fra et teoretisk synspunkt, og DNA kartlegging av genomet som styrer produksjonen av den aktuelle peptiddel, er nå tilstrekkelig godt definert til å være et praktisk redskap. Fastleggelsen av aminosyresekvensen direkte fra proteinet er en så besværlig og usikker fremgangsmåte, at den er av liten akademisk verdi og av praktisk talt ingen praktisk verdi på det nåværende tidspunkt. Mens direkte aminosyresekvensbe-stemmelse fra proteiner av peptider en dag kan bli et prak tisk redskap, er de nå tilgjengelige utførelsesformer ikke av en slik art at denne fremgangsmåten kan anbefales for fremstillingsoperasjoner eller for syntese av syntetiske peptider som er spesifike antigeniske determinanter. Ut-gangspunktet for oppfinnelsen er således genomet som bestem-mer aminosyresekvensen til peptiddelen som inneholder de spesifike antigeniske determinantregioner.

Såsnart aminosyresekvensene er kjent eller forutsagt, syntetiseres peptidet ved å bruke teknikken til Merrifield et al., eller enhver annen teknikk som er eller blir tilgjengelig. Teoretisk kunne man fortsette direkte fra peptidsyntesen til vaksinen, men forsiktighet, i det minste ved det nåværende kunnskapsnivå, tilsier at det således syntetiserte peptid først påvises utvetydig å være det samme som eller i det minste immunologisk ekvivalent til den spesifike antigeniske determinant hos det aktuelle antigen. Denne prøven gjøres ved kjemiske og fysikalske karakteriseringer, og til sist ved å etablere en immunreak-sjon mellom antistoffer mot den syntetiske determinant, og det naturlige antigen. Alminnelig kjente teknikker for å fastlegge molekylvekter, ladning, bindingsaffinitet etc, brukes ved denne karakteriseringen. Kapittel 2 i "Modern Concepts in Biochemistry", nevnt ovenfor, med tittelen "Methods of Biochemistry" og appendixet "Tools of the Cell Biologist" i "Cell Biology", nevnt ovenfor, beskriver generelt disse karakteriseringsfremgangsmåtene og gjengir fullstendige beskrivelser av spesifike fremgangsmåter og teknikker. Fremgangsmåter for radioimmunoprøving har en utstrakt bruk og er utførlig beskrevet av Hunter, W.M., "Preparation and Assessment of Radioactive Tracers", British Medical Bulletin, 30:18-23. Spesifike eksempler

på slike karakteriseringer er gjengitt nedenunder.

II. Fremstilling av vaksineantigen.

Når man først har erholdt det syntetiske peptid som det er påvist er den spesifike antigeniske determinant hos det aktuelle antigen, brukes kjente sammenbindings-teknikker for å binde determinanten til en bærer å gi anti genet i situasjoner hvor en slik bærer er nødvendig. Dette trinnet kan selvfølgelig utføres i en liten skala under fastleggingen av peptidets immunologiske identitet med den antigeniske determinant. Ved den første utprøving av oppfinnelsen i vårt laboratorium, var dr. Fu-Tong Liu f.eks. behjelpe-lig med å knytte det syntetiske proteinet vi hadde fremstilt til en kjent bærer, KLH, idet han brukte publiserte materialer og teknikker. (Liu, Fu-Tong et al., "New Procedyres for Preparation and Isolation of Conjugates of Proteins and a Synthetic Copolymer of D-Amino Acids and Immunochemical Characterization of such Conjugates", Biochemistry 18: 690-697 (1979)).

Valget av bærer er mer avhengig av den sluttlige, påtenkte bruk av antigenet enn av antigenets determinant,

og er basert på kriterier som ikke er spesielt omfattet av foreliggende oppfinnelse. Dersom vaksinen f.eks. skal brukes på ny, velges det en bærer som ikke gir en ubehagelig reaksjon hos det bestemte dyret. Dersom vaksinen skal brukes på mennesker, så knytter de overskyggende forhold seg til mangel på immunokjemisk eller andre bireaksjoner av bæreren, og/eller det resulterende antigen, sikkerhet og virksomhet - de samme forhold som gjelder for enhver vaksine beregnet på bruk av mennesker. Det er antatt at foreliggende oppfinnelse vil finne sin første, brede anvendelse i praksis på dyr, slik som kjæledyr og gårdsdyr. III. Immunresponsen - fremstilling av antistoff.

Etter injeksjon eller annen innføring av antigener i verten, svarer vertsimmunsystemet "ved fremstilling av store mengder antistoff mot antigenet. Ettersom det spesifike antigeniske determinant hos det fremstilte antigen,

dvs. antigenet dannet av det syntetiske peptid og bæreren,

er det samme som, eller i det minste immunologisk ekvivalent med determinanten hos det aktuelle, naturlige antigen, blir verten immun mot det naturlige antigen. Dette er det ønskede resultat i de tilfeller hvor oppfinnelsen er brukt som en vaksine.

Det er svært ofte ønskelig å bestemme om et be stemt antigen er tilstede som en hjelp f.eks. ved diagnose av en bestemt sykdom. Ettersom det syntetiske antigen er monospesifikt til den ene, aktuelle, spesifikt antigeniske determinant, er også antistoffer mot antigenet monospesifike mot det aktuelle antigen. Perfekt monospesifisitet kan ikke alltid oppnås men kryss-henvisning til andre antigeniske deler i antigenet unngås fordi antistoffet kun kan gi en immunrespons. Antistoffer utvinnes og bearbeides ved en hvilken som helst konvensjonell fremgangsmåte for bruk i diagnostiske prøver. Det er f.eks. vanlig å merke antistoffet for identifikasjon og kvantitativ bestemmelse. Ved immunprøver, er radiomerking f.eks. ved metoden til Greenwood, (se Hunter, Br. Med. Bull., 30:18 (1974)), og fluoressensmerking vanlig brukt.

IV. Eksempelvis fremgangsmåte - ukjent antigenisk

determinant.

Den aksepterte genetiske struktur hos replikasjons-dyktige murin leukemi virus, slik som Moloney, Rauscher, Friend og AKV, omfatter tre gener. Disse gener, gag, pol

og env, er arrangert i respektive orden langs det en-strengede RNA-genom. De transkriberes fra det intergrerte dobbelt-strengede DNA provirus. Proteinproduktene til disse tre genene er i utstrakt grad forstått. gag-genet koder for et polyprotein på omkring 65 kilodaltonn som protedlyttisk omdannes til proteiner, som fra amino til karboksylsyreenden, er på respektive 15, 12, 30 og 10 kilodalton. Disse proteinene finnes i virusets kjerne, og et av dem, P30, er blitt forbundet med viruspropisme. Det andre genet, pol, uttrykkes som ved en tilsynelatende utvidelse av gag-genet slik at det kan observeres et polyprotein på omtrent 180 kilodalton som inneholder både gag og pol-komponenter. Polyproteinet omdannes til et protein på 70 kilodalton som er omvendt transkriptase. Dette enzymet er ansvarlig for kopieringen av det enstrengede RNA genom hos en infiserende virus til den dobbelt-strengede DNA struktur som kan integreres i DNA hos verten. Det tredje genet, env, koder for et poly-

protein som glykosylerer og omdannes til bestanddelene gp70 og pl5E. Gp70 er hovedbestanddelen i hylsen og be-stemmer virusets vertområde. Det finnes av og til disulfid-bundet til pl5E, et hydrofobt protein som kan knytte gp7 0 til virale og cellulære membraner. Det er blitt beskrevet budbringer-RNA molekyler som kan forklare ekspresjonen av dise 3 genene.

Vi begynte våre undersøkelser ved 3' enden hos Moloney Murin Leukemi virus (Mo-MuLV) på grunn av vår spe-sielle interesse for env-genet som var antatt å være det mest 3' nære gen. Her oppdaget vi en ny genetisk kodende region som ligger på 3'-siden av env. Denne kaller vi fore-løbig for R-regionen fordi det er den kodende region som ligger lengst mot høyre i genomet. Vi har også kjemisk syntetisert deler av R-proteinet, frembragt antistoffer mot det syntetiske peptid, og immunologisk fastlagt kryss-reaktive materialer i infiserte celler.

Fig. 1 viser nucleotidsekvensen ved 3<1>enden i Mo-MuLV provirus. Den 1123 nucleotider store pluss-streng-sekvensen fra regionen som hos virus koder for 3' LTR og karboksylsyreenden, ble fastslått ut fra en 1108 basepar lang cDNA-klon og lett utvidet med sekvenser fra et infisert klon. Proteinsekvensen som er oversatt fra DNA<1>et,

er angitt over nucleotidsekvensen. De første 34 aminoende-rester ble bestemt av Copeland og Orozlan, og posisjonene 10-34 passet til vår sekvens. Pilen etter aminosyreposi-sjonen 103 (val) angir karboksylsyreenden hos pl5E. Resten av aminosyresekvensen er R-proteinet. De nummererte oligo-nucleotider (25, 42, 57 og 98B) utgjøres av de som svarer til AKV virus, og er vist i detalj i fig. 5. Regionen som er understreket etter regionen som koder for R-protein, er opphav til syntese av pluss streng DNA. Områdene merket IR^og IRRer de omvendte avslutningsgjentakelser som dekker endene hos LTR'ene. Innen LTR finner vi en 17 baser lang palindrom (understreket), og 3 direkte gjentagelser (DR 1,

2 og 3), som bef-inner seg like foran promotoren Hogness-box (p) for 5'-enden i den virale transkripsjon. Videre utover i molekylet er poly A addisjonssignalet for 3<1->enden i transkripsjonen.

Vi har også delt av denne regionen fra en fullstendig virus-klon, som med oppkuttingsundersøkelser kan påvises å bære alle biologisk aktive Mo-MuLV kodings-sekvenser. Denne nye DNA sekvensen stemmer overens med den originale med unntak av de beskrevne uviktige forskjeller. Vi antar at disse forskjellene representerer enten variasjoner i populasjonen av biologisk aktive genomer, eller artifakter som skyldes den kjente lette upålitelighet i den omvendte trans-skriptase-reaksjonen som genererte klonen som vi undersøkte til å begynne med.

Til orientering påviser vi flere egenskaper ved denne sekvensen som er viktige for virusets livssyklus.

Ved å fortsette fra 5<1>til 3' langs DNA-strengen, som svarer til genomisk RNA, ser vi regionen som koder for det meste av P15E (regionen som koder for karboksylsyreenden env), opphavet for replikasjonen av den annen (positive) DNA-strengen, de omvendte gjentakelser IRTog IR,,, som ligger inntil den delen av virale sekvenser som duplikeres ved 5' og 3<*>endene i det intergrerte provirus (de såkalte LTR'ene), og gjør virusets DNA til et transposon, og poly-

A addisjonssignalet og presumptive 3<1>avslutningsnucleotider som kommer foran poly A-halen. Trekk som er aktive ved 5'-kopien av LTR er også indikert, nemlig promotoren for genomisk ekspresjon og den første transkriberte basen, samt en sekvens like foran promotorenHognes box, som inneholder 3 direkte gjentakelser av en 7-baser lang sekvens. Disse gjentakelser kan (av beliggenhetsmessige grunner), være involvert i kontrollen av transkripsjon. Innenfor den 515 baser lange endegjentakelsen, legger vi også merke til en sekvens med 17 baser som danner en selv-inneholdende, omvendt gjentakelse (palindrom) men som er av ukjent (hvis i det hele tatt av noen) funksjon.

Den nye genetiske region som vi finner best kan bli forstått i forhold til hva som tidligere ble antatt å være den mest korrekte gen for proviruset, er den kodende region for virusproteinet pl5E. Aminoenden til pl5E kan stedfestes nøyaktig ved overlapping mellom proteinsekvensen fastlagt av vår DNA-sekvens og proteinsekvensen oppnådd av alle. Karboksylsyreenden til pl5E er definert som posisjon 103 på 3 måter. Copeland og Oroszlan fant at de to C-ende-aminosyrerestene til pl5E er leu-val. Vi finner et slikt par 103 posisjoner fra aminoendene til pl5E. Den antatte aminosyresammensetning i pl5E som man finner ved å tilskrive karboksylsyre-enden en posisjon ved valin, er i utmerket overensstemmelse med den observerte sammensetning. Endelig er den tilsynelatende molekylstørrelsen til pl5E som fastslått på SDS-geler omkring 15 kilodalton, en anslått stør-relse i overensstemmelse med mobiliteten til et hydrofobt protein med 103 rester.

Overraskende finner vi ikke et oversettbart avslut-ningskodon i posisjon 104. Istedet strekker den åpne over-settbare leserammen seg over 92 ytterligere tripletter før den kommer til en stans. Aminosyresammensetningen som man får ved å inkludere disse 92 tripletter, er fullstendig i uoverensstemmelse med aminosyresammensetningen til pl5E.

Vi konkluderer med at det primære env-gen proteinproduktet faktisk inneholder 3 peptider: pg70, pl5E og det nylig identifiserte protein, R, (posisjoner 104 til 195 i fig. 1). Derfor søkte vi etter R-proteinet.

Vi syntetiserte ved fast tilstandsmetoder flere peptider av det antatte Mo-MuLV R-protein og frembrakte antistoffer mot disse syntetiske peptider. Nærmere bestemt, ble de 15 restene ved C-enden (LTQQFHQLKPIECEP) bundet til et bærermolekyl, KLH, og injisert i 6 kaniner og 4 mus.

Vi undersøkte serumets evne til å immunologisk utskille

et syntetisk substrat med 36 rester som inneholder de 35-C-enderestene til R-proteinet som kommer foran -tyrosin, (125_yilnRLVQFVKDRISWQALVLTQQFHQLKPIECEP) . Sera fra alle de immuniserte kaniner og mus viste en positiv respons 10 til 70 ganger større enn normalt serum, som vist i tabell 1.

Vi søkte deretter etter R-proteinet i lysatet fra MuLV produserende SCRF 60A celler som var blitt merket med<35>s-metionin ved intervaller på 2 timer (R-proteinet inneholder intet tyrosin, og det var følgelig ikke aktuelt med jodmerking).

Fig. 2 viser reaksjonen av SCRF 60A-celler i log-fase, som produserer et virus som ikke lar seg skille fra Mo-MuLV (16), dyrket i Eagle's MEM med 10% kalvefosterserum. Cellene ble merket ved 37 o C og 2 x 10 fi celler pr/ml i 2 timer med ■^S-metionin (94 0 ci/mmol, lOOyCi/ml) i Hank<1>s balanserte salter med 10% Eagle's MEM. Cellene ble avkjølt, vasket med 0,15M NaCl, 10 mM natriumfosfat (pH 7,5), ekstra-hert med 0,15M NaCl, lOmM natriumfosfat (pH 7,5), 1%

NP40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 2% trasylol

i 20 minutter ved 0°C, og deretter behandlet med lydbølger og sentrifugert ved 12,000 x g i 5 minutter. Lysatet ble for-klarert ved reaksjon med 20 y normalt kaninserum og 20

yl normalt geiteserum i 3 0 minutter ved 0°C, fulgt av tilsats av formalinfikserte Staph A i 30 minutter og sentrifugert i 15 minutter ved 12,000 xg. Porsjoner av lysatet ble omsatt med 5 yl av A) normalt kaninserum, B) kanin anti-syntetisk R pentadecapeptid, C) geite anti-gp70, D) geit-anti-p30, eller É) normalt geiteserum eller F) anti-gp70 hybridom (nr. R1-16G07, ref. 17) kulturmedium i 1 time ved 0°C. Komplekser ble samlet opp med Staph A og etter 2 vask-inger med 500 mM LiCl, 100 mM tris (pH 8,5) oppløst i en ladingsbuffer fri for Staph A, og tilført på en 11% SDS-polyacrylamid-gel. Gelen ble senket ned i ENHANCE (NEN)

i 90 min, H20 i 60 minutter, tørket og eksponert på film. Båndene som fremkommer på figuren har tidligere blitt identifisert i dette laboratorium og av andre.

Anti-R sera ble fremstilt som følger. R pentadecapeptidet (LTQQFHQLKPIECEP) ved karboksylsyreenden ble konjugert med "keyhole limpet memocyanin" (KLH) ved hjelp av systeinsulfidryl. 63 yl 15ml/ml m-malimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester i N,N'-dimetyl-formamid ble tilført dråpevis under omrøring til KLH (10 mg/ml) i 10 mM kalium- fosfat (pH 7,0). Etter omrøring i 30 minutter ble blandingen filtrert og tilført en Sephadex G-25 kolonne (1,1M fos-fat, pH 6,0). Det aktiverte protein (2,3 ml) ble blandet med 0,1 ml av R pentadecapeptidet (10 ml/ml i 0,1 M kalium-fosfat, pH 7,3, 5mM EDTA), og oppløsningen justert til pH

6,5, omrørt i 4 timer ved romtemperatur og kromatografert på Sephadex G-100 (0,1M ammoniumbikarbonat pH 9,5). Det kon-jugerte protein ble samlet opp og brukt direkte for immuni-ser ing.

Som det vil ses av fig. 2., påviser et anti-R serum et protein med en tilsynelatende molekylstørrelse på omtrent 80 kilodalton i infiserte celler. Alle de individuelt påviste proteiner i immunt kanin- og musesera, har den samme molekylstørrelse. Etter som nucleotidsekvensene viste at pl5E og R var i den samme leseramme, antok vi at dette molekylet virkelig var forløperen for env. Antistoffer mot gp70, inkludert et anti-gp70 hybridoma, påviser et molekyl med den samme tilsynelatende molekylstørrelse som hos det fremkalt av anti-R, hvilket bekrefter at vi har å gjøre med forløperen for env. For å utelukke muligheten av at disse var to forskjellige molekyler, med et tilfeldig samsvar i molekylstørrelse, gjorde vi to eksperimenter. For det første, når lysatene er klargjort med anti-R sera, blir det 80 kilodalton radioaktive mål for anti-gp70 sera fjernet. Omvendt, fjernes R-determinantene ved klargjøring av lysatet med anti-gp70 sera. For det annet, viser proteolyttisk peptidned-brytning for identifisering at de to 80 kiledalton-molekylene fremkalt av anti-R og anti-gp7 0, at de er identiske. Følge-lig har vi identifisert 80 kilodalton-båndet som det fullstendige env-gen polyproteinproduktet som inneholder gp70, pl5E, (som vist av andre), og R determinanter, og derved bevist strukturen som er foreslått i fig. 3.

Fig. 3 viser et revidert genetisk kart for Mo-MuLV provirus. I 515 nucleotider-lange LTR'ene ligger inntil den proteinkodende region hos viruset. Opphavene for replikasjon av DNA minusstreng (bindingssted for oppstarting av tRNA) og plusstreng er like innenfor virusdelen fra LTR'ene ved hver ende. Det primære gag-genproduktet (Pr6 59a<?) over-føres til bestanddeler, N til C, pl5, pl2, p30 og plO.

Det endelige produkt fra pol-genet er 7 0 kilodalton. Polyproteinet fra env-genet, kalt Pr80<env>, består av bestanddelene fra N til C, gp70, pl5E og det nylig identifiserte R-protein.

Den første aminosyren i R, mærmere bestemt den

som følger umiddelbart etter karboksylsyreenden ved valin i 115E, er arginin. Ettersom basiske rester ofte er å

finne ved proteolyttiske avkutningssteder, er det mulig at R er proteolyttisk fremstilt fra env-polyproteinet på

dette sted. Ved å bruke forskjellige betingelser for gel-elektroforese var vi i stand til å påvise et protein med antatt molekylstørrelse 12 kilodalton spesifikt fremkalt av anti-R serum.

Fig. 4 viser påvisningen av R-proteinet. Et lysat av SCRF 60A celler (som beskrevet i omtalen av fig. 2), merket med -ri ^cS-m-tionin, ble oppdelt i 4 like deler, og fremkalt immunologisk med A) normal geit, B) geit anti-gp70, C) normal kanin, eller D) kanin anti-R serum, innsamlet med Staph A, og utsatt for elektroforese på en 5-17,5% SDS polyacrylamidgradient gel.

Vi har også funnet, ved indirekte immunoflour-essens, R proteindeterminanter på plasmamembranen hos SCRF 60A celler. Det kan ikke fastslås ut fra våre eksperimenter ved hvilken tid oppkuttingen av pl5E oppstår, og vi er åpne for muligheten av at den virkelige forankring for gp70 membran er det 22 kilodalton store proteinet som inneholder pl5E og R-peptider. I så fall oppstår den proteolyttiske avkutting som gir pl5E og R under deres isolering. Vi har ikke funnet et 22 kilodalton stort protein^med R-determinanter.

R-genet er tilstede i et annet virus. Pederson og Haseltin fastla nucleotidsekvensene i de store ribonu-cleaser Tl fragmentene hos AKV virus. (AKV virus er et endo-gent leukemi virus fra AKR mus). Ved hjelp av datamaskin-søk kunne vi påvise at flere av disse fragmentene var del vis homologe med grupper av vår Mo-MuLV sekvens. Vår defi-nerte rekkefølge gir en rimelig overensstemmelse med rekke-følgen oppnådd eksperimentelt av Pederson, Crothere og Haseltine. Overensstemmelse innen R-regionen er indikert

i fig. 1 og satt opp i detalj i fig. 5.

Fig. 5 viser en sammenligning av R-genet hos to virus. Oligonycleotidsekvensene bestemt av Pederson og Haseltine for AKV ble sammenlignet ved hjelp av datamaskin, med vår Mo-MuLV sekvens. Sammenfallende innen R-regionen er vist, Mo-MuLV over AKV, med de korresponderende, over-satte aminosyrer. Tallene i margen er de som ble brukt av Pederson og Haseltine. Forskjeller mellom nucleotidene er understreket. I fragment 98B var fenylalaninkodonet i vær cDNA-sekvens et tyrosinkodon i den infiserte klon, og er tyrosin i AKV. X<*>en i fragment 98B er en uløst posisjon hos AKV.

vi trekker to slutninger fra disse sammenligninger. For det første, legger vi merke til at tilsvarende fragmenter, selv om de ikke endrer pardannelse, ikke bevares fullstendig. Dette advarer oss kanskje med hensyn til hva vi kan forvente ved fremtidige sammenligniner av sekvenser hos beslektede virus. For det andre, legger vi merke til at sammenligninger innen R-regionen indikerer at AKV sannsynligvis koder for et R-protein som er svært likt R-proteinet hos Mo-Mu-LV. Nærmere bestemt 1) ingen av avvikene hos AKV introduserer nucleotider som tillater en for tidlig oversettelsesstopp,

2) flere (9) av nucleotidforskjellene mellom AKV/Mo-MuLV

er i tredje posisjon i triplettene, og påvirker ikke den kodede proteinsekvens, 3) enkelte nucleotidforskjeller endrer R-proteinets aminosyrer, men erstatningene tenderer til å

være bevarende eller synonyme (som vist i fig. 5), slik som fenylalanin til tyrosin i fragment 98B, asn-gln-arg til lys-gln-gln i fragment 25, eller met til leu i fragment 57. Alle disse substitusjoner er vurdert som positive korrelasjoner av Dayhoff mutasjonsmatrisen. Dessuten viser en preliminær sekvens erholdt åv Winship Herr med 217 nucleotider av R-regionen hos AKV, en åpen leseramme som inneholder 56 nucleo-

tidforskjeller fra vår Mo-MuLV-sekvens. Disse 56 forskjellene gir bare 6 aminosyreomskiftninger, hvorav alle er nøytrale. Disse observasjoner viser at R-proteinsekvensen er i stor grad bevart i de to virus.

Hele aminosyresekvensen vil R-proteinet svarer ikke nært til noen proteinsekvens i Dayhoff-atlaset. Noen underregioner av R, minner imidlertid om underregioner hos kjente proteiner, slik som dehydrogenaser og proteaser, og dette im-pliserer muligens områder av R-proteinet i nucleotidbinding eller gjensidige protein-proteinpåvirkninger.

R-proteinet kan ganske enkelt funksjonere som et strukturelt virusprotein. På denne bakgrunn skulle det svært hydrofobe områder mellom posisjonen 32 og 61 indikere at R innføres i cellulære eller virale membraner, hvor det tjener til å forankre andre virusproteiner. Som nevnt ovenfor, har vi allerede bevis fra fluoressensmikroskopi at R er tilstede i plasmamembranen hos infiserte celler. R-proteinet kan alternativt være innblandet i andre typer funksjoner. Som opp-rinnelig påpekt av Fisher, synes gener og deres virkningsre-gioner å samles i klynger. R-regionen er anbragt tett inntil og mellom regionen som koder for pl5E og opphavet for replikasjon av den positive streng, og LTR. Det er derfor mulig at R virker i replikasjon eller transposisjon (integrasjon).

På den annen side, kan R-proteinet spille en rolle i viral transformasjon. Et forvirrende mysterium ved leukemivirus har vært at de, selv om de transformerer'lymfevev, har de tilsynelatende ingen transformerende gener.

Som en transformerende protein, kunne R tenkes å virke direkte eller ved samvirke med et annet protein. I begge tilfeller, må to viktige punkter forklares. For det første, selv om de replikerer i praktisk talt alle celletyper hos mus, transformerer disse virus bare spesifike celler.

For det andre, er forandringer i gp7O-proteinet, som er kodet foran R-proteinet, sterkt forbundet med leukemogenisitet hos forskjellige virus, særlig de som er kalt MCF. Vi tenker oss derfor at enten samvirker gp70 og R direkte (kanskje gjennom bisulfidbinding), og har, i Moloney-tilfellet, en T-cellespesifik virkning eller at gp7 0 bremser noen celle-typespesifike egenskaper som gjør T-cellen sensitiv for den leukemogeniske virkning av R-proteinet. Det er ikke kjent hva som får viruset til å beholde dette gen.

Vårt arbeide, som beskrevet ovenfor, gir ikke bare en ny informasjonsmengde om systemet som vi valgte for å bevise eller gjendrive oppfinnelsen, men fremskaffer en generell fremgangsmåte for å gjøre proteiner tilgjengelige gjennom nucleotidsekvenser. Når det primære målet er ganske enkelt å fremstille en syntetisk vaksine mot et naturlig antigen, er vanligvis ikke alle undersøkelsene, utforskningene og prøvene fra eksemplet nødvendige, ettersom noen av disse undersøkelsene snarere var rettet mot å oppnå informasjon enn mot fremstilling av vaksiner eller antistoffer.

Trinnene som ble utført ved vår første utprøving

av fremgangsmåten omfatter:

(a) Dersom man starter med et antigen av interesse hvor de antigeniske determinantpeptid ikke er blittkarakterisert, er det første krav å identifisere og karakterisere dette peptid. I eksemplet var eksistensen av determinant-regionen ikke engang kjent, men ble bevist. Videre var det i eksemplet, ettersom viruset besto av RNA, nødvendig å kopiere til DNA ved transkripsjon. (b) For å få tilstrekkelige mengder for bekvem håndtering, ble cDNA for antigenet innført i en kjent plasmid, og store mengder av genet ble dyrket. Dette trinnet er selvfølgelig ikke nødvendig dersom tilstrekkelige mengder av DNA'et er tilgjengelig, eller dersom strukturen til DNA'

et eller peptidet er kjent, og ble utført kun for å lette vårt arbeid.

(c) Nucleotidsekvensen til cDNA ble fastlagt. Dette trinn vil ikke være nødvendig dersom det aktuelle pep- . tid er blittkarakterisert. Likeens vil trinnet ikke være nødvendig dersom man velger å karakterisere proteinet direkte istedenfor ved hjelp av dets genom. Foreliggende under-søkelse som inkluderte oppdagelsen at proteinet var blitt oppdelt eller nedbrutt og at det manglet et antigenisk deter-

minantsted, stadfester den svært generelle anvendbarheten av oppfinnelsen, og åpner døren for fremstilling av vaksiner og diagnostiske produkter mot antigener som ikke i det hele tatt opptrer i den infiserte organisme! (d) Når nucleotidsekvensen først er kjent, fast-legger den genetiske koden til genomet aminosyresekvensen hos proteinet, og peptiden som skal duplikeres syntetisk kan velges ut. Ethvert område i proteinet er et egnet utgangs-punkt. Fraværet av en region med reaktivitet overfor vertceller indikerer et. foretrukket startsted for syntese.

Etter å ha gjort valget, syntetiseres et peptid med den ønskede lengde ved i eksemplet ovenfor å benytte metoden til Merryfield et al. Peptiden bør være minst 4 mer, og vanligvis minst 8 mer. Lengre peptidkjeder sikrer større spesifi-sitet men krever også lengre tid ved syntesen. Peptider fra 8 og opp til flere hundre mer vil vanligvis være egnet. Det bør legges merke til at immunresponsen mot den 15 mer antigeniske determinant var spesifik både mot en 35 mer (+ radio-merke) determinant og det naturlige antigen. (e) Den spesifike antigeniske determinant som ble fremstilt syntetisk og følgelig var fri for fremmedproteiner, endotoksiner, cellefragmenter, virale genomer etc, konjugeres deretter med en egnet bærer til vaksinen hvor den spesifike antigeniske determinant er det syntetiske peptid. (f) Når vaksinen ble injisert i verten, immuniserte den verten og startet opp produksjonen av antistoffer. (g) Antistoffene viste seg å være oligospesifike for større syntetiske antigeniske determinanter og mot det naturlige antigen. (h) Antistoffene bandt seg til og inaktiverte viruset.

Oppfinnelsen lyktes således i å (i) forutsi og syntetisere en hittil ukjent antigenisk determinant, (ii) fremstille en vaksine som initierte den ønskede immunrespons, og (iii) fremstille et antistoff som monospesifikt bandt seg til det naturlige antigen og nøytraliserte viruset.

Hepatitis og influensavaksine.

13 peptider svarende til aminosyresekvenser forutsagt ut fra nucleotidesekvensen til hepatitis B overflate-antigen (HBgAg) ble syntetisert kjemisk. De frie eller bærerbundne syntetiske peptider ble injisert i kaniner og 7 av de 13 forårsaket en antipeptidrespons. Antisera mot 4 av de 6 oppløslige peptidene som besto av mer enn 10 aminosyrer var reaktiv mot naturlig HBgAg og frembragte spesifikt 23 000 og 28 000 daltonutgaver av HBgAg fra Dane-partikler. Etter som hepatitis-molekylet ikke ble valgt til denne undersøkelsen på grunn av noen strukturell egenskap som antydet unike muligheter for suksess, indikerer disse resultatene at strategien er generell og burde virke for ethvert molekyl såfremt tilstrekkelige områder er undersøkt. Peptider som disse er an-vendelige som vaksiner. 2 gener hvis nucleotidsekvenser var kjente og hvis proteinprodukter var av både teoretisk og praktis interesse, ble valgt ut. Det første var de viktigste kappeproteinet til hepatitis B-genomet, et molekyl som på grunn av sine ekstreme hydrofobe egenskaper, utgjorde en interessant utfordring for teknologien. Dernest ble humaglutinin fra influensavirus valgt ut ettersom dets komplette krystallografiske struktur er kjent (Wilson, I.A., Shehel, J.J. og Wiley, D.C. (1991, Nature, sidene 366-73), og således kunne man sammenligne hvordan antistoffer mot proteinområdet med kjent molekylær beliggenhet virker inn på infeksjonsevnen til virus, og faktisk hva de strukturelle korrelasjoner til de antigene-egenskaper består i hos molekylet.

Overflateantigenet hos hepatitis B-virus er et glykosilert protein og er det viktigste overflate-antigen i 42 nanometer-partikler (Dane-partikler) hos hepatitis B-virus (5-7). HBgAg inneholder gruppe og type-spesifike determinanter, og er antatt å være hovedmålet for nøytraliser-ende antistoff. Rensede preparater av HBgAg er fysisk hetero-gene, og består av i det minste 7 polypeptider som varierer de molekylstørrelser fra 23 000 til 97 000 dalton. Den i mengde viktigste HBgAg-bestanddel, har en molekylstørrelse på 23 000 dalton. (Peterson, D.L., Roberts, I.M. og Vyas, G.N. (1977), Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 1530-1534). Immunologiske undersøkelser viste at proteinene med forskjellige størrelser har til felles de samme determinanter, noe som antyder at den fysiske polymorfisme reflekterer forskjellige grader av glykosylering og aggregasjon. Aminosyresekvensen til den 226 aminosyrer lange HBgAg utledet fra de publiserte nucleotidsekvenser, er vist i fig. 7. Fremfor alt, er HBgAg et over måte hydrofobt molekyl som er rikt på prolin og cystein-rester. HBgAg ble undersøkt i det publiserte datamaskin-programmet til Kyte og Boolittle, som gir et fortløpende gjennomsnitt for de lokale hydrofobe egenskaper, og har vist seg å være svært pålitelige med hensyn til interne og eksterne proteinrester med kjent struktur. Dersom HBgAg betraktes med hensyn til områder, kan man skjeldne 3 hydrofobe og 2 hydrofile områder i molekylet. For enkelhelts skyld refereres det til hydrofile områder, men molekylet er i virkeligheten så hydrofobt, at det sannsynligvis er mer korrekt å betegne områdene som hydrofobe og mindre hydrofobe. Den største og mest hydrofobe region strekker seg omtrent over posisjonene 80 til 110. Dette hydrofobe området er inneslut-tet mellom to hydrofile områder, omfattende posisjonene 45 til 80, og 110 til 150. To øvrige hydrofobe områdene ble funnet ved N- og S-endene. Det meste av cysteinene er samlet i de to hydrofile områder. Totalt sett har man således et bilde av et hydrofobt molekyl med potensiale for komplekse konformasjoner bestemt av gjentatte krumninger ved proliner, og desulfidbindinger innen kjeden ved cysteiner. En slik struktur er i overensstemmelse med molekylets kjente resi-stens mot denaturering og nedbrytning av protolyttiske en-zymer. (Millman, I., Loeb, L.A., Bayer, M. og Blumberg,

B.S., (1970), J. Exp. Med. 131, 1190-1199). Følgelig kunne man ha forventet at det meste av molekylets antigeniske determinanter ville være dannet av aminosyrer som ligger fjernt fra hverandre i den lineære proteinsekvens, men som holdes tett sammen i rommet av molekylets tertiære struktur. Som sådan er HBgAg et utmerket prøvetilfelle for generaliser- ing av bruken av sammenhengende aminosyresekvenser ved ut-forming av syntetiske antigener ifølge foreliggende oppfinnelse .

Fremstilling av peptider.

I denne undersøkelsen ble peptider syntetisert ved å brukt fast fase-metoden, utviklet av Merrifield og hans kolleger. Hvert enkelt syntetisk peptid ble utsatt for syre-hydrolyse i vakuum, (6N. HCl, 110°C, 72 timer), og aminosyresammensetningen ble bestemt. Det ble ikke gjort noe forsøk på å fjerne multimere former, ettersom den eneste bruken av peptidene var som immunogener.

Binding av syntetiske peptider til bærerprotein♦

Alle peptidene med unntak av 1, 3a og 7 ble bundet til bærerproteinet KLH (keyhole limpet haemocyanin) gjennom peptidets cystein ved å bruke MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester) som bindingsreagens. Vanligvis ble 5 mg peptid oppløst i PBS (pH 7,5) eller Na-Borat buffer (pH 9,0), bundet til 3-4 mg KLH-MBS. pH ved oppløsningen av peptidet ble valgt for å optimalisere peptidoppløsligheten og innholdet av fritt cystein bestemt ved Ellman's metode, (Ellman, G.L. (1959), Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-93). For hvert peptid ble 5 mg KLH i 0,25 ml PBS omsatt med MBS oppløst i dimetylformamid i et molart forhold av KLH:MBS på 1:40, og omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. KLH-MBS

ble deretter kjørt gjennom Sephadex G-25, og vasket med PBS for å fjerne fritt MBS. Gjenvinningen av KLH fra toppfrak-sjonene fra kolonne-eluatet, målt ved O.D. 280, ble anslått til å være 80% . KLH-MBS ble deretter omsatt med 5 ml peptid, justert til pH 7-7,5 og omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Bindingseffektivitet ble målt ved hjelp av radioaktive peptider. Vanligvis ble 25-50 peptidmolekyler bundet pr.

100 000 dalton KLH.

Fremstilling av antipeptid- antistoffer.

Kaniner ble immunisert etter den følgende plan.

1) 200<y>g peptidbundet KLH i Freund's komplette medium (1:1) subcutant pp 0. <3ag, 2) 200 yg i Freund<*>s ufullstendige medium (1:1) subcutant på 14. dag, 3) 20 0 yg med 4 mg alum intraperitonealt på 21. dag. Det ble tatt blodprøver av dyrene 4 uker og 15 uker etter den første injeksjonen. Peptid 1 ble injisert uten KLH (1 mg/injeksjon) ifølge den samme plan.

Immunutfelling av syntetiske peptider.

Reaktiviteten hos de forskjellige antipeptid-sera ble bestemt ved deres evne til immunologisk å utfelle radio-ioderte målproteiner. Peptider ble merket med 1251ved hjelp av kloramin-T-reaksjonen dersom de inneholdt tyrosin, eller med Bolton-Hunter-reagens. Preparater av kappe-proteiner med høy renhetsgrad (en gave fra J. Gerin) ble merket med kloramin T. De radioiodinerte målene ble enten suspendert i PBS eller i RIPA (0,15M NaCl, 10 mM natriumfosfat,

pH 7,5, 1" NP40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS), og omsatt (5 x IO<6>cpm/reaksjon), ved<0>°c med 5 yl testserum eller normalt kaninserum i 1 time og utfellingene samlet opp ved hjelp av Staphylococcus aureus. Småkuler ble vasket med RIPA, deretter to ganger med 500 mM LiCl, 100 mM tris (pH 8,5) og opptelt. Variasjonene var omkring 20% ved duplikat-bestemmeIser.

Polyakrylamin- gel elektroforese av immunutfellinger.

Rensede Dane-partikler ( en gave fra W. Robinson) ble suspendert i RIPA og radioiodinert med kloramin T. Preparatet ble på forhånd klargjort to ganger ved inkubering ved 0°C med normalt kaninserum i 3 0 minutter, og med forma-linfiksert S. aureus i 30 minutter, fulgt av sentrifugering, (5 minutter ved 12 000 g), og deretter inkubert med 5 yl normalt, antipeptid 3 eller antipeptid 4-serum. Utfellinger ble samlet og vasket som ovenfor, suspendert i gel-ladnings-buffer, kokt, sentrifuert for å fjerne S. sureus, og utsatt for elektroforese på en 5-17% akrylamid- SDS-gel og autoradio-grafert.

Utvelgelse av peptider for syntese.

Betraktninger med hensyn til den fysiske struktur hos HBgAg såvel som variasjoner blant de 3 publiserte nucleotidsekvenser, avgjorde hvilke peptider som ble valgt ut for kjemisk fremstilling. I alminnelighet prøvde vi å velge ut regioner, slik at vi dekket en så stor del av protein-sekvensen som mulig, med peptider inneholdende en cysteinrest for å gi anledning til sammenbinding med et bærerprotein. Dersom nucleotidsekvensen ikke forutsa et cystein i en) aktuell region, ble et cystein plusset på ved C-enden av hensyn til sammenbinding. De syntetiserte peptider er understreket i fig. 1, og oppstilt i fig. 8.

Hele molekylet ble ikke syntetisert, ettersom det ble bedømt til mindre sannsynlig å lykkes med noen av regionene enn med andre. Området mellom 81 og 94 ble unngått på grunn av dets ekstreme hydrofobe egenskaper. Syntetiske peptider svarende til denne sekvensen måtte antas ikke å være oppløslige og selv om et antistoff mot dem kunne fremskaffes, kunne man ikke forvente at denne regionen ville være lokali-sert til overflaten på det naturlige molekyl. Av lignende grunner, ble en stor del (posisjonene 164 til 211) av det hydrofobe C-ende-området ikke undersøkt. Regionen mellom posisjonene 110-14 0 ble unngått etter som det ikke var samsvar mellom de tre publiserte nucleotid-sekvenser med hensyn til denne regionen. (Valenzuela, P., Gray, P., Quiroga, M., Zaldivar, J., Goodman, H.M. og Rutter, W.J. (1979), Nature, 280, 815,819, Pasek, M., Goto, T., Gilbert, W., Zink, B., Schaller, H., KacKay, P., Leadbetter, G. og Murray, K. (1979), Nature, 282, 575.579. Galibert,F., Mandart, E., Fitoussi, F., Tiollais, P. og Charnay, P. (1979), Nature, 281, 646-650). Peptider svarende til de ytterste N- og C-endene hos molekylet ble tatt med på grunn av tidligere suksess ved bruk av disse molekylregioner når den fullstendige tertiære struktur var ukjent. (Sutcliffe, J.G., Chinnick. T.M.,

Green, N., Liu, F.T. Niman, H.L. og Lerner, R.A. (1980), Nature, 287, 801-805. Walter, G., Scheidtmann, K-H,

Carbone, A., Laudano, A. og Doolittle, R.F. (1980), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 5179-5200). Gjenværende peptider ble valgt ut for å svare til hydrofile områder i molekylet, såvel som til prolin-innholdende knutepunkter melom hydrofile og hydrofobe omrader, hvor molekylet kunne forventes å krum-me seg og oppvise "hjørner". Peptidene 3a og 7 ble funnet å være uoppløslige, og ble følgelig ikke etterstrebet.

Antistoffer mot enkelte syntetiske peptider reagerer med naturlig NBgAg

Før testing av reaktiviteten mot naturlig NBgAg, var det viktig å forsikre seg om at det hadde oppstått en antistoffrespons mot det syntetiske peptid. Som det vil ses av dataene i tabell 2, var 6 av de 10 peptidene, når de var bundet til KLH, immunogeniske som bedømt ved evnen hos antiseraene til å utfelle de radioiodinerte peptider. Bare peptidene 4a, 8 og 8a oppviste ikke en anti-peptidrespons. Peptid 2 oppviste bare en marginal respons. Peptid 1 var en effektiv immunogen uten å kreve sammenkobling med KLH. Selv om graden var avhengig av tiden, indikerte tidlige blodprø-ver retningen av responsene.

For å bestemme hvorvidt antistoffene frembragte mot de forskjellige peptidene kunne reagere med HBgAg-molekylet, undersøke vi deres evne til immunoutfelling av radioiodert HBgAg som var blitt renset fra hepatitis B Dane-partikler. Når HBgAg ble suspendert i RIPA-buffer, utfelte 4 av de 7 antistoffer som reagerte mot det tilsvarende peptidet, også HBgAg. Nærmere bestemt, reagerte antistoffer mot peptidene 1, 3, 4 og 6 mot renaset HBgAg mens antistoffer mot peptidene 5, 5a og 6a ikke reagerte, på samme måte som de antisera som ikke møtte sine målpeptider (4a, 8 og 8a). Igjen oppviste antisera mot peptid 2 en marginal reaktivitet. I undersøkelsene vist i tabell 2, er det klart at der er variasjoner mellom kanin-sera som ble utsatt for iden-tisk behandling. I alle unntatt ett dyr, nr. 033 02, var 3-måneders responsen forutsibar ut fra de tidlige blodprø- , ver. Peptid nr. 8 var ikke særlig oppløslig, og mangel på respons hos to kaniner mot det må forsøksvis bli betraktet i lys av vår manglende evne, på grunn av oppløsligheten,

til å bestemme hvor effektivt det bandt seg til KLH.

Flere interessante trekk med hensyn til individuelle peptider som er immunogener, er åpenbart i tabell 2. Peptid nr. 6 er svært immunogent, og induserer antistoff som er reaktivt mot det selv, likesåvel som mot det naturlige HBgAg. Peptid nr. 6a (de 6 aminosyrene med C-enden hos peptid 6), selv om det er i stand til å indusere antistoffer mot seg selv, induserer imidlertid ikke antistoff som er reaktivt mot naturlig HBgAg. På den annen side, er nr. 4 i stand til å indusere antistoffet mot seg selv og naturlig HBgAg, mens heksamere ved C-enden (peptid nr. 4a) ikke gjør det. Peptid'nr. 1 er av spesiell interesse av to grunner. For det første avhenger dets immunogene evner ikke av en bærer, muligens fordi det i seg selv er av tilstrekkelig lengde til å indusere antistoff. Men mere interessant er det faktum at dets evne til å indusere antistoff som er reaktivt mot naturlig HBgAg, avhenger av pH'en brukt for å oppløsliggjøre immuno-genet. Ved pH 5", 3 er peptid nr. 1 fullstendig oppløselig, og oppviser 6 2% fritt cystein. Antistoffer frembragt mot peptidet som er oppløsliggjort ved denne pH, gjenkjenner mol-peptidet likesåvel som det naturlige HBgAg. Ved pH 8,5 er peptidet derimot knapt nok oppløselig (mindre enn 15%),

og oppviser intet fritt cystein. Når peptidet injiseres ved denne pH, frembringer det en dårlig respons mot seg selv og ingen mot HBgAg.

Selv om RIPA-buffer ikke vil antas å denaturere HBgAg, ønsket vi å undersøke immunreaktiviteten til molekylet under mere fysiologiske forhold. Antigenet ble følgelig suspendert i PBS (0,15 m NaCl 10 mM natriumfosfat pH 7,5), og omsatt med forskjellige antipeptidsera. Alle sera reagerte med HBgAg i PBS med den samme effektivitet som i RIPA (data som vist). Antistoffene gjenkjenner følgelig molekylet under forhold som er tilnærmelsesvis lik dets naturlige forhold. Antistoffer mot slike peptider kan derfor antas å virke såvel in vivo som in vitro.

For å fastslå hvilke(t) molekyl(er) i Dane-partikler som reagerer med antistoffer mot disse syntetiske peptider, ble rensede Dane-partikler (serotype adw) ødelagt ved hjelp av overflateaktive midler og proteinene ble radioiodert. De merkede proteiner ble felt ut med de forskjellige antipeptidsera og bestanddelene tilstede i utfellingene ble analy-sert på SDS-polyakrylamid-geler. 2 hovedbestanddeler med omtrentlig molekylstørrelse på 28 000 og 23 000 dalton ble spesifikt utfelt fra Dane-partikler ved hjelp av antistoffer som var reaktive mot naturlig HBgAg, fig. 9. 28 000 og 23 000 dalton-artene svarende til de tidligere beskrevne (Dane, D.S., Cameron,D.H. og Briggs, M. (1970) Lancet 695-698 . Peterson, D.L.., Roberts, I.M. og Vyas, G.N. (1977), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 1530-1534. Shih, J., og Gerin, J.D. (1977), J. Virol. 21, 347-357) to hovedformer av HBgAg (I og II) som er forskjellige med hensyn til glykosylerings-grad. Dessuten reagerte antisera mot peptid 3 (fig. 3) og peptid 6 (data ikke vist) også med proteiner på omtrent 47 000 og 170 000 dalton, som antakeligvis utgjør multimere former eller forløpermolekyler. 47 000 dalton-artene er sannsynligvis den dimere formen av HBgAg (Mishiro, S.,

Imai, M., Takahashi, K.f Machida, A., Gotanda, T., Miyakawa, Y. og Mayumi, M., (1980, J. Virol., 124, 1589-1593. Koistinen, V., (1980), J. Virol. 35, 20-23). Antisotffene

er således rettet mot et protein funnet i det kjente etio-logiske middel mot hepatitis B.

De grunnleggende molekyler som er forløpere for HBgAg stemmer overens med data fra Robinson hvor kjennetegn som skriver seg fra trypsin viser at enkelte steder hos formene med høyere molekylvekt svarer til de hos HBgAg, mens andre steder ikke gjør det, (Robinson, W., personlig meddel-else) . Mens alle antistoffer som reaktive med HBgAg gjenkjenner 23 000 og 28 000 dalton-formene i HBgAg hos Dane-partikler, gjenkjenner bare noen formene med høyere molekylvekter. Antagelig er konformasjonen og/eller graden av glykosylering hos de større formene slik at det aktuelle peptidet er gjemt. Alternativt kan omdannelsen av forløp-eren omfatte binding til proteiner eller cellulære strukturer som skjuler mol-proteinet.

Det følgende peptid ble bestemt, ved hjelp av de samme fremgangsmåter som utviklet ovenfor, og har spesifike antigeniske determinantkarakteristika for hepatitis B: PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArg

ThrCysMetThrThrAlaGlnGlyThrSerMetTyrProSerCys

Den venstre og høyre halvdel var også spesifike antigeniske determinanter, og som spesielt omtalt, virker regioner på 6 eller flere aminosyrepeptider, valgt fra kjente antigeniske determinanter også som spesifike antigeniske determinanter når de er fremstilt og prøvet ved fremgangsmåten beskrevet her.

Munn- og klovsyke.

Den samme fremgangsmåte ble også bruke for å ut-lede og fremstille syntetiske peptider som er spesifike antigeniske determinanter mot munn- og klovsyke-virus, som har de følgende sekvenser:

og, selvfølgelig, peptidet som kodes for av hene genomet, (Kupper, H., Keller, W., Kunz, C, Forss, S., Scholler, H., Franze, R., Strohmair, K., Marquardt, 0., Zeslovsky, V.G.,

og HafSchneider, P.H., "Cloning av cDNA of major antigen of foot and mouth disease virus and expression in E.coli.,", Nature 289: 555.559, (1981), se fig. 10.

Influensa.

Den generelle fremgangsmåten ble anvendt i fremstillingen ved å gå ut fra genomet til influensa-satmme X-47

(M. Verhoeyen, R. Fong, W. Min Jou, R. Dévos, D. Heijlebroek, E. Samon&W. Fiers, (1980), Nature 286, 771; A.G. Porter,

C. Barber, N.H. Carey, R.A. Hallewell, G. Threlfall, J.S. Emtage, (1979), Nature 282, 471) og bruke informasjon fra beslektede arter til å forutsi potensielle spesifike antigeniske determinantregioner (I.A. Wilson, J.J. Shehel, D.C. Wiley (1981), Nature 289, 366). Et antall av peptidregio-nene som det kodes for i genomregionene avmerket i fig. 11

er blitt fremstilt , og den generelle fremgangsmåten er således etterprøvet. Ytterligere bevis er fremskaffet, og det er ingen tvil om at metoden er vanlig under forutsetning av en tilnærmelse til fremstillingen av antigener og antigeniske og antistoff-fremstillinger av den type som er beskrevet heri.

Integrerte antigen- bærere.

Det er vanligvis nødvnedig å knytte det spesifike antigeniske determinantpeptidet til en bærer for å initiere en antistoffrespons i en vert. I noen tilfeller, dersom peptidet er tilstrekkelig stort, kan peptidet tjene som bærer. Mens mange bærere er tilgjengelige for laboratoriebruk, er antallet bærere godkjent for bruk i klinske preparater i virkeligheten svært begrenset. Disse problemene er fjernet av en nyanse ved" foreliggende oppfinnelse: Fremstillingen av poly(peptid)polymerer og kopolymerer.

Etter å ha identifisert de spesifike antigeniske peptidene og bevist at de frembringer antistoffer hos den aktuelle organisme, kan man fremstille et antigen som hovedsakelig består av spesifike antigeniske determinantpeptider bundet sammen som homopolymerer av repiterende enheter av det samme peptid, som kopolymerer av to eller flere spesifike antigeniske determinantpeptider (som kan initiere antistoffer hos den samme eller en annen naturlig forekommende organisme) eller som kopolymerer med andre peptider, hvorav noen aller alle ikke er antigeniske determinanter. Teknik-kene med å binde peptidkjeder sammen er velkjente, hittil har det imidlertid hverken vært mulig å fullføre de resulterende produkter som beskrevet, som er et nytt resultat, eller foreslått å fremstille poly(peptidspesifik antigenisk determinant)polymerer eller kopolymerer.

Et eksempel på et slikt antigen er poly(spesifik antigenisk determinantpeptid) hos hepatitis B vist i fig. 12.

Liposomer.

Liposomer som innbefatter spesifike antigeniske determinantoverflateenheter fremstilles ved å binde flere av peptidspesifike antigeniske determinanter til en fettsyre-enhet, f.eks. en stearylenhet, og omsette de resulterende stearylpeptider med en lipidrik kjerne. Stearylenhetene orienterer seg mot og "oppløses" i kjernen og resulterer derved i et liposom som oppviser flere spesifike antigeniske determinantpeptider. Alle peptidene kan være den samme spesifike antigeniske determinant, eller et antall spesifike antigeniske determinanter for det samme eller forskjellige naturlig forekommende antigener for den samme eller forskjellige organismer kan tilføres som en del av det spesifike antigeniske determinantliposom. Antigeniske liposomer av den omtalte type har hittil ikke vært fullført eller mulig .

Drøfting.

I bredt perspektiv illustrerer de foreliggende undersøkelsene at man kan ta en gitt nucleotidsekvens, kjemisk syntetisere' flere peptider fra forskjellige områder i det forutsatte protein, og mot noen av disse fremskaffe antistoffer som er reaktive mot den naturlige struktur. Ettersom hepatitis-molekylet ikke ble valgt ut for undersøk-elsen på grunn av strukturelle trekk som tydet på unike muligheter for å lykkes, tyder våre resultater på at strategien er generell, og skulle virke for ethvert molekyl, såfremt tilstrekkelig mange områder undersøkes. Med hensyn til re-gler som vi har lært å overholde, er at peptider med begrenset oppløslighet eller de som inneholder færre enn 6 aminosyrer, er et dårlig valg. Alle de virksomme peptider inneholdt ett eller flere proliner, et faktum som er i overensstemmelse med dets kjente nærvær i krumninger. I denne undersøkelsen viste 4 av 6 oppløslige peptider, varierende fra 10 til 34 rester, å være brukbare. Generell anvendelse av denne teknikken for å finne ukjente proteiner ut fra de kjente nucleotidsekvensene i deres gen, er nå mulig.

Tidligere undersøkelser vedrørende overflateantigenet hos hepatitis B konkluderte med at det var et molekyl med avgjørende avhengighet av konformasjonen ved fremstilling av antistoffer reaktive mot den naturlige struktur. Vyas og kolleger antok at reduksjonen og alkylering av di-sulfidbindingene i hepatitis B-antigenet resulterte i fullstendig tap av antigene-egenskaperi, (Vyas, G.N., Rao, K.R.

og Ibrahim, A.B. (1972) Science 178: 1300-1301). De foreliggende resultater viser derimot at det finnes determinanter i HBgAg som ikke er avhengig av noen konformasjon annen enn den som kan oppnås av korte peptider. Når de to under-søkelsene betraktes samlet, konkluderer man med at en lineær sekvens som del av en større denaturert struktur, enskjønt alkylert, ikke ville frembringe antistoffer som er reaktive mot det naturlige molekyl, mens den samme sekvens fri for påvirkning av nærliggende aminosyrer, vil frembringe slike antistoffer.

Det er områder i HBgAg som det gjenstår å utforske ved å bruke syntetiske polypeptider. Vi vet lite om molekylet mellom pos-isjonene 110 til 140, og 162 til 210. Den hydrofile region mellom 110 og 140 er av spesiell interesse på grunn av den store graden av variasjon mellom de forskjellige, avvikende sekvenser. Interessant nok var plasma som ble brukt som en kilde for Dane-partikler i undersøkel-sen av Pasek et al., av en kompleks serotype (adw og agw), og disse forfatterne fant mikroheterogenitet i regionen til frekvensen som svarer til HBgAg. Muligens svarer sekvens-variasjonen mellom 110 gil 135 til området i molekylet som svarer for typespesifisiteten hos HBgAg. Regionen som spenner over posisjonen 40-50 viser også signifikant hetero-genitet mellom de 3 nucleotidsekvensene. I denne sammenheng er det av interesse at antistoffer laget mot peptid nr. 5, som svarer til regionen forutsagt fra nucleotidsekvensen til Pasek et al., ikke reagerer med vårt prøvehylster, (serotype adw). Dette kan skyldes det faktum at i denne regionen, muligens en annen region med typespesifik variasjon, svarte ikke peptidene som vi valgte ut til hylster-peptidet som vi brukte.

Resultatene som er frembragt her bekrefter de generelle mulighetene som man har for å syntetisere peptider forutsatt fra nucleotidsyresekvenser, og fremskaffe antistoffer som er reaktive mot det naturlige molekyl. Slike antistoffer er unike reagenser idet at de reagerer med en liten region i det naturlige molekyl, som på forhånd er kjent av den som utfører eksperimentet. Antistoffer laget på denne måten skiller seg følgelig fra hybridoma som, selv om de er nyttige ved utførelsen av undersøkelser av hele molekyler, må karakteriseres ytterligere for finstrukturana-lyse av proteinområder.

Syntetiske peptider fremstilt ved å bruke nucleotidsekvenser som skjema, burde vise seg å være idelle for bruk i vaksinasjon. F.eks. gir en kombinasjon avpolypep-tider (slik som 1, 3, 4, 6 i denne undersøkelsen) bred beskyttelse mot hepatitis B-virus, og overvinner derved biologiske variable slik som forskjeller i serotype og antigeniske endringer i det infiserende middel, såvel som individuelle variasjoner i immunresponsen hos verten.

Det skal presiseres at utskiftinger av enkelte aminosyrer kan gjøres far å gi ekvivalente, spesifike antigeniske determinanter, som er kjente, og fullstendig ekvivalente antigeniske determinanter fremstilt og etterprøvet som omtalt her, kan adskille seg med hensyn til et begrenset antall aminosyrer i peptidsekvensen. Alt dette er tatt i betraktning innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Hovedtrekkene ved denne oppfinnelsen er anvendbarheten på alle patogener hvor det er en assosiert oligo-peptidantigenisk determinant som initierer en immunologisk respons hos verten.

EKSEMPEL - Bakterier.

Når f.eks. patogenen er bakteriell, og innføringen av bakteriene i verten initierer produksjon i verten av antistoffer, som tenderer til å binde og nøytralisere bakteriene, identifiseres delen av det bakterielle genom som koder for en mulig antigenisk determinant ved å bruke kjente genetiske teknikker. Det aktuelle gen klones deretter og dets nucleotidsekvens bestemmes ved å bruke kjente teknikker for kartlegging av DNA. Ut fra nucleotidsekvensen og den genetiske kode, bestemmes aminosyresekvensen for den sannsynlige anti-genproteinregion. Et stort antall av potensielle antigeniske determinanter syntetiseres deretter kjemisk, bindes til en bærer for å danne et potensielt antigen, og innføres i en egnet vert. Det således framstilte potensielle antigen som initierer produksjon av antistoffer, som binder og nøytra-liserer bakterier, og ikke er skadelig for verten, påvises ved kjente immunokjemiske teknikker. Antigener som således er påvist å indusere denønskede immunologiske beskyttelse, fremstilles deretter i en hvilken som helst ønsket mengde,

og kan brukes til å produsere beskyttende antistoffer i en vert. Antistoffer kan utvinnes for å fremstille oligo-spesifikt antistoff, f.eks. for bruk i diagnoser. Dette er selv-følgelig nøyaktig fremgangsmåten beskrevet til å begynne med for fremstilling av en antiviral vaksine, med unntak av at siktemålet er bakterier istedet for virus.

EKSEMPEL - Sykdommer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan f.eks. brukes ved fremstilling av vaksiner til beskyttelse mot og/ eller diagnostiske preparater av antistoff for identifisering av bakteriesykdommer hos dyr, slik som anthrax (Bacillus anthracis), svartfot (Clostridium chauvoei), og svinekolera (Erysipelothrix rhusiopthiae), samt virusdykdommer slik som viral svinekolera, munn- og klovsyke, og rabies. Vaksiner og antistoff mot bakteriesykdommer, slik som difteri (Coryne-bacterium diphtheriae), skarlagensfeber (Streptococcus pyo-genes), tuberkulose (Myobacterium tuberculosis), og kikhoste (Bordetella pertussis), og tyfus (Salmonella typhi), og virussykdommer slik som kopper (Variola major, Variola minor), meslinger (Rubeola), 3dagers meslinger (Rubella), kusma (Epidemic parotitis), influensa, og polymyelitt kan fremstilles ved fremgnagsmåten eller fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelsen. Det skal bemerkes at vaksiner beskrevet her er fri for bivirkninger, som har begrenset generell bruk av visse tidligere kjente vaksiner. F.eks. er, ifølge foreliggende oppfinnelse, en vaksine som består vesentlig av et syntetisk peptid hvis sekvens er utledet fra se-kvensbestemmelsen av DNA, som omfatter den spesifike antigeniske determinant for en bestemt stamme av influensavirus på en bærer og som er fri for bivirkninger som har begrenset bruken av tidligere kjente influensavaksiner, nå mulig.

Bred beskyttelse, uten alvorlige bivirkninger, mot influensa, kan oppnås ved å fremstille vaksiner som beskrevet her mot de vanlige eller forventede stammer av influensainduserende virus. Fremstillingen av vaksiner og antistoffpreparater for beskyttelse mot og diagnose av de ovenfor nevnte bakterielle og virale sykdommer, er selvfølgelig kun eksempler på det generelle formålet og anvendbarheten av oppfinnelsen.

Sopper, gjær, somatiske celler.

Den generelle ide og fremgnagsmåter ifølge oppfinnelsen er også anvendbare ved forhindring av patogene reaksjoner mot andre organismer, slik som sopper, gjær og patogene, somatiske cellefragmenter, hvorved den antistoff-anti- genbinding oppstår for å inaktivere organismen eller for å nøytralisere eller forhindre den patogene reaksjon av organismen i verten. Nøyaktig samme fremgangsmåte anvendes ved sopper og gjær, nærmere bestemt identifiseres den delen av organismegenomet som koder for det polare protein. Det aktuelle gen klones deretter og dets nucleotidsekvens bestemmes. Nucleotidsekvensen brukes deretter for å bestemme aminosyresekvensen hos det sannsynlige antigenprotein, og et stort antall potensielle antigeniske determinanter syntetiseres kjemisk, bindes til en bærer og injiseres hos en egnet vert. Den immunologiske responsen for hvert slikt "antigen" fastslås og den bestemte, spesifike antigeniske determinant av immunologisk interesse, identifiseres som knyttet til et bestemt antigen og som igjen har produsert antistoffer mot organismen som ikke reagerer i alvorlig grad med verten. Det således identifiserte, spesifike antigen-

isk determinant inneholdende peptid, syntetiseres deretter kjemisk i slike mengder som er ønsket, og vaksinen produ-

sert ved å binde peptidet til en bærer, brukes for å beskytte en vert mot organismens patogene egenskaper. Oligo-spesifike antistoffer for diagnostiske eller andre formål, kan også utvinnes.

EKSEMPEL - Diagnostiske teknikker.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan brukes

f.eks. ved fremstilling av diagnostiske tester, slik som immunoprøver, hvor det er nødvendig å ha antistoffer mot organismen som skal påvises eller et syntetisk antigen som etterligner en determinant på organismen som skal påvises. Slike diagnostiske teknikker omfatter f.eks. enzym-immunprøve, radioimmunprøve, fluorisensimmunprøve og andre teknikker hvor enten antistoffet eller antigenet er merket med en påvisbar merkelapp.

Ved således å bruke den doble antistoffteknikken. • trukket opp av Voller et al., "Enzym Immune Assays in Diag-nostic Medicine<r>, Bulletin of the World Health Organization, bind 53, sidene 55-65 (1976, en ELISA-prøve utført for å bestemme anvendbarheten av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av diagnostiske tester. Anti-R-serum og R-pentadecapeptidantigenet (oppnådd som beskrevet ovenfor), ble anvendt. Noen av antistoffet var konjugert med peroksy-daseenzym fra pepperrot ved periodid-metoden til Nakana og Kawaoi, Journal of Histochemistry and Cytochemistry, bind

22, sidene 1084-1091 (1984) . Ved å følge kjente enzymimmun-prøveteknikker ble en Linbro-plate dekket med renset antistoff og vasket. R-proteinet ble deretter til satt enkelte av brønnene i platen, fulgt av en inkuberingsperiode og en annen vask. Tilslutt ble antistoffet-peroksydasekonjugatet tilsatt alle brønnene fulgt av en annen inkubering og en 3. vask. Tilsats av substrat til brønnene ga en positiv respons (farge) i de brønnene hvor antigen var tilsatt, men ikke i de brønnene hvor antigen ikke var tilsatt, for på den måten å demonstrere hvor praktisk testen er.

På en lignende måte kan andre immunoprøvingstester utføres ved å bruke produkter fremstilt ved å følge fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL - Passiv immunisering.

For mange sykdommer oppnås beskyttelse ved å injisere en vaksine (inneholdende en svekket organisme) i subjektet som skal beskyttes, hvoretter subjektitet genererer antistoffer mot den svekkede organisme i vaksinen. Mens denne teknikken er praktisert for mange sykdommer, finnes der andre sykdommer hvor den foretrukne rute for beskyttelse er injeksjon av antistoff mot sykdommen, istedenfor injeksjon av et materiale som vil forårsake produksjon av dette antistoff hos subjektet. Denne type immunisering kalles "passiv immunisering".

I tilfeller hvor passiv immunisering er ønsket,

kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse utnyttes for å fremstille antistoffer mot determinanter på den respektive sykdomsorganisme, hvoretter antistoffene kan brukes for passiv immunisering.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt brukbar med hensyn til fremstilling av vaksiner mot sykdommer som er enten farlige å håndtere eller vanske-

lige å dyrke, slik som hepatitis B; rabies, gulfeber og forskjellige riketsiaer (f.eks. Q-feber).

Antistoffer fremstilt mot R-pentadecapeptid-anti-

gen produsert som beskrevet, er blitt konjugert med ferritin, (Singer, S.J. og Schick, A.F., J. Biophys, Biochem, Cytol., 9:519 (1961)), og omsatte forbinde de antigeniske stedene på viruspartikler, for derved å passivisere viruset. Over-falten på en viruspartikkel med de antigeniske punktene er bundet til antistoffer indusert ved hjelp av syntetisk anti-

gen visualisert med ferritin-konfigurajon er vist i fotogra-fiet på fig. 6.

På lignende måte fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse, en vaksine mot en organisme som induserer fremstilling av antigen hos verten. Genomdelen som koder for produksjon av antigenet i verten, identifiseres ved genetiske teknikker. Mer enn en del kan forsøksvis identifiseres og hver del føres gjennom til det endelige bevis med hensyn til hvilken del som faktisk koder for den antigeniske determi-

nant hos .det induserte antigen. Hvert gen av interesse blir deretter klonet og dets nucleotidsekvens bestemt hvoretter aminosyresekvensen hos det aktuelle peptid bestemmes ved konvensjonell genetisk koding. De respektive peptider syntetiseres og bindes til bærere for å danne potensielle antigener hvori den antigeniske determinant er peptidkjeden. Disse antigenene innføres i verten og antigenet som initierer produksjon av antistoffer mot det induserte antigen, identifiseres ved konvensjonelle immunokjemiske metoder. Etter injeksjon av dette antigen i verten, produseres antistoffer som binder og inaktiverer det patogene antigen, fremstilt av,

men ikke uttrykt i, organismen og beskytter mot eller be-grenser den patogene virkning i verten. Antistoffene kan selvfølgelig utvinnes. Et eksempel på denne anvendelse av foreliggende oppfinnelse er fremstilling av vaksine for beskyttelse mot kreft indusert av Rous sarcoma-viruset, og fremstillingen av diagnostiske oligospesifike antistoffer.

Andre patogener, inkludert kjemiske patogene midler, kan også indusere fremstilling av antigene proteiner i verten. Foreliggende oppfinnelse muliggjør identifiser-ingen av det gen, enten i en patogen organisme, eller i ver- v.i ten, som koder det antigene protein, fastleggingen av genets sekvenser, syntetisering av peptider som inkluderer den spesifike antigeniske determinant og fremstilling av antigenet som beskrevet her.

Det vil lett forstås at det sikkert vil være andre anvendelser av foreliggende oppfinnelse for fremstilling av vaksine mot sykdommer hvor den spesifike antigeniske determinant ikke gir seg uttrykk i den patogene organismen som sådant, etterhvert som slike organismer identifiseres og forstås.

Industriell anvendelse.

Muligheten for å produsere antigener som induserer en og kun en immunologisk respons, fremstillingen av antistoffer mot en patogen og det å fremstille antistoffer som binder og inaktiverer kun en antigendeterminant, er av enorm industriell og økonomisk viktighet for dyrehushold f.eks., for ikke å snakke om betydningen av disse teknikker for enkeltmennesker. Foreliggende oppfinnelse finner anvendelse i fremstillingen av vaksiner for dyr og også for mennesker, og i fremstillingen av antistoffer for diagnose og for behandling av dyre- og menneskesykdommer.

Claims (16)

1 Peptid, karakterisert ved at aminosyresekvensen til peptidet er avledet fra et naturlig forekommende genom, peptidet er syntetissert in vitro og duplikerer i det vesentlige sekvensen hos et naturlig forekommende, spesifikt antigenisk determinantpeptid.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av peptider, egnet for bruk i diagnostiske og terapeutiske fremgangsmåter, karakterisert ved trinnene å identifisere den delen av genomet hos en organisme som koder for peptid som potensielt er en spesifik antigenisk determinant, å bestemme nucleotidsekvensen i genet, å klarlegge aminosyresekvensen i peptidet ut fra nucleotidsekvensen i genet, å syntetisere kjemisk i det minste ett peptid, å fremstille et antigen av nevnte peptid og en bærerdel, å innføre det resulterende antigen i en vert, å bestemme immunologisk hvilket antigen fremstilt på denne måten som induserer anti-stof f produksjon mot organismen, og syntetisere kjemisk nevnte peptid i produksjonsmengder for bruk i diagnoser eller terapi.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot et antigenprotein, indusert i en vert av en patogen, karakterisert ved åi identifisere delen av det gen som koder for det induserte antigenprotein i verten, klone det således identifiserte gen, fastlegge nucleotidsekvensen i det klonede gen, klarlegge aminosyresekvensen til det induserte antigenprotein ut fra nucleotidsekvensen til genet, syntetisere kjemisk i det minste ett peptid, binde det således syntetiserte peptid til en antiben-bærer, innføre antigenet frembragt av bæreren og det tilknyttede peptid i en vert, fastlegge immunologisk hvilket av de således fremstilte antigener som induserte produksjon av antistoff mot antigenproteinet og syntetisere kjemisk peptidet i det således fastlagte antigen i terapeutiske mengder.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffprepa-rat, karakterisert ved ål identifisere den delen av genomet hos en organisme som koder for et potensielt antigenisk peptid, klone det således identifiserte gen, bestemme nucleotidsekvense til det klonede gen, klarlegge aminosyresekvensen til det polare antigenprotein ut fra nucleotidsekvensen til genet, syntetisere kjemisk i det minste ett peptid, binde det således syntetiserte peptid til en antigenbærer, innføre antigenet frembragt av bæreren og det tilknyttede peptid i en vert, bestemme immunologisk hvilke antigen av de således fremstilte antigener som induserte antistoffer mot organismen og utvinne antistoffer fra verten.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av antigen som omfatter en syntetisk, antigenisk peptid-region og en bærer, karakterisert ved ål bestemme strukturen av den antigeniske peptid-region ved kartlegging av genomet som styrer produksjonen av i det minste en antigenisk determinant av et naturlig forekommende antigen, og deretter bestemme ut fra genomkartet, sekvensen til peptidet som nevnte genom koder for, fulgt av kjemisk å syntetisere den antigeniske peptid-region hvis sekvens var således bestemt, og danne et antigen som opfatter nevnte antigeniske region.

6. Antigen, karakterisert ved at det i det vesentlige består av en kjemisk syntetisert, antigenisk peptid-region og bærer, idet peptidet har en sekvens som ble bestemt ut fra genomet som styrer produksjonen av i det minste den antigeniske determinant hos et naturlig forekommende antigen, antigenet er fritt for naturlig forkommende proteiner og proteinfragmenter, den antigeniske peptidregion er i det vesentlige et duplikat av en naturlig forekommende antigenisk determinant, og i stand til å initiere produksjon av antistoffer mot nevnte naturlig forekommende antigeniske determinant, når den injiseres i en vert-organisme.

7. Antigen, karakterisert ved at det i det vesentlige består av en bærer og et kjemisk, syn tetisert peptid, som i det vesentlige er en duplikat av en naturlig forekommende antigenisk region i et protein som induserer immunologisk respons i en vert infisert med en organisme hvori et slikt protein ikke er kommet til uttrykk, idet sekvensen til det kjemisk syntetiserte peptid er bestemt ut fra genomet hos organismen som styrer produksjonen av nevnte naturlig forekommende antigeniske region.

8. Antistoff, karakterisert ved at det er dyrket i en vert som respons på innføring i nevnte vert av den antigene sammensetning som består i det vesentlige av en bærer og et kjemisk syntetisert peptid som i det vesentlige er en duplikat av en naturlig forekommende antigenisk region hos et protein som induserer en immunologisk respons i en vert infisert med en organisme hvori et slikt protein ikke er kommet til uttrykk, idet sekvensen til det kjemisk syntetiserte peptid er bestemt ut fra genomet hos organismen som styrer produksjonen av nevnte naturlig forekommende antigeniske region.

9. Antistoff, karakterisert ved at det er dyrket i en vert som respons mot innføring i nevnte vert av et antigen bestående i det vesentlige av en kjemisk syntetisert, antigenisk peptid-region, og en bærer, idet peptidet har en sekvens som ble bestemt ut fra genomet som styrer produksjonen av i det minste den antigeniske determinant hos et naturlig forekommende antigen, antigenet er fritt for naturlig forekommende proteiner og proteinfragmenter, den antigeniske peptidregion er i det vesentlige en duplikat av en naturlig forekommende antigenisk determinant, og i stand til å initiere produksjonen av antistoffer mot nevnte naturlig forekommende antigeniske determinant når den injiseres i en vertorganisme.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av antigensammen-setning, karakterisert ved trinnene å: bestemme ut fra genomet til en organisme, regioner i peptidet, koder"for av dette genomet, de regioner i nevnte peptid som synes å inneholde spesifike antigeniske determinant-deler, syntetisere kjemisk i det minste en slik region i nevnte peptid, danne et potensielt antigen av nevnte region i nevnte peptid, injisere nevnte potensielle antigen i en vert, fastlegge om nevnte potensielle antigen induserer antistoffer iverten mot nevnte organisme, og fremstille antigen fra kjemisk syntetisert peptidregioner som ved de foregående trinn er vist å indusere i verten antistoffer mot naturlige, spesifike, antigeniske determinanter hos nevnte organisme.

11. Antigen, karakterisert ved at det i det vesentlig består av flere syntetiske, spesifike antigeniske peptid-determinantregioner hvorav i det minste noen av regioneen er i det vesentlige duplikater av en naturlig forekommende spesifik antigenisk determinantregion, idet nevnte antigen induserer, når innføre i en vert, antistoffer mot nevnte naturlig forekommende spesifike antigeniske determinantregion.

12. Antistoff, karakterisert ved at det er isolert fra en vert, idet nevnte antistoff resulterer fra innføringen i nevnte vert av antigen, som i det vesentlige består av flere syntetiske, spesifike antigendeterminant-peptidregioner, hvorav i det minste noen regioner er i det vesentlige duplikater av en naturlig forekommende spesifik antigenisk determinantregion, nevnte antigen induserer når det innføres i en vert, antistoffer mot nevnte naturlig forekommende, spesifike antigeniske determinantregion.

13. Peptidregionkopolymer, karakterisert ved at den i det vesentlige består av i det minste to syntetiske, spesifikt antigeniske peptiddeterminantregioner som svarer til naturlig forekommende spesifikt antigeniske determinantregioner knyttet til en organisme som en vert gir en immunologisk respons, de nevnte syntetiske peptidregioner er kjemisk bundet med en polymer av gjentatte enheter av nevnte syntetiske, spesifikt antigeniske peptid-determinantregioner, og er i stand til å initiere produksjon av antistoffer mot nevnte naturlig forekommende, spesifikt antigeniske determinantregioner.

14. Antigen, karakterisert ved at det i det vesentlige består av en bærerdel og en eller flere syntetiske, spesifikt antigeniske peptiddeterminantregioner valgt fra gruppen bestående av:

(ww) ethvert peptid som består av i det minste en sekvens på 6 eller flere aminosyrer valgt fra sekvensen i (a) til (w") ovenfor.

15. Liposom, karakterisert ved at det i det vesentlige består av en lipidrik kjernedel som i det minste har en syntetisk, spesifikt antigenisk peptiddetermi-nant tilknyttet ved hjelp av en lipidenhet bundet til peptidet, idet nevnte syntetiske, spesifikt antigeniske peptid-determinant i det vesentlige duplikerer en naturlig forekommende antigenisk determinant.

16. Syntetisk, spesifikt antigenisk determinant, karakterisert ved en syntetisk peptidregion og en lipidenhet bundet til peptidregionen, idet peptidregionen i det vesentlige duplikerer en naturlig forekommende antigenisk determinant.