KR870000702B1 - 합성 항원 펩티드의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 Mo-MuLV 프로비루스의 3′말단의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 도면.
제2도는 본 발명에 따른 새로운 합성 왁찐의 항혈청을 비롯한 여러 가지의 항혈청과 반응된 라벨을 붙인 SCRF 60A 세포 용해질의 SDS-PAGE 분리 방사선 사진도.
제3도는 Mo-MuLV 프로비루스에 대한 수정된 유전자 지도.
제4도는 제2도에 도시된 SCRF 60A의 라벨을 붙인 세포 용해질의 SDS-PAG E 분리의 방사선 사진도.
제5도는 Mo-MuLV 및 AKO 비루스의 유전자 지도들의 부분 대조도.
제6도는 본 발명에 따른 R-합성 항원예에 대하여 증식시키고 육안 식별을 위하여 페리틴(ferritin)과 접합시킨 항체에 의해 채색시킨 비루스 입자 표면의 전자 주사 광현미경 사진도.
제7도는 펩티드 서열과 위치(제7도에서의 밑줄 그은 잔기에 대응함)를 나타낸 도면. 밑줄 그은 잔기는 일차 단백질 서열에는 없었으나, 캐리어에 결합하거나 방사성 요오드화 반응을 위하여 첨가하였다. 펩티드 1,3a 및 7을 제외한 모든 펩티드는 이 명세서 중의“방법”의 항목에서 기재한 대로 캐리어 단백질 KLH와 결합시켰다. 펩티드 3a 및 7은 불용성이기 때문에 사용하지 않았다.
제8도는 합성용으로 선택된 단백질 부위들을 나타내기 위하여 단문자의 코오드 (A ala, C cys, D asp, E glu, F phe, G gly, H his, I ile, K lys, L leu, M met, N asn, P pro, Q gln, R arg, S ser, T thr, V val, W trp, Y tyr)로 나타낸 핵산 서열로부터 파세크(Pasek)와 그의 공동 연구자들이 번역한 바와 같은 226 아미노산 서열을 펩티드에 나타내는 도면. 이들 펩티드에 대응하는 굵은 선으로 밑줄을 그은 부위들은 1∼8 또는 3a∼6a, 8a의 번호가 붙여 있다. 굵은 밑줄의 말단에 위치한 C 또는 Y는 일차 서열에서 발견되지 않는 시스테인이나 또는 티로신을 기술적 이유 때문에 첨가시키지 않은 경우를 나타낸다. 3개의 뉴클레오티드 서열 결정기 중에서 모두 동일하지 않은 잔기는 가는 밑줄로 나타나 있다. 이들은 여러 개가 110∼140 사이에 밀집되어 있다.
제9도는 정상의 항펩티드 3 또는 항펩티드 4 혈청의 5㎕와 반응시킨 방사성 라벨을 붙여 정제 처리한 데인 입자(Dane particles)의 방사선 사진도. 침전물들을 수집하여 본 명세서의“방법” 항목에서 설명한 전기 영동법용으로 준비하였다. 시료들을 5 내지 17% SDS-폴리아크릴 아미드 겔 상에서 전기 영동을 행하여 방사선 사진을 촬영하였다.
제10도는 발굽 및 구강 질병의 게놈과 펩티드 서열내에 번역시에 특이성 항원 결정기 부위로 될 수 있는 부위를 나타낸 도면.
제11도는 인플렌자 X-47 군주와 잠재 특이성 항원 부위의 게놈과 이 게놈의 번역을 도시한 도면. 시스틴은 결합을 위한 잠재 항원 결정기로 생각되는 펩티드 부위에 첨가시키며, 티로신은 라벨(방사성 라벨)을 펩티드에 부치기 위하여 첨가시킨다.
제12도는 폴리(특이성 항원 결정기 펩티드) 공중합체 항원을 나타낸 도면.
본 발명은 DNA 서열에 의하여 유도되는 정보에 기초한 새로운 합성 항원의 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 설명하자면, 본 발명은 면역학적으로 천연 단백질(항원)의 일부에 대응하는 합성 항원 결정기(antigenic deferminants, 抗原決定基)를 캐리어(carrier)에 결합하여 형성시킨 전술한 합성 항원의 제조 방법에 관한것이다.
선행 기술에서는, 항원은 천연 물질로부터의 유도, 합텐(hapten)의 캐리어에의 결합 및 또는 재조합 DNA 기법에 의한 것 등의 여러 가지 방법으로 얻어져 왔다. 또, 어떤 합성 항원에 대해서는 셀라(Sela)와 그의 공동 연구자의 방법(Proc, Nat, Acad. Sci., U.S.A. Vol. 68, No. 7, pp.1450∼1455, July 1971; Sciance Vol. 166, pp.1365∼1374, December 1969; Adv. Immun., Vol. 5, pp.29∼129, 1966)이 알려져 있다.
천연 물질로부터 유도되는 항원으로서는, 혈액형 항원, HLA 항원, 분화(分化) 항원, 비루스 항원 및 박테리아 항원 등 무수히 많은 항원들이 알려져 있다. 최근, 이들 항원을 확인하고 연구하는 데 상당한 노력이 경주되어 왔다.
어떠한“합성”항원은 디니트로페놀과 같은 작은 분자들을 소의 혈청 알부민과 같은 캐리어 분자에 결합시켜 제조하여 왔는데, 이에 따라 결합된 작은 분자에 항체 생성을 유발하는 항원이 생성된다. 소분자 자체는 그것이 주입되어 있는 동물의 면역계에 의해서 인식되지 않을 것이기 때문에 캐리 분자가 필요한 것이다. 또한, 이 기술은 전술한 셀라와 그의 공동 연구자의 논문에 기재된 바와 같이, 공지의 단백질의 펩티드 단편을 캐리어에 결합시켜 항원을 제조하기 위해 분리된 상태로 이용되어 왔다.
이 합텐-캐리어(hapten-carrier) 기술은 면역 반응의 속성을 조사하는 데 연구 집단을 훌륭히 제공하여 왔으나, 진단법이나 치료법에 있어서 어떤 역할을 하는 항원을 생성시키는 데에는 그다지 이용되어 오지 않았다. 그 결점에도 몇 가지 이유가 있다.
첫째로, 이 기술을 이용하여 병원체(예컨대, B형 간염 비루스)로부터 유용한 항원 결정기를 선택 및 구성하기 위하여는, 병원체의 완전한 단백질 서열을 결정하여야 한다. 이 작업은 그 곤란성 때문에 지금까지 거의 행하여 오지 않았다.
둘째로, 병원체의 완전한 단백질 서열을 측정하려고 시도하였다 하더라도 다른 문제점들이 수반된다. 특히, 다수의 관련 항원들이 보통이 병원체 군에서는 거의 또는 전혀 표현되지 않는다. 예를 들면, 임균은 숙주 세포와 직접 접촉될 때에만 질병을 유발시키는 질병 항원 결정기를 표현한다. 그러므로, 종래의 시험관 내에서의 임균 배양법에 의해서는 관련 항원을 생성시키지 않을 수도 있다. 마찬가지로, 공지의 RNA 및 DNA 비루스의 종양성 단백질은 비루스 입자로는 존재하지는 않으나, 이 비루스가 숙주 세포와 상호 작용할 때에만 표현된다. 따라서, 종래의 비루스의 단리 기술 및 단백질의 정제 기술로는 이들 단백질을 얻을 수가 없는 것이다.
전형적으로, 왁찐은 적당한 보조제와 함께 숙주에 멸균 또는 독성을 약화시킨 세균을 도입시킴으로써 세균에 대한 정규의 면역 반응을 일으키는 한편, 바람직하게는 숙주 내에서 미생물의 발병 효과를 회피함으로써 제조된다. 그러나, 이 방법은 관련 항원 결정기 뿐만 아니라, 숙주 내에서 바람직하지 못한 반응을 일으키는 관련되지 않은 다수의 결실(缺失) 물질을 함유하는 왁찐의 복합성 때문에 병원성 반응을 거의 해소시킬 수가 없다는 공지된 사실로 인해 제한을 받아왔다. 이를 테면, 전형적인 방법에 의해 제조되는 왁찐은 목적으로 하는 면역 반응에 유해한 경쟁 항원, 관련 없는 면역 반응을 일으키는 항원, 미생물이나 배지로부터 생기는 헥산, 내독소 및 미지 조성의 성분과 공급원을 포함할 수가 있다. 복합 물질로부터 생성되는 이들 왁찐들은 관련 항원으로부터의 경쟁적인 자동 면역 반응까지도 일으킬 가능성이 비교적 높다.
재조합 DNA 기법으로 말미암아 왁찐에 이르는 새로운 접근 방법이 열렸는데, 이 방법은 제조 조작을 단일 유전자로부터 시작하는 장점이 있으나, 대장균(E.Coli)이나 기타 미생물 중에서 실제로 항원을 제조할 때에는 이러한 장점의 대부분이 없어지게 된다. 이 방법은 유전자가 플라스미드에 도입되고, 이어서 이것을 다른 대사 생성물과 함께 목적으로 하는 단백질을 생성시키는 대장균 내에 도입되는데 이들은 영양 배지 내에서 모두 혼합물 형태를 이룬다. 이 방법은 목적 단백질이 대장균 생성물 중에서 표현될 것이라는 불확실성 때문에 복잡한 방법이다.
이러한 문제점은 인터페론의 제조시의 곤란성에서도 나타난다. 나아가, 목적 단백질이 생성될 수 있다고 하더라도, 그것이 수확 가능성의 여부나 또는 대장균의 증식 공정에서 파괴 가능성 여부가 불확실하다. 이를 테면, 외래 단백질 또는 변성 단백질은 대장균에 의해 소화된다는 사실이 잘 알려져 있다. 단백질이 충분히 유익한 양으로 함유되어 있다고 하더라도, 불필요한 단백질, 내독소, 핵산, 유전자 및 미지물질 또는 예측할 수 없는 물질들과 같은 결실(缺失) 물질들을 비롯한 다른 모든 대장균 대사 생성물로부터 그 단백질을 분리시켜야만 된다.
결국, 틀림없이 비용이 많이 드는 일이지만, 진보된 방법에 의해 모든 다른 대장균 대사 생성물로부터 목적으로 하는 단백질을 분리하는 것이 가능하였거나, 또는 가능하게 되었다고 하더라도, 왁찐은 바람직하지 못한 항원 결정기들을 함유할 수 있는 완전한 단백질로 여전히 구성되는데, 이들 중의 몇 가지는 자가 면역 반응을 일으키는 것이라고 알려져 있다. 실제로, 다른 점에 있어서는 왁찐으로 생각할 수도 있는 일정의 단백질들은 전술한 바와같은 심각한 교차 반응이나 또는 부반응을 일으켜서 왁찐으로서의 이용을 방해하는 항원 결정기를 함유하고 있는 것으로 알려지고 있다.
예를 들면, 클론시킨 (cloned) 연쇄구균(Streptococci)으로부터 위에서 설명한 재조합 DNA 기법에 의해 증식시킨 왁찐은 심장병을 일으키는 항원 결정기 뿐만 아니라, 유익한 항원 결정기를 포함할 수 있는 단백질을 생성시키게 된다. 이와 같은 물질은 왁찐처럼 치료 역가가 거의 없고, 있다 하드라도 매우 낮다.
또 하이브리도마법(hybridoma technique)을 이용하여 비루스 유전자 제품에 대한 항체를 생성시키는 것도 가능하다. 기본적으로, 하이브리도마법은, 항원의 복합 혼합물로부터 시작하는 것을 가능하게 하며, 후에 그 공정 중에서의 특이 항체의 생성을 가능하게 한다.
이와는 달리, 본 발명은 역공정으로서, 본 발명자들은 항원 결정기가 고순도에 달하는 최종 단계에서 출발하므로, 목적하는 항원 생성물의 정제 필요성이 없어진다.
하이브리도마 항체는 결합성이 낮고 결합 상수가 낮기 때문에, 그 중요성이 제한되어 있는 것으로 알려지고 있다.
궁극적으로, 하이브리도마법에 있어서는 분리 기술, 순도 및 안정성에 관련된 모든 우려와 함께 악성 세포에 의한 항체의 생성에 의존하여야 한다.
이 생산이 저렴하고 고유한 다변성이 있다는 분명한 결과와 더불어, 하이브리도마법은 조직 배양이나 생쥐(마우스)내에의 도입에 달려 있다. 그 밖에, 하이브리도마를 처음에 사용하여야 할 소량의 복합 혼합물만을 이루어진 혼합물로 만드는 것은 어렵다.
아래에 기재한 방법이 쥐의 백혈병 천연 단백질 및 B형 간염 비루스와 반응하는 항체의 생성에 성공적이었는데, 사실상 이 방법은 획기적인 것이며, 그 당시에 있어서는 현존하는 분자 생물학적 사고와는 정반대 현상이었다. 그 놀라운 사실에는 두가지가 있다.
첫째로, 그 실험은 일련의 우발적 사실들을 포함하고 있었는데, 이들은 모두 성공적으로 수행하여야 하는 반면, 일상적인 것은 거의 없었다. 대부분의 이들 공정은 펩티드 합성의 설계도인 DNA 서열을 생성시키는데 필요한 것이었다. 생물학적 속성에 의하여 나타나는 변화 무쌍한 그와 같은 다수의 연속 공정을 수행할 수 있었던 것은 획기적이었다.
둘째로, 짧은 직선형 펩티드 사슬이 동물 중에서 항체 반응을 유발해 낼 수 있고, 그 유발된 항체들이 보다 크고 복잡한 본래의 단백질 구조를 인식한다는 것은 매우 획기적인 일이었다.
전술한 관점에 관하여, 아래의 공정들을 수행하여야만 하였으며, 아래의 고려들은 가망이 없다면 결국 성공 가능성을 적게 하였다. 첫째로, RNA 분자의 cDNA 복제물을 클로닝함에 있어서 퇴행성 비루스 역전자 효소(reverse transcriptase)를 사용하여 출발 DNA에 상보적인 뉴클레오티드를 중합시킨다. 그러한 복제 공정의 충실성은 500개의 뉴클레오티드 중에서 약 1개의 뉴클레오티드가 잘못 복제된다. 더우기, 출발 RNA는 또 하나의 복제 효소인 효소 RNA 중합 효소(polymerase)에 의해 살아 있는 세포 중에서 그의 유전자로부터 복제되기 때문에, 착오 요인이 도입된다.
이어서, cDNA 복제물은 플라스미드 벡터와 결합되는데, 이 방법은 클론된 DN A 단편내에서의 전위(轉位)를 포함하는 것으로 나타내어 왔다. 플라스미드는 이어서 세균 내에 도입되고, 재조합 플라스미드를 운반하는 형질 전환된 콜로니를 선발한다. 형질 전환된 박테리아의 콜로니는 증식 평판 위에 줄무늬를 내어 단편들로 나누고, 대량 증식과 DNA 제조를 위한 단일 분리균을 채취한다. 이 방법에서는 많은 횟수의 복제가 일어났기 때문에, 1회 이상의 뉴클레오티드 변경 공정으로 유전자가 손상을 입지 않는다고는 보장할 수가 없다.
그 이유는 분리시에 압력 선정이 없었기 때문이다. 이러한 손상은 그러한 유전자의 DNA 서열을 무의미하게 하거나 또는 펩티드의 선택 및 펩티드 합성의 설계도로서 역할을 함에 있어서 그것의 용도를 크게 떨어뜨릴 수 있다. 지금까지 요약한 장애들은 DNA가 본래의 비루스 유전자를 정확하게 나타내는 서열분석용 DNA 분리시에 관련된 장애들이다.
다음의 일련의 조작들은 비루스 유전자의 DNA 서열에 관련된다. 이들 연구의 초기에는, 일상적인 방식으로 정확하게 유전자 크기의 뉴클레오티드 서열의 해결 방안이 있다는 전망이 바로 나타났었다. 생거(Sanger)와 그의 공동 연구자들은 작은 세균 비루스 ψ×174의 뉴클레오티드 서열을 풀기 위한 노력을 설명한 바가 있다(Sanger et al., 1977, Nature, 265 : 687). 5300개의 뉴클레오티드 중 30개 이상의 착오를 포함하는 이들의 해결 방법은 DNA 서열 결정 결과를 해석하기 위한 단백질 및 DNA 서열 결정에 매달렸으며, 10명 이상의 과학자가 거의 5년 동안 종사하였다.
이 연구 때문에 상기 저자 중의 한 사람이 노벨상을 수상하였는데, 이들은“헥산 서열을 결정하는 다른 방법을 사용하는 것과 마찬가지로, 사용된 어떤 기술 자체는 완전히 신뢰할 수 있는 방법으로 인식될 수 없으며, 경우에 따라서 과오가 발생된다. 이러한 과오 및 불확실성은 보다 힘든 실험들을 통해서만 해소될 수가 있으며, 서열의 대부분이 그와 같이 확인되었으나, 머지 않아 완전한 서열이 입증될 가능성이 있다. 일일이 상세하게 입증시킬 만한 어떤 과학적인 타당성이 있다…… 는 확신은 없다,”라는 결론을 내렸다.
그러므로, 해결된 유전자의 DNA 서열로부터 예측되는 단백질 서열은 그것의 정확성을 입증할 방법이 출현될 때까지는 가설로서 존재한다. 현재 이러한 입증 방법은 세 가지의 형태, 이를 테면, 유전자의 단백질 생성물의 일부 아미노산 서열 분석법, DNA 서열에 의해 예측되는 단백질 내에서부터의 합성 펩티드에 대한 항체들이 천연 단백질과의 반응 관찰법, 클론시킨 유전자에 의한 기능 단백질의 실질적 표현법(비교적 이용하지 않고 있는 조작)이 있다.
본 발명자들은 아르논(Arnon)과 그의 공동 연구자의 논문(1971, Proc. Nat. Acad. Sci. 68 : 1450), 아탓시(Atassi)의 논문(1975, Immunochemistry 12 : 423) 및 바이아스(Vyas)와 그의 공동 연구자의 논문(1972, Science 178 : 1300)에 의한 종전의 연구들은 이들 저자에 의하여 짧은 직선형 아미노산 서열은 일반적으로 천연 단백질 구조와 반응성을 갖는 항체들을 유도시킬 수 없다는 사실을 지적하기 위한 것으로 해석되어 왔다. 대부분의 분자들의 거의 모든 부위에 대하여, 아미노산 잔기로부터 생긴 항원 결정기들은 직선형 서열로 충분히 분리되지만, 겹단백질 형태에 함께 근접한다는 생각이었다.
항체를 유도해 내는 데 사용되는 정확한 삼차원 구조의 펩티드는 하나의 서열 내에서 함께 근접해 있는 아미노산을 함유하는 항체들에 대해서도 대부분의 경우에 중요하다는 생각되었다. 이를테면, 셀라는 항리소짐 반응을 유도해내는 데에는 오히려, 정교한 대환(帶環) 구조를 합성하는 것이 필요하다는 생각하였으며, 아탓시는 각각 삼차원 구조의 목적 단백질을 모사(模寫)하기 위한 많은 정교한 분자들을 제조해 냈으며, 바이아스는 B형 간염 표면 항원의 삼차원 구조가 그 천연 구조와 반응성이 있는 항체를 유도해내는데 있어서 중요한 인자라고 결론지었다.
본 발명에서 특허 청구된 발견은 다른 사람들로 하여금 이 실험들이 일어나지 않으리라고 기대하도록 하였던 염려들이 보장되지 않았다는 사실을 입증해 준다. 그러나, 본 발명자들은 직성형 펩티드에 대한 항체들은 천연 단백질 분자와 반응하며, 이들의 정교한 합성법들은 본 발명에 의하여 제시된 진보된 공정의 관점에서 불필요 하고, 비경제적이며, 시대에 뒤떨어진 방법이라는 사실을 발견하기에 이르렀다.
본 발명에 따르면, 생체 중 중요 단백질의 비율은, 본 발명 방법은 단백질을 생성시키는 유전자로부터 시작할 수 있고, 또 모든 유전자는 통상 등량으로 존재하기 때문에 중요하지가 않다. 따라서, 소량의 단백질 성분으로 생체 중에서 항체 반응을 유발시키는 항원을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 천연의 경쟁 및 간섭 단백질을 함유하지 않는 항원에 의하여 왁찐이 관련 항원 결정기에 특이적인 보호 또는 회수 가능한 항체를 생성하므로, 어느 다른 항원 결정기와의 교차 반응성은 없다.
본 발명의 항체는 사실상 어떤 관련 숙주, 이를 테면, 양, 말 등과 같은 큰 동물 중에서 증식시킬 수가 있기 때문에, 동일 숙주로부터 주기적으로 항체들을 회수함으로써, 실질적으로 완전히 동일하고 또 신뢰할 수 있는 수명이 긴 항체의 공급원 또는“푸울 (pool)”을 극히 용이하고 저렴하게 얻을 수가 있다. 이와같은 장점은 종전 기술에 의해 증식시킨 항체의 비용과 신뢰성 결핍에 비하여 상당한 진보이다.
본 발명의 원리에 의하여 보호 왁찐용의 항원을 설계 또는 제조하거나, 또는 치료 및 예방에 있어서 모든 단백질 항체의 이용을 방해하거나 심하게 제한하여 왔던 많은 항원에 대하여 극히 심각한 자가 면역을 완전히 해소시키는 소기의 목적 또는 용도를 위한 항체를 제조하는 것이 가능하다. 이를 테면, 연쇄 구군의 경우에는 심장병과 같은 아주 심각한 부반응과 최근에“돼지 인플루엔지”예방 접종시에 신경학적으로 나타나는 자가 면역 및 심하면 때때로 처참한 비극까지 가져오는 교차 반응성 결정기를 함유하지 않는 항원 단백질을 결합시키는 항체를 생성하게 하는 특이성 항원 결정기만을 함유하는 왁찐을 용이하게 제조할 수 있다.
그 밖에, 아주 중요한 장점은 면역학적으로 관련된 단백질을 스스로 표현하지 않는 생체를 보호하기 위한 왁찐을 제조할 수가 있다는 것이다. 예를 들면, RNA 종양 비루스에 있어서, 세포 형질 전환에 대한 책임이 있고, 한편으로는 유전자 물질에 의해서 특이성을 갖는 단백질은 비루스 자체 내에서는 표현되지 않는다. 그러므로, 멸균시키거나 또는 독성을 약화시킨 비루스의 도입시에 예측되는 왁찐 생성에 사용된 종래의 방법에 따르면 왁찐을 제조하는 것이 불가능하다.
이와 유사하게, 고양이에 있어서, 고전적인 방법으로 실질적으로 백혈병이나 임파종에 대한 왁찐을 제조하는 것이 불가능하다. 그러므로, 본 발명은 종전 방법보다 훨씬 진보적이며 보다 더 훨씬 앞선 유형의 다른 왁찐 제조의 새로운 길을 열어 놓은 것이다. 본 발명의 실시에 따른 새로운 왁찐 및 항체는 종전의 방법에 의해서는 결코 생성시킬 수가 없었다.
요약하자면, 최근의 재조합 DNA 기법과 하이브리도마법을 비롯하여 왁찐 및 항체를 제조하기 위한 종래의 모든 방법을 본 발명의 방법과 비교하면, 종전 방법들은 기술적으로 더 복잡하고, 비용이 많이 들며 또 더 많은 시간을 소요하고, 수율 및 품질이 떨어질 뿐만 아니라, 목적 성분을 불필요한 성분들로부터 분리시켜야 하는 관점에서도 안정성 및 신뢰성이 모두 뒤떨어지는 것이다. 나아가, 종래의 방법들은 일정의 왁찐을 제조하거나, 일정 항원의 자가 면역 반응을 해소하는 길도 열어 주지 못하지만, 본 발명은 이들 새로운 결과들을 얻는 길을 열어주고 있다. 본 발명은 종래의 방법보다 더 간단하고, 저렴하며, 보다 직접적이고 생산적인 예상하지 못하였던 장점들을 제공하는 것이다.
본 발명은 새로운 합성 항원을 제조하는 종전 방법에 있어서의 전술한 장애와 기타 장애 및 결점들을 극복하고 있다. 이들 항원은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해지는 바와 같이 왁찐과 진단용 항체의 제조 뿐만 아니라, 수동 면역 예방 및 기타 목적의 세포 중재성 면역 반응성이 있는 높은 역가의 항체를 제조하는 데 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 왁찐은 비루스의 게놈, 박테리아 헥산 및 내독소를 전연 함유하지 않는다. 본 발명에 따른 왁찐 및 항체는 목적하는 항원에 대하여 특이적이며, 항원의 부적절한 부위에 나타날 수 있는 의사성 항원 결정기와 교차 반응도 하지 않는다.
본 발명에 따른 왁찐은 천연 단백질의 항원 결정기 부분에 대응하는 합성 펩티드가 결합되는 항원 캐리어로 구성되는데, 상기 합성 펩티드는 그 결과 생성된 항원의 특이성 항원 결정기로 작용하며, 그 항원은 항체 생성 또는 생성된 항원이 소정의 숙주에 도입될 때 천연 단백질의 상기 항원 결정기 부분에 대한 세포 중재성 반응을 개시한다.
후술하는 바와 같이, 본 발명은 또한 전체의 캐리어가 항원성인 항원을 제공하고자 하는 것이며, 이 점이 특히 중요하다.
본 발명의 특이한 관점은 항원 캐리어에 합성 항원 결정기 단위를 결합시켜 생성되는 합성 항원 및 이합성 항원의 제조 방법에 관한 것이다.
일반으로, 합성항원(면역학적으로는 특이항원 결정기를 함유하는 천연 항원에 해당함)은, (a) 게놈 (DNA 또는 RNA의 어느 하나)으로부터 펩티드 부위의 전부 또는 일부의 아미노산 서열을 결정하는 공정, (b) 잠재(potential) 항원 결정기인 펩티드의 부위를 예측하는 공정, (c) 천연 항원에 대응하는 펩티드의 1개 이상의 항원 결정기를 면역학적으로 복제하는 합성 항원 결정기 펩티드를 제조하는 공정과, 필요에 따라서 (d) 상기 (c) 공정에서 제조한 합성 결정기를 약리학적으로 허용되는 캐리어에 결합시켜서 목적으로 하는 합성 항원을 제조하는 공정에 의해서 생성시킬 수가 있다.
왁찐 제조 방법으로서의 본 발명의 방법은 대상 생체의 DNA 서열(또는 게놈이 RNA인 경우에는 작은 서열)로부터 단백질 항원의 항원 결정기 부위의 아미노산 서열을 결정하는 공정, 항원 단백질의 결정기 부위의 항원 복제물, 또는 실질적으로 복제물인 펩티드를 합성시키는 공정, 그리고 필요에 따라서, 그 합성 펩티드를 캐리어에 결합시키거나, 또는 펩티드가 특이성 항원 결정기이고, 숙주 내에 도입시에는 단백질 항원에 대하여 항체 생성을 개시하는 항원을 생성시키기 위한 캐리어를 형성시키는 공정으로 구성된다.
항체의 제조 방법으로서, 전술한 왁찐이 숙주에 도입되고, 단백질 항원에 대한 항체는 항체의 존재 여부를 확인하는 공지의 진단법에 사용하거나, 또는 수동 면역 예방의 치료제로서 사용하기 위한 숙주 체액으로부터 수확된다.
관련 항원 하정기를 스스로 표현하지 않는 병원성 제제에 대한 보호 항체를 생성시키거나 또는 숙주 내에서의 중재 면역 반응을 유도시키는 왁찐을 제조하는 것이 가능하다. 이를 테면, RNA 종양 비루스에 있어서, 세포 형질 변환 책임이 있는 반면에 유전자 물질내에서 특이적으로 된 단백질은 비루스 입자 자체로는 표현되지 않는다. 그러므로, 멸균 또는 독성이 감소된 비루스로부터는 왁찐을 제조하는 것이 불가능하다. 이와 유사한 현상이 비루스 유발성 고양이 백혈병 및 임파종에서 나타난다. 이러한 결과는 예전에는 달성할 수 없었다.
후술하는 바와 같이, 본 발명의 왁찐 제제 및 항체 제제의 제조와 본 발명의 방법들을 수행하는 데 있어서는 여러 가지의 물질들을 사용하는 다수의 공정들이 있으나, 본 발명은 어느 특정의 공정이나 반응 물질 또는 조건들의 이용에 국한되는 것은 아니며, 오히려 본 발명은 전술한 바와 같이 개념적인 것이며, 특허청구의 범위의 특수성을 가지고 정의된다.
그렇다면, 일반적인 의미에서, 본 발명의 하나의 관점은 종전 기술에 의한 왁찐의 모든 면역화 효과를 갖지만, 경쟁 또는 교차 대비의 면역적 부작용이 전연 없는 왁찐의 일반적인 제조 방법이다.
본 발명은 또한 항원 결정기를 스스로 포함하지 않는 미생물에 대하여 왁찐을 제조하기 위한 일반적인 방법이다.
본 발명의 방법에 따르면, 자동 면역과 같은 역반응을 개시하지만, 반대 결정기가 없는 결정기와 함께 단백질 내에서 사실상 조합되어 있는 면역학적으로 중요한 공지의 항원 결정기를 포함하는 왁찐도 역시 제조된다.
비루스의 특이성 항원 결정기에 대하여 특이성이 거나 또는 숙주 내에서 비루스에 의해 유발된 비루스성 질환에 대한 왁찐은 본 발명에 따른 중요한 관점이고 특징이며 생성물이지만, 본 발명은 비루스 왁찐에 대한 그들의 작용 범위에서 모두 동등한 중요성이 있는 박테리아, 곰팡이, 체세포 및 효모와 같은 성숙핵과 원시핵 중에서 또는 이들에 의하여 유발된 특이성 항원 결정기에 대하여 특수한 왁찐을 포함한다.
일시 면역을 유발시키기 위한 진단용 및 전술한 왁찐에 대한 숙주의 면역 반응에 의하여 생기고 전통적인 방법들에 얻은 다른 용도의 항체 제제도 역시 일반적 개념상 또한 중요하며, 본 발명의 특수한 용도이다.
왁찐은 펩티드 서열을 확인한 다음, 그 펩티드 서열을 화학적으로 합성하고, 생성되는 합성 펩티드를 캐리어에 결합시켜 항원을 생성시킨 후, 면역 화학 기법에 따라 숙주계내에 보호 항체 또는 수확 가능한 항체의 개시 세포 중재성 면역 반응의 개시를 달성함으로써 제조된다. 펩티드 서열은 미생물 내에 함유되거나, 또는 숙주내의 세균 또는 병원체에 의해서 유발되던 간에 병원체, 또는 미생물에 특이성인 항원 결정기를 함유하는 올리고 펩티드이면 모두 사용할 수가 있다.
항체 제제물, 왁찐 및 이들의 제조 방법들은 합성 항원 및 그 제조 방법과 마찬가지로 본 발명에 있어서 하나의 중요한 관점이다.
본 발명은 특이성 항원 결정기들인 합성 펩티드의 제조, 조성물 및 이의 이용으로 구성된다. 그러나, 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 잠재 항원의 펩티드를 코드시킨 미생물의 게놈 부위를 확인한 다음, 그 확인된 유전자를 클로닝하고 그 클론된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 항원을 제조하고자 하는 것이다. 항원 펩티드의 아미노산 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 해결되며 이와 같이 하여 결정된 아미노산 서열은 다음에 항원 캐리어에 접합시키거나, 또는 항원의 일부로 되어 숙주에 도입되는 적어도 하나의 펩티드가 되도록 화학적으로 합성된다.
항원을 숙주 내에 도입함으로써 생성이 개시되는 항체는, 펩티드 서열을 발생시키기 위하여 게놈이 이용되는 미생물에 대하여 어느 항원이 항체를 생성시키는가를 알아내기 위하여, 면역학적으로 검사된다. 이 항원이 생체 내에서 자연 발생되는 항원에 대하여 항체를 생성시킨다는 것이 나타나면, 캐리어와 더불어 또는 캐리어의 일부로서의 항원성 펩티드는 그 미생물에 의한 병원학적 감염에 대한 왁찐으로서 충분한 사용량으로 제조된다.
일반적으로, 펩티드에는 최저 4 내지 6개, 통상 6개의 아미노산이 있어야 하며, 대응하는 자연 발생 항원에 대한 항체를 생성시키는 데에는 통상 8개 만큼의 많은 아미노산이 필요하다. 그 서열상 약 18개 이상의 아미노산을 갖는 펩티드가 바람직하며, 상당히 높은 특이성과 항원 반응을 제공한다.
치료용 또는 진단용으로 사용할 수 있는 항체 조성물은 전술한 기술을 사용하여, 그러나, 전술한 합성 항원에 대하여 생성시킨 항체들은 숙주로부터 수확하는 공정을 덧붙여 제조할 수도 있다.
펩티드 항원 부위와 캐리어를 포함하는 항원의 제조 방법으로서, 자연 발생 항원의 적어도 1개의 항원 결정기의 생성에 관련되는 게놈의 지도를 작성(mapping)하고, 이어서 게놈 뉴클레오티드 서열(지도)로부터 그 게놈에 의하여 코드된 펩티드의 서열을 결정한 다음, 그와 같이 서열이 정해진 펩티드의 항원 부위를 화학적으로 합성시키고, 이펩티드의 항원 부위로부터 항원을 생성시킨다.
본 발명에 따라 제조되는 항원은 반드시 화학적으로 합성시킨 펩티드 항원성 부위와 캐리어로 구성되는데, 이 펩티드는 자연 발생 항원의 적어도 1개의 결정기의 생성에 관련되는 게놈으로부터 결정된 서열을 가지며, 이와 같이 합성한 펩티드는 자연 발생 단백질 단편을 함유하지 않으며, 이 합성 펩티드 항원 부위는 자연 발생 항원 결정의 실질적인 복제물이며, 숙주 미생물에 도입시키면 자연 발생 항원 결정기에 대한 항체를 생성시킬 수가 있다.
자연 발생 항원 부위를 갖는 단백질이 표현되지 않는 미생물에 의해 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 일으키는 단백질의 실질적인 복제물인 화학적으로 합성된 펩티드 부위와 캐리어 부위와로 반드시 구성되는 항체는, 자연 발생 항원 부위의 생성에 관련된 미생물의 게놈으로부터 얻은 펩티드 서열을 결정함으로써 제조된다. 이러한 형태의 항원은 미생물 자체로부터 생성시킬 수 없다는 것은 말할 나위도 없다. 항체들은 그러한 항원들을 숙주에 도입시켜 숙주 내에서 증식시킨 다음, 치료용 또는 진단용으로 사용하기 위한 항체들이 수확된다.
합성 펩티드 항원 결정기 부위로 반드시 구성되는 항원 조성물을 얻기 위한 일반적인 방법은, 미생물의 게놈으로부터 이 게놈에 의하여 코드된 펩티드 부위와 특이성 항원 결정기를 포함할 수 있거나 또는 구성할 수 있는 상기 펩티드의 그러한 부위를 결정한 다음, 그 펩티드의 이들 부위의 적어도 하나를 화학 합성시키고, 그 항성 펩티드 서열이 유도된 미생물의 게놈에 대한 항체가 숙주 내에서 생성되는가의 여부를 결정하고, 이어서 앞의 공정들에서 나타난 화학 합성 펩티드로부터 항원을 제조하여 상기 미생물의 자연 발생되는 특이성 항원 결정기에 대한 항체를 숙주 내에서 유도시키는 것이다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 복수개의 화학 합성 펩티드 부위들을 동시에 결합시켜 폴리(펩티드 단편) 중합체 또는 공중합체를 형성시킴으로써 항원을 제조하고자 하는 것인데, 이들 화학적으로 합성시킨 펩티드 부위들 중 적어도 몇개는 숙주 내에서 미생물에 대하여 항체를 유발시키는 것으로 나타났다. 이 방법을 이용하면, 항원의 전부 또는 적어도 실질적인 일부가 특이성 항원 결정기 부위들을 구성하는 항원을 제조하는 것이 가능하다.
이들 항원 결정기 부위들은 모두 동일하거나 또는 상이하여도 좋은데, 이를 테면 2개 이상의 항원 결정기들을 함께 합성시키거나 또는 공중합시켜 서로 상이한 수 많은 특이성 항원성 결정인자 부위들을 갖는 항원을 얻을 수가 있다. 필요에 따라서는 비항원 펩티드 부위들이 항원 내에 함유될 수도 있으며, 반드시 필요한 것은 아니지만 본 발명은 항원 내에 있는 적어도 수 개의 비항원 펩티드 서열도 포함한다. 이 방법은 또 1개 이상의 미생물에 대하여 예컨대 면역화시킬 수 있는 단일 항원을 얻는 길을 열어준다. 예를 들면, 미생물 A에 대한 특이성 항원 결정기인 합성 펩티드와 미생물 B에 대한 특정성 항원 결정기인 상이한 합성 펩티드로 구성되는 항원이 합성되면, 미생물 A와 미생물 B 양자에 모두 항체를 생성시키는 항원은 항원의 다른 제조 방법으로부터 생성되는 단백질 및 단백질 단편이 없는 단일한 항원 구조 내에 포함된다.
캐리어로서만 기능하며, 또 함께 중합 또는 공중합된 1개 또는 복수 개의 합성 펩티드 특이성 항원 결정기 부위로 반드시 구성된 부위가 실질적으로 없고, 숙주 내에 도입되었을때, 자연 발생되는 특이성 항원 결정기 부위에 대한 항체를 비롯하여 그 특이성 항원 결정기의 최소한 몇개가 자연 발생되는 특이성 항원 결정기의 실질적인 복제물인 새로운 항원은 본 발명의 방법에 의해 제조된다.
본 발명은 또한 정해진 아미노산 서열의 합성 펩티드로된 특이성 항원에 관한 것이다. 이를테면, 다른 특이성 항원 결정기 중에서도 B형 간염 및 인플루엔자에 대한 항체를 생성시키기 위한 특이성 항원이 확인된다. 이와 관련하여 거의 모든 항원 결정기 부위에 있어서의 특히 길이가 긴 항원 결정기 부위와 같이 어떤 아미노산류는 펩티드의 항원 특성을 파괴시키는 일이 없이 다른 아미노산류로 대치시킬 수가 있으며, 이들은 특정의 이름을 붙인 펩티드와 완전히 동등하다. 그러한 특이성 항원 결정기들은 본 발명의 목적에 부합되는 것으로 여겨지며 특이성 펩티드 서열을 지칭하고 정의할 때 포함된다.
본 발명의 또 하나의 관점에 있어서, 본 발명은 펩티드에 결합된 지질(脂質) 모핵에 의하여 그 지질에 결합된 최소한 하나의 합성 펩티드 특이성 항원 결정기가 있는 지질의 풍부한 핵부위로 반드시 이루어진 리조솜에 관한 것으로서, 상기 합성 펩티드 특이성 항원 결정기들은 실질적으로 자연 발생 항원 결정기의 복제물이다. 그러한 리조솜은 동일한 방법으로 다수의 동일 또는 상이한 합성 펩티드 특이성 항원 결정기들이 결합되어 있어도 좋다.
따라서, 본 발명은(ㄱ) 자연 발생 단백질과 그의 단편, (ㄴ) 모든 경쟁 및 간섭 단백질 및 (ㄷ) 비루스 게놈, 박테리아 헥산과 내록소가 없으며, 천연의 병원(病原) 관련 단백질에 존재하는 항원 결정기 아미노산 서열을 모사(模寫)하는 적어도 4개의 아미노산 서열을 가지고, 천연의 병원 관련 단백질의 분자량보다 적은 분자량을 갖는 예정량의 펩티드를 화학 합성하는 제1공정, 숙주 동물 내에서 항체의생성을 유도하는 데충분한 양의 상기 화학 합성 펩티드의 분취량을 상기 숙주에 도입하는 제2공정, 생성된 항체를 분석하여 상기 천연 동물성 병원 관련 단백질과의 반응능(反應能) 및 숙주 동물의 보호능(保護能)을 측정하는 제3공정, 그리고 천연 동물성 병원 관련 단백질과 반응하고 숙주 동물을 보호하는 항체를 유도하는 화학 합성 펩티드의 양을 제1공정에서의 양보다 다량으로 만드는 제4공정으로 이루어지는 것이 특징이다.
본 발명에 따른 전술한 여러 가지의 관점은 펩티드의 특이성 항원 결정기 특성에 중요성이 있거나 생성물의 생물학적인 기능으로서 적어도 한가지 주요 인자가 관련되어 있는 한, 그 항원, 항체 또는 다른 펩티드가 함유된 생성물을 생성시키는 데 이용할 수가 있다. 이를 테면, 리조솜은 펩티드 부위가 관련 미생물의 자연 발생 특이성 항원 결정기를 모사시킴으로써 2개 이상의 미생물에 대하여 2개 이상의 특이성 항원 결정기 부위가 포함되는 지방산-펩티드 부위를 포함할 수 있다. 복수개의 특이성 합성 펩티드 항원 결정기로 형성된 집합적인 항원 캐리어들은 말단끼리 합성시키거나 합성 후에 결합하거나, 또는 이들 방법들을 조합하여 제조할 수가 있다. 또 다른 결합 방법들도 생각할 수가 있다.
[방법 및 원재료]
본 발명에 따른 독특한 방법들과 원재료들에 대하여 아래에 상세히 설명하겠다. 그러나, 특수한 실험실적 기술 방법 및 원재료들은 일반적으로 분자 생물학 및 생화학에서 이용되는 것들이다.
관련되는 일반적인 원재료와 기술의 설명을 위해서는 효소학 방법(Method in Enzymology, Colowick, S.P 및 Kaplan, N.O 편저, Academic Press, New York), 면역 및 면역화학 방법(Method in Immunology and Immunochemistry, Academic Press) 및 생화학과 분자 생물학 핸드북(Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Chemical Rubber Publishing Company)이 참고된다.
캐리어에 결정기를 결합시켜 합텐(haptens) 및 항원을 제조하는 기술은 잘 알려져 있으며, 수 많은 캐리어들이 알려져 있다. 흔히 알려지고 있는 캐리어로서는 키이 호울 림피트 헤모시아닌(Keyhole Limpet Homocyanic KLH), 소외 혈청 알부민(BSA ), 양의 적혈구(SRBC), D-글루타민산, D-리신 등이 있다.
실험실 기술로서 그 자체 신규한 기술은 단 하나도 없기 때문에, 본 발명은 오히려 종전에는 결코 존재한 일이 없고, 또 종전 기술에 의해 제조된 최근의 제품보다 진보성 있는 제품의 제조 방법에 관한 것이다. 다음의 참고 문헌들은 본 발명 방법의 배경 설명 및 참고용으로 제공된 것이다.
참고문헌.
1970년에 이르러 마그린(Marglin)과 메릴필드(Merrifield)는“중간 크기의 펩티드를 합성할 수 있는 우리의 능력은 현재 충분히 확립되어 있다”고 보고할 수 있었다.[펩티드와 단백질의 화학적 합성(Chemical:Synthesis of Peptides and Protein), A. Marglin, 및 R.B. Merrifield, Ann. Rev. Biochem. 39 : 841∼866, 862페이지( 1970)]. 본 발명의 실시 가능성을 입증시키는 데에 전술한 메리필드 등의 방법을 이용하였으나, 합성 기술 그 자체는 그다지 중요한 것은 아니다.
DNA 지도 작성, 게놈의 일반적인 특성화 및 유전자 코드로부터 단백질 아미노산 서열의 예측은 가장 잘 확립된 기술이다.
결과적으로 생길지도 모르는 애매한 점을 방지하기 위한 노력으로 충분한 연구를 거친 비루스를 본 발명을 입증하기 위한 하나의 비히클(vehicle) 비루스로 선정하였다. 그러나, 이 선정은 본 발명을 한정시키는 것은 아니며, 펩티드를 함유하거나 또는 항원에 대한 특이성 결정기를 함유하는 모든 단백질 항원은 보호하기 위한 왁찐을 제조하기 위해서 본 발명에서 일반적으로 사용한 것이라고 생각하면 된다. 따라서, 관련 항원으로서는 특정한 항원성 결정기 펩티드가 항원을 면역 특성화시킬 수만 있으면 비루스, 박테리아 또는 체세포 단편의 어느 것이라도 사용할 수가 있다.
캐리어에 항원 결정기를 결합시키는 기술 및 원재료는 잘 알려져 있으며, 개개의 공정 그 자체에는 특별한 신규성이 붙어 있는 것은 없으나, 본 발명은 오히려 특이성 항원 결정기 합성 펩티드와 캐리어로부터 단일한 특이성 항원을 창출시키고, 종전 기술에 고유한 문제점 및 제한들을 해소시키는 왁찐을 제조하는 데에 있다.
본 발명의 도중에는 여러 가지의 물질들 및 반응 물질들의 분리, 성분 확인 및 추구한 반응 및 결과가 발생한 여부의 입증을 위한 여러 가지의 공정과 절차들이 수행된다.
일반적인 용법에 관한 기술은 표준 교과서 및 논문에 기재되어 있다. 예를들면, 효소학 방법(앞에 참조), 면역 및 면역 화학 방법(앞에 참조), 생화학 및 면역 화학 방법(앞에 참조),“세포 생물학-분자입문(Cell-Biology-A Molecular Approach)” (Dyson, Sobert D., 제2판, Allyn and Bacon, Boston(1987),“미생물학(Micro biology)”(Pleczar, Michael J., J., Reid., Roger D., Chan, E.C.S., 제4판, Mcgraw -Hill(1977)), 생화학의 최신 개념(Modern Concent in Biochemistry)” (Bohinski , R .D., 2개 정판, Allyn and Bacon, Boston(1976)) 등의 참고 문헌들이 있다. 또, 특정한 방법 절차들이 발표되어 있으며(참고 문헌, 1∼10, 21∼30, 32,35∼43), 큰 변동 없이 이용되고 있다.
[본 발명의 방법]
본 발명의 주어진 이용에 적용할 수 있는 본 발명 방법의 공정들은 관련된 특정 항원의 시료를 참작하는 지식 수준과 그 시료의 입수 가능도에 달려 있다. 여러 단계의 방법들을 고려하는 것이 편리하다.
Ⅰ. 항원 결정기의 특성화 및 그 확인
항원 결정기가 알려지고, 또 특이성 항원 결정기를 함유하거나 또는 이 결정기를 구성하는 펩티드 가지의 아미노산 서열을 알게되면 관련 항원의 특이성 항원 결정기를 면역학적으로 복제하는 합성 펩티드를 제조하기 위한 조작이 즉시 수행된다.
이와 같은 방법의 시도가 앞으로는 보다 많이 이용될 수 있을 것이나, 지금으로서는 통상 결정기 펩티드 또는 결정기를 함유하는 펩티드를 확인하여 그 펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 일이 필요하다. 아미노산 서열은 펩티드 부위의 생성을 지배하는 게놈의 DNA 지도 작성에 의해 직접 또는 간접으로 결정할 수 있다. 본 발명에 이용한 절차들은 이론적으로 알려져 있는 것이며, 관련 펩티드 부위의 생성을 지배하는 게놈의 DNA 지도 작성은 이제는 충분히 규명되어 있기 때문에 실용적인 수단이 될 수 있다. 단백질로부터 직접 아미노산 서열을 결정하는 일은 아주 어렵고 불확실한 조작이기 때문에, 언젠가는 이점에서 학술적 가치가 거의 없을 뿐만 아니라, 거의 실용적인 가치도 없을 것이다.
펩티드 단백질로부터 아미노산 서열을 직접 결정하는 일이 언젠가는 실용적인 도구로 된다 하드라도, 현재로서의 이 방법은 특이성 항원 결정기인 합성 펩티드를 제조 또는 합성하기 위한 본 발명에 권장할 정도는 아니다. 그러므로, 본 발명의 출발점은 궁극적으로는 특이성 항원 결정기 부위를 함유하는 펩티드부분의 아미노산 서열을 결정하는 게놈인 것이다.
일단 아미노산 서열을 알아내거나 예측되면, 메리필드와 그의 공동 연구자의 기술 또는 입수 이용할 수 있는 다른 기술들을 사용하여 펩티드를 합성한다. 이론적으로는, 펩티드 합성으로부터 직접 왁찐을 합성할 수 있다고 생각할 수 있으나, 적어도 현재의 지식으로는 그와 같이 합성된 펩티드는 관련 항원의 특이성 결정기와 동일하거나 또는 적어도 면역학적으로 동등한 것으로 보인다는 것을 확실히 가르킨다. 이 증거는 이화학적 특성화를 통하여, 궁극적으로는 합성 결정기에 대한 항체와 천연 항원 사이의 면역 반응을 입증함으로써 증명된다.
이 특성화에는 분자량, 하전량, 결합 친화력 등을 입증하기 위한 잘 알려진 기술들이 이용된다. 앞에서 말한“생화학의 최신 개념”제2장,“생화학 방법”과 앞에서 말한“세포 생물학”의 부록인“세포 생물학자의 도구”는 이들 특성화법을 일반적으로 설명하고 있으며, 특정 방법과 기술의 충분한 설명을 인용하고 있다. 또 방사 면역 분석 시험이 널리 사용되고 있으며, 더블유·엠 헌터(W.M. Hunter)의“방사선 추적자의 조제 및 평가”(Preparation and Assesment of Radioactive Tracers, British Medical Bulletin), 30 : 18∼23에 충분히 기재되어 있다. 이 특성화의 특정한 예를 아래에서 설명하겠다.
Ⅱ. 왁찐 항원의 제조
관련 항원의 특이성 항원 결정기로라고 알려져 있는 합성 펩티드가 입수되면, 공지의 결합 기술을 사용하여 캐리어가 필요로 하는 위치에 그 결합기를 결합시켜 항원을 형성시킨다. 이 조작은 물론 항원 결정기에 대한 펩티드의 면역학적 동일성을 입증하는 도중에 소규모로 행할 수 있다. 이를 테면, 후-통 류(Fu-Tong Liu) 박사는 본 발명자들이 처음에 실험실에서 본 발명을 입증할 때에 공지의 물질과 방법들을 사용하여 본 발명자들이 제조했던 합성 단백질을 공지의 캐리어인 KLH에 결합시킴으로써 본 발명을 입증하는 실험을 도와주었다.(Liu, Fu-Tong과 그의 공동 연구자,“단백질과 D-아미노산 합성 공중합체와의 접합체를 제조 및 분리하는 새로운 방법 및 이 접합체의 면역 화학적 특성화”[“New Procedures for Preparation and Isolation of Conjugates of Proteims and a Synthetic Copolymer of D-Amino Acids and Immunochemic al Characterization of Such Conjugates” Biochemistry, 18 : 690∼697(1979)].
캐리어의 선정은 항원 결정기 보다도 항원의 최종 목적 용도에 더 좌우되며, 본 발명에 특별히 포함되지 않은 기준에 근거한다. 이를 테면, 왁찐을 동물에 사용하고자 할 경우에는, 일정의 동물에 부작용을 일으키지 않는 캐리어를 선정한다. 또, 왁찐을 인체에 사용하고자 할 경우에 있어서 가장 중요한 것은 인체용 왁찐에 사용하는 것을 고려하여 캐리어 및 (또는) 생성 항원이 화학 면역 반응이나 또는 기타 부반응이 없어야 하고, 안정성 및 효능이 있어야 한다. 사실상, 본 발명은 애와 동물 및 사육 동물을 비롯한 모든 동물에 광범위하게 사용할 수 있도록 계획된 것이다.
Ⅲ. 면역 반응-항체제조
숙주 내에 항원을 주사하거나 다른 방법으로 주입시키면 숙주계는 항원에 대한 항체를 다량 생성시킴으로써 응답한다. 제조된 항원, 즉 합성 펩티드와 캐리어와 생성된 항원의 특이성 항원 결정기는 관련 천연 항원의 결정기와 면역학적으로 동일하거나 대등하므로, 숙주는 천연 항원에 면역된다. 본 발명 제품을 왁찐으로 사용하는 경우, 이 왁찐이 목적하는 결과이다.
일정의 항원이 예컨대 질병 진단시의 보조제로서 존재하는지의 여부를 결정하는 일이 바람직할 때가 있다. 그 이유는, 합성 항원은 단일한 관련 특이성 항원 결정기에 단일 특이성이며, 항원에 대한 항체도 역시 관련 항원에 대하여 단일 특이성이기 때문이다. 완전한 단일 특이성이 반드시 얻어지는 것은 아니지만, 면역 반응은 항체에 의해서만 일어날 수 있기 때문에, 항원의 다른 항원성 부위에 대한 교차 반응이 회피된다. 항체들은 채취하여 진단 시험에 사용하기 위한 통상의 방법으로 제조된다. 이를 테면, 그린우드(Greenwood)의 방법에 의한 방사성 표지법 [참조, Hunter, Br. Med. Bull. 30&18(1974)] 및 형광 염료 표지법이 면역 분석에 흔히 사용되고 있다.
Ⅳ. 조작예-미지의 항원 결정기
복제 성분인 쥐 백혈병 비루스, 이를테면 마우스 백혈병 비루스 (Moloney)로서 백혈병 비루스(Rausher), 프랜드 백혈병 비루스(Friend) 및 에케이브이 백혈병 비루스 (AKV)의 인정된 유전자 구조는 3개의 유전자를 갖는다. 이들 유전자, gag pol 및 env는 단일 가닥 RNA 게놈을 따라 각각의 대형으로 배열되어 있다. 이들은 조입(
)된 이중 가닥 DNA 프로비루스 (Provirus)로부터 전사된다. 이들 3개의 유전자들의 단백질 생성물은 상당히 상세하게 이해되어 있다. gag 유전자는 약 65킬로달톤(kilodalton)의 폴리단백질을 코드화하는데, 이 폴리단백질은 단백질 분해에 의하여 아미노 대 카르복실 말단이 각각 15,12,30 및 10킬로달톤의 단백질로 된다. 이들 단백질은 비리온 (virion)의 코어(core)에서 발견되는데, 그 하나인 p30은 굴성 비루스(virus tropism)와 관련되어 왔다.
두번째 유전자인 pol은 gag 유전자의 겉보기 확장 유전자로서 표현되므로, gag 와 pol의 양쪽 성분을 포함하는 약 180킬로달톤의 폴리단백질이 관찰된다. 폴리단백질은 역전사 효소인 70킬로달톤의 단백질로 된다. 이 효소가 숙주 DNA 내에 접합될 수 있는 이중 가닥 DNA 구조 내로 감염되는 비루스의 단일 가닥 DNA 게놈을 복제하는 역할을 맡는다.
세번째 유전자 env는, 글리코실화되어 gp70및 p15E성분으로 되는 폴리단백질을 코드화시킨다. Gp70은 주요 외피성분으로서 비루스 숙주 범위를 결정한다. 때로는, 비루스성막 및 세포막에 gp70을 고정시킬 수 있는 소수성 단백질인 p15E에 이황화물이 결합된 것이 발견된다. 메신저 RNA 분자들이 이들 세 개의 유전자들의 표현을 맡을 수 있다고 알려져 왔다.
본 발명자들은 몰로니종(Moloney) 마우스(백혈병 비루스(Mo-MuLV)의 3′말단에 대하여 연구하기 시작하였는데, 그 이유는 본 발명자들의 특별한 관심은 가장 양호한 3′기부(基部, proximal)인 것으로 생각되는 env 유전자에 있었기 때문이다. 이 연구에서 본 발명자들은 그 env의 3′측에 놓인 새로운 유전적 코딩 부위를 찾아 내었다. 이 부위는 오른쪽으로 치우쳐 있는 코딩 부위이로, 본 발명자들은 그 부위를 잠적적으로 R-부위라고 명명한다. 본 발명자들은 또한 R-단백질 부분을 화학적으로 합성하고, 항체들을 생육시켜 합성 펩티드로 되게 하여, 감염된 세포 내에서 교차 반응성 물질을 면역학적으로 검출하였다.
DNA 서열
제1도는 Mo-MuLV 프로 비루스의 3′말단을 갖는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다. 3′LTR과 카르복시 말단 비루스 코딩 부위로부터의 1123 뉴클레오티드 플러스-가닥 서열은 1108 염기쌍의 긴 cDNA 클론으로부터 해독한 다음 비감염 클론으로부터의 서열에 의해 약간 팽창시켰다. DNA로부터 번역된 단백질 서열은 뉴클레오티드 서열 상부에 나타난다.
처음의 아미노 말단 잔기는 코펠란드(Copeland)와 오로스즐란(Oroszlan) 법에 의해 결정하였으며, 10∼34 위치들은 본 발명자들의 서열과 일치한다. 숫자를 붙인 올리고 클레오티드(25, 42, 57 및 98B)는 AKV 비루스에 해당하는 것들을 나타내는데, 제5도에 상쇄하게 도시하였다. R코딩 부위로부터 아랫 쪽의 밑줄친 부위는 플러스-가닥 DNA 합성의 기점이다. IRL과 IRR로 표시된 부위들은 LTR들의 측면에 있는 역전 반복체(repeats)이다. LTR내에서 본발명자들은 17-염기의 긴 회문배열(回文配列, palindrome) (밑줄 친 부분)과 비루스 전사체의 5′말단에 대한 프로모터 호그니스 박스(Promotor Hogness Box) (p)로부터 바로 윗쪽에 위치하는 3개의 직접 반복체(di rect repeats)(DR 1, 2 및 3)를 인식하였다. 더 아래의 분자는 전사체의 3′말단의 폴리 A 추가 시그널이다.
본 발명자들은 생물학적으로 활성인 Mo-MuLV 코딩 서열을 운반하기 위하여 충분한 길이의 비루스 클론의 이 부위 역시 서열을 정하였다. 이 새로운 DNA 서열은, 설명된 대수롭지 않은 차이를 제외하고는, 본래의 서열과 일치한다. 본 발명자들은 이들 차이는 본 발명자들이 처음에 검토하였던 클론을 발생시키는 역전사 효소 반응의 알려진 약간의 불충실성 때문에 생물적으로 활성인 게놈이나 또는 인위 구조의 집단에 있어서의 변화 가능성을 나타내는 것이라고 생각하였다.
배향의 목적상, 본 발명자들은 비루스 생활 주기에 중요한 이 서열의 여러 가지 특징을 지적하였다. 본 발명자들은 게놈 RNA에 상당하는 DNA 가닥을 따라 5′로부터 3′까지 진행한 결과, 대부분의 p15E의 코딩부위(카르복시 말단 env코딩 부위) 제2 (정, positive) 가닥, DNA 복제의 기점, 접합된 프로비루스(소위, LTR)및 5′3′말단에서 모사되는 비루스 서열의 부위의 측면에 있고, 비루스의 DNA를 트란스포손( transposon)으로 만드는 역전 반복체인(inverted repeats) 및 IRL및 IRR, 그리고 폴리 A 추가 시그널과 폴리 A 후미 앞에 위치하는 예정의 최종 3′뉴클레오티드를 발견하였다
또한, 본 발명자들이 지적한 것은 LTR의 5′모사체에서 활성인 특징, 즉 게놈 표현용 프로모터와 최초로 전사된 염기 뿐만 아니라, 7-염기의 긴 서열의 3개의 직접 반복체를 포함하는 호그너스 박스로부터 약간 상부에 위치하는 서열이다. 이들 반복체들은 전사의 조절에 관련된다. 또한, 본 발명자들은 515-염기의 긴 말단 반복체 내에서 그 자체가 포함된 역전 회문배열(palindrome)을 형성하지만, 알려지지 않은 기능이 있는 17-염기들의 서열을 지적하였다.
DNA 서열에 의해 예측되는 새로운 단백질
본 발명자들이 발견한 새로운 유전자 부위는 앞에서 프로비루스의 가장 우측에 존재하는 유전자, 즉 비루스 단백질 p15E의 코딩 부위라고 앞서 생각했던 것과 관련하여 잘 이해될 수 있다. p15E의 아미노 말단들은 본 발명자들이 얻은 DNA 서열에 의하여 추측하는 단백질 서열과 다른 사람들이 얻은 단백질 서열간의 중복에 의해 정확히 위치시시킬 수 있다.
그 3개의 인자들은 p15E의 카르복시 말단들이 위치 103으로 정의돤다는 것을 암시하고 있다. 즉, 코펠란드(Copeland)와 오로스즐란(Oroszlan)은 p15E의 두 개의 C-말단 아미노산 잔기가 leu-val이라고 결정하였다. 본 발명자들은 p15E아미노 말단으로부터 이와 같은 한 쌍의 103 위치들을 발견하였다. 카르복시 말단을 적당한 위치의 발린에 줌으로써 얻어지는 p15E의 예측 아미노산 조성은 관찰된 조성물과 잘 일치된다. 결국, SDS 겔상에서 결정되는 p15E의 겉보기 분자 크기는, 103 잔기의 소수성 단백질의 이등성과 조화될 수 있는 크기로 평가되는 약 15 킬로달톤이다.
놀라운 사실은, 본 발명자들은 위치 104에서 번역 종결 코돈을 발견하지 못하였다는 점이다. 그 대신에 종지점을 만나기 전에 92 이상의 트리플렛트(triplet)을 위한 번역 해독 플레임(traslational reading frame)이 신장된다. 본 발명자들은 제1 env 유전자 단백질 생성물은 사실상 3개의 펩티드, 즉 gp70, p15E및 전술한 바와 바와 같이 확인되는 단백질 R를 함유한다는 결론을 내렸다. 그리하여, 본 발명자들은 R-단백질을 추구하였다.
감염된 세포 내에서의 R-단백질의 화학적 합성 및 검출
본 발명자들은, 고체 상태법에 따라, 추측된 Mo-MuLV R-단백질의 펩티드를 여러 개 합성하고 항체를 불려서 이들 합성 펩티드로 되게 하였다. 특히, C-말단 15 잔기들(LTQQFHQLKPIECEP)은 캐리어 분자 KLH에 접합시키고, 토끼 6마리와 쥐 6마리에 주사하였다. 본 발명자등른125-티로신(125-YILNRLVQFVKDRISVVQALVLT QQFHQ-LKPIECEP)의 앞에 위치하는 R-단백질의 35 C-말단 잔기를 함유하는 36 잔기 합성 기질의 면역학적 침전농에 대하여 혈청을 분석하였다. 면역시킨 토끼와 쥐들의 모든 혈청은 제1표에 나타낸 바와 같이 정상 혈청에 비하여 10 내지 70배의 정반응을 나타내었다.
[표 1]
계획 A : 제1일-사지(四肢)와 등에 프로인드 완전 보조액(Freund's complete adjuvant) 1㎍/㎏ 피하주사함.
CT15-KLH
제7일-반복 주사-프로인드 완전 보조액.
제14일-반복 주사-프로인드 완전 보조액.
제21일-출혈시킴.
계획 B : 제1일-체중 약 2.5 내지 3㎏의 토끼에 프로인드 완전 보조액을 1마리당 200㎍씩 피하 주사함(투여량을 상당량 감소시킴).
CT15-KLH
제7일-1마리당 50㎍씩 프로인드 불완전 보조액을 피하 주사함.
제14일-1마리당 50㎍씩 백반 투여함(1마리는 4㎍).
제21일과 28일-출혈시킴.
백반과 CT15-KLH 보조제를 토끼 1마리당 50㎍ 투여하고, 투여 제7일 후 출혈시킴.
계획 C : 초기 투여량을 1마리당 50㎍으로 감소시키고, 이후의 투여량을 또 50㎍으로 한 것을 제외하고는 계획 B와 동일하게 함.
CT15-KLH
계획 D : CT15-비오틴-아비틴을 사용한 것을 제외하고는 계획 C와 동일함.
다음에 본 발명자들은 2시간의35S-메티오닌 펄스에 의해 표지를 붙인 SCRF 60A 세포들을 생성하는 MuLV의 용해물(lysates)내에서 R-단백질을 찾아 내었다(이 R-단백질은 티로신을 전연 함유하지 않기 때문에 요오드 표지가 기대되지 않았다.)
제2도는 대수기(對數期, log phase) SCRF 60A 세포들의 반응을 나타낸 것인데, 이들 세포는 태반 송아지 10% 혈청이 들어 있는 이글(Eagle)의 MEM에서 생육된 Mo-MuLV와 식별될 수 없는 비루스를 생성한다. 이 세포들은 10% 이글의 MEM이 들어 있는 행크(Hank)의 평형염(Balanced Salts) 내에서35S-메티오닌(940Ci/밀리몰, 100μCi/㎖)에 의해 2×106세포/㎖의 양으로 37℃에서 표지를 붙였다. 이들 세포를 냉각시키고, 0.15M NaCl, 10mM 인산나트륨(pH7.5)으로 세척하여, 0℃에서 0.15M NaCl, 10mM 인산나트륨(pH7.5), 1% NP40, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS, 2% 트라실롤을 사용하여 20분간 추출한 다음, 12,000×g에서 5분간 초음파 처리하여 방사시켰다. 그 용해물을 토끼의 정상 혈청 20㎕ 및 염소의 정상 혈청 20㎕와 0℃에서 30분간 반응시켜 미리 제거시킨 다음, 비휘발성 포르말린 고정 Staph A를 30분간 첨가하고, 12,000×g에서 15분간 원심 분리시켰다.
용해물 일부를 A) 정상 토끼, B) 토끼 반합성(反合成) R-펜타데카펩티드, C) 염소 안티-gp70, D) 염소 안티 -p30또는 E) 정상 토끼 혈청 또는 F) 안티 -gp70하이브리도마(hybridoma)(no. RI-16G07, 참조 기호 17) 배양배지의 혼합물 5㎕와 0℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 복합체를 Staph A와 함께 수집한 후, 500mM LiCl로 2회 세척하고, Staph A를 제거하여 첨가시킨 완충액 중에 용해시킨 다음, 1% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에 첨가시켰다. 이 겔을 ENHANCE(NEN) 중에서 90분간, H2O 중에서 60분간 침지시켜 건조시킨 다음, 필름에 노출시켰다. 도면에 나타난 띠[밴드]들은 이 실험에서와 다른 학자들에 의해 이미 확인된 바 있다.
안티 -R 혈청은 다음과 같이 제조하였다. 카르복시 말단 펜타데카펩티드(LT QQFHQLKPIECEP)는 시스테인 술피드릴을 거쳐 키이호울 림피트 하모시아닌(key hole lampet hamocyanin)(KLH)과 접합시켰다. 10mM 인산칼륨(pH 7.0) 1㎖ 중에 KLH 10㎎을 용해시킨 용액에, N,N′-디메틸포름아미드 1㎖ 중에 m-말이미도벤조일-N-히드록시 숙신아미드 에스테르 15㎎을 용해시킨 용액 63㎕를 교반하면서 적가 시켰다. 30분간 교반 후에 그 혼합물을 여과하고, 세파덱스(Sephadex) G-25 컬럼( 0.1M 인산염, pH 6.0)에 도포하였다. 활성화 단백질(2.3㎖)은 R 펜타데카펩티드 0.1㎖(pH 7.3, 5mM EDTA의 0.1M 인산칼륨 중의 10㎎/㎖)와 혼합시키고, 이 용액을 pH 6.5로 조정하고, 실온에서 4시간 교반한 다음 세파덱스 G-100(0.1M 중탄산암모늄 pH 9.5) 상에서 크로마토그래피를 행하였다. 접합 단백질을 수집하여 면역화에 직접 사용하였다.
제2도에서 알 수 있는 바와 같이, 안티-R 혈청은 감염된 세포 중에서 약 80 킬로달톤의 겉보기 분자 크기를 갖는 단백질을 검출한다. 각각의 면역성 토끼와 쥐의 혈청은 모두 동일한 분자 크기를 갖는 단백질을 검출하였다. 뉴클레오티드는 p15E와 R가 동일한 해독 프레임 내에 있었다는 것을 보여주기 때문에 본 발명자들은 이 분자는 사실상 env 전구체라고 추측하였다. 안티-gp70하이브리도마를 비롯한 gp70에 대한 항체는 안티-R에 의해 침전되는 것과 동일한 분자 크기를 갖는 분자를 검출시키는 바, 이것은 본 발명자들이 env 전구체를 관찰하고 있다는 사실을 확인해 주는 것이다.
분자 크기가 이상하게도 동일하면서도 별개의 분자가 두가지 있을 수 있다는 것을 배제하기 위하여, 본 발명자들은 두가지 실험을 행하였다. 첫째로, 용해물을 안티-R 혈청으로 미리 제거시키면, 안티-gp70혈청에 대한 80 킬로달톤의 방사성 표적물이 제거된다. 반대로, 용해물을 안티-gp70혈청으로 제거시키면, R결정기가 제거된다. 둘째로, 안티-R과 안티-gp70에 의해 침전되는 두개의 80 킬로달톤 분자들의 단백질 분해성 펩티드 지문법(指紋法)에 의하면 이들 분자는 동일한 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명자들은 이 80킬로달톤 띠[밴드]는 gp70, p15E 및 R 결정기를 포함하는 완전한 env 유전자 폴리단백질 생성물이라는 것을 확인하고, 이에 따라 제3도에 제시된 구조를 입증하였다.
제3도는 Mo-MuLV 프로비루스에 대한 수정된 유전자 지도를 도시한 것이다. 515 뉴클레오티드의 긴 LTR는 그 비루스의 단백질 코딩 부위의 측면에 있다. 마이너스 가닥 DNA(tRNA 프라이머 결합 부위)와 플러스 가닥 DNA 복제의 기점들은 각 말단의 LTR로부터 비루스의 체내에 있게 된다. 처음의 gag 유전자 생성물(Pr65gag)은 N 내지 C, p15, p12, p30및 p10성분들로 처리된다. pol 유전자의 마지막 생성물은 70킬로달톤이다. Pr80env라고 부르는 env 폴리단백질은 N 내지 C, gp70, p15E및 새로 확인된 R 단백질로 구성된다.
p15E의 발린 카르복시 말단 바로 다음에 오는 R의 처음 아미노산은 아르기닌이다. 염기성 잔기가 단백질 분해성 클럽 부위에서 가끔 발견되기 때문에, R는 이 위치에서 env 폴리단백질로부터 단백질 분해로 처리될 수 있다. 상이한 겔 전기 영동 조건을 사용하여, 본 발명자들은 안티-R 혈청에 의해 특이적으로 침전되는 분자 크기가 12킬로달톤으로 평가되는 단백질을 검출할 수 있었다.
제4도는 R 단백질의 검출법을 도시한 것이다. SCRF 60A 세포들(제2도 범례에 설명되어 있는 바와 같음)의35S-메티오닌 표지가 붙은 용해물을 4등분하여, A) 정상 염소, B) 염소 안티-gp70, C) 정상 토끼, 또는 D) 토끼 안티-R 혈청을 사용하여 면역학적으로 침전시키고, Staph A와 함께 채취한 다음, 5∼17.5% SDS 폴리아크릴 아미드 경사 겔상에서 전기 영동시켰다.
또, 본 발명자들은 SCRF 60A 세포들의 플라스마 막 위에서 R 단백질 결정기를 간접 면역 형광법에 의해 관찰하였다. 본 발명자들의 실험으로부터는 p15E난할(卵割)이 일어나는 시간을 결정할 수가 없었으나, 순수한 gp70막 고정 물질은 p15E와 R 단백질을 함유하는 22 킬로달톤 단백질일 가능성을 공언할 수 있다. 이 경우에 p15E와 R를 생성시키는 단백질 분해성 클립은 이들의 분리시에 생성된다. 본 발명자들은 R 결정기가 있는 22킬로달톤 단백질은 관찰하지 못하였다.
R 유전자는 다른 비루스에도 존재한다. 패더슨(Pederson)과 하셀타인(Hase ltine)은 AKV 비루스의 대형 리보뉴클라제 Tl 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다 (AKV 비루스는 AKR 쥐의 내인성 백혈병 비루스이다.) 본 발명자들은 컴퓨터 검색에 의하여 Mo-MuLV 헝클어진 서열에 대하여 일부 상동성(相同性)을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명자들이 정한 규칙은 페디슨, 크로우데어(Crowthere) 및 하셀라인이 실험을 통해 얻은 규칙과 함께 이상적인 짝을 이룬다. R-부위 내에서의 짝들을 제1도에 나타나 있으며, 제5도에서 상세하게 설명하였다.
제5도는 두가지 비루스에 있어서의 R 유전자 비교를 나타내고 있다. 컴퓨터에 의하면 페더슨과 하셀타인이 AKV에 대하여 결정한 올리고뉴클레오티드 서열은 본 발명자들의 Mo-MuLV 서열과 짝을 이룬다. R 부위 내에서의 이들 짝은 대응하는 번역된 아미노산과 함께, AKV 위에 Mo-MuLV로 나타낸다. 왼쪽의 숫자들은 페더슨과 하셀타인이 사용한 숫자들이다. 뉴클레오티드간의 차이들은 밑줄을 그었다. 단편 98B에 있어서, 본 발명자들의 cDNA 서열 중의 페닐알라닌 코돈은 감염성 클론 중의 티로신 코돈이며 AKV 내에 있는 티로신이다. 단편 98B 중의 X는 AKV에 대하여 해독되지 않은 위치이다.
본 발명자들은 이들 정렬로부터 두가지 사실을 알아내었다. 첫째로, 짝을 이룬 단편들은, 짝을 이룰 기회는 없지만, 완전히 보존되지는 않는다. 이것은 아마도 관련된 비루스 서열의 장치의 비교로부터 어떤 것을 기대하는 것에 대한 경고이다.
둘째로는, 본 발명자들이 아는 것은 R 부위내의 짝들은 AKV가 Mo-MuLV의 R-단백질과 같이 R-단백질을 다량 코드할 것이라는 것이다. 특히, 1) AKV 차이점들은 어느 것도 조기 번역 종결을 명령하는 뉴클레오티드를 도입하지 않으며, 2) 여러 개의 (9) AKV/Mo-MuLV 뉴클레오티드 차이점들은 트리플렛트 내의 제3위치에 있으며, 코드된 단백질 서열을 변화시키지 않고, 3) 약간의 뉴클레오티드 차이점들은 R-단백질 아미노산을 변화시키지 않으나, 치환 위치(replacements)는 98B 지점에서 페닐알라닌이 티로신으로, 25 지점에서 asn-gln-arg이 lys-gln-gln으로 또는 지점 57 지점에서 met이 leu으로 바뀌는 바와 같이 보존되거나 동물이명(同物異名)으로 되기 쉽다. 이들 모든 치환은 데이호프(Dayhoff) 돌연변이 행렬에 의해 정(正)의 상관 관계로 생각된다. 그 밖에, AKV의 R-부위의 217 뉴클레오티드를 통하여 윈쉬프 헤르(Wins hip Herr)가 얻은 일차 서열은 본 발명자들의 Mo-MuLV 서열과의 56 뉴클레오티드 차이점을 포함하는 개방 해독 프레임을 나타낸다. 이들 56 차이점들은 모두 중성인 아미노산 치환체를 단지 6개만 만든다. 이들 관찰로부터, R-단백질 서열은 두가지 비루스 내에서 보존성이 높다는 것을 알 수 있다.
R-단백질에 대한 견해
R-단백질의 전체 아미노산 서열은 전부 데이호프 도해 중의 어떤 단백질 서열에 가깝게 대응하는 것은 아니다. 그러나, R이 어느 아역(亞域, subregion)들은 탈수소 효소 및 프로테아제와 같은 알려진 단백질들의 아역을 연상케 하는 것인데, 뉴클레오티드 결합이나 또는 단백질-단백질 상호 작용에 있어서의 R-단백질의 영역을 내포한다.
R-단백질은 단지 구조 비루스 단백질로 작용하는 것이 틀림 없다. 이와 관련하여, 위치 32와 61 사이의 소수성 영역은 R가 세포 또는 비루스 막내에 삽입되고, 여기서 R는 다른 비루스 단백질의 고정을 도와주는 것이라는 것을 나타낸다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 R는 감염된 세포들의 플라스마 막 내에 존재한다는 증거를 형광 현미경 사진으로부터 얻어 내었다. 또, R-단백질은 다른 종류의 기능에 관련될 수도 있다.
피셔(Fisher)에 의하여 처음으로 알려진 바와 같이, 유전자들과 이들의 작용 부위들은 밀집되어 있는 것 같이 생각된다. R 부위는 p15E코팅 부위와 정(正)의 가닥 및 LTR 복제의 기점 사이에 적당히 위치하고 있다. 따라서, R는 복제나 또는 전위시에 기능하는 것이 가능하다. 한편, R-단백질은 비루스를 형질 변환시키는 역할을 한다. 백혈병 비루스는 신비하리만큼 복잡하기 때문에, 이들이 림파샘 조직을 형질 변환시키기는 하지만, 겉보기 형질 변환 유전자는 운반하지 않는다.
R는 형질 변환 단백질로서 직접 작용하거나, 또는 다른 단백질과도 상호 작용할 수 있다. 어느 경우에 있어서도 다음의 두 가지 중요한 사실이 설명되어야 한다.
첫째로, 이들 비루스는 쥐의 모든 형의 세포들을 실질적으로 복제시키나, 특정 세포만을 형질 변환시킨다.
둘째로, R-단백질로부터 윗쪽에서 코드된 gp70단백질의 변화는 백혈병 유발성을 갖는 여러 가지의 비루스, 이를테면 MCF와 상호 관계가 크다.
그러므로, 본 발명자들은 gp70과 R는 직접 상호 작용하며(아마도 이황화 결합에 의해), 몰로니(Molo-ney)의 경우에는, T 세포 특이 작용을 가지거나, 또는 gp70은 R-단백질의 백혈병 유발 효과에 민감한 T-세포를 주는 어떤 세포형의 특이 효과를 일으킨다고 상상하였다. 비루스가 이 유전자를 유지시키는 원인이 무엇인가는 알려지지 않았다.
전술한 바와 같이, 본 발명자들의 연구는 본 발명을 제공 또는 반증하기 위하여 선택한 계에 관한 새로운 정보를 제공할 뿐만 아니라, 뉴클레오티드 서열에 의해 단백질을 얻는 일반적인 방법을 제공한다. 일반적으로, 주목적이 단지 자연 항원에 대한 합성을 천연 항원으로 제조하고자 하는 경우, 왁찐이나 항체의 제조보다도 정보를 얻는 데 몇 가지 검토의 목적이 있으므로, 실예의 연구, 검토 및 입증은 전연 필요가 없는 것이다.
본 발명의 처음의 입증 방법에서 취한 공정에는 다음과 같은 것들이 있다.
(a) 항원 결정기 펩티드가 특성화 되지 않은 항원으로부터 시작하는 경우에, 최초의 요건은 이 펩티드를 확인하고 특성화하는 것이다. 이 예에 있어서, 결정기 부위의 존재를 알 수는 없으나 입증된다. 또한, 이 예에 있어서, 비루스는 RNA로 구성되기 때문에 전사에 의해 DNA로 모사시킬 필요가 있다.
(b) 취급을 용이하게 하는 데 충분한 양을 얻기 위해서, 항원 cDNA를 기지의 플라스미드 내에 삽입시키고, 다량의 유전자를 증식시킨다. 물론, 이 조작은 충분한 양의 DNA를 얻을 수 있거나, 또는 DNA나 펩티드의 구조가 알려져 있으면 필요 없기 때문에 조작을 용이하게 하기 위하여 간단히 수행한다.
(c) cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 관련 펩티드를 특성화시킬 수 있으면, 이 공정은 필요없다. 마찬가지로, 게놈에 의한 것보다 직접 단백질을 특성화시키는 것을 선택한다면, 이 공정은 필요없다. 단백질이 분열되거나 분해된 사실의 발견 및 항원 결정기 부위가 빠져 있다는 사실의 발견을 포함하는 이 연구는 본 발명의 극히 일반적인 적용을 증명하며, 미생물을 감염시키는 데 전혀 나타나지 않는 항원용 왁찐과 진단제를 제조하는 길을 열어준다.
(d) 뉴클레오티드 서열이 일단 알려지면 게놈은 단백질의 아미노산 서열을 결정하며, 합성적으로 모사시켜야 할 펩티드를 선택할 수 있다. 단백질의 모든 부위가 적당한 출발점이다. 숙주 세포와의 교차 반응성 부위가 없다는 것은 합성을 시작하는데 유리한 부위가 있다는 것을 나타낸다. 선택이 있은 다음에는, 상기 예에서의 메리필드 등의 방법을 사용하여 목적하는 길이의 펩티드를 합성한다. 펩티드는 적어도 4mer이어야 하며, 일반적으로 적어도 8mer이어야 한다. 펩티드 가지가 길면 그만큼 특이성이 커지게 되나 합성 시간이 그만큼 더 길어진다. 8 내지 최고 수 백 mer까지의 펩티드가 적당하다. 15mer의 항원 결정기에 대한 면역 반응은 15 mer(플러스 방사성 표지) 결정기와 천연 항원에 대하여 모두 특이성이 있다는 사실을 주목하여야 한다.
(e) 특이성 항원 결정기를 합성하여 제조하고, 이종 단백질, 내독소, 세포 단편, 비루스 게놈 등을 제거시킨 다음, 적당한 캐리어와 접합시켜 특이성 항원 결정기가 합성 펩티드인 왁찐을 생성시킨다.
(f) 왁찐을 숙주 내에 주사하여 숙주를 면역시키고 항체를 생성시킨다.
(g) 이들 항체는 대형 합성 항원 결정기 및 천연 항원에 올리고 특이성이라는 것을 입증하였다.
(h) 항체는 비루스와 결합하여 불활성화 된다. 따라서, 본 발명은 (i) 종래에 알려지지 않은 항원 결정기의 예측 및 합성, (ii) 목적하는 면역 반응을 일으키는 왁찐의 제조 및 (iii) 천연 항원에 단독 특이적으로 결합하여 비루스를 중화시키는 항체의 제조에 성공한 것이다.
간염과 인플루엔자 왁찐
B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 뉴클레오티드 서열로부터 예측되는 아미노산 서열에 해당하는 13개의 펩티드를 화확적으로 합성하였다. 유리 합성 펩티드 또는 캐리어에 결합시킨 합성 펩티드를 토끼에 주사하여 13개 중 7개에 대하여 안티-펩티드 반응을 유발시켰다. 10개의 아미노산 보다 더 긴 6개의 가용성 펩티드 중에 4개의 펩티드에 대한 항혈청은 천연 HBsAg와 반응하여 Dane 입자들로부터 23,000 및 28,000 달톤 형태의 HBsAg를 특이적으로 침전시켰다. 성공을 위한 유일한 기회를 암시해 주는 어떤 구조적 특징 때문에 간염을 연구용으로 택한 것은 아니므로, 이들 결과는 상기 방법이 일반적이며, 충분한 범위로 연구될 때까지 모든 분자에 대한 연구를 행하여야 된다는 것을 가르켜 준다. 이러한 펩티드를 왁찐으로서 유용하게 사용할 수가 있다.
유전자의 뉴클레오티드 서열이 알려지고, 유전자의 단백질 생성물이 모두 이론적 및 실질적으로 관련된 두개의 유전자를 선택한다. 첫째의 것은 소수성이 크기 때문에 이 기술에 흥미 있는 도전장을 내는 분자인 B형 간염 게놈의 주요 외피 단백질이었다. 둘째는, 플루엔자비루스인의 헤마글루티닌(hemagglutinin)을 선택하였는데, 그 까닭은 그것의 완전한 결정 구조가 알려져 있고(Wilson, I.A., Skehel, J.J. 및 Wiley, D.C.(1981) Nature, pp.366∼73), 기지 분자 위치의 단백질 영역에 대하여 항체들이 어떻게 비루스 감염도를 교란시키는가, 그리고 사실상 그 분자에 대한 항원도의 상호 관계는 무엇인가를 서로 관련시킬수 있었기 때문이다.
B형 간염 표면 항원
B형 간염 비루스 표면 항원은 글리코실화 단백질이며, B형 단염 비루스의 42 나노미터 입자(Dane 입자)로 된 주표면 항원이다. HBsAg는 그룹(group) 및 타입( type) 특이성 결정기를 함유하며, 중화 항체의 주표적인 것으로 생각된다. HBsAg의 정제된 제제는 물리적으로 이형(異形)이며, 분자 크기가 23,000 내지 97,000달톤에 이르는 적어도 7개의 폴리펩티드로 구성된다. 질량 분석에 의하면 HBsAg2 주성분은 23,000달톤의 분자 크기를 갖는다(Pteterson, D.L. Roberts, I.M. Vyas, G.N.(19 77) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 74, 1530∼1534).
면역학적 연구에 의하면, 상이한 크기의 단백질들은 물리적 다형(多形, polym orphism)이 다른 글리코실화의 응집도를 반영한다는 사실을 의미하는 공통의 결정기를 공유한다는 사실을 보여준다. 기지의 뉴클레오티드 서열로부터 유도되는 226 아미노산의 긴 HBsAg의 아미노산 서열은 제7도에 도시되어 있다. 전반적으로, HBsAg는 프롤린과 시스테인 잔기가 풍부한 극히 소수성인 분자이다. HBsAg는 대략 평균적인 국부 소수성을 일으키는 카이트(Kyte) 및 두리틀(Doolittle)의 미발표 콤퓨터 프로그램에 의하여 연구를 행하여, 구조가 알려진 단백질의 내부 및 오부 잔기가 확실히 예측할 수 있다는 사실을 알았다.
HBsAg가 영역별로 고려되는 경우, 그 분자 내에서 3개의 소수성 영역과 2개의 “친수성”영역을 식별할 수 있다. 간략하게 하기 위해서, 친수성 영역을 언급하였으나, 사실상 그 분자는 매우 소수성이기 때문에 소수성에 대하여 생각하는 것이 친수성에 대한 것보다 더 정확하다. 가장 크고 가장 소수성인 영역은 약 80∼110위치까지 차지한다. 이 소수성 영역은 위치 45∼80 및 110∼150을 둘러싸는 2개의 친수성 영역과 접한다.
다른 2개의 소수성 영역들은 N 말단 및 C 말단에서 발견된다. 대부분의 시스테인은 2개의 친수성 영역 내에 밀집되어 있다. 전반적으로, 프롤린에서의 빈발되는 띠[밴드]와 시스테인에서의 결합쇄 내부의 이황화물에 의해 지령되는 복합 형태를 가질 잠재성이 있는 소수성 분자의 사진을 찍는다. 이와 같은 구조는 분자에 있어서의 단백질 분해 효소에 의해 알려지고 있는 내변성 및 내소화성과 일치되는 것이다.(Millman, I., Loeb, L.A. Bayer, M. 및 Blumberg, B.S.(1970) J. Exp. Med. 131, 1190∼1199).
그러므로, 이 분자의 대부분의 항원 결정기들은 선형 단백질 서열내에서 멀리 떨어진 아미노산에 의해 형성되지만, 분자의 3차 구조에 의해 공간 내에서 함께 가까이 유지된다. 이와 같이, HBsAg는 본 발명에 따른 합성 항원을 계획함에 있어서 연속되는 아미노산 서열의 이용을 일반화하는데 우수한 시험 사례이다.
원재료 및 방법
펩티드의 합성
이 연구를 위하여, 메리필드와 그의 공동 연구자들이 개발한 고체 상태법을 사용하여 펩티드를 합성하였다. 합성 펩티드는 진공 중에서 산가수 분해를 행하고(6N, HC l, 110℃, 72시간), 아미노산 조성을 측정하였다. 펩티드는 면역원으로서 사용하였기 때문에, 다량체형(multimeric form)을 제거하기 위한 어떠한 시도도 행하지 아니하였다.
캐리어 단백질에 대한 합성 펩티드의 접합
결합제로서 MBS(m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드에스테르)를 사용하여 펩티드의 시스테인을 통하여 1,3a 및 7을 제외한 모든 펩티드를 캐리어 단백질 KLH(키이홀 림페트 헤모시아닌)에 접합시켰다. 일반적으로, PBS(pH 7.5) 또는 붕산나트륨 완충액(pH 9.0) 중에 용해시킨 펩티드 5㎎을 KLH-MBS 3∼4㎎에 접합시켰다. 펩티드의 용해도를 최적으로 하기 위하여 펩티드의 용해에 적합한 pH를 선정하고, 엘만법(Ellman, G.L. (1959), Arch. Biochem. Biophys. 82, 70∼93)에 따라 유리 시스테인의 함량을 측정하였다. 각 펩티드에 대하여, PBS 0.25㎖ 중에 용해된 KLH 5㎎와 디메틸포름아미드 중에 용해시킨 MBS를 KLH : MBS의 몰비가 1:40이 되게하여 반응시키고, 실온에서 30분간 교반하였다. 이어서, KLH-MBS를 세파덱스 G-25에 통과시키고, PBS로 세척하여 유리 MBS를 제거하였다. O.D. 280에 의하여 조사한 컬럼 용출액의 피크 분획으로부터 얻은 KLH 회수율은 약 80%로 평가되었다. 다음에, KLH-MBS를 펩티드 5㎎과 반응시키고, pH를 7∼7.5로 조정한 다음, 실온에서 3시간 교반하였다. 접합 효율은 방사성 펩티드에 의해 조사하였다. 일반적으로, 25∼50 펩티드 분자가 100,000 달톤의 KLH와 결합되었다.
안티-펩티드 항체의 제조
다음의 순서대로 토끼를 면역시켰다. 1) 첫날에 프로인드 완전 보조액 중의 펩티드 200㎍이 접합된 KLH(1 : 1)를 피하 주사함. 2) 프로인드 불완전 보조액 중의 200㎍을 제14일에 피하 주사함. 3) 명반 4㎎과 함께 200㎍을 제21일에 복강내 주사함. 동물들은 최초의 주사후 14주 및 15주만에 출혈시켰다. 동일한 계획에 따라, KLH를 사용하지 않고(1㎎/주사), 펩티드 1을 주사하였다.
합성 펩티드의 면역 침전
여러가지 안티-펩티드 혈청의 반응성은 방사선 요오드와 표적 단백질을 면역 침전시키는 이들의 능력을 측정하였다. 펩티드에는 그 펩티드가 티로신을 함유한 경우에는 클로라민 T반응에 의해125I으로 또는 볼턴-헌터(Bolton-Hunter) 시약으로 표지를 붙였다. 고도로 정제된 의피 제제들(J. Gerin 제품)은 클로라민 T로 표지를 붙였다. 방사선 요오드화 표적은 PBS 또는 RIPA(0.15M NaCl, 10mM 인산나트륨 pH7.5, 1% NP40, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS) 중에 현탁시키고, 0℃에서 피검 혈청이나 또는 정상의 토끼 혈청 5㎕와 반응(5×106cpm/반응)시키고, 생성되는 침전물을 스타필로코쿠스 아우테우스 (Staphylococcus aureus)와 함께 수집하였다. 과립을 RIPA로 세척한 다음 500mM LiCl, 100mM 트리스(pH 8.5)로 2회 세척하고, 그 수를 세었다. 모사 결정기에 있어서의 변동률은 약 20%이었다.
면역 침전물의 폴리아크릴아미드 겔전기 영동
정제된 Dane 입자(Robinsom 제품)를 RIPA에 현탁시키고, 클로라민 T를 사용하여 방사선 요오드화 처리하였다. 이 제제를 0℃로 보온시킴으로써 정상 토끼 혈청으로 30분간 및 포르말린 고정 스타필로코쿠스 아우레우스로 30분간 사전 처리한 다음, 원심 분리하고(5분, 12,000g), 이어서 정상의 안티-펩티드 3혈청 또는 안티-펩티드 4 혈청과 함께 보온시켰다. 침전을 수집하고, 위에서와 같이 세척하여 겔상의 완충액 중에 현탁시키고, 비등 및 원심 분리하여 스타필로코쿠스 아우레우스를 제거한 다음, 5∼17% 아크릴아미드 SDS 겔 위에서 전기 영동시키고 방사선 사진을 찍었다.
결 과
합성용 펩티드의 선택
HBsAg의 물리적 구조에 관한 고찰과 발표된 3종의 뉴클레오티드 서열에 있어서의 변동에 따라 화학합성할 펩티드를 선택한다. 일반적으로, 본 발명자들은 캐리어 단백질에 접합되도록 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드와 함께 펩티드 서열의 일부를 되도록이면 크게 포함하도록 부위 선택을 시도하였다. 뉴클레오티드 서열이 관련 부위 내에서 시스테인을 예측할 수 없는 경우에는, 접합 목적으로 C-말단에 하나를 첨가하였다. 합성 펩티드는 제7도에서 밑줄을 그어 나타내고, 제8도에 도시하였다.
어느 부위는 다른 부위보다 성공률이 더 적다고 판단되었기 때문에, 분자 전체를 합성하지는 않았다. 81∼94 사이의 영역은 극히 소수성이기 때문에 회피하였다. 이 서열에 해당하는 합성 펩티드는 가용성이라는 것이 예측되지 않았으며, 또 이들 합성 펩티드에 대한 항체를 생성시킬 수 있다 하더라도, 이 부위는 천연 분자의 표면 상에 위치한다고 예측할 수는 없다. 비슷한 이유 때문에, 소수성 C-말단 영역의 큰 부위(위치 164∼211)에 관한 연구는 행하지 않았다.
110∼114 위치 사이의 영역은 발표된 3종의 뉴클레오티드 서열 중의 이 영역 내에서의 일치성이 없었기 때문에 회피하였다. (Valenzuela, P. Gray, P., Quiroga, M., Zaldivar, J., Goodman, H.M. 및 Rutter, W.J. (1979), Nature, 280∼815∼81 9. Pasek, M., Goto, T., Gilbert, W., Zink, B., Schaller, H., Mackay, P., Leadbette r, G. 및 Murray, E., Fitoussi, F., Tiollais, P. 및 Charnay, P.(1979), Nature, 281, 646∼650).
완전한 3차 구조가 알려진 분자 영역을 사용하여 이미 성공한 사례가 있기 때문에 분자의 N-극말단 및 C-극말단에 해당하는 펩티드들을 포함시켰다.(Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M. Green. N., Liu. F-T, Niman, H.L. 및 Lerner, R.A. (1980), Nature287, 801∼805. Walter, G., Scheidtmann, K-H, Carbone, A., Laudano, A. 및 Doolittle, R.F.(1980), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 5179∼5200). 나머지 펩티드들은 분자의 친수성 영역에 대응하도록, 그리고 분자가 회전하여“코너(corner)”에 노출되기를 기대하는 친수성 영역과 소수성 영역 사이의 프롤린 함유 접속부에 대응하도록 선택하였다. 펩티드 3 및 7은 불용성이라는 것을 알았으며, 따라서 추적되지 않았다.
합성 펩티드류의 항체와 자연 HBsAg의 반응
천연 HBsAg에 대한 반응성을 시험하기 전에, 합성 펩티드에 대한 항체 반응이 일어나 있다는 것을 확인하는 일이 중요하였다. 제2표의 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, KLH에 접합시킬 때, 항혈청의 방사선 요오드화 펩티드 침전능에 의해 판단한 결과 10개의 펩티드 중 6개는 면역원이었다. 펩티드 4a, 8 및 8a만이 안티-펩티드 반응을 일으키지 못하였고, 펩티드 2는 한계 반응만을 유발시켰다. 그리고, 펩티드 1은 KLH와 접합시킬 필요가 없는 유효한 면역원이었다. 그 정도는 시간의 경과에 따라 분류되지만, 조기 출혈들은 그 반응의 방향을 나타내는 것이었다.
여러 가지의 펩티드에 대하여 생성되는 항체가 HBsAg 분자와 반응할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 면역 침전응을 평가하고, B형 간염 데인(D ane) 입자들로부터 정제된 HBsAg를 방사선 요오드화 처리하였다. HBsAg를 RIPA 완충액 중에 현탁시켰을 때 적절한 펩티드에 대하여 반응을 일으킨 7개의 항체 중 4개 역시 HBsAg를 침전시켰다. 특히, 펩티드 1,3,4 및 6의 항체들은 정제된 HBsAg와 반응하는 반면에, 펩티드 5,5a 및 6a는 이들의 표적 펩티드(4a, 8 및 8a)를 알 수 없었던 항혈청이 반응하지 못했던 것과 같이 반응하지 못하였다. 다시, 펩티드 2는 한계 반응성을 나타내었다.
제2표에 주어진 연구에 있어서, 동일한 처리를 행한 토끼의 혈청 사이에 변동이 있다는 사실이 분명하다. 1마리의 토끼 03302를 제외한 모든 동물에 있어서의 조기 출혈은 3개월 반응을 예측하는 것이다. 펩티드, 8은 극히 불용성이었으며, 따라서 본 발명자들은 용해도 문제로 펩티드 8이 얼마나 유효하게 KLH와 접합되는가를 결정할 수가 없었기 때문에, 두 마리의 토끼가 그 펩티드에 반응하지 못한다는 것은 일시적이라고 생각할 수밖에 없다.
[표 2]
+항체 역가는 시험 혈청에 의한 침전수를 정상 혈청에 의한 침전수로 나눈 값으로 나타냄.
* pH 5.3에서 주사함.
** pH 8.5에서 주사함.
개개의 펩티드에 관한 여러 가지 관련된 특징들은 면역원이라는 것이 제2표에서 분명하다. 펩티드 6은 면역원이 높기 때문에 천연 HBsAg 뿐만 아니라, 그 자체와 반응성 있는 항체를 생성시킨다. 그러나, 펩티드 6a(펩티드 6의 C-말단 6 아미노산)는 그 자체에 대한 항체를 생성시킬 수는 있으나, 천연 HBsAg와 반응성 있는 항체는 생성시키지 못한다. 또, 펩티드 4는 그 자체에 대한 항체 및 천연 HBsAg를 생성시킬 수 있는 반면에, C-말단을 갖는 헥사머(hexamer)(펩티드 4a)는 생성시키지 못한다. 펩티드 1은 두가지 점에서 특히 관심을 끈다.
첫째로, 이것의 면역성은 캐리어에 좌우되지 않는데, 그 까닭은 아마도 펩티드 1 그 자체에 의하여 항체를 유발시키는 데에 면역성이 충분히 길기 때문이다. 그러나, 보다 흥미로운 것은 천연 HBsAg에 반응성이 있는 항체의 유발능은 면역원을 용해시키는데 이용하는 pH에 좌우된다는 사실이다. 펩티드 1은 pH5.3에서 완전히 용해되어 62% 유리 시스테인을 표현한다. 이 pH에서 용해된 펩티드에 대하여 생성되는 항체는 표적 펩티드 뿐만 아니라 천연 HBsAg를 인식시킨다. 이와 반대로, pH 8.5에서 그 펩티드는 난용성(15% 미만)이기 때문에, 유리 시스테인을 표현하지 않는다. 이 pH에서 주사하면, 그 펩티드는 그 자체에 대하여 약한 반응을 나타내며, HBsAg에 대해서는 전혀 반응이 없다.
RIPA 완충액은 HBsAg를 변성시키지 않을 것으로 예측되지만, 본 발명자들은 보다 생리적인 조건하에서 이 분자의 면역 반응성을 연구하고자 시도하였다. 항원을 PBS(0.15mM NaCl, 10mM 인산나트륨 pH 7.5) 중에 현탁시키고, 여러 가지의 안티 -펩티드 혈청과 반응시켰다. 모든 혈청을 RIPA(데이타는 나타내지 않음)에서와 거의 동일한 효율로 PBS 중의 HBsAg와 반응시켰다. 따라서, 항체는 거의 자연 조건하에서 분자를 인식시킨다. 그러므로, 이와 같은 펩티드에 대한 항체들은 시험관 내 뿐만 아니라, 생체 중에서도 기능하는 것이 기대될 수 있다.
데인 입자들 중 어느 분자가 이들 합성 펩티드에 대한 항체와 반응성이 있는가를 결정하기 위하여, 정제된 데인 입자들(혈청형 adw)은 세정제로 분해시키고 단백질은 방사선 요오드화 처리하였다. 표지를 붙인 단백질을 여러 가지의 안티-펩티드와 함께 침전시키고 침전물 중에 함유된 성분들을 SDS- 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였다. 분자크기가 대략 28,000 및 23,000 달톤인 두가지 주성분은 천연 HBsAg와 반응성이 있는 항체에 의해 데인 입자들로부터 침전시켰다(제9도).
28,000 및 23,000 달톤종은 글리코실화도가 다른 전술한 [Dane, D.S., Came ron, C.H 및 Briggs, M.(1970) Lancet 695∼698. Peterson, D.L. Roberts, I.M. 및 Vyas, G.N.(1977)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 1530∼1534. Shih, J., 및 Gerin, J.D.(1977) J. Virnl. 21, 347∼357]2종의 HBsAg의 주형태 (I 및 II)에 해당한다. 그 밖에, 펩티드 3(제3도) 및 펩티드 6(데이타는 나타나 있지 않음)에 대한 항혈청 역시 아마도 다량체 형태나 또는 전구체 분자를 나타내는 약 47,000 및 170,000 달톤의 이동도를 갖는 단백질과 반응하였다. 47,000 달톤종은 대개 HBsAg의 이량체형인 것 같다(Mishiro. S., Imai., M., Takahashi, K., Machida, A., Gotanda, T., Miyakawa, Y 및 Mayumi, M., m(1980), J. Virol. 124, 1589∼1593. Koistinen, V.,(1980), J. Virol. 35, 20∼23). 그러므로, 이 항체들은 기지의 B형 간염 병인제(病因劑)중에서 발견되는 단백질로 된다.
HBsAg에 대한 전구체인 분자들의 개념은, 보다 고분자량 형태의 어떤 반점들은 HBsAg의 분자들에 해당하는 반면에, 다른 반점들은 이들 분자들에 해당하지 않는다는 것을 나타내는 트립신 지문(指紋)에 있어서의 로빈슨(Robinson) 데이타와 일치한다( Robinson, W., Personal Communication). HBsAg에 반응성이 있는 모든 항체들이 데인 입자들 중에서 23,000 및 28,000 달톤 형태의 HBsAg를 나타내는 반면에 일부분만이 보다 고분자량 형태를 나타낸다. 아마도 보다 큰 형태의 구조 및(또는) 글리코실화도는 문제의 펩티드가 은폐된 것으로 추측된다. 별법으로서는, 전구체의 처리에는 표적 펩티드를 은폐시키는 단백질이나 또는 세포 구조에 결합시키는 처리를 포함시켜도 좋다.
전술한 전개에 있어서, 동일한 방법을 사용하여 B형 간염에 대한 특이성 항원 결정기 특성을 얻기 위하여 다음의 펩티드를 측정하였다.
PheProGlySerSerThrThrSerThrGlyProCysArg
ThrCysMetThrThrAlaGlnGlyThrSetMetTyrProSerCys
좌측 절반 역시 특이성 항원 결정기이며, 따로 설명한 바와 같이, 기지의 항원 결정기들로부터 선택된 6개 이상의 아미노산 펩티드 부위들도 또한 본 명세서에서 설명한 방법으로 제조하여 입증할 때 특이성 항원 결정기로서 기능한다.
발 및 구강의 질병
동일한 조작을 사용하여, 다음의 서열을 가진 발 비루스 및 구강 비루스에 대한 특이성 항원 결정기인 합성 펩티드를 유도하여 제조하고, 또한 그 펩티드를 전체의 게놈에 의하여 코드화시켰다.
ACCACTTCTGCGGGCGAGTCAGCGGATCCTGTCACCACCACCGTTGAAAACTACGGTGGC
ThrThrSerAlaGlyGluSerAlaAspProValThrThrThrValGluAsnTyrGlyGly
GAAACACAGATCCAGAGGCGCCAACACACGGACGTCTCGTTCATCATGGACAGATTTGTGAAS
GluThrGlnIleGlnArgArgGlnHisThrAspValSerPheIleMetAspArgPheValLys
[Kupper, H., Keller, W., Kunz, C., Forss, S., Scholler, H., Franze, R., Strohmair, K., Marguardt, O., Zaslovsky, V.G., 및 Hofschneider, P.H.,“Cloning of cDNA of major antigen of foot and mouth disease virus and expression in E. coli)” Nature 289:555∼559(1981), (제10도 참조)]
인풀루엔자
인풀루엔자 균주 X-47[M. Verhoeyen, R. Fong, W. Min Jou, R. Devos, D. Heijlebroek, E. Samon & W. Fiers. (1980), Nature 286, 771 ; A.G. Proter, C. Barber, N.H. Carey, R.A. Hallewell. G. Threlfall, J.S Emtage(1979) Nature 282 471]의 게놈으로부터 출발하며, 특이성 항원 결정기 영역을 예측하기 위하여 관련 균종으로부터의 정보를 이용하는 제법에 있어서 일반적인 제법을 적용하였다(I.A. Wilson, J.J. Skehel, D.C. Wiley(1981). (Nature 289, 366). 제11도에 도시한 게놈 부위로부터 코드된 다수의 펩티드가 합성되고 상기 일반적인 제법이 입증되었다. 또 다른 증거는 개발중이며, 그 방법은 본 명세서에 설명된 종류의 항원과 항원제제 및 항체 제제의 제조에 이르는 방법을 제공하는데 일반적이라는 데에 의문의 여지가 없다.
완전 항원 캐리어
일반적으로, 숙주 내에서 항체 반응을 일으키는 데에는 캐리어 특이성 항원 결정기 펩티드를 접합시켜야만 된다. 어떤 경우에 있어서는 펩티드를 충분히 크게 하면 그 펩티드가 캐리어 구성을 할 수도 있다. 다수의 캐리어들이 실험실용으로 사용될 수 있으나, 임상 제조용으로 인정되는 캐리어의 수효는 아주 제한되어 있다. 이러한 문제점들은 본 발명에 따른 하나의 관점, 이를 테면 폴리(펩티드) 중합체 및 공중합체의 제조에 의해 해소된다.
특이성 항원 펩티드를 확인하여, 이들이 관련 세균에 대한 항체를 생성시킨다는 것이 입증되면, 동일한 펩티드의 반복 단위를 갖는 단독 중합체, 또는 2개 이상의 특이성 항원 결정기 펩티드의 공중합체(자연적으로 생성되는 동일 또는 상이한 세균에 대한 항체를 생성시킬 수 있음) 또는 다른 펩티드(이들의 일부 또는 전부가 항원성 결정기가 아니어도 좋음)와의 공중합체와 함께 결합되는 특이성 항원 결정기 펩티드로 반드시 구성되는 항원을 제조할 수가 있다.
펩티드 가지를 함께 결합시키는 기술은 잘 알려져 있으나, 지금까지는 새로운 결과인 전술한 생성물의 제조 가능성이나, 폴리(펩티드 특이성 항원 결정기) 중합체 또는 공중합체를 제조하는 기술이 제안된 바 없다. 이와 같은 항원의 에는 제12도에 도시한 B형 간염 폴리(특이성 항원 결정기 펩티드)가 있다.
리포솜
특이성 항원 결정기 모핵으로 구성되는 리포솜은 다수의 펩티드 특이성 항원 결정기를 지방산 모핵, 예를 들면 스테아로일 부위 모핵에 결합시키고, 그 결과로 생성되는 스테아로일 펩티드를 지질이 풍부한 핵과 반응시킴으로서 제조된다. 스테아로일 모핵들 자신은 다수의 특이성 항원 결정기 펩티드를 나타내는 리포솜을 생성하는 핵 쪽으로 배향하고, 그 핵 내부로 용해된다. 펩티드는 모두 동일한 특이성 항원 결정기일 수가 있고, 또는 동일 또는 상이한 세균에 대하여 자연 발생되는 동일 또는 상이한 항원을 위한 다수의 특이성 항원 결정기들을 특이성 항원 결정기 리포솜의 일부로서 결합시킬 수도 있다. 전술한 종류의 항원 결정기에 대해서 종전에는 어떠한 기도도 행하여지지 않았으며, 또 존재하지도 않았다.
논 의
개괄적으로 볼 때, 본 발명의 연구는 일정한 뉴클레오티드 서열을 생성시킬 수가 있고, 예측되는 단백질의 여러 가지 영역으로부터 여러 가지의 펩티드를 화학적으로 합성시킬 수가 있으며, 이들의 일부와 함께 천연 구조와 반응성이 있는 항체를 생성시킬 수가 있다는 것을 나타내고 있다. 간염 분자는 유일한 성공의 기회를 제시해 주는 임의의 구조적 특징 때문에 연구용으로 선택하지 아니하였으므로, 본 발명자들의 결과들은 이 방법은 일반적이고, 연구 영역이 충분할 정도로 긴 임의의 분자에 대하여 연구를 행하여야 한다는 것을 제시해 주고 있다.
그 규칙에 관하여 말하자면, 지금에 이르러 본 발명자들은 용해도가 한정되어 있거나 또는 6개 미만의 아미노산들을 함유하는 펩티드는 선택의 기회가 적다는 것을 알게 되었다. 모든 생산적 펩티드들은 1개 이상의 프롤린을 함유하였으며, 따라서 이러한 사실은 공지의 것과 일치하는 것이었다. 본 발명에 있어서 잔기가 10∼34인 6개의 가용성 펩티드 중 4개가 유용하다는 것이 입증되었다. 유전자의 서열이 알렸진 뉴클레오티드 서열로부터 미지의 단백질을 발견하기 위한 이 기술의 일반적인 적용이 이제는 가능하게 된 것이다.
B형 간염 표면 항원에 대한 종전의 연구는 그 항원은 천연 구조와 반응성이 있는 항체의 제조를 위한 구조에 정확히 좌우되는 하나의 분자라는 결론을 내렸다. 바이아스 (Vyas)와 그의 공동 연구자들은 B형 간염 항원의 이황화물 결합의 환원 및 알킬화에 의해 항원성이 완전히 잃어지게 된다는 사실을 제시하였다(Vyas, G.N., Rao, K.R. Ibrahim, A.B.(1972). 그러나, 이와는 반대로 이들 결과들은 Science에는 짧은 펩티드에 의해 얻을 수 있는 것 이외의 어떠한 구조에도 좌우되지 않는 결정기들이 존재한다는 사실을 나타내고 있다.
이 두 가지의 연구들을 함께 고찰해 보면, 알킬화시켰음에도 불구하고 보다 크게 변질된 구조의 일부로서의 직선형 서열은 천연 분자와 반응성이 있는 항체를 생성시키지 못하는 반면에, 이웃하는 아미노산류의 구속을 받지 않는 동일한 서열은 이와 같은 항체를 생성시킨다는 결론을 내리게 된다.
합성 폴리펩티드를 사용하여 탐구해야 할 잔존하는 HBsAg의 영역들이 있다. 본 발명자들은 위치 110∼140과 162∼210 사이의 분자에 대하여는 거의 아는 바가 없다. 110과 140 사이의 친수성 영역은 여러 가지의 상이한 서열 중에서도 변화도가 높기 때문에 특히 관심을 끈다. 흥미롭게도, 파세크(Pasek) 등의 연구에서는 데인 입자들원으로서 사용한 플라즈마는 복잡한 혈청형(adw 및 agw)이며, 이들 연구자들은 HBsAg에 해당하는 서열의 영역 내에서의 미소한 이형성(異形性)을 주목하였다. 아마도, 110∼135 사이의 서열 변화는 HBsAg에 타입 특이성을 부여해 주는 분자의 영역에 해당하는 것 같이 생각된다. 위치 40∼50에 미치는 영역 역시 3개의 뉴클레오티드 서열중 대단한 이형성을 나타낸다.
이와 관련하여, 파세크 등의 뉴클레오티드 서열로부터 예측되는 영역에 해당하는 펩티드 5에 대하여 생성되는 항체들은 본 발명자들의 시험 외피(혈청형 adw)와 반응하지 않는다는 것은 흥미로운 것이다. 이것은 이 영역, 아마도 타입 특이성 변화의 제2영역 내에서는 본 발명자들이 선택한 펩티드들은 본 발명자들이 사용한 외피의 영역에 대응하지 않는 다른 사실에 기인하는 수도 있다.
본 명세서상에 기재한 결과들은 핵산 서열로부터 예측되는 펩티드를 합성하여 천연 분자에 반응성이 있는 생성능을 일반화 시켜주고 있다. 이러한 항체들은 본 신험에 앞서서 알려진 천연 분자의 잔은 영역과 이들 항체가 반응하는 한 독특한 반응 시약인 것이다. 따라서, 이 방법으로 생성시킨 항체들은 하이브리도마와는 다르며, 이 하이브리도마는 전체 분자의 연구 초기에는 유용하지만, 단백질 영역의 미세한 구조 분석을 위하여 더 특성화시켜야 한다.
복제물로서 뉴클레오티드 서열을 사용하여 제조한 합성 펩티드는 왁찐화의 이용에 이상적이라는 것을 증명되어야 한다. 예를 들면, 폴리펩티드(이를테면, 본 연구의 1,3,4,6)의 조합은 광범위하게 B형 간염을 비루스를 예방하며, 이에 따라 감염제(感染劑)의 혈청 다변성과 항원의 유전적 유동(
)과 같은 생물학적 변수 뿐만 아니라, 숙주 면역 반응의 개체성이 소거된다.
각 아미노산의 치환체들은 알려져 있는 바와 같이 대등한 특이성 항원 결정기들을 생성하도록 만들 수가 있으며, 또 본 명세서에 제공된 바와 같이 제조하여 증명할 경우, 완전히 대등한 항원 결정기들을 펩티드 서열체 내의 제한된 아미노산 수효가 달라질 수도 있다는 것을 명백히 이해하여야 한다. 이것은 모두 본 발명의 범위 내에서 시도된다.
일반적인 적용예
본 발명의 일반적인 방법들은 숙주 내에서 면역 반응을 일으키는 올리고 펩티드 항원 결정기와 관련된 모든 병원체에 대하여 적용할 수가 있다.
적용예-박테리아
예를 들면, 병원체가 박테리아이고 박테리아의 숙주내 도입이 박테리아를 구속 및 중화시키는 경향이 있는 항체의 숙주 생성을 유발시키는 경우에는, 가능한 항원 결정기를 코드화하는 박테리아 게놈의 일부는 공지의 유전자 기법을 사용하여 확인한다. 이어서, 관련 유전자는 클로닝시키고, 그의 뉴클레오티드 서열은 공지의 DNA 지도 작성 기법을 사용하여 결정한다. 이 뉴클레오티드 서열과 유전자 코드로부터, 추정되는 항원 단백질 영역의 아미노산 서열을 결정한다. 이어서, 많은 잠재 항원 결정기들을 화학적으로 합성하고, 캐리어에 접합시켜 잠재 항원을 생성시키고, 적당한 숙주 내에 도입시킨다.
박테리아와 결합하여 중화시키며 숙주에게는 무해한 항체 생성을 개시하는 상기와 같이 생성되는 잠재 항원은 공지의 면역 화학적 기술에 의해 결정한다. 이어서, 소정의 면역학적 보호를 유발시키기 위하여 그와 같이 결정된 항원은 소정의 규모도 제조하여 숙주 내에서 보호 항체를 생성시키는 데 사용할 수 있다. 항체들은 회수하여 예컨대 진단용에 사용하기 위한 올리고 특이성 항체를 제조할 수 있다. 이것은 물론 촛점을 비루수보다 박테리아에 맞춘 것을 제외하고는, 항비루스 왁찐을 제조하기 위하여 처음에 설명하였던 방법과 일치한다.
적용예-질병
본 발명의 방법은 예컨대, 탄저병(Bacilus anthracis), 기종저(Clostridium chauvoei) 및 돼지 콜레라(Erysipelothrix rhusiopathiae) 등의 동물에 있어서의 박테리아 질병과 비루스성 돼지 콜레라, 발 및 구강의 질병과 광견병 등의 비루스 질병을 예방하고, 전술한 병 등을 확인하기 위한 항체 진단 제제의 왁찐을 제조하는 데 사용할 수가 있다. 왁찐 이외에, 디프테리아(Corynebacterium cliphtheriae), 성흥열(Stre ptococcus pyogenes), 결핵(Mycobacterium tuberculosis), 백일해(Bordetellaper tussis) 및 장티프스(Salmonella typhi) 등의 박테리아 질병 및 천연두(Variola major , Variola minor), 홍역(rubeola), 풍진(rubella), 볼거리(Epidemic parotitis), 인플루엔자, 플리오마이엘리티스(Polyomyelits)에 대한 항체가 본 발명의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 본 발명에 설명된 왁찐은 종전 기술에 의한 왁찐에 있어서와 같이 그 용도가 제한되는 등의 부작용이 없다. 예컨대, 본 발명에 따르면, DNA 서열을 정함으로써 그 서열이 결정되고, 캐리어 위에 인플루엔자의 특정 균주에 대한 특이 항원 결정기가 들어 있으며, 종전의 인플루엔자 왁찐의 제한된 용도를 갖는 부작용이 없는 합성 펩티드로 반드시 구성된 왁찐이 이제는 가능하게 되었다. 부작용이 없는 인플루엔자의 광범위한 예방은 보다 보편적이거나 기대되는 인플루엔자 유발 비루스 균주에 대한 본 발명의 왁찐을 제조함으로써 성취될 수 있다. 전술한 박테리아 및 비루스 질환의 예방 및 진단용 왁찐과 항체제 제의 제조는 물론 본 발명의 일반적인 범주와 본 발명의 적용성을 예시한 것에 지나지 않는다.
진균류, 효모균, 체세포
본 발명의 개념과 방법들은 또한 진균류, 효모균 및 병원성 체세포 단편 등과 같은 다른 세균에 의한 병원성 반응을 방지하는 데에도 적용할 수 있는데, 여기서 항원-항체의 결합이 일어나서 세균을 불활성화 시키거나 또는 숙주 내에서 세균을 중화시키거나 세균의 병원성 반응을 방지함으로써, 또, 진균류 및 효모균, 즉 확인된 극성 단백질을 코드시키는 세균 게놈의 일부에도 동일한 방법이 적용된다. 다음에, 관련 유전자를 클로닝시키고, 그의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 이어서, 뉴클레오티드 서열을 추정되는 항원 단백질의 아미노산 서열의 결정에 이용하고, 다수의 잠재 항원 결정기들을 화학적으로 합성한 다음, 캐리어에 접합시켜 적당한 숙주 내에 주사한다. 전술한 각각의“항원”에 대한 면역 반응을 결정하고, 면역학적으로 관련이 있는 특정의 특이성 항원 결정기는 특정의 항원과 관련이 있고 세균에 대한 항체를 생성하며, 숙주에는 유해하게 반응하지 않는다는 것이 확인되었다. 이어서 이와 같이 확인된 특이성 항원 결정기를 갖는 펩티드는 소정의 양으로 화학 합성되며, 캐리어에 그 펩티드를 접합시켜 얻은 왁찐은 세균의 병원성으로부터 숙주를 보호하는데 사용된다. 다른 목적이나 진단을 위한 올리고 특이성 항체 역시 회수할 수 있다.
적용예-진단 기법
본 발명의 방법은 이를 테면 세균에 대한 항체를 검출하거나 또는 세균상에 결정기를 복제시키는 합성 항원을 검출하는 데 필요한 면역 분석법과 같은 진단 시험의 준비에도 사용될 수가 있다. 이러한 진단 기법에는 이를 테면 효소 면역 분석법, 방사선 면역 분석법, 형광 면역 분석법 및 기타의 방법들이 있는데, 이들 방법들에 있어서 항체나 항원에 검출할 수 있는 임의의 표지를 붙인다.
따라서, 볼러(Voller)와 그의 공동 연구자에 의해 설명된 이중 항체법,“진단 의학에 있어서의 효소 면역 분석법”세계 보건 기구 회보 (“Enzyme Immune Assays in Diagnostic Medicine,”Bulletin of the World Healfh OrganizZation), 제53권, 55∼65페이지(1976)에 의한 ELISA 시험을 행하여 본 발명 방법의 적용성을 결정한 다음, 진단 시험 준비를 하였다. 안티-R 혈청과 R-펜타데카펩티드 항원(위에서 설명한 바와 같이 얻음)을 사용하였다. 항체의 일부를 고추냉이 퍼옥시다제 효소와 나까나 (Nakana) 및 가와오이(Kawaoi)의 과요오드화물법, Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Volume 22, pp.1084∼1091(1974)에 의해 접합시켰다. 이어서, 공지의 효소 면역 분석법에 따라, 린브로 판(Linbroplate)을 정제된 항체로 피복시키고 세척하였다. 다음에, R-단백질을 판의 일부 요부(凹部, well)에 첨가시킨 다음, 보온하에 두번째 세척을 행하였다. 마지막으로, 항체 피옥시다제 접합체를 판의 모든 요부에 첨가시킨 다음, 두번째 보온하에 세번째 세척을 행하였다. 요부의 기질 첨가는 항원이 첨가된 요부들에 있어서는 정반응(색상)이 나타났으나, 항원이 첨가되지 않는 요부들에 있어서는 정반응이 나타나지 않았다. 그러므로, 이것은 시험의 실행을 나타내는 것이다. 유사한 방법으로, 본 발명의 방법으로 제조된 생성물을 사용하여 다른 면역 분석 시험을 행하였다.
적용예-수동 면역법
다수의 질병에 대한 예방은 예방하고자 하는 객체에 왁찐(약화시킨 세균 함유)을 주입함으로써 성취되는데, 이 때 그 객체는 왁찐 내에 들어 있는 약화된 세균에 대하여 항체를 만든다. 이 기술은 많은 질병에 대하여 행할 수가 있으나, 환자에 의해 항체를 생성시키는 물질을 주사 투여하는 것보다도 질병에 대한 항체를 주사 투여하는 것이 보다 바람직한 예방법이 될 수 있는 질병도 많다. 이러한 면역법을 수동 면역법이라고 일컫는다.
수동 면역이 필요한 경우에는, 본 발명의 방법을 이용하여 각각의 질병 세균에 있는 결정기에 대한 항체를 생성시킨 다음, 그 항체를 수동 면역에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 취급하기가 위험하거나 증식시키기가 어려운 질병, 이를 테면 B형 간염, 광견병, 황열병 및 여러 가지의 리케치아질병(예, Q 열병) 등의 왁찐 제조에 유용하게 사용할 수가 있다.
전술한 바와 같이 하여 생성시킨 R-펜타데카펩티드에 대하여 생성되는 항체는 페리틴(ferritin)과 접합시키고[Singer, SJJ. 및 Schick AAF., J. Biophys. Biochem. Cytol. 9 : 519(1961)], 비루스 입자 위에 있는 항원 부위와 결합하여 반응시킴으로써 , 비루스를 부동화(不動化)시킨다. 페리틴 배열에 의해 가시화(可視化)되는 합성 항원 유발 항체에 의하여 결합된 항원 부위를 갖는 비루스 입자의 표면은 제6도의 사진에 나타나 있다.
이와 같은 방법으로 숙주 내에서 항원을 생성시키는 세균에 대한 왁찐은 본 발명에 따라 제조된다. 숙주 내의 항원 생성을 코드화시키는 게놈 부위는 유전자 기술에 의해 확인된다. 1개 이상의 부위가 시험적으로 확인될 수가 있으며, 각 부위는 어느 부위가 유도된 항원의 항원 결정기를 실질적으로 코드화시키는가에 관한 최종 입증 증거를 성취한다. 다음에, 관련 있는 각 유전자를 클로닝시키고, 관련 있는 펩티드의 아미노산 서열로부터 결정되는 각 유전자의 뉴클레오티드 서열은 종래의 유전자 코딩에 의해 결정한다. 각 펩티드는 합성되고 캐리어와 결합되어 항원 결정기가 펩티드 가지인 잠재 항원을 생성시킨다. 이들 항원은 숙주 내에 도입시키고, 유도되는 항원에 대하여 항체를 생성시키는 항원은 공지의 면역 화합법에 의해 확인한다. 이 항원은 숙주 내에 주사 투여하면, 항체가 생성되고, 이 항체는 표현되지는 않지만 세균에 의하여 생성된 병원성 항원과 결합하여 그것을 불활성화시키고, 숙주 내에서의 병원 효과를 예방 또는 제한한다. 물론, 이 항체들을 회수할 수도 있다. 이 적용예는 로우스 사르코마(Rous sarc oma) 비루스에 의해 유발되는 암 예방용의 왁찐 제조 및 진단용의 올리고 특이성 항체 제조이다.
화학 병원체를 비롯한 다른 병원체도 역시 숙주 내에서 항원 단백질의 생성을 유도한다. 본 발명은, 전술한 바와 같이, 병원성 세균이나 또는 숙주 내에서 항원 단백질을 코드화시키는 유전자를 확인하는 공정, 이 유전자의 서열을 정하는 공정, 특이성 항원 결정기를 포함하는 펩티드의 합성 공정 및 항원을 제조하는 공정도 포함한다.
본 발명은 또한 보다 많은 세균들이 확인되고 추측되는 병원성 세균 그 자체 내에서는 특이성 항원 결정기가 스스로는 표현되지 않는 질병을 왁찐을 제조하는 데에도 이용할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
산업상의 이용
한 가지 및 단 한 가지 면역 반응을 일으키는 항원의 생성능, 병원체에 대한 항체의 생성능 및 단 한 가지의 항원 결정기와 결합하여 이 것을 불활성화시키는 항체의 생성능은 인간 개개인의 생명에 대한 이들 기술의 중요성은 말할 것도 없이 축산업에도 있어서도 그 산업성과 경제적인 중요성이 대단한 것이다. 본 발명은 동물용은 물론 인간용의 왁찐 제조와 동물 및 인간 질병의진단과 치료용의 항체를 제조하는 데 유용하다
Claims (1)
- (ㄱ) 자연 발생 단백질 및 그의 단편과, (ㄴ) 모든 경쟁 및 간섭 단백질과 (ㄷ) 비루스 게놈, 박테리아 핵산 및 내독소가 없으며, 천연의 병원성(病原性) 단백질에 존재하는 항원 결정기 아미모산 서열을 모사(模寫)하는 적어도 4개의 아미노산 서열을 가지고, 천연의 병원성 단백질의 분자량보다 적은 분자량을 갖는 예정량의 펩티드를 화학 합성하는 제1공정, 숙주 동물 내에서 항체의 생성을 유도하는 데 충분한 양의 상기 화학 합성 펩티드의 분취량을 상기 숙주에 도입하는 제2공정, 생성된 항체를 분석하여 상기 천연 동물성 병원성 단백질과의 반응능(反應能) 및 숙주 동물의 보호능(保護能)을 측정하는 제3공정, 그리고 천연의 동물 병원성 단백질과 반응하고 숙주 동물을 보호하는 항체를 유도하는 화학 합성 펩티드의 양을 제1공정에서의 양보다 다량으로 만드는 제4공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하여, 천연의 동물 병원성 단백질의 항원 결정기를 모사한 진단 및 치료용 합성 항원 펩티드의 제조 방법.
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