DE60120391T2

DE60120391T2 - Verwendung von hev-polypeptiden

Info

Publication number: DE60120391T2
Application number: DE60120391T
Authority: DE
Inventors: A. Howard Marietta FIELDS; E. Yury Duluth KHUDYAKOV; Jihong Atlanta MENG
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Centers of Disease Control and Prevention CDC
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2021-04-04
Also published as: WO2001077156A3; DE60120391D1; WO2001077156A2; EP1274725B1; AU5125001A; CA2405084C; EP1274725A2; ATE328897T1; AU2001251250B2; CA2405084A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete der Virologie und Immunologie und liefert immunogene neutralisierende Hepatitis-E-Virus-(HEV)-Polypeptide zur Verwendung als Reagenzien zum Nachweis von HEV in einer biologischen Probe und zur Verwendung als Impfstoffe zur Behandlung oder Prophylaxe einer HEV-Infektion.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die von HEV verursachte Krankheit wird Hepatitis E oder enterisch übertragene non-A-non-B-Hepatitis (ET-NANBH) genannt. Andere Namen schließen fäkal-orale non-A-non-B-Hepatitis und A-artige non-A-non-B-Hepatitis ein. HEV wird hauptsächlich auf dem fäkal-oralen Weg übertragen und verursacht epidemische oder sporadische Fälle von Hepatitis. Zahlreiche Ausbrüche von HEV traten in vielen Entwicklungsländern auf, was dazu führte, dass Zehntausende von Menschen infiziert wurden. Die Mortalitätsrate einer akuten HEV-Infektion liegt in einem Bereich von 0,5 bis 1% für die Bevölkerung im allgemeinen und bis zu 20% bei infizierten schwangeren Frauen. Obwohl nur wenige Fälle in den industrialisierten Ländern diagnostiziert wurden, wurden anti-HEV-Antikörper bei einem erheblichen Anteil von Blutspendern oder gesunden Menschen gefunden. Der Grund für diese relativ hohe Seroprävalenz ist nicht leicht zu erklären, kann aber mit dem zoonotischen Merkmal der HEV-Infektion in Verbindung gebracht werden.
HEV ist ein nicht umhülltes Virus. Das Virengenom besteht aus drei diskontinuierlichen, sich teilweise überlappenden offenen Leserahmen (ORFs), wobei ORF1 nicht-strukturelle Proteine (pORF1) codiert, ORF2 das vermeintliche 660 Aminosäuren (aa) lange Capsidprotein (pORF2) codiert und ORF3 ein kleines Protein (pORF3) mit unbekannter Funktion codiert. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von ORF2 und pORF2 sind in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Genome von verschiedenen HEV-Stämmen aus Nordamerika und Asien wurden in voller Län ge sequenziert. Nucleotidsequenz-Alignments bzw. -Ausrichtungen und phylogenetische Analysen basierend auf den vollständigen Sequenzen deuten auf die Gegenwart von drei unterschiedlichen Genotypen, die durch Burma-, Mexiko- und US-Stämme repräsentiert werden. Mehr Genotypen oder Unterstämme werden mithilfe von Teilsequenzvergleichen gezählt.
Rekombinante Proteine, die die Sequenz der Aminosäuren 112 bis 660 oder Aminosäuren 225 bis 660 von pORF2 überspannten, induzierten protektive oder schützende Immunantworten bei nicht-menschlichen Primaten (Purdy et al., 1993; Tsarev et al., 1994, 1997; Yarbough et al., 1997). Kürzlich wurden sechs antigene Domänen mit 26 IgG-antikörperreaktiven Epitopen und 24 IgM-antikörperreaktiven Epitopen innerhalb von pORF2 identifiziert unter Verwendung von drei Sätzen sich überlappender synthetischer 18-mer-, 25-mer- und 30-mer-Peptide (Khudyakov et al., 1999). Antikörper gegen rekombinantes HEV-C2-Protein (Purdy et al., 1992), das am Carboxylende zwei Drittel des HEV-Burma-pORFs enthält, neutralisierte HEV-Burma-, Mexiko- und Pakistan-Stämme in einem in-vitro-Neutralisierungsassay in effizienter Weise (Meng et al., 1998).
Die antigenen Eigenschaften von HEV wurden jedoch nicht gründlich untersucht, obwohl verschiedene antigene Bereiche innerhalb von pORF1, pORF2 und pORF3 gefunden wurden. Insbesondere wurden keine HEV neutralisierenden Polypeptide gefunden.
Virale neutralisierende antigene Epitope haben die einzigartige funktionelle Eigenschaft, einen Verlust der Virusinfektiosität zu verursachen, wenn ein Antikörper, der gegen das Epitop hervorgerufen wurde, an ein Virusteilchen bindet. Die Identifizierung eines solchen Epitops auf der Oberfläche eines Virions ist wichtig für Studien zum Mechanismus der Neutralisierung, als Grundlage zum Verständnis der molekularen Basis der Serotypisierung und als Ausgangspunkt zur Entwicklung von Spaltvakzinen.
Es wurde berichtet, dass kurze synthetische Peptide neutralisierende Antikörper gegen Hepatitis-A-Virus (Emini et al., 1985), Hepatitis-B-Virus (Neurath et al., 1986) und Hepatitis-C-Virus (Shimizu et al., 1996) hervorrufen. Kurze synthetische Peptide bilden jedoch nur lineare Epitope, die eine geringe intrinsische Im munogenizität haben aufgrund ihrer Unfähigkeit, T-Zellantworten hervorzurufen. Wenn sie in einer Art und Weise verabreicht werden, die die Bereitstellung von Hilfe durch T-Zellen fördert, können sie ziemlich starke Antikörperantworten hervorrufen. Antikörper, die auf diese Art und Weise gezüchtet wurden, binden jedoch gewöhnlich an native Antigene mit einer solch geringen Affinität, dass sie keine biologische Aktivität aufweisen, während sie mit dem Immunogen und dem ungefalteten Protein voller Länge gut reagieren. Mit wenigen bemerkenswerten Ausnahmen hat sich somit die Verwendung eines synthetischen Peptids, um eine neutralisierende Antikörperantwort gegen ein Virus hervorzurufen, als große Enttäuschung erwiesen (Yewdell & Bennink, 1997).
Die Entwicklung eines inaktivierten oder lebenden abgeschwächten HEV-Impfstoffs wurde durch den Mangel eines effizienten Zellkultursystems beeinträchtigt, das die HEV-Replikation und Vermehrung unterstützen kann. Die Identifizierung der neutralisierenden antigenen Epitope ist dringend notwendig, um eine sichere und effektive Spaltvakzine zur Kontrolle der HEV-Infektion zu entwickeln.
Es besteht daher eine lang dauernde und dringende Notwendigkeit, neutralisierende immunogene HEV-Polypeptide zu finden, die in einem klinischen Einsatz als HEV-Impfstoff verwendet werden können und dadurch gegen eine HEV-Infektion schützen. Außerdem besteht ein Bedarf für neutralisierende immunogene HEV-Polypeptide sowohl in klinischer als auch Laborumgebung, um die HEV-Infektion zu untersuchen und zu untersuchen, wie sie den Wirt befällt. Darüber hinaus wäre ein Polypeptid, das das neutralisierende Epitop von HEV nachbildet, nützlich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Immunogene HEV-Polypeptide und Methoden zu ihrer Verwendung werden bereitgestellt. Das Polypeptid ist ein isoliertes, rekombinantes oder synthetisches Polypeptid, das mindestens 50 Aminosäurereste zwischen den Aminosäureresten 452 bis 617 am C-Ende des HEV-pORF2-Proteins enthält, einschließlich mindestens eines neutralisierenden Epitops. Am meisten bevorzugt schließt ein Polypeptid die Aminosäurereste 452 bis 617 am C-Ende des HEV-pORF2-Proteins ein.
Jedes Polypeptid ist allein oder in Kombination mit anderen hier beschriebenen Polypeptiden nützlich als Reagenz, um die Pathogenese von HEV zu untersuchen. Insbesondere kann das Reagenz verwendet werden, um die Arten von Immunantworten zu identifizieren, die einen Schutz gegen die HEV-Infektion beitragen oder das Fortschreiten der Krankheit verringern. Die Polypeptide sind außerdem nützlich als Reagenzien, um die Wirkstoffwirksamkeit in klinischen Versuchen oder Behandlungsplänen bei Patienten, die sich einer HEV-Therapie unterziehen, zu überwachen. Die Polypeptide sind auch nützlich, um neutralisierende antigene Epitope von HEV zu modellieren.
Ein oder mehrere der Polypeptide sind auch nützlich als Impfstoffzusammensetzung, wenn sie mit einem pharmazeutischen Träger kombiniert werden, zur Prophylaxe, Behandlung oder Verhütung einer HEV-Infektion. Die Impfstoffzusammensetzung wird einem Individuum vor dem Kontakt mit HEV verabreicht, um eine HEV-Infektion zu minimieren oder zu verhindern und wird verabreicht, nachdem ein Patient infiziert wurde, um den Schweregrad der Infektion zu vermindern und das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen.
Antikörper für oder gegen neutralisierende Polypeptide werden bereitgestellt. Neutralisierende Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper, werden auch bereitgestellt.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein immunogenes Polypeptid bereitzustellen, das mit Antikörpern, T-Helferlymphozyten, oder cytotoxischen T-Lymphozyten von HEV-positiven Patienten reagiert.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, neutralisierende antigene Epitope von HEV bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand, neutralisierende Antikörper bereitzustellen und insbesondere monoklonale Antikörper, gegen HEV.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff zur Verhütung oder Behandlung einer HEV-Infektion bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen HEV-Impfstoff bereitzustellen, der einen Schutz gegen eine große Vielzahl von HEV-Stämmen und Varianten beiträgt.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen sicheren HEV-Impfstoff bereitzustellen, der nicht in einen pathogenen Zustand zurückkehren kann.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Forschungstool oder Reagenz zur Untersuchung der Pathogenese von HEV bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Forschungstool oder Reagenz bereitzustellen, um die Wirkstoffwirksamkeit bei klinischen Versuchen oder Behandlungsplänen zu überwachen.
Weitere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der Erfindung und ihre bevorzugten Ausführungsformen ergeben sich aus der detaillierten Beschreibung, die folgt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Immunogene HEV-Polypeptide und Methoden zu ihrer Verwendung werden bereitgestellt. Das Polypeptid ist ein isoliertes, rekombinantes oder synthetisches Polypeptid, das mindestens 50 Aminosäurereste zwischen den Aminosäureresten 452 und 617 am C-Ende des HEV-pORF2-Proteins enthält, einschließlich mindestens eines neutralisierenden Epitops. Am meisten bevorzugt schließt ein Polypeptid Aminosäurereste 452 bis 617 am C-Endes des HEV-pORF2-Proteins ein.
Jedes Polypeptid ist alleine oder in Kombination mit anderen hier beschriebenen Polypeptiden als Reagenz zur Untersuchung der Pathogenese von HEV nützlich. Insbesondere kann das Reagenz verwendet werden, um die Arten von Immun antworten zu identifizieren, die einen Schutz gegen eine HEV-Infektion beitragen oder das Fortschreiten der Krankheit vermindern. Diese Polypeptide sind auch nützlich als Reagenzien zur Überwachung der Wirkstoffwirksamkeit in klinischen Versuchen oder Behandlungsplänen bei Patienten, die sich einer HEV-Therapie unterziehen. Die Polypeptide sind auch nützlich, um neutralisierende antigene Epitope von HEV zu modellieren.
Ein oder mehrere der Polypeptide sind auch nützlich als Impfstoffzusammensetzung, wenn sie mit einem pharmazeutischen Träger kombiniert werden zur Prophylaxe, Behandlung oder Verhütung einer HEV-Infektion. Die Impfstoffzusammensetzung wird an ein Individuum verabreicht vor dem Kontakt mit HEV, um eine HEV-Infektion zu minimieren oder zu verhüten oder wird verabreicht, nachdem ein Patient sich infiziert hat, um den Schweregrad der Infektion zu verringern und ein Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen.
Antikörper für die neutralisierenden Polypeptide werden auch bereitgestellt. Neutralisierende Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper, werden auch bereitgestellt.
Definitionen
Die Ausdrücke "ein", "eine" und "einer", wie sie hier verwendet werden, sind so definiert, dass sie "ein oder mehrere" bedeuten sollen und schließen den Plural ein, wenn der Zusammenhang nicht dagegen spricht.
Unter "isoliert" wird ein Peptid verstanden, das frei ist von mindestens einigen der Komponenten, mit denen es natürlicherweise auftritt.
"Peptide", "Polypeptide" und "Oligopeptide" werden austauschbar verwendet und sind hier definiert als Ketten von Aminosäuren (typischerweise L-Aminosäuren), bei denen die Kohlenstoffatome über Peptidbindungen verbunden sind, die durch eine Kondensationsreaktion zwischen der Carboxylgruppe des Kohlenstoffatoms einer Aminosäure und der Aminogruppe des Kohlenstoffs einer anderen Aminosäure gebildet werden. Die endständige Aminosäure an einem Ende der Kette (d.h. Aminoende) hat eine freie Aminogruppe, während die endständige Amino säure am anderen Ende der Kette (d.h. Carboxyende) eine freie Carboxylgruppe aufweist.
Typischerweise werden die Aminosäuren, die ein Peptid bilden, der Reihenfolge nach nummeriert ausgehend vom Aminoende und ansteigend in Richtung auf das Carboxyende des Peptids. Wenn somit angegeben ist, dass eine Aminosäure einer anderen "folgt", ist diese Aminosäure näher am Carboxyende des Peptids als die "vorhergehende" Aminosäure.
Der Ausdruck "Rest" wird hier verwendet, um eine Aminosäure (D oder L) oder ein Aminosäuremimeticum zu bezeichnen, der in ein Oligopeptid durch eine Amidbindung oder eine mimetische Amidbindung eingebaut wird. Die Aminosäure kann als solche eine natürlich vorkommende Aminosäure sein oder kann, wenn dies nicht in anderer Weise beschränkt ist, bekannte Analoga natürlicher Aminosäuren umfassen, die auf gleiche Art und Weise wie natürlich vorkommende Aminosäuren wirken (d.h. Aminosäuremimetika). Außerdem schließt ein Amidbindungsmimetikum Peptidgerüstmodifikationen ein, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind.
"Antigen" bezieht sich auf eine Einheit oder ein Fragment davon, die/das eine Immunantwort in einem Säugetier induzieren kann. Der Ausdruck schließt Immunogene und Bereiche, die für die Antigenizität verantwortlich sind, oder antigene Determinanten ein.
"Neutralisierender Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der die Bindung von HEV an eine Zelle blockiert.
"Neutralisierendes antigenes Epitop" oder "neutralisierendes Epitop" bezieht sich auf ein Epitop, das einen neutralisierenden Antikörper hervorruft.
"Antigene Determinante" bezieht sich auf einen Bereich eines Proteins, der von einem Antikörper oder einem T-Zellrezeptor erkannt wird, z.B. in Serum, das gegen Wildtypprotein gezüchtet wurde.
Die Ausdrücke "bindet spezifisch an ein Peptid" oder "spezifisch immunoreaktiv mit" beziehen sich, wenn sie sich auf einen Antikörper oder T-Zellrezeptor beziehen, auf eine Bindungsreaktion, die für die Gegenwart des Peptids, oder eines Antikörpers oder eines T-Zellrezeptors des Peptids bestimmend ist, in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Mitteln. Unter bestimmten Immunoassaybedingungen binden spezifische Antikörper oder T-Zellrezeptoren daher bevorzugt ein spezielles Peptid und binden andere Proteine, die in der Probe vorhanden sind, nicht in bemerkenswerter Menge. Eine spezifische Bindung an ein Peptid unter solchen Bedingungen erfordert einen Antikörper oder eine T-Zelle, die ausgewählt wurden bezüglich ihrer Spezifität für ein spezielles Protein. Eine Mehrzahl von Immunoassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die mit einem speziellen Protein spezifisch immunoreaktiv sind. Z.B. werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig verwendet, um monoklonale Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit einem Protein immunoreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, bezüglich einer Beschreibung von Immunoassayformaten und Bedingungen, die verwendet werden können, um spezifische Immunoreaktivität zu bestimmen.
"Konservative Variationen" oder "konservativ modifizierte Variationen" einer spezifischen Sequenz bezieht sich auf Aminosäuren, die von Nucleinsäuren codiert werden, die identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen codieren, oder, wenn die Nucleinsäure keine Aminosäuresequenz codiert, auch im Wesentlichen identische Sequenzen. Wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes codiert eine große Anzahl funktionell identischer Nucleinsäuren ein gegebenes Peptid. Solche Nucleinsäurevariationen sind stille Variationen, die eine Art konservativ modifizierter Variationen sind. Der Fachmann erkennt, dass jedes Codon in einer Nucleinsäure (außer AUG, das gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist) mit Standardtechniken modifiziert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu liefern. Jede stille Variation einer Nucleinsäure, die ein Peptid codiert, ist somit in jeder beschriebenen Aminosäuresequenz implizit enthalten. Weiterhin erkennt der Fachmann auf diesem Gebiet, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure verändern, zufügen oder entfernen, oder einen geringen Prozentsatz an Aminosäuren (typischerweise weniger als 5%, noch typischer weniger als 1%) in einer codierten Sequenz konservativ modifizierte Variationen sind, wobei die Veränderungen zu einer Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch gleiche Aminosäure führen. Konservative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche Aminosäuren liefern, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V) und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

Zwei Polypeptide werden als "identisch" bezeichnet, wenn die Sequenz der Aminosäurereste in den zwei Sequenzen die gleiche ist, wenn sie auf maximale Übereinstimmung ausgerichtet werden. Eine optimale Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich kann durchgeführt werden durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Adv. App. Math. 2: 482 (1981), durch den homologen Ausrichtungsalgorithmus von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch die Methode von Pearson und Lipman zur Suche nach Ähnlichkeit, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988), durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Untersuchung.
Der Ausdruck "im Wesentlichen Identität" bedeutet, dass ein Polypeptid eine Sequenz aufweist, die mindestens 85% Sequenzidentität oder Homologie, bevorzugt 90%, bevorzugter 95% oder mehr im Vergleich zu einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von etwa 10 bis etwa 20 Aminosäuren hat. Ein weiterer Hinweis, dass Polypeptidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, besteht dann, wenn ein Peptid immunologisch reaktiv ist mit Antikörpern, die gegen das offenbarte Peptid gezüchtet wurden. Somit schließen die Peptide zur Verwendung für die vorliegende Erfindung Peptide ein, die immunologisch reaktiv mit Antikörpern sind, die gegen offenbarte immunogene Peptide gezüchtet wurden.
Synthetische Polypeptide
Die hier beschriebenen Polypeptide enthalten allgemein 50 bis etwa 166 Aminosäurereste, bevorzugter etwa 100 bis etwa 166 Aminosäurereste und noch bevorzugter etwa 166 Aminosäurereste. Die Polypeptide können hergestellt werden unter Verwendung einer Anzahl von Techniken zur chemischen Peptidsynthese, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind, einschließlich Lösungsmethoden und Festphasenmethoden, wobei die Festphasensynthese derzeit bevorzugt ist.
Insbesondere ist die Festphasensynthese, bei der die C-terminale Aminosäure der Polypeptidsequenz an einen unlöslichen Träger gebunden wird und anschließend aufeinander folgend die verbleibenden Aminosäuren in der Sequenz zugefügt werden, eine bevorzugte synthetische Methode zur Herstellung von Polypeptiden. Techniken zur Festphasensynthese werden von Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156 (1963) beschrieben. Viele automatisierte Systeme zur Durchführung von Festphasenpeptidsynthesen sind im Handel erhältlich.
Eine Festphasensynthese wird gestartet ausgehend vom Carboxy-terminalen Ende (d.h. C-Ende) des Polypeptids, indem eine geschützte Aminosäure über die Carboxylgruppe an einen geeigneten festen Träger gekuppelt wird. Der feste Träger, der verwendet wird, ist kein kritisches Merkmal, vorausgesetzt, dass er die Carboxylgruppe binden kann, während er gegenüber den in dem Peptidsyntheseverfahren verwendeten Reagenzien im Wesentlichen inert bleibt. Z.B. kann ein Ausgangsmaterial hergestellt werden, indem eine aminogeschützte Aminosäure über eine Benzylesterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz oder über eine Amidbindung an ein Benzhydrylamin-(BHA)-Harz oder p-Methylbenzhydrylamin-(MBHA)-Harz gebunden wird. Materialien, die zur Verwendung als feste Träger geeignet sind, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt und schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden ein: Halogenmethylharze, wie Chlormethylharz oder Brommethylharz, Hydroxymethylharze; Phenolharze, wie 4-(a-[2,4-Dimethoxyphenyl]-Fmoc-aminomethyl)phenoxyharz; tert.-alkylcarbonylhydrazidierte Harze und dgl. Solche Harze sind im Handel erhältlich und Methoden zu ihrer Herstellung sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Die Säureform der Peptide kann hergestellt werden durch Festphasenpeptidsyntheseverfahren unter Verwendung eines Benzylesterharzes als festem Träger. Die entsprechenden Amide können hergestellt werden unter Verwendung eines Benzhydrylamin- oder Methylbenzhydrylaminharzes als festem Träger. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass dann, wenn ein BHA- oder MBHA-Harz verwendet wird, die Behandlung mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure, um das Peptid vom festen Träger abzuspalten, ein Peptid mit einer terminalen Amidgruppe erzeugt.
Die α-Aminogruppe jeder Aminosäure, die für die Festphasensynthese verwendet wird, sollte während der Kupplungsreaktion geschützt werden, um Nebenreaktionen unter Beteiligung der reaktiven α-Aminofunktion zu verhüten. Bestimmte Aminosäuren enthalten auch reaktive funktionelle Gruppen in der Seitenkette (z.B. Sulfhydryl, Amino, Carboxyl, Hydroxyl etc.), die auch mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden müssen, um zu verhindern, dass chemische Reaktionen an diesen Stellen während der Peptidsynthese auftreten. Schutzgruppen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt, siehe z.B. The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Gross und Meienhofer (Herausgeber), Academic Press, N.Y. (1981)).
Eine in geeigneter Weise ausgewählte α-Aminoschutzgruppe macht die α-Aminofunktion während der Kupplungsreaktion inert, ist leicht entfernbar nach dem Kuppeln unter Bedingungen, die die Seitenkettenschutzgruppen nicht entfernen, ändert nicht die Struktur des Peptidfragments und die verhindert die Racemisierung bei Aktivierung direkt vor der Kupplung. In gleicher Weise müssen Seitengruppenschutzgruppen so ausgewählt werden, dass die funktionelle Gruppe in der Seitenkette während der Synthese inert bleibt, stabil bleibt unter den Bedingungen, die verwendet werden, um die α-Aminoschutzgruppe zu entfernen und muss nach Abschluss der Peptidsynthese unter solchen Bedingungen entfernbar sein, die die Struktur des Peptids nicht verändern.
Die Kupplung der Aminosäuren kann mit einer Vielzahl von Techniken erreicht werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Typische Ansätze beinhalten entweder die Umwandlung der Aminosäure in ein Derivat, das die Carboxylgruppe empfänglicher macht für die Reaktion mit der freien N-terminalen Aminogruppe des Peptidfragments oder die Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels, wie z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI). Häufig wird Hydroxybenzotriazol (HOBt) als Katalysator bei diesen Kupplungsreaktionen angewendet.
Allgemein wird die Synthese des Peptids gestartet, indem zuerst die C-terminale Aminosäure, die an der N-Aminoposition durch eine Schutzgruppe, wie Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützt ist, an einen festen Träger gekuppelt wird. Vor der Kupplung von Fmoc-Asn muss der Fmoc-Rest von dem Polymer entfernt werden. Fmoc-Asn kann z.B. an das 4-(α-[2,4-Dimethoxyphenyl]-Fmoc-aminomethyl)phenoxyharz gekuppelt werden unter Verwendung von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Hydroxybenzotriazol (HOBt) bei etwa 25°C mit etwa 2-stündigem Rühren. Nach dem Kuppeln der Fmoc-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die α-Aminoschutzgruppe entfernt unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF bei Raumtemperatur.
Nach Entfernung der α-Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden Fmoc-geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekuppelt. In geeigneter Weise geschützte Aminosäuren sind im Handel erhältlich von einer Anzahl von Zulieferern (z.B. Novartis (Schweiz) oder Bachem (Kalifornien)). Als Alternative zu der schrittweisen Zufügung einzelner Aminosäuren können auch in geeigneter Weise geschützte Peptidfragmente, die aus mehr als einer Aminosäure bestehen, an das "wachsende" Peptid gekuppelt werden. Die Auswahl eines geeigneten Kupplungsreagenzes, wie oben erläutert, ist dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor im Überschuss eingeführt und die Kupplung wird in einem Medium von Dimethylformamid (DMF), Methylenchlorid (CH₂Cl₂) oder Mischungen davon durchgeführt.
Wenn die Kupplung unvollständig ist, kann die Kupplungsreaktion vor Abspaltung der N-Aminogruppe und vor der Zuführung der nächsten Aminosäure wiederholt werden. Die Kupplungseffizienz kann durch eine Anzahl von dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannten Mitteln überwacht werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Überwachung der Kupplungseffizienz ist die Ninhydrinreaktion. Peptidsynthesereaktionen können automatisch durchgeführt werden unter Verwendung einer Anzahl von im Handel erhältlichen Peptidsyntheseautomaten, wie dem Biosearch 9500^TM Syntheseautomaten (Biosearch, San Rephael, CA).
Das Peptid kann abgespalten werden und die Schutzgruppen können entfernt werden, indem der unlösliche Träger oder feste Träger in wasserfreiem flüssigen Fluorwasserstoff (HF) in Gegenwart von Anisol und Dimethylsulfid bei etwa 0°C etwa 20 bis 90 Minuten lang gerührt wird, bevorzugt 60 Minuten lang; indem Bromwasserstoff (HBr) kontinuierlich durch eine Suspension mit einem 1 mg/10 ml des Harzes in Trifluoressigsäure (TFA) 60 bis 360 Minuten lang etwa bei Raumtemperatur durchgeblasen wird, abhängig von den ausgewählten Schutzgruppen; oder indem der feste Träger innerhalb der Reaktionssäule, die für die Festphasensynthese verwendet wurde, mit 90% Trifluoressigsäure, 5% Wasser und 5% Triethylsilan etwa 30 bis 60 Minuten lang inkubiert wird. Andere Methoden zur Abspaltung der Schutzgruppen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind, können auch verwendet werden.
Die Peptide können aus der Reaktionsmischung mithilfe einer dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannten Peptidreinigung isoliert und gereinigt werden. Z.B. können die Peptide gereinigt werden unter Verwendung von chromatographischen Verfahren, wie Reverse-Phase-HPLC, Gelpermeation, Ionenaustausch, Größenausschluss, Affinität, Auftrennung oder Gegenstromverteilung.
Rekombinante Polypeptide
Es versteht sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass Polypeptide auch mit anderen Mitteln hergestellt werden können, einschließlich z.B. rekombinanten Techniken. Beispiele für geeignete Klonierungs- und Sequenzierungstechniken und Anleitungen, die ausreichen, um Personen mit Fachwissen durch viele Klonierungsversuche zu führen, finden sich in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2. Aufl.), Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY (Sambrook). Produktinformationen von Herstellern biologischer Reagenzien und Versuchsanlagen, wie SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO) liefern auch Informationen, die nützlich sind für bekannte biologische Methoden.
Die hier beschriebenen Polypeptide sind von pORF2-Protein abgeleitet. Die Nucleotidsequenz der Nucleinsäure, die pORF2 codiert, ist bekannt. Somit kann die bekannte Nucleinsäuresequenz verwendet werden, um Polypeptide rekombinant herzustellen oder eine Nucleinsäure, die das gewünschte Polypeptid codiert, kann aus der Aminosäuresequenz abgeleitet werden.
Allgemein beinhaltet dies, dass eine Nucleinsäuresequenz erzeugt wird, die das Polypeptid codiert, die Nucleinsäure in eine Expressionskassette gebracht wird unter der Kontrolle eines speziellen Promotors, das Polypeptid in einem Wirt exprimiert wird, das exprimierte Polypeptid isoliert wird und, falls erforderlich, das Polypeptid renaturiert wird. Techniken, die ausreichen, um einen Fachmann durch solche Verfahren zu leiten, finden sich in Sambrook, siehe oben.
Versehen mit den hier beschriebenen Polypeptidsequenzen wird der Fachmann auf diesem Gebiet eine Vielzahl äquivalenter Nucleinsäuren erkennen, die das Polypeptid codieren. Dies beruht darauf, dass der genetische Code erfordert, dass jeder Aminosäurerest in einem Peptid durch mindestens ein Triplett von Nucleotiden in einer Nucleinsäure, die das Peptid codiert, spezifiziert ist. Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes werden viele Aminosäuren in äquivalenter Weise von mehr als einem Triplett von Nucleotiden codiert. Z.B. codieren die Tripletts CGU, CGC, CGA, CGG, AGA und AGG alle die Aminosäure Arginin. So weist an jeder Position, an der ein Arginin durch ein Nucleinsäuretriplett codiert werden soll, die Nucleinsäure eines der Tripletts, die Arginin codieren, auf. Ein Fachmann ist mit dem genetischen Code und seiner Verwendung gründlich vertraut. Eine Einführung zu diesem Gegenstand findet sich z.B. in Kapitel 15 von Watson et al., Molecular Biology of the Gene (Vierte Auflage, The Benjamin/Cummings Company Inc., Menlo Park, Kalifornien (1987)) und den darin zitierten Literaturstellen.
Obwohl jedes Nucleinsäuretriplett oder Codon, das eine Aminosäure codiert, verwendet werden kann, um die Position der Aminosäure in einem Peptid spezifisch anzugeben, sind bestimmte Codons bevorzugt. Es ist wünschenswert, Codons für eine erhöhte Expression eines codierten Peptids auszuwählen, z.B. wenn das Peptid zur Verwendung als immunogenes Reagenz gereinigt wird. Die Codons werden ausgewählt unter Hinzuziehung von spezifischen Codonauswahltabellen, die Codons zeigen, die typischerweise von dem Organismus, in dem das Peptid exprimiert werden soll, verwendet werden. Die von einem Organismus häufig verwendeten Codons werden in den Zellen des Organismus durch die noch häufiger vorkommenden t-RNA's übersetzt. Weil die t-RNA's weitverbreitet sind, wird die Übersetzung der Nucleinsäure in ein Peptid durch die zelluläre Übersetzungsmaschinerie erleichtert. Codonauswahltabellen sind für die meisten Organismen verfügbar. Bezüglich einer Einführung zu Codonauswahltabellen siehe Watson et al. oben.
Konservative Substitutionen
Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist außerdem leicht erkennbar, dass die hier beschriebenen Polypeptide und die Nucleinsäuremoleküle, die solche immunogenen Polypeptide codieren, verschiedenen konservativen Veränderungen unterzogen werden können, wie Insertionen, Deletionen und Substitutionen, wobei solche Veränderungen bestimmte Vorteile bei ihrer Verwendung bringen können, z.B. die biologische Aktivität erhöhen.
Der Fachmann erkennt, dass viele konservative Veränderungen von Nucleinsäurekonstrukten ein funktionell identisches Konstrukt liefern. Z.B. sind aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes stille Substitutionen (d.h. Substitutionen einer Nucleinsäuresequenz, die nicht zu einer Veränderung des codierten Peptids führen) ein implizites Merkmal jeder Nucleinsäuresequenz, die eine Aminosäure codiert. Der Fachmann erkennt auch viele Wege, um Veränderungen in einem gegebenen Nucleinsäurekonstrukt zu erzeugen. Solche wohl bekannten Methoden schließen gerichtete Mutagenese, PCR-Amplifikation unter Verwendung degenerierter Oligonucleotide, dass Zellen, die die Nucleinsäure enthalten, mutagenen Mitteln oder Strahlung ausgesetzt werden, chemische Synthese eines gewünschten Oligonucleotids (z.B. zusammen mit der Ligierung und/oder Klonierung, um große Nucleinsäuren zu erzeugen) und andere wohl bekannte Techniken ein. Siehe Giliman und Smith (1979), Gene 8: 81–97, Roberts et al. (1987), Nature 328: 731–734 und Sambrook oben.
Modifikationen von Nucleinsäuren werden mit Routinescreeningtechniken in geeigneten Tests für die gewünschte Eigenschaft ausgewertet. Veränderungen des immunologischen Charakters der codierten Peptide können z.B. mit einem geeigneten immunologischen Assay bzw. Test nachgewiesen werden. Modifikationen anderer Eigenschaften, wie Nucleinsäurehybridisierung mit einer komplementären Nucleinsäure, Redox- oder Wärmestabilität codierter Proteine, Hydrophobizität, Empfindlichkeit gegenüber Proteolyse oder die Tendenz zu aggregieren, werden alle mit Standardtechniken untersucht.
In gleicher Weise können auch konservative Aminosäuresubstitutionen, wobei eine oder wenige Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz eines Proteins durch andere Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften ersetzt werden, (siehe den Abschnitt über Definitionen oben) leicht als einem offenbarten Konstrukt ähnlich nachgewiesen werden.
Immunogene Konjugate
Immunogene Konjugate, die ein oder mehrere der oben beschriebenen synthetischen oder rekombinanten Polypeptide enthalten, kovalent gebunden an ein Trägerprotein, werden auch bereitgestellt. Geeignete Trägerproteine schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden ein: Thyroglobulin, Albumine, wie Humanserumalbumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren, wie Poly(D-lysin:D-Glutaminsäure), Influenza, Hepatitis-B-Virus-Kernprotein bzw. -Core-Protein, rekombinanter Hepatitis-B-Impfstoff und dgl.
Wenn Polypeptid und Trägerprotein relativ kurz sind, können sie unter Verwendung von chemischen Standardpeptidsynthesetechniken synthetisiert werden. Wenn beide Moleküle relativ kurz sind, wird ein chimäres Molekül gegebenenfalls als einzelnes durchgehendes Polypeptid synthetisiert. Alternativ können Peptid und Trägermolekül getrennt synthetisiert werden und dann chemisch fusioniert werden. Alternativ können Polypeptid und Träger einzeln rekombinant erzeugt werden und dann chemisch fusioniert werden. Am meisten bevorzugt werden Polypeptid und Träger rekombinant als einzelnes Polypeptid erzeugt.
Im Allgemeinen beinhaltet dies, dass eine Nucleinsäuresequenz erzeugt wird, die das Polypeptid-Trägerprotein-Immunogenkonjugat codiert, die Nucleinsäure in eine Expressionskassette gebracht wird unter der Kontrolle eines speziellen Promotors; das Protein in einem Wirt exprimiert wird, das exprimierte Protein isoliert wird, und, falls erwünscht, das Protein renaturiert wird. Techniken, die ausreichen, um einen Fachmann durch solche Verfahren zu leiten, finden sich in Sambrook, oben.
Obwohl Polypeptid und Trägermolekül oft direkt miteinander verbunden sind, erkennt der Fachmann, dass die Moleküle über ein Spacermolekül getrennt sein können (z.B. ein Peptid), das aus einer oder mehreren Aminosäuren besteht. Allgemein hat der Spacer keine andere spezifische biologische Aktivität als ein immunogenes Peptid an das Trägerprotein zu binden oder einen gewissen minimalen Abstand oder eine andere räumliche Beziehung zwischen ihnen herzustellen bzw. für sie zu sorgen. Die den Spacer bildenden Aminosäuren können jedoch so ausgewählt werden, dass sie gewisse Eigenschaften des Moleküls beeinflussen, wie Faltung, Nettoladung oder Hydrophobizität.
Sobald die rekombinanten immunogenen Konjugate exprimiert sind, können sie mit Standardverfahren gereinigt werden, einschließlich einer Ammoniumsulfatausfällung, mit Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dgl. Im Wesentlichen reine Zusammensetzungen mit etwa 50 bis 95% Homogenität sind bevorzugt und 80 bis 95% oder mehr Homogenität ist am meisten bevorzugt zur Verwendung für therapeutische Mittel.
Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass nach einer chemischen Synthese oder rekombinanten Expression die immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung eine Konformation besitzen können, die wesentlich verschieden ist von den nativen Konformationen der sie bildenden Polypeptide. In diesem Fall ist es oft notwendig, das Polypeptid zu denaturieren und zu reduzieren und dann das Polypeptid zur erneuten Faltung in die bevorzugte Konformation zu bringen.
Methoden, um Proteine zu reduzieren und zu denaturieren und eine erneute Faltung zu induzieren, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt.
Multiepitoppolypeptide
In einer alternativen Ausführungsform werden die hier beschriebenen immunogenen Polypeptide zu Multiepitop- oder Polyepitop-Polypeptiden oder -Proteinen kombiniert. Typischerweise werden 2 bis 12 immunogene Polypeptide zu einem einzelnen Polypeptid mit rekombinanter oder synthetischer Technik fusioniert.
Bei rekombinanten Verfahren werden Multiepitopproteine hergestellt, indem synthetische oder rekombinante Nucleinsäuren, die immunogene Peptide codieren, ligiert werden. Diese Nucleinsäuren werden enzymatisch (z.B. unter Verwendung eines DNA-Ligaseenzyms) oder synthetisch ligiert. Alternativ wird ein einzelnes Nucleinsäuremolekül synthetisiert, das mehrere immunogene Peptide codiert. In jedem Fall codiert die entstehende Nucleinsäure mehrere immunogene Peptide, alle im gleichen Leserahmen. Somit enthält das translatierte Polypeptid zwei oder mehr immunogene Peptiddomänen.
Wenn die Multiepitoppolypeptide mit automatischen Verfahren zur chemischen Synthese erzeugt werden, werden Konkatemere von Peptiden direkt gekuppelt. Dies wird chemisch durchgeführt, indem Peptide unter Verwendung von chemischen Standardmethoden verbunden werden. Alternativ wird ein Polypeptid das mehrere immunogene Peptide codiert, synthetisch hergestellt.
Gegebenenfalls werden chemische oder rekombinante Linkerregionen zwischen immunogene Polypeptiddomänen eingefügt, um die Präsentation für Antikörper, die an die Domänen binden, zu erleichtern. In bevorzugten Ausführungsformen werden 10 bis 50 Aminosäuren zwischen immunogene Domänen eingesetzt. Im Wesentlichen jede Aminosäure oder chemische Einheit, die Amid- oder Carboxylverbindungen bildet, kann als Linker verwendet werden.
Antikörperproduktion
Antikörper, die mit Spezifität an die oben beschriebenen Polypeptide binden, werden auch bereitgestellt. Die Antikörper schließen einzelne, allelische, Stamm- oder Artvarianten und Fragmente davon ein, sowohl in ihrer natürlich vorkommenden (volle Länge) Form als auch in rekombinanten Formen. Außerdem werden Antikörper gegen diese Polypeptide entweder in ihren nativen Konfigurationen oder in nicht nativen Konfigurationen erzeugt. Anti-Idiotyp-Antikörper können auch erzeugt werden. Viele Methoden zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Die Antikörper sind nützlich als Untersuchungswerkzeuge zur Isolierung zusätzlicher Mengen der antigenen Polypeptide und zur Untersuchung der Pathogenese von HEV im Allgemeinen. Die Antikörper können auch therapeutisch nützlich sein zur passiven Immunisierung von mit HEV infizierten Patienten.
Die Antikörper schließen Neutralisierungsantikörper ein. Methoden zum Screenen von Antikörpern zur Neutralisierung sind bekannt. Ein spezifischer in-vitro-Neutralisierungsassay wird bei Meng et al., 1997; 1998 und unten beschrieben.
Die folgende Diskussion wird vorgestellt als allgemeiner Überblick über die Techniken, die zur Erzeugung von Antikörpern verfügbar sind; der Fachmann wird jedoch erkennen, dass viele Variationen der folgenden Methoden bekannt sind.
Eine Anzahl von Immunogenen werden verwendet, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch mit Polypeptiden reaktiv sind. Rekombinante oder synthetische Polypeptide mit einer Länge von 50 Aminosäuren oder mehr, ausgewählt aus den hier offenbarten Polypeptiden, sind die bevorzugten Polypeptidimmunogene zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern. In einer Klasse von bevorzugten Ausführungsformen ist ein immunogenes Polypeptidkonjugat auch als immunogen eingeschlossen. Die Polypeptide werden entweder rein, teilweise rein oder in unreiner Form verwendet.
Rekombinante Polypeptide werden in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen exprimiert und unter Verwendung von Standardtechniken gereinigt. Das Po lypeptid oder eine synthetische Version davon wird dann einem Tier, das Antikörper erzeugen kann, injiziert. Entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper können für die nachfolgende Verwendung in Immunoassays erzeugt werden, um die Gegenwart und Menge des Polypeptids zu bestimmen.
Methoden zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Kurz gesagt wird ein Immunogen, bevorzugt ein gereinigtes Peptid, ein Peptid, das an einen geeigneten Träger gekuppelt ist (z.B. GST, Keyhole Limpet Hämocyanin etc.) oder ein Peptid, das in einen Immunisierungsvektor eingebaut ist, z.B. einen rekombinanten Vacciniavirus, mit einem Adjuvans gemischt und Tiere werden mit der Mischung immunisiert. Die Immunantwort des Tiers auf das Immunogenpräparat wird überwacht; indem Testblutproben genommen werden und der Reaktivitätstiter des interessierenden Peptids bestimmt wird. Wenn geeignet hohe Titer an Antikörper gegen das Immunogen erhalten worden sind, wird Blut von dem Tier gesammelt und Antiseren werden hergestellt. Eine weitere Fraktionierung der Antiseren zur Anreicherung der Antikörper, die mit dem Peptid reaktiv sind, wird nach Wunsch durchgeführt.
Antikörper, einschließlich bindender Fragmente und rekombinanter Einzelkettenversionen davon, gegen die Polypeptide werden erzeugt durch Immunisierung von Tieren, z.B. unter Verwendung von immunogenen Konjugaten, die ein Polypeptid kovalent gebunden (konjugiert) an ein Trägerprotein enthalten, wie oben beschrieben. Das interessierende Immunogen ist ein Polypeptid mit mindestens 50 Aminosäuren, in einer weiteren Ausführungsform hat das Polypeptid 100 Aminosäuren und in einer weiteren Ausführungsform hat das Fragment eine Länge von etwa 166 Aminosäuren und umfasst die Aminosäurereste 452 und 617 vom C-Ende des HEV-pORF2-Proteins. Die immunogenen Konjugate werden typischerweise hergestellt, indem das Polypeptid an ein Trägerprotein (z.B. als Fusionsprotein) gekuppelt wird oder alternativ rekombinant in einem Immunisierungsvektor exprimiert wird.
Monoklonale Antikörper werden aus Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper ausscheiden. Diese Antikörper werden auf ihre Bindung an normale oder modifizierte Peptide gescreent oder auf agonistische oder antagonistische Aktivität gescreent. Spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper binden ge wöhnlich mit einem K_D von mindestens etwa 0,1 mM, üblicher mindestens etwa 50 mM und am meisten bevorzugt mindestens etwa 1 mM oder besser. Oft binden spezifische monoklonale Antikörper mit einer K_D von 0,1 mM oder mehr.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Säugetienrwirten herzustellen, wie Mäusen, Nagetieren, Primaten, Menschen etc. Die Beschreibung von Techniken zur Herstellung solcher monoklonalen Antikörper findet sich bei Kohler und Milstein (1975), Nature 256: 495–497. Kurz zusammengefasst, verläuft diese Methode, indem einem Tier ein Immunogen injiziert wird, d.h. ein immunogenes Peptid der vorliegenden Erfindung entweder allein oder gegebenenfalls gebunden an ein Trägerprotein. Das Tier wird dann getötet und Zellen aus der Milz entnommen, die mit Myelomazellen fusioniert werden. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle oder ein "Hybridoma", das in vitro reproduzieren kann. Die Population von Hybridomas wird dann gescreent, um einzelne Klone zu isolieren, die jeweils eine einzige Antikörperart für das Immunogen ausscheiden. Auf diese Art und Weise sind einzelne erhaltene Antikörperarten die Produkte immortalisierter und klonierter einzelner B-Zellen aus dem Immuntier, die als Antwort auf eine spezifische Stelle, die an der immunogenen Substanz erkannt wurde, erzeugt wurden.
Alternative Methoden zur Immortalisierung schließen die Transformation mit Epstein-Barr-Virus, Onkogenen oder Retroviren oder andere Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, ein. Kolonien, die aus einzelnen immortalisierten Zellen entstehen, werden auf die Produktion von Antikörpern der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen gescreent und die Ausbeute der monoklonalen Antikörper, die von solchen Zellen erzeugt werden, wird verbessert durch verschiedene Techniken einschließlich Injektion in die Bauchhöhle eines Wirbeltier-(bevorzugt Säugetier)-wirts. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung werden mit oder ohne Modifikation verwendet und schließen chimäre Antikörper, wie humanisierte Mausantikörper ein. Andere geeignete Techniken beinhalten die Selektion von Bibliotheken rekombinanter Antikörper in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al. (1989), Science 246: 1275–1281 und Ward et al. (1989), Nature 341: 544–546.
Häufig wird das Polypeptid oder der Antikörper markiert, indem er entweder kovalent oder nicht kovalent an eine Substanz gebunden wird, die für ein nachweisbares Signal sorgt. Eine große Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken sind bekannt und werden umfangreich in der wissenschaftlichen und Patentliteratur berichtet. Geeignete Markierungen schließen Radionucleotide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Anteile, chemilumineszierende Anteile, Magnetteilchen und dgl. ein. Patente, die die Verwendung solcher Markierungen lehren, schließen die U.S.-Patente Nr. 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 und 4 366 241 ein.
Wie oben erwähnt, können die hier bereitgestellten Antikörper in der Affinitätschromatographie zur Isolierung zusätzlicher Mengen der hier aufgefundenen Polypeptide verwendet werden. Säulen werden z.B. mit den Antikörpern, gebunden an einen festen Träger, z.B. Teilchen, wie Agarose, Sephadex oder dgl., hergestellt, wobei ein Zelllysat durch die Säule geleitet wird, gewaschen wird und mit steigenden Konzentrationen eines milden Denaturierungsmittels behandelt wird, wodurch gereinigte Polypeptide freigesetzt werden. Zusätzlich können Antikörper verwendet werden, um Expressionsbibliotheken zu screenen auf spezielle Expressionsprodukte, z.B. HEV-Proteine. Gewöhnlich werden die Antikörper in einem solchen Verfahren mit einem Anteil markiert, der eine leichte Detektion der Gegenwart des Antigens durch Antikörperbindung zulässt. Darüber hinaus können auch Antikörper, die gegen die hier beschriebenen immunogenen Polypeptide gezüchtet wurden, verwendet werden, um Antiidiotyp-Antikörper zu erzeugen. Solche Antikörper sind nützlich, um verschiedene pathologische oder Resistenzzustände nachzuweisen oder zu diagnostizieren, die mit der Gegenwart der jeweiligen Antigene in Beziehung stehen.
Immunoassays
Sowohl die hier beschriebenen Polypeptide als auch die Antikörper, die mit Spezifität an die Polypeptide binden, sind nützlich als Reagenzien, als Einfangmittel oder Markierungsmittel in Assays, um ein Zielpeptid oder einen Antikörper nachzuweisen. Allgemein kann das Zielmolekül quantitativ mit einer Vielzahl von Immunoassaymethoden bestimmt werden. Außerdem können Immunoassays in irgendeiner der verschiedenen Konfigurationen durchgeführt werden.
Immunoassays verwenden oft ein Markierungsmittel, um spezifisch an einem Bindungskomplex zu binden und den Bindungskomplex zu markieren, der von dem Einfangmittel und dem Analyt gebildet wird. Das Markierungsmittel kann selbst eines der Anteile sein, die den Antikörper/Analytkomplex bilden. Somit kann das Markierungsmittel ein markiertes Peptid oder ein markierter Antipeptid-Antikörper sein. Alternativ kann das Markierungsmittel eine dritte Einheit sein, z.B. ein weiterer Antikörper, der spezifisch an den Antikörper/Peptidkomplex bindet, oder an eine modifizierte Einfanggruppe (z.B. Biotin), die kovalent mit dem Peptid oder Antipeptid-Antikörper verbunden ist.
Alternativ kann das Markierungsmittel ein Streptavidinmolekül sein, das einen fluoreszierenden Farbstoff darauf trägt und an dem die Peptide, die mit MHC-(HLA)-Molekülen komplexiert sind, eingefangen werden. Diese Reagenzien können verwendet werden, um einzelne T-Zellen zu zählen, die spezifisch für die Peptide sind, unter Verwendung allgemein verwendeter Ausstattungen, wie Durchflusszytometer, was somit eine genaue quantitative Auswertung und Phänotypinformation der Immunantwort liefert, wie von J. D. Altman et al. in Science 274 (5284): 94–96 (1996) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Markierungsmittel ein Antikörper, der spezifisch an das Einfangmittel bindet. Solche Mittel sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt und umfassen am typischsten markierte Antikörper, die spezifisch Antikörper der jeweiligen Tierart binden, aus der das Einfangmittel abgeleitet ist, z.B. Antiidiotyp-Antikörper oder Antikörper gegen ein Peptid, wenn das Peptid das Einfangmittel ist. Wenn z.B. das Einfangmittel ein aus der Maus stammender Antipeptid-Antikörper ist, kann das Markierungsmittel ein Ziege-Antimaus-IgG sein, d.h. ein Antikörper, der spezifisch ist für die konstante Region des Mausantikörpers.
Weitere Proteine, die spezifisch konstante Immunglobulinregionen binden können, wie Streptokokkenprotein A oder Protein G werden auch als Markierungsmittel verwendet. Diese Proteine sind normale Bestandteile der Zellwände von Streptokokkenbakterien. Sie zeigen eine starke nicht immunogene Reaktivität mit konstanten Immunglobulinregionen aus einer Vielzahl von Arten.
Bei allen Assays können Inkubations- und/oder Waschstufen nach der Vereinigung der Reagenzien notwendig sein. Inkubationsstufen können variieren von etwa 5 Sekunden bis mehrere Stunden, bevorzugt etwa 5 Minuten bis etwa 24 Stunden. Die Inkubationszeit hängt jedoch von dem Testformat, den Analyten, dem Volumen der Lösung, Konzentrationen und dgl. ab. Gewöhnlich werden die Tests bei Umgebungstemperatur durchgeführt, obwohl sie über einen weiten Temperaturbereich, wie 5°C bis 45°C durchgeführt werden können.
Nicht-kompetitive Testformate
Immunoassays zum Nachweis eines Peptids oder Antikörpers für ein Peptid können entweder-kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. Nicht-kompetitive Immunoassays sind Assays, bei denen die Menge an eingefangenem Analyten (z.B. Antipeptid-Antikörper) direkt gemessen wird. Bei einem bevorzugten "Sandwich"-Assay wird z.B. das Einfangmittel (z.B. immunogene Peptidantikörper) direkt an ein festes Substrat gebunden, wo es immobilisiert wird. Diese immobilisierten Peptide fangen Antikörper, die in einer Testprobe vorhanden sind, z.B. einer biologischen Flüssigkeit, am meisten bevorzugt Blutserum, ein. Der so immobilisierte Antikörper wird dann durch ein Markierungsmittel gebunden, z.B. einen zweiten Antikörper, der eine Markierung trägt. Alternativ kann dem zweiten Antikörper eine Markierung fehlen, aber dieser kann wiederum an einen dritten markierten Antikörper gebunden werden, der spezifisch für Antikörper der Art ist, aus der der zweite Antikörper abgeleitet ist.
Sandwich-Assays für ein Peptid oder einen Antikörper können auch konstruiert werden. Wie oben beschrieben, bindet das immobilisierte Peptid spezifisch an den in der Probe vorhanden Antikörper. Ein markierter Antikörper bindet dann an dem bereits gebundenen Antikörper. Freier markierter Antikörper wird ausgewaschen und der verbleibende gebundene markierte Antikörper nachgewiesen (z.B. unter Verwendung eines Gammadetektors, wenn die Markierung radioaktiv ist).
Kompetitive Testformate
Bei kompetitiven Assays wird die Menge an Analyt (z.B. immunogenes Peptid oder Antikörper für ein immunogenes Peptid), die in der Probe vorhanden ist, indirekt gemessen, indem die Menge an zugegebenem (exogenem) Analyten gemessen wird, die von einem Einfangmittel (z.B. einem Antikörper oder Peptid) durch den in der Probe vorhandenen Analyten verdrängt (oder weggedrängt) wird. In einem kompetitiven Assay bzw. Test wird eine bekannte Menge Analyt der Probe zugegeben und die Probe mit einem Einfangmittel in Kontakt gebracht, z.B. einem Peptid, das spezifisch den Analyten bindet. Die Menge an an das Peptid gebundenem Analyt ist umgekehrt proportional zur Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Einfangmittel an einem festen Substrat immobilisiert. Die Menge an Analyt, die an das Einfangmittel gebunden wird, wird bestimmt, entweder indem die Menge an Antikörper, die in einem Antikörper/Peptidkomplex vorhanden ist, bestimmt wird oder alternativ, indem die Menge an verbleibendem nicht komplexiertem Antikörper bestimmt wird. Die Menge an Peptid in einer zu untersuchenden Probe kann auch nachgewiesen werden, indem ein exogenes markiertes Peptid dem Test zugefügt wird.
Ein Haptenhemmungsassay ist ein weiterer bevorzugter kompetitiver Assay. Bei diesem Assay oder Test wird ein bekannter Analyt, in diesem Fall eines oder mehrere der hier beschriebenen Peptide, an einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge Antipeptid-Antikörper wird zu der Probe zugegeben und die Probe dann mit dem immobilisierten Peptid in Kontakt gebracht. In diesem Fall ist die Menge an Antikörper, die an das immobilisierte Polypeptid gebunden wird; proportional der Menge an Peptid, die in der Probe vorhanden ist. Wiederum wird die Menge an immobilisiertem Antikörper nachgewiesen, indem entweder die immobilisierte Fraktion des Antikörpers oder die Fraktion des Antikörpers, die in Lösung bleibt, quantitativ bestimmt wird. Der Nachweis kann direkt sein, wenn der Antikörper markiert ist, oder indirekt, wenn ein markierter Anteil anschließend zugegeben wird, der spezifisch an den Antikörper bindet, wie oben beschrieben. Der Fachmann erkennt, dass die Rolle von Peptid und Antikörper umgekehrt werden können, um den gleichen Effekt für die quantitative Auswertung des Antikörpers zu erzielen.
Ein oder mehrere der hier beschriebenen Polypeptide oder alternativ ein oder mehrere der Antikörper für die Polypeptide werden bevorzugt quantitativ in einer biologischen Probe, z.B. einer biologischen Flüssigkeit oder einer Gewebeprobe, die von einem Patienten stammt, ausgewertet. Der Nachweis der Peptide oder Antikörper deutet darauf hin, dass das Individuum, aus dem die biologische Probe entnommen wurde, eine Immunantwort auf den Virus hervorbringt. Eine Bestimmung der Menge an Antikörper oder an Protein, die in der biologischen Probe vorhanden ist, liefert einen Hinweis auf den Immunitätsgrad oder das Ausmaß der Reaktion auf die Behandlung und kann daher zur Prognose verwendet werden.
Die zu testende oder zu analysierende Probe kann aus jeder biologischen Quelle erhalten werden und wird bevorzugt einem Menschen oder Tier entnommen, das mit dem Hepatitis-A-Virus infiziert sein kann oder dieses beherbergen kann. Die Probe kann z.B. eine Zellprobe, eine Gewebeprobe oder biologische Flüssigkeit sein, z.B. Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Samen, Speichel, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Fermentationsflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Gewebekulturflüssigkeit, Ascitesflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit und dgl. Die bevorzugte biologische Probe ist eine biologische Flüssigkeit, aus der Zellen entfernt werden können. Die am meisten bevorzugten Proben sind Blutplasma oder Serum. Die biologische Probe kann auch eine Laborforschungsprobe sein, z.B. ein Zellkulturüberstand, Virenisolat oder Virenkonzentrat. Die Probe wird gesammelt oder erhalten unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind.
Die Probe kann vor der Verwendung in dem Test verdünnt, gereinigt, konzentriert, filtriert, gelöst, suspendiert oder in anderer Weise manipuliert werden. Bevorzugt wird eine Probe, die teilchenförmiges Material enthält, vor der Verwendung verdünnt, filtriert oder sowohl verdünnt als auch filtriert. Das bevorzugte Verdünnungsmittel ist eine Pufferlösung. Jede aus einer Anzahl von wässrigen Standardpufferlösungen unter Anwendung einer Vielzahl von Puffern, wie Phosphat, TRIS-Detergenz oder dgl. mit physiologischem pH-Wert kann verwendet werden.
Die Probengröße für die biologische Flüssigkeitsprobe ist bevorzugt ungefähr 0,5 μl bis 1 ml. Eine bevorzugte biologische Flüssigkeitsprobengröße ist zwischen ungefähr 1 und 100 μl. Am meisten bevorzugt ist das Volumen der biologischen Flüssigkeitsprobe ungefähr 10 bis 50 μl.
Nach Reaktion mit einem oder mehreren der hier beschriebenen Reagenzien kann das Zielpeptid oder der Zielantikörper in der Probe bestimmt werden und quantitativ ausgewertet werden mit einer Anzahl von dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannten Mitteln. Diese schließen analytische biochemische Methoden, wie Spektrophotometrie, Radiographie, Elektrophorese, Kapillarelektrophorese, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie (DC), Hyperdiffusionschromatographie und dgl., und verschiedene immunologische Methoden, wie Fluid- oder Gelpräzipitatreaktionen, Immundiffusion (einzeln oder doppelt), Immunelektrophorese, Radioimmunoassays (RIAs), Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs), Immunofluoreszenzassays und dgl. ein.
Andere Testformate
Western-Blot-Analyse kann auch verwendet werden, um die Gegenwart des Zielpeptids in der Probe nachzuweisen und quantitativ zu bestimmen. Die Technik schließt allgemein ein, dass Probeprodukte durch Gelelektrophorese auf Basis des Molekulargewichts getrennt werden, die getrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (z.B. ein Nitrocellulosefilter, ein Nylonfilter oder derivatisiertes Nylonfilter) überführt werden und die Probe mit den Antikörpern, die spezifisch die Peptide binden, inkubiert wird. Die Antipeptid-Antikörper binden spezifisch an ein Peptid, das auf dem festen Träger fixiert ist. Diese Antikörper werden direkt markiert oder können alternativ nachfolgend detektiert werden unter Verwendung markierter Antikörper (z.B. markierte Schaf-Antimaus-Antikörper, wenn der Antikörper für das Peptid ein Mausantikörper ist), die spezifisch an den Antipeptid-Antikörper binden.
Weitere Testformate schließen Liposomenimmunoassays (LIAs), die Liposomen verwenden, die dazu vorgesehen sind, spezifische Moleküle zu binden (z.B. Antikörper) und eingekapselte Reagenzien oder Marker freisetzen, ein. Die freigesetzten Chemikalien werden dann mit Standardtechniken nachgewiesen.
Markierungen
Das Markierungsmittel, das verwendet wird, um das Polypeptid oder den Antikörper zu markieren, kann z.B. ein Peptid, ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein immunogenes Peptid oder ein Mosaikpolypeptid von immunogenen Peptiden oder ein Komplex, wie die hier beschriebenen, oder ein Polymer, wie eine Affinitätsmatrix, ein Kohlenhydrat oder Lipid sein. Der Nachweis kann mit irgendeiner bekannten Methode erfolgen, z.B. Immunblotting, Western-Analyse, Gel mobility-shift-Assays, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsanalyse (FISH), Verfolgung radioaktiver oder biolumineszierender Marker, kernmagnetische Resonanz, elektroparamagnetische Resonanz, Stopped-flow-Spektroskopie, Säulenchromatographie, Kapillarelektrophorese oder andere Methoden, die ein Molekül basierend auf einer Veränderung der Größe und/oder Ladung aufspüren. Die jeweilige Markierung oder nachweisbare Gruppe, die in dem Test verwendet wird, ist kein kritischer Aspekt der Erfindung. Die nachweisbare Gruppe kann irgendein Material mit einer nachweisbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche nachweisbaren Markierungen wurden auf dem Gebiet der Immunoassays gut entwickelt und allgemein kann jede Markierung, die bei solchen Methoden nützlich ist, für die vorliegende Erfindung angewendet werden. So ist eine Markierung irgendeine Zusammensetzung, die mit spektroskopischen, fotochemischen, biochemischen, immunochemischen, elektrischen, optischen oder chemischen Mitteln nachweisbar ist. Nützliche Markierungen für die vorliegende Erfindung schließen Magnetkügelchen (z.B. Dynabeads^TM), fluoreszierende Farbstoffe (z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Texas-Rot, Rhodamin und dgl.), radioaktive Markierungen (z.B. ³H, ²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P), Enzyme (z.B. LacZ, CAT, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, und andere, die üblicherweise als nachweisbare Enzyme entweder in EIA oder ELISA verwendet werden) und kolorimetrische Markierungen, wie kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Kunststoff-(z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latex etc.)-Kügelchen ein. Die Markierung kann direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des Tests mit im Stand der Technik wohl bekannten Methoden gekuppelt werden. Wie oben angegeben, kann eine weite Vielzahl von Markierungen verwendet werden, wobei die Auswahl der Markierung von der erforderlichen Empfindlichkeit, der Leichtigkeit der Konjugation der Verbindung, Stabilitätserfordernissen, verfügbaren Geräten und Vorschriften über die Entsorgung abhängt.
Nicht radioaktive Markierungen werden oft über indirekte Mittel gebunden. Allgemein wird ein Ligandenmolekül, z.B. Biotin, kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet dann an einen Antiligand, z.B. Streptavidin, ein Molekül, das entweder inhärent nachweisbar ist oder kovalent gebunden ist an ein Signalsystem, z.B. ein nachweisbares Enzym, eine fluoreszierende Verbindung oder eine chemilumineszierende Verbindung. Eine Anzahl von Liganden und Antiliganden kann verwendet werden. Wenn ein Ligand einen natürlichen Antiliganden hat, z.B. Biotin, Thyroxin und Cortisol, kann er zusammen mit markierten natürlich vorkommenden Antiliganden verwendet werden. Alternativ kann jede haptenische oder antigene Verbindung in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden.
Die Moleküle können auch direkt an Signal erzeugende Verbindungen konjugiert werden, z.B. durch Konjugation an ein Enzym oder Fluorophor. Als Markierungen interessierende Enzyme sind hauptsächlich Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreduktasen, insbesondere Peroxidasen. Fluoreszierende Verbindungen schließen Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon etc. ein. Chemilumineszierende Verbindungen schließen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione, z.B. Luminol ein. Zu einem Überblick über verschiedene Markierungssysteme oder Signal erzeugende Systeme, die verwendet werden können, siehe U.S.-Patent Nr. 4 391 904.
Mittel zum Nachweis von Markierungen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt. So kann z.B. dann, wenn die Markierung eine radioaktive Markierung ist, ein Mittel zur Detektion einen Szintillationszähler oder einen fotografischen Film wie bei der Autoradiografie einschließen. Wenn die Markierung eine fluoreszierende Markierung ist, kann sie nachgewiesen werden, indem das Fluorochrom mit der geeigneten Wellenlänge des Lichts angeregt wird und die entstehende Fluoreszenz nachgewiesen wird, z.B. durch Mikroskopie, visuelle Inspektion, über einen fotografischen Film, durch Verwendung elektronischer Detektoren, wie ladungsgekoppelte Bauteile (wie CCDs) oder Fotoverstärker und dgl. In gleicher Weise werden enzymatische Markierungen nachgewiesen, indem die geeigneten Substrate für das Enzym bereitgestellt werden und das entstehende Reaktionsprodukt nachgewiesen wird. Schließlich können einfache kolo rimetrische Markierungen einfach nachgewiesen werden, indem die Farbe, die mit der Markierung verbunden ist, beobachtet wird. So erscheint in verschiedenen Dipstick-Assays konjugiertes Gold oft rosa, während verschiedene konjugierte Kügelchen die Farbe des Kügelchens zeigen.
Einige Testformate erfordern nicht die Verwendung von markierten Komponenten. Z.B. können Agglutinierungsassays verwendet werden, um die Gegenwart der Zielantikörper nachzuweisen. In diesem Fall werden mit Antigen beschichtete Teilchen durch Proben, die die Zielantikörper enthalten, agglutiniert. Bei diesem Format muss keine der Komponenten markiert sein und die Gegenwart der Zielantikörper wird durch einfache visuelle Inspektion nachgewiesen.
Festphase
Wie oben erwähnt, können abhängig von dem Test verschiedene Komponenten, einschließlich des immunogenen Polypeptids, Antipeptid-Antikörpers oder Antiidiotyp-Antikörpers, an eine feste Oberfläche gebunden sein. Viele Methoden zur Immobilisierung von biologischen Molekülen an einer Vielzahl von festen Oberflächen sind im Stand der Technik bekannt. Z.B. kann die feste Oberfläche eine Membran (z.B. Nitrocellulose), ein Mikrotiternapf (z.B. PVC, Polypropylen oder Polystyrol), ein Teströhrchen (Glas oder Kunststoff), ein Dipstick oder Messstäbchen (z.B. Glas, PVC, Polypropylen, Polystyrol, Latex und dgl.), ein Mikrozentrifugenröhrchen oder ein Glas-, Siliciumdioxid-, Kunststoff-, Metall- oder Polymerkügelchen sein. Die erwünschte Komponente kann kovalent gebunden oder nicht kovalent durch nicht spezifische Bindung gebunden sein.
Eine große Vielzahl organischer und anorganischer Polymere, sowohl natürlich als auch synthetisch, kann angewendet werden als Material für die feste Oberfläche. Beispielhafte Polymere schließen Polyethylen, Polypropylen, Poly-(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Viskose, Nylon, Poly(vinylbutyrat), Polyvinylidendifluorid (PVDF), Silicone, Polyformaldehyd, Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose und dgl. ein. Andere Materialien, die angewendet werden können, schließen Papier, Glas, Keramik, Metalle, Metalloide, Halbleitermaterialien, Zement oder dgl. ein. Zusätzlich können Substanzen, die Gele bilden, wie Proteine (z.B. Gelatine), Lipopolysaccharide, Silicate, Agarose und Polyacrylamide verwendet werden. Polymere, die verschiedene wässrige Phasen bilden, wie Dextrane, Polyalkylenglycole oder Tenside, wie Phospholipide, langkettige (12 bis 24 Kohlenstoffatome) Alkylammoniumsalze und dgl. sind auch geeignet. Wenn die feste Oberfläche porös ist, können verschiedene Porengrößen angewendet werden, abhängig von der Art des Systems.
Zur Herstellung der Oberfläche kann eine Vielzahl verschiedener Materialien angewendet werden, z.B. Laminate, um verschiedene Eigenschaften zu erzielen. Z.B. können Proteinbeschichtungen, wie Gelatine, verwendet werden, um eine nicht spezifische Bindung zu vermeiden, die kovalente Konjugation zu vereinfachen, die Signaldetektion zu verbessern oder dgl.
Wenn eine kovalente Bindung zwischen einer Verbindung und der Oberfläche erwünscht ist, wird die Oberfläche gewöhnlich polyfunktionell gemacht oder kann polyfunktionalisierbar sein. Funktionelle Gruppen, die an der Oberfläche vorhanden sein können und zur Bindung verwendet werden können, schließen Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, ethylenische Gruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dgl. ein. Die Art der Bindung einer Vielzahl von Verbindungen an verschiedene Oberflächen ist wohl bekannt und in der Literatur vielfältig erläutert.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Impfstoffe und andere pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere der hier beschriebenen Polypeptide oder Antikörper enthalten, werden in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger bereitgestellt. Die Zusammensetzungen sind nützlich für therapeutische und prophylaktische Methoden zur Behandlung, Verhütung oder Senkung einer HEV-Infektion bei Menschen. Solche Zusammensetzungen sind geeignet zur Verwendung in einer Vielzahl von Wirkstoffabgabesystemen. Geeignete Formulierungen finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Auflage (1985). Ein kurzer Überblick über Methoden zur Wirkstoffabgabe findet sich bei Langer, Science 249: 1527–1533 (1990).
Die Zusammensetzungen sind für einzelne Verabreichungen oder eine Reihe von Verabreichungen geeignet. Wenn sie in Serie gegeben werden, werden Impfungen nach einer Anfangsverabreichung gegeben, um die Immunantwort zu boostern bzw. zu verstärken, was typischerweise als Boosterimpfung bezeichnet wird.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung vorgesehen. Bevorzugt werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, z.B. intravenös, subcutan, intradermal oder intramuskulär verabreicht. So liefert die Erfindung Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung, die eine Lösung der oben beschriebenen Mittel gelöst oder suspendiert in einem geeigneten Träger, bevorzugt einem wässrigen Träger enthalten. Eine Vielzahl wässriger Träger kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dgl. Diese Zusammensetzungen können mit üblichen wohl bekannten Sterilisierungstechniken sterilisiert werden oder können steril filtriert werden. Die entstehenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung, so wie sie sind, oder lyophilisiert verpackt werden, wobei das lyophilisierte Präparat mit einer sterilen Lösung vor der Verabreichung vereinigt wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen nach Bedarf enthalten, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, z.B. pH-Wert einstellende und puffernde Mittel, die Tonizität einstellende Mittel, Benetzungsmittel und dgl., z.B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc.
Für feste Zusammensetzungen können übliche nicht toxische feste Träger verwendet werden, was z.B. pharmazeutische Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dgl. einschließt. Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare nicht toxische Zusammensetzung gebildet, indem irgendeiner der normalerweise angewendeten Hilfsstoffe, z.B. Träger, wie sie vorher aufgeführt wurden, und im Allgemeinen 10 bis 95% aktiver Inhaltsstoff verarbeitet werden, bevorzugter hat der aktive Inhaltsstoff eine Konzentration von 25 bis 75%.
Für Aerosolverabreichung werden die Polypeptide bevorzugt in fein verteilter Form zusammen mit einem Tensid und einem Treibmittel bereitgestellt. Das Tensid darf natürlich nicht toxisch sein und ist bevorzugt in dem Treibmittel löslich. Beispielhaft für solche Mittel sind Ester oder Teilester von Fettsäuren, die 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie Capron-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Olesterin- und Ölsäuren mit einem aliphatischen mehrwertigen Alkohol oder cyclische Anhydride davon. Gemischte Ester, wie gemischte oder natürliche Glyceride können angewendet werden. Ein Träger kann auch nach Wunsch enthalten sein, z.B. ein Anteil an Lecithin für die intranasale Abgabe.
Die an den Patienten zu verabreichende Menge variiert abhängig davon, was verabreicht wird, vom Zustand des Patienten und der Art der Verabreichung. Bei therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen an einen Patienten verabreicht, der bereits mit dem HEV-Virus infiziert ist, in einer Menge, die ausreicht, um die Verbreitung des Virus zu hemmen oder mindestens teilweise die Symptome der Krankheit und ihre Komplikationen aufzuhalten. Eine geeignete Menge, um dies zu erreichen, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen von dem Schweregrad der Krankheit, der jeweiligen Zusammensetzung und dem Gewicht und Allgemeinzustand des Patienten ab. Im Allgemeinen liegt die Dosis in einem Bereich von etwa 100 μg bis etwa 3000 μg/Tag, bevorzugt etwa 1500 μg/Tag für einen Patienten mit 70 kg.
Bevorzugter wird das Polypeptid prophylaktisch als Impfstoff verwendet. Alle hier offenbarten immunogenen Polypeptide können als Impfstoffe entweder allein oder in Kombination, z.B. in einem Multiepitop- oder Polyepitopimpfstoff verwendet werden. Die Immunantwort kann die Erzeugung von Antikörpern, Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) gegen Zellen, die die immunogenen Polypeptide präsentieren, oder andere im Stand der Technik wohl bekannte Mechanismen einschließen. Bevorzugt schließt die Immunantwort die Erzeugung neutralisierender Antikörper ein. Die bevorzugte Dosis liegt in einem Bereich von 100 μg bis etwa 3000 μg/Tag, bevorzugt etwa 1500 μg/Tag, wobei in 1 bis 6 Dosen verabreicht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die immunogenen Polypeptide kovalent an ein Trägerprotein, wie oben beschrieben, gebunden (konjugiert). Nützliche Trägerproteine schließen, ohne darauf begrenzt zu sein, Thyroglobulin, Albumine, wie Humanserumalbumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren, wie Poly(D-lysin:D-Glutaminsäure), Influenza, Hepatitis-B-Virus-Core-Protein, rekombinanten Impfstoff mit Hepatitis-B-Virus ein. Die Impfstoffe können auch ein physiologisch tolerierbares (annehmbares) Verdünnungsmittel, wie Wasser, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung enthalten und typischerweise enthalten sie weiterhin ein Adjuvans. Adjuvanzien, wie inkomplettes Freund's Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Alaun sind im Stand der Technik wohl bekannte Materialien.
DNA-Impfstoffe
Zusätzlich können DNA oder RNA, die immunogene Polypeptide oder die Antikörper der vorliegenden Erfindung codieren, in Patienten eingeführt werden, um eine Immunantwort auf die immunogenen Polypeptide, die die Nucleinsäure codiert, zu erhalten. Siehe Wolff et al., Science 247: 1465–1468 (1990), die die Verwendung von Nucleinsäuren zur Erzeugung einer Expression der immunogenen Polypeptide, die die Nucleinsäuren codieren, beschreiben, deren Lehre hier durch Bezugnahme miteingeschlossen wird. Impfstoffe, die aus DNA oder RNA, die immunogene Polypeptide codieren, aufgebaut sind, werden allgemein im Stand der Technik als DNA-Impfstoffe bezeichnet.
Impfstoffzusammensetzungen, die immunogene Polypeptide und Nucleinsäuren der Erfindung enthalten, werden an einen Patienten verabreicht, um eine schützende Immunantwort gegen das Polypeptid hervorzurufen. Eine "schützende Immunantwort" ist eine, die das Ausbreiten von HEV verhindert oder hemmt und somit zumindest teilweise die Symptome der Krankheit und ihre Komplikationen verhütet. Eine Menge, die ausreicht, um dies zu erreichen, wird als "immunogen wirksame Dosis" bezeichnet. Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen von der Zusammensetzung, der Art der Verabreichung, dem Gewicht und allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und der Beurteilung des verschreibenden Arztes ab. Für Peptidzusammensetzungen ist der allgemeine Bereich für eine Anfangsimmunisierung (d.h. für therapeutische oder prophylakti sche Verabreichung) etwa 100 μg bis etwa 3000 μg/Tag, bevorzugt etwa 1500 μg/Tag, gefolgt von verstärkenden Dosierungen des Peptids gemäß einem Boostingplan über Wochen bis Monate abhängig von der Antwort des Patienten und dem Zustand des Patienten, z.B. indem die HEV-Pegel im Blut des Patienten gemessen werden. Für Nucleinsäuren sind die gleichen Dosierungsbereiche bevorzugt.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht in irgendeiner Weise so konstruiert werden sollen, dass sie Beschränkungen des Schutzbereichs darstellen. Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von HEV-Polypeptiden, wie in Anspruch 1 definiert, ebenso wie die spezifischen HEV-Polypeptide per se, wie in Anspruch 8 definiert.
Beispiele
Methoden und Materialien
Zellkultur
PLC/PRF/5, eine menschliche Hepatocarcinomazelllinie, wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (Gibco BRL, Grand Island, NY), das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (HyClone, Laboratory Int., Logan, Utah) ergänzt war, gezüchtet und bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Für den in-vitro-Neutralisierungsassay, der unten beschrieben wird, wurden trypsinisierte Zellen in 24-Napf-Flachbodenkulturplatten in einer Konzentration von 10⁵ Zellen pro Napf ausgesät und über Nacht inkubiert, um Zelleinzelschichten zu bilden.
Virusvorrat
Die Inocula der HEV-Burma-, Pakistan-, Marokko- und Mexikostämme werden bei Meng et al., 1998, beschrieben. Der HEV-US-Stamm wurde aus einer Fäkalprobe erhalten, die von einem 62 Jahre alten weißen Mann stammte, der unter akuter Virenhepatitis litt, der kurz davor nicht außerhalb der Vereinigten Staaten unterwegs gewesen war (Kwo et al., 1997; Schlauder et al., 1998). Dieses Inoculum wurde hergestellt, wie bei Meng et al., 1998, beschrieben.
Synthetische Peptide
51 überlappende 30-mer-Peptide (P1 bis P51), die das pORF2-Protein zwischen den Aminosäuren 221 und 660 (SEQ ID Nr. 1) umfassen, wurden mit FMOC-Chemie an einem Mehrfachpeptid-Syntheseautomaten ACT Modell MPS 350 (Advanced Chemtech, Louisville, KY) nach den Vorschriften des Herstellers synthetisiert. Die synthetischen Peptide wurden mit Aminosäureanalyse, Hochleistungsflüssigchromatographie und Kapillarelektrophorese charakterisiert. Für die Tierimmunisierung wurde jedes der Peptide mit einem Trägerprotein, Rinderserumalbumin (BSA), durch 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid-(EDC)-Kupplungsmethoden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (PIERCE, Rockford, IL) konjugiert.
Konstruktion von rekombinanten HEV-Plasmiden
31 rekombinante HEV-Plasmide wurden mit einem pGEX-4T-2-Vektor (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) und verschiedenen Größen von PCR-Fragmenten, die mit PCR-Walking-Technik aus einem HEV-Burmaplasmid, das die gesamte ORF2-Sequenz enthielt, amplifiziert worden waren, konstruiert. Die Primer wurden ausgewählt basierend auf der HEV-Burmasequenz (Tam et al., 1990) und so modifiziert, dass sie BamH-I- oder Xho-I-Restriktionsstellen enthielten, um die Klonierung zu erleichtern.
Die Amplifikation wurde durchgeführt mit dem Expand^TM-High-Fidelity-PCR-System (Boehringer Mannheim, GmbH, Deutschland). Die PCR-Produkte wurden mit einem QIAquick-PCR-Purification-Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) gereinigt. Sowohl gereinigte PCR-Produkte als auch pGEX-4T-2-Vektor wurden mit BamHI und XhoI (Boehringer Mannheim) in Puffer B bei 37°C über Nacht verdaut, mit T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) bei 16°C über Nacht ligiert und dann verwendet, um kompetente E.-coli-JM109-Zellen (Promega, Madison, WI) zu transformieren. Nach der Klonierung wurden rekombinante Plasmide aus Transformanten gewonnen unter Verwendung des Wizard-Miniprep-DNA-Purification-Systems (Promega). Die Gegenwart eines Inserts wurde mit PCR bestätigt unter Verwendung von zwei Primern, die aus Regionen stammten, die die Mehrfachklonierungsstelle von pGEX-4T-2 flankieren. Die Primärstruktur der Inserts wurde schließlich durch DNA-Sequenzierung mit einem 373- oder 377-DNA-Sequenzautomaten bestätigt (ABI, Foster City, CA).
Herstellung von HEV-GST-Fusionsproteinen
E.-coli-JM109-Zellen, die mit den rekombinanten Plasmiden transformiert waren, wurden bei 37°C über Nacht in Luriabrühe-(LB)-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet. Die Über-Nacht-Kultur wurde 20 Mal mit frischem LB-Medium, das die gleiche Konzentration an Ampicillin enthielt, verdünnt und bei 37°C 3 bis 4 Stunden lang gezüchtet, bis ein Wert für die optische Dichte (OD) von 0,6 bis 1,0 bei 600 nm erreicht war. Die Genexpression wurde induziert durch Zugabe von Isopropyl-(D-thiogalactopyranosid) (IPTG, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zu der Kultur auf eine Endkonzentration von 1 mM. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C unter konstantem Schütteln wurden die Zellen durch Zentrifugation mit 6.000 g 15 Minuten bei 4°C pelletisiert und dann mit 3 ml Lysepuffer (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) pro Gramm gepackter Zellen resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten in Eis mit einer Endkonzentration von 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma) und 0,5 mg/ml Lysozym (Sigma) inkubiert. Dann wurden 4 mg Desoxycholinsäure pro Gramm E.-coli-Zellen zugegeben, wobei 5 Minuten lang kontinuierlich bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das Lysat wurde mit 20 U/ml DNAse (Boehringer Mannheim) bei Raumtemperatur inkubiert, bis es nicht mehr viskos war, und 20 Minuten bei 4°C mit 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt und mit Bulk and Redipack GST Purification Modulen (Pharmacia Biotech) gereinigt. Das Pellet, das unlösliches HEV-GST-Fusionsprotein enthielt, wurde vollständig gewaschen, wieder suspendiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) homogenisiert und in Aliquots bei –70°C aufbewahrt. Gleichzeitig wurde GST-Protein aus pGEX-4T-2-Vektor als Kontrolle hergestellt.
Western-Immunoblot-Analyse für rekombinante HEV-Proteine
Aliquots der homogenisierten HEV-GST-Fusionsproteine wurden durch Elektrophorese auf vorgegossenen 12% Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamidgelen (Bio-Rad, Richmond, CA) getrennt und anschließend auf Nitrocellulosemembranen (Bio-Rad) geblottet. Die Nitrocellulosemembranen wurden über Nacht mit Blockierungspuffer, der 10% normales Ziegenserum, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,05% Tween 20 in 0,01 M PBS enthielt, inkubiert und dann 1 Stunde mit Serumproben inkubiert, die von Cynomolgusaffen gesammelt worden waren, die experimentell mit dem HEV-Pakistan-Stamm (SAR-55) infiziert worden waren, verdünnt 1:100 in Blockierungspuffer. Die Membranen wurden dreimal mit Waschpuffer (PBS mit 0,05% Tween 20) gespült und 1 Stunde mit durch Affinität gereinigtem Ziegen-Antihuman-Immunglobulin G (IgG, Pierce), das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, verdünnt 1:6000 in Blockierungspuffer, inkubiert. Nach dreimaligem Waschen, wie oben, wurde die Farbentwicklung ausgeführt mit 3,3'-Diaminobenzidin als Substrat (Bio-Rad).
Immunisierung von Mäusen mit synthetischen HEV-Peptiden und rekombinanten Polypeptiden
Jedes der BSA-konjugierten Peptide und HEV-GST-Fusionsproteine wurde mit einem Adjuvans, TiterMax (CytRx, Atlanta, GA) in gleichem Volumen emulgiert und dann verwendet, um eine Gruppe von 3 bis 4 weiblichen Hsd-NIHS-Mäusen, die 6 bis 9 Wochen alt waren, zu immunisieren. Die Mäuse wurden subcutan an zwei Stellen auf dem Rücken geimpft mit insgesamt 100 μl der Emulsion, die 50 μg des konjugierten Peptids oder Fusionsproteins enthielt. Vier Wochen später wurden die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 10 μg des gleichen Peptids oder Proteins, verdünnt in 100 μl PBS, geboostet. 7 Tage nach der Boosterinjektion wurde den Mäusen Blut aus dem Herzen entnommen. Die Immunserumproben, die von jeder Gruppe von Mäusen erhalten wurden, wurden gepoolt und durch 30-minütiges Erwärmen auf 60°C inaktiviert. Aliquots wurden erstellt und für den weiteren Test bei –70°C aufbewahrt. Immunserumproben gegen BSA und GST wurden mit dem gleichen Verfahren hergestellt.
Enzymimmunoassays für Anti-HEV-Antikörper
Das zum Nachweis von Antikörpern gegen synthetische HEV-Peptide verwendete Protokoll wird bei Khudyakov et al., 1999, beschrieben. Allgemein wurden synthetische Peptide (110 μl) in einer Konzentration von 5 μg/ml in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, (Immulon II; Dynatech Laboratories, Inc.) bei Raumtemperatur 12 Stunden lang an Mikrotiternäpfen adsorbiert. Das Serum wurde 1:100 in PBS, das 0,1% Tween 20 und 10% normales Ziegenserum (PBS-T) enthielt, verdünnt. 100 μl verdünntes Serum wurden jedem Napf zugegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Bindung von Antikörpern an die Peptide wurde mit affinitätsgereinigten Antikörpern gegen Human-IgM gekuppelt an Meerrettichperoxidase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) festgestellt, indem 100 μl einer 1:10.000- oder 1:5.000-Verdünnung in PBS-T zugegeben wurden und 1 Stunde bei 37°C inkubiert wurde. Der Ausfluss, ausgedrückt als PIN-Verhältnis und gleich 3,0, wurde statistisch einzeln für jedes Peptid als Mittelwert des Ergebnisses mit negativen Kontrollen plus mindestens 3,5 Standardabweichung über dem Mittelwert etabliert, wobei P die optische Dichte bei 493 nm (OD₄₉₃) von Anti-HEV-positiven Proben bedeutet und N die OD der negativen Kontrollen bedeutet. Jede Serumprobe in jedem Versuch wurde auch mit einem irrelevanten Peptid (Nr. 1546) mit der Sequenz PMSMDTSDETSEGATFLSLS, das aus einem kleinen ORF innerhalb der Minus-Strang-RNA von Hepatitis-G-Virus stammte, getestet. Als zusätzliches Kriterium wurde das Verhältnis zwischen OD₄₉₃ für jedes HEV-Peptid und OD₄₉₃ für dieses irrelevante Peptid, das für jede Serumprobe gefunden wurde, verwendet. HEV-Peptide wurden als spezifisch immunoreaktiv mit Serumproben angesehen, wenn dieses Verhältnis größer als 2 war.
Seroneutralisierungsassay auf Basis in-vitro-PCR
Dieser Test wird von Meng et al., 1997; 1998, beschrieben. Kurz gesagt werden ungefähr 100 infektiöse Zellkulturdosen eines HEV-Inoculums verdünnt in 100 μl Hank's Lösung mit 100 μl Immunserumprobe in einer Verdünnung von 1:10 vermischt. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Mischung auf eine Zelleinzelschicht von PLC/PRF/5 geimpft. Nach 2-stündiger Absorption bei 37°C wurden die Zellen dreimal mit Hank's Lösung gewaschen und anschließend sofort die RNA mit TRIzolreagenz (Gibco BRL) nach der Anleitung des Herstellers extrahiert. Reverse Transkription, Nested PCR wurden durchgeführt unter Verwendung eines Satzes von Universal-HEV-PCR-Primern. Die äußeren Primer waren YK-1291 (5'GTT GTC TCA GCC AAT GGC GAG CC) (SEQ ID Nr. 2) und YK-1294 (5'-GCC TGC GCG CCG GTC GCA ACA) (SEQ ID Nr. 3). Die inneren Primer waren YK-1292 (5'-TGG AGA ATG CTC AGC AGG ATA A) (SEQ ID Nr. 4) und YK-1293 (5'-TAA GTG GAC TGG TCG TAC TCG GC) (SEQ ID Nr. 5). Sowohl die Amplifikationen der ersten Runde als auch der zweiten Runde wurden durchgeführt mit dem folgenden Wechselprogramm: Denaturierung 45 s bei 94°C, Annealing 20 s bei 60°C, Verlängerung 60 s bei 72°C, über 30 Zyklen. Amplicons wurden mit Agarosegelelektrophorese mit Größenmarkern getrennt und mit Ethidiumbromidfluoreszenz sichtbar gemacht. Die Neutralisierung wurde bestimmt durch Abwesenheit von nachweisbarer HEV-RNA in der geimpften Zellkultur. Ein normales Mausserum als Kontrolle, Anti-BSA oder Anti-GST-Serum als Kontrolle, Viruskontrolle und nicht geimpfte Zellen als Kontrolle wurden zum Nachweis von HEV-RNA gleichzeitig verarbeitet.
Ergebnisse
HEV-neutralisierende antigene Epitope konnten nicht mit den synthetischen Peptiden nachgeahmt werden.
Die 51 Immunserumproben gegen BSA-konjugierte synthetische HEV-Peptide (P1 bis P51) wurden sowohl mit ELISA als auch dem in-vitro-Neutralisierungsassay getestet. Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren alle Serumproben immunoreaktiv mit dem Trägerprotein BSA, was darauf hindeutet, dass die Mäuse Immunantworten auf die Antigene entwickelten. Nur 30 von 51 (59%) Serumproben enthielten jedoch nachweisbare Antikörper für die jeweiligen synthetischen Peptide. Diese reaktiven Proben schienen in 5 Gruppen Cluster zu bilden: Gruppe 1 mit anti-P1 bis anti-P4, Gruppe 2 mit anti-P11 bis anti-P16, Gruppe 3 mit anti-P19 bis anti-P28, Gruppe 4 mit anti-P33 bis anti-P43 und Gruppe 5 nur mit anti-P51. Nichtsdestotrotz zeigte, wenn die Immunserumproben mit dem in-vitro-Neutralisierungsassay getestet wurden, keine von diesen neutralisierende Aktivität sowohl gegenüber HEV-Burma- als auch Mexikostämmen. Da gepoolte Antikörper manchmal die Antikörperfunktionen erhöhen können, wurden die Immunserumproben in den Gruppen 1, 2, 3 und 4 zusammengebracht und wiederum mit dem in-vitro-Neutralisierungsassay getestet. Es wurde keine neutralisierende Aktivität nachgewiesen. Daher konnten Antikörper, die durch Immunisierung von Mäusen mit synthetischen HEV-Peptiden erhalten worden waren, mit ELISA, nicht aber mit in-vitro-Neutralisierungsassay nachgewiesen werden. Diese Daten deuten darauf hin, dass HEV-neutralisierende antigene Epitope von den Epitopen verschieden sein können, die mit ELISA nachweisbare Antikörper induzieren.
Tabelle 1: Nachweis von Antikörpern gegen mit BSA konjugierte synthetische HEV-Peptide mit ELISA und Neutralisierungsassay
Expression von HEV-GST-Fusionsproteinen
31 Fragmente, die verschiedene Regionen der vollständigen HEV-Burma-ORF2-Sequenz umfassen, wurden getrennt mit PCR amplifiziert und dann in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-4T-2 kloniert. Das insertierte Fragment in jedem Klon wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Nach Induktion mit IPTG wurden große Mengen HEV-GST-Fusionsproteine exprimiert, was durch Abwesenheit von E.-coli-JM109, der mit pGEX-4T-2-Vektor selbst transformiert ist, gezeigt wird. Die geschätzten Molekulargewichte der exprimierten Fusionsproteine stimmten überein mit den vorhergesagten Größen, einschließlich 26 kDa von GST (Tabelle 2).
Tabelle 2: Rekombinante HEV-GST-Fusionsproteine und ihre Western-Blot-Reaktivität auf Immunserumproben
Die meisten Proteine wurden als Inclusion-Bodies bzw. Einschlusskörper erzeugt. Einige davon, wie pA1, pA2, pA3, pA4, pA11, pA12, pA13, pA14, pA15, pF2, pN309, pN393, pN421, pN452 und pB166 waren teilweise löslich. Alle der teilweisen löslichen Proteine, die am N- oder C-terminalen Teil des HEV-pORF2 angeordnet waren (außer pF2) hatten ein Molekulargewicht von nicht mehr als 55,5 kDa einschließlich des GST-Teils (außer pF2 und pN309). Die antigene Reaktivität der rekombinanten Proteine wurde mit Western-Immunoblot-Assay mit Serumproben, die aus einem experimentell infizierten Cynomolgusaffen erhalten wurden, der mit HEV-Pakistanstamm SAR-55 geimpft worden war, analysiert. Es wurden keine Proteine erkannt in der Serumprobe, die vor der Impfung abgenommen worden war, während 25 der 31 Proteine mit der Serumprobe, die am Tag 54 nach der Impfung abgenommen worden war, reaktiv waren (Tabelle 2). Die Daten bestätigten die Spezifität der rekombinanten Fusionsproteine mit HEV-Eigenschaften. Die Proteine wurden daher verwendet, um Mäuse zu immunisieren, um Immunserumproben für Neutralisierungsassays zu erzeugen.
HEV-neutralisierende antigene Epitope sind am C-terminalen Teil des pORF2 angeordnet
15 Immunserumproben gegen die etwa 100 aa langen rekombinanten Proteine (pA1 bis pA15) und vier Immunserumproben gegen die etwa 400 aa langen rekombinanten Proteine (pF1 bis pF4) wurden zuerst mit ELISA mit einem gereinigten GST-Antigen getestet. Wie in Tabelle 3 gezeigt, waren alle Serumproben mit GST immunoreaktiv, was darauf hindeutet, dass die Immunisierung der Mäuse mit diesen rekombinanten Proteinen mit GST-Fusionseigenschaften erfolgreich war. Dann wurde der in-vitro-Neutralisierungstest durchgeführt sowohl mit HEV-Burma- als auch Mexikostämmen, um die neutralisierende Aktivität zu bestimmen. Wie bei den synthetischen Peptiden rief keines der etwa 100 aa langen Proteine neutralisierende Antikörper hervor. Für die Immunserumproben gegen die vier etwa 400 aa langen Proteine konnte bei 3, jeweils gegen pF1 (aa 1 bis 417), pF2 (aa 113 bis 507) und pF3 (aa 189 bis 580) keine neutralisierende Aktivität gezeigt werden. Nur die Serumprobe gegen pF4, das am äußeren C-terminalen Teil (aa 274 bis 660) von pORF2 angeordnet ist, neutralisierte sowohl Burma- als auch Mexikostämme bei dem in-vitro-Neutralisierungstest. Drei Gruppen von gepoolten Immunserumproben gegen pA8 bis pA15, pF2 und pA12 bis pA15, pF3 und pA14 bis pA15, deren entsprechende Sequenzen die aa 274 bis 660 abdecken, zeigten auch keine neutralisierende Aktivität (Tabelle 3). Diese Daten zeigen, dass HEV-neutralisierende antigene Epitope am C-terminalen Teil von pORF2 angeordnet sind und beweisen auch, dass diese Epitope sehr konformationsabhängig sind.
Tabelle 3: Neutralisierende Aktivität von Immunserumproben gegen etwa 100 und etwa 400 Aminosäuren lange rekombinante HEV-Proteine
HEV-neutralisierende antigene Epitope wurden innerhalb der Sequenz von aa 452 bis 617 von pORF2 kartiert
Für die Feinkartierung der HEV-neutralisierenden antigenen Epitope wurden weitere 12 Immunserumproben gegen rekombinante Proteine, die von pF4 am N- oder C- oder sowohl N- als auch C-Ende trunkiert waren, mit ELISA und mit dem in-vitro-Neutralisierungstest getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4: Neutralisierende Aktivität von Immunserumproben gegen trunkierte rekombinante pF4-Proteine
Wie in Tabelle 4 gezeigt, waren alle Serumproben für GST bei ELISA immunoreaktiv, was darauf hindeutet, dass die immunisierten Mäuse Antikörper gegen diese trunkierten HEV-GST-Fusionsproteine erzeugten. Der in-vitro-Neutralisierungstest wurde dann wiederum sowohl mit HEV-Burma- als auch Mexikostämmen durchgeführt. Überraschenderweise waren die Immunserumproben gegen Protein pN309, pN336, pN364, pN393, pN421, pN452, die vom N- Ende von pF4 an Position aa 309, 336, 364, 393, 421 bzw. 452 trunkiert waren, ähnlich wie anti-pF4 in der neutralisierenden Aktivität für beide Stämme. Wenn jedoch die Immunserumprobe gegen pN499, die vom N-Ende von pF4 an Position aa 499 trunkiert war, angewendet wurde, verschwand die neutralisierende Aktivität, was darauf hindeutet, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in dem Bereich zwischen aa 452 und aa 499 signifikant sind, um HEV-neutralisierende antigene Epitope zu bilden.
Für die Serumproben gegen Protein pC617, pC580, pC540, pC507, die vom C-Ende von pF4 an Position aa 617, 580, 540 bzw. 507 trunkiert waren, neutralisierte nur anti-pC617 die HEV-Stämme bei dem in-vitro-Neutralisierungstest. Somit sind die Aminosäurereste zwischen aa 617 und aa 660 am äußersten C-Ende von pORF2 nicht wesentlich für die Konstruktion neutralisierender antigener Epitope, aber ein oder mehrere Aminosäurereste in dem Bereich zwischen aa 580 und aa 617 sind offensichtlich unverzichtbar.
Wenn schließlich mit der Immunserumprobe gegen das Protein pB166, das sowohl am N-Ende als auch am C-Ende von pF4 an Position aa 452 und 617 trunkiert war, der in-vitro-Neutralisierungstest durchgeführt wurde, wurde ein sehr konsistentes Ergebnis erhalten. Diese Serumprobe, anti-pB166, neutralisierte sowohl die Burma- als auch Mexikostämme. Insgesamt deuten diese Daten stark darauf hin, dass HEV-neutralisierende antigene Epitope innerhalb der Sequenz von aa 452 bis 617 von pORF2 kartiert werden können und effizient mit pB166 modelliert werden können, dem 166 Aminosäure langen rekombinanten Protein.
Über-Kreuz-Neutralisierung von anti-pB166 mit verschiedenen Genotypen oder Untertypen von HEV
Wie oben gezeigt, war pB166 das Minimalprotein, das HEV-neutralisierende antigene Epitope enthielt. Es ist nachvollziehbar, dass dieses Protein die geringste unspezifische Reaktivität hat aufgrund seiner kürzesten Sequenz. Obwohl die Immunserumprobe gegen pB166 neutralisierende Aktivität sowohl gegen den homologen Burmastamm als auch den heterogenen Mexikostamm zeigte, wurde die Kreuzneutralisierung gegenüber anderen geografischen HEV-Stämmen getestet. Ein quantitativer Kreuzneutralisierungstest wurde mit HEV-Stämmen durchgeführt, die aus Burma, Pakistan, Marokko, Mexiko und USA stammten, die unterschiedliche Genotypen und Untertypen von HEV repräsentieren. Die Immunserumprobe gegen pB166 wurde zweifach verdünnt aus 1:10 und mit 100 infektiösen Zellkulturdosen jedes HEV-Stamms gemischt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurden die Mischungen auf PLC/PRF/5 Zelleinzelschichten geimpft. Schließlich wurde die Kreuzneutralisierung bestimmt basierend auf einem PCR-Nachweis, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Die Neutralisierungstiter von anti-pB166 für verschiedene Stämme, außer dem Marokkostamm, waren nicht signifikant variabel, wie in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Kreuzneutralisierungsendpunkttitration von anti-pB166 mit verschiedenen geografischen HEV-Stämmen
LITERATURSTELLEN:

Emini E. A., J. V. Hughes, D. S. Perlow und J. Boger, 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J. Virol. 55: 836–839.
Khudyakov Y. E., E. N. Lopareva, D. L. Jue, T. K. Crews, S. P. Thyagarajan und H. A. Fields, 1999, Antigenic Domains of the open reading frame 2-encoded protein of hepatitis E virus. J. Clin. Microbiol. 37: 2863–2871.
Kwo P. Y., G. G. Schlauder, H. A. Carpenter, P. J. Murphy, J. E. Rosenblatt, G. J. Dawson, E. E. Mast, K. Krawczynski und V. Balan, 1997. Acute hepatitis E by a new isolate acquired in the United States. Mayo Clin. Proc. 72: 1133–1136.
Meng J.-H., P. Dubreuil und J. Pillot, 1997. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J. Clin. Microbiol. 35: 1373–1377.
Meng J.-H., J. Pillot, X. Dai, H. A. Fields und Y. E. Khudyakov, 1998. Neutralization of different geographic strains of the hepatitis E virus with anti-hepatitis E virus-positive serum samples obtained from different sources. Virology 249: 316–324.
Meng X.-J., R. H. Purcell, P. G. Halbur, J. R. Lehman, D. M. Webb, T. S. Tsareva, J. S. Haynes, B. J. Thacker und S. U. Emerson, 1997. A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9860–9865.
Neurath A. R., S. B. H. Kent, K. Parker, A. M. Prince, N. Strick, B. Brotman und P. Sproul, 1986. Antibodies to a synthetic peptide from the preS 120–145 region of the hepatitis B virus envelope are virus-neutralizing. Vaccine 4: 35–37.
Purdy M. A., K. A. McCaustland, K. Krawczynski, J. Spelbring, G. R. Reyes und D. W. Bradley, 1993. Preliminary evidence that a trpE-HEV fusion protein protects cynomolgus macaques against challenge with wild-type hepatitis E virus (HEV). J. Med. Virol. 41: 90–94.
Purdy M. A., K. A. McCaustland, K. Krawczynski, A. Tam, M. J. Beach, N. C. Tassopoulos, G. R. Reyes und D. W. Bradley, 1992. Expression of a hepatitis E virus (HEV)-trpE fusion protein containing epitopes recognized by antibodies in sera from human cases and experimentally infected primates. Arch. Virol. 123: 335–349.
Schlauder G. G., G. J. Dawson, J. C. Erker, P. Y. Kwo, M. F. Knigge, D. L. Smalley, J. E. Rosenblatt, S. M. Desai und I. K. Mushahwar, 1998. The sequence and phylogenetic analysis of a novel hepatitis E virus isolated from a patient with acute hepatitis reported in the United States. J. Gen. Virol. 79: 447–456.
Shimizu Y. K., H. Igarashi, T. Kiyohara, T. Cabezon, P. Farci, R. H. Purcell und H. Yoshikura, 1996. A hyperimmune serum against a synthetic peptide correspond ing to the hypervariable region 1 of hepatitis C virus can prevent viral infection in cell cultures. Virology 223: 409–412.
Tam A. W., M. M. Smith, M. E. Guerra, C.-C. Huang, D. W. Bradley, K. E. Fry und G. R. Reyes, 1991. Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virology 185: 120–131.
Tsarev S. A., T. S. Tsareva, S. U. Emerson, S. Govindarajan, M. Shapiro, J. L. Gerin und R. H. Purcell, 1994. Successful passive and active immunization of cynomolgus monkeys against hepatitis E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10198–10202.
Tsarev S. A., T. S. Tsareva, S. U. Emerson, S. Govindarajan, M. Shapiro, J. L. Gerin und R. H. Purcell, 1997. Recombinant vaccine against hepatitis E: dose response and protection against heterologous challenge. Vaccine 15: 1834–1838. Yarbough P. O., K. Krawczynski, A. W. Tam, C. P. McAtee, K. A. McCaustland, Y. Zhang, N. Garcon, J. Spelbring, D. Carson, F. Myriam, J. D. Lifson, M. Slaoui, J. P. Prieels, H. Margolis und T. R. Fuerst, 1997. Prevention of hepatitis E using r62K subunit vaccine: full protection against heterologous HEV challenge in cynomolgus macaques, S. 650–655. In M. Rizzetto, R. H. Purcell, J. L. Gerin und G. Verme (Herausgeber), Viral hepatitis and liver disease. Edizioni Minerva Medica, Turin, Italien.
Yewdell J. und J. Bennink, 1997. Immune responses to viruses, S. 271–305. In D. D. Richman, R. J. Whitley und F. G. Hayden (Herausgeber), Clinical virology. Churchill Livingstone, New York, NY.

SEQUENZEN

ORF2 und pORF2 (SEQ ID Nr. 1) (beigefügte Seite)
YK-1291 (5'-GTT GTC TCA GCC AAT GGC GAG CC) (SEQ ID Nr. 2)
YK-1294 (5'-GCC TGC GCG CCG GTC GCA ACA) (SEQ ID Nr. 3)
YK-1292 (5'-TGG-AGA ATG CTC AGC AGG ATA A) (SEQ ID Nr. 4)
YK-1293 (5'-TAA GTG GAC TGG TCG TAC TCG GC) (SEQ ID Nr. 5)

Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung eines HEV-Polypeptids, das mindestens 50 Aminosäurereste von den Aminosäureresten 452 bis 617 vom C-Ende des HEV-pORF2-Proteins aufweist einschließlich mindestens eines neutralisierenden Epitops zur Herstellung einer Zusammensetzung, um neutralisierende Anti-HEV-Antikörper zu erzeugen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das HEV-Polypeptid mindestens etwa 100 Aminosäurereste von den Aminosäureresten 452 bis 617 vom C-Ende des HEV-pORF2-Proteins aufweist, einschließlich mindestens eines neutralisierenden Epitops.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das HEV-Polypeptid die Aminosäurereste 452 bis 617 des C-Endes des HEV-pORF2-Proteins aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das HEV-Polypeptid Aminosäurereste vom C-Ende des HEV-pORF2-Proteins bis aa 617 aufweist und mindestens die Aminosäurereste 452 bis 617 enthält.
Verwendung eines Polypeptids oder eines immunogenen Moleküls, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, zur Herstellung eines Impfstoffs, um eine neutralisierende Immunantwort gegen HEV hervorzurufen.
Verwendung eines immunogenen Moleküls, das ein neutralisierendes HEV-Polypeptid aufweist, das mindestens Aminosäurereste 452 bis 617 vom C-Ende des HEV-pORF2-Proteins aufweist, oder konservative Modifikationen davon, zur Herstellung eines Impfstoffs, um eine neutralisierende Immunantwort gegen HEV zu induzieren.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Neutralisierendes HEV-Polypeptid bestehend aus einer der folgenden Aminosäuresequenzen: Aminosäuren 274 bis 660; 309 bis 660; 336 bis 660; 364 bis 660; 393 bis 660; 421 bis 660; 452 bis 660; 274 bis 617; und 452 bis 617 vom C-Ende des HEV-pORF2-Proteins oder konservative Modifikationen davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Polypeptid nach Anspruch 8.
Antikörper, der gegen eines der Polypeptide von Anspruch 8 erzeugt wurde.