JPH02504395A - アポａｉ定量のための診断方法及び診断システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アポＡｌ定量のための診断方法及び診断システム（技術分野） 本発明は血液サンプル中に存在する、７ポＡｌ量を免疫学的に定量するのに有用 な抗体及びポリペプチドに関する。

（背景） リポタンパク質は血中コレステロールの主要なキャリヤーである。これらは、コ レステロール含有コアを囲む極性脂質と会合する１つ以上のタンパク質から成る 表面フィルムを有するミセル状脂質−タンパク賞複合体（粒子）である、リポタ ンパク質は本来、超遠心によって測定される浮遊密度に基づいて分類されており 、これにより４つの主要な密度グループ−キロミクロン、超低密度リポタンパク 質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（Ｌ　Ｄ　Ｌ）及び高密度リポタンパク 質（ＨＤ　Ｌ）に分類されている。

現在、多くの研究により血漿ＨＤＬコレステロールレベルと冠動脈症（ＣＡＤ） の発病との間に逆比例関係がある事が確認されている。すなわち、ＨＤＬ粒子中 に存在する血中コレステロールレベルが高い程、ＣＡＤの発病率が低下する。

同様に、現在多くの研究により、ＨＤＬの主要タンパク質成分であるアポリポタ ンパク質（アポＡｌ）の血中レベルもＣＡＤの発病と逆相関があることが示され ている。さらに、ワイズワイラ−（Ｗｅｉｓ　Ｗｅｉｌｅｒ　）等（クリニカル ケミストリー（Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、Ｌｌｌ、３４Ｂ　（１９８１）は、アポ Ａルベルを知ることがＨＤＬコレステロールの評価を向上しうろことを報告した 。

ＣＡＤとの逆相関係により脂質代謝におけ−るアポＡ１の構造と機能に間して精 力的な研究が行なわれている。現在、アポＡ１の性化であると考えられている。

構造的には精製アポＡ１は高い割合（５５％）のα−へリンクスを含み、ＨＤＬ 粒子中のようにリン脂質と会合したときにはそれが７０％に増大すると報告され ている。アポＡｌの脂質結合性は、主としてα−ヘリックス状でかつ両親媒性で あるプロリン残基により中断されている一連の２２個のアミノ酸反復配列の働き によるようである。

本来のアポＡ１の臭化シアン−及びトリプシン断片のエドマン分解により測定し たアポＡｌのアミノ酸残基配列はブリューワー（Ｂｒｅｗｅｒ　）等により報告 された（バイオケム、バイオフィズリサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｇ＋、）＋１０．６２３−６３０ 　（１９７Ｂ））、ブリューワ−（Ｂｒｅｗｅｒ　）等の方法に従がいアポＡｌ を臭化シアン（ＣＮＢｒ）で分解すると４個の主要断片が生じ、それらは、アポ Ａ１配列のアミノ末端からカルボキシ末端の方向にＣＮＢｒ１、ＣＮＢｒ２、Ｃ ＮＢｒ３及びＣＮＢｒ４と命名した。　ＣＮＢ　ｒ　１．　ＣＮＢ　ｒ　２、Ｃ ＮＢｒ３及びＣＮＢｒ４はＣＮＢｒ切断過程でそこに存在するメチオニン残基が 分解される結果として生ずるホモセリンラクトンをそのカルボキシ末端に有する ポリペプチドであることに注意を要する。

本来のアポＡ！、すなわちＨＤＬ粒子中に存在するアポＡｌの免疫化学的特徴は 、それが抗原的に不均一でありかつ不安定であることから問題とされてきた事で ある。アポＡｔの抗原的不均一性は本来のＨＤＬ中の脂質によりいくつかのエピ トープがマスクされている事又は脂質又は他のＨＤＬ会舎タンパク賞によるアポ Ａｌの構造の変化がいくつかのエピトープの抗体結合能を左右する事によるらし い、限定されに抗血清に対する免疫反応性の経時的変化から明白なようにアポＡ ｌの抗原的不安定性はインビトロで起こることが示されている自己会合及び脱ア ミド化のような現象によるらしい。

このようなアポＡ１の抗原的な不均一性及び不安定性は愚者の血液サンプル中の アポＡｌの定量法及び定量システムを構築するのを困難にしている。このことは 、中でもこれらのシステムが、このシステムにおいて基本的な抗アポＡｌ抗体の 免疫反応性が少なくとも一定であり、また好ましくは患者のサンプル中のアポＡ １と等価である参照物質（標準物質）を必要としていることによる。

最近、このアポＡｌの抗原的不均一性及び不安定性に関する問題を克服するため の努力は、その発現が特定の単離条件及び保存条件下で一定もしくは“保存”さ れている本来のアポＡｌ上のエピトープを同定するためにモノクローナル抗体（ ＭＡＢ）を用いる事に集中してきている。さらに、ここで”保存性エピトープ。

と呼ぶこれらのエピトープは、脱アミド化を起こすプロセス又は保存によっても ＨＤＬ上の発現が有意な影響を受けない、すなわち有意に増減しないアポＡｌエ ピトープとして定義される。

エピトープＡと命名される代表的保存性アポＡｌエピトープはミルソープ（Ｍｅ ｌｔｂｏｒｐｅ　）等により　（アルテリオ（Ａｒｔｅｒｉｏ、）、　　６゜２ ８５−２９６　　（１９８６））ＭＡＢ４Ｈ１と免疫反応するアポＡＴ　　ＣＮ Ｂｒ１の一部であると定義された。ミルソープ（Ｍｉｌｔｈｏｒｐ　）等による と、エピトープＡの発現は、４℃から一８０℃の温度で保存した愚者血清サンプ ル中で経時的に一定である。このことは、Ｃ，Ｃ’及びＣ＃と命令され、全てア ポＡｌのＣＮＢｒ２ｔ＋１域に存在するエピトープとは対照的である。すなわち これら全ては“非保存性”エピトープであり、その発現は同温度範囲の保存によ り有意に増減した。

（本発明の要約） 本発明は基本的に多くとも約４０残基のアミノ酸から成り、かつそのアミノ酸配 列の一部として、式：％式％ で表わされる配列を有するアポＡ１ポリペプチドに関する。

また、本発明は、 ｆａｌ　　アポＡｌ／ＨＤＬ （ｂｌ　　アポＡ１単離物 ｔｅｌ　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ１、及び（ｄ）　　ポリペプチド、 と免疫反応するが、 ｔｅｌ　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ２ ｆｆｌ　　７ボＡＩ　　ＣＮＢｒ３、 （幻　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ４、 （ｈｌ　　ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＩＩ　、及び＋ｉ＋　　ポリヘブ＋ 　）’　ＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡとは免疫反応しない抗アポＡｌ抗体分子を含む モノクロ−′ナル抗体に関する。

別の態様において本発明は、本質的にわずか約４０残基のアミノ酸から成り、か つそのアミノ酸配列の一部として式：％式％ で表わされる配列を有するアポＡ１ポリペプチドを少なくとも１回検定するのに 十分な量含むキット型の診断システムに関する。

また、本発明は、 ｆａｌ　　アポＡｌ／ＨＤＬ。

（ｂ）　　アポＡＩＪＩＩｉ物、 ｆＣ）　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ１、及び（ｄｌ　　ポリペプチドＤＥＰＰＱＳ ＰＷＤＲν［ｌＬＡと免疫反応するが、 ｔｅｌ　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ２、 ｆｆｌ　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ３、 （幻　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ４、 （〜　ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＭＩＤＲ、及び（ｉｌ　　ポリペプチドＱＳＰ ＷＤＩＩＩＶＫＤＬＡとは免疫反応しない抗アポＡｌ抗体分子を含むモノクロー ナル抗体を少なくとも１回検定するのに十分な量含むキー／　）型の診断システ ムに関する。

さらに本発明は、血液サンプル中のアポＡ１量の検定法であって、 （１）サンプルを、 （ａ）抗１ポＡｌモノクローナル抗体であって、（ｉ　）アポＡｌ／ＨＤＬ。

（ｉｉ）アポＡ１単離物、 （ｉＨ）アポＡＴ　　ＣＮＢｒ１、及び（ｉｖ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷ ＤＲＶＫＤＬＡ　。

と反応するが、 （ｖ）　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ２、 （ｖｉ）アポＡＩ　　ＣＮＢｒ３、 ｈｉ）アポＡＴ　　ＣＮＢｒ４、 （ｖｉ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＩｉ　、及び（ｉｘ　）ポリペプチド ＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡ、とは免疫反応しない抗体分子を有するモノクローナル 抗体と、及び （ｂ）本質的にわずか約４０残蟇のアミノ酸から成り、かつ、そのアミノ酸配列 の一部として、式： ％式％ で表わされる配列を有するアポへＩポリペプチドと、に混合することにより免疫 反応混合物を作り、（２）了ボＡｌ含有免疫反応生成物が生成するのに十分な時 間、該免疫反応混合物を維持し、そして （３）ステップ（２）で生成した生成物量を測定し、それにより血液サンプル中 のアポＡｌ量を測定する、 工程を含む方法に関する。この検定法において、工程（１）　（ａ）の抗７ボＡ Ｉ　　ＭＡＢはＭＡＢＡＩ−１６であり、がっ、工程（１）　（ｂ）のポリペプ チドは、式： ％式％ から成る群から選ばれたポリペプチドであることが望ましい。

（図のＦｉ！　ｊｉＬ　ｆｔ説明） 図は本開示の一部を形成する。

第１図は、プリューワー（Ｂｒｅｗｅｒ　）等により報告された（バイオケム・ バイオフィズ・リサーチ・コミニニケーシヲン（Ｂｉｏｃｈｅ＠。

Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｎｉ、　）　８０．６２３−６３０　（１ ９７Ｂ）　）アポＡＩ　　ＣＮＢｒ１のアミノ酸残基配列の残基値Ｎ１番から８ ６番までの配列を示している。

残基位置８６番に位置するメチオニン（Ｍ）残基での切断により生成するアポＡ Ｉ　　ＣＮＢｒ１はホモセリンラクトンに転換したカルボキシ末端メチオニンを 有する残基位置１番から８６番に相当する配列を有する。ＣＮＢｒ１のトリプシ ン切断で生成し、ＴＩからＴ４と命名される４個断片の位置及び断片Ｔ３のＢＮ ＦＳ−スカトールによる切断で生成し、Ｓｌと命名される１個の断片の位置も示 しである。

第２図は、アポＡｌ／Ｉ（ＤＬへのＭＡＢ　　Ａｌ−１６の結合を競合的に阻害 するアポＡｌ／ＨＤＬ、新鮮な血漿中に存在するＨＤＬ及びポリペプチドＡｌ　 ｌ−１５の能力を示している。タンパク賞濃度はマークウェル（Ｍａｒｋｗｅｌ ｌ　）等の方法（アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｓ＋、　）、　　８１．２０６−１２０（１９７８））に従って測定した。対 数〔ロジント（ｌｏｇｉｔ）　）変換したアポＡｌ（Δ）、血漿（０）及びポリ ペプチドＡｌ　ｌ−１５（・）のデータは各々−１，９６、−２，４７、及び− ２，６０の勾配を与えた。

第３図はＭＡＢ　　Ａｌ−１６に対する各ポリペプチドＡＩ　１−１０、Ａｌ　 ｌ−１５、Ａｌ１−２１及びＡ１５−１５の免疫活性〔例６で述べられている固 相競争ＲＩＡにおける抗体結合の５０％阻害に要するペプチドのモル濃度（Ｍ） 値（ＩＤｓｅ））を示している。ＩＤ、。値は対数（１ｏｚｆｔ　）変換競合曲 線の直線回帰解析により得られ、これらはこの図の上部に示されている。ペプチ ドＡｌ　ｌ−１５及びＡｌ１−２１に対するＭＡＲＡｌ−１６の親和性は、これ らのペプチドにより生成した対数変換直線の勾配が各々−２，６０及び−２，５ ７であったことから本質的に同一であると測定された。１１合ペプチドの濃度は 第２図で述べられている方法により測定し、１リットル当りのモル数（ｗ＋Ｍ　 ）で示されている。

（本発明の詳細な説明） Ａ、定義 （アミノ酸）ここで同定される全てのアミノ酸は天然のＬ型のものである。標準 的ポリペプチド命名法に従かい（ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリ ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、　）、　　２４３　。

３５５７−５９　（１９６９）　）、アミノ酸残基の略号は以下の対応表に示さ れているものを使用した。

（対応表） Ｙ　　　　Ｔｙｒ　　　　　　Ｌ−チロシンＧ　　　　Ｇａｙ　　　　　　グリ シンＦ　　　　　Ｐｈｅ　　　　　　Ｌ−フェニルアラニンＭ　　　　Ｍｅｔ　 　　　　　Ｌ−メチオニンＡ　　　　Ａｌａ　　　　　　Ｌ−アラニンＳ　　　 　Ｓｅｒ　　　　　　Ｌ−セリンＩ　　　　　Ｉｃｅ　　　　　　Ｌ−イソロイ シンＬ　　　　　Ｌｅｕ　　　　　　Ｌ−ロイシンＴ　　　　Ｔｈｒ　　　　　 　Ｌ−スレオニンＶ　　　　Ｖａｌ　　　　　Ｌ−バリンＰ　　　　　Ｐｒｏ　 　　　　　　Ｌ−プロリンＫ　　　　Ｌｙｓ　　　　　　Ｌ−リジンＨＨｉｓ　 　　　　　Ｌ−ヒスチジン Ｑ　　　　Ｇｉｎ　　　　　　Ｌ−グルタミンＥ　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　 Ｌ−グルタミン酸ＷＴｒｐＬ−）リプロファン ＲＡｒｇ　　　　　　Ｌ−アルギニン Ｄ　　　　　Ａｓｐ　　　　　　Ｌ−アスパラギン酸Ｎ　　　　Ａｓｎ　　　　 　　Ｌ−アスパラギンＣＣｙｓ　　　　　　Ｌ−システィン 全てのアミノ酸残基配列は左から右に従来のアミノ末端からカルボキシ末端の方 向で書かれた式で表わされていることに注意せよ、さらに、アミノ酸残基配列の 始め又は終りのダフシはそのポリペプチド鎖における計約５０残基までの１個以 上のアミノ酸残基からなる配列への結合を示している。

（アポＡｌ／ＨＤＬ）アポＡｌ／ＨＤＬはＨＤＬ粒子上に存在する場合のアポＡ ｌを意味している。

（脱脂アポＡｌ）脱脂アポＡｌは実質的に会合した脂質を持たないアポＡｌを意 味している。

（単離アポＡｌ）単離アポＡｌは、一般的にアポＡｌに加えてＨＤＬ上に存在す るアポＡＩ［のような他のタンパク質及び会合した脂質の両方を実質的に含まな いアポＡ１を意味している。

（ポリペプチド及びペプチド）ポリペプチド及びペプチドとは隣り合うアミノ酸 残基のα−アミノ基及びカルボキシ基間のペプチド結合により互いに連結した多 くとも約４０残基の一連のアミノ酸を意味し、ここでは同義的に用いられている 語である。

（タンパク質）タンパク質とはポリペプチドと同様に互いに連結した約５０残基 以上の一連のアミノ酸を意味して用いられる語である。

Ｂ、ポリペプチド ここで用いられているように、°アポＡｌポリペプチド”という語句はアポＡ１ 分子の一部と相同的（構造がＩＩしている）なアミノ酸残基配列を有するポリペ プチドを意味している。

１つの態様において、本発明のアポＡｌポリペプチドは基本的に少なくとも約１ ５残蟇でかつわずか約４０残基のアミノ酸、好ましくは多くとも約２５残基のア ミノ酸からなり、かつその配列の一部として式−ＤＥＰＰＳｌｌＰＷＤＲＶＩ［ ｌＬＡ　−ｒ表わされる配列を有する。

別の！Ｓ様において、本発明のアポＡｌポリペプチドは本質的に少なくとも約１ ５残基でかつわずか２５残基、好ましくはわずか約２１残基のアミノ酸から成り 、かつその配列の一部として、式ニー　ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡＴＶＹ ＶＤＶ　−ニよっＴ表わされる配列を有する。

好ましいアポＡｌポリペプチドを第１表に示す。

第１表 名称１　　　　　アミノ酸残基配列 Ａ　Ｉ　１−１５　　　　ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡＡ　１１−２１　　 　　ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡＴＶＹＶＤＶｌ、　ここで用いている各ポ リペプチドの名称は、そのポリペプチドのアミノ酸残基配列が由来するアポＡｌ タンパク質中の対応する残基を示している。

さらに本発明のアポＡｌポリペプチドは、実質的に全てのＨＤＬ上に存在するア ポＡ１により発現されるエピトープ（抗原決定基）を免疫学的に真憤る能力を特 徴とすることが望ましい。

また、ここで本ポリペプチドと呼ばれる本発明のアポＡ１ポリペプチドは、組換 えＤＮＡ技術を含むポリペプチド分野でよく知られている技術により合成し得る 。メリフィールド型の固相合成等の合成化学技術は純度、抗原特異性、不都合の 副産物がないこと、生成の容易さなどの理由で好ましい、使用可能な多くの技術 の秀れた概説は、固相ペプチド合成に関してはＪ、Ｍ、スチュヮード（Ｓｔｅｗ ａｒｄ　）及びＪ、　Ｄ、ヤング（Ｙｏｕｎｇ　）　、　　＠固相ペプチド合成 ”、ｗ、Ｈ，フリーマン版、サンフランシスコ、１９６９；Ｍ、ボダンスキ−（ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　）等、′ペプチド合成ｚｉン・ウィリー・アンド・ヤング （Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　）版、第２＆１１１９７６及びＪ、マ イエンホーフｙ−（Ｍｅｉｅｎｂｏｆｅｒ　）＋　　”ホルモンタンパク質及び ホルモンペプチド９、第２巻、第４６頁、アカデミツクブレス版にューヨーク） 、１９８３及び古典的溶液合成に関してはＥ、シュローダ−（５ｃｈｒｏｄｅｒ 　）及びに、クプケ（Ｋｕｂｋｅ　）　　”ペプチド°、第１巻、アカデミツク ブレス版（二ニーヨーク）、１９６５に見ることができる。これらは参考とじて ここで引用している。これらの合成に使用し得る過当な保護基は前記テキスト及 び参考として引用するＪ、Ｆ、Ｗ、マコーミ−（ＭｃＯｍｉｅ　）　’育機化学 における保ｆｉ基”、プレナムプレス版、ニューヨーク、１９７３に述べられて いる。

一般に関連する固相合成法は成長するペプチド鎖に１個以上のアミノ酸残基又は 過当に保護したアミノ酸残基を順次付加していくことを含む、通常第１番目のア ミノ酸のアミノ基又はカルボキシ基のいずれかが選択的に除去し得る適当な保護 基で保護されている。リジンなどの反応性側鎖を含むアミノ酸に対しては別の除 去し得る保護基が使用される。

例として固相合成を用いる場合は保護又は誘導化したアミノ酸をその非保護のカ ルボキシル基又はアミノ基を介して不活性な固体サポートに結合する。それから そのアミノ基又はカルボキシル基の保護基を選択的に除去した後、適当な保護を 行った相補的（アミノ又はカルボキシル）基を有する配列上次のアミノ酸を加え 、固体サポートにすでに結合している残基とアミド結合を形成するのに適した条 件下で反応させる。ついでアミン又はカルボキシル基の保護基を新しく付加した アミノ酸残基から除去した後、その次のアミノ酸（適当に保護したもの）を加え て、これらの操作を繰り返していく、全ての望ましいアミノ酸を適当な配列で結 合した後すべての末端及び側鎖の保護基（及び固体サポート）を順次又は一度に 除去し最終的ポリペプチドを得る。

本ポリペプチドはこれが必要とされる配列を含み、かつアポＡｌと免疫反応する 抗体と免疫反応し得る限り、アポＡｌのアミノ酸残基配列と同一である必要はな いことを理解すべきである。

従って保存的にしろ非保存的にしろそれらの使用に特定の利点を提供しうる変化 であるアミノ酸の置換も考え得る。保存的置換とは生物学的に類イ以する残基へ のアミノ酸置換である。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン 又はメチオニンのような疎水性残基間の置換又はアルギニンとリジン間、グルタ ミン酸とアスパラギン酸間、又はグルタミンとアスパラギン間など極性残基間の 置換が含まれる。また“保存的置換′という語句には、ポリペプチドが必要とさ れる結合活性を示すならば未置換アミノ酸の代りに置換アミノ酸を使用すること も含まれる。

本発明のポリペプチドが１個以上の保存的又は非保存的置換が行なわれているた めアポＡ１の配列と同一ではない配列を有する場合、本発明のポリペプチドをラ ベル又は固体マトリクス又はキャリヤーに簡便に結合し得る１リンカ−”でその リンカ−残基が７ポＡ　Ｉエピトープを形成しない、すなわちアポＡｌに構造が 類領していないリンカ−を提供する目的でいずれかの末端に別の残基を付加する 場合の残基位置９９番のプロリン残基は置換又は欠失し得ないという条件でそれ らアミノ酸残基の通常わずか約３０パーセント、より一般的にはわずか２０パー セント、好ましくはわずか１０パーセントが置換されている０本発明のポリペプ チドに使用し得るラベル、固体マトリクス及びキャリヤーは以下に説明する。

通常アミノ酸残基リンカ−は少なくとも１個の残基であり、また４０個以上の残 基であることも可能であるが、より一般的には１から１０個の残基であり、アポ Ａ１エピトープを形成しないものである。リンカ−に使用される典型的アミノ酸 残基はチロシン、システィン、リジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等であ る。

さらに本ポリペプチドは特に指定されない限り、例えばアセチル化又はチオグリ コール酸アミド化等の末端Ｎ　Ｈｚアシル化、アンモニア、メチルアミン等によ る末端カルボキシルアミド化等による修飾されることにより天然のアポＡＩと配 列が異なり得る。

キャリヤーに結合し、当分野でキャリヤー−ハプテン結合体として知られている 物を生成するとき、本発明のアポＡ１ポリペプチドはアポＡ！、好ましくはＨＤ Ｌ粒子の一部を成すアポＡＴ（アポＡｌ／ＨＤＬ）と免疫反応する抗体を含み得 る。免疫学的交叉反応性の原則からみて、本発明は第１表に示したポリペプチド の抗原的関連変異体に関する。“抗原的に関連する変異体”とは少なくとも約１ ５残基でかつわずか約４０残基を含み、かつ配列ＤＥＰＰＱＳＰｉＲＶｌ［ｌＬ Ａを含み、かつ第１表のポリペプチド及びアポＡｌと免疫反応し得る抗体分子を 含み得るポリペプチドである。

Ｃ９抗体及びモノクローナル抗体 種々の文法型の“抗体°という語は一部の免疫グロブリン分子及び、又は免疫グ ロブリン分子の免疫学的活性部分すなわち抗体結合部位又はパラトープを含む分 子を意味する集合名詞としで用いられている。

“抗体結合部位”とは抗原を特異的に結合する重鎮及び軽鎖の可変及び超可変領 域を含む抗体分子の構造部分である。

ここで用いている種々の文法型の°抗体分子”という語句は本来の免疫グロブリ ン分子及び免疫グロブリンの免疫学的活性領域の両方を意味している。

代表的抗体分子とは本来の免疫グロブリン、実質的免疫グロブリン及び当分野で Ｆａｂ、　Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）ｚ及びＦ　（Ｖ）として知られている領域を 含むバラトープを有する免疫グロブリン分子の一部である。

抗体のＦａｂ及びＦ　（ａｂ　’　ＬｔＪ域は、従来法を用いた実質的抗体の各 々パパイン及びペプシンによるタンパク質分解で調製される。

例えばチオフィロポラス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ　）及びディクソン（ Ｄｉｘｏｎ　）の米国特許第４，３４２，５６６号参照、また、Ｆａｂ’抗体領 域もよく知られておりＦ（ａｂ’）ｚ領域のメルカプトエタノール等による二本 の重鎮領域を結ぶジスルフィド結合の還元及びそれにつづく生成したタンパク質 メルカプタンのヨードアセトアミド等の試薬によるアセチル化により生成する０ 本来の抗体分子を含む抗体の方が好ましいのでここでは説明してこれを使用する 。

本発明のポリクローナル抗体は、１）わずか２５残基のアミノ酸を含む本ポリペ プチド、及び２）アポＡＴ／ＨＤＬと免疫反応し得ることを特徴とする。さらに 本発明のポリクローナル抗体は了ボＡＩ　　ＣＮＢｒ２、ＣＮＢｒ３及びＣＮＢ 　ｒ　４と免疫反応する抗体分子を実質的に含まないことを特徴とする。

種々の文法型の”モノクローナル抗体”という語句は特定の抗原と免疫反応し得 る唯１種の抗体結合部位を含む一部の抗体分子を意味する。従つて、一般にモノ クローナル抗体はそれが免疫反応する抗原に対する単一の結合親和性を示す、そ れゆえモノクローナル抗体はその各々が異なる抗原に免疫特異的な抗体結合部位 を複数含む抗体分子、例えば二特異的モノクローナル抗体も含み得る。

本発明のモノクローナル抗体（ＭＡＢ）（本ＭＡＢ）は、ｔｅｌ　　アポＡｌ／ １（ＤＬ へ）　アポＡ１単離物 ｔｅｌ　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ１、及びｉｄｌ　　ポリペプチド　Ａｌ１−１ ５、と免疫反応するが、 （ｅｌ　　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ２、 ｆｆｌ　　アポＡＴ　　ＣＮＢｒ３、 （幻　アポＡＩ　　ＣＮＢｒ４、 （（転）　ポリペプチドＡｌ　ｌ−１０、及び＋＋１　　ポリペプチドＡｌ５− １５、とは免疫反応しないことを特徴とする。

本発明の好ましいＭＡＢはアポＡｌ／ＨＤＬと免疫反応し、そしてアポＡＴ／Ｈ ＤＬ及びポリペプチドＡｌ１−１５に対する免疫反応性の比は、約１：５から約 ５：１、好ましくは約１：２．５から約２．５：１そしてより好ましくは約１． ５：１から約１＝１．５の範囲の僅を示す。

ここで用いられているように、種々の文法型の°免疫反応性”という語は所定量 の抗体及び所定量のアポＡｌ／ＨＤＬ間の免疫反応の５０％を阻害するのに必要 な抗原濃度を意味する。すなわち免疫反応性とは０．５０Ｂ　／　Ｂ　ｏ値（Ｂ ｏは競合抗原非存在下で結合する抗体の最高値であり、並びにＢは競合抗原存在 下で結合する抗体量である。双方ともバックグランド補正したものである）を与 えるのに必要な抗原濃度である。ロンドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ　）、クリニカ ルケミストリー（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅ＋ｍ、　）　、　　２０．　１２５５−１ ２７０　（１９７４）参照。

本発明のモノクローナル抗体は天然のアポＡＴ／ＨＤＬ及びポリペプチドＡｌ１ −１５に対し同一（区別できない）の親和性を有することがより望ましい、すな わち好ましいモノクローナル抗体は、別々に測定した時、統計解析でＰ　＜　０ ．１、好ましくはＰ〈０．０５、より好ましくはＰ＜０．０１の信頼度で区別で きない（等価である）ポリペプチドＡｌｌ−１５に対する親和性を宵している。

抗原に対するモノクローナル抗体の親和性の測定法及びそれらの親和性の比較法 は当分野ではよく知られている０例えばミニーシー（Ｍｕｌｌｅｒ　）％ジャー ナル・オプ・イムノロジカル・メソフズ（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、 　）　　３４．　３４５−３５２　（１９８０）及びソカル（５ｏｋａｌ　）等 、バイオメトリー（Ｂｉｏｍｅｔｒｙ　）、　Ｗ、　Ｈ，フリーマン版（１９８ １）参照、モノクローナル抗体の親和性の好ましい測定法は平衡競争阻害分析に よるものである。この方法では、特徴であるモノクローナル抗体への結合に対す るアポＡＩ／ＨＤＬ及びアポＡｌ／ＨＤＬと競合するポリペプチドＡ１１−１５ の能力を測定し、かつ比較する。トサオ（丁ｓａｏ　）等、ジャーナル・オブ・ バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ■、）。

２５７．１５２２２−１５２２８　（１９Ｂ２）参照。

例えばモノクローナル抗体によって示されるアポＡｌ／）（ＤＬ及びポリペプチ ドＡｌ１−１５への親和性が同じく区別できない）かどうかの測定は以下のよう に行ない得る。

（ａ）液相競合体として存在するポリペプチドＡｌ１−１５の存在下既知量のモ ノクローナル抗体が固相のアポＡｌ／ＨＤＬに結合する割合を種々の競合体濃度 で測定する。それから各結合率測定値の対数（ｌｏｇｉｔ　）変換値を競合体（ 液相ポリペプチド）濃度に対してプロットする。　　（ｌｏｇｉｔ（Ｙ）ｌｏｇ 　ｅ　Ｙ／　１−Ｙ）（Ｙは所定量の競合体存在下におけるモノクローナル抗体 の結合パーセント）〕。

（ｂ）ステップ（ａ）と同量のモノクローナル抗体を用い、液相競合体として存 在するアポＡｌ／ＨＤＬの存在下、固相アポＡｌ／）（ＤＬに結合する抗体の割 合をステップ（ａ）と同じ競合体濃度で測定する。それから各結合率の対数変換 値を競合体（液相アポＡ　Ｉ／ＨＤＬ）ｆｉ度に対してプロットする。

（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で得られた各プロットについて直線回帰解析を 行ない各々の勾配を得る。

（ｄ）アポＡｌ／ＨＤＬ及びポリペプチドＡｌ　ｌ−１５について得られた勾配 を、ソカル（５ｏｋａｌ　）等、（上述、ｐ４８５、ボックス１４．５）が述べ た勾配等個性テストを用いて比較する。

一般的に抗体分子そのものを含む本モノクローナル抗体はナイマン（Ｎｉｍａｎ 　）等（参考として引用するプロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ、主０．４９４９−４９５３　（１９８３））により報告さ れているポリペプチド誘導ハイプリドーマ技術を用いて調製し得る。Ｎ阜に言う とモノクローナル抗体組成物を生成するハイプリドーマを作るためにミエローマ 又はその他の自己増殖細胞系列を本発明のポリペプチドで高度免疫化した哺乳類 のＮｉｌから得られるリンパ球と融合する。

このミエローマ細胞系列は、リンパ球と同じ種に由来する方が好ましい、一般的 にマウスの１２９　Ｇｌｘ”株が好ましい哺乳類である０本発明で用いるのに適 したマウスミエローマにはヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン惑受性（ ＨＡＴ）細胞系列のＰ３Ｘ６４−Ａｇ８．６５３及びＳｐ　２１０−Ａｇ　１４ があるが、これらは各々ＣＲＬ１５８０及びＣＲＬ１５８１という名称でアメリ カン・タイプ・カルチ十−・コレクシツン（メリーランド州、ロックビル）から 入手し得る。

一般的に肺細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０００を用いてミエロー マ細胞に融合される。融合した細胞はＨＡＴに対する感受性で選択する０本発明 のモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマは例６で述べられているラジオ イムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）を用いて同定する。

本発明のモノクローナル抗体は適当なポリペプチド特異性をもつ抗体分子を分泌 するハイプリドーマを含む栄養培地からモノクローナルハイプリドーマ培養を開 始しする。この培養をハイプリドーマが培地中に抗体分子を分泌するのに十分な 条件及び時間維持する。それから抗体を含む培地を回収する。さらに抗体分子は 従来技術により隼離し得る。

これらの組成物を調製するのにを用な媒体は当分野でよく知られていると同時に 市販されており、それらには合成培養培地、近文系マウス等が含まれる０代表的 合成培地にはダルベツコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ：ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃ ｏ　）等ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）　　８．３９６　（１９５９）に４ ．５ｇ／Ａグルコース、２０ｍグルタミン及び２０％ウシ胎児血清を補つたもの がある。

代表的近文系マウスにはＢａ１ｂ／ｃ株がある。

上述の方法で生産したモノクローナル抗体は例えばアポＡｌ含有免疫反応産物の 生成をａ・要とする診断及び治療法に使用し得る。

本モノクローナル抗体、すなわちＭＡＢＡ＋−１６の生産にを用なハイプリドー マはハイプリドーマ１（１３１Ｅ４であり、該ハイプリドーマは１９８８年３月 ２９日、ブタペスト協定に従かいアメリカン・タイプ・カルチ中−・コレクシラ ン（ＡＴＣＣ）（米国ＭＤ州コロツクビル　０８５２）に登録されＡＴＣＣ名が 与えられている（）、ハイプリドーマ（）は当分野でよく知られているように本 モノクローナル抗体を生産する他の不朽細胞系列を生成するのに用い得る。従っ て本モノクローナル抗体の生産はＡＴＣＣによるハイプリドーマ培養に依存する わけではない。

Ｄ０診断システム 本発明のキット型の診断システムには、少なくとも１回の検定を行なうのに十分 な量の本アポＡｌポリペプチド及び、又は本モノクローナル抗体が別々にパフケ ージされた免疫化学試薬の形で含まれている。また、一般的にパンケージした免 疫化学試薬の使用説明書も含まれている。

ここで使用されているように、“パフケージ”という梧は所定量以下の本発明の ポリペプチド、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を保持し得るガラス 、プラスチック、紙、ホイル等の固体マトリクス又は固体物質を意味する。従っ て、例えばパフケージはミリグラム量の本ポリペプチドを入れるのに用いるガラ スバイアルでもよいし、またマイクロプレートの本ポリペプチドを機能的に固定 した、すなわち抗体により免疫学的に結合され得るように結合したマイクロプレ ートのウェルもパンケージとなり得る。

一般に”使用説明書°には試薬の濃度又は少なくとも１回の検定を行なう際の混 合する試薬及びサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の保持時間、温度、バ ッファ条件等のパラメータを記述した明確な発現が含まれる。

好ましい態様において、本発明の診断システムはさらに本発明のポリペプチド又 は抗体分子を含む複合体の生成を知らせ得るラベル又は指示手段を含んでいる。

ここで用いられている“複合体゛という語は抗体−抗原、又はレセプター−リガ ンド反応などの特異的結合反応の産物を意味する０代表的複合体は免疫反応産物 である。

ここで用いられている種々の文法型の“ラベル”及び”指示手段”という語は検 出し得るシグナルの生成に直接又は間接的に関与し複合体の存在を指示する単− 原子及び分子を意味する。いずれもラベル又は指示手段も発現したタンパク質、 ポリペプチド又は本発明の抗体の一部又はモノクローナル抗体組成物である抗体 に結合するか又はその中に取り込まれているが、もしくは別々に用いられる。そ してこれらの原子又は分子は単独か又は他の試薬と合せて用い得る。これらのラ ベルはそれ自体、臨床診断化学の分野ではよく知られており、それらが他所で述 べている新しいタンパク質の方法及び、又はシステムで使用されている場合に限 り本発明の一部を構成する。

抗体又は抗原を変性することなしに化学的に結合し、有用な免疫螢光トレーサー となる螢光色素を形成する螢光ラベル剤もラベル手段となり得る０適当な螢光ラ ベル剤とはフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオ シアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフサレンスルホニルクロ ライド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴ Ｃ）　、リザミン、ローダミン８２００スルホニルクロライド（ＲＢ２００ＳＣ ）等の螢光色素である。免疫螢光分析技術の説明はデル力（Ｄｅｌｕｃａ　）　 　“免疫螢光分析°（°道具としての抗体′）、マージャロニス（Ｍａｒｃｈａ ｌｏｎｉｓ　）等線、ジョンウィリー・アンド・サンズ版１８９−２３１頁（１ ９−８２）（参考として引用する）に見られる。

好ましいＭ祿における指示グループにはホースラディシュバーオキシダーゼ（Ｈ ＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等の酵素がある。基本的な指示グループがＨＲ Ｐ又はグルコースオキシダーゼ等の酵素であるような場合には、レセプター−リ ガンド複合体（免疫反応物）が生成した事を可視化する付加試薬が必要である。

ＨＲＰ用の付加試薬には過酸化水素及びジアミノベンジジンのような酸化色素前 駆体が含まれる。グルコースオキシダーゼに有用な付加試薬は２．２′−アジド −ジー（３−エチル−ベンズチアプリン−〇−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である 。

また、放射性元素もを用なラベル化剤であり、ここでの説明に用いている０代表 的ラジオラベル化剤はガンマ線を放出する放射性元素であるａ　　”’１％　　 ”’１％　　””Ｉ、＋ｓｔ■及び”Ｃｒｔ！どのそれ自身がガンマ線を放出す る元素は一部のガンマ線発生放射性元素指示グループを形成している。特に１２ ５１が好ましい。もう１つの有用なラベル手段グループにはそれ自身陽電子を発 生するＩＩＣ，ＩＩＦ、ＩＩＣ及び１３Ｎなどの元素がある。そのように発生す る陽電子は動物の体内に存在する電子と衝突してガンマ線を生成する。また、Ｉ Ｉ＋インジウス又は３Ｈのようなベータ発生物も有用である。

ラベルの結合、すなわちポリペプチド及びタンパク質のラベル化は当分野ではよ く知られている０例えばハイブリドーマによって生産された抗体分子は培養培地 中の成分として提供される放射性同位元素含有アミノ酸の代謝的取込みによりラ ベル化し得る。

例えばガルフレ（Ｇａ１ｆｒｅ　）等、メソソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍ ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｗ＋ｏ１．　）　、７３．３−４６　（１９８１）参照。

活性化した官能基を介するタンパク質の結合又はカンプリング技術も特に有用で ある０例えばオーラメアス（Ａｕｒａｍｅａｓ　）等、スカンジナビアン・ジャ ーナル・オブ・イムノロジー（５ｃａｎｄ、　Ｊ。

１ｍ＋＊ｕｎｏ１．　）　、８−１補７．７−２３　＜１９７８）　、ロンドウ エル（Ｒｏｄｗａｌｌ　）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｂ、　）　、 ３．８８９−８９４　（１９８４）及び米国特許第４．４９３，７９５号参照。

また診断システムは好ましくは別のパンケージとして特異的結合試薬を含み得る ・“特異的結合試薬”とは本発明の試薬又はこれらの試薬を含む複合体を選択的 に結合し得る分子であるがそれ自身は本発明のポリペプチド又は抗体分子組成物 ではない。代表的特異的結合試薬は第２の抗体分子、補体タタンパク質又はその 断片、Ｓ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ　）タンパク質Ａ等である。この特異的結 合試薬は、本発明の試薬が複合体の一部として存在するときその試薬と結合する ことが望ましい。

好ましい態様においては特異的結合試薬はラベル化されている。

しかし診断システムがラベル化されていない特異的結合試薬を含むとき、一般的 にこの試薬は増巾手段又は増巾試薬として使用される。これらの８様においてラ ベル化した特異的結合試薬はその増巾手段が本発明の試薬を含有する複合体に結 合したときその増巾手段を特異的に結合し得る。

本発明の診断キットは°ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　’様式で使用し、血液、血清又は面素 などの血液サンプル中のアポＡ１量を検出し得る。

”ＥＬｌＳＡ”とは面相に結合する抗体又は抗原及び酵素−抗原又は酵素−抗体 結合体を使用し、サンプル中に存在する抗原の検出及び定量する酵素結合免疫吸 着検定法である。ＥＬＩＳＡ技術の説明はり、Ｐ、サイフ（５ｉｔｅｓ　）等の “基礎及び臨床免疫学”、１９８２年ＣＡ州ロスアラモスのレンジメディカル出 版発行、第４編第２２章、及び米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０ ，７５２号及び第４，０１６，０４３号に見られる（これらは全て参考として引 用したものである）。

このように、好ましい態様において本発明のアポＡｌポリペプチド又はモノクロ ーナル抗体は固体マトリクスに固定し、本診断システム中の１つのパフケージに 含まれる固体サポートを生成し得る。

一般的に試薬は水性媒体からの吸着により固体マトリクスに固定されるが当分野 でよく知られているタンパク質及びポリペプチドに通用し得るその他の固定様式 も使用し得る。

また有用な固体マトリクスも当分野ではよく知られている。これらの物質は非水 溶性であり、またこれらにはファルヤシアファインケミカルズ（ＮＪ州、ピスカ タウエイ）から商標ＳＥＰＩ（ＡＤＨＸの名で市販されている架橋デキストラン 、アガロース、ＩＬ州北シカゴのアボンドラボラトリーズ社から市販されている 約１ミクロンから約５ミリメートル径のポリスチレンビーズ、シート、テープ又 はヘラ状のポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋アクリルアミド、ニトロセルロ ース又はナイロン製の生地、ポリスチレン又はポリ塩化ビニル製のチェーブ、プ レート又はマイクロプレートのウェルが含まれる。

ここで述べている診断システムの試薬、ラベル化した特異的結合試薬又は増巾試 薬は、溶液、液体分散物又は例えば凍結乾燥体のような実質的な乾燥粉末の形で 提供し得る。指示手段が酵素の場合、その酵素基質もこのシステムの別のパンケ ージで提供され得る。前述のマイクロプレートのような固体サポート及び１つ以 上のバッファも本診断検定システムの別にパッケージされた要素として含み得る 。

診断システムに関し、ここで議論されているバンキング材は診断システムで一般 に使用されているものである。これらには、ガラス及びプラスチック製（例えば ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート製）の瓶、バイアル、プラ スチック及びプラスチックホイルコート化包装材等が含まれる。

Ｅ、検定法 本発明は免疫化学反応試薬として本発明のポリペプチド、ポリクローナル抗体、 又はモノクローナル抗体を用い、その量がサンプル中のアポＡｌ量に直接的又は 間接的に関係する免疫反応産物を生成させて、生物学的液体サンプル中のアポＡ １を定量する種々の免疫検定法に関する。当業者は、本発明の免疫化学試薬を身 体サンプル中に存在するアポＡｌ量に関係する免疫反応産物を生成するのに使用 し得る多くの従来の臨床診断化学的方法があることを理解できるであろう、従っ て、ここでは代表的検定法について述べるが、本発明はこれに制限されるもので はない。

競合的又は非競合的な不拘−及び均一操作法が本発明の検定法を行う上で採用し 得る０例えば本発明は以下のステップを含む血液サンプル中のアポＡｌ量を検定 する競合的方法に関する；（Ｍｌ　　液液サンプルを、 （１）本発明のモノクローナル抗体、好ましくはＡｌ−１６、及び （ｉｉ）本発明のアポＡ１ポリペプチド、好ましくはＡ１１−Ｉｓ又はＡｌ１− ２１、 と混合して免疫反応混合物を作る。

血液サンプルは、既知量の血液又は血清又は血漿など血液由来産物として提供さ れるのが好ましい、使用するサンプルのタイプに関係なく、当分野で知られてい るようにサンプルは少なくとも約１２時間絶食したヒトから入手することが好ま しい。

このようなサンプルは°絶食サンプル９と呼ぶ、また、血清又は血漿をサンプル として用いる場合、検定するアポＡｌエピトープの発現を修正する目的でそのサ ンプルを変性剤で処理する必要はないことが注目される。

混合するモノクローナル抗体量は既知であることが望ましい。

さらにモノクローナル抗体がラベル化、すなわち、酵素、放射性核種などの指示 手段に機能的に結合されている態様が望ましい。

アポＡｌポリペプチドは、固体サポートの一部、すなわち固体マトリクスに機能 的に結合して存在し、その結果生成する免疫反応混合物は、固相及び液相を有す る方が好ましい、さらに免疫反応混合物中に存在するポリペプチド量がそのエピ トープと免疫反応し得る免疫反応混合物中に存在する抗体結合部位数と比較して 過剰のエピトープを形成するのに十分な量で存在することが望ましい。

（ｂ）　　その免疫反応混合物を約４℃〜約５，４５℃の温度で、サンプル中に 存在するアポＡ１がモノクローナル抗体中に存在する抗アポＡｌ抗体結合部位の 一部と免疫反応（免疫学的に結合）し、アポＡｌ含有免疫反応産物を形成するの に十分な時間である約１０分から約１６〜２０時間等所定の時間、生物学的検定 条件下に維持する。

生物学的検定条件とは本発明の免疫化学的試薬及び検定するアポＡｌの生物学的 活性を維持する条件である。これらの条件には、約４℃〜約４５℃の温度範囲、 約５〜約９のｐＨ範囲及びＷＷ水から約１モル濃度の塩化ナトリウム溶液のイオ ン強度範囲が含まれる。これらの条件を至適化する方法は当分野ではよく知られ ている。

（Ｃ）　　生成したアポＡｌ含有免疫反応産物の量を測定し、それによりサンプ ル中のアポＡｌ量を測定する。

直接的又は間接的なアポＡｌ含有免疫反応産物の定量は一般に使用する指示手段 のタイプに依存する、当分野でよく知られている検定法で行ない得る。

好ましい競合検定法の場合、ステップ（Ｃ）で測定する生産物量は血液サンプル の代りに、既知量の本ポリペプチド、好ましくはＡｌ　ｌ−１５又はＡｌ１−２ １を含むコントロールサンプルを用い同様に生成させ、かつ定量した免疫反応産 物量に関係している。

別の態様において、本発明は次のステップを含む二重抗体又は１サントイフチ９ 免疫検定法に関する。

（５１）　　血液サンプルを第１の抗体、好ましくはモノクローナル抗体と混合 して、抗体とサンプル中に存在するアポＡＴ／ＨＤＬが本モノクローナル抗体、 好ましくはＭＡＢＡＩ−１６と免疫反応し得る第１の免疫反応産物を作り得る第 １の免疫反応混合物を作る。第１の抗体は固体マトリクスに機能的に結合してい ることが望ましい。

伽〕　このようにして生成した第１の免疫反応混合物を第１の免疫反応産物が生 成するのに十分な時間、生物学的検定条件に維持する。それから第１の免疫反応 産物をサンプルから分離することが望ましい。

ｌｃ）　　第１の免疫反応産物を、 （ｉ）本発明のモノクローナル抗体、好ましくはＭＡＢＡＩ−１６、及び （ｉｔ　）本発明のアポＡ１ポリペプチド、好ましくはＡｌ　ｌ−１５又はＡｌ １−１２ （ステップ（ｉｉ）はステップ（ｉ）の前か又は実質的に同時、すなわち約５〜 ｌＯ分以内、好ましくは約１〜２分以内に行うことが望ましい） と混合することにより第２の免疫反応混合物を作る。

（ｄｌ　　このようにして生成した第２の免疫反応混合物を第２の、又は“サン ドインチ”免疫反応産物を生成するのに十分な時間、生物学的検定条件に維持す る。

（ｅ）　　生成した第２の免疫反応産物を定量し、それによりサンプル中のアポ ＡＴを定量する。

ステップ（ｃ）（ｉ）の本モノクローナル抗体は、好ましくは酵素等でラベル化 されており、従って生成する第２の免疫反応産物はラベル化されていることが望 ましい。

好ましい二重抗体検定法において、二重抗体法のステップ（ｅ）で測定した免疫 反応産物の量は血液サンプルの代りに既知量の本ポリペプチド、好ましくはＡｌ １−１５又はＡｌ１−２１を含むコントロールサンプルを用いて同様に生成し、 かつ定量した免疫反応産物量に関係している。

例 以下の例は本発明を説明するものであって、これを制限するものではない。

】、抗原の調製 Ａ、ポリペプチド ポリペブチドＡｌ１−１０、Ａｌ１−１５、Ａｌ１−２１及びＡｌ５−１５はモ デル４３０人自動ペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ、ＣＡ州フォス ターシティ）を使用し、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）（アドパン ストエンザイモロジ−（Ａｄｖ。

ＥｎｚｙＩｌｏｌ、　）　　３２．２２１−９６　（１９６９））により報告さ れている古典的固相法を用いて合成した。ペプチドレジンはフン化水素で切断し 、抽出後、逆相Ｃ１８カラムを使用した高速液体クロマトグラフィーにより純度 を確認した（つを−ターズアソシエーツ、ＭＡ州ミルトート）。

ペプチドＡｌ１−１５及びＡｌ１−２１のアミノ酸残基配列は先の第１表に示し た。ポリペプチドＡｌ１−１０及びＡｌ１５−１５の配列を以下の第２表に示す 。

Ａ　Ｉ　１−　］　ＯＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＡ　Ｉ　５−１５　　　　　　ＱＳ ＰＷＤＲＶＫＤＬＡＢ、アポＡｌ／ＨＤＬの調製 ＨＤＬは地方血液バンク（ＣＡ州、サンディエゴ、サンディエゴプラズマセンタ ー）の正常絶食提供者血液のプラズマフェレシスによって得た血漿から単離した 。この目的のため、このようにして得た血漿を最終濃度５ミリモル濃度（−Ｍ） ベンズアミジン、１１ジイソプロピルフルオロホスフエート、１０ｍ？！エチレ ンジアミン四酢＃　（ＥＤＴＡ）　、１０ミリグラム／ミリリツトル（■／　ｌ １ｌ）　大豆トリプシンインヒビター及び１０，０００ニー’−７ト／■ｐアプ ロチニンとなるように調整した。その後ＨＤＬを密度調整に固体の臭化カリウム を用いた連続的超遠心により、この調整血漿から単離した。

第１にこの調整血漿を約２０００，０００ｘｇで１８〜２４時間達心し、生成す る上滑の下層を回収した。その下層に密度が１．０６３ｇ／ミリリフドル（ｇ／ ｓｆ）以上となるまで固体ＫＢｒを加えた。この混合物に１．０６３　ｇ／　ｍ ｌの密度のＫＢｒを含む０、】％ＥＤＴＡ溶液を重層し；２００．ＯＯＯｘｇで ４８時間以上遠心した。再び下層を回収し、それに密度が１．２１ｇ／ｍｆ以上 によるように固体ＫＢｒを加えた。この調整層に密度１．２１ｇ／ｍ１ｃＤＫＢ ｒを含む０．１％ＥＤＴＡ液に重層後、２００，０００ｘｇで４８時間以上遠心 した。

その後、その上層を回収し、密度が１．０６３　ｇ／　ｅｊ！以上になるまで固 体ＫＢｒを添加した。この調整上層に密度１．０６３ｇ／＋ｃｌのＫＢｒを含む ０．１％ＥＤＴＡを重層し、さらに２００，０００ｘｇで４８時間以上遠心した 。

その中間層を回収し、それに密度が１．２１ｇ／ｍｆ以上になるまで固体ＫＢｒ を混合した、この調整中間層に、密度１．２１ｇ／ｖａｎのＫＢｒを含む０．１ ％ＥＤＴＡ溶液を重層し、３００．０００Ｘｇで４８時間以上遠心した。　１． ０６３〜］、２１　ｇ／　ｍＡの密度を有するＨＤＬ含有上層を回収した０回収 したＨＤＬはリポタンパク賞パンフ７　　（ＬＬＢ　：　０．１５　ｍＭ　Ｈａ ｃｋ、　０．３　ｍＭ　ＥＤＴＡ及びＯ，ＯＯ５％α−テコフェロール水溶液） に対して透析し、このアポＡｌ／ＨＤＬは無菌状態で保存し、３日以内に使用し た。

Ｃ０脱脂アポＡ１の調製 脱脂アポＡｌはアポＡｌ／ＨＤＬから脂質を有機抽出することにより調製した。

例ＩＢで調製した゛アポＡｌ／ＨＤＬサンプルをまずＰＨ７，５の０．０１パー セントＥＤＴＡ溶液に対し一晩透析した後０．００３パーセントＥＤＴＡ溶液に 対して約１２時間透析してからチューブ当り１０〜２０ミリグラムのタンパク質 となるように凍結乾燥した。各チューブに３５＠ｌの無水アルコール：無水エー テル（１：　ｌ）を４℃で添加した。混合後この溶液を一２０℃に２０分間維持 した。それからこの溶液を０℃、１１００Ｏｘで３０分間遠心し、その上清をデ カンテーション後、アポＡｌ含有ペレントを回収した。

前述のエタノール／エーテル抽出をあと２回、計３回行った。

つづいて、そのサンプルに４℃で３５１１１７！の無水エーテルを加え、この混 合物を一２０℃に３０分間維持した後、−２０℃、１０００１ｇで３０分間遠心 した。このアポＡＴ含有ペレントを回収し、窒素を用いて乾燥して脱脂アポＡｌ を回収した。この脱脂７ポＡｌはアポＡｌばかりでなく、アポＡ１のようなＨＤ Ｌに関連する他のタンパク質も含むことに注意を要する。

Ｄ、アポＡ１単離物の調製 アポＡ１はキノシタ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　）等（ジャーナル・オブ・バイオケ ミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　９土、６１５−６１７　　（１９８ ３）の操作に従かい高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）を用いたサイ ズ分別により脱脂アポＡｌから単離した。

脱脂アポＡＴ約３００ｍ１を２００マイクロリツトル（μｌ）の０．１％ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶 解し、スフェロゲルーＴＳＫ３０００ＳＷＨＰＬＣカラム（ベフクマンインスッ ラメント社、ＣＡ州マフラートンによるサイズ分別を行った。アポＡｌ単離物を 含むフラクシヨンを一２０℃で保存した。またアポＡＴは先に述べた脱脂及びポ リアクリルアミド電気泳動によっても単離した。

Ｅ、ポリアクリルアミド−）ＩＤＬの調製法に示す量の別個に調製した溶液を混 合し架橋反応混合物を作ることにより、ＨＤＬをポリアクリルアミド中に固定化 した。

ｆａ）　　５０＋ｑｒＨＤＬを含む４．３＊１のＬＬＢ。

価）　２８％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミドを含む１．２５ｍｊ！の水溶液、（Ｃ） ２％（Ｗ／Ｖ）Ｎ、Ｎ’メチレン−ビスアクリルアミドを含む２．５ｔａｌの水 溶液、 ｆｄｌｌ、２５ｍｊのＬＬＢ。

（ｅ）１％（Ｗ／Ｖ）過＠酸アンモニウムを含む１．２ｍＮの水溶液。

架橋反応は３７℃で約１６時間行った。架橋が起らなかったならつづいてＴＥＭ ＥＤ　（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−子トラメチルエチレンジアミン）を混合し、３７ ℃、約９０分以内で架橋させた。

生じたポリアクリルアミドの塊りを２０ｍ１ｔＬＬＢの存在下で機械的にホモジ ナイズし、ついで遠心濾過によりＬＬＢで洗浄してポリアクリルアミド−ＨＤＬ とした。

２、　モノクローナル抗体の作製 Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｂ　ｙ　Ｊマウス（スクリブスクリニックアンドリサーチファン デーションビバリウム、ＣＡ州ラうョラ）を完全フロインドアジュバント（ＣＦ 　Ａ）中の免疫原としての５０μｇポリアクリルアミド及び５００ユニ７）のイ ンターフェロンγで腹水注射（ｉ、ｐ、　）により免疫化し、ついで各々約３週 間の間隔をあけてインターフェロンを含まない不完全フロイントアジ二バンド（ １陥）を用いた二次及び三次免疫化を行った。

最後のアジュバントを含む免疫化から約９カ月後で融合４日前生理食塩水中５０ μｇのＨＤＬを用い、静脈注射（ｉ、ν、）でマウスを追加免疫し、さらに１日 後に同様の潅流追加免疫化を行った。

このような処理を行った動物を殺し、各マウスの肺臓を採取した。そして肺細胞 サスペンションを調製した。ついでこの牌細胞すスベンジ曹ンから、２３℃、ｌ ｏｏｏｒｐｍで約１０分間の遠心により肺細胞を抽出した。上滑除去後、細胞ペ レットを５　ｍｌのＮＢＪＣＪ溶解バンファに再懸濁し、これを約１０分間イン キュページ古ンした。

この熔解細胞サスベンジランに１０−１のダルベンコ修正イーグル培地（ＤＭＥ Ｍ）（ギプコ）及びＨＥＰＥＳ　（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペリ ジンエタンスルホン酸〕バンファを混合し、ついでこの混合物を２３℃、１１０ ００ｒｐで約１０分間遠心した。

この上清をデカンチーシーンし、ペレットを１５蒙ｌのＤＭＥＭ及びＨＥＰＥＳ に再懸濁してから２３℃、１０００μｌｍで約１０分間遠心した。上記の操作を くり返した。

それからこのペレットを５１１ＪのＤＭＥＭ及びＨＥＰＥＳで再懸濁した。この 牌細胞すスペンジッンの部分種本をカウンティング用に確保した。融合は細胞系 列Ｐ３ｘ６３Ａｇ　８．６５３　　（ＡＴＣＣ１５８０）のサブクローンである 非分泌性マウスミエローマ細胞系列Ｐ３ｘ６３Ａｇ　８．６５３．１を用い以下 の方法で行った。ミニローマ：肺細胞の比約１：１０又は１：５を用い、十分量 のミエローマ細胞を遠心でペレットを作り、１５ｓｊのＤＭＥＭ及びＨＥＰＥＳ で２度洗浄した後２３℃、１０００ｒｐ−で遠心した。

肺細胞及びミエローマ細胞を１５−ｌの丸底試験管中で合せ、このａｆｉ２混合 物を２３℃、１１０００ｒｐで１０分間遠心した後その上滑をアスピレータ−で 除いた。その後約３７℃で激しく攪拌しながらｌ　ｍｌ、ピペットを用いて２０ ０．ｃ＋ｊの５０パーセント（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール４０００　（Ｐ ＥＧ、ＡＴＣＣ。

ＭＤ州バルチモア）水溶液を加えてそのペレットを破壊し、１５〜３０秒間、緩 やかに攪拌した。この細胞混合物を７００ｒｐ−で４分間遠心した。

ＰＥＧを加えてから約８分後、細胞を乱すことなくペレットに５　＊ＪのＤＭＥ Ｍ＋ＨＥＰＥＳを加えた。１分後、この混合物をｌ　　ｍｌピペットで攬拝し、 さらに４分間インキニベーシヨンした。

この混合物を１０００μｌｗａで７分間遠心した。上滑をデカンチーシラン、ペ レットに５■ｌのＨＴ（ヒボキサンチン／チミジン）培地をゆっくり加え、静か に５分間放置した。それからこのペレットを大きな塊りに壊ねし、ついで予め７ ．５＋ｓＪのＨＴ培地を入れておいたＴ７５フラスコの中に入れた（フラスコ当 り２．５ｓｊり。

この細胞サスペンションを３７℃でインキュベーシヨンして融合細胞を生育させ た。２４５時間後、フラスコに１０ｍｌのＨＴ培地を加え、ついで６時間後０． ３ｍＪの０．０４５Ｍアモノプテリンを加えた。融合から４８時間後、フラスコ に１０ｍ１．のＨＡＴ　（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン）培地を 加えた。

融合から３日後、ケネソト（Ｋｅｎｎｅｔｔ　）等（カレント・トピックス・イ ン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、　　Ｔｏｐ、　 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　ｆｍｕｎｏｌ、　　）８　１．　　７　７　　（１ ９７８）　　）により報告された方法でウェル当り約２ＸＩＯ’個生細胞の割合 で（計７６８ウェル）ＨＡＴバンファ培地を用いたＧ６穴組織培養プレートに生 細胞をブレーティングした。

ＨＡＴ培地を用い、融合後７日間細胞を生育させ、その後は約４〜５日の間隔を 置いてＨＴ培地を用いて生育させた。生育は顕微鏡で観測した。約２週間後培養 上、清を回収し、基本的にはカーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ　）及びニジイントン（ Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ　）の方法に従った（ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＊、　）　　２５ユ、１５２１３〜１５２２１　　（１９ ８２））面相ラジオイムノアッセイによりＨＤＬ特異的抗体の存在を検定した。

簡単に言うと、まずマイクロプレートのウェルに５μｇ／蒙ｌアポＡＴ／ＨＤＬ を含む５μｌのＰＢＳを入れた。このプレートを４℃に一晩（約１６時間）！持 し、アポＡｌ／ＨＤＬをウェルの壁に付着させた。５ＰＲＩＡバンフア　Ｃ２， ６８ｍＭ　　ＫＣＩ、１．４　７ｍＭ　　　ＫＨｔＰＯ，、１３７ｓＭ　　　Ｎ ａＣｌ、　　８．０　３ｍＭ　　ＮａｔｌｌＰＯ，，０，０５％Ｔｗｅｅｎ　− ２０，０，１Ｋ　Ｉ　Ｌｌ／ｍ＃　）レイゾール、０．１％ＢＳＡ、０．０１５ ％ＮａＮ５　）を用い４回ウェルを洗浄後、各ウェルに３％正常ヤギ血清（ＮＧ Ｓ）及び３％ウシ血清アルブミンを含む５ＰＲＩＡバツフア２００μｌを加え、 過剰のタンパク質結合部位をブロックした。このプレートを２０℃に３０分間維 持した後、これを振ってウェルを空にし、乾爆さセて固体サポート、すなわちア ポＡ１／ＨＤＬを機械的に固定化させる固体マトリクスとした。

その後各ウェルに５０μｌのハイブリドーマ組織培養上滑を入れ、固相免疫反応 産物を作つた。この混合物を３７℃に２時間維持し、固相免疫反応産物を生成さ せた。先に述べたようなウェル洗浄の後、ｍｌ当りタンパク質０．２５μｇの１ ２５！ラベル化ヤギ抗マウス１．Ｇ５０μＥを各ウェルに加え、ラベル化反応混 合物を作った。この混合物を３７℃に１時間維持し、′１１ラベル化固相免疫反 応産物を生成させた。先に述べたようなウェル洗浄の後、各ウェルに結合した＋ ！Ｓ１ラベル化産物の量をガンマシンチレーシ；ンで測定した。

約１６個のハイブリドーマ培養物からその培地に抗ＨＤ）Ｉ抗体を分泌するハイ ブリドーマＡｌ−１６を選択した。ハイブリドーマＡｌ−１６はＩｇＧｚａ免疫 グロブリン重鎮を有することが測定され、さらにここで述べているような特性を 有することが明らかにされた。

３、　モノクローナル抗体の調製及び精製０．３ｓｊのミネラルオイルで怒作し 、かつ５Ｘ１０”個のハイブリドーマ細胞を１！腔注射した、退会１０のＢａ１ ｂ／Ｃマウスから腹水を得た。腹水の平均発注時間は９日であった。２３℃、１ ５、ＯＯＯＸｇ、１５分間の遠心による清澄化後、ハイブリドーマＨ１３５Ｄ３ によって生産された腹水を収集し、−２０℃で凍結保存した。

５個のハイブリドーマから、１０ｍＭ）リス（ｐＥ８．０）の０−０．５モル濃 度（Ｍ）濃度勾配を用いたファルマシアモノＱ　　ＨＲ５１５アニオン交換カラ ム（ファルマシアファインケミカルズ、ＮＪ州、ピスカタウェイ）を使用した高 速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）により、各々のＡｌ− １６モノクロ一ナル抗体を精製した。この精製Ｍａｂをアミコン攬袢限外濾過セ ル（ＭＡ州デンバー：ＰＭ３０メンフ゛レン）によりｌｅｇ／ｍＪの濃度にま？ ｆｆ１１１、ＰＢＳ（ｌＪ７ａｉｌ衝液、ｐＨ７，２）　ニ対しｒ透ｆｒした後 、−７０℃で保存した。

４、放射性ヨウ素化 ＨＤＬ、アポＡｌ及びヤギ抗マウスＩｇの免疫化学的精製物の放射性ヨウ素化は 、エンザイモビーズヨウ素化操作法及びバイオラボ社から入手した（ＣＡ州、バ ーリンガム）エンザイモビーズを用いて酵素的に行った。エンザイモビーズによ るヨウ素化は以下に議論されるように、固相ラジオイムノアンセイ用の抗原及び 抗体の特性化にも使用した。

５、　アポＡｌ臭化シアン断片持異性 ＭＡＢＡＩ−１６のアポＡＩ　　ＣＮＢｒ断片持異性はカーチス（Ｃｕｒｔｉｓ ｓ　）等（プロシーディング・オン・ザ・ワークシランプ・オン・リボプロティ ンへテロジェナイアティ−（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆｔｈｅ　Ｗｏｒｋｓｈ ｏｐ　ｏｎ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　）Ｉｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　）＋リ フペル（Ｌｉｐｐｅｌ）編、ＮＩＨ刊行番号８７−２６４６、ｐ、　　３６３− ３７７（１９８７））の方法に従かいウェスタンブロンド分析により測定した。

Ｎ車に言うとＣＮＢｒ断片化を９０％ギ酸に溶かしたアポＡｌ車離物について行 った。ＣＮＢｒを１３０００倍モル過剰量加え、その反応混合物を約２０℃に約 １５時間維持した。凍結乾燥後、このＣＮＢｒ断片を１％ＳＤＳ、０．ＯＩＭ　 　）リス（ｐＨ８，２）溶液中で可溶化し、カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）等（ジ ャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩ ｌ、　）　　２６０．　２９８２−９３　（１９８３））によって報告されてい る、８Ｍ尿素及び２％アソホリンを含む６％ポリアクリル７ミドスラブゲルを用 いた等電点電気泳動で分画した。電気泳動的に分離タンパク質をｌ’１ＡＢＡｌ −１６との免疫反応に使用するニトロセルロースに転移させた。免疫反応産物の 生産を放射性ヨウ素化したヤギ抗マウスＩｇによるオートラジオグラフィーで検 出した。

これらの実験の結果はＭＡＢＡＩ−１６がアポＡＴ　　ＣＮＢｒ断片ＣＮＢｒ２ 、ＣＮＢｒ３及びＣＮＢ　ｒ　４とは免疫反応しないが、ＣＮＢｒ１とは免疫反 応することを示している。′−たこれらの結果はＭＡＢＡｌ−１６がアポＡｌｊ ｉｇｌ物と免疫反応することを示していることに注意を要する。

６、　　ＭＡＢ　Ａｌ−１６の免疫反応性本来のアポＡｌ／ＨＤＬ、脱アミド化 アポＡｌ／ＨＤＬ及び種々のポリペプチドに対するＭＡＲＡＩ−１６の免疫反応 性を以下に示す競合ＲＩＡによってテストした。

１０　ｕ　ｇ　／ｌａｎ　（１）７ポＡｌ／ＨＤＬを含むＰＢＳ（０，１５ＭＮ ａＣ１，０，ＯＬＭ　　ＮａＰＯ，、ｐＨ７，２）１００ｐｌをマイクロプレー トのウェルに加えた。このプレートをシェーカー上で２０℃に１時間維持し、ア ポＡｌ／ＨＤＬをウェルに付着させて固体サポートを作る。過剰の液体を吸引に よってウェルがら除去した後、２００、ｃ＋＃のフ゛ロンク）８液（ＰＢＳ中３ ％ＢＳＡ、３％ＮＧＳ）を各ウェルに加え、ついでそのウェルをシェーカー上、 ２０’Ｃに３０分間維持する。つづいてこのブロック溶液を吸引で除去し、その ウェルを５ＰＲＩＡバフフアで３回洗浄した。

その後各ウェルにまず３％ＢＳＡ及び種々の濃度の競合抗原、すなわち了ボＡｌ ／）（ＤＬ、又はペプチドを含むＰＢ３５０μｌを加え、ついで＄２に３％ＢＳ Ａを含むＰＢＳ？１　：　］、２５Ｘ１０’に希釈した清澄化腹水の形のＭＡＢ ＡＩ−１６５０μｌを加えて競合免疫反応混合物を作った。コントロールウェル では、競合抗原又は抗体の代りに３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いた。

この免疫反応混合物をシェーカー上４℃で約１６時間維持し、固相免疫反応産物 を生成させた。先に述べたようにウェルを洗浄した後、１００μｌの１２Ｊラベ ル化ヤギ抗マウスＴｇ　　（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１００ＪＪ１当り２ｘ ｌＱ’　（７））ｌＪ７ｏ。

酢酸沈殿化物となるように希釈した＋ｚＳ）−ヤギ抗マウスＩｇ＞を各ウェルに 加える。このようにして作ったラベル化免疫反応混合物をシェーカー上４℃に４ 時間維持した。つづいてこのウェルを先に述べたように５ＰＲ）Ａで洗浄し、生 成した＋２Ｊ−ラベル化固相免疫反応産物量を測定した。

アポＡＩ／ＨＤＬ、新鮮な血漿中のＨＤＬ及びポリペプチドＡｌ１−１５と免疫 反応するＭＡＢＡＩ−１６の能力を先に述べたＲＩＡにおける競合物として各々 を使用することにより比較した。この実験の結果を第２図に示す、アポＡｌ／Ｈ ＤＬ、血漿ＨＤＬ及びポリペプチドＡｌｌ−１５の対数変換データの勾配は−１ ，９６、−２，４２及び−２，６０であった。ＭＡＢ　　ＡＴ−１６は血１ＨＤ Ｌ及びペプチドＡｌ１−１５に対し基本的に同一の親和性を示した。このことは ＭＡＢＡＩ−１６により認識される血＠ＨＤＬ及びペプチド上のエピトープの発 現は、同一でないにしろ僚でいることを示している。しかし、脱脂したアポＡ＋ に対するＭＡＢＡＩ−１６の親和性はかなり小さく、アポＡ１のアミノ末端部分 は脱脂により変化を受けていることを示している。

第１表及び第２表に示したポリペプチドに対するＭＡＲＡＩ−１６の免疫反応性 を比較するため、各々のストック溶液を１０μｇ　／　ｓ　１　（１）濃度で調 製した。このストック又はこのストックの２倍希釈シリーズ５０μｌをこの例で 述べたＲＴＡＬ：Ｄｆｉ台者として使用した。第３図に図式で示したこの実験の 結果は、ペプチドＡｌ１−１０及びＡｌ５−１５は固相アポＡｌ／ＨＤＬへの門 ＡＢＡＴ−１６の結合を阻害し得ないことを示している。しかし、ペプチドＡｌ １−１５及びＡｌ１−２１は効果的競合者であった。

さらに、対数変換曲線の勾配分析は、ペプチドＡｌ１−１５及びＡｌ１−２１へ のＭＡＢＡＩ−１６の親和性は同じであることを示した。

特定のＢ様及び例を含む先の明細は本発明を説明するためのものであってこれを 制限する意図はない。本発明の真の精神及び範囲を逸脱することなしに他の多く のイ１正や変化を行ない得る。

ロジット（Ｖ） 合成ペプチド（Ｍ） ＦＩＧ、　３ 平成　　年　　月　　日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、事件の表示　　　ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１２６２２、発明の名称　　　アポ ＡＩ定量のための診断方法及び診断システム ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　　スクリップス　クリニック　アンドリサーチ　ファウンデーション ５、補正命令の日付　　平成２年９月４日６、補正の対象　　　　明細書及び請 求の範囲の翻訳文７、補正の内容　　　　別紙のとおり 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）基本的に多くとも４０残基のアミノ酸を含み、かつアミノ酸残基配列の一 部として、式−ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡ−で表わされる配列を有するア ポＡＩポリペプチド。 （２）前記ポリペプチドが、 ａ）ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＰＶＫＤＬＡ、及びｂ）ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＨＤＬ ＡＴＶＹＶＤＶからなる群から選ばれる式で表わされるアミノ酸残基配列を有す る請求の範囲（１）記載のポリペプチド。 （３）モノクロ−ナル抗体であって、 （ａ）アポＡＩ／ＨＤＬ、 （ｂ）アポＡＩ単離物、 （ｃ）アポＡＩＣＮＢｒ１、及び （ｄ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡ、と免疫反応するが、 （ｅ）アポＡＩＣＮＢｒ２、 （ｆ）アポＡＩＣＮＢｒ３、 （ｇ）アポＡＩＣＮＢｒ４、 （ｈ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲ、及び（ｉ）ポリペプチドＱＳＰＷＤ ＲＶＫＤＬＡ、とは免疫反応しない抗アポＡＩ抗体分子を含むモノクロ−ナル抗 体。 （４）前記抗体分子がＡＴＣＣを有するハイブリドーマによって生産されるもの である請求の範囲（３）記載のモノクロ−ナル抗体。 （５）少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量のアポＡＩポリペプチドであ って、 （ａ）ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡ、及び（ｂ）ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫ ＤＬＡＴＶＹＶＤＶからなる群から選ばれる式で表わされるアポＡＩポリペプチ ドを含むキット型の診断システム。 （６）前記ポペプチドを固体マトリクスに機能的に結合させた請求の範囲（５） 記載の診断システム。 （７）さらに、少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量のモノクロ−ナル抗 体であって、 （ａ）アポＡＩ／ＨＤＬ、 （ｂ）アポＡＩ単離物、 （ｃ）アポＡＩＣＮＢｒ１、及び （ｄ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡ、と免疫反応するが、 （ｅ）アポＡＩＣＮＢｒ２、 （ｆ）アポＡＩＣＮＢｒ３、 （９）アポＡＩＣＮＢｒ４、 （ｈ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲ、及び（ｉ）ポリペプチドＱＳＰＷＤ ＲＶＫＤＬＡとは免疫反応しない抗アポＡＩ抗体分子を含むモノクロ−ナル抗体 を含有する請求の範囲（５）記載の診断システム。 （８）前記抗体分子がＡＴＣＣを有するハイブリドーマによって生産されるもの である請求の範囲（７）記載の診断システム。 （９）前記抗体分子を酵素指示手段に機能的に結合させた請求の範囲（７）記載 の診断システム。 （１０）少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量のモノクロ−ナル抗体であ って、 （ａ）アポＡＩ／ＨＤＬ、 （ｂ）アポＡ１単離物、 （ｏ）アポＡＩＣＮＢｒ１、及び （ｄ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡと免疫反応するが、 （ｅ）アポＡＩＣＮＢｒ２、 （ｆ）アポＡＩＣＮＢｒ３、 （ｇ）アポＡＩＣＮＢｒ４、 （ｈ）ポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲ、及び（ｉ）ポリペプチドＱＳＰＷＤ ＲＶＫＤＬＡとは免疫反応しない抗アポＡＩ抗体分子を含むモノクロ−ナル抗体 を含有するキット型診断システム。 （１１）前記抗体分子がＡＴＣＣを有するハイブリドーマによって生産され得る ものである請求の範囲（１０）記載の診断システム。 （１２）前記抗体分子を酵素指示手段に機能的に結合させた請求の範囲（１１） 記載の診断システム。 （１３）血液サンプル中のアポＡＩ量の検定法であって、（８）血液サンプルを 、 （ｉ）ＡＴＣＣを有するハイブリドーマにより生産される抗アポＡＩモノクロ− ナル抗体と、及び（ｉｉ）ａ）ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡ及びｂ）ＤＥＰ ＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡＴＶＹＶＤＶからなる群から選ばれるアポＡＩポリペ プチドと、に混合することにより免疫反応混合物を作り、（ｂ）該免疫反応混合 物を、アポ含有免疫反応産物が生成するのに十分な時間維持し、そして （ｃ）ステップ（ｂ）で生成した産物量を測定することにより、血液サンプル中 のアポＡＩ量を測定する、工程を含む方法。 （１４）前記ポリペプチドが固体マトリクスに機能的に結合し、かつ前記抗体が 酵素ラベルに機能的に結合し、かつ工程（ｂ）で生成した前記産物がラベル化し た免疫反応産物である請求の範囲（１３）記載の方法。 （１５）アポＡＩ／ＨＤＬ及びポリペプチドＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡと 免疫反応し得る抗体分子を生産し、ＡＴＣＣを有するハイブリドーマ。