FI90988B - Monoklonaaliset vasta-aineet natriumdiureesia lisääviä nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä kohtaan - Google Patents
Monoklonaaliset vasta-aineet natriumdiureesia lisääviä nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä kohtaan Download PDFInfo
- Publication number
- FI90988B FI90988B FI861128A FI861128A FI90988B FI 90988 B FI90988 B FI 90988B FI 861128 A FI861128 A FI 861128A FI 861128 A FI861128 A FI 861128A FI 90988 B FI90988 B FI 90988B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- monoclonal antibodies
- peptides
- antibodies according
- anp
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
90988
Monoklonaaliset vasta-aineet natriumdiureesia lisääviä nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä kohtaan
Kyseessä oleva keksintö koskee yleisesti uusia hyb-5 ridoomasolulinjoja, erityisesti hybridoomasolulinj oj a, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita (mAK), jotka ovat spesifisiä, natriumdiureesia lisääviä sydäneteisen peptidejä kohtaan, erityisesti peptidejä kohtaan, joita ihminen ja rotta valmistavat, sekä niiden käyttöä dlag-10 nostisena aineena ja tutkimustarkoituksiin.
Hiiren myeloomasolujen yhdistäminen immunisoitujen hiirien pernasolujen kanssa [Köhler ja Milstein, Nature 256, 495 - 497 (1975)] oli ensimmäinen osoitus mahdollisuudesta saada jatkuvia solulinjoja, jotka valmistavat 15 tasa-aineisia (ns. "monoklonaalisia") vasta-aineita. Siitä lähtien on tehty lukuisia yrityksiä erilaisten hybridiso-lujen (ns. "hybridoomien") valmistamiseksi ja niiden muodostamien vasta-aineiden käyttämiseksi erilaisiin tieteellisiin tutkimuksiin [esim.: Current Topics in Microbiology 20 and Immunology, osa 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Mel-chers et al., Springer Verlag, 1978, sekä viitteet siinä; C. Barnstable et al., Cell 14, 9 - 20 (1978); P. Parham, W.F. Bodmer, Nature 276, 397 - 399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, nidos 2, D.M. Wier, julkai-25 sija Blackwell 1978, luku 25; Chem. Eng. News, 15 - 17 (1979), 9]. Nämä työt kuvaavat periaatteellista tekniikkaa monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hybridoomien avulla.
Monoklonaalisia vasta-aineita on valmistettu histo-30 kompabiliteettiantigeenejä, hapteeneja ja entsyymejä vastaan. El kuitenkaan tunneta yhtään monoklonaalista vasta-ainetta, joka reagoi hyvin selektiivisesti natriumdiureesia lisäävien nisäkkäiden sydäneteisen peptidien, kuten esimerkiksi ihmisen ja rotan peptidien, kanssa.
35 2
Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien yhteydessä on kysymys ryhmästä, jolla on erilaisia ketju-pituuksia, joiden pienin tehokas sekvenssi koostuu 23 aminohaposta. Peptidit, joissa on lisäksi N-terminaalises-5 ti ja C-terminaalisesti muita aminohappoja, ovat yhtä tehokkaita. Peptidit syntyvät entsymaattisten vaikutusten kautta sydäneteisessä noin 152 aminohapon suuruisesta esi-astemolekyylistä. ANP koodaava geeni on kloonattu ja DNA on sekvensoitu.
10 ANP:t indusoivat lyhytkestoisen, voimakkaan nat- riumdiureesin, jossa yhteydessä ei ole tähän mennessä voitu osoittaa aineiden tarkkaa vaikutuspistettä tubuluksis-sa. Lisäksi ANP:t ovat tehokkaita verisuonia laajentavia aineita, jotka mm. voivat vastaanvaikuttaa noradrenalii-15 nin, angiotensiini II:n, histamiinin ja serotoniinin verisuonivaikutukseen. ANP:n vaikutusta ei lopeteta indometa-siinin avulla, mikä tekee epätodennäköiseksi vaikutuksen endogeenisen prostaglandiinisynteesin kautta. On kuvattu ANP:n verenpainetta alentavia vaikutuksia "two-clip"-hy-20 pertoniaa potevilla rotilla sekä SH-rotilla.
Eristetyillä soluilla voitiin osoittaa inhiboivaa vaikutusta aldosteronin ja vasopressiinin erittymiseen. Tavanomaisia vasta-aineita käyttämällä voidaan radioimmu-nologisesti mitata ANP:n plasmapeili, joka riippuu kulloi-25 senkin koe-eläimen tilavuustilasta. 125J:lla merkatulla ANP-johdannaisella voidaan osoittaa spesifinen sitoutuminen zona glomerulosa -soluihin. Ensimmäiset kokeet viit-taavat kallikreinin vapautumiseen munuaisista ANP:n avulla. Tietyissä olosuhteissa voidaan peptidin munuaisvaiku-30 tus lopettaa Haloperidolilla suoritetun esikäsittelyn avulla (Sagnella ja MacGregor, Nature 399, 666 - 668, 1984). ANP:n vaikutusspektri tekee erittäin todennäköiseksi tämän peptidin kausaalisen ja oireenmukaisen osallistumisen verenkiertosairauksiin (hypertonia, hypotonia, val-35 timonkovetustauti), sydänsairauksiin (akuutti ja krooninen 90988 3 sydämen vajaatoiminta, sydäninfarkti, sydämen rytmihäiriöt, sydämen sepelvaltimosairaus) sekä munuaissairauksiin (akuutti ja krooninen munuaisvaurio erilaisten perussairauksien aikana, uremia). Kaikissa mainituissa sairaus-5 tapauksissa tulee sen tähden olemaan suuri merkitys erilaisissa kehon nesteissä (esim. veressä, plasmassa, seerumissa, virtsassa, lymfassa tai selkäydinnesteessä) olevan ANP:n kvantitatiivisella määrityksellä.
Totunnaisten antiseerumeiden avulla mitatut ANP:n 10 plasmapeilit ovat osittain hyvin korkeita, mikä voidaan selittää näiden vasta-aineiden ristireaktion tai puuttuvan spesifisyyden avulla. Erittäin spesifisiä (monoklonaali-sia) vasta-aineita käyttämällä voidaan sulkea pois vaara määrittää väärin natriumdiureesia lisäävien, sydäneteisen 15 peptidien korkea plasmapeili. Täten sellaiset vasta-aineet soveltuisivat ihanteellisesti kaikkien tautien, joihin liittyy muuttunut ANP-peili, taudinmääritykseen.
Kyseessä oleva keksintö koskee monoklonaalisia vasta-aineita, joille on tunnusomaista, että ne on valmistet-20 tu natriumdiureesia aiheuttavia nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä vastaan, että ne eivät ristireagoi angiotensiini II:n, leu-enkefaliinin, substanssi P:n, aldosteronin, ACTH:n, bradykiniinin, gamma-MSH:n, insuliinin, vasopres-siinin ja reniinin kanssa ja että ne ovat valmistettavissa 25 viljelemällä hybridoomasolulinjaa NCACC 850 314/1 tai NCACC 850 314/2 sopivassa viljelyväliaineessa ja ottamalla vasta-aineet talteen supematantista. Kyseessä oleva keksintö koskee edelleen hybridoomasolulinjoja, jotka syntetisoivat ja erittävät näitä monoklonaalisia vasta-aineita 30 nisäkkäiden, erityisesti ihmisen ja rotan, natriumdiureesia lisääviä sydäneteisen peptidejä kohtaan. Nämä hybri-doomat valmistetaan von Köhlerin ja Milsteinin alussa mainittujen menetelmien mukaisesti. Immunogeenin kantajalla, esim. proteiiniin sidotuilla, natriumdiureesia lisäävällä 35 sydäneteisen peptidillä suoritetun hiirien immunisoinnin 4 jälkeen näiden hiirien pernasolut sulautuvat yhteen hiiren myeloomasolulinjan solujen kanssa. Tästä syntyviä hybri-doomia tutkitaan systemaattisesti vasta-aineiden suhteen, jotka reagoivat selektiivisesti natriumdiureesia lisäävien 5 sydäneteisen peptidien kanssa. Tällä tavalla eristettiin keksinnön mukaiset hybridoomat, jotka valmistavat mono-klonaalisia vasta-aineita natriumdiureesia lisääviä sydäneteisen peptidejä vastaan. Hybridoomat talletettiin tal-lennusnumeroilla 850314/1 (hybridoomasolulinja, joka tuot-10 taa mAK:ta 11A-Ali) sekä 850314/2 (hybridoomasolulinja, joka tuottaa mAK:ta 23 M-D9), National Collection of Animal Cell Cultures-talletuslaitokseen, PHLS Centre for Applied Mikrobiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, UK.
15 Kyseessä olevan keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää esimerkiksi natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien peilin määrittämiseen biologisissa nesteissä, kuten esimerkiksi veressä, plasmassa, seerumissa, virtsassa, lymfassa tai aivo-selkäydinnesteessä. Ky-20 seessä olevan keksinnön mukaiset vasta-aineet soveltuvat erityisen hyvin immunologisten määritysmenetelmien valmistukseen. Mutta niitä voidaan käyttää myös natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien eristämiseen immuno-adsorptiokromatografian avulla.
25 ANP:n merkityksen tutkimista varten, erilaisin fy siologisin ja patofysiologisin edellytyksin, ovat eläin-koetutkimukset ehdottoman tarpeellisia. Näiden tehtävien ja ANP:n farmakologiaa koskevien töiden edellytyksenä ovat spesifiset ja herkät kokeet kvantitatiivista määritystä 30 varten kehonnesteissä.
Kyseessä olevan keksinnön mukaiset vasta-aineet soveltuvat myös erittäin hyvin fysiologisiin ja farmakologisiin kokeisiin.
Hybridoomien valmistus käsittää ylipäänsä seuraavat 35 vaiheet: 90988 5 A) Nisäkkäiden immunisointi immunogeenisella kantaja-aineella, erityisesti immunogeeniseen kantaja-ainepro-teiiniin (esim. tulivuorikotilon hemosyaniiniin, KLG) sidotulla, natriumdiureesia lisäävällä sydäneteisen pepti- 5 dillä, Joka on peräisin esimerkiksi ihmiseltä tai rotalta (KLH-ANP). Naaraspuoliset Balb/c-hiiret osoittautuivat tähän tarkoitukseen käyttökelpoisiksi. Immunisointisuunni-telma Ja KLH-ANP:n konsentraatiot tuli valita siten, että muodostuu riittävä määrä antigeeniä stimuloivia lymfosyyt-10 tejä. Kolme immunisointia, Jotka suoritettiin 14 päivän välein 100 pg:lla KLH-ANP hiirtä kohti, ruiskeena, Joka oli fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, osoittautuivat tehokkaiksi.
B) Immunisoitujen nisäkkäiden (esim. hiirien) per-15 nasolujen suspension saanti Ja valmistus sopivassa elatus- aineessa. Noin 1 ml elatusainetta/perna on riittävä määrä. Tähän tarvittavat koetekniikat ovat tunnetut.
C) Lietettyjen pernasolujen liittäminen sopivan so-lulinjan myeloomasolujen kanssa (esim. hiiren myelooma 20 PX63Ag8), missä käytetään sopivaa yhteenliittämisen kiih- dytintä (esim. polyetyleeniglykolia). Edullisia sulautumisen katalyyttejä ovat polyetyleeniglykolit, joiden keskimääräinen molekyylipaino on 1 000 - 4 000 (esim. kaupallisesti saatava PEG 1000 jne.). Kuitenkin voidaan käyttää 25 myös muita tunnettuja yhteenliittämisen kiihdyttäjiä. Suhde, jossa on noin 10 pernasolua myeloomasoluja kohti, on edullinen. Sulauttamiselatusaineen kokonaistilavuus noin 0,5 - 1,0 ml on riittävä 108 pernasolua varten. Hiiren monet myeloomasolut ovat tunnettuja ja saatavissa esim.
30 tieteellisistä laitoksista tai solujentallennuslaitoksis-ta. Käytettyjen solulinjojen tulee lähinnä osoittaa geneettistä vauriota, niin että sulautumattomat myeloomasolut kuolevat tietyssä valintaväliaineessa, kun taas hybridit jäävät eloon. Useimmiten käytetään 8-atsaguanii-35 nin suhteen resistenttejä solulinjoja, joilta puuttuu ent- 6 syymi hypoksantiini-guaniini-fosforibosyyli-transferääsi ja jotka sen tähden eivät pysty kasvamaan HAT-elatusai-neessa (hypoksantiini, aminopteriini, tymidiini) (Science 145:709, 1964).
5 Käytetyn myeloomasolulinjan tulee olla etupäässä myös "non-secreting"-tyyppiä, jotta se ei itse muodosta vasta-aineita tai immunoglobuliinien L-ketjuja. Tietyissä tapauksissa voivat kuitenkin erittävät myeloomasolut olla edullisia.
10 D) Yhteensulautumaseosta (perna- ja myeloomasolut) laimennetaan ja kasvatetaan yksittäisissä putkiloissa, selektiivisessä elatusaineessa, niin että sulautumattomat solut eivät lisäänny ja kuolevat 1-2 viikon kuluessa. Yksittäiset, yhteensulautuneet solut eristetään sillä ai-15 kaa kun laimennusaineen tilavuus säädetään siten, että yksittäiseen putkiloon (esim. mikrotiitterilevyn jokaiseen syvennykseen) tulee tietty määrä soluja (noin 1-4).
E) Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien vasta-aineiden läsnäolon tarkastus jokaisesta putki- 20 losta.
F) Toivottuja vasta-aineita valmistavien hybridoo-mien valinta (esim. rajoittavan laimennuksen avulla) ja kloonaus.
Kun kerran haluttu hybridooma on valittu ja kloo-25 nattu, voidaan vasta-aine valmistaa kahdella erilaisella tavalla. Erittäin puhtaita, monoklonaalisia vasta-aineita saadaan, kun hybridooma viljellään sopivassa elatusaineessa tietty aika ja vasta-aine otetaan supernatantista. Sopiva elatusaine ja viljelyn optimikesto ovat yksinkertai-30 sesti määritettävissä. Tämä in vitro -tekniikka tuottaa monoklonaalisia vasta-aineita, joissa on epäpuhtautena vain pieniä määriä heterologisesta seerumista (vasikan sikiön seerumista) peräisin olevia proteiineja.
Oleellisesti korkeampien konsentraatioiden valmis-35 tamiseksi monoklonaalisia vasta-aineita, joiden puhtaus on 90988 7 vain vähän vähäisempi, voidaan valittua hybridoomaa ruiskuttaa vatsaontelonsisäisesti hiirelle - etupäässä syngee-ni- tai semisyngeenihiirelle. Tämä johtaa hiiressä tietyn inkubointiajan jälkeen kasvaimien kehittymiseen, joka va-5 pauttaa koe-eläimen veressä ja vatsaontelon tulehdusnes-teessä (ascites) korkean vasta-ainekonsentraation (5-20 mg/ml). Siinä tapauksessa, että näillä hiirillä on veressä ja vesivatsassa (ascites) normaaleja vasta-aineita, niin niiden konsentraatio mAK:een verrattuna on hyvin al-10 hainen. Täten saadulla monoklonaalisella vasta-aineella on hyvin korkea tiitteri (se on aktiivinen laimennuksissa 10~3 tai sen alapuolella) ja spesifisen ja epäspesifisen immunoglobuliinin suhde on noin 20:1.
Esimerkki 1 15 Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus natrium- diureesia lisääviä ihmisen ja rotan sydänpeptidejä kohtaan Immunisointiin käytettyjen antigeenien valmistus Antigeeninä käytettiin ihmisen a-ANP:n tai rotan atriopeptiini II:n (Bachem) ja tulivuorikotilon hemosya-20 niinin (KLH, Pacific Biomarine Supply Company) konjugaat-tia. Valmistusta varten sekoitettiin KLH ja humaani a-ANP tai atriopeptiini II moolisuhteessa 1:1 ja sekoitettiin konsentraationa 2 mg/ml fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa keittosuolaliuoksessa glutaraldehydin kanssa. Glu-25 taraldehydin loppukonsentraatio reaktioerässä nousi 0,25 %:iin. Yhden tunnin mittaisen, huoneen lämpötilassa suoritetun inkuboinnin jälkeen dialysoitiin proteiinikon-jugaattia 4 *C:ssa useita kertoja fosfaatilla puskuroitua fysiologista keittosuolaliuosta vastaan.
30 Balb/c-hilrien immunisointi
Naaraspuolisia Balb/c-hiiriä immunisoitiin vatsaontelonsisäisesti 100 pg:lla KLH-ANP-konjugaattia, joka oli 0,2 ml:ssa Freundin täydellistä adjuvanttia. 14 päivää myöhemmin eläimet saivat uudelleen 100 pg antigeeniä vat-35 saontelonsisäisesti Freundin epätäydellisessä adjuvantis- 8 sa. Kaksi muuta immunisointia tehtiin laskimonsisäisesti 14 päivän välein kulloinkin 50 pl:lla antigeeniä, joka oli 100 pg:ssa fosfaatilla puskuroitua keittosuola-liuosta, eläintä kohti. Kolmen päivän kuluttua viimeisestä antigee-5 nin antamisesta eläimiltä otettiin pernat.
Pernasolususpension valmistus
Kerätyistä pernoista valmistettiin yksittäissolu-suspensio puristamalla elimet ruostumattomasta teräksestä valmistetun siivilän läpi. Solut siirrettiin Dulbeccon 10 "Minimal Essential" -elatusaineeseen (DMEM), jota oli täydennetty glukoosilla (4,5 g/1), penisilliinillä (100 yk-sikköä/ml) sekä streptomysiinillä 100 pg/ml. Solut pestiin kolme kertaa DMEM:llä ja lietettiin uudelleen haluttuna konsentraationa samaan elatusaineeseen. Yleensä saa-15 tiin noin 108 solua/perna.
Mveloomasolulen valmistus Tässä yhteydessä käytetty myeloomasolulinja X63Ag8.653 on hiiren myeloomasolulinjan P3-X63-Ag8 ala-klooni, joka ei ilmennä immunoglobuliinien raskaita eikä 20 kevyitä ketjuja [J. Immunol. 123: 1543-1550 (1980)]. Solut ovat herkkiä 8-atsaguaniinin konsentraatiota 20 pg/ml kohtaan eivätkä voi kasvaa elatusaineessa, joka sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT). Niitä viljeltiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty glukoosilla (4,5 25 g/1), glutamiinilla (20 mM), penisilliinillä (1 000 yksik- köä/ml), streptomysiinillä (100 pg) ja 10 %:lla vasikan sikiön seerumia (täydellinen elatusaine). Yhteensulautumisen ajankohtana myeloomasolut olivat solun lisääntymisen logaritmisessa vaiheessa.
30 Solujen yhteenliittyminen
Pernasolususpensiot lisättiin myeloomasoluihin DMEM:ssä, josta seerumi puuttui, suhteessa 10:1 ja niitä sentrifugoitiln 10 minuutin ajan 200 g:11a pyöreäpohjai-sissa kupeissa. Solujen laskeutumisen jälkeen supernatant-35 ti dekantoitiin varovaisesti. Soluja inkuboitiin 2 ml:n kanssa polyetyleeniglykolin, molekyylipaino 2 000, liuok- 90988 9 sessa [laimennettu 30 %:iin (paino/paino) DMEM:113, pH 7,6], yhden minuutin ajan 37 °C:ssa. Tähän lisättiin 20 ml DMEM, mihin solut lietettiin varovaisesti uudelleen muutamien minuuttien aikana. Niitä sentrifugoitiin vielä kerran 5 viiden minuutin ajan 200 g:11a ja solusaostuma lietettiin uudelleen HAT-elatusaineeseen konsentraationa 10* solua/ml, minkä jälkeen ne jaettiin 1 ml:n suuruisina erinä Costar-levyille.
Hvbridooman kasvatus 1a valinta 10 Solujen yhteensulautumisen jälkeen soluja kasvatet tiin HAT-elatusaineessa (hypoksantiini, aminopterllnl, tymidiini) 37 °C:ssa 5 %:n kanssa COz kosteassa atmosfäärissä. Muutamien viikkojen jälkeen hybridoomasoluviljel-mien supernatantit tutkittiin anti-ANP-aktiivisuuden ole-15 massaolon suhteen vastaavan entsyymi-immunologisen määrityksen avulla (ks. alla).
Ne hybridoomasolulinjat, jotka antoivat positiiviset tulokset anti-ANP-kokeessa, valittiin kloonausta varten.
20 Tällöin hybridoomille suoritettiin "rajalaimennus", jolloin mikrotiitterilevyn 96 syvennykseen siirrostettiin keskimäärin 0,5 solua syvennystä kohti, jolloin "syöttösoluina” lisättiin 105 hiiren tymosyyttlä/syvennys. Tämän kloonausmenettelyn jälkeen anti-ANP-vasta-ainetta valmis-25 tavia soluja vielä lisättiin, ne jäähdytettiin ja niitä säilytettiin nestemäisessä typessä täydellisessä elatusai-neessa, joka sisälsi 25 % vasikani sikiön seerumia sekä 7,5 % dimetyylisulfoksidia.
Monoklonaalisten vasta-aineiden suurempien määrien 30 valmistus
Kloonattuja hybridoomla ruiskutettiin vatsaontelon-sisäisesti hiiriin, joita oli esikäsitelty 0,5 ml:11a "pristania”, jotta noin 10 - 15 päivän kuluttua voitiin saada vasta-ainetta sisältävää ascites-nestettä. Vasta-35 alneaktiivisuus määritettiin ascites-nesteessä radioaktiivisella sitoutumisen inhibitiokokeella (ks. esimerkki 3).
10
Anti-ANP-aktiivisuuden määritys villelmäelatusai-neiden supernatanteista 100 μΐ viljelmäelatusaineen supernatanttia pantiin mikrotiitterilevyille, joille oli kolmen tunnin ajan huo-5 neen lämpötilassa adsorboitu konjugaattia, joka oli muo- . dostettu häränseerumin albumiinista ja humaani-α-ANP:stä tai rotan atriopeptiinistä (5 pg/ml) ja jotka niin ollen oli pesty vedellä. Kaniinin anti-hiiri-immunoglobuliini, joka oli kytketty peroksidaasiin, lisättiin levyille; tä-10 män jälkeen levyjä inkuboitiin kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tislatulla vedellä suoritetun, 5-kertaisen pesun jälkeen lisättiin entsyymin suhteen soveliasta subs-traattipuskuria ja syntyneen, värjäytyneen tuotteen kon-sentraatio määritettiin mikrotiitterilevyille soveltuvan 15 fotometrin avulla.
Esimerkki 2
Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi
Monoklonaalisten vasta-aineiden tyypitys 20 Kyseessä olevan keksinnön yhteydessä kuvattujen mo noklonaalisten vasta-aineiden luokat ja alaluokat analysoitiin. Vasta-aine rikastettiin elatusaineen supernatan-tista seostamalla ammoniumsulfaatilla (40-%:inen kyllästys) ja puhdistettiin osittain. Immunoglobuliiniluokka 25 määritettiin Ouchterlonyn geelidiffuusiokokeessa käyttämällä luokkaspesifisiä anti-hiiri-immunoglobuliini-anti-seerumeita. Monoklonaalinen vasta-aine 23M-D9 ihmisen ANP vastaan kuuluu IgG^luokkaan. Monoklonaalinen vasta-aine 11A-A11 atriopeptiini II vastaan kuuluu myös IgGj-luokkaan. 30 Vasta-aineen ristireaktio erilaisten muiden pepti dien kanssa
Humaani-ANP:n monoklonaalisen vasta-aineen risti-reaktiivisuus erilaisten muiden peptidien kanssa havaittiin radioimmunologisen, sitoutumisen estymistä koskevan 35 kokeen avulla. Koe suoritetaan erityisessä määrityspusku-rissa (0,02 M natriumfosfaattia; 0,15 M NaCl; 0,01 % tio- 90988 11 mersaalia; 0,1 % gelatiinia; 0,01 % BSA (häränseerumin albumiinia) ja 0,1 % Triton-X 100, pH 7,4). Radioaktiivi-eesti merkattua ihmisen 125jodi-a-humaani-ANP (aminohapot 1-28) tai rotan 125jodi-atriopeptiini II (Amersham Buch-5 ler) inkuboitiin yhdessä vasta-aineiden kanssa sopivassa laimennuksessa 16-48 tunnin ajan 4 °C:ssa. Kokonaistilavuus nousee 500 pl:aan. Sitoutumisen inhibointlkokeessa koeerä sisältää samassa tilavuudessa lisäksi merkkaamaton-ta antigeeniä tai erilaisia inhibilttoreita vaihtelevina 10 konsentraatioina. Inkuboinnin lopussa adsorboidaan hiileen vasta-aineeseen sitoutumaton, radioaktiivisesti merkattu 125jodi-antigeeni (humaani-a-ANP, jossa on aminohapot 1-28 tai rotan atriopeptiini II) aktiivihiilen suspension (0,02 N natriumfosfaatti; 2 % Norit-A-aktiivihiili; 0,02 % Dex-15 tran 60; 0,1 % BSA sekä 10 mM Na2-EDTA, pH 7,4) lisäyksen ja tätä seuraavan, 20 minuutin pituisen, jäiden päällä suoritetun inkuboinnin jälkeen. Tä.män jälkeen aktiivihiili sedimentoidaan sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 3 600 g:11a ja radioaktiivisuus määritetään supernatantis-20 ta. Mitattiin erilaisten peptidien konsentraatio, joka tarvitaan syrjäyttämään 50 % vasta-aineen 125jodiantigeenis-tä. Kuten kuvioista 1 ja 2 käy selville, vasta-aineet reagoivat erittäin spesifisesti ihmisen ja rotan sydäneteisen peptidien kanssa. Ristireaktiivisuutta muiden suola-vesi-25 talouden säätelyyn osallistuvien välittäjien kanssa ei voitu osoittaa. Täsmälleen niin tehottomia olivat erilaiset vasoaktiiviset aineet (ks. taulukot 1 ja 2).
Esimerkki 3
Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien 30 monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ANP-immuunireaktiivisuuden osoittaminen biologisissa nesteissä ja kudoksissa monoklonaalisen vasta-aineen avulla_
Suurissa laimennuksissa voidaan antigeenit määrit-35 tää kvantitatiivisesti radioimmunologisen pitoisuusmääri- 12 tyksen avulla. Tätä koetta varten tarvitaan erittäin spesifinen vasta-aine sekä radioaktiivisesti merkattu antigeeni. Radioaktiivisesti merkatun antigeenin sitoutuminen vasta-aineeseen voidaan annoksesta riippuen inhiboida ei-5 radioaktiivisella antigeenillä. Jos määrättyjä, erilaisia, ei-radioaktiivisia antigeenin konsentraatioita inkuboidaan vasta-aineen ja radioaktiivisesti merkatun antigeenin vakiokonsentraatioiden kanssa, voidaan tällä tavalla laatia luonteenomainen kalibrointikäyrä. Kuvio 1 esittää sello laista kalibrointikäyrää ja radioaktiivisesti merkatun antigeenin (125jodi-humaani-aA-NP, aminohapot 1-28) syrjäytymistä mAK 23M-D9:stä erilaisten atriopeptiinien tai niiden johdannaisten avulla. Tällöin esitettiin radioaktiivisen antigeenin sitoutuminen vasta-aineisiin prosent-15 teinä merkkaamattoman antigeenin tai sen fragmentin kon-sentraatiota vastaan fmoolina/ml. Tällöin merkitsee _._ Humaani-a-ANP (1 - 28) -------- ------ Humaani-ANP-fragmentti (7 - 28) 20__ANP-fragmentti (18 - 28)
Koe suoritettiin ascites-nesteellä, laimennuksella 1:1 500 000, kokeessa kuvatulla tavalla. Viljelmäsuperna-tantilla suoritettu koe antaa samanlaisia tuloksia, ai-25 noastaan käytettävä laimennus on tekijän 500 - 1 000 verran pienempi. Tämä koe ilmaisee selvästi, että ANP-fragmentti (aminohapot 18 - 28) el kykene syrjäyttämään radioaktiivisesti merkattua antigeeniä vasta-aineesta. Vasta-aineella ei siis ole ristireaktiivisuutta tämän fragmentin 30 kanssa. Antigeenin tuntemattomat määrät liuoksessa voidaan määrittää tämän kalibrointikäyrän avulla. Kyseessä olevassa keksinnössä kuvattuun monoklonaaliseen vasta-aineeseen perustuva radioimmunologinen pitoisuusmääritys ja 125jodi-humaani-a-ANP: n (aminohapot 1 - 28) käyttö "tracerina” 35 tekevät mahdolliseksi määrittää biologisissa nesteissä ja 90988 13 kudosuutteissa aina konsentraatlona 20 pg/ml saakka, mikä vastaa määrää 6 fmol/ml (ks. kuvio 1).
Kuvio 2 esittää mAK 11A-All:n avulla, joka reagoi spesifisesti rotan atrlopeptlinln kanssa, suoritettua 5
__ Atrlopeptllnl I
-----1·- ---- Atrlopeptllnl II
--/\- Atrlopeptllnl III
-----A----- ANP-framgenttia (13 - 28) 10 Käyrä on sama kuin kuviossa 1.
Koe suoritettiin ascites-nesteellä käyttäen loppu-laimennusta 1:1 250 000 tekstissä kuvatulla tavalla. Vil-jelmäsupernatantllla suoritettu koe antaa samanlaisia tu-15 loksia, ainoastaan käytettävä laimennus on tekijän 500 -1 000 verran pienempi. Tämä koe ilmaisee selvästi, että ANP-fragmentti (aminohapot 13 - 28) ei kykene syrjäyttämään radioaktiivisesti merkattua antigeeniä vasta-aineesta. Vasta-aineella ei myös ole ristireaktiivisuutta tä-20 män fragmentin kanssa. Tämän kalibrointlkäyrän avulla voidaan määrittää liuoksesta tuntemattomia määriä antigeeniä. Radioimmunologinen pitolsuusmääritys, joka perustuu kyseessä olevassa keksinnössä kuvattua monoklonaaliseen vasta-aineeseen sekä 125jodi-atriopeptiini III:n käyttöön "tra-25 cerina", tekee mahdolliseksi määrittää biologisissa nesteissä ja kudosuutteissa aina konsentraatioon 20 pg/ml saakka, joka vastaa määrää noin 5 fmol/ml (ks. kuvio 2). Kyseessä olevassa keksinnössä kuvattujen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla on tässä yhteydessä kuvatun radio-30 immunologisen menetelmän rinnalla mahdollista suorittaa myös muita immunologisen pitolsuusmäärityksen muita muotoja (esim. ELISA, kemiluminointiin perustuva määritys.
14
Taulukko 1 mAK 23M-D9: n ristireaktiivisuuden tutkiminen muiden endogeenisten välittäjien kanssa, joilla on suoni vaikutusta tai vaikutusta suola-vesitalouteen 5 Aine Maksim, tutkittu Ristireak- kons. (pmol/ml) tiivisuus Angiotensiini II (humaani) 14
Leu-enkefaliini 26
Substanssi P 10 - 10 Aldosteroni 44 ACTH (sika) 4
Bradykiniini 13 γ-MSH 10
Insuliini (rotta) 3 15 Vasopressiini 15
Kaniini (sika) 0,5
Taulukko 2 mAK 11A-All:n ristireaktiivisuuden tutkiminen mui-20 den endogeenisten välittäjien kanssa, joilla on suonivaikutusta tai vaikutusta suola-vesitalouteen Aine Maksim, tutkittu Ristireak- kons. (pmol/ml) tiivisuus Angiotensiini II (humaani) 14 25 Leu-enkefaliini 26
Substanssi P 10 -
Aldosteroni 44 ACTH (sika) 4
Bradykiniini 13 30 γ -MSH 10
Insuliini (rotta) 3
Vasopressiini 15
Reniini (sika) 0,5 li
Claims (9)
1. Monoklonaaliset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne on valmistettu natriumdiureesia aiheuttavia 5 nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä vastaan, että ne eivät ristireagoi angiotensiini II:n, leu-enkefaliinin, substanssi P:n, aldosteronin, ACTH:n, bradykiniinin, gamma-MSH:n, insuliinin, vasopressiinin ja reniinin kanssa ja että ne ovat valmistettavissa viljelemällä hybridoomasolu-10 linjaa NCACC 850 314/1 tai NCACC 850 314/2 sopivassa vil-jelyvällaineessa ja ottamalla vasta-aineet talteen super-natantista.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne on valmis- 15 tettu natriumdiureesia aiheuttavia rotan sydäneteisen peptidejä vastaan.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne on valmistettu natriumdiureesia aiheuttavia ihmisen sydäneteisen 20 peptidejä vastaan.
4. Hybridoomasolulinjat, tunnetut siitä, että ne tuottavat jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisia monoklonaalisla vasta-aineita ja että niillä on NCACC-talletusnumerot 850 314/1 ja 850 314/2.
5. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mu kaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 4 mukaisia solulinjoja viljellään sopivassa viljelyväliaineessa ja vasta-aineet otetaan talteen supernatantista tai että 30 hybridoomasoluja injektoidaan syngeenisiin tai semisyn- geenisiin hiiriin ja vasta-aineet otetaan talteen verestä tai vatsaontelon askiitesnesteestä.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö natriumdiureesia al-35 heuttavien sydäneteisen peptidien määrittämisessä in vitro biologisista nesteistä.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten mo-noklonaalisten vasta-aineiden käyttö natriumdiureesia aiheuttavien sydäneteisen peptidien määrittämisessä in vitro verestä, plasmasta, seerumista, virtsasta, imunes- 5 teestä tai luuydinnesteestä.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten mo-noklonaalisten vasta-aineiden käyttö immunoanalyysien valmistuksessa.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten mo- 10 noklonaalisten vasta-aineiden käyttö natriumdiureesia aiheuttavien sydäneteisen peptidien eristämisessä immuno-adsorptiokromatografian avulla. 90988
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3509958 | 1985-03-20 | ||
DE19853509958 DE3509958A1 (de) | 1985-03-20 | 1985-03-20 | Monoklonale antikoerper gegen atriale, natriuretische peptide vom menschen |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI861128A0 FI861128A0 (fi) | 1986-03-18 |
FI861128A FI861128A (fi) | 1986-09-21 |
FI90988B true FI90988B (fi) | 1994-01-14 |
FI90988C FI90988C (fi) | 1994-04-25 |
Family
ID=6265723
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI861128A FI90988C (fi) | 1985-03-20 | 1986-03-18 | Monoklonaaliset vasta-aineet natriumdiureesia lisääviä nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä kohtaan |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5156977A (fi) |
EP (1) | EP0195331B1 (fi) |
JP (2) | JPH0648994B2 (fi) |
KR (1) | KR940010021B1 (fi) |
CN (1) | CN1017349B (fi) |
AT (1) | ATE75754T1 (fi) |
AU (1) | AU570838B2 (fi) |
CA (1) | CA1340391C (fi) |
DE (2) | DE3509958A1 (fi) |
DK (1) | DK165955C (fi) |
ES (1) | ES8801945A1 (fi) |
FI (1) | FI90988C (fi) |
GR (1) | GR860732B (fi) |
IL (1) | IL78172A (fi) |
NO (1) | NO170692C (fi) |
PT (1) | PT82215B (fi) |
ZA (1) | ZA862029B (fi) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1335082C (en) * | 1987-09-01 | 1995-04-04 | Hiroo Imura | Monoclonal antibody recognizing -hanp and a reagent for immunoassay of -hanp |
JP2724315B2 (ja) * | 1988-02-29 | 1998-03-09 | 塩野義製薬株式会社 | α−ANPを認識するモノクローナル抗体およびα−ANPの免疫学的測定法 |
CA1339210C (en) * | 1988-05-31 | 1997-08-05 | John Lewicki | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
JP2561513B2 (ja) * | 1988-07-04 | 1996-12-11 | 塩野義製薬株式会社 | γ−ANPを認識するモノクローナル抗体 |
JP2665850B2 (ja) * | 1991-11-14 | 1997-10-22 | 塩野義製薬株式会社 | hBNPのC端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
AU2493499A (en) * | 1998-02-03 | 1999-08-16 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Determination of the amount of hlhbeta core fragment in a sample from a subject and uses thereof |
EP1698901B1 (de) * | 1999-01-29 | 2008-07-30 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zum Nachweis von N-terminalem proBNP |
US6949282B2 (en) | 2000-07-07 | 2005-09-27 | Delphi Technologies, Inc. | Contoured crushable composite structural members and methods for making the same |
US20170363620A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Abbott Laboratories | BIOMARKERS TO PREDICT NEW ONSET HEART FAILURE WITH PRESERVED EJECTION FRACTION (HFpEF) |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4451570A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-29 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line |
US4659678A (en) * | 1982-09-29 | 1987-04-21 | Serono Diagnostics Limited | Immunoassay of antigens |
JPH0794473B2 (ja) * | 1984-03-02 | 1995-10-11 | サントリー株式会社 | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
JPS60184098A (ja) * | 1984-03-02 | 1985-09-19 | Suntory Ltd | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
US4596769A (en) * | 1984-03-05 | 1986-06-24 | Temple University | Monoclonal antibodies to peptidoglycan and methods of preparing same |
WO1985004870A1 (en) * | 1984-04-19 | 1985-11-07 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Novel atrial natriuretic/vasodilator polypeptides |
US4666829A (en) * | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
-
1985
- 1985-03-20 DE DE19853509958 patent/DE3509958A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-03-04 NO NO860804A patent/NO170692C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-03-08 EP EP86103100A patent/EP0195331B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-08 AT AT86103100T patent/ATE75754T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-03-08 DE DE8686103100T patent/DE3685145D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-15 CN CN86101671A patent/CN1017349B/zh not_active Expired
- 1986-03-17 IL IL78172A patent/IL78172A/xx unknown
- 1986-03-18 CA CA000504379A patent/CA1340391C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-18 PT PT82215A patent/PT82215B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-03-18 FI FI861128A patent/FI90988C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-03-18 AU AU54914/86A patent/AU570838B2/en not_active Expired
- 1986-03-19 ES ES553154A patent/ES8801945A1/es not_active Expired
- 1986-03-19 KR KR1019860002012A patent/KR940010021B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-03-19 ZA ZA862029A patent/ZA862029B/xx unknown
- 1986-03-19 DK DK127686A patent/DK165955C/da not_active IP Right Cessation
- 1986-03-19 GR GR860732A patent/GR860732B/el unknown
- 1986-03-20 JP JP61061055A patent/JPH0648994B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-03-14 US US07/323,527 patent/US5156977A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-14 JP JP6014950A patent/JPH0746999B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5047507A (en) | Monoclonal antibodies with specificity affinity for human carcinoembryonic antigen | |
FI87933B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av monoklonal humanreninantikropp r 3-36-16 och hybridomacell som producerar densamma | |
JP2758394B2 (ja) | ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクロナール抗体 | |
FI90988B (fi) | Monoklonaaliset vasta-aineet natriumdiureesia lisääviä nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä kohtaan | |
US5051364A (en) | Anti-lipocortin-I and anti-lipocortin-II monoclonal antibodies | |
US4767843A (en) | Monoclonal antibody to cardiac myosin heavy chain | |
DK175750B1 (da) | Monoklonale antistoffer, der genkender gamma-atrialt natriuretisk polypeptid, hybridomceller, der producerer sådanne antistoffer, og fremstilling og anvendelse deraf | |
US5124264A (en) | Monoclonal antibody recognizing atrial natriuretic polypeptide | |
EP0205177B1 (en) | Method of assaying myosin light chain | |
JP2609858B2 (ja) | コラゲナーゼインヒビターの酵素免疫学的定量法 | |
JP4493882B2 (ja) | 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体 | |
NUSSBERGER et al. | A monoclonal antibody specific for the carboxy-terminus of angiotensin II | |
EP0364560A1 (en) | Diagnostic methods and systems for quantifying apo ai | |
Dardenne et al. | Autoimmune mice develop antibodies to thymic hormone: production of anti-thymulin monoclonal autoantibodies from diabetic (db/db) and B/W mice. | |
US5141865A (en) | Monoclonal antibodies which bind thromboxane A2 receptor antagonists and diagnostic methods based thereon | |
JPH08157500A (ja) | Fas抗原の定量法 | |
JP2004091454A (ja) | 抗体及びその製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法 | |
EP0439117A1 (en) | Monoclonal antibodies which bind (E)-5-(2-bromovinyl)-arabinofuranosyluracil and diagnostic methods based thereon | |
JPH03504131A (ja) | 免疫原性ヒト・インターロイキン‐3ペプチドおよびそれに対するモノクローナル抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
FG | Patent granted |
Owner name: BAYER HEALTHCARE AG |
|
MA | Patent expired |