FI90988B - Monoklonaaliset vasta-aineet natriumdiureesia lisääviä nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä kohtaan - Google Patents

Description

90988

Monoklonaaliset vasta-aineet natriumdiureesia lisääviä nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä kohtaan

Kyseessä oleva keksintö koskee yleisesti uusia hyb-5 ridoomasolulinjoja, erityisesti hybridoomasolulinj oj a, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita (mAK), jotka ovat spesifisiä, natriumdiureesia lisääviä sydäneteisen peptidejä kohtaan, erityisesti peptidejä kohtaan, joita ihminen ja rotta valmistavat, sekä niiden käyttöä dlag-10 nostisena aineena ja tutkimustarkoituksiin.

Hiiren myeloomasolujen yhdistäminen immunisoitujen hiirien pernasolujen kanssa [Köhler ja Milstein, Nature 256, 495 - 497 (1975)] oli ensimmäinen osoitus mahdollisuudesta saada jatkuvia solulinjoja, jotka valmistavat 15 tasa-aineisia (ns. "monoklonaalisia") vasta-aineita. Siitä lähtien on tehty lukuisia yrityksiä erilaisten hybridiso-lujen (ns. "hybridoomien") valmistamiseksi ja niiden muodostamien vasta-aineiden käyttämiseksi erilaisiin tieteellisiin tutkimuksiin [esim.: Current Topics in Microbiology 20 and Immunology, osa 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Mel-chers et al., Springer Verlag, 1978, sekä viitteet siinä; C. Barnstable et al., Cell 14, 9 - 20 (1978); P. Parham, W.F. Bodmer, Nature 276, 397 - 399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, nidos 2, D.M. Wier, julkai-25 sija Blackwell 1978, luku 25; Chem. Eng. News, 15 - 17 (1979), 9]. Nämä työt kuvaavat periaatteellista tekniikkaa monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hybridoomien avulla.

Monoklonaalisia vasta-aineita on valmistettu histo-30 kompabiliteettiantigeenejä, hapteeneja ja entsyymejä vastaan. El kuitenkaan tunneta yhtään monoklonaalista vasta-ainetta, joka reagoi hyvin selektiivisesti natriumdiureesia lisäävien nisäkkäiden sydäneteisen peptidien, kuten esimerkiksi ihmisen ja rotan peptidien, kanssa.

35 2

Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien yhteydessä on kysymys ryhmästä, jolla on erilaisia ketju-pituuksia, joiden pienin tehokas sekvenssi koostuu 23 aminohaposta. Peptidit, joissa on lisäksi N-terminaalises-5 ti ja C-terminaalisesti muita aminohappoja, ovat yhtä tehokkaita. Peptidit syntyvät entsymaattisten vaikutusten kautta sydäneteisessä noin 152 aminohapon suuruisesta esi-astemolekyylistä. ANP koodaava geeni on kloonattu ja DNA on sekvensoitu.

10 ANP:t indusoivat lyhytkestoisen, voimakkaan nat- riumdiureesin, jossa yhteydessä ei ole tähän mennessä voitu osoittaa aineiden tarkkaa vaikutuspistettä tubuluksis-sa. Lisäksi ANP:t ovat tehokkaita verisuonia laajentavia aineita, jotka mm. voivat vastaanvaikuttaa noradrenalii-15 nin, angiotensiini II:n, histamiinin ja serotoniinin verisuonivaikutukseen. ANP:n vaikutusta ei lopeteta indometa-siinin avulla, mikä tekee epätodennäköiseksi vaikutuksen endogeenisen prostaglandiinisynteesin kautta. On kuvattu ANP:n verenpainetta alentavia vaikutuksia "two-clip"-hy-20 pertoniaa potevilla rotilla sekä SH-rotilla.

Eristetyillä soluilla voitiin osoittaa inhiboivaa vaikutusta aldosteronin ja vasopressiinin erittymiseen. Tavanomaisia vasta-aineita käyttämällä voidaan radioimmu-nologisesti mitata ANP:n plasmapeili, joka riippuu kulloi-25 senkin koe-eläimen tilavuustilasta. 125J:lla merkatulla ANP-johdannaisella voidaan osoittaa spesifinen sitoutuminen zona glomerulosa -soluihin. Ensimmäiset kokeet viit-taavat kallikreinin vapautumiseen munuaisista ANP:n avulla. Tietyissä olosuhteissa voidaan peptidin munuaisvaiku-30 tus lopettaa Haloperidolilla suoritetun esikäsittelyn avulla (Sagnella ja MacGregor, Nature 399, 666 - 668, 1984). ANP:n vaikutusspektri tekee erittäin todennäköiseksi tämän peptidin kausaalisen ja oireenmukaisen osallistumisen verenkiertosairauksiin (hypertonia, hypotonia, val-35 timonkovetustauti), sydänsairauksiin (akuutti ja krooninen 90988 3 sydämen vajaatoiminta, sydäninfarkti, sydämen rytmihäiriöt, sydämen sepelvaltimosairaus) sekä munuaissairauksiin (akuutti ja krooninen munuaisvaurio erilaisten perussairauksien aikana, uremia). Kaikissa mainituissa sairaus-5 tapauksissa tulee sen tähden olemaan suuri merkitys erilaisissa kehon nesteissä (esim. veressä, plasmassa, seerumissa, virtsassa, lymfassa tai selkäydinnesteessä) olevan ANP:n kvantitatiivisella määrityksellä.

Totunnaisten antiseerumeiden avulla mitatut ANP:n 10 plasmapeilit ovat osittain hyvin korkeita, mikä voidaan selittää näiden vasta-aineiden ristireaktion tai puuttuvan spesifisyyden avulla. Erittäin spesifisiä (monoklonaali-sia) vasta-aineita käyttämällä voidaan sulkea pois vaara määrittää väärin natriumdiureesia lisäävien, sydäneteisen 15 peptidien korkea plasmapeili. Täten sellaiset vasta-aineet soveltuisivat ihanteellisesti kaikkien tautien, joihin liittyy muuttunut ANP-peili, taudinmääritykseen.

Kyseessä oleva keksintö koskee monoklonaalisia vasta-aineita, joille on tunnusomaista, että ne on valmistet-20 tu natriumdiureesia aiheuttavia nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä vastaan, että ne eivät ristireagoi angiotensiini II:n, leu-enkefaliinin, substanssi P:n, aldosteronin, ACTH:n, bradykiniinin, gamma-MSH:n, insuliinin, vasopres-siinin ja reniinin kanssa ja että ne ovat valmistettavissa 25 viljelemällä hybridoomasolulinjaa NCACC 850 314/1 tai NCACC 850 314/2 sopivassa viljelyväliaineessa ja ottamalla vasta-aineet talteen supematantista. Kyseessä oleva keksintö koskee edelleen hybridoomasolulinjoja, jotka syntetisoivat ja erittävät näitä monoklonaalisia vasta-aineita 30 nisäkkäiden, erityisesti ihmisen ja rotan, natriumdiureesia lisääviä sydäneteisen peptidejä kohtaan. Nämä hybri-doomat valmistetaan von Köhlerin ja Milsteinin alussa mainittujen menetelmien mukaisesti. Immunogeenin kantajalla, esim. proteiiniin sidotuilla, natriumdiureesia lisäävällä 35 sydäneteisen peptidillä suoritetun hiirien immunisoinnin 4 jälkeen näiden hiirien pernasolut sulautuvat yhteen hiiren myeloomasolulinjan solujen kanssa. Tästä syntyviä hybri-doomia tutkitaan systemaattisesti vasta-aineiden suhteen, jotka reagoivat selektiivisesti natriumdiureesia lisäävien 5 sydäneteisen peptidien kanssa. Tällä tavalla eristettiin keksinnön mukaiset hybridoomat, jotka valmistavat mono-klonaalisia vasta-aineita natriumdiureesia lisääviä sydäneteisen peptidejä vastaan. Hybridoomat talletettiin tal-lennusnumeroilla 850314/1 (hybridoomasolulinja, joka tuot-10 taa mAK:ta 11A-Ali) sekä 850314/2 (hybridoomasolulinja, joka tuottaa mAK:ta 23 M-D9), National Collection of Animal Cell Cultures-talletuslaitokseen, PHLS Centre for Applied Mikrobiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, UK.

15 Kyseessä olevan keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää esimerkiksi natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien peilin määrittämiseen biologisissa nesteissä, kuten esimerkiksi veressä, plasmassa, seerumissa, virtsassa, lymfassa tai aivo-selkäydinnesteessä. Ky-20 seessä olevan keksinnön mukaiset vasta-aineet soveltuvat erityisen hyvin immunologisten määritysmenetelmien valmistukseen. Mutta niitä voidaan käyttää myös natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien eristämiseen immuno-adsorptiokromatografian avulla.

25 ANP:n merkityksen tutkimista varten, erilaisin fy siologisin ja patofysiologisin edellytyksin, ovat eläin-koetutkimukset ehdottoman tarpeellisia. Näiden tehtävien ja ANP:n farmakologiaa koskevien töiden edellytyksenä ovat spesifiset ja herkät kokeet kvantitatiivista määritystä 30 varten kehonnesteissä.

Kyseessä olevan keksinnön mukaiset vasta-aineet soveltuvat myös erittäin hyvin fysiologisiin ja farmakologisiin kokeisiin.

Hybridoomien valmistus käsittää ylipäänsä seuraavat 35 vaiheet: 90988 5 A) Nisäkkäiden immunisointi immunogeenisella kantaja-aineella, erityisesti immunogeeniseen kantaja-ainepro-teiiniin (esim. tulivuorikotilon hemosyaniiniin, KLG) sidotulla, natriumdiureesia lisäävällä sydäneteisen pepti- 5 dillä, Joka on peräisin esimerkiksi ihmiseltä tai rotalta (KLH-ANP). Naaraspuoliset Balb/c-hiiret osoittautuivat tähän tarkoitukseen käyttökelpoisiksi. Immunisointisuunni-telma Ja KLH-ANP:n konsentraatiot tuli valita siten, että muodostuu riittävä määrä antigeeniä stimuloivia lymfosyyt-10 tejä. Kolme immunisointia, Jotka suoritettiin 14 päivän välein 100 pg:lla KLH-ANP hiirtä kohti, ruiskeena, Joka oli fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, osoittautuivat tehokkaiksi.

B) Immunisoitujen nisäkkäiden (esim. hiirien) per-15 nasolujen suspension saanti Ja valmistus sopivassa elatus- aineessa. Noin 1 ml elatusainetta/perna on riittävä määrä. Tähän tarvittavat koetekniikat ovat tunnetut.

C) Lietettyjen pernasolujen liittäminen sopivan so-lulinjan myeloomasolujen kanssa (esim. hiiren myelooma 20 PX63Ag8), missä käytetään sopivaa yhteenliittämisen kiih- dytintä (esim. polyetyleeniglykolia). Edullisia sulautumisen katalyyttejä ovat polyetyleeniglykolit, joiden keskimääräinen molekyylipaino on 1 000 - 4 000 (esim. kaupallisesti saatava PEG 1000 jne.). Kuitenkin voidaan käyttää 25 myös muita tunnettuja yhteenliittämisen kiihdyttäjiä. Suhde, jossa on noin 10 pernasolua myeloomasoluja kohti, on edullinen. Sulauttamiselatusaineen kokonaistilavuus noin 0,5 - 1,0 ml on riittävä 108 pernasolua varten. Hiiren monet myeloomasolut ovat tunnettuja ja saatavissa esim.

30 tieteellisistä laitoksista tai solujentallennuslaitoksis-ta. Käytettyjen solulinjojen tulee lähinnä osoittaa geneettistä vauriota, niin että sulautumattomat myeloomasolut kuolevat tietyssä valintaväliaineessa, kun taas hybridit jäävät eloon. Useimmiten käytetään 8-atsaguanii-35 nin suhteen resistenttejä solulinjoja, joilta puuttuu ent- 6 syymi hypoksantiini-guaniini-fosforibosyyli-transferääsi ja jotka sen tähden eivät pysty kasvamaan HAT-elatusai-neessa (hypoksantiini, aminopteriini, tymidiini) (Science 145:709, 1964).

5 Käytetyn myeloomasolulinjan tulee olla etupäässä myös "non-secreting"-tyyppiä, jotta se ei itse muodosta vasta-aineita tai immunoglobuliinien L-ketjuja. Tietyissä tapauksissa voivat kuitenkin erittävät myeloomasolut olla edullisia.

10 D) Yhteensulautumaseosta (perna- ja myeloomasolut) laimennetaan ja kasvatetaan yksittäisissä putkiloissa, selektiivisessä elatusaineessa, niin että sulautumattomat solut eivät lisäänny ja kuolevat 1-2 viikon kuluessa. Yksittäiset, yhteensulautuneet solut eristetään sillä ai-15 kaa kun laimennusaineen tilavuus säädetään siten, että yksittäiseen putkiloon (esim. mikrotiitterilevyn jokaiseen syvennykseen) tulee tietty määrä soluja (noin 1-4).

E) Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien vasta-aineiden läsnäolon tarkastus jokaisesta putki- 20 losta.

F) Toivottuja vasta-aineita valmistavien hybridoo-mien valinta (esim. rajoittavan laimennuksen avulla) ja kloonaus.

Kun kerran haluttu hybridooma on valittu ja kloo-25 nattu, voidaan vasta-aine valmistaa kahdella erilaisella tavalla. Erittäin puhtaita, monoklonaalisia vasta-aineita saadaan, kun hybridooma viljellään sopivassa elatusaineessa tietty aika ja vasta-aine otetaan supernatantista. Sopiva elatusaine ja viljelyn optimikesto ovat yksinkertai-30 sesti määritettävissä. Tämä in vitro -tekniikka tuottaa monoklonaalisia vasta-aineita, joissa on epäpuhtautena vain pieniä määriä heterologisesta seerumista (vasikan sikiön seerumista) peräisin olevia proteiineja.

Oleellisesti korkeampien konsentraatioiden valmis-35 tamiseksi monoklonaalisia vasta-aineita, joiden puhtaus on 90988 7 vain vähän vähäisempi, voidaan valittua hybridoomaa ruiskuttaa vatsaontelonsisäisesti hiirelle - etupäässä syngee-ni- tai semisyngeenihiirelle. Tämä johtaa hiiressä tietyn inkubointiajan jälkeen kasvaimien kehittymiseen, joka va-5 pauttaa koe-eläimen veressä ja vatsaontelon tulehdusnes-teessä (ascites) korkean vasta-ainekonsentraation (5-20 mg/ml). Siinä tapauksessa, että näillä hiirillä on veressä ja vesivatsassa (ascites) normaaleja vasta-aineita, niin niiden konsentraatio mAK:een verrattuna on hyvin al-10 hainen. Täten saadulla monoklonaalisella vasta-aineella on hyvin korkea tiitteri (se on aktiivinen laimennuksissa 10~3 tai sen alapuolella) ja spesifisen ja epäspesifisen immunoglobuliinin suhde on noin 20:1.

Esimerkki 1 15 Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus natrium- diureesia lisääviä ihmisen ja rotan sydänpeptidejä kohtaan Immunisointiin käytettyjen antigeenien valmistus Antigeeninä käytettiin ihmisen a-ANP:n tai rotan atriopeptiini II:n (Bachem) ja tulivuorikotilon hemosya-20 niinin (KLH, Pacific Biomarine Supply Company) konjugaat-tia. Valmistusta varten sekoitettiin KLH ja humaani a-ANP tai atriopeptiini II moolisuhteessa 1:1 ja sekoitettiin konsentraationa 2 mg/ml fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa keittosuolaliuoksessa glutaraldehydin kanssa. Glu-25 taraldehydin loppukonsentraatio reaktioerässä nousi 0,25 %:iin. Yhden tunnin mittaisen, huoneen lämpötilassa suoritetun inkuboinnin jälkeen dialysoitiin proteiinikon-jugaattia 4 *C:ssa useita kertoja fosfaatilla puskuroitua fysiologista keittosuolaliuosta vastaan.

30 Balb/c-hilrien immunisointi

Naaraspuolisia Balb/c-hiiriä immunisoitiin vatsaontelonsisäisesti 100 pg:lla KLH-ANP-konjugaattia, joka oli 0,2 ml:ssa Freundin täydellistä adjuvanttia. 14 päivää myöhemmin eläimet saivat uudelleen 100 pg antigeeniä vat-35 saontelonsisäisesti Freundin epätäydellisessä adjuvantis- 8 sa. Kaksi muuta immunisointia tehtiin laskimonsisäisesti 14 päivän välein kulloinkin 50 pl:lla antigeeniä, joka oli 100 pg:ssa fosfaatilla puskuroitua keittosuola-liuosta, eläintä kohti. Kolmen päivän kuluttua viimeisestä antigee-5 nin antamisesta eläimiltä otettiin pernat.

Pernasolususpension valmistus

Kerätyistä pernoista valmistettiin yksittäissolu-suspensio puristamalla elimet ruostumattomasta teräksestä valmistetun siivilän läpi. Solut siirrettiin Dulbeccon 10 "Minimal Essential" -elatusaineeseen (DMEM), jota oli täydennetty glukoosilla (4,5 g/1), penisilliinillä (100 yk-sikköä/ml) sekä streptomysiinillä 100 pg/ml. Solut pestiin kolme kertaa DMEM:llä ja lietettiin uudelleen haluttuna konsentraationa samaan elatusaineeseen. Yleensä saa-15 tiin noin 108 solua/perna.

Mveloomasolulen valmistus Tässä yhteydessä käytetty myeloomasolulinja X63Ag8.653 on hiiren myeloomasolulinjan P3-X63-Ag8 ala-klooni, joka ei ilmennä immunoglobuliinien raskaita eikä 20 kevyitä ketjuja [J. Immunol. 123: 1543-1550 (1980)]. Solut ovat herkkiä 8-atsaguaniinin konsentraatiota 20 pg/ml kohtaan eivätkä voi kasvaa elatusaineessa, joka sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT). Niitä viljeltiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty glukoosilla (4,5 25 g/1), glutamiinilla (20 mM), penisilliinillä (1 000 yksik- köä/ml), streptomysiinillä (100 pg) ja 10 %:lla vasikan sikiön seerumia (täydellinen elatusaine). Yhteensulautumisen ajankohtana myeloomasolut olivat solun lisääntymisen logaritmisessa vaiheessa.

30 Solujen yhteenliittyminen

Pernasolususpensiot lisättiin myeloomasoluihin DMEM:ssä, josta seerumi puuttui, suhteessa 10:1 ja niitä sentrifugoitiln 10 minuutin ajan 200 g:11a pyöreäpohjai-sissa kupeissa. Solujen laskeutumisen jälkeen supernatant-35 ti dekantoitiin varovaisesti. Soluja inkuboitiin 2 ml:n kanssa polyetyleeniglykolin, molekyylipaino 2 000, liuok- 90988 9 sessa [laimennettu 30 %:iin (paino/paino) DMEM:113, pH 7,6], yhden minuutin ajan 37 °C:ssa. Tähän lisättiin 20 ml DMEM, mihin solut lietettiin varovaisesti uudelleen muutamien minuuttien aikana. Niitä sentrifugoitiin vielä kerran 5 viiden minuutin ajan 200 g:11a ja solusaostuma lietettiin uudelleen HAT-elatusaineeseen konsentraationa 10* solua/ml, minkä jälkeen ne jaettiin 1 ml:n suuruisina erinä Costar-levyille.

Hvbridooman kasvatus 1a valinta 10 Solujen yhteensulautumisen jälkeen soluja kasvatet tiin HAT-elatusaineessa (hypoksantiini, aminopterllnl, tymidiini) 37 °C:ssa 5 %:n kanssa COz kosteassa atmosfäärissä. Muutamien viikkojen jälkeen hybridoomasoluviljel-mien supernatantit tutkittiin anti-ANP-aktiivisuuden ole-15 massaolon suhteen vastaavan entsyymi-immunologisen määrityksen avulla (ks. alla).

Ne hybridoomasolulinjat, jotka antoivat positiiviset tulokset anti-ANP-kokeessa, valittiin kloonausta varten.

20 Tällöin hybridoomille suoritettiin "rajalaimennus", jolloin mikrotiitterilevyn 96 syvennykseen siirrostettiin keskimäärin 0,5 solua syvennystä kohti, jolloin "syöttösoluina” lisättiin 105 hiiren tymosyyttlä/syvennys. Tämän kloonausmenettelyn jälkeen anti-ANP-vasta-ainetta valmis-25 tavia soluja vielä lisättiin, ne jäähdytettiin ja niitä säilytettiin nestemäisessä typessä täydellisessä elatusai-neessa, joka sisälsi 25 % vasikani sikiön seerumia sekä 7,5 % dimetyylisulfoksidia.

Monoklonaalisten vasta-aineiden suurempien määrien 30 valmistus

Kloonattuja hybridoomla ruiskutettiin vatsaontelon-sisäisesti hiiriin, joita oli esikäsitelty 0,5 ml:11a "pristania”, jotta noin 10 - 15 päivän kuluttua voitiin saada vasta-ainetta sisältävää ascites-nestettä. Vasta-35 alneaktiivisuus määritettiin ascites-nesteessä radioaktiivisella sitoutumisen inhibitiokokeella (ks. esimerkki 3).

10

Anti-ANP-aktiivisuuden määritys villelmäelatusai-neiden supernatanteista 100 μΐ viljelmäelatusaineen supernatanttia pantiin mikrotiitterilevyille, joille oli kolmen tunnin ajan huo-5 neen lämpötilassa adsorboitu konjugaattia, joka oli muo- . dostettu häränseerumin albumiinista ja humaani-α-ANP:stä tai rotan atriopeptiinistä (5 pg/ml) ja jotka niin ollen oli pesty vedellä. Kaniinin anti-hiiri-immunoglobuliini, joka oli kytketty peroksidaasiin, lisättiin levyille; tä-10 män jälkeen levyjä inkuboitiin kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tislatulla vedellä suoritetun, 5-kertaisen pesun jälkeen lisättiin entsyymin suhteen soveliasta subs-traattipuskuria ja syntyneen, värjäytyneen tuotteen kon-sentraatio määritettiin mikrotiitterilevyille soveltuvan 15 fotometrin avulla.

Esimerkki 2

Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi

Monoklonaalisten vasta-aineiden tyypitys 20 Kyseessä olevan keksinnön yhteydessä kuvattujen mo noklonaalisten vasta-aineiden luokat ja alaluokat analysoitiin. Vasta-aine rikastettiin elatusaineen supernatan-tista seostamalla ammoniumsulfaatilla (40-%:inen kyllästys) ja puhdistettiin osittain. Immunoglobuliiniluokka 25 määritettiin Ouchterlonyn geelidiffuusiokokeessa käyttämällä luokkaspesifisiä anti-hiiri-immunoglobuliini-anti-seerumeita. Monoklonaalinen vasta-aine 23M-D9 ihmisen ANP vastaan kuuluu IgG^luokkaan. Monoklonaalinen vasta-aine 11A-A11 atriopeptiini II vastaan kuuluu myös IgGj-luokkaan. 30 Vasta-aineen ristireaktio erilaisten muiden pepti dien kanssa

Humaani-ANP:n monoklonaalisen vasta-aineen risti-reaktiivisuus erilaisten muiden peptidien kanssa havaittiin radioimmunologisen, sitoutumisen estymistä koskevan 35 kokeen avulla. Koe suoritetaan erityisessä määrityspusku-rissa (0,02 M natriumfosfaattia; 0,15 M NaCl; 0,01 % tio- 90988 11 mersaalia; 0,1 % gelatiinia; 0,01 % BSA (häränseerumin albumiinia) ja 0,1 % Triton-X 100, pH 7,4). Radioaktiivi-eesti merkattua ihmisen 125jodi-a-humaani-ANP (aminohapot 1-28) tai rotan 125jodi-atriopeptiini II (Amersham Buch-5 ler) inkuboitiin yhdessä vasta-aineiden kanssa sopivassa laimennuksessa 16-48 tunnin ajan 4 °C:ssa. Kokonaistilavuus nousee 500 pl:aan. Sitoutumisen inhibointlkokeessa koeerä sisältää samassa tilavuudessa lisäksi merkkaamaton-ta antigeeniä tai erilaisia inhibilttoreita vaihtelevina 10 konsentraatioina. Inkuboinnin lopussa adsorboidaan hiileen vasta-aineeseen sitoutumaton, radioaktiivisesti merkattu 125jodi-antigeeni (humaani-a-ANP, jossa on aminohapot 1-28 tai rotan atriopeptiini II) aktiivihiilen suspension (0,02 N natriumfosfaatti; 2 % Norit-A-aktiivihiili; 0,02 % Dex-15 tran 60; 0,1 % BSA sekä 10 mM Na2-EDTA, pH 7,4) lisäyksen ja tätä seuraavan, 20 minuutin pituisen, jäiden päällä suoritetun inkuboinnin jälkeen. Tä.män jälkeen aktiivihiili sedimentoidaan sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 3 600 g:11a ja radioaktiivisuus määritetään supernatantis-20 ta. Mitattiin erilaisten peptidien konsentraatio, joka tarvitaan syrjäyttämään 50 % vasta-aineen 125jodiantigeenis-tä. Kuten kuvioista 1 ja 2 käy selville, vasta-aineet reagoivat erittäin spesifisesti ihmisen ja rotan sydäneteisen peptidien kanssa. Ristireaktiivisuutta muiden suola-vesi-25 talouden säätelyyn osallistuvien välittäjien kanssa ei voitu osoittaa. Täsmälleen niin tehottomia olivat erilaiset vasoaktiiviset aineet (ks. taulukot 1 ja 2).

Esimerkki 3

Natriumdiureesia lisäävien sydäneteisen peptidien 30 monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ANP-immuunireaktiivisuuden osoittaminen biologisissa nesteissä ja kudoksissa monoklonaalisen vasta-aineen avulla_

Suurissa laimennuksissa voidaan antigeenit määrit-35 tää kvantitatiivisesti radioimmunologisen pitoisuusmääri- 12 tyksen avulla. Tätä koetta varten tarvitaan erittäin spesifinen vasta-aine sekä radioaktiivisesti merkattu antigeeni. Radioaktiivisesti merkatun antigeenin sitoutuminen vasta-aineeseen voidaan annoksesta riippuen inhiboida ei-5 radioaktiivisella antigeenillä. Jos määrättyjä, erilaisia, ei-radioaktiivisia antigeenin konsentraatioita inkuboidaan vasta-aineen ja radioaktiivisesti merkatun antigeenin vakiokonsentraatioiden kanssa, voidaan tällä tavalla laatia luonteenomainen kalibrointikäyrä. Kuvio 1 esittää sello laista kalibrointikäyrää ja radioaktiivisesti merkatun antigeenin (125jodi-humaani-aA-NP, aminohapot 1-28) syrjäytymistä mAK 23M-D9:stä erilaisten atriopeptiinien tai niiden johdannaisten avulla. Tällöin esitettiin radioaktiivisen antigeenin sitoutuminen vasta-aineisiin prosent-15 teinä merkkaamattoman antigeenin tai sen fragmentin kon-sentraatiota vastaan fmoolina/ml. Tällöin merkitsee _._ Humaani-a-ANP (1 - 28) -------- ------ Humaani-ANP-fragmentti (7 - 28) 20__ANP-fragmentti (18 - 28)

Koe suoritettiin ascites-nesteellä, laimennuksella 1:1 500 000, kokeessa kuvatulla tavalla. Viljelmäsuperna-tantilla suoritettu koe antaa samanlaisia tuloksia, ai-25 noastaan käytettävä laimennus on tekijän 500 - 1 000 verran pienempi. Tämä koe ilmaisee selvästi, että ANP-fragmentti (aminohapot 18 - 28) el kykene syrjäyttämään radioaktiivisesti merkattua antigeeniä vasta-aineesta. Vasta-aineella ei siis ole ristireaktiivisuutta tämän fragmentin 30 kanssa. Antigeenin tuntemattomat määrät liuoksessa voidaan määrittää tämän kalibrointikäyrän avulla. Kyseessä olevassa keksinnössä kuvattuun monoklonaaliseen vasta-aineeseen perustuva radioimmunologinen pitoisuusmääritys ja 125jodi-humaani-a-ANP: n (aminohapot 1 - 28) käyttö "tracerina” 35 tekevät mahdolliseksi määrittää biologisissa nesteissä ja 90988 13 kudosuutteissa aina konsentraatlona 20 pg/ml saakka, mikä vastaa määrää 6 fmol/ml (ks. kuvio 1).

Kuvio 2 esittää mAK 11A-All:n avulla, joka reagoi spesifisesti rotan atrlopeptlinln kanssa, suoritettua 5

__ Atrlopeptllnl I

-----1·- ---- Atrlopeptllnl II

--/\- Atrlopeptllnl III

-----A----- ANP-framgenttia (13 - 28) 10 Käyrä on sama kuin kuviossa 1.

Koe suoritettiin ascites-nesteellä käyttäen loppu-laimennusta 1:1 250 000 tekstissä kuvatulla tavalla. Vil-jelmäsupernatantllla suoritettu koe antaa samanlaisia tu-15 loksia, ainoastaan käytettävä laimennus on tekijän 500 -1 000 verran pienempi. Tämä koe ilmaisee selvästi, että ANP-fragmentti (aminohapot 13 - 28) ei kykene syrjäyttämään radioaktiivisesti merkattua antigeeniä vasta-aineesta. Vasta-aineella ei myös ole ristireaktiivisuutta tä-20 män fragmentin kanssa. Tämän kalibrointlkäyrän avulla voidaan määrittää liuoksesta tuntemattomia määriä antigeeniä. Radioimmunologinen pitolsuusmääritys, joka perustuu kyseessä olevassa keksinnössä kuvattua monoklonaaliseen vasta-aineeseen sekä 125jodi-atriopeptiini III:n käyttöön "tra-25 cerina", tekee mahdolliseksi määrittää biologisissa nesteissä ja kudosuutteissa aina konsentraatioon 20 pg/ml saakka, joka vastaa määrää noin 5 fmol/ml (ks. kuvio 2). Kyseessä olevassa keksinnössä kuvattujen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla on tässä yhteydessä kuvatun radio-30 immunologisen menetelmän rinnalla mahdollista suorittaa myös muita immunologisen pitolsuusmäärityksen muita muotoja (esim. ELISA, kemiluminointiin perustuva määritys.

14

Taulukko 1 mAK 23M-D9: n ristireaktiivisuuden tutkiminen muiden endogeenisten välittäjien kanssa, joilla on suoni vaikutusta tai vaikutusta suola-vesitalouteen 5 Aine Maksim, tutkittu Ristireak- kons. (pmol/ml) tiivisuus Angiotensiini II (humaani) 14

Leu-enkefaliini 26

Substanssi P 10 - 10 Aldosteroni 44 ACTH (sika) 4

Bradykiniini 13 γ-MSH 10

Insuliini (rotta) 3 15 Vasopressiini 15

Kaniini (sika) 0,5

Taulukko 2 mAK 11A-All:n ristireaktiivisuuden tutkiminen mui-20 den endogeenisten välittäjien kanssa, joilla on suonivaikutusta tai vaikutusta suola-vesitalouteen Aine Maksim, tutkittu Ristireak- kons. (pmol/ml) tiivisuus Angiotensiini II (humaani) 14 25 Leu-enkefaliini 26

Substanssi P 10 -

Aldosteroni 44 ACTH (sika) 4

Bradykiniini 13 30 γ -MSH 10

Insuliini (rotta) 3

Vasopressiini 15

Reniini (sika) 0,5 li

Claims (9)

90988

1. Monoklonaaliset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne on valmistettu natriumdiureesia aiheuttavia 5 nisäkkäiden sydäneteisen peptidejä vastaan, että ne eivät ristireagoi angiotensiini II:n, leu-enkefaliinin, substanssi P:n, aldosteronin, ACTH:n, bradykiniinin, gamma-MSH:n, insuliinin, vasopressiinin ja reniinin kanssa ja että ne ovat valmistettavissa viljelemällä hybridoomasolu-10 linjaa NCACC 850 314/1 tai NCACC 850 314/2 sopivassa vil-jelyvällaineessa ja ottamalla vasta-aineet talteen super-natantista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne on valmis- 15 tettu natriumdiureesia aiheuttavia rotan sydäneteisen peptidejä vastaan.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne on valmistettu natriumdiureesia aiheuttavia ihmisen sydäneteisen 20 peptidejä vastaan.

4. Hybridoomasolulinjat, tunnetut siitä, että ne tuottavat jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisia monoklonaalisla vasta-aineita ja että niillä on NCACC-talletusnumerot 850 314/1 ja 850 314/2.

5. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mu kaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 4 mukaisia solulinjoja viljellään sopivassa viljelyväliaineessa ja vasta-aineet otetaan talteen supernatantista tai että 30 hybridoomasoluja injektoidaan syngeenisiin tai semisyn- geenisiin hiiriin ja vasta-aineet otetaan talteen verestä tai vatsaontelon askiitesnesteestä.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö natriumdiureesia al-35 heuttavien sydäneteisen peptidien määrittämisessä in vitro biologisista nesteistä.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten mo-noklonaalisten vasta-aineiden käyttö natriumdiureesia aiheuttavien sydäneteisen peptidien määrittämisessä in vitro verestä, plasmasta, seerumista, virtsasta, imunes- 5 teestä tai luuydinnesteestä.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten mo-noklonaalisten vasta-aineiden käyttö immunoanalyysien valmistuksessa.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisten mo- 10 noklonaalisten vasta-aineiden käyttö natriumdiureesia aiheuttavien sydäneteisen peptidien eristämisessä immuno-adsorptiokromatografian avulla. 90988