JPH03504131A - 免疫原性ヒト・インターロイキン‐３ペプチドおよびそれに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫原性ヒト・インターロイキンー３ペプチド本発明は概ね、抗体の産生に有用 なペプチド、そして更に詳しくはヒトのインターロイキン−３の免疫原性ペプチ ドおよびそれに対して特異的なモノクローナル抗体に関するものである。

背景技術 循環している血液細胞は常に新しく産生された細胞によって置き換わっている。

置換される血液細胞は造血と呼ばれる過程で作られ、ここでは少くとも８種の成 熟血液細胞系列、すなわち、赤血球、マクロファージ（単球）、好酸球、巨核球 （血小板）、好中球、好塩基球（肥満細胞）、Ｔリンパ球、および８９２８球が 産生される：バーゲスおよびニコラ（Ｂｕ＋ｇｅｓｉ　ａｎｄＮｉｃｏｌａ）　 、成長因子と幹細胞（Ｇ＋ｏｗＬｈ　Ｆａｃｔｏ「ｓ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ（１巨 （アカデミツクプレス、ニューヨーク、　　１９８３）。血球細胞産生の調節の 多くはコロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）と呼ばれる一群の伝達性糖蛋白質によって 仲介されている。これらの糖蛋白質は、それらの存在を検出するために用いられ ている、生体内及び試験管内のアッセイ法から、このように命名されている。半 固体培地における造血細胞のクローン培養技術は試験管内アッセイ法の開発にお いて特に重要である。このような培養中では、個々の前駆細胞（すなわち発生的 にある一つの系列に分化を開始しているが、依然として増殖能を持つ細胞）は、 生体内において対応する過程と本質的に同一と信じられている過程によって増殖 し、成熟子孫細胞のコロニーを形成することができる。造血におけるＣ８Ｆの役 割は、最近多くの総説のテーマとなっている。例えば：メトカルフ（Ｍｅｊｃａ ｌｌ）　、造血コロニー刺激因子（Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｏ１ｏ ｎ７　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ）（エ　ルセヴイア、ニューヨ ーク、　　＋９８４）　　；メトカルフ、　Ｐｒｏｃ。

これらの因子の検出、抽出および精製は、それらが典型的に含まれている培養上 清の性質によってしばしば複雑になるため、また、混合液中に同時に働く因子が 存在するため、また、各因子の性状を確認するためのアッセイの感度（あるいは その欠如）のため、また、これらの因子の分子量の範囲がしばしば似ていること を始めとする因子の諸性質のため、そして天然の状態ではこれらの因子が非常に 低濃度で存在するために、非常に困難である。

主として遺伝子クローニングによってますますＣ３Ｆが入手可能になるにつれ、 これらの臨床応用法の検索に関心が集まってきた。ホルモンとの生理的類似性（ 例えば、可溶性因子であること、成長を媒介すること、細胞のレセプターを介し て機能すること等）のため、Ｃ８Ｆ使用の可能性は、現在のホルモンの使用法か ら類推されている：例えばデキスタ−（Ｄｅｘｌｅ＋）　。

Ｎａｔｕｒｅ、　　Ｖｏｗ、　　３２１．　　Ｄｇ、　　１９８（１９１１Ｄ　 、これらの因子の使用は、腫瘍の化学療法あるいは放射線療法後の（血液細胞の ）回復のための治療、骨髄形成不全の治療、好中球欠損症の治療、骨髄移植後の 造血系再生を促進するための治療、およびすでに成立した感染に対する宿主の抵 抗性を増すための治療（例えばデキスタ−（Ｄｒｘｌｅｒ）　、前文中で引用） など、血液細胞産生の刺激が必要となるようないくつかの臨床場面で示唆されて いる。

過去数年間で、マルチ−Ｃ３Ｆ（ｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆ）またはインターロイキン −３（ＩＬ−３）と呼ばれるネズミ類Ｃ８Ｆ活性は、同定、精製、そしてクロー ニングされた：ヨコタ（Ｙｏｋｏｌａｌら；　ＰＴＤＣ，Ｎａ１１．　Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、８１．　ｐｇｓ、　１［１７０−１０１４（１９８４） 　；　’７　ｙン（Ｆｕｎｇ）ら、　Ｎａｔｕ「ｅ、　　Ｖｏｌ、　　３０７． 　ｐｇｓ、　　２３３−２３７　（＋９８４）　　；　バーペル（Ｈａｐｅｌ） ら、　　Ｂｌｏす、　Ｖｏｌ、　　６５．　　ｐｇｓ。

＋４５３−１４５９（＋９８５）　　；イール（ｌｈ　ｉ　ｅｅｌら、　１．　 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｖｏｌ、　　１２９゜ｐｇｓ、　２４３１−２４３６（ １９Ｂ２）　；イール（Ｉ　ｈ　ｌ　ｅ）ら、　１．　　ｌｍ１ｕｎｏ１．、　 Ｖａｔ。

１３１、　　ｐｇｓ、　　２ｇ２−２８７（Ｉｎ３）　　；およびイスコツ（Ｉ ｓｃｏｖｅ）ら。

リンホカインの細胞および分子生物学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ８ｎｄ　　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａ＋Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　１４ｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）　　（アカデミツク 　プレス、ニューヨーク、　　＋９８５）中、　ｐｇｓ、　　３９７−４２５゜ ネズミ類ＩＬ−３は、全ての認識された骨髄系の前駆細胞の増殖および分化を刺 激可能であるため、広い範囲のＣ８Ｆ活性を持つ、例えば：デキスター（Ｄｅｘ ｔｅｒ）　、　Ｎａｔｕ「ｅ、　Ｖｏｌ、　　３０９．　　ｐｇｓ、　７４６− ７４７（１９８４）　；イール（ｌｈｌｅ）ら、リンホカイン（Ｌｙｍｐｈｏｋ ｉｎｅｓ）　、　Ｖｏｌ、　　９．　　ｐＨ。

＋５３−２００　（＋９８４）。最近、ラット、テナガザル、およびヒトからマ ウスのＩＬ−３の相同体が報告され、ネズミ類（マウス）の対応する分子と同様 に、広範な活性を持つようである：コーエン（Ｃｏｈｅｎ）　　ら、　　Ｎｕｅ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　Ｖａｔ、　　１４．　　ｐｇｓ 。

３６４］−３６５８Ｔ１９８６）　　；ヤン（Ｙａｎｇ）ら、胚具、　Ｖｏｌ、 　　４７．　　ｐｇｓ、　　３−１０（１９８６＋、およびオーツカ（Ｏｔｓｕ ｋａ）、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｖａｔ、　１４０＋ｐｇｇ、　２２ ８Ｂ−２２９５（１９８８）。

臨床的に興味が持たれる蛋白質に特異的なモノクローナル抗体の産生は、効率の 良い免疫精製法および診断キットの開発に向けて、重要な一歩であった、例えば ：ゼッカー（Ｓｅｃｈｅｒ）ら。

（Ｂａ＋ｔｈｏｌｏｍｅｖ）ら、ＰＣＴ公開番号ｗｏｍ号。目的の蛋白質に特異 的なモノクローナル抗体を得るためには、特にその蛋白質の遺伝子はクローニン グされ配列決定されているが、まだ免疫に充分な量の精製蛋白質が得られていな いような場合には、ペプチドに対する抗体を作成することが最も便利な方法であ る、例えば：ウオルター（Ｗｘｌｔｅｒ）ら、　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅ Ｉｉｎｇ、　Ｖｏｌ、　　５．　　ｐｇｓ、　　６ｌ−９１（１９８３）　；ラ ーナー（Ｌｅａｎｅｒ）ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｆｌ、　　Ａｃａｄ、　　 Ｓｃｉ、、　　Ｖｏｌ、　　７Ｂ、　　ｐｇｓ、　　３４０３−３４０７（＋９ ８１）　；およびプリンスキー（Ｂｕｌｉｎｓｋｉ）　、　　Ｉｎ１ｅ＋ｎ８ｔ １．Ｒｅｙ。

Ｃ７１ｏ１．、　Ｖｏｌ、　　１０３．　　ｐｇｓ、　　２８１−３０２（１９ ８６１゜この方法における主な問題点は、遺伝子配列から予測されたアミノ酸配 列から、いかにして目的の蛋白質の抗原決定基に対応するペプチドを選ぶかとい う点である。蛋白質中のどのアミノ酸配列がその抗原決定基を構成するかは、見 かけ上多くの要因によって決定されており、また、現在のところ特定のアミノ酸 配列を抗原決定基に対応づけるための多数の不完全な条件が得られるにすぎない 、Ｃｂｅｍ、、　Ｖｏｌ、　６０．　ｌ１ｇ５．　２６Ｑ６−２６１０（１９ｇ ２）　　；ノボトニー（Ｎｏｙｏｔｎ７）ら、　　Ｐ＋ａｃ、　　Ｎａｔｌ、　 　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、　　Ｖｏｌ、　　８３．　　ｐｇｓ、　　２２６− ２３０（１９８６）　@； ＶＯｌ、　　７５．　　ｐｇｓ、　３８３−３９３（１９８４）。

ヒトインターロイキン−３蛋白質の臨床応用の可能性の観点から、精製および検 出のためのモノクローナル抗体の開発は、非常に望ましいであろう。

発明の概要 本発明は以下の式Ｉ： Ｉ（−ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡ　ｌ−０Ｈ（あるいは二 Ｈ−ＰＩｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｉｎ−Ａｕｇ　−Ａ 　１ａ−Ｖａｔ　−Ｌ　ｙｓ−８ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｓｎ　 −Ａ　ｌａ　−Ｓ　ｅｔ　−Ａｌａ　−Ｉ　１ｅ−ＯＨ） で定義されるヒト・インターロイキン−３ペプチド、キャリアと上記のペプチド との複合体からなる免疫原、および上記ペプチドに特異的なモノクローナル抗体 に関するものである。ここで用いられる“免疫原”という用語は、免疫反応を起 こすことのできる物質を示す。ここで用いられる“キャリア”という用語は、本 発明におけるペプチドに化学的に結合したときに、それによって生じる複合体に よって免疫された宿主に、結合されたペプチドに特異的な抗体を産生させるよう な全ての物質を示す。キャリアは、赤血球、バクテリオファージ、蛋白質、ある いはアガロースビーズのような合成粒子を含む。望ましくは、キャリアは、血清 アルブミン、ガンマ−グロブリン、キーホール　リンペット　ヘモシアニン（ｋ ｃ７ｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｒｌ　ｈｅｍｏｃ７ａｎｉｎ）、チログロブリン、オバ ルブミン、フィブリノーゲン、ミオグロビン、あるいはこれらの類似物のような 蛋白質である。

−貫してアミノ酸の標準的な記号、例えば；コーエン（Ｃｏｈｅｎ）　、　　“ アルファーアミノ酸の命名と記号”　（Ｎｏｍｅｎｃｌｘｊｕｅａｎｄ　Ｓ７ｍ ｂｏｌｉｓｍ　ｏｊ　ａｌｐｈａ−＾ｍ１ｎｅ＾ｃｉｄｓ）　、　　Ｍｒｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、　　１０６．　　ｐｔｓ、　　３−１７　　（アカデミツク　プレス、 ニューヨーク。

１９８４）　、が用いられている。従って、この参照文献中の表■は、参照によ って本明細書に含まれているものとする。

発明の詳細な説明 本発明におけるペプチドは標準的な技術で合成できる、例えばスチュワート（Ｓ ＩｅｖａＮ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、　　”固相ペプチド合成”　　（Ｓ ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５７ＩＩｔｈｅｓｉｓ）　、第２版（ ピアス　ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　、 　ａツクフォード、　　ＩＬ、　１９８４）。望ましくは市販の自動合成器を用 いる、例えばベガ・バイオケミカルズ（ＶＢａ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎｉｃａ１ｇ） 　　（タクソン。

ＡＺ）モデル２９６ＡまたはＢ１あるいはアプライド　バイオシステムス社（＾ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　　Ｉｎｃ、）　　（フォスターシティ −、ＣＡ）モデル４３０Ａ。

本発明におけるペプチドは、架橋したポリスチレン支持体上における固相合成で 、カルボキシル末端残基から開始し、完全な１９残基鎖が形成されるまで順次ア ミノ酸を加えて合成する。

我々は、合成を完全に自動化されたペプチド合成器（アプライド　バイオシステ ムス、Ｉｎｃ、　　モデル４３０Ａ）で行った。

以下の参照文献は合成における化学に関するものである：メド　ウェクゼル、ス トックホルム、１９ε４）の１８５頁；ケント（ＫｅｎｔＪら、　“ペプチドの 化学８じ　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔ＋７８４）　。

イズミヤ編（プロティン　リサーチ　ファンデーション、　Ｂ、　Ｈ。

オーサカ、　１９８５）　　；メリフィールド（Ｍｃ＋＋１ｌｉｅｌｄ）　、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　。

Ｖｏｌ、　２３２．　ｌ１ｇ５．３４１−３４７（１９８６）　；および上記最 後の参照文献中に引用されている参照文献。

固相合成においては、主としてペプチド合成の停止、欠失、あるいは修飾による 、合成の副産物を除去することが最も重要である。たいていの副反応は、純粋な 、良く調べられた樹脂、純粋なアミノ酸誘導体、純粋な溶媒の使用、および適切 なカップリングおよび切断法、そして反応条件の選択によって除去あるいは減少 できる；例えばバラニー（Ｂａ＋ａｎ７）およびメリフィールド（Ｍｅａｒ百１ ｅｌｄ）、　　’ペプチド’　　（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　、　　クロス アンド　メイエンホツファー編、　Ｖｏｌ、　　２．　１１ｇ５．　　ｌ−２８ ４（アカデミツク　プレス、ニューヨーク、　　１９７９）。−残基あるいはそ れ以上の残基を欠く、欠失ペプチド（の産生）を避けるために、カップリング反 応が完了していることをモニターすることが重要である。このためには定量的ニ ンヒドリン反応が有用である；サリン（Ｓａｔｉｎ）ら、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃ ｂｅｍ、、　Ｖｏｌ、　１１７．９１１４７（１９８１１゜アミノ酸重合の条件 では安定であるが、強酸には不安定な適切な側鎖保護基をつけて、Ｎ　　−ｔ− ブチルオキシカルα ボニル−アミノ酸を用いた。保護されたペプチド鎖の重合ののち、保護基を除去 し、チオエステル吸収剤の存在下で低濃度、そして後に高濃度の無水フッ化水素 を用いて、ペプチドを用いた側鎖保護基は以下のものである、Ａｓｐ　（ＯＢ！ Ｉ）　。

Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）　、　Ｓｅ＋　（Ｂｚｌ）　、　Ｔｈ＋　（Ｂｚｌ）　、 　Ｌｙｓ　（（Ｊ　−Ｚ）、　Ｔｙ＋　（Ｂｒ−Ｚ）、　Ａｕｇ（ＮＧＴｏｓ） 、　Ｃｙｓ　（４−ＭｅＢｔｌ）　。

およびＨｉｓ（ＩｍＤＮＰ）。（Ｂｚｌ＝ベンジル；Ｔｏｓ＝ｈルエンスルホニ ル、ＤＮＰ＝ジニトロフェニル；Ｉｍ＝イミダゾール；Ｚ＝ベンジロキシカルボ ニル）。残りのアミノ酸残基は側鎖に保護基を持たない。ケミカル　ダイナミク ス社より購入して使用前にエタノールより再結晶したｔＢｏｃ−Ｈｉｓ（ＩｍＤ ＮＰ）を除き、全てのアミノ酸はペニンスラ　ラボラトリーズより購入した。［ ｔ　−Ｂｏｃ＝Ｎ２−　ｔ−ブチルオキシカルボニル］。各サイクルにおいてｔ Ｂｏｃ−Ｎ　　−保護ペブチα ドー樹脂を、ジクロロメタン（Ｄ　ＣＭ）　　（Ｌｌｌｅｎｃｋ＋ｏｄｌ）中で ６５％トリフルオロ酢酸（イーストマン　コダック製）（使用前に蒸溜）処理し た：Ｎ　−保護基を除くために、初め１分間、α そして次に１３分間処理する。ペプチド−樹脂はＤＣＭで洗浄し次にジメチルホ ルムアミド（ＤＭＦ）（アプライド　バイオシステム）中で２回、１０％のジイ ソプロピルエチルアミン（Ｄ　Ｉ　ＥＡ）　　（アルドリッチ）を用いて中和し た。各処理はそれぞれ１分間行った。中和はＤＭＦで洗浄した後に行った。

カップリングはＤＭＦ中で１６分間、事前に合成したアミノ酸の対称性の無水物 を用いて行った。事前に合成した対称性の無水ドリッチ）を添加して調製した。

５分後に活性化したアミノ酸を別の容器に移し、連続的な窒素ガス流で置換しな がらＤＣＭを蒸発させた。ＤＣＭは窒素置換の途中の様々な段階でＤＭＦ（総量 ６ｍ１）で置換した。最初のカップリングののち、ペプチド−樹脂をＤＣＭ、Ｄ ＣＭ中の１０％ＤＩＥＡ、そして次にＤＣＭで洗浄した。再カップリングのため 、同じアミノ酸および活性化試薬（ジシクロへキシルカルボジイミド）を順に反 応容器の中に移した。同じ容器中で活性化し、１０分間カップリングさせたのち 、５０％のＤＭＦ−ＤＣＭ混合液となるように充分なりＭＦを加え、カップリン グを１５分間続けた。アルギニンは事前に合成したエステルとしてＤＭＦ中でハ イドロキシベンゾトリアゾール（アルドリッチ）を用いて、６０分間反応させ、 そして次に他のアミノ酸と同様の方法で再カップリングさせた。

アスパラギンおよびグルタミンは事前に合成されたハイドロキシベンゾトリアゾ ールエステルとしてＤＭＦ中で２回カップリングさせた。各カップリングは４０ 分間行った。全ての残基について２回目のカップリングののち、樹脂を洗浄し、 試料を自動的に取って定量的ニンヒドリン反応（サリン（Ｓａｒｉｎ）ら、上文 中で引用）を用い、残った重合していないα−アミンを検出した。

合成ペプチドを担体に結合させる一般的な技術はい（っがの参考文献中に記述さ れている、例えば：ウォルター（Ｗａｌｌｅ＋）およびトウーリトル（Ｄｏｏｌ ｉｌ＋Ｉｅ）、　　”遺伝子工学”　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　 （セットロー　（Ｓｅｆｌｏｖ）　ら編）　、　　Ｖａｔ、　　５．　　ｐｇｓ 。

６ｌ−９１（プレナムプレス、　Ｎ、　　Ｙ、、　　１９８３）中、　“合成ペ プチドに対する抗体”　（Ａｎｌｉｂｏｄｉｅ＋　Ａｇａｉｎｓｔ　５７ｎｌｈ ｅｌｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　；グリーン（Ｇ「ｅｅｎ）　ら、胚旦、　　Ｖ ｏｌ、　　２Ｂ、　　ｐｇｓ、　　４７７−４８７（１９Ｂ２）ルーナー（Ｌｅ ｒｎｅｒ）　ら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｆｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、 　　Ｖｏｌ、　　７８．　　ｐｇｓ。

３４０３−３４０７（１９８１）　　；シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）ら、アメリカ 合衆国特許第４．４７４．７５４号：およびガンフィールド（Ｇａ＋＋ｌ１ｅｌ ｄ）ら、アメリカ合衆国特許第４．３１１．６３９号。この参照により、これら の参考文献は本明細書に含まれるものとする。同様にハプテンを担体に結合する ために用いられる技術は本質的に上文中で参照された技術と同じである；例えば ティエセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）　　“酵素免疫アッセイの実際と理論”　（Ｐ＋ ａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｌｍｍｕｎｏａｓｓａ Ｈ）　　（エルセヴイ乙ニューヨーク、　１９８５）の第２０章。

ペプチドを担体に結合するための四つの最も一般的に使われている方法は以下の ものを用いる。　（１）アミノカップリングのためのグルタルアルデヒド、例え ばカガン（Ｋｅｇａｎ）およびグリツク（Ｃｌｉｃｋ）によりジャッフェ　アン ド　ベルマン（Ｊａｆｆｅａｎｄ　Ｂｅｂ＋ｍ１ｎ）編、　′ホルモンの放射線 免疫アッセイ法”（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｉｄｉｏｉｍｍ ｕｎｏａｓｃａＹ）　、　　ｐｇｓ、　　３２８−３２９（アカデミツク　プレ ス、　Ｎ、　　Ｙ、、　　１９７９）、およびウォルタ−（Ｗａｉｔｅｒ）　ら により、Ｐｔｏｃ、　　Ｎａｔｌ、Ａｅｇｄ、　　Ｓｃｉ、、　　Ｖｏｌ、　　 ７？、　　ｐｇｓ。

５１９７−５２［１０に開示されている；（２）カルボキシル（基）からアミノ （基）へのカップリングのための水溶性カルボジイミド、例えばホアール（）Ｉ ｏａ＋ｅ）らにより、］、　Ｂｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　２４２゜ｐ ｇｓ、２４４７−２４５３　（＋　９６７）に開示されている；（３）チロシン とチロシンの側鎖カップリングのためのビス−ジアゾベンジジン（ＢＤＢ）　、 例えばバシーリ（Ｃａｓｓｉｎｉ）らにより、ジャッフェアンド　ベルマン出版 （上文中にて引用）“ホルモンの放射線免疫アッセイ法”　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｉｓａｙ）　。

ｐｇｓ、　　４６−４７に、およびウォルタ−（ｗａｉｅｓ）ら（上文中にて引 用）により開示されている；および（４）アミノ基へのシスティン（または他の スルフヒドリル）のカップリングのためのマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ シスクシニミド　エステル（ＭＢＳ）、例えばキタガワ（Ｋｉｌａｇａｗａ）ら １こより１．Ｂｉｏｃｈｅｍ。

（トーキヨー）　、　Ｖｏｌ、　　７９．　　ｐｇ５．　２３３−２３９（１９ ７６）に、およびラーナー（Ｌｅａｎｅｒ）ら（上文中にて引用）により開示さ れている。

与えられたペプチドを蛋白質担体に結合するための適切な方法を選択するための 一般的な法則は以下のように言える：カップリングのために選ぶアミノ酸はその 配列中に１残基だけ、望ましくはその部分の適切な末端に含まれなければならな い。例えば抗原性を持つ可能性があるとして選ばれた配列の主要な部分にチロシ ン残基が含まれるならばＢＤＢを使用してはいけない。同様にリジンが中央にあ る場合、グルタルアルデヒド法は使用できず、また、アスパラギン酸またはグル タミン酸はしばしばカルボジイミド法を除外する。逆に、それらが選ばれた蛋白 質の配列中に天然の状態で存在するしないにががゎらず、適当なアミノ酸残基を 結合部位として、選ばれた配列のどちらの末端にも存在させることができる。

もし、選択された免疫原性ペプチド断片がＩＬ−３のカルボキシルまたはアミノ 末端に及ばない場合、樹脂と結合していない末端はＩＬ−３には存在しない末端 であってもよく、その場合、免疫原性ペプチド断片は末端において天然のＩＬ− ３と有意に異なることになる。この差によって生じるあらゆる問題は、カルボキ シ末端を蛋白質担体との結合に選び、遊離アミノ末端をアセチル化すればある程 度回避できる。

式Ｉで示されるペプチドの担体蛋白質とのカップリングの効率は、合成の一段階 で放射性アミノ酸を用いて調製するがあるいは合成を完了したペプチドのチロシ ン残基のヨード化によって標識して調製した、放射標識ペプチドを用いて簡便に 測定できる。ペプチド中にチロシンが含まれていると、必要に応じて感度の良い 放射線免疫アッセイを行うこともできる。故に、本発明におけるペプチド配列の 中にそれが含まれていない場合、末端の残基としてチロシンを導入することが望 まれることがある。

望ましい担体は蛋白質であり、望ましい蛋白質担体はウシ血清アルブミン、ミオ グロビン、オボアルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ ＬＨ）、あるいはこれらの類似物を含む。

リウ（Ｌｉｕ）らによりＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　Ｖｏｌ、　　１８．　 　ρｇｓ、　　６９０−６９７（１９７９）に開示されているように、ペプチド はシスティンを通してＭＢＳでＫＬＨに結合できる。ペプチドはリン酸緩衝塩類 溶液（ｐＨ７、５）　、　Ｏ，ＩＭホウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ９，０）また は１．０Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）に溶解される。ペプチドを溶解 する際のｐＨはペプチドの溶解度を最適化するように選択する。水溶性ペプチド の遊離システィンの含量はエルマン（Ｈｌｍａｎ）の方法（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ７ｓ１．　Ｍｏ１．８２．９ｇ。

７０７７（＋９５９））によって決定する。

各ペプチドについて、０．２５ｍ１のｌ０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し た４■のＫＬＨを０．７■のＭＢＳ（ジメチルホルムアルミド中に溶解）と反応 させ、３０分間室温で撹拌する。ＫＬＨは３０％以上のホルムアミドには不溶性 であるため、ホルムアミドの部分的な濃度が高くなりすぎないことを確実にする ためＭＢＳを一滴ずつ加える。反応生成物、ＫＬＨ−ＭＢは未反応のＭＢＳを除 くため、５１１ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセフ ァデックスＧ−２５に通す：カラム溶出物のＫＬＨ−ＭＢを次に、１ｍｌの選択 した緩衝液中に溶解された５■のペプチドと反応させる。ｐＨは７〜７．５に調 整し、反応は室温で３時間、撹拌しながら行う。カップリングの効率は放射性の ペプチドを用い、複合体サンプルをリン酸緩衝塩類溶液に対して透析することに よって測定する；効率は典型的には８％から６０％の間である。

ペプチド−担体複合体が得られたら、標準的な手法、例えば：キャンベル（Ｃａ ｍｐｂｅ　ｌ　ｌ）により“モノクローナル抗体技術”（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ 　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　　（ｚルセヴイア、ニューヨー ク、　　＋９８４）　　；バレル（Ｈｕ＋＋ｅｌｌ）出版、　“モ／クローナル ハボカラートン、　　ＦＬ、　１９８２）　、　　シュライニル（Ｓｃｈｒｅｉ ｅｔ）ら。

用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生ずる。

特にアメリカ合衆国特許第４．５６２．００３号はこの参照により本明細書に含 まれるものとする。モノクローナル抗体産生のための第一段階は、Ｂリンパ球の 原料を得るために宿主動物を免疫することである。このＢリンパ球を適切な不死 化細胞株と融合し、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成する。

不死化細胞株は、通常、ミエローマのような腫瘍細胞株である。

宿主動物は、げっ菌類であることが望ましく、不死化細胞株も同様にげっ菌類細 胞、特に同じげっ菌類の種由来のものであることが望ましい。作成ののち、ハイ ブリドーマをスクリーニングし、本発明におけるペプチドに対する抗体を産生じ ているものをスクリーニングする。免疫操作、リンパ球の回収、および細胞融合 は全て当業者にはよく知られた技術である。免疫操作は精製したペプチド−担体 複合体を、通常は適切なアジュバンれる抗原の量、注射の部位、注射および採血 の時間計画、アジュバントの使用（例えばフロイントの完全または不完全アジュ バントを使用するかどうか）等を含む変わりうるいくつかの要因によって最適化 できる。細胞融合の技術もまた当業者には良く知られており、一般には細胞を融 合剤、例えば最も一般的にはポリエチレングリコールを混合して行う。

ハイブリドーマ作成の成功は、例えばＨＡ　Ｔ選択のような標準的な方法で評価 し、選出する。増殖しているハイブリドーマから目的の抗体を有効に分泌してい るものを、培養上清をアッセイして選択する。通常これは、ウェスタンプロット 、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡアッセイのような免疫反応に基づくアッセイを用い て行なう。抗体は標準的な蛋白質精製技術によって培地から回収できる。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方ともＥＬ　Ｉ　ＳＡによってス クリーニングできる。他の固相免疫アッセイと同様、この試験法は巨大因子がプ ラスチックに非特異的に吸着する性質に基づいている。免疫学的な活性を失わず 、不可逆的にこの反応が起こるため、単純に複合体を未結合の物質と分離するこ とによって、抗原−抗体の複合体を生成できる。

抗ペプチド血清を滴定するために、免疫に用いた担体とは異なる担体に結合した ペプチド、または非結合のペプチドのみを９６穴のマイクロタイタープレートに 吸着させる。吸着した抗原は、ウェル中で抗ペプチド血清の希釈液と反応させる 。未結合の抗体を洗い流し、残った抗原−抗体複合体を免疫した動物のＩｇＧに 特異的な、抗体と反応させる；この二次抗体はアルカリホスファターゼのような 酵素に結合されている。酵素の基質を加えたときに産生される可視色の反応生成 物により、どのウェルが抗ペプチド抗体を結合したか示される。分光光度計の使 用により、ペプチドに特異的に結合した抗体のより良い定量が可能となる。高力 価の抗体は１０−３とｌｏ−５間の稀釈で直線の滴定曲線を与える。

実　　施　　例 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。あるペプチドおよび／また は担体の選択、および温度、濃度、および他の変数の値の選択は、本発明の適用 を例示するためのものであり、本発明の限界と考えられるものではない。

実施例１ （Ｃ）ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡＩのオボアルブミンおよび／また はミオグロビンへの結合とそれに対するポリクローナル抗体の産生（Ｃ）は担体 蛋白質との間のシスティン架橋を示す。

５０■のオボアルブミン（ＯＶＡ）および５０■のミオグロビン（ＭＹＯ）（例 えばシグマ社より入手可能）を、それぞれｌ０ｍ１の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム に溶解し、１５ｍ１のファルコン試験管（ファルコン　プラスチクス、オクスナ ード、ＣＡ）あるいはそれに相当する容器中で、室温下、１時間１ｍｌの０．１ ２　（Ｍ）ヨードアセトアミド溶液（８８■のヨードアセトアミドを４ｍｌの０ ．１Ｍ重炭酸ナトリウムに溶解する）と反応させた。各反応液は４℃で一晩、１ １の０．１Ｍ重炭酸ナトリウムに対して透析した。これとは別に、４ｍｌ試験管 中で１０．の（Ｃ）　Ｐ　Ｎ　Ｌ　Ｅ　Ａ　Ｆ　ＮＲ，ＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡＩ を２ｍｌの０．１Ｍ　　ＤＴＴ（ジチオスレイトール）溶液（ｐＨ８で５０ｍＭ 　　Ｔｈ１ｓおよび２５ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む）に溶解し、３７℃で一 晩インキユベートし、ＧＦＯ５ゲル濾過カラム（１，５Ｘ２６．５ａｏ）　　（ ＬＫＢ、　ブＯ−７，スウェーデン）にかけ、０．０１５Ｍ酢酸および０．００ ５Ｍベーターメルカプトエタノールを含むペプチド溶出用緩衝液を用いて溶出し た。

還元されたペプチドを含む各約３．５ｍｌの分画３本を２０６ｎｍにおける光学 濃度で検出し、回収してまとめ、ドライアイスで凍結して一晩凍結乾燥した。そ の間にＯＶＡおよびＭＹＯを透析から回収し、０．４５マイクロメーターのフィ ルターを通して不純物を除去した。ＯＶＡおよびＭＹＯはそれぞれテトラヒドロ フラン（５■／ｍりに溶解した３８０マイクロリツトルのヨード酢酸のＮ−ヒド ロキシスクシニミドエステル（ＮＨＩ　Ａ）（レフター（Ｒｅｃｔｏｒ）らによ り（１，１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｌｈ、　、　　Ｖｏｌ。

２４、　　ｐｇ、　　３２１（１９７８））に開示されている）と混合し、３０ 分間室温で撹拌し、４リツトルのＰＢＳ（４リツトルの水に１．８ｇＮａＨ，、 ＰＯ４−Ｈ２Ｏ，７，２ｇＮａ２　ＨＰＯ４’　７Ｈ２０；および３４ｇＮａＣ １を含む）に対して一晩透析して、活性化した。

これとは別に、凍結乾燥したペプチドは、５ｍｌのホウ酸還元緩衝液（１！の水 に２ｇのＮａ、、Ｂ４Ｏ７”ｌ０Ｈ２０，１７，４ｇＮａＣ１および３３６　ｍ ｇ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ−Ｎ　ａ　２を加え、濃塩酸でｐＨを８．５に合わせ、１５ 分間窒素下に置いて脱酸素したのち１７８■のアスコルビン酸を加える）に再懸 濁した。透析したヨードアセチル化されたＯＶＡおよびＭＹＯは回収し、別々に ペプチドを含む等量（望ましくは２ｍ１）のホウ酸還元緩衝液と混合して、室温 で一晩反応させた。得られた複合体は５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１２，５％ゲル）で分 析した。複合体を含む溶液はＰＢＳで１■／ｍｌに希釈し、フィルターを通して 滅菌し、適切な体積（例えば５００マイクロリツトル）の画分を免疫操作に用い 、モして／あるいは４℃で保存した。

ＭＹＯ複合体に対するポリクローナル抗血清はラットで作成した。免疫操作のス ケジュールは以下の通りである：最初に０．５ｍ１ＰＢＳ中の］ＯｈｇのＭＹＯ 複合体を０．５ｍｌのフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と混合し、ラッ トに腹腔内注射した。追加して１７日および８６日に同一の複合体を腹腔内注射 した；この８６日以後にＥＬ　Ｉ　ＳＡによってＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱ ＮＡＳＡＩに対する陽性反応が得られた。このラットポリクローナル抗血清は、 電気泳動的に分離された組換えヒトＩＬ−３（オーツカ（Ｏｔｓｕｋａ）ら、上 文中にて引用）のウェスタンプロット分析にも用いられた。市販品として得られ たヒツジ抗ラット免疫グロブリン試薬を二次標識として用いた。

ｐｃＤ−３Ｒ−ＩＬ−３によってトランスフェクションされα たＣ０８７組織の培養上清、およびｐｂｌＬ−３−１４を含む酵母の定常期にお ける培地をセントリコン１０濃縮器（アミコン社、デーバース、ＭＡ）によって 濃縮した。回収した標品は０．０６２Ｍ　　Ｔ＋ローＨ（１（ｐｉ（６，８）　 、　２％ＳＤ８．１０％グリセロール、および５％２−ＭＥを含むＳＤＳサンプ ル緩衝液で１／１に希釈し、５分間煮沸した。標品は不連続緩衝液系（レムリ（ Ｌａｅｍｌｉ）、　Ｎａｔｕ【ｅ、　Ｖｏｌ、　２２７．　ｐｇ、　６８０（１ ９７０））の５ＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲルに添加した。電気泳動の後 、蛋白質は４℃で２０ｍＭ）リス塩基、１５０ｄグリシンおよび２０％メタノー ル中、０．２Ａで一晩、電気泳動的にニトロセルロース膜に移した。この膜はＰ ＢＳに溶けた０、５％ＢＳＡＩ００ｍｌ中でブロッキングを行った。第一抗体は ０．１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳで希釈したヒトＩＬ− ３に対するラット抗血清を用いた。ニトロセルロース膜をこの溶液５０ｍ１中で ２時間インキュベートし、ＰＢＳ−ＢＳＡ−ツイン緩衝液を３回交換しながら、 各回２０分間洗浄した。５０ｍ１のＰＢＳ−ＢＳＡ−ツイン中の５０μｐ容の１ ２５■−標識したヒツジ抗ラットＩｇを標識された二次抗体として用いた。プロ ット（された膜）は２時間インキュベートし、上述の方法で再び洗浄した。ニト ロセルロース膜は軽（乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させた。ヒトの組換えＩＬ− ３のバンドは抗血清によって有効に同定された。

実施例１におけるラットは１３５日に以前の注射と同一の組成物（全体で２００ １１ｇの複合体）を最終の腹腔内注射および静脈注射した。４日後にラットを層 殺し、肺臓細胞をマウスミエローマ（骨髄腫）細胞、Ｐ２Ｘ６３−　Ａｇ８．６ ５３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）と１：１の比でポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）を用いて融合した。ＨＡＴ培地中の細胞懸濁液（３，５Ｘ　１０’細胞／ ′ｍｌ）は、４０枚の９６穴プレートに分注した。１０日後にハイブリドーマの 上清を、マイクロタイタープレートに直接固定したヒトＩ　Ｌ　−３に対する結 合能（間接ＥＬＩＳＡ）によって試験した。結合した抗体は、ペルオキシダーゼ を結合したヤギ抗ラット免疫グロブリンを用い、標準的な方法で検出した。ＩＬ −３と反応する抗体を分泌しているハイブリドーマは限界希釈法によってクロー ニングした。ＭＰ３．８Ａ５．１２はこのような方法によって選ばれたハイブリ ドーマの一つである。ＭＰ３．８Ａ５．１２由来の抗体は、１ｇＧ２８アイソタ イプであることを確認した。ハイブリドーマは標準的な動物細胞の培養技術を用 いて貯蔵（例えば１０％ＤＭＳＯを含む培地中で一７０℃）および培養（例えば 、１ｍＭグルタミンおよび５０ｍＭ２−メルカプトエタノールを補った、１０％ ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ）できる。

本発明は更に、ヒト・インターロイキン−３を含まれると思われるサンプル中の ヒト・インターロイキン−３の存在を検出するキットを提供するものであり、こ のキットは以下のものを含む： ヒト・インターロイキン−３の第一抗原決定基に特異的な第一のモノクローナル 抗体； ヒト・インターロイキン−３に特異的なポリクローナル抗体組成物およびヒト・ インターロイキン−３の第二の抗原決定基に特異的な第二のモノクローナル抗体 （この第二の抗原決定基は第一の抗原決定基とは異なる）からなるグループから 選んだ第二の抗体； 支持手段；および シグナル産生手段。

本キットにおいては、第一のモノクローナル抗体は、バイブ異的なポリクローナ ル抗体組成物であって良い。シグナル産生手段は上記の第一のモノクローナル抗 体に機能的に結合した酵素を含むことができ、この酵素はペルオキシダーゼ、ベ ーターガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含むグループから選 ばれる。このようなキットの提示のための一般的な原理は良く知られている。

以上の本発明の具体的態様の記述は、実例による説明および記載の目的で行なわ れた。これらは完全なものであること、または本発明をここで開示された詳細な 形に制限することを目的とするのではなく、明らかに上記の説明に照らして多く の修飾および変形が可能である。この具体的な説明は本発明の原理および実際の 適用方法を最も良く説明し、それによって当業者が様々な具体的な様式、および 意図する特別の目的に適した様々な変形を用いて、本発明を最善に活用すること が可能であるように選択し、記述した。本発明の範囲は、請求の範囲によって定 義される。

出願人は、ハイブリドーマＭＰ３．８　Ａ５．Ｉ２をアメリカンタイプカルチャ ーコレクション、ロックヴイル、ＭＤ。

ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ）に、受託番号ＨＢ９７２７で寄託した。この寄託は、３５ Ｕ　Ｓ　ＣＩ２２および３７ＣＦＲ１，１４に従ってアメリカ合衆国の特許庁長 官が（細胞を）入手可能であることを保証し、アメリカ合衆国特許の発行にとも ない、公衆が入手可能になることを保証する、すなわち、寄託細胞が維持される ことを要求する、“特許の目的のための培養細胞の寄託”に関するＡＴＣＣの同 意に基づいて提示される条件の下で行なわれた。寄託された株が入手可能である ということは特許に関する法律に従ってあらゆる政府の権威の下に保障される権 利を犯して本発明を使用する許可であると解釈されるものではない。

この寄託は“微生物の保存に関するブタペスト条約”の要求に適合するように修 正されている。

補正書の翻訳文提出書 平成　２年１−１月２６日 特許庁長官　　　植　松　　　敏　　殿１、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２１５２ ２、発明の名称 免疫原性ヒト・インターロイキン−３ペプチドおよびそれに対するモノクローナ ル抗体３、特許出願人 名　称　　シェリング・バイオチック・コーポレーション新大手町ビル　２、特 許 請求の範囲・ １、　以下ノ７ミ／酸配列二Ｈ−ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡ　ｌ− ＯＨで定義される免疫原性のヒト・インターロイキン−３ペプチド。

２、担体に結合されたペプチド：Ｈ−ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡ　 ｌ−ＯＨを含む複合体。

３、前記の担体がオボアルブミン、ミオグロビン、キーホールリンペットヘモシ アニン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン、およびフィブリノーゲンからな るグループから選択される請求項２記載の化合物。

４、ペプチド　Ｈ−ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡｌ−ＯＨに特異的な モノクローナル抗体。

５、アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番号ＨＢ９７２７で寄託さ れたハイブリドーマＭＰ３．８Ａ５．１２によって産生された請求項４記載のモ ノクローナル抗体。

６　アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番号ＨＢ９７２７で寄託さ れたハイブリドーマＭＰ３．８Ａ５．１２゜７、ヒト・インターロイキン−３を 含むと思われるサンプル中のヒト・インターロイキン−３の存在を検出するため の、以下のものを含んでなるキット： ヒト・インターロイキン−３の第一抗原決定基に特異的な第一のモノクローナル 抗体。

ヒト・インターロイキン−３に特異的なポリクローナル抗体組成物およびヒト・ インターロイキン−３の第一の抗原決定基とは異なる第二の抗原決定基に特異的 な第二のモノクローナル抗体からなるグループから選ばれた第二の抗体；支持手 段；および シグナル産生手段。

８、上記の第一のモノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ョンに受託番号ＨＢ　９７２７で寄託されているハイブリドーマＭＰ３．８Ａ５ ．１２が産生じたものであり、上記の第二の抗体がヒト・インターロイキン−３ に特異的なポリクローナル抗体組成物である請求項７記載のキット。

９、シグナル産生手段が上記の第一のモノクローナル抗体に機能的に結合させた 酵素を含むものであり、該酵素はベルオキ国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のアミノ酸配列：Ｈ−ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡＩ−ＯＨ で定義される免疫原性のヒト・インターロイキン−３ペプチド。
2. ２．担体に結合されたペプチド：Ｈ−ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡＩ −ＯＨを含む複合体。
3. ３．前記担体がオボアルブミン、ミオグロビン、キーホールリンペットヘモシア ニン、チログロブリン、ウシ血清アルブミン、およびフィブリノーゲンからなる グループから選択される請求項２記載の化合物。
4. ４．ペプチド：Ｈ−ＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡＩ−ＯＨに特異的な モノクローナルのペプチド抗体。
5. ５．ハイブリドーマＭＰ３．８Ａ５．１２によって産生された請求項４記載のモ ノクローナル抗体。
6. ６．ハイブリドーマＭＰ３．８Ａ５．１２。
7. ７．ヒト・インターロイキン−３を含むと思われるサンプル中のヒト・インター 口イキン−３の存在を検出するための以下のものを含んでなるキット： ヒト・インターロイキン−３の第一抗原決定基に特異的な第一のモノクローナル 抗体； ヒト・インクーロイキン−３に特異的なポリクローナル抗体組成物およびヒト・ インターロイキン−３の第一の抗原決定基とは異なる第二の抗原決定基に特異的 な第二のモノクローナル抗体からなるグループから選ばれた第二の抗体；支持手 段；および シグナル産生手段。
8. ８．上記の第一のモノクローナル抗体がハイブリドーマＭＰ３．８Ａ５．１２が 産生したものであり、上記の第二の抗体がヒト・インターロイキン−３に特異的 なポリクローナル抗体組成物である請求項７記載のキット。
9. ９．シグナル産生手段が上記の第一のモノクローナル抗体に機能的に結合させた 酵素を含むものであり、該酵素はペルオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ およびアルカリホスファ多 ダーゼからなるグループから選ばれる請求項８記載のキット。