JPS62269698A - Ｉｌ−２蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、発明の詳細な説明 最近１０年の間に、免疫コンビ−テント細胞は抗原特異
性および非特異性分子の両者を生産し、そのため免疫応
答の誘導および調節の中で伯の免疫コンビ−テント細胞
と相互作用できるという事が明かとなった（　Ｂ．　Ｉ
ｆ．　Ｗａｋｓｍａｎ　　［　９　８　０年］、Ｅ．　
Ｐｉｃｋ編集：　Ｌｙｐｈｏｋｉｎｅ　Ｋｅｐｏｒｔｓ
　、第１巻、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｎ＋ｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ　、中、１頁：ｌｌ．Ｎ。

Ｇｅｒｎ＋ａｉｎ　、　　［１９８０年］　Ｅ、　Ｐｉ
ｃｋ編集：しｙＩＩｌｐｈｏｋｉｎｅ　Ｋｅｐｏｒｔｓ
、第１巻、Ｈｅｗ　ＹｏｒｋＡＣａｄｅｌｌｉＣｐｒｅ
ｓｓ、中、７頁）。そのような分子が８またはＴ−リン
パ球から分泌されるとリンフ才力インと呼ばれ、マクロ
ファージまたは単球で生産されるとモノ力インと呼ばれ
る。細胞から分泌され、その細胞と極めて近接の他の細
胞に作用するこれらの蛋白質および糖蛋白質分子はサイ
ト力インとして分類される。この種の、蛋白質およびペ
プチド分子による局所細胞調節をオートクリンと呼び、
このような細胞調節は、伝達物質が血液により運搬され
て特別部位の目的標識に作用するエンドタリン系と区別
される。

インクリューキン−２（ｔＬ−２＞は免疫応答の調節に
重要な役割を果す多くのリンフ才力インの一つである。

ＩＬ−２は１９７９年にモーガン、ラセツテイおよびガ
ロにより始めて個別の物質として同定された（０．　Ａ
、　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｆ、　Ｉｌ、　Ｒ５５ｃｅｔｔｉ
。

Ｒ，Ｇａ１ｌｏ［１９７６年］　５ｃｉｅｎｃｅ　１９
３巻、１００７頁〉。ＩＬ−２はそれ以前はＴ−細胞生
育因子（ＴＣＧＦ）として知られ、■−リンパ球が分裂
促進因子または抗原に露出した後分泌する。この二Ｍ目
の信号がＴ−リンパ球の増殖を促進する。

この糖蛋白質分子はＴ−細胞が作用するほとんど全ての
免疫応答の誘発および維持に茫接に関与している（Ｊ、
Ｊ、　Ｆａｒｒａｒ、　Ｗ、　Ｒ，Ｂｃｎｊａｍｉｎ。

Ｈ，１，、ｌ１ｉｌｆｉｋｅｒ、　Ｈ，ｌｌｏｗａｒｄ
、　Ｗ、　Ｌ、　Ｆａｒｒａｒ、およびＪ、　Ｆｕｌｌ
ｅｒ−Ｆａｒｒａｒ　［１９８３年］　Ｉｍｍｕｎｏｌ
。

Ｒｅｖ、　６３巻、１２９頁）、ＩＬ−２は１１］１１
１表層の特異的レセプターと結合フることにより成熟Ｔ
細胞の！！ｌ殖のための普遍的シグナルを出すと考えら
れている（に、八、　Ｓｍ１ｔｅｒ　［１９８年］　１
＋＋ｕａｕｎｏｌ。

Ｒａｙ、　５１巻、３３７−３５７頁：　Ｒｏｂｂら、
［１９８１年］　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｈｅｄ、　　１５４
巻、１４５５−１４７４頁）。ＩＬ−２は抗原特異性細
胞毒性゛「リンパ球、ナチュラルギラー１１１１１１、
或いはリンフ才力イン活性型キラー細胞を誘導すること
が知られており、これらの細胞は全て悪性化に対する効
果細胞と考えられ、機能的Ｔ細胞応答を再構成し、確立
したネズミ先天性白血病の免疫Ｔ細胞および化学療法誘
導による消去を助けることが知られている（Ａｌｔｌａ
ｎら、［１９８４年］　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８１巻、２１７６−２
１８０頁）。

ＩＬ−２の生産および／または応答の異常はいく・つか
の疾患と関係している。そのような欠陥はヒトに於いて
、老人、−次免疫不全の小児、宿主反応に対するｉｌｌ
織移植を受けて９髄移植された人、および寄生虫感染マ
ウスで紅斑性狼癒と同定されている（Ａｌｔｌｌｌａｎ
ら、［１９８４年］Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃ
ｉ　ＵＳＡ、　８１巻、２１７６−２１８０貞）。

ＩＬ−２は癌患者に於いて免疫応答モデイファイヤーと
して有用かも知れない（にａｙら、Ｉｍｍｕｎｏ−ｌｏ
ｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　［１９８３年１．６巻、１７５
−１７８頁）。

自己のリンフ才力イン活性化キラーＩＬＡＫ）ｌｌｌ胞
および組換えによるＩＬ−２を２５人の進んだ転移癌患
者に全身投与したところ２５名の患者中１１名で癌の退
行が歪められた（　Ｒｏｓｃｎｂｅｒａら、Ｔｈｅ　Ｎ
ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ　　［１９８５年１．３１３巻、１４８５−
１４９２頁）。

１９８３年にインターリュキン２の全−次配列が呑口ら
により報告された（　ｌａｎｉｇｕｃｈｉ　ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　ＩＬｏｎｄｏｎ）　、［１９８３年’ｌ、３０
２巻、３０５−３１０頁）。ｌし−２は１３３個のアミ
ノ酸を有し、次の配列を示す。

アミノＭ　Ｊ３よび対応する三文字表示および一文字表
示は以下の通りである。

アミノ酸　　　　　　　二叉ヱ　　　二叉１アラニン　
　　　　　　Ａｌａ　　　　　Ａアルギニン　　　　　
　Ａｒｑ　　　　　　Ｒアスパラギン　　　　　△Ｓｎ
　　　　　　Ｎアスパラギン酸　　　　ＡＳＤ　　　　
　　Ｄシスティン　　　　　　ｃｙｓ　　　　　　ｃグ
ルクミン酸　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　Ｅグルタミン
　　　　　　Ｑｌｎ　　　　　　Ｑグリシン　　　　　
　　Ｇｌｙ　　　　　　Ｇヒスデシン　　　　　　）（
ｉ　ｓ　　　　　　Ｈ小モセリン　　　　　　ト＋ｓｅ
　　　　　　−イソロイシン　　　　　Ｉｌｅ　　　　
　　Ｉロイシン　　　　　　　ｌｅｕ　　　　　　Ｌリ
ジン　　　　　　　　ＬｙＳ　　　　　　Ｋメチオニン
　　　　　　Ｍｅｔ　　　　　　Ｍフェニルアラニン　
　　ｐｈｅ　　　　　　Ｆプロリン　　　　　　　　Ｐ
ｒｏ　　　　　　Ｐセリン　　　　　　　３ｅｒ　　　
　　　Ｓスレオニン　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　Ｔ
トリプトファン　　　　ＴｒＤ　　　　　　Ｗチロシン
　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　Ｙバリン　　　　　
　　Ｖａｌ　　　　　　ＶＩＬ−２を合成により生産す
ることは理論的には可能であるが均質な物″ｄを多重に
生産するには適さない。ＩＬ−２は現在では組換え体を
用いた醗酵により生産されている。モノクローナル抗体
はＩＬ−２の大規模生産および精製の際の有用な分析試
薬である。

１９８１年にＧｉ　ｌ　ｌ　ｉｓらはその抗体産物がＩ
Ｌ−２の活性を阻害するＢ細胞ハイブリドーマの生成を
報告した（Ｇｉｌｌｉｓら、ｌｈｃ　Ｊ、　ｏｒ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　［４９８１年］、１２６巻、１９７８−
１９８４頁）。

Ｂ　Ａ　ｌ−［３／　ｃ雌マウスをラッテ牌臓細胞から
ｒｉｍした［　１．−２で免疫処理する。免疫５Ｉ！Ｘ
置マウスの牌臓を取り出して細胞けん濁液を得る。これ
らの牌臓細胞をＢ　Ａ　Ｌ、　Ｂ　／　Ｃ骨髄腫Ｓ　Ｐ
　２　／　Ｏと融合させるＩｇＧ産物がヒト、マウスお
よびラッテ１［−２の分子に存在する決定基に対して生
産されていると思われるモノクローナルＢ細胞ハイブリ
ドーマを単離した（八日ｍａｎら、［１９８４年１、Ｐ
ｒｏｃ　Ｎａｔｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｉｔｓ＾、８１
巻、２１７６−２１８０頁）。

スタントラ−（５ｔａｄｌｃｒら、Ｔｈｅ　Ｊ、　ｏｆ
ｌｍｍｕｎｏｌ、　［１９８２年１．１２８巻、１６２
０〜］６２４頁）は８ＡＬ８／ｃマウスを部分Ｍ製した
ヒトＩＬ−２で免疫処理した。免疫５Ｉ！！冒したマウ
スの牌臓を集め、牌臓細胞を形質ａｒｍ肝細胞とハイブ
リダイズさせた。ハイブリドーマ培養物の上澄液につい
てＣＴ　６細胞株増殖ＩＬ一２活性の゛阻害能を検索し
た。８個の株がラッテおよびマウスＩＬ−２と共にヒｌ
−Ｉ　Ｌ　−２の粗物質または精製物質に応答するｒＬ
−２依存性ｍ胞株の増殖を阻害する抗体を生産している
ことがわかった。これらの抗−ＩＬ−２抗体はＩＬ一２
生産能を有するヒ１−Ｔ細胞の増殖は１４１害しなかっ
た。

スミスらは（Ｓｍｉｔｈら、Ｔｈｅ　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ。

［１９８３年１．１３１巻、１８０８−１８１４頁）Ｄ
ＭＳ−１、ＤＭＳ−２およびＤＭＳ−３と同定される３
種のＩＬ−２に対するモノクローナル抗体の製造を報告
した。ＤＭＳ−１および２はＩＬ−２活性の抗体濃度依
存中和ににり示されるように、ＩＬ−２と特異的に反応
した。ＤＭＳ−３はＩＬ−２中和に対する効果はより低
いが、ＩＬ−２とＪ：り強く結合し、免疫吸着剤として
働いた。

アルドマンら（Ａｌｔｍａｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ＾
ｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ［１９８４年］、８１巻、２１７
６−２１８０頁）はＩＬ−２の予想アミノ酸配列から作
成した８種の合成ペプチドを免疫原として用いてヒトＩ
Ｌ−２に対するポリクローナル抗体の１［を報告してい
る。各ペプチドは１３〜１５個のアミノ酸より成り、呑
口らにより報告されたＩＬ−２配列のデータ（Ｔａｎｉ
ｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ　：　Ｌｏｎｄｏｎ。

１１９８３年］、３０２巻、３０５−３１０頁）に基づ
いている。８個のペプチドの中の４個に対する抗体が１
９られた。ＩＬ−２ペプチドの１つに対する抗体をアフ
イニテイにより精製したものはフイトヘムアグルチニン
刺激のヒト末梢血管リンパ球の細胞質を特異的に染色し
た。これらの抗体はいずれもＩＬ−２活性の中和を示さ
なかった。

ＲＯｂｂら　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ
　　Ｓｃｉ、　　ｕｓＡ　　　［１９８３年］８０巻、
５９９０−５９９４頁）はＩＬ−２の第三番目のアミノ
酸の炭化水素部分に特異的に反応する［ＨＩＩ−［Ａ５
と命名したモノクローナル抗体の調製を報告した。この
抗体はＩ「−２めアフイニテイ精製に利用されたが１シ
ー２の生物活性は阻害しなかった。

ＩＬ−２に対するモノクローナル抗体はＩＬ−２の免疫
精製、ＩＬ−２免疫測定の開発、１１−−２分子の活性
部位の同定および免疫応答に於けるＩＬ−２の生理的役
割を調べるインビボ実験の測定法などと共にＩＬ−２の
生物活性の研究のための強力な分析および診断の道具を
提供する。ＩＬ−２に対するモノクローナル抗体は知ら
れているが、ＩＬ−２の精製のためのアフイニテイ試薬
として、またＩ　Ｌ　−２の高感度２点免疫アッセイの
試薬として日常利用できるものはあまりない。

本発明は、ヒトおよびマウスＩＬ−２精製のためのアフ
イニテイ試薬として、また感度の高い二点免疫アッセイ
のための試薬として利用できるＩＬ−２に対するモノク
ローナル抗体を得るためのものである。本発明はざらに
、本発明による新規なモノクローナル抗体のＩＬ−２精
製のためのアフイニテイマトリックスとしての利用およ
び血清やプラズマのような生体試料中のＩＬ−２定巾の
ための二点免疫アッセイ法への使用に関するものである
。

本発明によるＩＬ−２に対するモノクローナル抗体は、
組換えヒトインクリューギン２（γＩＬ−２）で免疫処
置した動物の抗体酸性細胞と骨髄ｉ！Ｆｉ胞とのハイブ
リドーマを生成し、該ハイブリドーマから抗−ヒトイン
タリューキン２抗体産成りローンを選択し、抗−ヒトイ
ンタリューキン２モノクローナル抗体を産成する選択株
を培養することにより得られる。

本発明は特に天然ＩＬ−２、組換え１［−２およびＩＬ
−２合成ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を目的
としている。さらに本発明は次の特性を有する三群のモ
ノクローナル抗体を目的としている。

グループ１：ＩＬ−２の作用を、ＩＬ一２バイオアッセ
イおよびレセプター結合アッセイの両者で５０％以上阻
害し、天然または組換えヒｈ　Ｉ　Ｌ−２蛋白質の１〜
１２．９〜１９．４１〜５５または２１〜１２３番目の
アミノ酸間で結合するくエピＩ・−ブを認識する）モノ
クローナル抗体。

グループ２：１Ｌ−２ＲＩＡアツレイによる測定で天然
または組換えヒトＩＬ−２と強いアフイニテイを有し、
ＩＬ−２バイオアツセイおよびレセプター結合アッセイ
による測定でＩＬ−２の作用を隋書せず、天然または組
換えヒトＩ　Ｌ　−２蛋白質の４０〜７０，４２〜５６
．２１〜１２３．７８〜８７、５２〜７０，６６〜８７
、１０７〜１２１または７１〜８７番目のアミノ酸間で
結合するモノクローナル抗体。

グループ３：ＩＬ−２バイオアツ頃イおよびレセプター
結合アッセイで天然または組換えマウスおにびヒトＩＬ
−２を阻害し、１Ｌ−２蛋白質の４１〜５５番目のアミ
ノ酸間で結合するモノクローナル抗体。

グループ１のモノクローナル抗体（ｍＡＢｓ）【よＩＬ
−２中和アツレイＪ３よびレセプター結合アツセイでＩ
Ｌ−２の作用を５０％以上阻害する。

グループ１のｍＡＢＳは天然または組換え１１−−２蛋
白質の１〜１２．９〜１９．４１〜５５または２１〜１
２３番目のアミノ酸に位首するエピトープを認識または
結合する。このようなｍＡＢｓはＩＬ−２の生物活性に
必要な２つの別のアミノ酸配列、例えば１〜１９および
４１〜５５、を同定するのに用いられる。

グループ２のモノクローナル抗体はＩＬ−２の作用を阻
害しない。本発明のグループ２モノクローナル抗体は放
射免疫アッセイによる測定でＩ［−２に対し高いアフイ
ニテイ（１０７−１０９Ｍ−１）を有し、従ってヒトＩ
Ｌ−２のｙ６製または中離のためのアフイニテイクロマ
トグラフイーの試薬として、さらに二点イムノアッセイ
のための抗体として有用である。グループ２ｍＡＢｓは
１Ｌ−２の生物活性に必要でないアミノ酸配列を認識す
る。

グループ３のモノクローナル抗体はＩＬ−２中和アツセ
イおよびレセプター結合アッセイにおいてマウスＩＬ−
２およびヒトＩＬ−２の作用を阻害する。グループ３０
ｍ　Ａ　３　ｓば特に、インビトロおよびインビボの両
方のアッセイに於いてＩＬ−２作用のモデル拮抗物質と
して有用である。さらに、このグループのｍＡＢｓはヒ
トまたはマウスＩＬ−２の精製のため、特に前臨床試験
に必要なマウス！し−２の大規模生産のためアフイニテ
イマトリックス取り込む材料として適している。

「酵素免疫アッセイＪ　　（ＥＩＡ）という用語は次の
アッセイを言う。ハイブリドーマ上澄液をマイクロタイ
タープレートのような固体基質に固定したγＩＬ−２ま
たはＩＬ−２合成ペプチドと反応させる。ベルオキシダ
ービと結合した山羊抗−マウス１９Ｇ１続いて０−フェ
ニレンジアミンとインキュベートした後、γＩＬ−２ま
たはＩＬ−２ペプチドと結合した抗体量を各ウェルの吸
光度（ＯＤ　　）を測定することにより決定する。対前
値より１０倍以上の高い特異結合が認められたものを陽
性とする。

「中和アッセイ」という用語はＧ１１ｌｉｓらにより記
載される従来のＴ細胞生育アッセイ（Ｇｉｌｌｉｓら［
１９７８年］　、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２０巻、
２０２７頁）を表わ１°。標準手法に少し改良を加えて
いるが、それらは技術の熟練内のものであり、個々の要
求により適当なものである。簡単には、ｌし−２依存性
ネズミ細胞傷害性Ｔ１１１胞株をＩＬ−２および試験す
るモノクローナル抗体の存在下でインキュベ−１・する
。モノクローナル抗体がＩＬ−２蛋白質の“中和”工と
１−一ブと結合すると、ＩＬ−２はＴｌ胞株による取り
込みに利用されない。即ち、モノクローナル抗体がＩＬ
−２活性を゛中和″する。ｍＡＢがＩ　＋−−２蛋白質
の中和エピトープに結合しないと、ＩＬ−２はＴ細胞株
による取り込みを受ける。

「結合アッセイ」という用語は通常ロブら（Ｒｏｂｂら
［１９８１年］　、　Ｊ、、、　　Ｅｘｐ、　　Ｗｅｄ
、　１５４巻、１４５５−１４７４頁）により１７ｉ１
発された方法を示す。ここで用いられているＪ：うに、
この用語はモノクローナル抗体が放射標識＋１−２（＋
−１ｍ−２＞の標的細胞でのレセプタ一部位への結合を
阻害する能力を測定するアッセイを特別に示す。

「エピトープ」　（場合によっては「抗原性決定因子」
と６言われる）という用語はＩＬ一２分子上で本発明の
モノクローナル抗体が結合する領域を示す。このｒ　Ｉ
　Ｌ＝２分子分子鎮域」はｍＡＢにより認識されるアミ
ノ酸配列である。膿晋により、ＩＬ−２蛋白質のアミノ
酸はＮ−末端アミノ酸から順番に番号をつけ、従って１
〜１２の部分はｌし一２蛋白質の最初の１２個のアミノ
酸を表わす。

「放射免疫アッセイＪ（ＲＩＡ）という用語は本発明の
モノクローナル抗体が　　ｌ−標識ＩＬ−２と結合する
能力を測定するアッセイを表わす。

本発明−のモノクローナル抗体を固体基？ｔ（アガロー
スピーズ）に結合した山羊抗−マウス１０Ｇとインキュ
ベートし、遠心分離によってビーズを集め、　　　ｌ−
標識ＩＬ−２とインキュベートする。

イの１股、ベレットのｔ１１射活性をガンマ−測定計で
測定する。、　　　ｌ−標識ＩＬ−２に対するｍ　Ａ　
Ｂのアフィニテイが高い稈、ガンマ−測定計での値も高
くなる。

ペプチドはヒトＩ　Ｌ　−２のアミノ酸配列の報告サレ
テイル配列（Ｇ、　ＢａｒａｎＶおよびＲ，Ｂ。

Ｈｅｒｒｉｅｆｉｅｌｄ　　［１９８０年］　、Ｐ（３
ＤｔｉｄＯ３：＾ｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｒ
ｓ、　８ｉ０１００Ｖ、　Ｅ、　ａｒａｓｓａ３よびＪ
、　　Ｈｅ１ｅｎｈｏｆｃｒ　　編集、　八ｃａｄｅｍ
ｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ。

第２巻、１−２５５頁）に由来している。合成ペプチド
はＨｃｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法（Ｊ、　Ｐ、　Ｔａｇ
、　Ｗ、　Ｆ。

＋１ｅａｔｏｒおよびＲ，Ｂ、　Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
　［１９８３年］、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｕ＋、　Ｓｏ
ｃ、　１０５巻、６４４２−６４５５頁）により合成さ
れた。全ペプチドの組成はアミノ酸分析によって確認さ
れた。ハイブリドーマ上澄液の検索に用いた合成ペプチ
ドのアミノ酸配列は以下に示す。

組換えＩＬ−２アナログは以下の通り調製した。

決まったアミノ酸の変化はＥ、ｃｏｌｉ中でヒトＩＬ−
２蛋白質を発現することの出来る二ｆｆ１ｍ０Ｎ△プラ
スミドの変異により行なった。部位特異変異はアミノ酸
の変化をコードする合成オリゴヌクレオチドを利用し、
Ｈｏｒｉｎａｇａら＜　Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎ０１０（ｌ
Ｖ２巻、６３６−６３９頁：１９８４年）の記載のとお
り行なった。各変異について１１００ｎの分析した線状
プラスミドＤＮＡとｉ　ｐＩＩｒｏｌｅのりん酸化合成
オリゴヌクレオチドと混合した。

ＤＮＡは加熱により熱変性させ、室温でアニーリングさ
ゼた。生成したヘテロ二本鎖分子の一本鎖領域に合成オ
リゴヌクレオチドが取り込まれる。

ＤＮＡ混合物の試料をＥ、ｃｏ　ｌ　ｉＭｃ１０６１株
に移した。変異プラスミドを含有する細菌コロニーは、
野生型ＩＬ−２ＤＮＡがハイブリダイズしない条件下で
３２Ｐ−標識合成オリゴヌクレオチドと特異的にハイブ
リダイズすることで同定される。変異プラスミドは標準
条件下４２℃で宿主細・　胞を生育させることで組換え
ＩＬ−２蛋白質アナログの発現を誘導した。

一個のアミノ酸を変化させたアナログを第１表に示す。

さらに、天然たん白質から１〜１０１１〜２０および１
２４〜１３３番目のアミノ酸を欠円させた欠損変異株も
得た。

血清中の抗−ＩＬ−２抗体の高力価を達成するためには
およそ２５−５０μ９の免疫原、好ましくはおよそ５０
μりの免疫原をＯおよび７日目に投与し、続いて３００
日目およそ５０μ３からおよそ７５μ９の免疫原を、好
ましくはおよそ７５μびの免疫原を追加免疫しておよそ
１：０．５−１０×１０５およびおよそ１：１−’２Ｘ
１０３希釈のＥＩＡおよびＲＩＡ力価を夫々前る。

以下に示す実施例は本発明のモノクローナル抗体の調製
および使用の詳細なる説明を示す。

実施例　１ く免疫処置〉 ８−１０週令の雌Ｂａ１ｂ／ｃマウス８匹（チャールス
・リバー・ラボラトリズ、米田マサチュセツツ州つイル
ミングトン）をフロインＩ・完全アジュバント中の２５
−５０μＪの組換えヒトインタリューキン２（γＩＬ−
２）でＯおよび７日目に免疫処置する。免疫処置は３カ
所の部位で行なうニ一つは腹腔的注射、二つは皮下注射
で一方は左置径部、他方は布置径部に行なう。３００日
目マウスを眼窩後層から採血し、その血清について酵素
免疫アッセイ（Ｅ　ＩＡ）および放射免疫アッセイ（Ｒ
ＩＡ）で抗ＩＬ−２抗体を測定した。６０日８に５０−
７５μｑのγＩＬ−２の追加免疫を腹腔的注射で行ない
、９０日８に再び採血した。

血清について抗−ＩＬ−２抗体を測定し、続いてＩＬ−
２の生物活性の阻害能を調べた。ＩＬ−２の生物活性の
阻害は二つの方法で評価した°：１）マウスＣＴＬＬｉ
ｌｌ胞またはヒト末梢血液リンパ芽球のＩＬ一２依存性
増殖の中和（中和アッセイ）および２）　　　Ｉ−標１
１Ｌ−２の標的細胞への結合の阻害（レセプター結合ア
ッセイ）である。両アッセイともＩＬ−２が細胞レセプ
ターと結合するのに必要なＩＬ−２のエビ］−−ブと結
合する高アフイニテイ抗体を測定するものである。９０
日８に血清はＥＩＡおよびＲＩＡの力価としてそれぞれ
およそ１　：０．５−１．０Ｘ１０５および１：１−２
Ｘ１０３希釈を示し、■し−２の生物活性をも阻害した
。二回目の採血後４５−１００日後に、マウスは連続３
１日間５０μりのγＩＬ−２を静注および腹腔的注射に
て追加免疫処置した。５８目にマウスを殺し、牌臓を摘
出して牌細胞を調製した。

実施例　２ くハイブリドーマ細胞融合の調製〉 融合の２日前に牌細胞フィーダー細胞をマウスより完全
培地中［ＩＭＤＭ＋１０％胎児ウシ血清、グルタミン（
２，０ｍＭ）、および１００μＭヒボキナンチン、０．
４μＭアミノプテリンおよび１６μＭチミジン（ＨＡＴ
）含有２−メルカプトエタノール］で調製した。Ｄｅ　
ｓｔ、　ＧｒＯｔｌｌおよびＳｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒの
方法、（１９８０年）、Ｊ。

１＋ｅ＋ｎｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３５巻、１
頁、の改良法に従って牌臓細胞（１０”）を対数増殖期
のＰＡＩ−Ｏマウス骨髄腫細胞（１０５）と融合させた
（Ｊ、　Ｗ、　５ｔＯＣｋｅｒら、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ、　２１７巻、１９８２年５月、
１５５−１５７頁）。細胞を混ぜ、遠心分離により集め
、３５％（Ｖ／Ｖ）ポリエチレングリコール含有ＩＭＤ
Ｍ１．Ｏａｉ！中に静かに攪拌を続けながら３７℃で１
分余りけん渇する。３７℃で３分間インキュベーション
の後、細胞を遠心分離で集め、１０Ｉ１１のＩ　ＭＤＭ
＋ＨＡＴに静かにけん濁する。細胞を完全培地中）ＩＡ
Ｔ１ｄ当り１　Ｘ　１０６個になるよう希釈し、１ｄの
完全培地当りｌＸ１０６個のフィーダー細胞を含有する
２４穴マイクロタイタープレートに分注する（ウェル当
りＬｄ）。ハイブリドーマ上澄液につき実施例３および
４に示すＩＬ−２ＥＩＡおよびＲＩＡにより抗−ＩＬ−
２抗体の測定を行なう。希釈を限定してハイブリドーマ
を選択する。

実施例　３ ＜ＩＬ−２ＥＩＡ＞ 予めγＩＬ−２または第１表のＩＬ−２ペプチドをコー
トしく１１００ｎ／ウエル、３７℃−晩）、２５ｍＭり
ん酸ナトリウム、ｐＨ６，５、中２％ＢＳＡ＋１Ｍ　　
ＮａＣｊ！＋０．１５％Ｔｗｅｅｎ　２０を３５μｍを
添加したマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐ
ｒｏｂｉｎｄまたはｃｏｓｔａｒＥＩＡ）のウェルにハ
イブリドーマ培養上澄液（６５μｍ）を加える。室温で
２時間インキュベーション後、ウェルをＰＢＳ　（２５
ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で洗滌する。ワ
サビ大根のペルオキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイ
ムＢ１０ＣｈｅｌｌｉＣａｌＳ）に結合した山羊抗−マ
ウスＩＱＧ＋ＩｏＭを１００μｉ（抗体緩衝液で１：１
０００希釈：２５ｍＭりん酸ナトリウム、ＤＨ６，５，
０，５Ｍ　　ＮａＣｊ！＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０
　＞ずつ各ウェルに添加し、室温で９０分間インキュベ
ートする。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｃｅｎ　２
０で洗滌し、０−フェニレンジアミン＜０．１Ｍクエン
酸緩衝液、Ｉ）ｌ−１４，５、＋０．０１２％過酸化水
素中０．４Ｉｔｇ／ｍ１）と室温で３０分間インキュベ
ートする。５０ｍＭ異性重亜１！ｔＩＭナトリウムを含
有’Ｌ６２．５Ｍ　　Ｈ２ＳＯ２を５０ｕ！添加する事
により反応を停止する。基質の色を０Ｄ４８８でタイタ
ー　チック・マルチスキャンＭＣを用いて測定する。

実施例４ ＜ＩＬ−２ＲＩＡ＞ ハイブリドーマ培養上澄液（０，１−０，５ａｄりをＲ
ＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７，５
，１％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１００，１％デオキシコ
レート、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１５Ｍ
　　ＮａＣｊ！、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ＞中１％ＢＳΔ溶
液中、アガロースビーズ（シグマＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、）に結合した山羊抗−マウスＩｑＧの５０％【プん
濁液１００μｌと回転攪拌機上Ｖ温で２時間インキュベ
ートする。ビーズを遠心分離により集め、ＲＩＰＡ緩雨
液で一回洗滌後１％ＢＳＡ＋Ｒ［ＰＡ！ＩＩＩ液中（７
）　　　Ｉ標識ＩＬ−２（１０−２０ｆｍｏｌｃｓ、１
−２ｘ１０’ｃｐｍ）２５０μｌを加える。回転攪拌機
上４℃−晩インキユベートした後、ビーズをＲＩＰＡ！
ｌ衝液で洗滌し、ＬＫＢガンマ−測定計で放射能を測定
する。

実施例　５ ＜　Ｉ　Ｌ−２中和アッセイ〉 ＩＬ−２の生物活性はＩ　Ｌ−２依存性のネズミ細胞傷
害Ｔｌ胞株（ＣＴＬＬ）を用いてＧ１１ｌｉｓらにより
記載されている通り（Ａｌｔｍａｎら、［１９８４年］
　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ、
　８１巻、２１７６−２１８０頁：　ｎｏｂｂら、Ｎ９
８３年］　ＰｒｏｃＮａｔｌ’ＡＣａｔｊ　ｓＣｉ　Ｕ
ＳＡ　、　８０巻、５９９０−５９９４頁）に微量アッ
セイにて測定した。ＩＬ−２生物活性の阻害はＩＬ−２
活性測定を改良して測定した。簡単には、濃縮したハイ
ブリドーマ上澄液（２０（１１！Ｉｌｌ縮）２５μｌを
ＩＬ−２を含む培地（１単位＃り２５μｌと３７℃１時
間インキュベートする。この混合物を５０μｍの培地お
よびＣＴＬＬ［Ｉ胞を含有するマイクロタイタープレー
トに入れ、３７℃で一晩インキユベートする。翌日、培
養物を３Ｈ−チミジンでパルス標識しく０．５μＣ１１
５０μｍ／ウェル）、３７℃５時間インキュベートを行
なう。３日−チミジンの取り込みを液体シンチレーショ
ンカウンターで測定し、その結果を抗体存在下に於ける
３日−チミジン取り込み阻害を培地の対照値と比較して
パーセントで表わす。

実施例　６ ＜ＩＬ−２レセプタ一結合アッセイ〉 ハイブリドーマ抗体による　　１−ＩＬ−２の標的細胞
への結合阻害は文献（Ｒ，Ｊ、　Ｒｏｂｂら、［１９８
１年］、上記引用）の方法に改良を加えて測定した。バ
イブリドーマ上澄液（２０倍濃縮）を予め　　Ｉ−ＩＬ
−２と３７℃１時間インキュベートしておく。ネズミＣ
Ｔ６またはヒト末梢血液リンパ芽球細胞（６Ｘ１０４個
）の１２０１１１を最終容量が１５０μｌとなるように
加える。３７℃で２０分間インキュベーション後、細胞
をシリコン油混合物を通して４℃９０秒間遠心分離する
。細胞ペレットを含む遠心管の先端を切り取り、ガンマ
−測定計で放射活性を測定する。結果は抗体ｑ右下での
　　１−ＩＬ−２結合阻害を対照と一比較してバーセン
１−で表わす。第２表に実施例３−６に記載した測定の
結果をまとめた。「エピトープ」と記した項のカッコ内
のアミノ酸、例えば”ＩＬｙｓ　　８）”、はモノクロ
ーナル抗体が結合するのに必須なものである。

ハイブリドーマ抗体のエピトープは上述のＩＬ−２合成
ペプチドとのＥＲＡ反応性および第１図の組換えＩ　Ｌ
　−２アナログのウェスタンプロットおよびドツトプロ
ット分析により決定した。ウェスタンプロットおよびド
ツトプロットアッセイは実施例７に記載する。

実施例　７ くエピトープのマツピング分析〉 ウェスタンプロットのために組換えヒトＩＬ−２アナロ
グ含有のＥ、ｃｏｌｉ抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより
分離し、ニトロセルロースに転写して各ハイブリドーマ
抗体で検索する。ドツトプロットには、Ｅ、ｃｏｌｉの
抽出物を直接ニドＯセル［ｌ−スに移し、乾燥侵各抗体
で検索する。

ＩＬ−２アナログと結合した抗体はペルオキシダーゼ結
合抗−抗体とペルオキシダーゼ基質である４−０１−１
−ナフトールで検出される。ＩＬ−２の４０〜７０番目
のアミノ酸についての結果を第３表にまとめた。第３表
のデータは異なるＩＬ−２アナログとの各ｍＡＢの反応
性をウェスタンおよびドツトプロット分析で測定したも
のである。

北潰 ３０−７０　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　
　　　　＋　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　＋
　　　　　　　　　−ト４０−７０　　　　　　　−１
−　　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋
４２−５６＋＋＋− ５２−７０’−−−−− マウスｒＬ＝２　　　　　　’　　　　　＋　　　　　
−±本発明のモノクローナル抗体は通常のアフイニテイ
クロマトグラフイー手法の試薬として利用できる。グル
ープ３のモノクローナル抗体は特にマウスおよびヒトＩ
Ｌ−２の両方を単離し、精製するのに使用できる。ここ
に記載されるモノクローナル抗体はまた、血清やプラズ
マなどの生体試料中の微ｍのＩＬ−２を測定する°゛二
点サすドイッチアッセイ″の試薬としても有用である。

本発明のモノクローナル抗体は生体試料中のＩＬ−２蛋
白質の借を測定するための方法に有用であり、その方法
は以下のステップより成る。

＋１）ｉＬ−２蛋白質のエピトープに結合する能力のあ
る第一のモノクローナル抗体を固体担体に結合し、 （２）　　該第一モノクローナル抗体と生体試料とを接
触させて該ペプチドと該ＩＬ−２蛋白質との不溶性複合
体を該試料中に形成させ、（３）　　上記第２ステップ
の複合体と、前記第一のモノクロナール抗体と結合した
エピトープとは異るＩＬ−２蛋白質の一つのエピトープ
と結合する能力を有する標識した第二のモノク【］ナー
ル抗体の一定量とを接触させ、（４）　　該固体担体を
該生体試料および該未反応標識抗体とから分離し、 （５）　　該固体担体と結合した標識抗体の量を測定す
る。

但し、該固体相基質に結合する該標識の聞が該試料中に
存在するインタリューキン２の吊に比例する。

本技術の熟練者には明かな通り、グループ１゜２および
３のｍＡＢｓはＩ　ｌ−−２蛋白質の同じエピトープに
結合しない限り、免疫アッセイでお互いに交換して使用
できる。例えば、グループ３のｍＡＢ、１３Ａ６とグル
ープ１のｍＡ８．１３Ｄ２は］し−２蛋白質の４１〜５
５エピトープと結合するので一緒に使用できない。免疫
測定アッセイに使用するのに好ましいのは、グループ１
ｍΔＢ　　５８１とグループ２のｍＡ　　Ｂ１７Ａ１で
ある。両方のｍＡＢｓとらｌＸ１０９Ｍ−１の程度の７
フイニテイを有する。

本発明の二点サンドイッチアッセイはＩＬ−２の０．５
から１．０ｎ９／ｄ！（３２，２５から６４、５ｆｉｏ
ｌｅ　／ｄ）の感度で標準曲線を作成した。

アッセイの直線にのる範囲は０．５−１．０ｎｇ／ｌｌ
ｌ１から１０ｎｇ／−であって、これは５−１０単位／
Ｉ１１カら１００１ｉ位／ｄに相当する。ＩＬ−２をウ
シ血清アルブミン添加緩衝液で希釈しても１００％ヒト
血清で希釈してもアッセイの感度は同じであった。

アッセイにグループ１ｍＡＢ、５Ｂ１とグループ２ｍＡ
Ｂ、１７Ａ１とを併せて使用するとざらに高い感度が得
られる。この場合、１１Ｉｌの試料当’００．１＋９（
７）ＩＬ−２（６，４５ｆｍｏｌｅｓ）の微量をも検出
できる。これは試料１１ｄ当り２単位のＩＬ−２活性に
相当する。

ここで用いている生体試料という用語は、血液、リンパ
液等ＩＬ−２蛋白質を含有するものを表わす。本発明の
免疫測定アッセイに用いられる好ましい生体試料として
は血清またはプラズマがあり、特に血清である。

木！ｊｌ！　Ｉｔの免疫測定アッセイで用いられる本発
明の第一のモノクローナル抗体は通常免疫アッセイに用
いられるいかなる担体にでも固定される。例えば、プラ
スチック装ビーズまたはポリエチレン、ボリスヂレン、
ポリプロピレン或いは他の適当な材質の試験管である。

またアガロース、架橋デキストランおよび他の多糖類の
ような粒状物質も有用である。固定化の技術は本技術の
熟練者にはよく知られている。例えば、米国特許Ｎｔ１
３．６４５゜５５２に記載されている方法を用いて抗体
を多糖ポリマーに結合する。

本発明の標識した第二のモノクローナル抗体は従来の免
疫測定アッセイで通常用いられる標識を用いて調製され
る。例えば、米国特許Ｎｕ３．９４０．４７５に記載さ
れる蛍光測定による検出のための蛍光性標識および米国
特許ＮｃＬ３．６４５，０９０に記載される酵素マーカ
ー、或いは、例えばＩＩ　ｕ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒおよびＧ
ｒｅｅｎｗｏｏｄ、　Ｎａｔｕｒｅ　　（１９６２年）
、１４４巻、９４５頁の方法を用いた放射標識Ｉ　　が
ある。ここで用いるのは酵素標識が好ましい。

実施例　８ ＜Ａ、ＩＬ−２の二点サンドイッチアッセイ〉グループ
１のｍＡＢ　　５Ｂ１をコーティング緩衝液（５０ｍＭ
トリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣ１ｐＨ８，０）で２０μ
ｇ／ｄとなるよう希釈し、その１００μｌをコスタール
Ｅｌ△マイクロタイタープレートの各ウェルに入れる。

プレートを室温で一晩インキユベートする。その後プレ
ートを洗滌用緩衝液（２５ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液
、１５０ｍＭ　　ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２
０　）で３回洗滌する。洗滌したプレートの各ウェルに
予め加温したく３７℃）ブロッキング用ＩＩＷ液２５０
μｋを添加する。プレートは３７℃で１５−３０分間イ
ンキュベートした後、洗滌用緩衝液で３回洗滌する。続
いて１００μｌの血清試料または標準液を各ウェルに加
えて４℃で一晩インキユベートする。プレートはＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎ　！ＩＩＩ液で３回洗滌する。次に各ウェ
ルにビオチンを結合した抗体希釈液（１０または２０μ
’ｊ／ｄのｍＡＢ　　１７Ａ１＞１００Ｉｉｊ！を加え
て３７℃で２時間振とうしながらインキュベートする。

その後プレートをＰ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔｗｅｅｎで３回洗
滌し、かくウェルにストレプトアビジン／ベルオキシダ
ーゼ抱合体１００μｍを添加する。プレートを次に室ｒ
ｇＡ１５分間娠とうしながらインキュベ−１−する。プ
レートをＰＢＳ／Ｔｗｃｅｎで３回洗滌した後、１００
μｌのベル：オキシダーゼＬを質を各ウェルに加えて室
温３０分分間上うしてインキュベートする。反応は２．
５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４および５０ｍ’Ｍ異性償亜ｉ酸を含む
溶液を５０μｌ添加して停止する。タイタータック・マ
ルチスキャンＭＣを用いて４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。

＜３．二点アッセイの標準曲線のｖＡ製〉ＩＬ−２を１
．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清で
希釈する。この溶液を希釈して０．１μ！？　／　／ｌ
ｊ！から０．１１＋１９／ｄを含む段階希釈液を１υる
。標準曲線には１１Ｇ１のウェルを使用する。一つのウ
ェルは緩ｆｉａのブランクに用いる。

くＣ，モノクローナル抗体のビオチン化〉１７Ａ１と同
定されたグループ２の七ツク０−ナル抗体をＯ，１Ｍ炭
酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，４、に対して４℃に
て一晩透析する。蛋白濃度を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウ
ムＷＩｉｉ液、ｐＨ８，４、を用いて１−５１１１ｆｆ
／ｍｅに調整する。

新たに調製したＤＭＳＯ中１．１η／戴のビオチンＮ−
ヒドロキシザクシンイミドエステルを１ｄの抗体（１，
０Ｒｇ＞当り１０’Ｏμｌ添加する。反応は室温で２時
間時々撮とうじながら行なう。その後、未反応のエステ
ルを１００ｕ１の１Ｎ−Ｎｌ−１４Ｃ，ｊ！を加えてブ
ロックし、反応液をさらに１０分間インキュベートする
。続いてＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡ溶液１−（ピオチン
化抗体１　ｍ’Ｊに対して１ｍ＞を加え、反応液を４℃
で０．０１％チメＯサール含右ＰＢＳ　（ｐＨ１７，４
）を用いて一夜透析する（少なくとも２１のＰＢＳを用
いる）。

くり、ベルＡ”キシダーゼ基質の調製〉０−フェニレン
ジアミン溶液（０，４ｒＩｔｇ／ｍｉ）はクエンＰＩｉ
緩衝液を用いて調製する。本溶液１０ｄに対して４μｌ
の３０％Ｈ２Ｏ２を加えて終濃度を０．０１２％とする
。

＜Ｅ、緩衝液および希釈液の組成〉 １、コーティング緩衝液： ５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８，０ １５０ｍＭ　　ＮａＣ１ °２．ブロッキング用緩衝液ニ ー”ＦＢＳＩ衝液＋１６０μｇ／ｌｌｌ１！ヒトＩｇＧ
”− １０％ＦＢＳ　（熱不活化） １％ＢＳＡ ０．３％ゼラチン ２５ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液、 ｐｉ−１８，０ １５０ｍＭ　　ＮａＣｊ！ １６０μｇ／ＩＲ１ヒト［ｏＧ −“１，４％Ｂ５Ａｌ１衝液″− １、４％ＢＳＡ ０．３％ゼラチン ２５ｍＭりん酸ナトリウム！１ｖｊＩ液、ｐＨ７，５ １５０ｍＭ　　ＮａＣｊ！ ４、ビオヂン化抗体希釈液ニ ー”ＦＢＳ緩衝液＋Ｔｗｅｅｎ　＋ｈｕ　Ｉ　ＱＧ”　
−ＦＢＳ！１衝液＋ヒトｌ０Ｇ ０１２％　Ｔｗｅｅｎ　２０ ５．０−フェニレンジアミン緩衝液： ０．１Ｍクエン酸緩衝液、ＤＨ４，５ ら、洗滌用緩衝液ニ ー″Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｔｗｅｅｎ”− ２５ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液、 ｐＨ７，２ １５０ｍＭ　　ＮａＣ１ ０，０５％　Ｔｗｅｅｎ２０ 上記の二点サンドイッチアッセイは本発明によるモノク
ローナル抗体を使用することにより交差反応性を除去或
いは大きく減少させているため非常に特異性が高く、従
って感度が高い。交差反応性が除去或いｔよ減少されて
いるため「偽陽性」の結果の出現もないか非常に低下す
る。

天然型および組換え！Ｌ−２に特異なモノクローナル抗
体（ｍＡＢ＞を開発し、ＩＬ−２中和アツセイおよび］
し−２レセプタ一結合アッセイによりｌし一２活性の阻
害を試験した。７５の個のｍＡＢＳのエピトープをＩＬ
−２合成ペプチドへのＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ反応性および
組換えｌし一２アナログを用いたウェスタンプロットお
よびドツトプロット分析により決定した。ｍＡＢｓは３
つのグループに分類されたニゲループ１は両方の活性測
定アッセイでＩＬ−２活性を阻害する。グループ２はＩ
Ｌ−２活性は阻害しない。グループ３はマウスとヒトＩ
Ｌ−２の活性を阻害するがラッテのＩＬ−２活性は阻害
しない。エピトープマツピングのデータをｌし一２活性
阻害と比較するとヒトＩ　１−２活性に重要な２つのエ
ピトープが明かとなる：１〜１９および４１〜５５番目
のアミノ酸である。４１〜５５の領域内にマウスＩＬ−
２活性を中和する１３Ａ６抗体のエピトープが存在する
が、これはマウスＩＬ−２と結合も中和反応もしない１
３Ｄ２のエピトープと異なってはいるが非常に近いもの
である。エピトープの競合実験から、１〜１９および４
０〜６０の配列は元の分子中で物理的に近接しているこ
とがわかっている。

アミノ酸１〜１２に結合する抗体５８１はＩＬ−２結合
で４０〜７０残基に特異なｍＡＢを阻害するがそれぞれ
２１〜１２３および７１〜８７に結合するｍＡＢＳ　　
１７Ａ１および３Ｄ５は同じアッセイでブロックされな
い。分析した７５１１１ｉｌのｍＡＢｓの中で９５％以
上が１〜１９および４０〜８０のアミンＭ領戚に集中し
たエピトープを認識する。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）天然型または組換えヒトＩＬ−２に対して３．５
   ×１０＾７Ｍ＾−＾１以上のアフィニティを有し、天然
   型または組換えヒトＩＬ−２の機能を従来の中和アッセ
   イ法およびレセプター結合アッセイ法による測定で５０
   ％以上阻害し、該ＩＬ−２蛋白質と１〜１２番目、９〜
   １９番目、２１〜１２３番目或いは４１〜５５番目のア
   ミノ酸の間で結合するモノクローナル抗体。
2. （２）該ＩＬ−２蛋白質と１〜１２番目或いは９〜１９
   番目のアミノ酸の間で結合する特許請求の範囲第（１）
   項記載のモノクローナル抗体。
3. （３）該ＩＬ−２蛋白質と４１〜５５番目のアミノ酸間
   で結合する特許請求の範囲第（１）項記載のモノクロー
   ナル抗体。
4. （４）該ＩＬ−２蛋白質と２１〜１２３番目のアミノ酸
   間で結合する特許請求の範囲第（１）項記載のモノクロ
   ーナル抗体。
5. （５）ヒトＩＬ−２とおよそ１．０×１０＾９Ｍ＾−＾
   １のアフィニティを有する特許請求の範囲第（２）項記
   載のモノクローナルを抗体。
6. （６）天然型または組換えヒトＩＬ−２蛋白質とのアフ
   ィニティーが従来の放射免疫測定法による測定でおよそ
   ２．７×１０＾７Ｍ＾−＾１以上であり、従来の中和ア
   ッセイ法およびレセプター結合アッセイ法による測定で
   ＩＬ−２の機能を阻害せず、該ＩＬ−２蛋白質と４０〜
   ７０番目、４２〜５６番目、５２〜７０番目、６６〜８
   ７番目、７８〜８７番目、１０７〜１２１番目或いは２
   １〜１２３番目のアミノ酸間で結合するモノクローナル
   抗体。
7. （７）ＩＬ−２蛋白質と４０〜７０或いは４２〜５６番
   目のアミノ酸間で結合する特許請求の範囲第（６）項記
   載のモノクローナル抗体。
8. （８）ＩＬ−２蛋白質と６６〜８７、７１〜８７或いは
   ７８〜８７番目のアミノ酸間で結合する特許請求の範囲
   第（６）項記載のモノクローナル抗体。
9. （９）ＩＬ−２蛋白質と２１〜１２３或いは１０７〜１
   ２１番目のアミノ酸間で結合する特許請求の範囲第（６
   ）項記載のモノクローナル抗体。
10. （１０）およそ１．０×１０＾９Ｍ＾−＾１のアフィニ
    ティを有する特許請求の範囲第（９）項記載のモノクロ
    ーナル抗体。
11. （１１）およそ２．７×１０＾８Ｍ＾−＾１のアフィニ
    ティーを有する特許請求の範囲第（７）項記載のモノク
    ローナル抗体。
12. （１２）中和アッセイ法およびレセプター結合アッセイ
    法による測定で天然型または組換えヒト或いはマウスＩ
    Ｌ−２を阻害し、ＩＬ−２蛋白質の４１〜５５番目のア
    ミノ酸間のエピトープと結合し、放射免疫測定法により
    測定した時ヒトまたはマウスＩＬ−２蛋白質とおよそ３
    ．５×１０＾７Ｍ＾−＾１のアフィニティーを有するモ
    ノクローナル抗体。
13. （１３）中和アッセイ法で測定した時ヒトＩＬ−２を４
    ０％以上阻害し、マウスＩＬ−２を７５％以上阻害する
    特許請求の範囲第（１２）項記載のモノクローナル抗体
    。
14. （１４）生体試料中のＩＬ−２蛋白質の定量方法であっ
    て、 １、固体担体に該ＩＬ−２蛋白質の一つのエピトープに
    結合する能力を有する第一のモノ クローナル抗体を結合させ、 ２、該第一番目のモノクローナル抗体とＩＬ−２蛋白質
    を含有する生体試料を接触させて 該第一モノクローナル抗体と該ＩＬ−２蛋 白質との不溶性複合体を形成させ、 ３、上記第２ステップの複合体と、該ＩＬ−２蛋白質の
    一つのエピトープと結合する能力 を有する標識した第二のモノクローナル抗 体の一定量とを接触させ、 ４、該固体担体を該生体試料および未反応標識第二モノ
    クローナル抗体から分離し、 ５、該固体担体と結合した該標識第二モノクローナル抗
    体の量を測定する ことより成る方法で、但し、該標識の量が該試料中に存
    在するＩＬ−２蛋白質の量に比例し、該第一および第二
    のモノクローナル抗体がそれぞれＩＬ−２蛋白質に対し
    て少なくとも約２．７５×１０＾７Ｍ＾−＾１のアフィ
    ニティを有し、該第一のモノクローナル抗体および該第
    二のモノクローナル抗体がＩＬ−２蛋白質と１〜１２、
    ９〜１９、２１〜１２３、４２〜５６、４０〜７０、４
    １〜５５、７８〜８７、５２〜７０、６６〜８７、７１
    〜８７或いは１０７〜１２１番目のアミノ酸間で結合し
    、該第一および第二のモノクローナル抗体がＩＬ−２蛋
    白質の同一または重複したエピトープを認識しないよう
    な、生体試料中のＩＬ−２蛋白質を定量する方法。
15. （１５）該第一および該第二のモノクローナル抗体がＩ
    Ｌ−２蛋白質に対して少なくともおよそ５．０×１０＾
    ７Ｍ＾−＾１のアフィニティを有する特許請求の範囲第
    （１４）項記載の方法。
16. （１６）該第一および該第二のモノクローナル抗体がＩ
    Ｌ−２蛋白質に対して少なくともおよそ２．８×１０＾
    ７Ｍ＾−＾１のアフィニティを有する特許請求の範囲第
    （１４）項記載の方法。
17. （１７）該第一および該第二のモノクローナル抗体がＩ
    Ｌ−２蛋白質に対して少なくともおよそ１．０×１０＾
    ９Ｍ＾−＾１のアフィニティを有する特許請求の範囲第
    （１４）項記載の方法。
18. （１８）該第一のモノクローナル抗体がＩＬ−２蛋白質
    と１−１２番目のアミノ酸の間で結合し、該第二のモノ
    クローナル抗体がＩＬ−２蛋白質と２１〜１２３番目の
    アミノ酸間で結合する特許請求の範囲第（１７）項記載
    の方法。
19. （１９）標識抗体が放射性同位元素、酵素および蛍光物
    質からなる群より選択されるもので標識されている特許
    請求の範囲第（１４）項記載の方法。
20. （２０）標識モノクローナル抗体が酵素により標識され
    ている特許請求の範囲第（２０）項記載の方法。