JPS6051121A - モノクロ−ナル抗体ならびにその製法，使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ハイブリドーマに由来するヒトインターロイ
キン２（以下、ヒトＩ　Ｌ　２と略記する。）に特異的
な単クローン性抗体とその製造方法に閏する。

肺臓細胞と骨ｆｔ．　Ｈ細胞のハイブリトーマは文献中
に記載されている。例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ　（！Ｌ　
ａｔ．。

ＮａＬｕｒａ　２５（ｉ，４４１５　（　＋９７５）お
よびＥｕｒ．Ｊ．１ｍｍｕｎｏ１．０。

５１１　（　１９７０）　；　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ
　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　２６（ｉ，５５０（１９７７
）　；　Ｗａｌｓｈ、Ｎａｔｕｒｅ　２６Ｂ、４９５　
（１９７７）参照。

しかし本発明以前には、ヒトＴリンボーマに由来するＩ
ｌ２を抗原として作用させて得られる抗ヒ）ＩＬ２抗体
産生細胞のハイプリドーマを作成し、ヒ）　Ｉ　Ｌ　２
に対するモノクローナル抗体、すなわち、抗ヒトＩ　Ｌ
　２モノクローナル抗体を産生ずる方法に関しては全く
知られていない。

本発明に従えば、ヒ）Ｉｌ２に対して特異性を示すモノ
クローナル抗体を産生ずるハイプリトーマクローンおよ
び該クローンが産生ずる性状の均一な抗ヒ）ＩＬ２モノ
クローナル抗体が提供される。さらに該モノクローナル
抗体を用いたＩｌ２の微量定量法および精製法か提供さ
れる。

本発明のハイプリトーマクローンは、（ａ）骨ｆｔｉ腫
細胞すなわち骨髄の初期腫瘍からの悪性化細胞と（ｂ）
ヒ）　Ｉ　Ｌ　２て免疫された動物の肺臓またはリンパ
節の細胞中に存在する抗体産生細胞とのハイプリドーマ
を作成し、このハイプリドーマを培養およびクローン化
してヒ）Ｉｌ２に特異性を示す抗体を産生ずるクローン
として選択されるものである。

Ｉｌ的とするモノクローナル抗体はこのようなりＩＪ−
ノを培養した培養上清から塩析、イオン交換クロマトグ
ラフィー等の精製操作により回収できるが、必要に応じ
て全培養」−清を用いることもできる。また抗ヒトＩ　
Ｌ　２抗体産生ハイブリドーマを組織適合性動物、胸腺
欠損ヌードマウス等の腹腔内に移植し、増殖させ、該動
物の腹水中に産生されたモノクロ−ナル抗体を精製、回
収するとともできる。

Ｉ　Ｌ　２は、Ｔリンパ球が産生ずる可溶性免疫調節物
質であり、（ａ）機能的に分化成熟したキラーＴす７３
球あるいはヘルパーＴリンパ球をインビト１７で増殖さ
せる、（ｂ）未成熟な胸腺細胞の分裂を促進する、（Ｃ
）胸腺細胞あるいはヌードマウスの肺臓細胞から抗１巾
細胞存在下に細胞障害性Ｔ　ＩＪンバ球をＡｎ　；Ｑ−
Ｊる−（ｄ）”ｒ細胞の欠如したヌードマウスの１’ｌ
ｔ　ＩＮ、Ｗ細胞中に′ｒ細胞依存性抗原に対する抗体
産生細胞を誘導し、ヘルパー１機能を誘導している、等
の事実が知られ、種々のＴ細胞の活性化を通じて免疫応
答の調節物質として重要な位置を占めていることは公知
である。従って免疫不全症、自己免疫疾患、癌などの患
者の血中ＩＬ２濃度を泪す定することは、その患者の免
疫機能の異゛；へ′を知る」二での極めて有用な免疫／
（ラメータとなる。

しかして、本発明によりモノクローナルな抗ヒ）ＩＬ２
抗体か提供されたことにより従来微量にしか血中に存在
しないために困難とされてｌ、）たｆｆ１ｌ中Ｉ　Ｌ２
ｆｆｉの測定か可能となった。すなわち、＋ｆｎ中のＩ
ｌ２は抗ＩＬ２抗体を用いたラジ」−イムノアッセイあ
るいはエンザイムイムノア・ソセイにより容易に定量す
ることかできる。

また、本発明によって製造された抗ヒトＩＬ２モノクロ
ーナル抗体を担体樹脂などの適当な支Ｐｔ体に結合させ
親和クロマトグラフィーを１〒うことによって細胞また
は菌体を培養した培地中に含まれるＩｌ２を特異的に精
製して極めて純度の高０ヒ）Ｉｌ２を容易に得る道が開
けた。例えシス、抗ヒトＩ　Ｌ　２モノクローナル抗体
は、プロムシアンチ活性化したセファ０−ス（）１ルマ
シア社製）等の支１！を体に結合させることができるが
、とのモノク１ｊ−９゛ル抗体結合支持体でカラムを作
成し、アフィニティークロマトグラフィーを行うことに
より容易にＩ　Ｌ　２を精製することができる。すなわ
ち、ｐＩＩが中性イ］近の溶媒を用いてＩ　Ｌ　２を特
異的に抗体力ラノ・に吸着させた後、ラットを同一の溶
媒でよく洗浄し、ｆ＋Ｈを２．８　（＝１近に下げるあ
るいは１％Ｓ　Ｉ）　Ｓにて溶出すると結合してＩｌま
た１１．２が活性を失うことなく溶出してくる。

さらに本発明によって製造された抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２モ
ノクローナル抗体を用いてラジオイムノアッセイまたは
エンザイムイムノアツセイを行うことにＪ、り微量のＩ
　ｌ、　２を感度良く定量する方法力へ開けた。

本発明のハイプリドーマは、骨Ｍｎ１π細胞と抗体産生
細胞を融合させることによって製造される。

抗体産生細胞としては、Ｉｌ２で免疫されたマウス、ラ
ットなどの動物からの肺臓またはり／ｌ′？節細胞全細
胞るとよい。骨Ｎｕ細胞と抗体産生細胞の由来する動物
の種は、両細胞が融合可能な限りにおいて異なってもよ
いが、通常同一種の細胞を用いた方がよい結果が得られ
る。

本発明実施のための一つの好ましいハイブリドーマは、
ヒトＩＬ２で免疫したマウス７１１１１　ＭＭ細胞とマ
ウス骨髄細胞の間のハイプリトーマである。

例えば、予め水酸化アルミニウムと百日咳死菌をアジュ
バントとしてヒトＴす／ボーマ由来ＩＬ２で免疫したＢ
ＡＬＢ／Ｃマウスの抗体産生肺臓細胞とｎＡＬＢ／Ｃマ
ウスの骨髄腫細胞　Ｐ−３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ−１の間
のハイブリドーマで優れた結果か得られた。通常骨髄腫
細胞としては、Ｐ−３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ−１の他、Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−ＮＳ　Ｉ／１−Ａｇ４−１
、ＭＰＣｌ　１−４５．６．ＴＧ、１．７、ＳＰ２／Ｖ
−Ａｇ１４、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３　（以上、マ
ウス）、２１０、ＲＣＹ、Ａｇ１．２．３　（ラ　ッ　
ト　）　、　５ＫＯ−００７、ＧＨ１５００６ＴＧ−Ａ
１２　（以上、ヒト）等の８７ザグアニノ耐性の細胞株
が用いられる。また、抗体産生細胞は、例えば、次のよ
うにして得るとよい。まず、マウス、ラットなどの動物
をヒ）　Ｉ　Ｌ　２で免疫する。ここで用いるヒトＩ　
Ｌ　２は、゛ヒト扁桃腺リンパ球、ヒト末１１１　＋１
１１リンパ球、またはヒトＴす／ホー７などのヒトリッ
パ性１「ｌｉ　ｌｕ細胞または人工的に作られたハイブ
リドーマに由来するものが挙げられる。因みに、ヒ）Ｔ
リンホーマ出來Ｉ　Ｌ　２は、容品に大ｉ１１．に製造
てき、抗原として純度の高いものが使えるので、正常ヒ
トリンパ球由来１■７２にまさる。

次に、免疫した動物から肺臓細胞を調製する。その調製
方法は、この技術分野においてよく知られた方法である
が、例えば「免疫実験操作法」Ａ４４７頁（［１本免疫
学会編、昭和５０年）参照。

ハイブリドーマの作成とそれからの抗ヒトＩ　Ｌ２抗体
産生りＩＪ−ンの選択は、例えば、次のようにして行え
る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセンダイ
ウィルス（Ｔ−Ｉ　Ｖ　Ｊ　）を用いて抗体Ｐｒ′、生
細胞と骨Ｗ１腫細胞とを融合させる、生じたハイブリド
ーマはヒボキシザンチン、アミノブチリ／、チミジンを
含む培地中で生育する。融合しなかった抗体産生細胞と
骨髄腫細胞は、該培地中では共に死滅し、ハイブリドー
マだけが個々のクローンから増殖してくる。生育したハ
イブリドーマから抗体ＩＬ２抗体を産生ずるクローンが
選択される。

全てのハイブリドーマクローンが抗体を産生ずるわけで
はない。また、個々のクローンによって産生される抗体
は特異性が異なり、全てのクローンが抗ヒ）ＩＬ２抗体
を産生ずるのではない。従って、１１．２に対して特異
性を示す抗体を産生ずるり「１−ノを選択しなければな
らない。

抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２抗体産生クローンの選択は、例えば
、次のようにして行える。ギリス（Ｇｉｌｌｉｓ）等（
ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、）１２０巻　２０２７頁（１９７８））によれ
ば、細胞障害性Ｔリンパ球株（ＣＴ　Ｌ　Ｌ　’）はＩ
Ｌ２存在下に増殖し、ＣＴＬＬの細胞内へのトリチウム
で放射標識したチミジンの取り込みはＩＬ２の存在下Ｄ
ＮＡ合成の増大に伴って増大する。　ＣＴＬＬはヒトＩ
　Ｌ　２によっても増殖し、抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２抗体に
よりこの増殖作用は阻害されるので、ハイブリドーマの
培篠−に清をヒ）ＩＬ２と共存させＣＴ　ｌ、　Ｌの増
殖が阻害されるか否かを判定することにより抗ヒ）ＩＬ
２Ｌｆ体の存否を判定することができる。

抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２抗体がＩＬ２の活性部位に対し特異
的であれば、該抗体の添加によってＩＬ２の活性は阻害
され、また抗体の特異性がＩ　Ｌ　２の活性部位以外の
部位に対するものである場合は、抗体と共にブドウ球菌
（Ｓｔａ’ｐｈｙｌｏｃｏｃｃ、ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　
）によって抗１ｂｉ抗体複合物を沈降させ、ＩＬ２を培
地中から吸収消滅させることによりＩ　Ｌ　２活性は消
失り゛る。

ハイブリドーマはインビトロで長期連続継代培養するこ
とができ、フラスコ、シャーレ、ローラーボトル、スピ
ナーフラスコ、回転ジャー、夕／り培ｊ♀器等で培養で
きる。あるいは組織適合性動物または胸腺欠如ヌードマ
ウス中において生育することかできる。ハイブリドーマ
は培地あるいは動物の血清、または腹水からこの技術分
野において知られた方法によって回収できる。例えばプ
ロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナルφアカデミ−
・オブ・ザイエ／ス儂ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ。

△ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、）７５巻１５１０頁（
１９７８）参照。

以下に、ハイプリドーママの一つの細胞株を製造し抗ヒ
トＩＬ２モノクローナル抗体を製造するための一つの典
型的な例を挙げる。この例の方法は１３　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　Ｃマウスの肺臓細胞とＢＡＬＢ／Ｃ山来の骨髄由来
胞を融合することで示しているが、他の抗体産生細胞お
よび他の骨髄ｕ細胞を用いても行うことかできる。同様
にこの方法はヒトＴ細胞系白血病細胞Ｊ　１１１　（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ　８１２９　’）に由来するヒ）Ｌ２を免
疫に用いているが、他の細胞に由来するヒトＩＬ２もま
た使用できる。

（ａ）　抗体産生肺臓細胞の製造 ＢＡＬＢ／Ｃマウスを２，５“００ユニツトのＪ１１１
山来ヒトＩＬ’２で水酸化アルミニウム２１Ｉｇ、百日
咳死菌１０９個と共に腹腔内注射し免疫する。

１４日後、さらに５，０００ユニツトのＩｌ２を水酸化
アルミニウム４　ｍｇと共に５個所に分けて背中に筋肉
的注射し補助免疫する。さらに１４日後、５．０００ユ
ニツトのＩｌ２をアジュバントなしに腹腔内に注射し補
助免疫する。最終補助免疫から１４１１後、肺臓を摘出
し、細胞浮遊液をゲルハルト（Ｇｃｒｈａｒｄ）等（Ｅ
ｕｒ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．．５．　７２０（＋９７５
））の方法に従って調製し、５Ｘ１０？個の細胞を予め
６００レントゲンのＸ線を照射した＋３　Ａ　Ｌ　Ｉｌ
　／Ｃマウスに静脈内移入し、同時に１０，０００ユニ
ツトのＩ　Ｌ　２を２　ｍｇの水酸化アルミニウム、と
共に腹腔内津射し補助免疫する。３日後＃臓を摘出し、
細胞ｌ下遊液とし、融合のための抗体産生細胞とする。

（１））骨髄腫細胞の製造 ブＩＩＩシーディンゲス・オブＩザ・す“シａす°ル・
アカデミ−・オプ・サイエンス・ニー・ニス・エイ　（
ｒ’ｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ　、八ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ
、＾）　７Ｇ、　４０６＋（＋９７９＞に記載された如
きヒボキザ／チンホスボリボシルトランスフェラーゼが
欠損した１３　Ａ　Ｌ　Ｔ３　／　Ｃマウスの骨髄肝細
胞（Ｐ　３−ＸＧ３　Ａｇ８Ｕ　Ｉ）を培地、例えば、
１０％牛脂児血清（Ｐ　ＣＳ　）を含むＲＩ）　Ｍ　Ｉ
　−１０４０培地中に維持する。ｌ）−３−Ｘ（３３−
Ａｇ８Ｕ−１の生育はヒボキサンチン・アミツブラリ／
・ヂミジ／培地（ＩＩ　Ａ　Ｔ培地）により阻害される
。

＜ｃ＞　ハイプリドーマの製造 肺臓細胞および骨ａ腫細胞をコブロフスキー（Ｋｏｐｒ
ｏｗｓｋｉ）等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４゜２９８５　（１９７７）　）の
方法に従ってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１，０
００の存在下に融合させる。

融合処理の後、細胞をリトルフィールド（Ｌｉｔｔｌｅ
（ｉｅｌｄ）によりサイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）１
４５巻７０９頁（１９０４）に記載されているＨ　Ａ　
Ｔ培地中に懸濁し、そして組織培養プレートの個々のウ
ェルに接種する。この際栄養細胞として少量のＢ　Ａ　
Ｌ　１３　／Ｃマウスの胸腺細胞を共存させておくこと
が好ましい。

培養開始後１日、２日、３日、７日後に個々のつ。

ルのＨＡ　Ｔ培地を半量新たなＨＡ　Ｔと交換し、さら
に１４日、１５日、１６日後にヒボキサンチン・チミジ
ンのみを含む培地（Ｉ−Ｉ　Ｔ培地）に半量ずつ交換す
る。

（ｄ）　抗ヒトＩＬ２抗体産生ハイブリドーマの検定）
Ｉ　Ａ　Ｔ培地中に生育してきたハイブリドーマを通常
の培地、例えば、１０％ＦＣ８を含むＲＩ）　Ｍ　１．
１０４０倍地に移し、その培養上清を抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　
２抗体の検定標品としてそのまま用いる。ＣＴ　１．、
　Ｌを、例えば２％ＦＣＳを含むクリック培４１（Ｃｌ
ｉｃｋ培地）中に懸濁する。組織培養マイクロプレート
の個々のウェルにヒ）Ｉｌ２．検定標品、ｃＴＩＪＬ、
Ｃｌ　ｉｃｋ培ＪＪ３を加え満す。抗原抗体複合物を沈
Ｒさぜたい場合は培地の代わりにブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙ−１ｏｃｏｃｃｕｓ　２Ｌｕｒｅｕｓ）の死菌を培
地に加える。　２４時間培養した後、トリチウムで放射
標識されたデミジンを加え、さらに４時間培養してヒト
１１，２ににるＣ　Ｔ　１．１．のデミジン取り込みの
増大が抗ヒトＩ　Ｌ、　２抗体倹定標品によって阻害さ
れるが否かを細胞に取り込Ｊ：れた放射活性によって検
定する。

放ＩＪ・Ｉ活性の測定はこの技術分野においてよく知ら
れた方法によって容易に実施できる。

（０）　ハイプリドーマのクローニング選択（ｄ）の操
作で抗体活性の認められたハイブリトーマをこの技術分
野においてよく知られた限界希釈法によってさらにクロ
ーン化する。生育してきたりｌ」−ンの培養上清はさら
に（ｄ＞の方法にょって抗体活性を検定し、抗体活性の
強いクローンを選択する。

（ｆ）　選択クローンを用いて抗ヒトＩＬ２モノクロー
ナル抗体を製造するには次のようにする。すなわち、ク
ローンを適当な培地、例えば、１０％１？　ＣＳを含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞濃度がその」１限に達す
るまで培養する。培養後遠心操作により細胞を培養液か
ら除く。培養液中には抗体が含まれている。

（ｇ＞　培養」１清あるいは腹水からのモノクローナル
抗体の精製は、この技術分野においてよく知られた方法
を用いて容品に実施される。

（ｈ）ＩＬ２特異的アッセイ法 （ｇ）にて精製された抗体をマイクツブレートに固定化
させる。次いでＩ’Ｌ、２被検サンプルを添加後、ビオ
ヂノ化抗体を加えるとＩｔ２量に従って抗体が結合する
。これに、アビジン化酵素例えばアビジンアルカリ７オ
スフアターゼ（ＥＹ、Ｌａ、ｂｏｒａｔ。

−ｒｙ　Ｉｎｃ、Ｕ、Ｓ、八、）を反応させる、アビジ
ン−ビオチンの特異的結合により抗体に結合した酵素に
対する基質例えばｐ−ｎ１ｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅを発色さぜ吸光度゛から微Ｈ１のＩＬ２ｆ
ｆｉを測定するシステムを確立した。

以下の実施例は、本発明を例示するだめのものであって
、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１　（抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２抗体産生ハイブリトー
マの作成） ヒトＴ細胞系白血病細胞Ｊ−１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８
１２９）を：Ｉ／カリ゛バリンＡで刺激して得られた１
■、２２、５００単位を水産化アルミニウム２■、百日
咳死菌１〔］９個とノ（にＢ＾１．Ｉｔ　／　Ｃマウス
の腹腔内に注射し免疫した。　１４日後、　さらに５．
０　（１０単位のＩ　Ｌ　２を水酸化アルミニウム４　
ｗａｇと共に５箇所に分けて背中に筋肉的注射し補助免
疫した。さらに１４０後５．０　（１０７４１位のＩｔ
２をアジュバントを用いずに腹腔内に注射し補助免疫し
た。最終補助免疫から１４１１後肺臓細胞を摘出し、ダ
ルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて細胞を
浮遊化させ、５Ｘ１０？個の細胞を含む浮遊液１紅を予
め６００レントゲンのＸ線を照射したＢＡＬＢ／ｌ”マ
ウスに静脈内移入し、同時に１０．０００単位のＩｔ２
を２１１ｇの水酸化アルミニウムと共に腹腔内に注射し
補助免疫した。

３目移肺臓を摘出しり、ＭＥＭを用いて細胞浮遊液を調
製し、１０７個の肺臓細胞を含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ１０＋
０６を予めＤＭＥＭ１０ｍｌ！、中に浮遊させた２×１
０６個のＰ−３−Ｘ６’３−Ａｇ８Ｕ−１骨髄腫細胞と
混合した。混合物を８００ｇで５分間遠心し、上清を除
去した後、容器をよく振盪し、沈υした細胞をほぐした
。その後５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１
０００（和光純薬社製）を含むＤＭＥＭを２５０μｌ添
加しゆるやかに撹拌した。Ｉ）　Ｅ　Ｇ添加後１分おき
にＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　０　、５　ｌｆを添加していき総量
を２．２Ｅｌｌｆとする。　さらに１分後ＤＭＥＭ　１
０紅を加えた後５００ｇで５分間遠心し上１１を除去し
、１ｏｉｚの１０％牛脂児血１ｎを含むＲＰＭＩ−１６
４０培地に細胞を浮遊させ、組織培養プレート（コスタ
−社製９Ｇ穴）の各ウェルに２００μｔずつ接種し、３
７℃、５％ＣＯ２下で培養した。１日、２日、３日、７
日後に培地の半１ｊ’Ｌ’（１００ＩＩ　ｔ　）を１１
　Ａ　Ｔ培地（１０％牛脂児血清、４Ｘ１０−’Ｍアミ
ノプテリン、１６×１０−５Ｍチミジン、ｌＸｌ０−’
Ｍヒボキづノヂンを添加したＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ−１８４０
培地）色交換し、さらに培養を続けた。培養の１１．１
３．１／１日目に培地の半量（１００ｕ　Ｉ！　）　ヲ
Ｉ−Ｉ　Ｔ　培ｆｉｌ！　（１０％牛脂児血１ｙｔ１ｓ
、　ｅｘｌｏ−５Ｍチミシ７、ｌＸｌ０−’ｒｖｌヒボ
キザンヂンを添加したＲＩ’ＭＩ−１６４０培ＪＩＩＪ
　）に交換した。

融合操作開始から１６日後、１４個のつ。ルがらハイブ
リドーマのコロニーが出現した。このハイブリドーマを
１ｏ％ＦＣ３を含むＲＩ）　Ｍ　Ｉ　−１１ｉ　４０培
地中で培養し、その培養上清の抗Ｉ　Ｌ　２活性を次の
ようにして測定した。

培養−に清を被検液とし、被検液５０μ℃と２５Ｕ／ｍ
ｌノＪ　１１１山来Ｌ−トＩＬ２を５０　ｕ　ｌ、さら
に：　４　Ｘ　１０３個のｃＴＬＩ７を総量２００μ６
となるようにクリック／’ＲＰ　Ｍ　Ｉ培地中に混合し
、組織培養プレート（コスタ−社製９６穴）の各つゴル
に接種し、２４時間培養し、最後の４時間を各ウェル０
．５μＣｉのトリチウム化チミジン（ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社製ＮＥ’Ｔ−０２７Ｘ）でラベ
ルし、マイクロプレート用ｌ″−−ベスターで細胞をグ
ラスフィルター上に７１−ベストしＩ　Ｌ　２　＆こよ
るＣ　Ｔ　Ｌ　Ｌの増殖かハイブリドーマ培養上清によ
り抑えられるか否かを検討した。

表１に示ずように、トリチウム化チミジン（３Ｈ−Ｔｄ
Ｒ）の取込み量より、Ｉ−１−３と命名したハイブリト
ーマがＣＴ　Ｌ　Ｌの増殖を抑制したことかわかる。

表　１ 細　菌　株　３ｌ−ｒ−ＴｄＲ取込み ＲＩ’Ｍ１　１０４（＋培１１　（ブリ／り）２．６１
’　３　ＸＧ３　Ａｇ８Ｕ　１　（対照）３．２ハイブ
リドーマ　ｌｌ−１１，８ １１−２１，０ １１−３０，９２ １１−４３，０ １１−５２，８ ｎｌｌ−６３，３ ノ／ｌｌ−７２，２ ／ｌ　１１−８　２．７０ １１−０　２．９０ １１１０　３．３０ ＩＩ　ｌｌ−１１２，４２ １／　＋１１２　３．１８ ／／　１１−１３　３．１ 実施例２　（抗ヒ）ＩＬ２抗体産生細胞株のクローニン
グ） ハイブリドーマＨ−３細胞株を、１０％ＦＣ３をａむＲ
Ｉ）ＭＩ−１６４０培地中に：１ｍ／ｍ１Ｄａ度で浮遊
させ、各ウェル２００μｉとなるように組織培養プレー
ト（コスタ−社製９６穴）に接種し限界希釈法によるク
ローン化を行った。１４日目移８０個のウェルから４８
個のハイブリドーマクローンか出現した。

各クローンの培養」−清の抗ＩＬ２活性を実施例１にな
らって１１１１１定した結果が表２である。いくつかの
クローンか抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２活性を示したが、Ｈ−３
−１２か特に強い抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２活性を示した。

表　２ り　ロ　−　ン　３　ｌｌ−ＴｄＲ取込み１２１”Ｍｌ
　１０４０培地（ブランク）１１−３　１．０４ １１−３−　１　１．、　３ １１−３−１０　０．　９４ ＋１−３−１２　０．　４ １１−３−１８　１　、／１ １１−Ｊ−２（１０，９ １１−３−２５２，２ １１−３−２７２，７ １１３３２１，０ １１−３−３８０、９ １１−３−４００，８ ＋１−３−４１　１　、３ １１−３−４５　１．　１ １１−３−４７　２．　２ 実施例３　（抗ヒ）　Ｉ　Ｌ　２抗体の産生）ハイブリ
ドーマＴ−１−３−１２クローンの培養」二１ｉｌｔを
ジ・エンザイムセンター製ブドウ球菌菌体イグゾルブ（
Ｉｇｓｏｒｂ）と共に３７°Ｃで３０分間インキュベー
トし、ＩｇＧ婆吸酸吸収後、３．０００　ｇ１０分間遠
心し、上清の抗ヒ）ＩＬ２活性を実施例１と同様の方法
で測定した。

表３に示したように、イグゾルブでＩｇＧを吸収した上
清には抗ヒ）　Ｔ　Ｌ　２活性が消失しており、Ｈ−３
−１２クローンは抗ヒトＩ　Ｌ　２　＋ｇＧ抗体を産生
じていたことがわかる。

表　３ ザ　／　プ　ル　３ｌ−Ｉ−ＴｄＲ取込み（ＸＩＯ’　
ｃｐｍ） Ｒ１）Ｍｌ−１，（３４０培地（ブラック）１．８Ｈ−
３−１２０，３ ）−１−３−１２（イグゾルブ処理）１．６実施例４　
（抗ヒ）ＩＬ２１ｇＧ抗体の分離精製）１１−３−：　
１２クローンの培養」１清を３５％飽和の硫酸アンモニ
ウムで塩析し、生じた沈汚を最少量の５０　ｍ　Ｍ　）
リス−塩酸緩衝液に溶解した後、予め同様の緩衝液で平
衡化したＤＥＡＩε−セル１Ｊ−ス（ファルマシア社製
）でイオン交換クロマトグラフィーを行い、非吸着画分
に溶出されるＬｇＧ画分の抗ヒトＩ　Ｌ　２活性を実施
例１と同様の方法でｆｌｌり定した。

表４はその結果であるが、このようにして抗ヒトＩＬ２
１ｇＧ抗体を分離精製するととかてきる。

表　４ ザ　ン　プ　ル　３ｌ−１−ＴｃｌＲ取込み（Ｘ１０’
ｃｐｍ）　。

■ぐＩ’Ｍ１　１（ｉ４０培地（ブランク　１．９２Ｊ
ｉ３−１２　０．２Ｅ３ 実施例ｊ　（ＩＬ２の特異的分離精製）実施例４で分離
精製した抗ヒ）ＩＬ２１ｇＧ抗体をブロムシアンで活性
化したセファロース（ファルマシア社製）に結合させ、
抗ヒ）ＩＬ２１ｇＧ結合セファローズゲルを作成した。

このゲルで作成したカラムにヒトＴ細胞系白血病細胞Ｊ
−’１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８１２！：ｌ）をＣｏｎ　
Ａで刺激した培養」１清を通過させ、上清中に含まれる
ＩＬ２を抗Ｉ　Ｌ　２−ＩｇＧ結合セファ０−スに結合
させた。

充分量のリンｒＩｉ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７，２）で
カラムを洗浄後、０．１．Ｍグリンノー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ２，８）でＩＬ２を溶出した。溶出液を０．９％のＮ
ａＣｉを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に透
析後、ＣＴ　Ｌ　Ｌ細胞のＤＮＡ合成でＩＬ２活性を検
定した。あるいはリン酸緩衝液でカラム洗浄後、１％Ｓ
ＤＳ　（７９°Ｃ）でＩＬ２を溶出、溶出液を０°Ｃ水
中で急冷しＳＤＳを除き、同様にＣＴＬ、Ｌ細胞てＩＬ
２活性を検定した。

表５に示すように、ＩＬ２は抗Ｉ　Ｌ’２−１ｇＧセフ
ァロースに親和性を示し結合する両分に回収されたこと
かわかる。

表　５ ・リー　ン　ブ　ル　３Ｈ−ＴｄＲ取込み（Ｘ　１０’
　ｃ　ｐｍ） Ｒ１）ＭＩ−１（３４０培地　０．２２Ｊｌｌｌ−１ｔ
、２　、　］、、８ ＩｇＧ七８ｔ【Ｊ−ス未吸着画分　０．３実施例６　（
抗ヒ）ＩＬ２＋ｇＭ抗体産生ハイブリドーマの作成） 実施例１と同様の方法にて抗ＩＬ２抗体産生ハイブリト
ーマの作成を行った。得られたハイブリ１’−マの＝１
０ニーの培養」１清の抗Ｉ　Ｌ　２活性を実施例１と同
様の方法にて検定した。

その結果、表６に示したようにＡｌ０と命名したハイブ
リトーマに抗ＩＬ２活性が認められた。

表　６ 細　胞　株　３１１−ＴｄＲ取込み ＲＰＭｉ１６４０培地　１，４ Ｐ−３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ−１，２，３ハイブリドーマ
　Ａ２Ｂ　１．５ ＡＥ３０　、　２．０ ）ｌ　Ａ８４　１．．８ ／／　Ａｌ３５　１．５ １／　Ａ６（３１，８ ／／　Ａ２Ｂ　１．８ Ａ７０　０．５ ＪＩ　Ａｌ１　２．０ ））　Ａｌ２　１．０ １１　Ａｌ７　１．７ １１　Ａｌ８　１．７ Ｎ　Ａｇ０　．１．８ ／／　Ａｇ２　１．７ 次にＡｌ（）の培養上清にヤギのマウスＩｇＭに対する
ＩｇＧ抗体（カペル拳ラボラトリーズ社製）を加え３７
℃、１時間インキュベートした後、イグゾルノを加えさ
らに３７°Ｃ１３０分間インキュベ−１した。遠心操作
によりイグゾルブを沈設させた上清の抗Ｉ　Ｌ　２活性
を実施例１と同様の方法にて倹ン釘した。

その結果１表７に示したように、Ａ”７０ハイブリドマ
の抗Ｉ　Ｌ　２活性は、ＩｇＭ吸収操作により消失する
。従ってＡｌ０の産生ずる抗１■、２抗体は、ＩｇＭで
あることがわかった。

表　７ Ａｌ０培養」−清処理　３１１−ＴｄＲ取込み（Ｘ１０
４／紅） 無　処　理　０．フ イグゾルブで吸収　０．５ 抗１イ１抗体とイグゾルブで吸収　１．８実施例７　（
抗ＩＬ２抗体産生ハイプリドーマのマウス腹腔内移植） ハイプリドーマＩ−１３を１３ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔
内に５Ｘ　１０６個、ｏ、５ｍｚの生理食塩水に懸濁し
移植した。１０日後、マウスの腹部が肥大したことを確
めた後、注射器で増殖した細胞を回収した。遠心操作に
より腹水から細胞を除き実施例１と同様の方法で抗ＩＬ
２活性の検定を行った。

表８かその結果であるが、Ｉ４３から腹水中に抗Ｉ　Ｌ
　２抗体か産生されていることがわかる。

表　８ ザ　ン　プ　ル　３Ｈ−ＴｄＲ取込み （ＸＩＯ’　ｃｐｍ） Ｐ　−３Ｘ（ｉ３−八ｇ８Ｕ−１移植マウスの腹水　２
．８１−１３移植マウスの腹水　０・２ 実施例８　（ｌＬ２の特異検出定量法）実施例４′で精
製した抗ヒ）ｒＬ２＋ｇＧ抗体をＰ　Ｂ　Ｓ　（Ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ　［ｌｕ［ｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）にて
１００μｇ／ｕとし、９６穴マイクロプレー　１・に各
４０μ℃宛滴ド、１時間室温に静置し固定化させた。

０．５％牛脂児血清アルブミンを加えたＩ’　Ｂ　Ｓ（
ＲＩ　Ａ　−ｂｕｒｔｅｒ）で３回洗浄後、ヒトＩＬ２
を添加（２０Ｉｔ　Ｉ！　／　ｗｅｌｌ）　Ｌ、１時間
室温静置した。

同様にＲＩ　Ａ　−ｂｕ、［ｅｒにて３回洗浄後、精製
ビオチン化抗Ｉ　Ｌ　２　＋ｇＧ抗体（３０１１６／ｗ
ｅｌｌ）を１時間室温で反応させ、同様に洗浄後アビジ
ン化酵素（５０μｆ／ｗｅｌｌ）を添加し、未結合部分
を洗浄除去した後、基質とし。てＰニトロ７オスフエイ
ト（２μｇ／ｍ６，１５０μｆ／ｗｅｌｌ）を添加発色
させた。発色が認められたところで３　Ｍ　Ｎａ０ｌｌ
（１２５ＩＩ　ｆ／ｗｅｌｌ）にて反応を停止させ、分
光光度１！１にて４０５　ｎｍにおける吸光度（００４
０５）を測定した。

その結果を表９に示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）　抗ヒトイ／クーロイキン２モノクローリ・ル抗
   体。
2. （２）　ヒトインターロイキ／２で免疫した動物の抗体
   産生細胞と骨髄腫細胞との間にハイブリドーマを形成さ
   せ、該ハイブリドーマをクローン化して抗ヒトインター
   ｌコイキン２抗 ーンを選択し、このようにして選択されたクローンを使
   用して抗ヒトインターロイキン２モノクローナル抗体を
   製造することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方
   法。
3. （３）　該クローンを組織筒金性動物または胸腺欠損ヌ
   ードマウスの腹腔内に移植し、増殖させ、該動物腹水中
   に抗ヒトインターロイキン２モノクローナル抗体を産生
   せしめ、必要に応じてこれを分離＄＋１１製する特許請
   求の範囲第２項の方法。
4. （４）　抗ヒトインターロイキン２モノクロ−リール抗
   体を結合させた担体樹脂を用いてアフィニディークト１
   マドグラフィーを行い、細胞あるいは菌体を培養した培
   地中に含まれるヒトインターロイ４−７２を特異的に精
   製する方法。
5. （５）　４Ｘヒトインターロイキン２モノクｒＪ−−）
   ル抗体を用いてラジオイムノアッセイ、またはエンザイ
   ムノアノセイを行いインター１ｊイキ／２を〉ｒ量する
   インター＋１イキ／２の微量定量法。