JPH034781A - 肝炎ウイルス抗体を産生する細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、肝炎ウィルスの抗体を連続産生ずることので
きる細胞系にかかわる。

肝炎ウィルス（Ａ型、Ｂ型および非Ａ型非Ｂ型剤）はヒ
トに有意な罹病率ないし死亡率をもたらす。かかるウィ
ルス剤は、臨床上の苛酷性において変異する急性感染を
生ずるのみならず、肝硬変、実質性肝機能不全および死
に通ずる慢性的な肝臓病の原因となり或はそれに与かる
。この急性ないし慢性的な肝炎感染はアメリカ国内でま
た世界的に医療上大きな問題となっている。更に注目す
べきは、慢性的肝炎感染が世界各地での一次肝細胞癌と
関連してきたということである。而して、改善された血
清学法による初期診断を含む上記ウィルスの生物学を理
解する努力と慢延を防ぐ予防手段の発達に医療上の重要
な意味がある。

肝炎ウィルス以外のウィルスすなわちインフルエンザウ
ィルスおよび狂犬病ウィルス、主な組織適合性抗原、赤
血球、ハプテン、蛋白質、酵素および細胞関連抗原に対
してもギノクローン抗体が製造されているが、ヒトの肝
炎ウィルス又はウィルス性抗原に対するモノクローン抗
体の体細胞ヒブリドによる製造は考慮されていない。Ｂ
　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ脾細胞とＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ骨髄
腫細胞との融合した細胞ヒブリドを用いて抗体を形成す
ることが提案されている。例えば、ケーラー等、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・イミューノロジー、第６巻、第５
１１〜５１９頁（１９７６）およびネイチャー第２６５
巻、第４９５〜４９７頁（１９７５）。

また、ＭＯＰ　Ｃ／２１系から誘導されたＢＡＬＢ／ｃ
　（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ　　８）骨髄腫細胞の形成が従来法
に開示されている。ケーラー等、ネイチャ、第２５６巻
、第４９５〜４９７頁（１９７５）。

肝炎ウィルスに対する抗体又は活性誘導体を産生ずる手
段を提供することが非常に望ましい。かかる抗体は、そ
れがヒトの肝炎ウィルス感染を診断するのに利用できる
ことで重要である。しかも、それは、ヒトの肝炎を治療
する際非常に特異な免疫予防試薬として有用である。

厩肥するに、本発明に従えば、肝炎ウィルス抗原に対し
非常に特異なモノクローン抗体を合成し分泌するヒブリ
ドーマ細胞系が確立される。第一工程として、動物のリ
ンパ細胞を特定の免疫経路ないしスケジュールに従い免
疫化して、肝炎抗原に対するモノクローン抗体を産生ず
るリンパ細胞を生ぜしめる。得られたリンパ細胞を回収
し、これを同じ動物種から得られた骨髄腫細胞と融合さ
せて体細胞ヒブリドを形成する。次いで、免疫性肝炎抗
原に対する抗体を連続的に産生ずるために、形成した細
胞ヒブリドを組織培養で或は、免疫緩和せる又は有性生
殖の動物体内で無期限に増殖させる。

以下、本発明の実施態様に関し説示するに、本発明の方
法では、ウィルス抗原例えばＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ
Ａｇ）　、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢ　ｅ　Ａ　ｇ）又は、
Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡ　Ｖ）若しくは非Ａ型非Ｂ型肝
炎ウィルスの抗原を調製することによって、動物の肝細
胞をインビトロ又はインビボで刺激（免疫化）する。而
して、抗原を投与する経路およびスケジュールは本発明
に臨界的とわかった。先ず抗原を腹腔内経路で投与し次
いで静脈経路で抗原を投与することが必要とわかった。

もし、初回および二回目の抗原投与を腹腔内経路か静脈
経路のいずれかで行ない或は初回の投与を静脈経路でま
た二回目の投与を腹腔内経路で行なうなら、引続く工程
でヒブリド細胞を形成することがうまくはいかず、また
ヒブリド化が遂行されたとしても、生成せるヒブリドは
抗体を連続的に産生じない。その上、上記２工程の各々
で投与される抗原の量を成る臨界的な範囲すなわち、約
１〜２０μｇ／動物好ましくは５〜１０μｇ／動物の範
囲内に保たねばならないとわかった。もし、抗原の用量
が低すぎるなら、免疫法応答が動物の体内でほとんど又
は全く誘発されない。

また、もし用量が高すぎるなら、動物は抗原に耐性を示
さなくなり、抗体を産生じない。更に、二回目の抗原投
与を行なうためには、初回の抗原投与後生くとも３週間
好ましくは５週間ないしそれ以上待つことが必要とわか
った。もし、二回目の抗原投与を約３週間より早く行な
うなら、動物の体内における免疫法応答は低下する。抗
体産生性細胞を融合に先立って分離することが望ましい
が、しかしそれは必要でない。なぜなら、骨髄腫細胞と
の融合後に抗体産生性細胞を非抗体産生性細胞から分離
することができるからである。

骨髄腫細胞との融合は、ヒポキサチン−アミノプテリン
−チミジン（ＨＡ　Ｔ）培養基に対して敏感な骨髄腫細
胞を用い、該成分の欠けている酵素例えばチミジンキナ
ーゼ（Ｔ　Ｋ）又はヒポキサチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）によって遂行さ
れる。これは、ＨＡＴ培地中での増殖によりヒブリドの
選択を達成させることができる。細胞融合に使用される
骨髄腫細胞系は、ケーラー等によりヨーロピアン・ジャ
ーナル・イミューノロジー、第６巻、第２９２〜２９５
頁（１９７６）に記載されているようなり　Ａ　Ｌ　Ｂ
　／　ｃマウスＭＯＰＣ２１骨髄腫から誘導されるもの
である。骨髄腫細胞系はＰ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１
と同定されている。この種の細胞は２０μｇ　／　ｍｌ
の８−アザグアニンに対し耐性であって、ヒボキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）を含有する培
地において死滅する。骨髄腫細胞は、グルコース、グル
タミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びウシ胎児
血清を補充しうる適当な細胞増殖培地において増殖され
る。他の三種のマウス系統、すなわち４５．６Ｔ６１．
７．５ｐ２１０及び６１５１３をもこれら融合のために
使用されている。融合は、増殖培地中の骨髄腫細胞に対
しリンパ細胞の懸濁物を加え、遠心分離してペレットを
生成させることにより行なわれる。次いで、細胞は、融
合剤を含有する増殖培地中にて培養される。融合を行な
うための適する技術は、たとえばケーラー等、ヨーロピ
アン・ジャーナル・イミューノロジー、第６巻、第５１
１〜５１９頁（１９７６）又はケフター等、ツマチック
・セル・ジエネチックス、第３巻、第２３１〜２３６頁
（１９７７）に記載されている。

ウィルス抗原に向けられる抗体を合成かつ分泌するヒブ
リドーマ（ｈｙｂ＋１ｄｏｎ＋ａｓ）を次いで培養して
、比較的安定な遺伝構成を有する細胞系の連続的増殖を
確立させる。細胞系をクローン化して、各県から個々の
細胞の子孫を生成させる。細胞系又はクローンを組織培
養で或いは先天性若しくは免疫緩和した宿主において生
体内で無限に繁殖させ、ウィルス性肝炎抗原に対する抗
体を合成かつ分泌させ続ける。次いで、抗体は、通常の
沈殿、イオン交換又は親和クロマトグラフィーなどによ
り、組織培養細胞から又は組織適合性宿主動物の腹水液
若しくは血清から回収される。

本発明により得られるヒブリドーマはＩｇＧ抗体又はＩ
ｇＭ抗体のいずれかを産生ずることができ、そして後者
は多価である。Ｈ２５Ｂ１０として同定された細胞系培
養物の寄託は、アメリカン会タイプ・カルチャー・コレ
クションに行なわれ、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８０１７が
付与された。

この細胞系はＩｇＧ抗体を産生ずることができる。

Ｈ２１Ｆ８−１として同定された細胞系培養物の寄託は
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに行
なわれ、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８０１８が付与された。

この後者の細胞系は、ウィルス性肝炎に対するＩｇＭ抗
体を産生ずることができる。

以下の例により本発明を説明するが、本発明はこれにの
み限定されるものでない。下記例で用いるマウス脾細胞
は、従来文献、例えば、前出ヨーロピアン・ジャーナル
・イミューノロジー、第６巻の第２９２〜２９５頁（１
９７６）に記されたものである。

例１− この例は、本発明の方法を使用してＨＢｓＡｇに対する
モノクローン抗体を作りうるという事実を示している。

免疫用抗原の調製　肝炎８表面抗原を密度勾配沈降法に
より数単位のヒト血漿から単離したが、これはボンド等
による方法（ジャーナル・インフエクショナル・デイシ
ーズ、第１２５巻、第２６３〜２６８頁（１９７２））
及びドリースマン等による方法（ジャーナル・ヴアイロ
ロジー、第１０巻、第４６９〜４７６頁（１９７２））
を用いる放射線免疫分析により高滴定値のＨＢｓＡｇを
含有することが知られている。最高量のＨＢｓＡｇ活性
を有する部分を集め、燐酸緩衝塩液に対して透析しそし
て蛋白含量をローリ−等による技術（ジャーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー、第１９３巻、第２６５〜２
７５頁（１９５１））によって測定した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの免疫化　抗−ＨＢｓＢ
ｓ分泌性ヒドリドーマ生させる最適な免疫方法に関し、
幾つかの問題が探求され、たとえば次のものが包含され
る：１）−次及び二次免疫の経路、２）免疫抗原濃度の
重要性、及び３）−次免疫と二次免疫との間の時間間隔
を増加させる役割。これらの研究において、抗原投与に
関し腹腔内経路と静脈経路との比較も行なった。最適抗
原濃度（０，１，１，１０及び１００μｇウィルス蛋白
）は第ニブ−スト（ｂｏｏｓｔ）の時期に評価した。最
後に、細胞融合は最終ブースト後７２時間に設定したが
、−次免疫と二次免疫との間の間隔は２．３．５及び１
０週間スケジュールで変化させた。

脾細胞の調製　牌臓を最終の抗原ブースト後７２時間で
免疫化動物から取り出し、４．５ｇ／Ａ’のグルコース
と１０００　Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ　／　
ｍｌのストレプトマイシンとが補充されたドウルベツコ
の最少必須培地（ＤＭＥＭ）中に入れた。この肺臓を２
５番手針により徹底的に切開した。細胞をＤＭＥＭで３
回洗浄し、同じ培地中に一定濃度で際懸濁させた。大凡
約１億個の細胞が各肺臓から得られた。

骨髄腫細胞の調製　細胞融合用に使用した骨髄腫細胞系
Ｐ３−ＮＳ　１／１−Ａｇ４−１は、たとえばケーラー
等によりヨーロピアン・ジャーナル・イミューノロジー
、第６巻、第２９２〜２９５頁（１，９７６）に記載さ
れているように、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウスＭＯＰ
Ｃ２１から誘導した。

この種の細胞は２０μｇ　／　［［１１の８−アザグア
ニンに対し耐性であり、ヒポキサンチン−アミノプテリ
ン−チミジン（ＨＡ　Ｔ）を含有する培地中で死滅する
。４．５ｇ／ｌのグルコースと２０ｍｇ／Ａ！のグルタ
ミンと１０００　Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ　
／　ｍｌのストレプトマイシンと２０％のウシ胎児血清
とを補充したＤＭＥＭ　（完全培地）において細胞を増
殖させた。骨髄腫細胞は、細胞融合の時期において増殖
の対数期であった。

細胞融合技術　肺細胞懸濁物を、血清を含まないＤＭＥ
Ｍ中の骨髄腫細胞に対し１−０・１の比で加え、２００
Ｘｇで１０分間遠心分離して、丸底試験管中にペレット
を生成させた。培地を細胞混合物から静かにデカントし
た。予め調製したポリエチレングリコール１０００　（
ＤＭＥＭで３０ｖ／ｗ％に希釈したもの、ｐＨ７、６）
の容量２ｍｌを３７℃にて６分間かけて加えた。この培
養の後、２０ｍ１のＤＭＥＭを数分間かけて加え、細胞
を静かに再懸濁させた。次いで、細胞を２００Ｘｇにて
５分間遠心分離し、完全培地中に再懸濁させて２００〜
３００，０００個／２００μＩの細胞濃度を得、そして
これを９６穴マイクロ滴定板中に１００μｍ部にて接種
した。２４時間後、５０μｌの培地を除去し、ヒボキサ
ンチン（１００μＭ）とチミジン（１６μＭ）とが補充
された新鮮な完全培地１５０μｌで置換した。３日目に
、培地５０％を、ＨＡＴ　（アミノプテリン濃度０．４
μＭ）含有の完全培地に変えた。次いで２週間にわたり
、１日おきにＨＡＴの５０％培地変化を行なった。

この期間の後、培地を毎日５０％変化させ、１〜２週間
にわたりＨＴ含有完全培地で置換させ、次いで最終的に
ヒブリドーマがクローン化に対し充分数まで増殖される
間、完全培地に変換した。

ヒブリドーマのクローン化　全てのマイクロ滴定器の穴
を最初に、融合後１０〜２０日間で増殖につきスクリー
ニングした。陽性の抗−ＨＢｓ分泌体が同定されたら、
細胞を順次により大型の皿ニ移し、クローン化のため幾
つかのヒブリドーマ細胞系を選択した。ヒブリドーマを
二重希釈クローン化技術にかけ、この場合１２０個のマ
イクロ滴定器穴に、３Ｔ３フイ一ダー層上の０．５細胞
／穴の計算希釈にて接種した。残余の陽性分泌体を生長
させ、凍結しそしてウシ胎児血清２５％とジメチルスル
ホキシド７．５％とを含有する完全培地中に液体窒素の
下で貯蔵した。

クローンの染色体分析　染色体分析のため、脾細胞とＰ
３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１骨髄腫細胞とクローン性ヒ
ブリドーマとをコルヒチン（１０μｇ　、／　ｍｌ　）
に対し３７℃にて２時間さらし、低張（０，０７５Ｍ）
ＫＣＩ溶液で処理し、冷無水メタノールと氷酢酸との３
：１−混合物で固定し、数滴の細胞懸濁物をスライドガ
ラス上に載置し、風乾しそしてクエン酸−燐酸緩衝液に
てｐＨ６、８に緩衝されたギエムサ（Ｇｉｅｍｓａ’　
ｓ　）　１　：　５０で染色した。

抗−ＨＢｓ活性の分析　抗−ＨＢ　ｓ活性を分析する際
、三種の別々の分析を行なった。１２０μｌの培養上澄
液をマイクロ滴定板から取り出し、完全培地で２００μ
ｌまで希釈した。抗−ＨＢｓ結合を最適化するため、一
連の予備実験から最良の培養条件を決定した。肝炎８表
面抗原で被覆したビーズを室温にて２４時間培養した後
、蒸留水で充分に洗浄した。（１１２５）　−ＨＢｓＡ
ｇ　（１００〜１５０．ＯＯＯｃｐｍ）を加え、試験板
を室温にてさらに３６時間培養した。ビーズを再び蒸留
水で充分に洗浄し、パラカード・ガンマ−・カウンター
によって計数した。

使用１７た第二の固相放射線免疫分析法においてはヤギ
の抗−マウスＦ　（ａ　ｂ’　）　２を調製し、これを
ウィリアム等によりセル、第１２巻、第６６３〜６７３
頁（１９７７）に記載されたように親和カラム法により
精製した。この抗体を、マルチャロニスによりバイオケ
ミストリー・ジャーナル、第１１３巻、第２９９〜３１
４頁（１９６９）に記載されたラクトペルオキシダーゼ
法を用いて、〔１１２５〕により沃素化した。この固相
放射線免疫分析法の手順は、〔■１２５〕−抗−マウス
Ｆ　（ａｂ’　）２　　（１００，０００ｃｐｍ）を第
二のプローブとして加えた以外は、上記のものと同一で
あった。

最後に、ヒブリドーマにより産生された抗−ＨＢｓがＨ
ＢｓＡｇ被覆された（ａｙｗ及びａｄｗ亜型）ヒト〇−
陰性赤血球を微血球凝集反応にて凝集させる能力を、バ
ンズ等によりガストロエンテロロジー、第６８巻、第１
０５〜１１２頁（１９７５）に記載されたように測定し
た。略記すれば、培養上澄液２５μｌをトリス緩衝液、
ｐｌ（’７．　４の２５μｌで希釈し、一連の２倍希釈
を９６穴の■底マイクロ滴定板にて行なった。

ＨＢｓＡｇ結合した指示赤血球の０．　５％溶液２５μ
ｌを加え、揺動台（６サイクル／分）上にて３７℃で４
５分間培養した。細胞を２００％ｇにて１０分間沈降さ
せ、４５°の角度で１５分間静置した。陽性凝集反応を
示した最終希釈物として、抗−ＨＢｓの滴定値を測定し
た。

全ての分析に対する陽性比較は、肺臓副出時に得られた
種々の希釈におけるＨＢｓＡｇ免疫マウスからの血清を
包含した。さらに、極めて高い滴定値の抗−ＨＢｓを含
有する１５大の特性化された血友病血清をも使用した。

これらの血清は全て、ウーチタ口二一（Ｏｕｃｈｆｅ＋
１ｏｎ７）ゲル拡散法におけるＨＢｓＡｇによる沈殿反
応と、標準放射線免疫分析法における高結合と、１：６
４，０００乃至ｉ：ｉ、２００，０００の範囲の受動血
球凝集測定値を示した。各分析において、血友病血清は
未希釈で加えた。陰性比較は、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ
４−１骨髄腫細胞系からの培地と、培養３日後における
免疫化脾細胞からの培地と、中毒性破傷風及び心臓ミオ
シン正常マウス及びヒト血清に対しモノクローン抗体を
分泌する他の二種のヒブリドーマ細胞系からの培地で構
成した。

免疫スケジュールの効果　下記第１表に示すように、抗
−ＨＢｓの血清滴定値、すなわち免疫病歴の反映、は−
次免疫から二次抗原ブーストに至る時間の函数として漸
増した。さらに重要なことに、二次抗原ブーストが２週
間及び３週間である際ヒブリドーマが産生されたが、こ
れらの細胞は低レベルの抗−ＨＢｓ活性しか示さなかっ
た。これらの低レベルの抗−ＨＢｓ活性は後に、ヒブリ
ドーマが順次に組織培養に移されるにつれて喪失した。

しかしながら、−次免疫と二次免疫との間により長い熟
成時間を置くと、陽性抗−ＨＢｓ分泌細胞系の比率が増
加するだけでなく、多数の安定かつ連続的に維持された
ヒブリドーマ細胞系を得ることができ、これらに極めて
高い抗−ＨＢｓ分泌活性を保有した。

第１表　抗−ＨＢ　ｓを分泌するヒブリドーマの産生に
関する免疫スケジュールの効果 ２週間　　　３週間　　　５週間　　１０週間１：１０
２ １：１０３ ２０ １＋１０’ ０．１９ ヒブリドーマ増殖に ついて陽性の穴　％ ６２％ 抗−ＨＢｓを分泌する ヒブリドーマ　％ ８．４３　　　　　＋０．７４　　　　４３．６１（１
４％）（１５％）（４０％） ０．４６ ０．１８ ８０％ １％ １．６１　　　　１２．９４ （１，１％）（１２％） ０．３３ ７３％ １６％ ０．７７ Ｆｏ、７１（イ） １００％ １００％ ＊　−次免疫〔完全フロイド補助液（ＣＦＡ）中１０μ
ｇＨＢｓＡｇ］の後、静脈内二次免疫（１０μｇＨＢｓ
Ａｇ）の時間。

＋　結合された（ｌＩ２５）−ＨＢｓＡｇＸｌＯ−３の
ｃｐｍｏ 括弧内の数値は、２００μ！中に加えられた（：Ｉ””
’　）−ＨＢｓＡｇの総カウント数から計算した、結合
カウント数の％を示す。

第１表における、「ヒブリドーマ増殖についての陽性の
穴％」及び「抗−ＨＢｓを分泌するヒブリドーマ％」と
して示した値は、いずれも、−次免疫として１０μｇＨ
ＢｓＡｇ／動物、二次免疫として１０μｇＨＢｓＡｇ／
動物の濃度で抗原を用いた場合の値を示す。

ヒブリドーマの分析　第１図は、最適免疫条件下におけ
るこのような一つの良好な融合の結果を示しており、４
７種の陽性細胞系における抗−ＨＢｓ活性の範囲を示し
ている。この図及び他の図において平行点線の間の領域
は、陰性比較の平均±ＳＥＭを示している。この実験に
おいて、［：Ｉ”’　）−ＨＢｓＡｇプローブを用いる
抗−ＨＢｓ結合の分析は、９６穴マイクロ滴定板におい
て増殖が観察された初期融合の１−０〜２０日後に行な
った。成る種のヒブリドーマから得られた細胞培養上澄
液（全用量２００μｌ／穴）の１２０μ！は、［ｌＩ２
５）　　ＨＢｓＡｇ結合活性につき異常に高い値を示し
たことを特記すべきである。

たとえば、細胞系２Ｅ４により産生された抗−ＨＢｓは
、放射線免疫分析に加えられた１、００．ＯＱＱｃｐｍ
のうち９５，０００ｃｐｍを結合した。

下記第２表は、三種の異なる分析法を使用して測定した
、抗−ＨＢｓを分泌するヒブリドーマの代表例であり、
各分析は抗−ＨＢｓ産生に対し確証的であった。幾つか
のヒブリドーマ培養物から得られた抗−ＨＢｓは著しく
良好な凝集性抗体であり、ＨＢｓＡｇ亜型の間の区別を
行なうことができた。たとえば、ＩＦ８及びそのクロー
ンＩＦ８−３８６は、亜型ａｄｗで被覆された赤血球の
みを凝集させ、ｄ決定子に対し又は亜型ａｄｗ上の特定
抗原になるべきものに対し何ら特異性を示さない。亜型
ａｙｗについては凝集を起こさなかった。他の細胞系、
すなわち２Ｇ２及び５Ｃ４は、両皿型に対する共通の決
定子、すなわちａ若しくはＷ上に存在する又は他の共通
の抗原上に存在する決定子、を識別する抗−ＨＢｓを産
生じたことを特記すべきである。さらに、１：２５６に
希釈した培養上澄液２５μｌはまだ陽性の凝集反応を示
し、ＨＢｓＡｇに対するヒブリドーマ抗−ＨＢ５の異常
に高い結合性を示唆した。さらにこの結論に対する裏付
けは、第２図に示されるような、抗−ＨＢｓ含有上澄液
の希釈曲線によって示される。なお、第１図及び第２図
中の記号ｒ２Ｅ４Ｊ、ｒ５Ｄ３Ｊ、ｒ５Ｃ４Ｊ、ｒ２０
２Ｊ等は、特定の親細胞系培地から得られた、上澄液中
に存在する抗体を示す。比較として、血友病血清（Ｈ３
）の希釈曲線を挙げるが、この場合の抗−ＨＢｓはウー
チタ口二一・ゲル拡散法により１：５０にて検出するこ
とができ、ａｄＷ及びａｙｗのいずれで被覆した赤血球
に対しても１：２．２Ｘ１０６の最終血球凝集値を示し
た。

第２表　三種の別々の分析法により測定したヒブリドー
マ上澄液からの抗−ＨＢｓ 活性の代表例 （ｃｐｍ） （ｃｐｍ） ａｄＷ Ｆ８ ２３、０６ ４．７６ ２５Ｇ Ｆ８− ３Ｉ３６↓ ２２．５１ ４．０３ １：１２８ Ｆ８− ３Ｃ２↓ ３．０５ ４．５４ ｅｇ Ｇ２ Ｄ２ Ｅ６ Ｇ８ Ｃ４ 培地口 ２６、９３ １１．５２ １．７１ ４．０１ ３４、３５ ０．１７ ｙｗ ＊　結合した［１１２５）−ＨＢＳＡｇ及び〔１１２５
〕−ヤギー抗−マウスＦ　（ａ　ｂ’　）　２×１０３
のｃｐｍ（材料及び方法参照）。初期試料容積は１２０
μｌとした。

＋ＨＢｓＡｇ被覆されたヒト−陰性赤血球（ＨＢｓＡｇ
亜型ａｄｗ及びａｙｗ）の血球凝集測定値。陽性の測定
値は１：２と考えられる。

初期試料容積は２５μ！であった。ｎｅｇ−血球凝集な
し。

↑　ＩＦ８のクローン。

９　培養培地（ＤＭＥＭ）からの平均ｃｐｍ０１１　　
中毒性破傷風に対しモノクローン抗体を産生ずるヒブリ
ドーマクローンであるクローン２８８Ｂ３を含有する培
地からの平均Ｃｐｍ０■　血友病の血清又はアボット標
準比較血清。

個々のクローンにより産生された抗−トＩＢｓは、第４
表及び第５表に示されるように、明らかに独特な重連路
サブクラスを示した。さらに検査した４種のクローンに
ついては、全て抗−ＨＢｓ活性を有するＩｇＭを産生じ
た。しかしながら、元の細胞系（第４表）はＩｇＧ、ア
イソタイプの抗−ＨＢｓを産生じ、系ＩＦ２はＩ　ｇ　
Ｇ　ｌ　とｔｇＧ。

の両者を、そして系２Ｃ４はＩ　ｇ　Ｇ　１とＩｇＡと
を産生じた。これらのデータは下記する電気泳動データ
と組合せて、細胞系のクローン特性の構成を示した。

第４表から判るように、Ｎα２１の５８１０細胞系はＨ
ＢｓＡｇに対するＩｇＧ抗体を産生ずる。

この細胞系から得られる細胞系８２５Ｂ１０はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、Ａ
ＴＣＣ番号ＣＲＬ−８０１７が付与されている。Ｎα２
２−２９の細胞系はいずれもＩＦ８（第２表、第３表参
照）から得られるものであり、いずれもＨＢＳＡｇに対
するＩｇＭ抗体を産生ずる。これら細胞系と同様にＩＦ
８から得られるヒブリドーマ８２１Ｆ８−１は寄託され
ておりＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８０１，８が付与されてい
る。

憂 ＋ ヰ ←　　■　　； クローン化ヒブリドーマにより産生された免疫上記した
ように、ヒブリドクローンにより分泌されたクラス及び
サブクラスの抗−ＨＢｓ活性を分析した。培養物におけ
る免疫化肺細胞のみが、放射線免疫分析法による抗−Ｈ
Ｂｓ活性をもたらさなかった。同様に、抗−ＨＢｓ活性
は、Ｐ３−ＮＳ　Ｌ／１−Ａｇ４−１親骨髄腫細胞系の
培養上澄液において検出されなかった（第６表）。〔こ
の細胞系に関しては、前出ヨーロピアン・ジャーナル・
イミューノロジー、第６巻の第２９２−２９５頁（１９
７６）を参照のこと。〕 ククローンダブリドーマ２Ｆ１１びＩＦ８を［：Ｃ”）
−リジンと共に培養し、抗−ＨＢｓ活性を有する免疫グ
ロブリンをさらにセファロース４Ｂカラムクロマトグラ
フイー及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る分析にかけた。第４図は、クローン化ヒブリドーマ２
Ｆ１１３Ｇ９１Ｇ８からの（Ｃ”］−リジン標識された
培養上澄液のセファロース４Ｂカラムクロマトグラフイ
ーの結果を示している。第４図に示されるように、抗−
ＨＢｓを有する２Ｆ１１により産生された免疫グロブリ
ンはＩｇＭと共に移動した。第５図は、抗−ＨＢｓ活性
を有するクローン２Ｆ１１３Ｇ９１．６８及びＩＦ８３
Ｂ７１Ｆ２からの（ＣＩ４）−リジン標識された上澄液
の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示してい
る。抗−ＨＢｓＩｇＭを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルにかけた場合、第５図に示されるようなＩｇＭ重連鎖
及び軽連鎖のみが検出され、他の免疫グロブリンアイソ
タイプは検出されなかった。これは、抗ＨＢｓ活性が独
特の免疫グロブリンアイソタイプに存在することができ
かつＰ３−ＮＳＩ／１．−Ａ、ｇ４−１親骨髄腫と免疫
化肺細胞との融合から生じることを示している。この細
胞系はＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８０１８と同定されている
。かくして上記した基準によるヒブリドーマのクローン
特性が確定され、かつクローン化細胞系の四種が全て三
種の結合分析法により測定して抗−ＨＢｓを産生ずると
いう事実が確定された。

幾つかのこの種の細胞系のクローン化に先立って追加実
験を行ない、第３表に示したように、これら細胞が実際
に極めて高い結合活性を有する抗−ＨＢｓを産生ずるこ
とを確認した。この研究において、マイクロ滴定器の穴
には１０４〜１０２細胞／穴１個の範囲の種々な濃度で
接種した。４日後、各式を抗−ＨＢｓ活性につき分析し
た。予想通り、全ての穴は陽性の増殖と上澄液における
極めて高い抗−ＨＢｓ活性の存在とを示した。かくして
、細胞系２Ｆ１１、ＩＦ８．５Ｄ３及び２Ｅ４が、前記
希釈技術を用いるジ（ないし重）クローン化のために選
択された。

ヒブリドーマのクローン化　第３図は、系５Ｄ３の希釈
クローン化の代表的な例である。０．５細胞／穴１個に
て接種した初期１２０個の穴のうち、５３個すなわち４
４％が陽性のヒブリドーマ細胞増殖を示したが、５３個
のうち２１個のみが１１０００ｃｐより大きい抗−ＨＢ
ｓ結合値を示しかつ陽性の抗−ＨＢｓ分泌体であると考
えられた。１２種のこのような細胞系から得られた培養
上澄液１−２０μｌは添加された〔１１２５〕−ＨＢｓ
Ａｇ　　１００，０００ｃｐｍのうち５０゜０００ｃｐ
ｍ以上を結合する抗−ＨＢｓを産生じ、これらの数値は
血友病血清により得られる数値より大であることを特記
すべきである。高抗−ＨＢｓ活性を有する二種のヒブリ
ドーマ（それぞれ１００．０００及び９６，０００ｃｐ
ｍの［１１２５）　　ＨＢｓＡｇ結合）を同じ技術によ
り再クローン化させ、全て９５〜９８％の結合値を示し
た（第４表）。

クローンの再分析　クローン化したヒブリドーマを染色
体分析にかけ、その結果を元の骨髄腫細胞系及び免疫化
脾細胞と比較した。Ｐ３−ＮＳＩ／　１−　Ａ　ｇ　４
−１骨髄腫細胞は平均数６３個の染色体を含有し、肺細
胞は平均数４０個を、そしてクローンヒブリドーマは８
０〜９７個を含有した（第５表）。これらの結果は、抗
−ＨＢｓを分泌する細胞が予想された個数の染色体を含
有しかつ実際にＮＳＩ細胞とＨＢｓＡｇ免疫化脾細胞と
の融合から生じたことを示唆している。

モノクローン抗ＨＢｓ抗体の性質　二重クローン化細胞
系より誘導した腹水液は、下記第７表にみる如く高いＨ
Ｂｓ結合活性を示した。アイソタイプ分析で、３種の細
胞系はＩｇＭクラスの抗ＨＢ　ｓを産生じ、他の２種は
ＩｇＧ、サブクラスのＩｇＧ抗ＨＢｓを産生したことが
わかった。ここで注目すべきは、５Ｄ３のＩｇＭ抗ＨＢ
ｓが１１２５−ＨＢｓＡｇに対して最も高い結合活性を
示したことである。３種のＩｇＭ抗体および２種のＩｇ
Ｇ抗ＨＢ　ｓ抗体の見掛は結合係数を求めた。

ＩｇＭの場合、抗原も抗体も潜在的に多価なので、表中
のにα値は、かかる抗原分子と抗体分子との結合アビデ
イティを表わす。抗ＨＢｓ１分子当り４Ｘ１０”ｊ’１
モルまでの値が観察された。

抗ＨＢｓの血球凝集測定値は著しく高い。事実、１　：
２．２Ｘ１０１２で希釈した細胞系５Ｄ３より誘導せる
腹水液２５μｌはまだ陽性の凝集反応を示した。これは
、指標細胞上に被覆されたＨＢｓＡｇに対するＩｇＭ抗
ＨＢｓの明らかに高いアビデイティを説明するものであ
る。加えて、５Ｄ３１ｇＭ抗ＨＢｓは、ａｄｗ及びａｙ
ｗＨＢｓＡｇの両皿型に対する共通の決定子を識別した
。これとは対照的に、細胞系ＩＦ８．２Ｆ１１、ｌｃ７
および４Ｅ８は、ａｙｗ　　ＨＢｓＡｇ被覆された細胞
よりもａｄｗ　　ＨＢｓＡｇ被覆された細胞に対して高
い特異性を示した。種々のモノクローン抗ＨＢｓによっ
て示される血球凝集測定値の変動性は、これら抗体がＨ
ＢｓＡｇ上の各種エピトープに指向しうろことを示唆し
た。

４、

【図面の簡単な説明】

第１図は最適免疫条件下における融合結果を示すグラフ
であり、第２図は抗−ＨＢｓ含有上澄液の希釈曲線を示
すグラフであり、第３図は細胞系５Ｄ３の希釈クローン
化の代表例を示すグラフであり、第４図はクローン化ヒ
ブリドーマ２Ｆ１１３Ｇ９１Ｇ８からの〔Ｃ１４〕−リ
ジン標識した培養上澄液に対するセファローズ４Ｂカラ
ムクロマトグラフイーの結果を示すグラフであり、第５
図はクローン２Ｆ１１３Ｇ９１Ｇ８及びＩＦ８３Ｂ７１
Ｆ２からの（Ｃ１４）−リジン標準した上澄液に対する
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す
グラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウスの骨髄腫に融合したウィルス性肝炎抗原で
   免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞の細胞ヒブリドよ
   りなる、ウィルス性肝炎抗原に対する抗体を産生するヒ
   ブリド連続細胞系。
2. （２）ヒブリドが、ヒポキサンチン−アミノプテリン−
   チミジンを含む培養基中に在る特許請求の範囲第１項記
   載の細胞系。
3. （３）抗体がＩｇＧフラクションである特許請求の範囲
   第１項又は２項記載の細胞系。
4. （４）抗体がＩｇＭフラクションである特許請求の範囲
   第１項又は２項記載の細胞系。
5. （５）抗体がＩｇＡフラクションである特許請求の範囲
   第１項又は２項記載の細胞系。