FR2509178A1 - Antigene tumoral associe au cancer primitif de foie et anticorps correspondants hbv-t ag et anti-hbv-t. applications a la production d'un antigene reactif et d'immunserums specifiques en vue du diagnostic precoce et de la mise au point d'une therapeutique du cancer primitif du foie - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE LA DETECTION ET LA CARACTERISATION D'UN ANTIGENE HEPATO-CELLULAIRE HBV-T AG ASSOCIE A LA TRANSFORMATION TUMORALE DES HEPATOCYTES PAR LE VIRUS DE L'HEPATITE B. ELLE CONCERNE EGALEMENT LA DETECTION DES ANTICORPS SPECIFIQUES DE CET ANTIGENE TUMORAL ANTI-HBV-T. LE DOMAINE D'APPLICATION DE L'INVENTION EST DEFINI PAR L'UTILISATION DE L'ANTIGENE HBV-T ET DES ANTICORPS CORRESPONDANTS POUR LA MISE AU POINT DE TECHNIQUES DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES DU CANCER PRIMITIF DU FOIE.

Description

L'invention concerne la détection et la caractérisation d'un antigène hépatocytaire associé a la transformation cellulaire induite par le virus de l'Hépatite B.

I1 concerne également l'utilisation de cet antigène et des anticorps correspondants pour la mise au point de méthodes diagnostiques et thérapeutiques du Cancer Primitif du Foie.

I1 existe a l'heure actuelle de nombreux arguments impliquant le virus de l'hépatite B (HBV ; Virus HB) dans la genèse du Cancer Primitif du Foie (CPF) ou carcinome hépatocellulaire'''4. Ces arguments sont d'ordre - 4idrniologique : Il existe une corrélation géographique parfaite entre les zones a forte prévalence de CPF et les zones où l'infection par le virus HB est endemique. De plus, chez les porteurs chroniques du virus de l'hépatite B (sujets porteurs chroniques de l'antigène d'enveloppe du virus HB = sujets HBs Ag positifs) le risque de développer un CPF est particulièrement élevé, notamment dans la populat male (risque relatif )10).

- actinique et anatomopathologique : I1 existe une séquence évolutive : portage chronique de l'antigène HBs - cirrhose post-hepatitique macronodulaire - CPF.

- virologique : Les marqueurs seriques de replication du virus HB (HBs et/ou anticorps diriges contre la capside virale, anticorps anti-HBc) sont présents chez plus de 70 % des sujets atteints de CPF, notamment chez les sujets jeunes. Chez les sujets ages, on retrouve le plus souvent le témoignagne d'une replication ancienne du virus HB (anticorps diriges contre l'enveloppeviraleanticorps anti-HBs).

Dans la cellule hépatique on peut mettre en évidence par différentes techniques les antigènes structuraux du virus de l'hépatite B (HBs Ag dans le cytoplasme : HBc dans le noyau et le cytoplasme). Le genome du virus de l'hépatite B est intégré dans le génome des cellules tumorales.

- de la pathoZogie comporte: : Des virus voisins du virus HB sur le plan structural et antigénique sont également associés à une séquence clinique et anatomo-pathologique hepatite - cirrhose - CPF1 7
Cet ensemble d'arguments fait du modèle "HBV-CPF" un des exemples les plus probants de cancerogenèse virale chez l'homme.

OBJET DE L'INVENTION
Dans les modèles actuellement connus de cancérogénèse virale, on détecte des antigènes viro-induits dont certains sont porteurs de l'activité transformante (protéine kinase, produit du gène transformant sarc du virus du sarcome de Rous) ou témoins de la transformation cellulaire (antigènes T associés à la transformation par différents Papovavirus).

Le principal objet de cette invention est l'identification, l'isolement et la caracterisation d'un ou plusieurs antigènes associés à la transformation cellulaire induite par le virus HB.

Un des buts de cette invention est d'utiliser ce ou ces antigènes et les anticorps correspondants à la mise au point de méthodes diagnostiques du CPF ou des stades de degenierescence cellulaire qui le précèdent.

Un autre but de l'invention est de préparer à partir du ou des antigènes isolés et purifiés des anticorps correspondants hautement spécifiques ou monoclonaux pour leur utilisation dans des tests de diagnostic du CPF.

Un autre but est l'utilisation de ces anticorps à des fins thérapeutiques.

Un autre but est de produire des antigènes ou des anticorps marqués par des enzymes, ou des radioisotopes, ou couplés à des particules inertes.

D'autres buts apparaftront au cours de la description qui suit.

RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont découvert une protéine antigénique presente dans les hépatocytes de sujets atteints de CPF et dans les cellules d'une lignée tumorale issue d'un CPF humain (liqnée dénommée PLC/PRF/5 t8 ). Cet antigène a été mis en évidence par immunofluorescence indirecte et technique immunoenzymatique indirecte en utilisant comme anticorps réactifs des sérums issus de malades atteints de CPF.

Les buts de cette invention sont en partie réalisés par
- l'isolement de cet antigène et sa caractérisation.

- la sélection de sérums contenant l'anticorps spécifique de cet antigène.

- la production de l'antigène a partir de cultures cellulaires d'hématome en lignée continue.

- la production d'anticorps monospécifiques chez diverses espèces animales.

- la préparation d'antigènes et d'anticorps couples a des particules inertes à fin d'utilisation comme reactifs dans des tests immunologiques.

De plus les buts poursuivis sont réalisés
- en mettant au point des techniques de détection de l'antigène présent dans les cellules et des anticorps correspondants présents dans les sérums des malades.

- en developpant des techniques de purification de l'antigène afin de l'utiliser comme immunogène pour produire des anticorps monospécifiques.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Dans la description ci-dessous le terme HBV-T désigne l'antigène caractérisé et isolé dans les CPF humains. Il peut désigner l'antigène dans son intégralité ou une partie de l'antigène ayant conservé tout ou partie des propriétés. de la molécule native.

Les anticorps designés anti-HBV-T sont des anticorps capables de se lier selectivement à l'antigène HBV-T quelle que soit l'origine de ces anticorps. De tel anticorps peuvent être obtenus
- à partir de sérums de malades atteints de CPF.

- à partir de sérums de primates atteints de CPF naturels ou expérimentaux.

- après immunisation chez l'animal avec l'antigène HBV-T purifié ou des préparations le contenant.

- à partir de serums d'animaux atteints de CPF dûs à des virus proches du virus HB induisant un antigène tumoral ayant des communautés antigéniques avec l'antigène HBV-T.

L'antigène- HBV-T a été découvert par des techniques d'immunofluorescence induire et d'immunopéroxydase indirecte dans des hépatocytes provenant de malades atteints de CPF. Les antiserums réactifs proviennent de malades atteints de CPF.

1 - Hépatocytes
L'antigène HBV-T a été découvert dans les hépatocytes d'un malade d'origine sénégalaise (LD2) atteint de CPF. Le prelevement de tissu hépatique a été obtenu à l'autopsie et immédiatement congelé à -200 C sous la forme d'échantillons d'envir 1 cil?. Le stockage est réalisé à la température de - 700 C. Un échantillon est fixé par décongélation dans le fixateur de Bouin aqueux oO il est laissé pendant 24 heur
L'échantillon est rincé à l'eau courrante pendant 16 heures puis déshydraté par bains successifs éthanol-toluène, enfin inclus en paraffine. Des coupes sériées de 3 > im (microns) sont collées sur des lames de verre pour microscope. Les coupes sont déparaffinées par le xylol et plongées dans une solution tampon quelques heures avant les réactions immunologiques.

L'antigène HBV-T a été également découvert dans une lignée d'hépatome d'origin humaine (lignée PLC/PRF/5 ). La lignée est cultivée en milieu M.E.M contenant 10 % de sérum de veau foetal, de la glutamine et des antibiotiques aux concentratio usuelles. Les cultures sont effectuées à 370 C sous une atmosphère de 95 % d'air, 5 % de CO2. D'autres milieux pour cultures cellulaires peuvent être utilisés, en obtenant des résultats analogues.

Les réactions immunologiques mettant en évidence l'antigène HBV-T peuvent être réalisées sur des tapis de cellules cultivées en tube de Leighton ou sur des coupes de cellules. Les tapis celluliares obtenus sur lamelles (tubes de Leighton) sont lavés en tampon phosphate, fixés dans l'acétone 10 minutes et stockés à -700 C. Les coupes de cellules proviennent de culots cellulaires obtenus après trypsination des cellules, fixation par le formaldehyde et inclusion en paraffine. Les culots cellulaires inclus en paraffine sont alors traités comme des échantillons de tissus hépatiques (lignes 32/35 page 3).

2 - Antisérums
Les antisérums contenant les anticorps anti-HBV-T proviennent de sujets atteints de CPF prelevés quelques jours avant leur décès.

Les antisérums ayant une activité anti-HBV-T possèdent le plus souvent des marqueur de réplication du virus de l'hépatite B : HBs Ag et/ou anit-HBc.

Les antisérums sont stockes à -70" C après répartition en aliquots de 100 il.

3 - Réactions immunologiques * Immnofluorescence
L'immunofluorescence est réalisée selon la technique indirecte. Cinquante microlitres (rl) de sérum sont déposés sur les coupes de tissu ou de cellule et incubés 30 minutes à température ambiante sous atmosphère humide. Ce premier temps de la réaction peut également être réalisé avec les immunoglobulines purifiées (ou des fragments Fab).

Autres conditions de température peuvent être utilises (par exemple : 37 C) ainsi que des temps d'incubation différents (par exemple : 1 heure).

Après plusieurs lavages en tampon véronal pH 7,2, les immunoglobulines anti-gammaglobulines humaines (anti-IgA, anti-IgG, anti-IgM) conjuguées à l'lsothiocyanate de fluorescéine sont déposées sur la lame. Une deuxième incubation à température ordinaire et sous atmosphère humide est alors réalisée. La lame est ensuite lavée au tampon vérona pH 7,2. L'echantillon est alors recouvert de glycérine tamponnée et d'une lamelle.

L'observation est réalisée avec un microscope à fluorescence. Dans cette deuxième étape, les lavages peuvent être réalisés avec d'autres types de solution tamponnée (par exemple tampon phosphate) ; d'autres types d'anticorps peuvent être utilisés (par exemple : anti corps monospécifiques des différentes c-lasses d'immunoglobulines, anti-IgG, anti-IgA ou anti-IgM : anticorps anti-Fab : anti-corps marqués par d'autres substances fluorescentes telle la rhodaminej. Un contre-colorant peut être utilisé (par exemple : Bleu d'Evans).

Les temps et températuresd'incubation peuvent être modifiés comme dans l'étape precédent a Immunopéroxydase
La réaction d'immunoperoxydase indirecte est realisee selon les méthodologies employées pour les réactions d'immunofluorescence. Dans la deuxième étape de la réaction les anticorps marqués sont des anticorps anti-immunoglobulines humaines.

marquées a la péroxydase (anti-IgA, anti-IgG, anti-IgM). L'activité péroxydasique est révélée par le 4 chloronaphtol (ou la diaminobenzidine). Des modifications peuvent être apportées a la réaction en utilisant des anticorps monospécifiques des différentes classes d'immunoglobulines, ou des anticorps anti-Fab, ou des anticorps marqués par d'autres enzymes (par exemple : la phosphatase alcaline, la R galactosidase ou la glucose oxydase).

4 - Contrôles
ta ua2iditd des conclusions est entièrement ddpendante de la spécificitd des anticorps utiZisds pour les réaction imnunologiques.

Aucune réaction positive d'immunofluorescence ou d'immunopéroxydase n'a été observée dans des coupes de CPF ou des cellules en culture contenant l'antigène
HBV-T avec les sérums contrôles suivants
- sérums provenant de sujets sains (donneurs de sang) européens et africains sans marqueurs d'infection par le virus HB.

- sérums provenant de sujets européens atteints de CPF d'étiologie alcoolique sans marqueurs d'infection par le virus HB.

- sérums provenant de sujets européens atteints de cancer non hépatiques ou ayant des métastases hépatiques d'autres cancers.

Aucune réaction positive.d'immunofluorescence ou d'immunopéroxydase n'a été observée dans des coupes de foies provenant de sujets sains (sujets décédés accidentellement) non infectes par le virus HB avec les sérums contenant les anticorps anti -HBV-T;
L'antigène HBV-T ne correspond pas à un antigène structural connu du virus HB (HBs Ag, antigène d'enveloppe ; HBc Ag, antigène de capside ; HBe Ag, antigène cryptique associé à la capside). L'antigène HBV-T n'est pas
- l'antigène HBs car les sérums anti-HBV-T positif sont anti-HBs négatif.

- l'antigène HBc car d'une part les coupes de foie LD2 et la lignée PLC/PRF/5 sont HBc Ag négatif ; d'autre part, aux dilutions utilisées les anticorps anti-HBV-T ne réagissent pas avec des coupes de foies sélectionnés HBc Ag positif (foies provenantde sujets atteints d'hépatite chronique active).

- l'antiqène HBe car parmi les sérums anti-HBV-T positifs certains sont anti-HBe négatifs.

En conclusion, l'antigène HBV-T et l'anticorps correspondant anti-HBV-T repre- sentent un nouveau svstème anti qène-anti corps associé à la transformation tumorale des hénatocvtes infectés par le virus HB. L'antigène HBV-T ne crresDond pas à un antigène de structure du virus HB déa connu ni à un comDosant normal du tissu hépatique.

5 - Caractérisation et isolement de l'antigène HBV-T
L'antigène HBV-T révélé par les réactions d'immunofluorescence et d'immunopéroxydase est intracytoplasmique (Figures 1 et 2). I1 pourrait correspondre à un matérie amorphe observable en microscopie électronique (Figure 39.

Pour la poursuite des buts exposés plus haut la purification de l'antigène sera obtenue soit à partir de tissus de CPF, soit à parir de cellules transformées,- provenant de CPF, enlignées continues, soit enfin a partir du surnageant de ces cultures.

Pour la préparation d'anticorps par immunisation d'animaux un antigène purifié doit être utilisé. Une purification partielle peu suffire pour l'obtention d'anticorps monoclonaux d'origine animale. Enfin il existe une source possible d'anticorps, notamment monoclonaux, a partir de cellules immunitaires de sujets anti-HBV-T positifs.

La purification de l'antigène HBV-T à partir de cellules ou de surnageants de cultures cellulaires peut se faire selon les modalités suivantes
- les tissus hépatiques sont émincés et homogénéisés en milieu tamponné contenant ou non des détergents (par exemple : le triton X 100 ou le Nonidet P 40). Les cellules sont alors lysées soit par sonication, soit a l'aide d'un tampon de lyse (par exemple tampon Tris-NaCl pH 7,2 contenant du triton X 100, du désoxycholate de sodium et du
SDS) Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation (par exemple : 100 000 g pendant une heures). On obtient ainsi un lysat cellulaire contenant l'antigène HBV-T.

- à partir de cultures cellulaires, soit après trypsination des cellules et sonication ou lyse selon la technique décrite précédemment, soit après lyse du tapis cellulaire par un tampon contenant des substances tensioactives, on obtient un lysat cellulaire contenant 1 'antigène HBV-T.

- le surnageant de culture est traité comme un lysat cellulaire; dans la suite de la purification une étape de concentration préalable peut être ajoutée (par exemple ultrafiltration sur membrane) ; precipitation et relargage avec des sels type sulfate d'ammonium, des polymères - type polyéthylène glycol -, ou l'acide trichloracetique).

Le lysat cellulaire, ou le surnageant de culture (Concentré ou non), contenant l'antigène HBV-T peut être purifié par chromatographie, ultracentrifugation ou el ectrophorèse préparative.

La chromatographie d'exclusion diffusion (filtration sur gel) utilise un gel d'agarose, de dextran, d'acrylamide, ou un gel mixte, dont les propriétés résolutives permettent de séparer l'antigène HBV-T d'autres constituants cellulaires ou extracellulaires de poids moléculaires différents. La dimension des colonnes et la nature du gel sont fonction du volume d'échantillon à purifier. Par exemple, on utilisera une colonne de section 25 mm et de longueur 1 000 mm contenant du Séphadex G 200R (Pharmacia Fine Chemical, Uppsala, Suede) équilibrée en tampon isotonique pour purifier un aliquot de 5 ml de lysat cellulaire ou de concentré de surnageant cellulaire.

L'obtention d'anticorps anti-HBV-T spécifiques permet de réaliser une chromatographie d'affinité. Par exemple, on utilisera un Sépharose 4 B activé au bromure de cyanogène ou un gel d'acrylamide activé au glutaraldéhyde, ou tout autre support avec ou sans agent de couplaqe, sur lequel seront fixés les anticorps anti-HBV-T.

La chromatographie d'affinité pourra être réalisée en colonne ou en "batch".

L'ultracentrifugation peut être isopycnique, zonale ou continue, en gradients préformés ou non de sucrose ou de chlorure de césium. Les concentrations en sucrose ou en chlorure de césium sont fonction de l'expérimentation en routine.

L'électrophorèse préparative ou des méthodes voisines (isoélectrofocalisation, isotachophorèse) peuvent être utilisées pour purifier l'antigène HBV-T.

Ces différentes méthodes sont combinées pour obtenir l'antigène HBV-T purifié.

6 - Obtention d'anticorps spécifiques
Les anticorps spécifiques ont un intérêt pour la purification de l'antigène
HBV-T (par exemple : par chromatographie d'affinité). Ils peuvent également être utilisés dans la mise au point de tests diagnostiques et de molécules thérapeutique coupléesà une toxine.

L'obtention d'anticorps anti-HBV-T peut se faire à partir de sérums de malades à partir d'animaux immunisés avec l'antigène HBV-T ou des préparations le contenant
La fraction gamma-globulinique des serums contenant les anticorps anti-HBV-T peut être purifiée par les techniques conventionnelles de séparations plasmatiques (par exemple : précipitations à l'alcool ou au sulfate d'ammonium). Le degré de purification des anticorps sera fonction de la source d'obtention et de l'applicati désirée. Les anti-HBV-T destinés à la mise au point de tests ou à la purification de l'antigène HBV-T peuvent être d'origine animale. Au contraire, les anticorps anti-HBV-T destinés à la thérapeutique doivent être d'origine humaine : anticorps naturels ou anticorps obtenus apres une immunisation avec 1 'antigène HBV-T purifié (adjuvé ou non).

A partir de l'antigène HBV-T et des anticorps anti-HBV-T peuvent être dévelopF des méthodes de diagnostic de l'antigène HBV-T ou des anticorps circulants. L'antic
HBV-T peut être détecté sur biopsies hépatiques par immunocytochimie (par exemple immunofluorescence ou immunopéroxydase directes ou indirectes). Des méthodes plus 5ens ibles, telles des tests radioimmunologiques ou immunoenzymatiques, pourraient permettre la détection de l'antigène HBV-T dans les liquides biologiques (sang, ur liquide d'ascite...). Dans ce but un test immunologique peut être mis au point en utilisant une méthode compétitive ou une méthode sandwich.L'anticorps anti-HBV-T couplé à un support solide (par exemple : une bille de verre, la paroi interne d'u plaque de microtitration) soit directement soit avec un agent de couplage. L'antig
HBV-T présent dans le liquide biologique est absorbé sur les anticorps insolubilis
La présence de l'antigène HBV-T est alors révélée, soit par competition avec un antigène HBV-T marqué (méthode compétitive), soit par fixation dans un deuxième temps d'anticorps anti-HBV-T marqués (méthode sandwich). Le marquage de l'antigène dans la méthode compétitive, ou de l'anticorps dans la méthode sandwich, peut être réalisé avec un radioélement (par exemple : 125 Iode) ou avec un enzyme (par exemple : phosphatase alcaline).Des variantes de ces méthodes immunologiques peuvent être utilisées : par exemple adsorption directe non spécifique de l'antigène à doser sur un support puis révélation avec un anticorps anti-HBV-T marqué.

La détection des anticorps anti-HBV-T peut être réalisée selon les mêmes principes compétition ou sandwich. I1 est intéressant de distinguer les anticorps anti-HBV-T appartenant a différentes classes d'immunoglobulines (IgM, IgA, IgG). Plusieurs méthodes peuvent être utilisées : soit séparation des différentes classes d'immunoglobulines par les-techniques classiques (ultracentrifugation en gradient de sucrose, filtration sur gel, chromatographie d'échange d'ions, adsorption par la protéine
A de staphylococcus aureus ou par la concanavalline A), soit en utilisant une technique sandwich dans laquelle l'antigène HBV-T est fixé à un support solide.Les anticorps anti-HBV-T appartenant à différentes classes sont révélées par des anticorps marqués diriges contre les différentes classes d'immunoglobulines humaines (par exemple : anticorps anti-chaine u pour révéler les IgM anti-HBV-T).

Des tests de diagnostic rapide, mais de moindre sensibilité, peuvent également être développés pour la détection, soit de l'antigène HBV-T, soit des anticorps anti
HBV-T. Dans ces tests, l'antigène HBV-T (ou les anticorps anti-HBV-T) sont couplés à des particules inertes (par exemple : particules de latex, hématies, proteines A de staphylococcus aureus) selon les méthodologies habituelles afin de detecter les anticorps anti-HBV-T (ou l'antigène HBV-T).

Les anticorps anti-HBV-T obtenus comme décrit précédemment peuvent être utilisés à des fins thérapeutiques entant que "porteurs spécifiques" de molécules destinées à détruire ou à stopper la multiplication, de cellules cancéreuses antigène HBV-T positives. Par exemple, les anticorps anti-HBV-T peuvent être couplés à une moutarde à l'azote, à la colchicine, à la mitomycine, à la 5 Iodo désoxyuridine. Les choix des agents de liaison sont alors fonction des groupements chimiques disponibles sur chaque molécule, afin que l'activité biologique des "poisons cellulaires" ne soit pas modifiée après couplage aux anticorps spécifiques.

REFERENCES
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Exemples
- Exemple 1 : mise en évidence de l'antigène HBV-T par réaction immunologique sur des coupes de biopsies hépatiques (immunocytochimie)
Les biopsies hépatiques sont inclues dans des blocs de paraffine ou des coupes de 3 fm sont effectuées. Ces coupes sont déposées sur des lames de verre puis stockées (techniques histologiques habituelles).

Avant toute réaction immunologique la paraffine est éliminée par traitement des lames au Xylol. Les lames sont ensuite plongées dans une solution de carbonate de lithium durant 10 minutes afin de neutraliser l'acidité due à la fixation, puis dans le tampon de Coons pendant quelques minutes.

1 - Immunofluorescence (méthode indirecte)
50oui de sérum anti-HBV-T positif (provenant d'un sujet africain atteint de
CPF HBs Ag positif : serum 121, sérothèque de l'Institut de Virologie de Tours) dilué au 1/10 en tampon de Coons sont déposés sur la coupe de tissu hépatique et incubés pendant 30 minutes à température de la pièce dans une chambre humide. Après 15 minutes de lavage dans 2 bains successifs de tampon de Coons, 50 pl d'immum-serum antiimmunoglobulines humainesmarqué à l'isothiocyanate de fluoresceine (immumsérum de mouton anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM) dilue au 1/50 en tampon de Coons est deposé sur la coupe de tissu. Le Bleu Evans au 1/1000 est utilise comme contre-colorant.

Après 30 minutes d'incubation (à température de la piece, en atmosphère humide) 3 lavages en tampon de Coons sont nécessaires afin d'éliminer l'excès de colorant.

Les coupes sont alors recouvertes d'une goutte de glycérine tamponnee pH7.6 diluée au 1/3 et d'une lamelle. Ces lames sont alors prêtes à être observées au microscope à fluorescence.

Une fluorescence cytoplasmique evitant le noyau est observée dans les cellules
HBV-T positives.

2 - Immunopéroxydase (méthode indirecte)
La réaction d'immunopéroxydase est réalisée dans les mêmes conditions que la réaction d'immunofluorescenceDans la deuxième etape de la réaction, 50 pu d'immunsérum anti-immunoglobulines humaines marqué à la péroxydase (immunsérum de mouton antiIgG, anti-IgA, anti-IgM) dilué au 1/20 en tampon de Coons est deposé sur la coupe de tissu hépatique. Après 30 minutes d'incubation, suivies de 3 lavages en tampon de Coons, l'activité péroxydasique est révélée par le 4 chloro-naphtol.

La réaction enzymatique se déroule en 20 minutes à température de la pièce. Après 3 lavages en tampon de Coons, les lames sont prêtes à être montées et observées au microscope.

Une coloration brun-violacée cytoplasmique signe la présence de l'antigène
HBV-T.

- Exemple 2 : détection d'anticorps anti-HBV-T dans les sérums de sujets ayant un processus inflammatoire hépatique chronique (immunocytochimie).

Des coupes de cellules de la lignée d'hépatome PLC/PRF/5 sont utilisées en tant qu'antigène HBV-T de référence. Les lames sont prétraitéescomme décrit dans l'exemple 1.

Les rections utilisées sont l'imrnunofluorescence indirecte et l'immunopéroxydase indirecte.

Durant le premier temps de la réaction, 50 pl de sérum à tester (dilué au 1/10 en tampon de Coons) sont déposes sur la coupe de cellules HBV-T Ag positif et incubés pendant 30 minutes à température de la pièce dans une chambre humide. Le deuxième temps de la réaction est identique à ce qui a été décrit dans l'exemple 1.

Les images observées en cas de positivité sont identiques à ce qui a été décrit dans l'exemple 1.

- Exemple 3 3 : Production de l'antigène HBV-T par une lignee d'hépatome humain.

La lignée d'hepatome PLC/PRF/5 est cultivée en milieu M.E.M. contenant 10 % de sérum de veau foetal, de la glutamine et des antibiotiques (pénicilline 100 U.I/m streptomycine : 100 ug/ml, Amphotéricine B : 2 pq/ml) en flacons de 75 cm2 en atmosphère 95 Z d'air + 5 % de C. Les changements de milieu interviennent tous les 3 jours. En 9 jours une culture confluente est obtenue. Le tapis cellulaire est lave une fois avec du tampon PBS, pH 7.2. Ce tampon de lavage etant éliminé, 3 ml de tampon de lyse (NaCl 0,15 M / Tris-HCl 0,05 M, pH 7.2 + Triton X 100 1 % / Désoxycholate de sodium 1 % / SDS 1 Z) sont ajoutes.Après 10 minutes à 4 C avec agitation intermittente, la solution de lyse est collectée. Elle contient l'antigène HBV-T concentré.

- Exemple 4 : mise en evidence de l'antigène HBV-T produit par la lignée PLC/PRF/ par immunoprécipitation.

Une culture subconfluente (8-9 jours) de la lignée PLC/PRF/5 (boite flacon de 75 cm,) est marquée avec de la 35 S-methionine à la concentration de 20/uCi/ml de milieu de culture pendant 18 heures. Les cellules sont lavees avec du tampon PBS, pH 7.2 froid puis 3 ml de tampon de lyse (cf formule détaillée dans l'exemple 3) sont ajoutées. Apres 10 minutes d'agitation intermittente à 40 C la solution de lyse est collectée.

Le lysat cellulaire est centrifugé à 50 000 g pendant 2 heures dans une centrifugeuse réfrigérée BeckmanR J 21. Le surnageant est alors prélevé soigneusement. Ce surnageant est pretraité par absorption sur des immunoglobulines (provenant d'un sujet adulte sain) elles-mêmes absorbés sur protéine A-Sépharose. Après 30 minutes d'incubation le surnageant est recueilli. Le lysat cellulaire est alors incubé avec des IgG anti-HBV-T (10 l de sérum anti-HBV-T) immobilisées sur protéine A-Sépharose.

Après 4 lavages en tampon de lyse suivis d'un lavage en tampon NaCl 0,15 M / Tris-HCl 0,05 M, pH 7.2, le complexe "Sépharose-Proteine A-anti-HBV-T-HBV-T Ag" est repris en tampon dénaturant (Tris-HCl 100 mM / SDS 2 C/o / B mercaptoéthanol 5 % / Glycérol 15 /
Bleu de Bromophênol 0,001 t) et porté à ébullition 5 minutes.

25 fl de cette solution sont déposés sur un gel à 10 % d'acrylamide. Après une migration de 4 heures, le gel est séché. Le gel séché est alors mis au contact d'une émulsion radiographique et exposé pendant 10 jours. La révélation met en évidence 3 bandes principales de poids moléculaire compris entre 50 000 et 150 000 daltons.

- Exemple 5 : marquage de l'antigène HBV-T et des anticorps anti-HBV-T par des enzymes afin de les utiliser dans des kits diagnostiques.

La technique etant applicable aussi bien à l'antigène HBV-T qu'aux anticorps anti-HBV-T, nous ne detaillerons la méthodolojie que pour le marquage de l'antigène HBV-T.

L'enzyme choisi pour cet exemple est la phosphatase alcaline.

10 mg de phosphatase alcaline sont dissous dans une solution d'anticorps (5 mg dans 2 ml de tampon phosphate 0,1 M, pH 6.8) au préalable dialysée 24 heures à + 40 C contre 2 litres de tampon phosphate 0,1 M, pH 6.8. Dès que la dissolution est terminée, on ajoute goutte à goutte 0,05 ml de la solution de glutaraldéhyde à 1 % en agitant régulièrement. La solution est laissée au repos 3 heures à température du laboratoire, puis la réaction est stoppee par addition d'une solution de lysine.

Une dialyse de 24 heures à 40 C contre 2 litres d'eau physiologique tamponnée est effectuée. Après centrifugation 20 minutes à 20 000 tours/minute de la solution dialysée, le conjugué soluble est prélevé dans le surnageant. Il est conservé à + 40 C dans un flacon fermé hermétiquement.

- Exemple 6 : couplage des anticorps anti-HBV T à une molécule radioactive (Tc 99M par exemple) pour orienter une hépatectomie partielle dans le traitement d'un cancer primitif du foie, ou bien pour vérifier après chirurgie l'absence de tissu cancéreux résiduel.

Le couplage peut être réalisé dans un bac à électrolyse contenant deux électrodes de zirconium dans lequel on mélange 2 ml d'une solution saline normale et stérile de
Tc 99M pertechnetate (contenant approximativement 60 mCi) à 5 ml d'une solution 0,05 N d'HCl. On fait passer un courant de 5,6 volts à 100 mA pendant 45 à 50 secondes.

Après l'électrolyse le pH de la solution est réajusté à 7,4 puis on injecte immédiatement 0,2 ml de gammaglobulines purifiées ou 1 ml de serum concentré dans le flacon que l'on agite de façon douce et continue. On laisse incuber 30 minutes å 37 C.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Antigene, présent dans les cellules transformees par le virus de l'hépa- tite B, autre que les antigènes structuraux du virus de l'hépatite B : antigène

HBs, antigène HBc, antigène HBe, ADN-polymérase.

2. Antigène selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les sérums provenant de sujets atteints de cancer primitif du foie contiennent des anticorps dirigés spécifiquement contre lui.

3. Procédes d'obtention de l'antigène selon la revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils permettent d'isoler l'antigène

1) à partir de cellules en lignes provenant de cancers primitifs du foie d'origine humaine ou animale,

2) à partir de cellules transformees par le virus de l'hépatite B,

3) à partir de biopsies hépatiques, de prélèvements autopsiques ou de métas

tases, d'origine humaine ou animale.

4. Procedés d'obtention d'anticorps selon la revendication 2, diriges specifiquement contre l'antigène selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les anticorps sont obtenus

1) à partir de sérums de sujets atteints de cancer primitif du foie,

2) à partir de sérums d'animaux immunisés avec l'antigène obtenu selon la

revendication 3,

3) a partir de produits monoclonaux obtenus par fusion cellulaire entre une

lignée tumorale d'immunocytes et des immunocytes humains ou animaux immu

nisés avec l'antigène isolé selon la revendication 3,

4) à partir de produits monoclonaux obtenus par transformation par un virus

de cellules productrices d'anticorps selon la revendication 2.

5. Procédes caractérisés par le fait que l'antigène selon la revendication 1 est utilise dans le diagnostic d'infectiOns hépatiques chroniques.

6. Procedés caracterisés par le fait que les anticorps selon la revendication 4 sont utilises dans le diagnostic d'infections hépatiques chroniques.

7. Procedes caractérisés par le fait que l'antigène selon la revendication 1 et les anticorps selon la revendication 4 sont utilisés à des fins thérapeutiques.

8. Procédés caractérisés par le fait que les anticorps-selon la revendication 4 sont utilisés pour localiser les cellules tumorales afin de guider un acte therapeutique ou de préciser les indications d'une chimiothérapie post-chirurgicale.