JPS62179399A - 抗原ｇｐ６５０に特異的なモノクロ−ナル抗体によるヒトのガンの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｘ更段分互 この発明は消化器ガン、肝ガン、乳ガン、肺ガン、舌、
ガン、ファロピアン管のガン、リンホーマ、多発性ミエ
ローマ等をもった患者の血清中で、高分子抗原ｇｐ６５
０の含量が高まるのを検出することに関する。正常なヒ
トの血清や他のいくつかのガンをもった患者の血清では
、この抗原のレベルは低く、検出できない。

ｌ匪立！１ ポリクローナル抗体と免疫蛍光を利用した初期の研究（
ゴールデンバーグ等、キャンサー・リサーチ、第３６巻
、　３４５５頁、１９７６年；チャクラパティ−等、ジ
ャーナル、オン。イムノロジカル・メソツメ、第４３巻
、３０１頁、　１９８１年；ティラー等、イムノロジカ
ル・コミュニケーション、第１２巻、３１５頁、１９８
３年：チャクラバーティー等、キャンサー・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオフィジックス、第６巻、２４
９頁、１９８３年など参照）は、Ｇトコ９腫瘍（ヒト／
ハムスターの異種移植）からとった細胞液画分が、いく
つかの初代ヒト大腸ガンによって発現される抗原の材料
となることを示した。これらのポリクローナル抗血清や
その他の抗血清（アレンズ等、ビオキミカ、ビオフィジ
カ　アクタ、第７８０巻、１頁。

１９８５年参照）を用いたヒトの大腸ガンの凍結切片に
ついての間接免疫蛍光による研究（ヒルガーズ等、キャ
ンサー・リサーチ、第３２巻、９８頁、１９７２年参照
）は、ヒトの腸のガンから得た多くの標本に中程度から
明確な免疫蛍光のあることを示した（イエオマン等、メ
ソッド・イン・キャンサー・リサーチ、第１９巻、２３
３頁、１９８２年参照）、交叉免疫電気泳動法による解
析（ローレル、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・
クリ二カル・ラボラトリ−・インベステイゲーション、
第２９巻、２１頁、　１９７２年参照）は、これらのポ
リクローナルの抗血清が２０種以上の抗原を認識できる
ことを示した（チャクラパティ−等、１９８３年）、十
分な予備吸収を正常なヒトと正常なハムスターの組織で
行った後は、３個の抗原だけが検出された。定量的な放
射免疫測定法（チャクラパティ−等、１９８３年）によ
って、大腸抗原３（Ｃ＾−３）の発現量が増大すること
が初代ヒト大腸腫瘍の抽出物で測定できだが、正常な大
腸粘膜や非腫瘍性の大腸試料から採取した粘膜の抽出物
には、陰性または低値しか検出できなかった（パーラ等
、キャンサー・リサーチ、第４４巻。

４０４０頁、１９８４年）。これら抗血清で認識される
抗原のさらに深い生化学的キャラクタリゼーションによ
って、それらが６００〜８００キロダルトンの分子量を
もつことが示された（チャクラパティ−等、１９８３年
）。

ポリクローナル抗血清で得られた定量的なデータが、非
常に高分子の抗原に対する反応性にもとづく免疫的分析
法によって、大腸ガンが、正常な隣接大腸及び正常な大
腸標本を認別できることを示しているので、本発明者は
高分子量の抗Ｊ７ｉ　（６００〜８００キロダルトン）
でどのような選択的免疫がなされるかの実験をはじめた
。本発明は高分子量のヒトの腫瘍抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を作製し、末梢血試料にその存在を検出する
ことを口論んだ研究からなされたものである。これまで
の研究に使われたポリクローナル抗体に比較してモノク
ローナル抗体の利点は（１）モノクローナル抗体の特異
性が高いこと、（２）抗体の供給加可能性として無限で
あること、（３）その特異性を改善するために吸収を必
要としないことなどである。ｍ瘍標本から調製される抽
出物を分析することに比較して血清にもとづくテストの
利点は、（１）試料の採取が容易なこと、（２）特殊な
タイプのガンである可能性の高い患者のガンを）検索で
きること、（３）無症候性の人を早期に検出できること
、（４）病気の治療効果や再発をひきつづき追跡可能な
こと、などである。

抗［ｇｐ６５０は検量化されたＳ−３００セフアクリル
カラムでのゲル濾過法で定量して約６５０ＫＤの分子量
をもち、この抗原を発現しているヒトの大腸腫瘍細胞の
原形質の中に当該抗原が存在していることが免疫蛍光法
によって示されている。

第１表は抗原ｇｐ６５０の特性の要約を示している。こ
のモノクローナル抗体によって認識される抗原決定基は
この蛋白の上にあり、その免疫的反応性とクロマトグラ
フィーでの挙動の点で、ガン胎児性抗ＪＸ（ＣＥＡ）と
相違する（ケスラー等。

キャンサー・リサーチ、第３８巻、１０４１頁、１９７
８年参照）。

第２表には、このモノクローナル抗体の臨床上の特異性
が示されている−　ｇｐ６５０のレベルの上昇（第３表
）は消火器ガン、乳ガン、肺ガン、舌ガン、ファロピア
ン管のガン、リンホーマ、肝ガン、多発性ミエローマの
患者でみられた。

正常なヒトの血清や初代胆のう硬化症の血清ではｇｐ６
５０のレベルは増加しなかった。

第１表 糖タンパク 原形質液に生成され存在する。

ガン患者の血清中にある。

タンパク性の抗原決定基。

（ａ）分子量は８Ｍグアジニン塩酸塩の存在下（変性状
Ｓ）と非存在下（正常状態）で検量化されたセフアリク
リルＳ−３００カラムでのゲル濾過法で測定した。抗原
ｇｐ６５０はプロテアーゼ、エンドグリコシダーゼ、亜
硝酸、還元剤、コンドロイチナーゼＡＢＣ，ＤＮアーゼ
■で処理され、その組成やそれらに対する感受性が調べ
られた。ガン胎児性抗原のゲル濾過上の特徴は、市販の
抗原清を用いてＥＬＩＳＡ法で８１ｑ定した。

第２表 （ａ） 抗ＪＭｇｐ６５０に特異的なモノクローナル抗体の臨床
上の特異性胃、小腸ガン　　　　　　　　８／９ 乳ガン　　　　　　　　　　　４／４ 肝ガン　　　　　　　　　　　３／３ 多発性ミエローマ　　　　　　２／２ リンホーマ　　　　　　　　　　１／２肺ガン　　　　
　　　　　　　１／１ フアロピアン管ガン　　　　　１／Ｌ 舌ガン　　　　　　　　　　１／１ 子宮ガン　　　　　　　　　　０／１ 前立腺ガン　　　　　　　　　０／１ 食道ガン　　　　　　　　　　０／１ 匪ｎ＞− 正常血清　　　　　　　　　　０／３ 初代胆のう硬化組織　　　　　０／１ （ａ）免疫的反応性はプラスティックのマイクロタイタ
ープレートに結合した抗原を用いて直接結合ＥＬＩＳＡ
法で調べた。−次抗体とインキュベートした後、ウマの
抗マウスビオチン化二次抗体を加え、次いで、アビジン
−ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を加え
た。　２．２’−アジノージ−（３−エチルベンズチア
ゾリンスルホン酸（６））ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ
）と過酸化水素を加え１発色を見ることで結合した西洋
ワサビペルオキシダーゼの量を定量することで調べた（
ケイゼイ等、キャンサー・レターズ、第１２巻、２９５
頁、１９８１年参照）。

第３表 ガン 肝ガン　　　　　　　３　　　　１４−７５　　　３９
肺ガン　　　　　　　１　　　　　３０　　　３０乳ガ
ン　　　　　　　４　　　　／０．４５　　　３０フア
ロピアン管ガン　１　　　　　２９　　　２９ミエロー
マ、多発性　２　　　　　８−３２　　　２０大腸ガン
　　　　　　９　　　　０−４５　　　１６舌ガン　　
　　　　　１　　　　６　　　６リンホーマ　　　　　
２　　　　　０−１０　　　５子宮ガン　　　　　　１
　　　　　４　　　４前立腺ガン　　　　　１　　　　
０　　　０食道ガン　　　　　　１　　　　　００初代
胆のう硬化組織　１　　　　　２　　　２（ｅ）値は３
回分析した最低値によっている。

となる　　文 Ｊ、１１．アレンズ、Ｆ、Ｔ、ボスマン、Ｊ、ヒルガー
ズ：「大腸ガンの組織抗原」ビオキミカ、ピオフ　シカ
・アフタ、第７８０巻、１〜１９頁、１９８５年。

Ｊ、パーラ、Ｊ、アンビル、Ｒ，グラウテイエ、Ｐ、バ
ーティン：　「大腸アデノカルシノーマに隣接した組織
学的に正常な粘膜の粘膜関連Ｍ１抗原の異常パターン」
、キャンサー・１サ一チ第４４巻、　４０４０−４０４
５頁、１９８４年。

Ｆ、Ｃ，ベネット、Ｌ、Ｃ，イエオマン：「ハイブリド
ーマの培養上清の゛′点滴免疫結合法″による分析の改
良法」、ジャーナル・オン・イムノロジカル・１笠１五
、第６１巻、２０１〜２０７頁、　１９８３年。

Ｓ、チャクラパティ−１Ｃ，Ｗ、ティラー、Ｌ、Ｃ，イ
エオマン：「原形質液抗原の分析のための免疫電気泳動
法の比較」、ジャーナル・オン・イムノロジカル・メソ
ッド、第４３巻、３０１〜３１１頁、１９８１年。

Ｓ、チャクラパティ−、Ｃ，Ｖ、ティラー、　Ｌ、Ｃ，
イエオマン、　ｒ７００キロダルトンのヒトの大腸カル
シノーマ関連抗原の分離と部分的特徴」、ヱヱンサー・
バイオケミストリー・アンド・バイオ−ＺΔ二２３二λ
２２．第６巻、２４９〜２５９頁、１９８３年。

Ｄ、Ｍ、ゴールデンバーグ、Ｓ、ウィッチ、に、エルス
ター：　　ｒＧｌｌ−３９：ゴールデンハムスターに継
代移植できる新しいヒト腫瘍細胞」、トランスプラント
、第４巻、７６０〜７６３頁、１９７６年。

Ｄ、Ｍ、ゴールドバーブ、　Ｋ、Ｄ、パント、Ｈ，Ｌ、
ダールマン：　「正常及び悪性化した消化器組織に関連
した抗原」キャンサー・リサーチ、第３６巻、３４５５
〜３４６３頁、１９７６年。

Ｊ、ヒルガーズ、　Ｒ，Ｃ，ノウインスキー、Ｇ、ギー
アリング、ｖ、ハープイー：　「免疫蛍光法による鳥類
及び哺乳類の発ガン性ＲＮＡウィルス（オンコーナウィ
ルス）の検出」、き２覧）竺ｉ：ニニツーサーチ、第３
２巻、９８〜１０６頁、　１９７２年。

Ｄ、Ｅ、ケルゼイ、Ｒ，に、ブツシュ、１１．ブツシュ
：「ヒト腫瘍の核性抗原検出のための酵素免疫測定法」
、キャンサー・レターズ、第１２巻、２９５〜３０３頁
、１９８１年。

河、Ｊ、ケスラー、Ｊ、Ｅ、シヴリー、Ｄ、Ｇ、プリチ
ャード、Ｃ，Ｗ、　トッド：　「ガン胎児性抗原に関連
した腫瘍抗原の単離、免疫学的特徴及び構造的研究Ｊ、
キャンサー・リサーチ、第３８巻、１０４０〜１０４８
頁、１９７８年。

Ｕ、に、レムリ；　「バグテリオファージＴ４の頭部の
組立ての間の構造蛋白の分解」ネイチャー℃見企二トン
→−１第２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年。

Ｃ，Ｂ、ローレル；　「電気免疫測定法」スカンジ遺１
２４）２１〜３７頁、１９７２年。

Ｃ，Ｗ、ティラー、Ｓ、チャクラパティ、　Ｋ、Ｓ、シ
ャウダー、Ｌ、Ｃ，イエオマン；　「交叉免疫電気泳動
法と免疫蛍光法によるＧＷ−３９アデノカルシノーマ細
胞の細胞質抽出物の同定」、イムノロジカル・コミュニ
ケーション、第１２巻、３１５〜３２９頁、１９８３年
。

Ｌ、Ｃ，イエオメン、Ｊ、Ｊジョーダン、Ｒ，に、ブツ
シュ、Ｃ，Ｗ、ティラー、■、サベージ、１１．ブツシ
ュ、「正常あるいは再生ラット肝にはないノピコフ肝ガ
ン及びウォーカ２５６カルシノザルコーマ腫瘍細胞のク
ロマチンの胎児性タンパク」プロ９５８〜３２６２頁、
１９７６年。

Ｌ、Ｃ，イエオマン、ｃ、Ｉｌ、ティラー、Ｓ、チャク
ラパティ−１；「大腸腫瘍細胞抗原」メソツメ・イン・
キャンサー・リサーチ（Ｈ，ブツシュ。

Ｌ、Ｃ，イエオマンＷ）第１９巻、２３３〜２７１頁、
アカデミツク・プレス出版社にューヨーク）、１９８２
年。

見肌食又ぢ 本発明は消化管のガン、乳ガン、肝ガン、肺ガン、舌ガ
ン、ファロピアン管ガン、リンパ腫、多発性ミニローマ
等のガンがあると診断された血清に、高分子量の抗原（
ｇｐ６５０）があることを発見したことに帰せられる。

他のタイプのガンをもった患者や初代胆管硬変症患者の
血清や正常人の血清では、この抗原のレベルは低値か、
この抗原が存在しなかった。本発明の重要な側面は、ガ
ン患者の血清に共通の抗原があることの発見、　ｇｐ６
５０抗原の単離精製、この抗原に特異的なモノクローナ
ル抗体の作製、この抗原に特異的なモノクローナル抗体
を使った診断テスト及びヒトのガン抗原ｇｐ６５０に特
異的なモノクローナル抗体を含む診断キットなどにある
。

従って、本発明の目的は、ＧＷ−３９腫瘍細胞の細胞質
抽出物に存在し、一連のガン患者の血清にみられる原形
質液性の抗原ｇｐ６５０を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、診断や治療措置の目的に使
われる抗原ｇｐ６５０に特異的なモノクローナル抗体を
提供することである。

本発明のもう一つの目的は、この原形質液性抗原を純粋
な形で提供することである。

本発明のもう一つの目的は、純粋な抗原ｇｐ６５０を抽
出して精製する工程を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、ヒトのガン抗原＆ρ６５０
に特異的なモノクローナル抗体を含む診断キットを提供
することである。

本発明ののもう一つの目的は、診断のために標識の担体
として用いられるところのヒトガン抗原に特異的なモノ
クローナル抗体を提供することである。

この発明のその他の目的、特徴、利点は以下に述べると
ころから明らかになろう。

望ましい具体的　容 本発明は、ある範囲のヒトのガンをもった患者の血清に
、共通のヒトガン抗原ｇｐ６５０が存在することの発見
、その抽出１分難、部分精製、及びヒトのガンをイン・
ビイトロ及びインビボで診断できることと直接または間
接に関連づけることができる当核抗原に対して、高い特
異性と選択性をもったモノクローナル抗体の作製に帰せ
られる。

旦）ＪソＬ乙疲廠釘咀捜 ヒトのガン抗Ｊ７Ｗｇｐ６５０は、消化器ガン、乳ガン
、肝ガン、肺ガン、舌ガン、ファロピアン管ガン、リン
パ腫、多発性ミエローマなどのガン患者の血清に増加し
ていることが見付けられた。

ｇｐ６５０抗原が増加したレベルを示していると分析さ
れた最多数の標本は、大腸のガン、乳ガン、肝ガンの患
者のものであった。この抗原はヒトの大腸腫瘍細胞の原
形質液及びそのような抗原を含む体液から得ることがで
きる。正常人の血清、初代胆管硬変症の患者及び前立腺
、子宮、食道のガンをもった患者では、この抗原は存在
しないか、または低値である ヒトのガン抗原ｇｐ６５０は、排除クロマトグラフィー
によって未変性の状態で６５０キロダルトンの抗原分子
として同定されている。８Ｍのグアニジン塩酸塩の存在
下では、ｇｐ６５０のゲル濾過によって３５０キロダル
トン抗原が得られた。

免疫細胞化学的研究によって、その抗原はこの抗原を含
む大腸細胞の細胞質に存在することが示された。

ヒトのガン抗原ｇｐ６５０は、０．００５Ｍ　ＭｇＣＱ
　２　。

０．０２５Ｍ　ＫＣＱ　、１ｍＭフェニルメタンスルホ
ニルフルオリド、０．１ｍＭロイペプチンを含む０．０
５Ｍ　トリスバッファー（ｐＨ７，４）中でホモゲナイ
ズされたＧリー３９腫瘍細胞から抽出できる。１００．
ＯＯＯＸｇで４時間遠心分離した後、抗原は可溶性の細
胞液画分に残っている。ヒトのガン抗原ｇｐ６５０は、
選択的抽出、セファデックスＧ−１００カラムでのクロ
マトグラフィー、セファクリルＳ−３００カラムに２回
通すことによって高度に精製された。

リクロマトグラフィーによって、抗原は大兄６５０キロ
ダルトンの分子量をもった単一の左右対称のピークとし
て流出する（第１図参照）。

この抗原は正常人の血清では非常に低いレベルでしか検
出されない。

一ζ上ｊ口１遭− ヒトの血清及び組織の採取及び分析に関わる全てのステ
ップは、ベイラー研究所人体研究審理委員会（Ｂａｙｌ
ｏｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｂ
ｒｏａｄｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）の承
認を受けた。患者の血清は主としてテキサス州ヒユース
トンのメソシスト病院とベンタウブ病院の消化器科及び
ガン科からの患者から採取した。ヒトの腫瘍の切片はア
ラバマ州バーミンガムのアラバマ大学組織調達プログラ
ムから調達した６凍結切片標本はベイラー医科大学病理
学科で調製した。

ＧＶ−３９細　の　　　の。

ＧＷ−３９固形腫瘍をゴールデン・シリア・ハムスター
の後脇腹から外科的に削除しくゴールデンバーグ等、１
９７６年）、ホバート肉挽機で砕断し、１０％の牛胎児
血清と０．０５％のノイラミニダーゼを含む改良したイ
ーグル培地１０容量中に分散した。懸濁液を３７°Ｃで
３時間穏やかに攪拌した。

細胞塊を１１０００Ｘで２０分間遠心分離して収集した
。細胞塊を１ｍＭのフェニルメタンスルホン酸フルオリ
ドと０．１ｍＭのロイペプチンを含む網状赤血球用標準
バッファー（Ｒ５Ｂ　＝　０．ＯＩＭ　トリス塩酸１０
．ＯＩＭ　ＮａＣＱ　／１．５ｍＭ酢酸マグネシウム、
ｐＨ７，４）に懸濁し、１０分間１０００　Ｘ　ｇを遠
沈することによって２回洗滌した。洗われた腫瘍細胞を
１ｍＭのフェニルメタンスルホン酸フルオリドと０．１
ｍＭのロイペプチンを含む０．０５Ｍ　トリス−塩酸／
　０．００５Ｍ　ＮｇＣＱ　、１０．０２５Ｍ　ＫＣＱ
　（ｐｉ（７，４）に悲濁し、殆どの核が細胞質から離
れてくるまで５Ｄ−４５型スーパーデイスパツクスでホ
モゲナイズした。細胞の崩壊は位相差顕微鏡で追跡した
。破壊されてない細胞と核は、１１００Ｏｘで２０分間
遠心分離することで除き、細胞質の上澄を集めた。

細胞質ゾルは細胞質粗画分からｔｏ、ｏｏｏｘ　ｇ　−
２０分間、次いで１００．ＯＯＯＸｇ−４時間継続的に
遠沈することで調製した。

のための　ｙＫ６５０の 細胞質ゾル画分は攪拌して圧力をかける透析で１０ｍｇ
蛋白／ｍＱにまで濃縮し、その２００ｍｇを６１００セ
フアデツクスカラムにかけた。ゲルに排除される部分を
集めて５　ｍｇ／ｍ　Ｑに濃縮し、その１０ｍｇをＳ−
３００セフアクリルカラムにかけた。大兄６５０ＫＤの
分子量のところに溶出する高分子画分を集めて濃縮し、
４ｍｇをＳ−３００セフアクリルカラムでリクロマトグ
ラフにかけた（第１図参照）。単一の殆んど対称的なピ
ークを集め、不連続バッファーポリアクリルアミドゲル
電気泳動で低分子量成分を分析（レムリ、１９７０年）
して銀染色により解析すると、２５０キロダルトンより
低い分子量のペプチドは除かれていることが示された。

アガロースとアクリルアミドをくみ合わせたゲルでの解
析では、銀で染色されそして抗体の転写で検出できる物
質の幅広い領域がゆっくり移動することが示された。Ｓ
−３００セフアクリルクロマトグラフイーをくり返して
得た６５０ＫＯ成分はマウスの免疫に使われた。

とモノクローナル　　の生Ｊ ４ないし６週齢の雌のＢａ１ｂ／ｃマウスに、　６５０
ＫＤ抗原を４回ｉ、ρ、投与した。最初の投与では完全
フロインドアジュバントで４３０μｇの抗原を使った。

最初の投与の１ケ月後、マウスに６週間間隔で不完全フ
ロインドアジュバントで３回ブースター投与した。最終
の促進免疫から２〜４日後、融合のためにマウスを犠牲
にして牌細胞を採取した。

’！ＡＪｌ　　ムとフローニング 雌のＢａ１ｂ／ｃマウスの肺臓からとったリンパ球を、
フィコール−ハイバーク密度勾配（Ｍ、Ａ、　）＜イオ
プロダクト社、メリーランド州つォーカースヴイル市）
から採取し、ダルベツコ−改変イーグル培地（叶諏）中
５０％のポリエチレングリコール溶液（ＰＥ０１５００
）　（ハイブリドーマサイエンス社製）の１ｍＱで１５
分間Ｐ３−Ｘ−６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞（
ソーク研究所、カリフォルニア州すンディエゴ市）と融
合した。ｓｏｏ　ｘ　ｇで１５分間遠沈して細胞を集め
た。細胞をハイブリドーマ培地（２０％の牛胎児血清、
２ｍＭのグルタミン、１００単位のペニシリン、ストレ
プトマイシン１００単位、１ｍＭのアスパラキン酸ソー
ダ、１４μＨのチミジン１０．１ｍＭのヒポキサンチン
１０．４μＭのアミノプテリンを含む改変イーグル培地
用非必須アミン酸を含むダルベツコ−の改変イーグル培
地）に再懸濁した。細胞忌濁液はフィーダ一層としてウ
ェル当りｌＸｌ０’個の同系の牌細胞を入れた２４ウエ
ル培養プレートに配分した。

ハイブリドーマ・スクリーニング コロニーが見えてきたら、点滴イムノプロット法（ベネ
ット、イエオマン、１９８３年）によって自然の免疫原
と２−メルカプトエタノールで還元した免疫原に対する
反応性についてウェルをスクリーニングした。反応性の
あったハイブリドーマを９６ウエルのマイクロタイター
プレートで制限希釈によってサブクローン化した。単一
のコロニーとなると思われるウェルを、点滴イムノプロ
ット法によって再試験した。再クローン化したハイブリ
ドーマを２４ウエルのプレートにふやし、さらにフィー
ダ一層細胞のないフラスコにふやした。

ハイブリドーマの　殖とモノクローナル　　の精−大量
の抗体を高濃度に作製するために、ハイブリドーマクロ
ーンを次のようにして腹水腫瘍として増殖した。すなわ
ち、約Ｉ　Ｘ　１０’のハイブリドーマ細胞を細胞培養
して収穣し、５Ｘ１０５個の細胞を、１０日前に予めブ
リスタン（テトラメチルペンタデカン）を投与したマウ
スの腹腔に、０．５ｉｌ（ｌの無菌の燐酸塩緩衝化食塩
水と共に１、ρ、投与した。約−週間腫瘍の増殖を行っ
た後マウスの腹腔から１日おきに腹水をｉ、ｐ、採取し
た。腹水からは抗体を遠心分離によって精製した。モノ
クローナル抗体は結合抗原法とヤギの抗マウス抗体法（
ＩｇＧ１　、２ａ　、　２ｂ　、に）とによってＩｇＧ
１．にとタイプが決められた。ＩｇＧ画分は培養上澄か
ら硫安沈殿とＤＥＡＥセファセル・クロマトグラフィー
によって精製した。精製した抗体は分注して使用するま
で一１８°で保存した。

ガンＡ者の血清　のヒトガン打原ｇ６５０のＥＬＩＳＡ
）析ガン患者の血清試料（１μＱと５μＱ）をトリスｔ
１ｍ化生理食ｍ水（ＴＢＳ＝０．０５Ｍ　ト＋Ｊ　スｍ
ｒｊ１１０．１５Ｍ　ＮａＣＱ　／ｐＨ７，４）で２０
０μＱに希釈し、９６ウエルのマイクロタイタープレー
トのウェルに２時間おき結合させた。これと他の全ての
その後のインキュベーションと洗滌は、２５℃で行った
。

ウェルを４回ＴＢＳで洗い、それから３％ウシ血清アル
ブミンと１０％のトリ血清を含むＴＢＳで２時間ブロッ
キングした。ウェルを１回ＴＢＳで洗い、抗ｇｐ６５０
モノクローナル抗体をブロッキング液で１　：　１００
０に希釈して加えた。２時間後。

ウェルを４回ＴＢＳで洗い、２００μρのビオチン化ウ
マ抗マウス抗体（ベクター・ラボラトリーズ）を、１％
ウマ血清を含むブロッキング液で１：１５０に希釈して
ウェルに加えた。１時間後、ウェルを４回ＴＢＳで洗っ
た後、２００μＱのアビジン結合ビオチン化西洋ワサビ
ペルオキシダーゼを、ＴＢＳで１：５００に希釈して加
えた。ウェルを４回ＴＢＳで洗い、次いで０．０５Ｍク
エン酸塩１０゜１Ｍ燐酸塩バッファー（ＰＨ４，０）で
１回洗った。０．０２％過酸化水素と０．１５Ｂ／ｍ　
ＱのＡＢＴＳ試薬を含む０．０５阿クエン酸塩１０．１
Ｍ燐酸塩（ｐｆ＋４．０）中で新たに調製した発色液を
加え、２０分間発色させてＥＬＩＳＡリーダーで測定し
た。試料の反応性は抗体の存在で得られた値から、抗ｇ
ｐ６５０モノクローナル抗体のない状態で分析された臨
床標本で得られるＥＬＩＳＡバックグランドを差引くこ
とによって計算された。Ｓ−３００セフアクリルで精製
した抗原ｇｐ６５０の５０〜５００ｎｇの量で作った標
準曲線から、ヒトのガン抗Ｊ７ｆｇｐ６５０のｎｇ相当
量が計算された：その単位はｎｇ／μΩ相当量として計
算された。

この試料抗体で検１される血清中の含量の高いガンこの
研究により、ヒトガン抗原ｇｐ６５０が消化器ガン、胆
ガン、乳ガン、肺ガン、舌ガン、ファロピアン管ガン、
リンパ腫、多発性ミエローマなどの患者の血清に増加し
ていることを確認した。ヒトの大腸腫瘍から調製された
凍結切片と、ヒトの大腸腫瘍からとった培養細胞中に、
このヒトが抗原ｇｐ６５０が存在することを初期の研究
は示している。正常な人、胆管硬変症の患者及びその他
のタイプのガンの患者では、血清中の抗原量は非常に低
いか検出されないレベルであった。

タニーＬ 陰性の血清□５種の異なる標本、正常標本３、非ガン標
本１．３種のガン標本□ヒトガン抗原ｇｐ６５０の含量
は不検出または低値であった（第３表参照）。

例　　２ バックグランド□抗ｇｐ６５０モノクローナル抗体がな
い条件で、臨床上の血清試料からとったバックグラウン
ドの量はいろいろであった。

未知の物質は第２抗体と、ビオチン化西洋ワサビペルオ
キシダーゼの要素、すなわち、第２抗体ビオチン化西洋
ワサビペルオキシダーゼ検出系の要素に、弱く結合する
ものと思われる。この変異性は第１の抗ｇｐ６５０モノ
クローナル抗体のない条件で得られた値を、存在下で得
られた値から差し引くことで補償された。

ヱー主 抗原の範囲□得られたＥＩＪＳＡの値はＳ−３００で精
製された抗原から調製される標準曲線を基準として、ｎ
ｇ／μＱの抗原単位に換算したものである。この値は前
立腺や食道のガンでのＯから胆ガンの７５までの範囲が
あった。２．５以下の値は、バックグランドまたはそれ
よりわずかに高い程度と判定された。５〜１０の範囲の
値は中程度、１０以上の値は高値とみなされた。

敗−± 消化器ガン以外のガン□消化器ガン患者の血清中の抗原
ｇｐ６５０の量が増加しているのに加えて、乳、肝、肺
、舌、ファロピアン管、ミエローマ、リンパ腫などの患
者からとった血清では、中程度から高いレベルが［１１
９された。子宮ガンの患者の血清ではｇｐ６５０は低値
であった。

前立腺ガンや食道ガンの患者の血清では、抗原ｇｐ６５
０は検出されなかった。

例　　５ 標識□抗体を表示する直接免疫化学的方法は、第１抗体
に次のような１つまたはそれ以上の標識をつけることを
含んでいる。すなわち、Ｌ２Ｓ　Ｉ　、　１３１　Ｉ　
、　１４Ｃ，３Ｈのようなオートラジオグラフィーやラ
ジオシントゲラフイーのための放射性アイソトープ、蛍
光顕微ｍｍ　察のためのフルオレッセイン、ファイコピ
リプロチイン。

テトラメチルローダミンのような蛍光クロモフォア、発
蛍光、吸収、可視色あるいは電子顕微鏡でみる電子濃厚
産物を生成する凝集などで検出するための蛍光物質１発
色物質を生成する酵素、あるいは直接または間接に電子
顕微鏡でみえるようにするためのフェリチン、ペルオキ
シダーゼあるいは金粒子のような電子密度分子などがそ
の標識である。

間接−間接免疫化学的方法には、第２抗体あるいは第１
抗体に特異的な他の結合タンパクを発蛍光色素、電子濃
厚化合物、光、蛍光、電子顕微鏡ａａで検出可能な生成
物を作る酵素あるいはオートラジオグラフィーで検出可
能な放射性アイソトープなどで標識することが含まれる
。

抗体を観察できるようにする間接的免疫化学的方法には
、ハイブリッド第１あるいはハイブリッド第２抗体もし
くは抗体フラグメント（Ｆ（ａｂ’　）２が含まれるが
、そこではハイブリッド抗体標品の一部がヒトのガン抗
ＪＭｇｐ６５０に特異的であるか（ハイブリッド−次抗
体）、−次抗体に特異的であり（ハイブリットニ次抗体
）、一部は前節で述べたような標識に特異的なものであ
る。

参１０Ｆ−ｚｈ 配送のためには、標識抗体または結合あるいは非結合型
の抗体をトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）または他の
緩衝化した懸濁用試薬で包装される、適当な懸濁剤には
グリセリン、ヘパリン、ショ糖などが含まれる。適当な
緩衝液にはバルビタール緩衝液１モルホリン緩衝液、Ｍ
ＯＰＳ−３−（Ｎ−モルホリ）プロパンスルホン酸、へ
ペス（ＨＥｒ’ＥＳ）−Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ−２−エタン−スルホン酸、燐酸塩、炭酸塩
のようなものが含まれる。

かくして本発明はここに述べられた目的を達するために
適用することができ、ここで述べた特徴とこれに内在す
る他の特徴ももっている。

ここには本発明の望ましい内容が示されているが、特許
請求の範囲で規定される発明の思想の範囲内で変更を加
えることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトガン抗原ｇｐ６５０のセファクリルＳ−３
００リクロマトグラフイーを示し、黒く影にした部分が
集められ濃縮された画分に相当する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量が約６５０，０００ダルトンで、８Ｍグアニ
   ジン塩酸塩の存在下で分子量約３００，０００ダルトン
   の分解産物となり、０．０５Ｍトリスの塩酸／０．００
   ５Ｍ　ＭｇＣｌ＿２／０．０２５Ｍ　ＫＣｌ（ｐＨ７．
   ４）の溶液に可溶で、ヒトの腫瘍細胞の原形質液画分に
   専ら存在するという特徴をもつほぼ精製された形のｇｐ
   ６５０と示されるヒト抗原。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の抗原に特異的に免疫
   反応するモノクローナル抗体を産生分泌し、ネズミの脾
   リンパ球とＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細
   胞の融合で作られたネズミのハイブリドーマ。 ３、特許請求の範囲第２項に記載のハイブリドーマから
   作られたモノクローナル抗体。 ４、ｇｐ６５０抗原と特異的に反応することで特徴づけ
   られるモノクローナル抗体。 ５、生体試料にｇｐ６５０に対するモノクローナル抗体
   を結合し、次いで抗原の結合に関してその生体試料を分
   析することを含む生体材料中のｇｐ６５０抗原を検出す
   るための免疫学的分析法。 ６、生体材料がヒトの血清である特許請求の範囲第５項
   に記載の免疫学的分析法。 ７、生体材料が固定したヒトの悪性化細胞である特許請
   求の範囲第５項に記載の免疫学的分析法。 ８、分析手段が光、結合された放射活性、色を形成する
   酵素、蛍光、オートラジオグラフィー、誘導測定、直接
   的結合ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、直接的結合ＲＩＡ
   及び競合ＲＩＡからなる群から選択される特許請求の範
   囲第５項に記載の免疫学的分析法。 ９、ｇｐ６５０抗原に対する特異性によって特徴づけら
   れるモノクローナル抗体、抗体−抗原結合を測定するた
   めの検出手段、ｇｐ６５０の存在の有無を示すために標
   的細胞の外部の材料に使われるときに有効な診断用キッ
   トの上記の要素を含む抗原をｇｐ６５０を検出するのに
   適した診断用キット。 １０、検出手段が光、結合された放射活性、色を形成す
   る酵素、蛍光、オートラジオグラフィー、誘導測定、直
   接的結合ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、直接的結合ＲＩ
   Ａ、競合ＲＩＡからなる群から選択され、標的細胞が血
   清、または固定した悪性化細胞のヒト生体試料であり、
   診断キットがモノクローナル抗体のための第一容器と標
   的細胞をモノクローナル抗体と結合させるための第二容
   器を含んでいる特許請求の範囲第９項に記載の診断キッ
   ト。 １１、診断用キット要素を包装し、保護するための包装
   手段をもった特許請求の範囲第１０項に記載の診断用キ
   ット。 １２、抗原ｇｐ６５０に対するモノクローナル抗体をヒ
   トの生体試料と結合させ、それによってヒトの生体試料
   における抗原の量の増加を示させることを含むガンの免
   疫学的検出のための方法。 １３、ヒトの生体試料がヒトの血清である特許請求の範
   囲第１２項に記載の方法。 １４、ヒトの生体試料が固定したヒトの悪性化細胞であ
   る特許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １５、抗原ｇｐ６５０がカルシノーマ、ザルシノーマ、
   ヘパトーマ、血液細胞新生物からなるガンの種類の一つ
   である特許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １６、抗原を圧力透析濃縮で、次いでセファデックスゲ
   ル排除クロマトグラフィー及びセファクリルＳ−３００
   カラムによる排除クロマトグラフィーにより順次濃縮し
   精製することを含むヒトのガン抗原ｇｐ６５０の精製法
   。 １７、細胞液性抗原がヒトのガン細胞から抽出される特
   許請求の範囲第１６項に記載の方法。 １８、ヒト以外の宿主動物をｇｐ６５０抗原で免疫し、
   そのヒト以外の宿主からハイブリドーマ・クローンを選
   択し、選択されたハイブリドーマ・クローンから、ｇｐ
   ６５０に特異的ハイブリドーマクローンを採取し、採取
   されたハイブリドーマを細胞培養または腹水中で再培養
   し、そして細胞培養または腹水からモノクローナル抗体
   を採取する工程を含むヒトガン患者の血清にみられるｇ
   ｐ６５０に特異的なモノクローナル抗体の調製法。