JPS62501955A

JPS62501955A - ヒト非小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPS62501955A
Application number: JP60505034A
Authority: JP
Inventors: ヘルストーム、インゲゲルド; ブラウン、ジヨセフ　パトリツク; ヘルストーム、カール　エリツク; ホーン、ダイアン; リンスレイ、ペーター
Original assignee: オンコーゲン　リミテッド　パートナーシップ
Priority date: 1984-11-02
Filing date: 1985-10-30
Publication date: 1987-08-06
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: ATE117089T1; DK314586A; FI85814C; DK170619B1; GB2182949A; EP0566066A1; JP2567564B2; GR852622B; YU172185A; GB2182949B; DE3587976D1; DE3587976T2; IL76877A; KR910000903B1; IE852681L; FI862821A; WO1986002735A1; EP0207090A4; NZ214055A; ES8704735A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１７、検知可能な信号を発し得る標識を接合した請求の範囲第３６項のモノクローナル抗体。

１８、標識が螢光素である請求の範囲第３６項のモノクローナル抗体。

１９、請求の範囲第１５項の抗体を発現し得るマウスハイブリドーマ。

２０、請求の範囲第３６項の抗体からなる組成物。

２１、　（ａ）ヒト非小細胞肺癌細胞の細胞表面抗原と結合する抗体を産生するハイブリット連続細胞系（ここで該細胞系は、牌細胞と同じ動物種から誘導された骨髄腫と融合された、該細胞表面抗原で免疫処置された動物牌細胞の細胞ハイブリッドからなり、また該細胞系はＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ＨＢ８６２７の識別特性を有するものである。）、および（ｂ）該細胞系のための培養培地からなる組成物。

２２、ヒト非小細胞肺癌細胞から誘導され、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された場合に約９４．０００の分子量を有する、精製形態におけるタンパク質抗原。

２３．１　５　１０　１５　２０Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−トＲ−Ｌ−Ａ−Ｄ−Ｇ−Ｇ−＾−Ｔ−Ｎ−０−Ｇ−Ｒ−Ｖ −Ｅ−Ｉ−Ｆ−Ｙ−Ｒ−Ｇ−０−Ｗ−Ｇ−Ｔ−Ｖからなるアミノ酸末端配列を有する精製形態におけるタンパク質。

２４、ざらに末端グリコシド残基からなるものである請求の゛範囲第２３項のタンパク質。

２５、末端シアル酸残基を有する請求の範囲第２３項のタンパク質。

２６、末端シアル酸残基および末端アミノ酸配列（α）−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｇ−Ｄ− トＲ−Ｌ−へ−Ｄ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｎ−０を有する約９４，０００に等しい分子量を有する実質的に純粋な糖タンパク質化合物。

２７、さらに、末端アミノ酸配列が、ａ　−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｅ−１−Ｆ−Ｙ−Ｒ−Ｇ−０−Ｗ−Ｇ−丁−■を含むものである請求の範囲第２６項の糖タンパク質化合物。

２８、少なくとも４５，０００単位／ｍ’ｊの比活性（ここで比活性は、競合的結合検定法において、　■標識されたＬ３抗体の結合を５０％まで阻止するのに必要とされる抗原の量と定義される。）を有する請求の範囲第２３項のタンパク質の７０％以上からなる組成物。

２９、少なくとも４５，０００単位／ｍｙの比活性（ここで比活性は、競合的結合検定法において、　■標識されたＬ３抗体の結合を５０％まで阻止するのに必要とされる抗原の量と定義される。）を有する請求の範囲第２３項のタンパク質の９０％以上からなる組成物。

３０、ざらに、分子量７６、　ｏｏｏの抗原のより少ない量からなるものでおる請求の範囲第２８項の抗原。

３１、請求の範囲第２３項のタンパク質からなる正常ヒト血清から精製された組成物であって、少なくとも正常ヒト血清のものの３０００倍で該タンパク質に関する精製因子を有する組成物。

３２、ざらに分子量７６、０００の抗原のより少ない量からなる請求の範囲第３１項の組成物。

３３、請求の範囲第２３項のタンパク質からなる培養癌細胞精製された組成物であって、培養癌細胞のものの少なくとも９０倍で該タンパク質に関する精製因子を有する組成物。

３４、さらに分子ｉ７６．０００の抗原のより少ない量からなる請求の範囲第３３項の組成物。

３５、ヒト非小細胞肺癌細胞から誘導された細胞表面抗原でおって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に゛よって、測定された場合に約１３５，０００の分子量を有する、精製形態におけるタンパク質抗原。

３６、分子量２４，０００および１６，０００のＶ８プロテアーゼ開裂フラグメントでさらに特徴づけられる請求の範囲第３５項のあって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された場合に約７２，０００の分子量を有する、精製形態におけるタンパク質抗原。

３９、請求の範囲第３８項の抗原からなる組成物。

４０、悪性細胞を含むことが予期されるサンプルにおける悪性細胞の検知のための方法であって、該サンプルを請求の範囲第２２項の抗原の存在に関して調べることからなる方法。

４１、サンプルが血清である請求の範囲第４０項の方法。

４２、悪性細胞を含むことが予期されるサンプルにあける悪性細胞の検知のための方法で必って、該サンプルを請求の範囲第２３項の抗原の存在に関して調べることからなる方法。

４３．サンプルが血清である請求の範囲第４２項の方法。

４４、悪性細胞を含むことが予期されるサンプルにおける悪性細胞の検知のための方法であって、該サンプルを請求の範囲第２６項の抗原の存在に関して調べることからなる方法。

浄書（内容に変更なし）明細書ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体および抗原関連出願への相互参照本出願は、１９８４年１１月２日に出願された同時係属出願に係る米国出願筒６６７、５２１号に連続して関連している。この出願に表わされていない前記出願の要旨は、参考としてここに組み入れである。

ヒト肺癌は男性における癌腫による多くの死亡の原因となるものであり、また女性における癌腫死亡の最も頻繁な原因としての乳癌の侵襲の過程である（キャンサー　ファクツ　アンド　フィガーズ、　１９８３年［Ｃａｎｃｅｒ　Ｆａｃｔｓ　ａｎｄＦｉｇｕｒｅｓ、　１９８３］）。この疾患は、４つの主な組織学的タイプ、すなわち類表皮腫（エビデルモイド）（３０％）、腺癌（３５％）、未分化大細胞（１５％）および小細胞（２０％）に分けることができる。肺癌の多くの症例は、化学療法および照射療法によって治癒不可能である。小細胞肺癌は、大きざにおける低減によって化学療法および照射療法に応答するが、全体的な治癒ではない。腫瘍の完全な外科手術的除去が唯一有効な療法であると見なされている。しかしながら、予期せぬことには、肺癌患者の３０％未満が、診断で完全に切除され得る腫瘍を有しており、また肺癌患者の１／３未満が、外科手術的完全除去の後５年間生存している。それゆえ、肺癌のより早期の診断、癌延展の程度のより良好な限定、およびより効果的な療法を可能とする方法に対する大きな必要性が存在する。

モノクローナル抗体は、これらのすべての目的のために用いられ得るものである。しかしながら、必須条件は、正常成人組織においてよりもより肺癌において強く発現される抗原に対する抗体を見出すことである。腫瘍細胞集団の公知の不均質性、同じ抗原におけるいくつかの決定基の存在、治療学的標的と比較した場合における診断マーカーと′してのこれらの好適性に関する抗体間の予期された違い、および同じ抗原に対する異なる抗体の異なる生物学的特性の見地において、いくつかの異なる抗体が必要とされる。

２−光丘五亘りに見肺癌抗原に対するモノクローナル抗体は、シコラら［５ｉｋｏｒａ　ｅｔ　ａｌ、］（ブブリテラシュジャーナル　オブ　キャンプ−（１９８１年）［Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ（１９８１）］第４３巻第６９６〜７００頁）や、カツチタら［Ｃｕｔｔｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、］（プロセス　オブナショナル　アカデミ−サイエンス　アメリカ合衆国（１９８１年）［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　（１９８１）］第７８巻第４５９１〜４５９５頁）や、バーキら［Ｖａｒｋｉ　ｅｔ　ａｌ、］　（キャンサーリサーチ（１９８４年）［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８４）］第４４巻第６８１〜６８１頁）や、ティー、ダブリュー、マンディーら［Ｈｏｎｄｙ、Ｔ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、］（サイエンス（１９８１年）　［Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ　（１９８１）］第２１４巻第１２４６〜１２４８頁）や、ジエー、ディー、ミナら［Ｈｉｎｎａ、Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、］（イン　ヒトｏ　［Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｌ第１７（１２）第１０５８〜１０７０頁（１２−１９８１年））や、エイ、ジエー、ケンネルら［にｅｎｎｅｌ、Ａ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、］（キャンサー　リサーチ［ＣａｎＣｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ］第４１　（９，ＰＴＩ　）第３４６５〜３４７０頁、ケミカル　アブストラクト［Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓｔ、　］第９５（１５）第１３０８５０２）や、エイ、ヒー。

バイリンら［Ｂａｙｌｉｎ、Ａ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、］（プロセス　オブ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　アメリカ合衆国［Ｐｒ０Ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ］第７９巻第４６５０〜４６５４頁（８−１９８２年））や、ティー、エヌ、カーネイら［Ｃａｒｎｅｙ、Ｄ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ、］（パソハイオロシーアニュアル［Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ａｎｎｕａｌ　］　１９８２年第１２第１１５〜１３６頁（１９８２年））や、エイ、エフ、ガズダーら［Ｇａｚｄａｒ、Ａ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ、］（セミナーズ　イン　オンコロジー［Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏ１ｏｇｙｌ第１０巻第３〜１９頁（３−１９８３年））や、エイ、シー、ホリンスヘッドら［Ｈｏ１ｌｉｎｓｈｅａｄ、Ａ、Ｃ０ｅｔ　ａｌ、］（キャンサー　ディテクター　プレベント［ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃ、　Ｐｒｅｖｅｎｔ、　］第６巻第１８５〜１９１頁（１９８３年））や、ジエイ、ティー、マルシャインら［）ｌｕｌｓｈｉｎｅ、Ｊ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、］（ジエイ　イムツール［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　］第１３１（１）第４９７〜５０２頁（１９８３年））ヤ、エル、シー、ヒュアングら団ｕａｎｇ、　Ｌ、　Ｃ，ｅｔａｌ、］　（アーキテクチャ　オブ　バイオケミストリー　アンド　バイオフィジイツクス［Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、コ第２２０（１）第３１８〜３２０頁（１９８３年））や、ニス、サージら［Ｓａｊ　ｉ　。

Ｓ　、　ｅ　ｔ　ａｌ、　］（ハイブリドマ第３（２）第１１９〜１３０頁（１９８４年）、バイオ　アブストラクト［Ｂｉｏ　Ａｂｓｔ、　］第７９００５５６９）や、ケイ、ポスレットら［Ｂｏｓｓｌｅｔ、に、ｅｔ　ａｌ、］　（ベアリング　インストミツト［Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔ、）１ｉｔｔ、］第７４巻第２１〜３４頁（１９８４年）、ケミストリー　アブストラクト［Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓｔ、　］ＣＡ１０１（９）第　７０６６８６）や、エイ、ティー、ローゼンら［ＲＯ３ｅｎ、　Ａ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、］（キャンサー　リサーチ［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ］第４４（５）第２０５２〜２０６１頁（１９８４年）、バイオ　アブストラクト［Ｂｉｏ、　Ａｂｓｔ、］第７９０１４６５８）や、ジー、エヌ、ピー、パン　ハイジエンら［Ｖａｎ　Ｍｕｉｊｅｎ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、］（アマージエイ　パトール［Ａｍｅｒ　Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、］］第１１（３）第３６３〜３６９頁（１９８４年）、バイオ　アブストラクト［Ｂｉｏ　Ａｂｓｔ、　］第７９０２３６０５　）や、ジー、ジエイ、プリンタラ −ら［Ｐｒ１ｎｃｌｅｒ。

Ｇ、Ｊ、ｅｔ　ａｔ、］　（キャンサー　リサーチ［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ］第４２巻第８４３〜８４８頁（３−１９８２年））や、ティー、マザーリックら団ａｚａｕｒｉｃ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、］［キャンサー　リサーチ（ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ］第４２巻第１５０〜１５４頁（１−１９８２年））や、ジエイ、エイ、ブラーツら［Ｂｒａａｔｚ、Ｊ、Ａ、ｅｔ　ａｔ、］　（キャンサーリサーチ［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ］第４２巻第８４９〜８５５頁（３−１９８２年））や、アール、イー、ソポルら［５ｏｂｏｌ、　Ｒ，Ｅ、　ｅｔａｌ、］　（フェト　ブロク［Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　］第４１　（３）第４０９、アブストラクト［Ａｂｓｔ、コ第８１６（４−１９８２））によって述べられている。

あらかじめ定めらむだ特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養が、コーラ− らＥＫ６ｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、］（ネイチャー（１９７５年）　２６５：４９５〜４９７［Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）　２６５：４９５−４９７］）によって述べられている。腫瘍抗体の生産手段は、米国特許第４．１７２．１２４号に述べられている。

発明の概要本発明は、ヒト非−小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の抗原における決定部位を限定する新規な抗原組成物とモノクローナル抗体に関する。“’　Ｎ５ＣＬＣ細胞″なる用語は、類表皮含細胞、腺癌細胞および未分化穴細胞癌細胞を含むものである。決定部位はまた、例えば、乳房の・いくつかの癌などのいくつかの伯の癌の抗原において見い出されることができ、そして、これゆえ本発明の抗体は、これらの他の癌細胞に対しても結合する。これらのモノクローナル抗体は、腫瘍細胞に対するよりも低い度合で正常成人細胞に結合する。゛よ゛り低い度合での結合″ なる用８Ｒは、結合が免疫組織学的技術によって検知することが不可能であろうこと、若しくは、結合が、免疫組織学的技術によって決定されるようにＮ５ＣＬＣ細胞に対して結合するよりも約４から５倍程小さいであろうことを意味する。

このモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマによって分泌される。

本発明はまた、本発明に係るモノクローナル抗体若しくは抗原組成物を用いるいくつかの診断方法にも関係している。このような方法のひとつは、Ｎ５ＣＬＣ細胞の存在の、このような細胞を含んでいるであろうと疑われる検体における、測定を包含するものである。この検体は、モノクローナル抗体と接触させられ、そしてこのことは、この検体において存在し得る他の細胞タイプから、このような細胞を識別できるものである。接触は、抗体のこのような細胞への結合のための条件下で行なわれる。接触の後、検体における抗体のこのような細胞への結合の存在あるいは不在が測定される。この結合は、検体におけるＮ５ＣＬＣ１Ｂ胞の存在あるいは不在に関連するものである。一般に、検体は、モノクローナル抗体に関する標識された特異的結合パートナ−と接触させられる。この標識は、検知可能な信号を発し得るものである。

特定の実施態様の詳述本発明は、精製形態におけるある新規な抗原、またヒトＮ５ＣＬＣ細胞上のこのような抗原に特異的な抗体ならびにこのような抗体の機能的等何体、結合フラグメントおよび免疫複合体、ざらにこのような抗体を用いるある診断方法に関するものである。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、コーラ−とミルスティン（上記）の標準的技術によって製造され得る。例えば、複数の滲出液からのヒト肺癌細胞あるいはヒト非小細胞肺癌からの培養細胞、または正常胎児肺からの細胞が免疫原として用いられる。これらの細胞はマウス中へ注入され、十分な時間の後、マウスは屠殺されそして牌細胞が得られる。所望される免疫グロブリンに関しコード化する牌細胞染色体は、該牌細胞を、骨髄腫細胞とあるいはリンパ腫細胞と、通常ポリエチレングリコールの存在下において、融合することによって不滅化される。融合されたハイブリドーマを含む得られた細胞は、ＨＡＴ培地などのごとき選択培地において増殖させられ、そして生存細胞がこのような培地において限界希釈条件を用いて増殖される。細胞は、例えば微小力価ウェル（窪み）［ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｅｌｌ］などのような適当な容器中にて増殖され、そして上澄み液が所望の特異性を有するモノクローナル抗体に関してスクリーニングされた。

モノクローナル抗体の収率を高めるために種々の技術が存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け入れる哺乳動物宿主の腹腔内ヘハイブリドーマ細胞を注入し、そして腹水を収穫するといったようなことがある。腹水中に十分な量のモノクローナル抗体が集められない場合、該抗体は宿主の血液から収穫される。種々の周知の方法が、モノクローナル抗体を他のタンパク質あるいは他の不純物から遊離するための、モノクローナル抗体の単離および精製に関して存在する（コーラ− とミルスティン、上記、を参照のこと。）本発明のこのようなモノクローナル抗体の１つは、Ｌ３と呼称される新規なモノクローナル抗体で例示される。このモノクローナル抗体は、ヒトＮ５ＣＬＣ細胞、すなわち悪性細胞のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）による分子量が７６、０００の特性を有する細胞関連抗原における決定部位、およびＮ５ＣＬＣ細胞により培養培地中へ分泌されたタンパク質抗原（形態■、■および■抗原）における決定部位を限定する。この抗体はＩｇＧ１イソタイプである。このＬ３抗体は、Ｌ３マウスハイブリドーマによって産生される。

形ＬＳＩのし３抗原は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド−次元ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、９４．０００の分子量を有するものである。形態■のＬ３の抗原は５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、７６．０００の分子量を有しまた形態■のし３抗原は５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２６．０００の分子量を有する。

形態■のＬ３抗原は、培養培地からアフィニティークロマトグラフィーによって９倍に精製され得（第１表）、そしてアフィニティークロマトグラフィーは、糖タンパク質の１つである形態■のＬ３抗原をそれぞれ７０％および９０％より以上含む組成物を与えるためのアクリルアミドゲル技術に続かれる。アフィニティークロマトグラフィー精製から得られた組成物は、培養培地に関する５２２単位／ｍｇに比較される４６，５００単位／■の比活性［５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙｌを有している。この比活性は、Ｃａ１ｕ　−１細胞のフォルマリン固定化単層を用いる競合的結合検定において、１２５■標識されたし３抗体の結合を５０％まで阻止するのに必要とされる抗原の量として定義される。アフィニティークロマトグラフィーにより培養培地から得られた組成物は、形態工の抗原を７０％以上含み、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥで約５０．０００〜２００．０００の間の分子量の非特異的タンパク質物質である３０％未満の多くの部分は、より少ない量である約１０〜２０％の形態■の抗原を含むものである。組成物中には、微量の形態■の抗原がまた存在する。

Ｌ３抗原の細胞および細胞外形態の間の関係を決定するために、細胞は３５Ｓメチオニンで放射性標識され、そしてパルス追跡実験が行なわれた。細胞は１時間の間３５Ｓメチオニンでパルス標識され、標識されていないメチオニンを含む培地中へ種々の時間置かれ、そして免疫沈降分析がなされた。最初に、すべての特異的免疫沈降可能細胞結合放射能が分子は７６、０００タンパク質において見出された。

観察された他の標識されたタンパク質はまた、また抗体が除かれたサンプルにおいても見出された。追跡期間の間、分子量７６、０００の形態における放射能は、減少し、一方、培地中へ放出された形態（ＨＷ９４，０００）において見出された放射能は増加した。細胞結合形態における放射能は、放出された形態において表われた放射能と同様の動力学を有して消よって約１．５時間であると測定された。これらの結果は、抗原の細胞結合した分子量７６、０００形態が、分子量９４，０００の形態の先駆体（形態ＩのＬ３抗原）であることを提唱するものである。

このＬ３抗原が糖タンパク質であるゆえに、炭水化物変性は、細胞からの放出の間の観察されたＬ３抗原のサイズにおける明白な増加に関して想像される説明となるであろう。この可能性は、該分子の細胞形態および放出された形態を含む免疫沈降物を公知の特異性のグリコシダーゼで処理することにより調べられた。細胞結合し３抗原のサイズは、分子量５９．０００に、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ　Ｈ）での処理によって低減されたが、ノイラミニダーゼによっては影響されず、このことは、それがト架橋高マンノースオリゴ糖を含んでいることを示すものであった（クレソチンら、　１９７４年　ジエイ、パイオル、ケム、、ユ鯵：８１１〜８１７［丁ａｒｅｎｔｉｎｏ、１９７４．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４９：８１１−８１７］を参照のこと）。この結果は、成熟が、Ｎ−架橋グリコシル化の公知の阻止剤である、タニカマイシンに感応性である発見と一致する（レホルら、　１９７６年　エフイービーニス　レターズ。

７１：１Ｂ７〜１７０［Ｌｅｈｌｅ、ｅｔ　ａｌ、、１９７６、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　７１：１Ｂ？−１７０］）。これに対して、放出された抗原は、ＥｎｄｏＨ耐性であるが、ノイラミニダーゼ処理によって分子１ａｏ、ｏｏｏにサイズにおいて低減され、このことは形態■の１３抗原における末端シアル酸残基の存在を示すものである。これゆえ、細胞結合形態から放出形態へのＬ３抗原の転化はＮ−架橋炭水化物側鎖の成熟によって達成される。

、形態■のＬ３抗原のアミノ酸末端配列は、アフィニティークロマトグラフィーおよびアクリルアミドゲル分離技術の組合せにより精製された組成物において、周知の技術を用いて決定された。この配列（α）は、以下の通りであった。

Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−）１−Ｒ−Ｌ−Ａ−０−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ、Ｎ−Ｑそしてさらに以下のように定義された。

ａ　−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｅ−１−Ｆ−Ｙ−Ｒ−Ｇ−Ｑ−Ｗ−Ｇ−Ｔ−Ｖアミノ酸に関する上記１文字記号は、■＝バリン、Ｎ＝アスパラギン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｇ＝ニブリシンＨ＝メチオニン、トアルギニン、［＝ロイシン、静アラニン、Ｔ＝トレオニン、Ｑ・グルタミン、Ｅ・グルタミン酸、Ｉ＝イソロイシン、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｙ・チロシンおよび―＝ニトリブトファンあるこれらの周知の意味を有する。上記は、形態■のし３抗原が存在しようがしまいが、形態工の１３抗原を含有する組成物に関する単一配列として得られる。

Ｌ３抗原の上記の３０のＮ−末端アミノ酸配列の、ザ　ナショナル　バイオケミカル　リサーチ　ファウンデーション　プロティン　バンク［ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＢｉＯＣｈｅｍｉＣａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｋｌ（１９８５年３月出り）において存在するタンパク質配列との比較は、顕著な相同を何ら表わさなかった。形態工の１３抗原の配列はまた、ヒトＣ１−エステラーゼ　インヒビターおよびヒトα−２−チオールプロテイナーゼ　インヒビターを含む、現在このデータベースに列挙されていない、いくつかの血清タンパク質のものと比較された。これらの配列のいずれも形態 ■のＬ３抗原のＮ−末端配列と何ら顕著な相同を表わすものではなかった。

我々は、形態工のＬ３抗原が正常ヒト血清中に存在し、そして血清から形態■のＬ３抗原が精製されることを確定した。血清からの該Ｌ３抗原の特性が第３表に概要される。

形態王のＬ３抗原は、３９％の収率を有して正常ヒト血清から３０ＧＯ倍容以上で精製され得る（第２表）。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる精製物質の分析は、主要成分が、培養培地から精製された形態■および形態■成分（いずれの形態も最初の血清サンプルの主要成分ではない。）で共遊走したタンパク質であることを明らかにした。血清からの形態工および形態■のＬ３抗原の双方が、おそらくグリコジル化相違に帰因するミクロ異質性を示す、起源ゲルにおいて２つの別個な成分に分解されることは、注目すべきことでおる。双方の形態とも、イムノブロッティング［ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ１分析に続いて、また散開性ヨウ素化および免疫沈降の後に反応的である。培養培地から精製された抗原での場合、免疫沈降の後に、さらに別の形態である分子量２６，０００　（、形態■のＬ３抗原）が検知される。イムノアフィニティー（免疫親和性）クロマトグラフィーによって得られた組成物は、形態工のし３抗原を５０重量％より多く含み、残部物質は、形態■のＬ３抗原、トランスフェリンおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥで約５０．０００〜２００．０００の分子量の非特異的タンパク質からなる。この組成物は、正常ヒト血清に関する１３．３単位／ｍ３と比較される４５，５００単位／ｍＦｌの比活性を有する。

これらの結果は、Ｌ３抗原活性が、培養培地および血清の双方において見出された２つの成分（形態■および形態■）において発現されることを示している。適当な５ＤＳ−ＰＡＧＥによる血清からの形態■のＬ３抗原のざらに精製は、９０重量％より多いレベルで形態王のＬ３抗原を卓越して含有し、不定微量の形態■ 抗原と、トランスフェリンおよび約５０．０００〜２００．０００の分子量の非特異的タンパク質である残余物質を含むものである。

二次元等電点電気泳動−３ＤＳ−ＰＡＧＥにより血清および培養培地の双方から精製される、■標識され免疫沈降された抗原が比較された。双方の抗原の二次元移動度はきわめて類似しており、４．２〜５，０のｌ）Ｈ範囲で異質様として遊走する形態■および形態■成分を有していた。双方の源からの形態■の１３抗原はまた、５．８および６．２の概算１）ｌ−１値で遊走する２つのより小さい成分を示す。双方の抗原の炭水化物組成は、またグリコシダーゼ感応性に関して試験することによって調べられた。双方の源からの形態工および形態■のＬ３抗原は、Ｅｎｄｏｌ−１耐性でおり、一方双方のノイラミニダーゼ処理は、代射的標識された抗原の処理に続き見られる特徴的な分子！８０，０００のフラグメントの出現をもたらすものであることが見出された。形態■抗原のノイラミニダーゼ感受性は、これがＬ３抗原の分子量７６、０００の細胞結合形態とは異なるものであることを示すものである。

双方の分子が構造的に同様であることを確認するために、我々は、双方の形態からの形態１分子をタレベランドら。

（１９７７年）ジエイ、パイオル、ケム、、−ζ区：１１０２〜１１０６［ＣＩｅｖｅｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７７）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５２：１１０２−１１０６］によって述べられるような一連の部分プロテアーゼ開裂反応にかけられた。培養培地および血清の双方から精製された、放射標識化形態工抗原が、調製の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り取られ、そしてＶ８プロテアーゼとフィンガープリントされた。双方の分子は同一の部分開裂パターンを生じ、少なくとも５つの制限的部分開裂生成物が、双方の場合において観察される（分子量＝７６．０００．４９，０００゜３１．０００．２０，０００および１４，３００）。これらの結果は、培養培地およびヒト血清から精製されたし３抗原がかなり関連おるものであることを示すものである。

我々は次に、血清からの１３抗原の３つの形態の間の関係を研究した。形態■および形態■に関するすべてのフィンガープリントは、形態■分子が形態王分子から誘導される分子１３１，０００ａよび分子量１４，３００のフラグメントを生じないものであるが、極めて類似しているものである。このパターンは形態■および形態■の分子が極めて関連のめるものであることを暗示するものである。形態■抗原は、血清中に見られるより大きな抗原性形態と分子Ｍ１ｄ、３００の部分開裂生成物を共有し、このことは、形態■抗原も、形態■抗原に構造的に関連することを示すものである。種々の形態の間の構造において極めて類似することは、形態■および■分子が形態■から誘導されることを暗示するものである。

［３抗原が、肺の癌以外の腫瘍タイプの抗原性成分として過去に述べられたかどうかを決めるために、流出あるいは分泌された腫瘍関連抗原に関するコンピータ −に援助された文献サーチが行なわれた。

我々は、［３抗原と同様のサイズでかつ炭水化物組成物でおる、黒色腫分泌タンパク質抗原のいくつかの報告（ナタリら（１９８２年）、キャンサー　レス、４２：５Ｂ３〜５８９；ブモールら、（１９８２年）ハイブリドーマ１：２８３〜２９２；およびウィルソンら、（１９８１年）、インド、ジェイ、キャンＷｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８１）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２８：２９３ −３００１）を発見した。

少量の前記モノクローナル抗体［４６５，１２５：前記ナタリら（Ｎａｔａｌｉ　ｅｔ　ａｌ、）］は、色素細胞腫会合抗原に関する第１回国際会式（Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　ＭｅｌａｎｏｍａＡｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ）の出席者を通じて入手できる。本発明者らは、遂次免疫沈降実験に使用してＬ３抗原と抗体４６５、１２５により確認された抗原との間を確認する試験を行なった。両抗体は、特に３５３−メチオニンで代謝的に標識された細胞の培養培地からＭｒ　９４，０００タンパク質を沈降させる。免疫沈降法によるＬ３または４６５．１２５抗原用の培養培地の欠失は、別の抗原の抗原活性の随伴欠失を生起する。

これは、両抗体により確認された抗原決定因子が同−分子上で運搬されることを示す（第３表）。しかしながら、この二つの抗体により確認されたエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）は、１２５Ｉ−１３抗体の結合用の抗体４６５．１２５の競合を検出できなかったので明らかに異なる。

Ｌ５と命名されている本発明の他の抗体は、ヒトＮ５ＣＬＣ細胞に特有な細胞表面タンパク質抗原上に決定因子部位を決定する。上記方法および１２５Ｉ標識法により決定されたように、該タンパク質の分子量は、約１３５，０００ドルトンである。この抗原はＩＧＭクラスのものである。該Ｌ５抗体は、主要器官の線維細胞類、内皮細胞類および上皮細胞−類のような正常な細胞とは検出可能に結合しない。該Ｌ５抗体は、Ｌ５　マウスバイア　１，１　ト−？　（Ｌ５　ｍｕｒｉｎｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）から産生きれる。Ｌ５抗体は、クリーブランドらがジャーナル、オブ、バイオロジカル、ケミストリー第２２５＠第１１０２〜１１０６号［ＣＩｅｖｅｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９７７）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５２：１１０２−１１０６］に記載している方法に示されているように、Ｍｒ　２４，０００および１６，０００の二つの特徴的な■８プロテアーゼフラグメントを有している。したがって、Ｌ５抗原は、同様な分子量の他の抗原からは区別される。

本発明の他のモノクローナル抗体は、１１８と命名され、かつヒトＮ５ＣＬＣ細胞に特有な他の細胞表面タンパク質抗原上に決定因子個所を決定する。このタンパク質の分子量は、前記両方法とで決定して約７２，０００ダルトンである。該抗体は、ＨＧ１アイソタイプのものである。この１１８抗体は、若干の正常細胞、特に牌臓よりも弱い程度に結合する。

また、本発明の範囲内には、Ｆａ　ｂ、　Ｆ　（ａｂ’　）２、Ｆｖフラグメント等の前記モノクローナル抗体の有用な結合フラグメントも含まれる。この抗体フラグメントは、常法により得られる。例えば、有用な結合フラグメントは、パパインまたはペプシンを用、いる抗体のペプチダーゼ分解により産生される。この用語によれば有用な結合フラグメントは、該フラグメントがその同一起源抗原（ｃｏｇｎａｔｅａｎｔ　ｉｇｅｎ）上の結合個所のための抗体と競合することを意味する。

本発明の新規な抗体の上記の特定の実施例群は、それぞれの抗原上の特異的決定部位に結合するおよびマウス源からの特異なりラスおよびイソタイプのものである抗体を目的とするものであるが、これは何ら限定を意味するものではない。上記抗体類、ならびにマウス源、ヒトを含むその他の哺乳動物源もしくは他の源またはこれらの組合せのいずれかからの上記抗体類と機能的等優性を有する抗体類が、本発明において、このようなりラス内のイソタイプを含めてＩＱ　Ｍ、ＩＱ　ＡＳ　Ｈｌ　Ｅ等のごとき他のクラスのものも同様に用いられ得る。“機能的等価性″なる用語は、抗体が上記に述べた決定部位に結合することができ、そしてこのような部位に関して本発明の特定の抗体と競合し得ることを意味する。すなわち、このような抗体は、このような決定部位を有する細胞もしくは細胞フラグメントまたは分泌された抗原を含有する検体と組合せられた場合に、このような決定部位に結合し、そしてこのような部位への結合から本発明の抗体を阻害するものであろう。

本発明の一方法は、肺組織において悪性状態の存在を測定することを含むものである。「悪性状態」なる用語は、がん（腫）　（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を同時に含む形成異常（ｄｙｓｐｌａｓｔｉ）゛の、新生物形成（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の悪性のまたは腫瘍性（ｔｕｍａｒ）細胞等の存在を表わす。この検体は、本発明のモノクローナル抗体と接触されるかあるいは結合される。接触は抗体の悪性細胞への結合のための条件下で行なわれる。接触の後、検体における悪性細胞への抗体の結合の存在が観察される。すなわち、検体は、抗体と抗原部位との免疫複合体に関して調べられる。この免疫複合体形成は、検体における悪性細胞の存在に関するものである。

本発明による方法の特定の実施例（説明のために挙げられるもので本発明を限定するものではない。）は、切除細胞における腫瘍細胞の検知方法である。上記方法は、腫瘍の除去の後に得られた腫瘍の一切片である検体に対して適用される。

切除される腫瘍は、切片を得るために処理され、この処理は、切除直後に、通常の冷凍である、腫瘍もしくは組織を冷凍することを最初に含むものである。組織の冷凍層は、次に、例えば低温槽を用いて、切片へと切断される。

上記のようにして得られた腫瘍の切片は、本発明のモノクローナル抗体と接触させられ、そして次に検知可能な標識で標識された、上記モノクローナル抗体に対して指向し切除された検体、例えば腫瘍の切片は、第１のモノクローナル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条件下で接触させられる。インキ１ベーシヨンは、例えばガラス製ペトリ皿のような適当な容器において、約２０〜３０℃ の温度で約１５〜３０分間の間、例えば少量のアジ酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような水性培地中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、通常検知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の決定ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能な数を提供するのに十分なものである。

インキュベーションに続き、切片は、非特異的に結合した抗体を低減ないし消去するために洗浄され、そして次に、抗原部位を保持する検体の細胞へのモノクローナル抗体の結合によるものである上記の複合体を観察するために調べのである。従って、結合は、例えば、検体を該モノクローナル抗体に関する標識された特異的結合パートナ−と接触させることによって測定される。標識は検知可能な信号を発し得るものであり、放射性標識、例えば蛍光体などのような発色団、酵素などでめり得る。

上記のアプローチを用いる技術の一例は、免疫蛍光染色法である。この技術において、腫瘍の冷凍切片は、アセトンを用いてガラス製スライド上に固定され、そして例えばベトリ皿にて、モノクローナル抗体とインキュベートされる。例えばリン酸緩衝食塩水などのような適当な緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿上に移され、そして例えば、用いられたモノクローナル抗体に関して特異的な標識化抗体であり得る、モノクローナル抗体に関する標識された特異的結合パートナ−と接触させられる。はとんどの場合において、モノクローナル抗体はマウス源由来のものであるので、モノクローナル抗体に関し特異的な標識された抗マウス免疫グロブリンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当な宿主をマウス抗体で注射し、十分な時間をあき、そして注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリンを収獲することによる標準的技術により産生され得る。

該スライドの、例えば水性緩衝液を用いての二度目の洗浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およびカバーグラスで覆われ、そして次に該切片に対するモノクローナル抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で調べられた。結合の測定はまた、検体中でこのような結合の位置の識別をも含むものである。

検体へのモノクローナル抗体の結合はまた、放射性物質、染料および蛍光体を含む発色団、あるいは酵素などのような検知可能な信号を発し得る標識に共有結合されたモノクローナル抗体を用いることによって測定され得る。抗体当りの用（くられた標識の数は、標識された抗体が用いられる診断方法の必要条件および抗体へ標識を結合するための部位の有効性によって通常決定される。

抗体および抗体フラグメントへ標識を結合させるだめの方法は当分野において周知のものである。このような方法は、米国特許第４，２２０，４５０号、第４，２３５，８６９号、第３，９３５゜０７４号および第３，９９６，３４５号中に見い出される。

本発明のモノクローナル抗体が用いられ得る技術の他の例は、血漿および血清を含む意味での体液中におけるＬ　ｅ　Ｘおよび１−６Ｖ決定基を負う分子の検知である。この目的のため、本発明の抗体は、単独であるいは別の決定基に対して指向する他の抗体と共に用いられ得る。

本発明のモノクローナル抗体が用いられる技術のざらに　・別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識［ＩｍｍｔＪｎＯｐｅｒＯＸ　１ｄａｓｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇｌ　（ガリギュースら、インターナショナルより変更されたようなステロンベーガー、イムノサイトケミストリー、ジョン　ウィリー　アンド　サンズ、ニューヨーク、　１９７９年、第１０４〜１０９頁［Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７９．ｐｐ１０４−１６９ａｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂｙ　Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ（１９８２）２９：５１１−５１５］）である。試験されるべき組織は、ガラス製スライドなどのような支持体上にアセトンなどのような適当な溶媒を用いて固定される。次に、組織は、モノクロ−少ル抗体とインキュベートされ、そして洗浄されて結合していない抗体が除かれる。次に組織はウサギ抗マウスＨＩＧとインキュベートされ、結合していない抗体を除去するために洗浄され、マウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体と組合され、結合していない接合体を除去するために洗浄し、そして次に酵素に関する基質で処理された。この処理に続き、該スライドは、検知可能な信号に関して調べられた。

本発明の抗体は、だ液のような肺からの剥脱性細胞検体における悪性状態の存在を測定する方法に用いられ得る。

“剥脱性゛なる用語は、検体が、１ａ織の表面をこするあるいは洗浄することによって得られた単離細胞おるいは細胞の凝集物（それらの細胞は個々に、あるいは隣屑ないしは板状において除去される。）からなるものであることを意味するものである。剥脱性細胞検体は、生検によって得られたもののような、切除された組織から識別されるべきである。検体と抗体との間の接触は、抗原部位への抗体の結合のための条件下で行なわれる。接触の後、抗原部位への抗体の結合の存在あるいは不在が測定され、そしてこれは肺における悪性状態の存在に関するものである。

肺における悪性の存在を測定するために、痰試料は、この方法において使用される剥脱性細胞検体を与える。この方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口を含む胃腸路などからの剥脱性細胞検体における悪性状態の検知において利用性を見出すものである。

剥脱性細胞検体は次に、抗原−抗体複合体を形成するために、検体の特異的抗原部位への抗体の結合のための条件下で前述の抗体と接触させられた。この抗原部位は、検体における細胞あるいは細胞フラグメント上に存在され得る。

一般に、検体は例えば通常ガラスあるいはその他の適当な物質からなるスライドのような適当な支持体上へ載置される。剥脱性細胞検体は、通常、スライドの表面上に検体の薄層を与えるようにスライド上で塗抹される。抗体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝化培地中にて行なわれる。

用いられる緩衝液は、リン酸塩、トリス、重炭酸塩などを含む。ｐｔ−＋は、検体および抗体の状態に関係するものであって、通常５〜８の範囲内にある。水性培地は、約Ｏ〜４０％の量の有機極性溶媒をざらに含んでいてもよい。有機極性溶媒は水溶性であり、通常約１〜１０個の炭素原子と約１〜４個の酸素原子を有している。抗体は、水性培地中に約１〜１００μ９／ｄ、好ましくは約１０〜２０μｇ／ｄの濃度で存在する。検体の抗体との接触の間の温度は、約４〜４０℃ 、好ましくは１０〜３０℃である。接触の期間は、通常約１５〜１２０分、好ましくは約３０〜６０分間である。

検体と抗体との間の接触の後、支持体は通常未反応抗体を除去するために処理される。通常、これは支持体を水性の、通常緩衝化された、培地で洗浄することによりなされる。

次に、検体における抗原部位へ結合した抗体（ここでこの結合は、該位置での悪性状態の存在に関するものである。

）の存在が観察される。すなわち、検体は、形成された抗原−抗体（免疫）複合体の数を測定するために調べられる。

いくつかの例においては、問題の抗原部位の極めて少ない数が、剥脱性細胞検体において見い出され得ることに注意すべきである。しかしながら、悪性状態においては、多数の抗原部位が存在し、この後者の状態は、多数の抗原−抗体複合体が、悪性状態が存在している場合には計測可能であるゆえに、この方法により、非悪性状態以上に容易に識別できる。結合の存在の測定を行なうために、検知可能な信号を発する手段が、検定系に組入れられる。例えば、検定において用いられた抗体を検知可能な信号を発し得る標識へ結合させることができる。標識は、放射性物質、染料および蛍光体を含む発色団、酵素あるいは同様のものであり得る。抗体に対して用いられる標識の数は、方法の必要条件および抗体へ標識を結合させるための部位の有効性によって通常決定される。

あるいはまた、洗浄されたスライドを、例えば用いられた抗体に対して特異的な標識された抗体であり得る、抗体に対する標識された特異的結合パートナ−と接触させることも可能である。モノクローナル抗体がマウス源由来のものである場合には、該方法において用いられた抗体に対して特異性の標識された抗マウス免疫グロブリンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当な宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当な時間をおき、そして注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリンを収穫することによる標準的技術によって産生され得る。抗体に対する標識された特異的結合パートナ−が用いられる場合、スライドは、該スライドを蛍光に関して調べる前に再度、水性培地で洗浄されなければならない。

蛍光体標識が用いられる場合において抗体と細胞検体との間の結合の存在を測定するために、スライドは、通常は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べられる。蛍光体以外の標識が用いられる場合には、スライドないし検体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べられる。

上記の説明は、免疫蛍光検査技術における本発明の抗体使用に主として注がれたものである。しかしながら本発明の抗体は、抗原−抗体反応を含むほとんどの検定法において用いられることができるものである。該検定法群は、均質性［ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　］でも不均質性［ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓコでもよい。均質性検定方法においては、検体は、血清、尿および同様なもののごとき生物学的流体であり得、または、検体は溶解されそして屑を除去するために清澄化され得る。例えば、抗体Ｌ３が、がん患者からの血清中の同起源抗原（ｃｏｇｎａｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）　、すなわち■型、■型または■型のＬ３抗原の濃度を測定するために本発明者らにより用いられ、あるがん患者は、通常の対照と比較してこの抗原より高いレベルを持つべきであることが見出された。免疫学的反応は、通常特異的抗体、標識された被分析物および関心の試料を含むものである。

標識から生じる信号が、抗体の標識された被分析物への結合において直接的にあるいは間゛接的に変化される。免疫学的反応およびその程度検知の双方が、均質溶液において行なわれる。用いられ得る免疫化学標識は、フリーラジカル類、蛍光染料類、酵素類、バタテリオフ？−ジ類、補酵素類などが含まれる。

不均質性検定方法においては、試薬は、通常、検体、特異性抗体、および検知可能な信号を発するための手段である。検体はプレートあるいはスライドなどのような支持体上に通常載置され、そして液相中で抗体と接触させられる。

支持体は次に液相から分離され、支持体相あるいは液相のいずれかが、検知可能な信号に関して、このような信号を発する手段を用いて調べられる。この信号は、検体における被分析物の存在に関するものである。検知可能な信号を発する手段は、放射性標識類、蛍光体類、酵素類などの使用を含むものである。不均質性免疫検定法の例としては、放射性標識免疫検定法（ラジオイムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素結合免疫学的検定法などが含まれる。

上記の免疫学的検定技術の詳細な論議に関しては、ニドワード　テイーマギオ［Ｅｄｗａｒｄ　Ｔ、Ｍａｇｇｉｏｌ（シーアールシー　プレス　インコーポレーテッド、ボカ　ラドン。

フロツク、　１９８０年［ＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ。

１９８０１）による“エンザイムーイムノアッセイ（［ｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙドを参照のこと。例えば、米国特許第３．６９０゜８３４号、第３．７９１．９３２号、第３，８１７，８３７号、第３．８５０．５７８号、第３．８５３．９８７号、第３，８６７．５１７号、第３，９０１，６５４号、第３．９３．５．０７４号、第３．９８４．５３３号、第３．９９６．３４５号および第４．０９８．８７６号（この列挙は、余す所なく掲げることを意図するものではない。）もまた参照のこと。

本発明の抗体はまた、ジエイ、ナクル、メト、（１９８３年）２４：１２３〜１２９［Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｈｅｄ、（１９８３）　２４：１２３−１２９１中におよびジャーナル　オブ　クリニカル　インベスティゲーション（１９８３年＞　７２　：　２１０１〜２１１４［Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　（１９８３）　７２−：２１０１−２１１４１中に悪性骨髄腫に関して述べられたものと同様な方法において、Ｎ５ＣＬＣを保持するヒト患者での転移性沈積物を画像とするために用いられ得る。抗体またはそのフラグメントは、放射性標識され、そして患者へ静脈内的に投与され、その後該患者は例えばガンマ線カメラなどを用いて画像とされる。

本発明はまた、上記に述べた方法を実施するための診断キットを含むものである。１つの実施態様においては、診断キットハ、パッケージされた組合（ｐａｃｋａｇｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉ。

ｎ）で（ａ）上記により詳細に定義されたモノクローナル抗体および（１））上記モノクローナル抗体に対する特異結合パートナ−と検知可能な信号を発し得る標識との接合体からなる。この試薬はまた、このような方法を行なうのに必要なようにｌｉ化剤、および例えば、ポリサッカライド類のようなタンパク質安定化剤などのごとき補助的作用物質をも含み得る。この診断キットはざらにまた、必要に応じて、該標識が一構成成分である信号発生系の他の構成成分、試験におけるバックグラウンド干渉を低減するための作用物質、対照試薬、試験を行なうための装置などを含み得るものでおる。他の実施態様においては、診断キットは、本発明のモノクローナル抗体と検知可能な信号を発し得る標識との接合体からなるものである。上記したような補助的作用物質はまた存在し得る。

本発明の抗体は、治療学的に用いられ得る。固有の生物学的特性を有する抗体は、直接治療剤として°有用である。

また、抗体は、免疫毒素を形成するために毒素へ、また放射線製薬的または製薬的に形成するために放射性物質または薬剤へ結合され得る。抗体の免疫毒素あるいは放射線製薬品を製造する方法は、周知で市る（例えばキャンサートリートメント　レポーツ（１９８４年）　６８：３１７〜３２８［ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８４）　６８：３１７−３２８３を参照のこと。）。

本発明のモノクローナル抗体の他の治療的用途は、免疫源として本発明のモノクローナル抗体の１つを使用することにより産生される抗イデイオタイプ抗体での患者免疫処置である。このような免疫処置は、能動的抗腫瘍活性をもたらし得る（例えば、ネポムら、プロシーディング　オブザ　ナショナル　アカデミ−オド　サイエンシズ　オブザ　ユナイテッド　ステート　オブ　アメリカ（１９８４年）８１　：　２８６４〜２８６７［Ｎｅｐｏｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

（１９８４）即：２８６４−２８６７　］を参照のこと。）。同様のアプローチにおいて、患者は、それぞれの抗体の精製形態あるいは変性形態におけるそれぞれの抗体で免疫化され得る。

特に、本発明の興味ある観点は、本発明のＬ３抗体は、他の抗体と組合わせて使用され得る。この組合わせは、前゛記肺癌の少なくともタイプ、特に未分化細胞肺癌を検出することにおいて有効である。例えば、（１９８４年１１月２日に出願された米国特許出願番号６６７、５２１に開示されている）モノクローナル抗体Ｌ３およびＬｉ２は、有効量、すなわち前記肺癌の全てを検出し得る組合わせを与える量だけ組合わされる。

本発明のモノクローナル抗体のいくつかはまた、乳癌および陰門の表皮細胞癌のようなその他の癌に関連す′る抗原における決定部位を限定する。従って、本発明の抗体は、このような癌に対して指向する診断的あるいは治療的製品における使用を見い出し得るものである。

実施例本発明は以下に例示される実施例によってざらに説明される。使用される多数の方法がまず最初に述べられる。

林■ 培養培地はジブコ［Ｇ　ｉ　ｂｃｏ　］のものを使用した。ウシ胎児の血清はジブコまたはハイクロン［Ｈｙｃｌｏｎｅｌのものを使用した。テフロンで被覆された多数のウェルの顕微鏡用のスライド（１２ウエル）はメロイ［ＭｅｌＯＶ］のものを使用した。

プラスチック製の培養器はコニニング［Ｃｏｒｎｉｎ（］］または］］コスターｏ５ｔａｒｌのものを使用した。ｖ８プロテアーゼおよびウシ血清アルブミンはシグマ［Ｓｉｇｍａｌのものを使用した。

ノイラミニダーゼおよびパンソルビン［Ｐａｎ５Ｏｒｂ　ｉ　ｎｌ　（フォルマリン固定したスタフィロコッカス・アウレウス（ｓ、　ａｕｒｅｕＳ））はカルバイオケム［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍｌのものを使用した。エンドグリコシダーゼＨはマイルズ団１１ｅｓ］のものを使用した。ニトロセルロース（Ｂへ８５．０．４５μ）はシ１ライヒャー［５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒｌおよびシュウエル［５ｃｈｕｅ　ｌ　Ｉ　］のものを使用した。プロティン△−セファＦロース［５ｅｐｈａｒｏｓｅｌ　、ＣＮ　Ｂ　ｒ活性化され“たセファ０−ス４Ｂ、セファデックス［５ｅｐｈａｄｅｘｌＧ−１０，ＤＥＡＥセファセル［５ｅｐｈａｃｅ　ｌ　１ｃｔｊよヒフロチインＡ結合したセファロースＣＬ４Ｂはファーマシア［Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　］のものを使用した。ＮＰ−４０はパーティクル　データ　リミテッド［Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｄａｔａ　Ｌｔｄ、］のものを使用した。ポリエチレングリコール、Ｘ線フィルムおよびコ　・ダブ−［Ｋｏｄａｖｕｅｌ− 染色キットはコダック［Ｋｏｄａｋコのものを使用した。アクリルアミドおよび銀染色キットはバイオラット［ＢｉｏＲａｄｌのものを使用した。予め染色された分子量マーカーはベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ、ベセスダ、メリーランド州（ＢＲＬ）［Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｔ　ｈｅｓｄａ　、　Ｍａｒｙ　Ｉ　ａｎｄ　（ＢＲＬ）］のものを使用した。１４Ｃ−メチル化分子量マーカー、　Ｈ−グルコサミン、３５３ −メチオニンおよび１２５Ｉはアメルシャム［Ａｍｅｒｓｈａｍｌのものを使用した。ＦＩＴＣ接合されたヒツジ抗マウスイムノグロブリンはタボ［丁ａＯＯ］のものを使用した。パラボン（ｐａｒａｇｏｎ］血清タンパク質の電気泳動装置はベックマン［ＢｅｃｋｍａｎｌＯものを使用した。アンフォリンはエルケイビー［ＬＫＢ］のものを使用した。

免疫組織学的技法ノケミストリー、ジョン　ウィリーとサンズ、ニューヨーク州、　１９７９年、　１０４−１６９頁（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７９．ｐｐ１０４−１６９）　、ガリギュースら（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ　ｅｔ　ａｔ、）による修正としてインド、ジエイ。

キャンザー（１９８２年）　２９：５１１−５１５頁［Ｉｎｔ、Ｊ、ＣａｎＣｅｒ（１９８２）２９：５１１−５１５　］が用いられた。これらの試験についての標的組織は、外科術的に得られ、液体窒素の中であらかじめ冷やされたイソペンタンに４時間入れて凍結された。組織はその後、使用されるまで液体窒素の中または一７０℃で保存された。ウサギ抗マウスＩｇＧ［スターンバーガー−メイヤー　イムノケミカルズ、インコーポレーテッド、。

シャレッツヴイレ、メリーランド州（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−ＭｅｙｅｒＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、　、Ｊａｒｅｔｔｓｖｉ　Ｉｌｅ、）１０）］は５０分の１の希釈で用いられた。マウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体［ＰＡＰ、スターンバーガー−メイヤー　イムノケミカルズ、インコーポレーテッド（ＰＡＰ、　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−）Ｉｅｙｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ）］は、特別に精製されたＰＡＰを２ｍＥ／ｄ含有しており、８０分の１の希釈で用いられた。凍結された切片は調製され、乾燥されアセトンで処理されそして乾燥された［ガリギュースら、　１９８２年（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ　ｅｔ　ａｔ、１９８２）］。組組織学的価のために用いられる切片はヘマトキシリンで染色された。非特異的なバックグラウンドを減少させるために、切片は５分の１に希釈された正常ヒト血清であらかじめインキュベートされたＥガリギュースら、　１９８２年（Ｇａｒｒｉｏｕｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２）］。

マウス抗体、ヒツジ抗マウスＩＯＧそしてマウスＰＡＰは１０％正常ヒト血清および３％ウサギ血清の溶液で希釈された。

染色方法は、特異的または対照抗体で連続している切片を２．５時間処理し、５０分の１で希釈されたウサギ抗マウスＩｇＧで３０分間インキュベートし、ざらに８０分の１に希釈されたマウスＰＡＰ複合体に３０分間さらすことによるものであった。抗体を用いたそれぞれの処理の後、スライドはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２度洗浄された。免疫組織化学的反応は、新鮮に調製されたＯ、　ＯＳ％３，３°−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライト［シグマ、セントルイス、ミズーリー州（Ｓｉｇｕｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＮＯ）］および００．０１％過酸化水で０．０５Ｍトリス緩衝液においてｐｌ−ｆ　７．６で８分間進められた。さらに蒸留水中で１％０３０４溶液への２０分間の暴露は染色を強めた。

スライドはそれぞれコード付けされ、そしてコード付けされたサンプルは独立した研究所によってチェックされた。

典型的なスライドは微分干渉対照光学器［ツフイスーモナルスキ（Ｚｅ　ｉ　５ｓ−Ｈｏｎａｒｓｋ　ｉ　）　］を使用して撮影された。抗体の染色の程度はＯ（反応なし）、＋（はとんどの細胞が陽性ではない）、十＋（少なくとも細胞の３分の１が陽性）、＋十＋（はとんどの細胞が陽性）、＋＋＋＋（はとんど全部の細胞が強い陽性を示す）というように評価された。十とＯの染色の差は＋十と十の染色の差はど明確に区別されないので、染色の階級においては＋十、またはそれ以上を「陽性」として数えることにした。腫瘍細胞および支質細胞は腫瘍サンプルにおいて観察された、支質細胞は全く染色されないかまたは腫瘍細胞よりもさらに弱く染色されるので染色は腫瘍細胞に関するものが記録された。

抗原の細胞上局在は、非イオン性界面活性剤での透過化の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測することによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面へ結合する抗体は、■標識された抗体を用いての直接結合検定法（ブラウンら、プロシーディング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシズ　オブ　ザ　ユナイテッド　ステート　オブ　アメリカ（１９８１年）　７８：５３９〜５４３［Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９８１）７８：５３９−５４３１）によっであるいは、（ＦＡＣ３）　ＩＩ細胞識別器を用いる間接蛍光によって同定された。細胞内位置に結合する抗体は、　■標識された抗体を細胞に直接結合させ、続いて、パラホルムアルデヒドで固定化し、さらに続いて非イオン性界面活性剤ＮＰ−４０で透過化することによって測定された。

結合検定法ａ）放射性標識された抗体を用いることによって行なわれる結合検定法（ブラウンら、上記）のために、培養細胞（１０６）は、培養培地中で熱活性化（５６℃ で３０分間）胎児ウシ血清１００μｐ中の　Ｉ標識された抗体１０６ｃｐｍと４ ℃で３０分間インキュベートされた。ＰＢＳ　５ｍｆ！の添加の後、細胞は２５０Ｘ　（ｌで１０分間遠心分離することによってペレット化された。上澄み液は吸い出され、そしてペレットは１２５Ｉに関して計数された。非特異的結合を計測するために、並行的インキュベーションが競合物として標識されていない抗体１０μ９を用いて行なわれた（ブラウンら、上記）いくつかの例においては、結合検定法は、類似の様式においてプラスチック製培養皿へ付着した細胞単一層上で行なわれた。

ｂ）ＦＡＣ３ＩＩ細胞識別器において行なわれる結合検定法のために、細胞は、５　ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳを用いて、それらの基質から除去された。１×１０５細胞を含有する試料は最初に２μｇ／＆！の濃度でモノクローナル抗体とインキュベートされ、続いて１：２００の希釈でフルオレセイン結合ヤギ抗マウス抗体とインキュベートされた。細胞は次に洗浄されそして培養培地中に再懸濁ぎれた。ＦＡＣ８分析の直前に、ヨウ化プロピシウムが非生存細胞を染色するために１μｇ／７！の最終濃度へと添加された。ＦＡＣ３分析の間、細胞放射赤色蛍光が、生存細胞のみを調べるために、電子的に追出された。フルオレセイン蛍光の平均強度が、次にそれぞれの抗体に関して測定された。陰性の比較対照はモノクローナル抗体のない試料から構成されており、一方陽性の比較対照は、ＨＬＡ　・タイ１組織縁適合性抗原に対するモノクローナル抗体からなるものであった。平均チャンネルフルオレセインが少なくともバックグラウンドの３倍であった場合に、着色は陽　′性であると見なされた。

タンパク質抗体測定タンパク質抗体を確認するために、肺癌腫またはヒト胎児肺細胞は表面を放射性ヨウ素化されたまたは３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識化された。抗原はモノクローナル抗体とのインキュベーションそしてヤギ抗マウスＩ（ＩＧの添加およびスタフィロコッカス・アウレウスへの吸着にヨッて細胞溶解物から単離された。免疫法と物は洗浄されドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって上述のように分析された［ブラウンら、上記参照（Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａ！、上記参照口。

３５ｓ−メチオニン標識化特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、２５ｍＭへペス緩衝液、４ｍＭＬ −’グルタミン、１４．５ｍ３７Ｍ　’ｆルコース、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μ９／ｍ１ストレプトマイシンおよび２５％熱失活化新生子牛血清（ＮＣ３）を含有しているメチオニン非含有ダルベツコ最少必須培地において微小力価ウェルに播かれた。

細胞は０．１ｍＣ１３５Ｓ−メチオニンと３７°ＣＴ−６時間接触し、そして細胞を除去するために上澄液は除去され遠心分離された。

イソタイプ測定ａ）オークターロ二−免疫拡散法特定のハイブリドーマの上澄液の部分標本が２％寒天プレートの中央ウェル中へ入れられた。単性異性ウサギ抗マウスＩｐイソタイプ抗体（メロイ［Ｈｅ１ＯＶ］）が外側のウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、さらに４℃で一晩インキユベートされた。

ｂ）可撓性ポリ塩化ビニル製の９６ウエルプレート（コースタ−［Ｃｏ５ｔｅｒｌ　）が３７°Ｃで２時間０．１ｍｙ／ｒｒｄ！ヤギ抗マウスＩＣＪ抗体で被覆され、そして３７°Ｃで２時間３％ＢＳＡ溶液で逆被覆された。ハイブリドーマ上澄液が次に３７℃で２時間インキュベートされた。ＰＢＳで洗浄した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）プレートは、３７℃で２時間ベルオキシダーセに結合した単性異性つサギ抗マウス■９イソタイプ抗体（ザイムド（Ｚｙｍｅｄｌ）とインキュベートされた。

洗浄の後、プレートは０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４，５中の１ｍＦ／ｄオルソフェニレンジアミンおよび０．３％Ｈ２Ｏ２とインキュベートされた。６３０ｎｍでの光学密度がダイナチック酵素結合免疫吸着剤検定プレート読取器［Ｄｙｎａｔｅｃ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒｌにおいて測定された。

ブドウ球菌性プロティンＡ結合検定法微小力価ウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｅｌｌ）を、ＰＢＳに０．０２％のＮａＮ３を加えた５％Ｎ、Ｃ３でインキュベートし、上澄液を吸出した。２５μ ｐの表皮細孔の懸濁液（２Ｘ１０７セル／ｍｅ）を各ウェルに加え、室温で１時間２５μｇの特異抗体でインキュベートした。プレートを７分間１２００ｐｐｍで遠ｏｃｏｃｃａ　Ｉ　）プロティンＡ（約５０，０００ｃｐｍ／２５．Ｑ　）を加えた。そのプレートを２５℃で１時間インキュベートし、２度５％ＮＣ３／ＰＢＳ／Ｎａ　Ｎ３で洗浄し、乾燥した。ウェルの底を切り離し、ガンマカウンターで計測した。

細胞培養カル−１肺癌（ＣａｌＵ−１ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞を、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクションから得た。１ｄ当り５０ユニツトのペニシリン、１ｉ当り５０μ９のストレプトマイシンおよび１０％（ｖｉｖ）の胎児ウシ血清（ｆｅｔａｌｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ、Ｆｅ２）を含むグロース　メディアム（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｅｄｉｕｍ）［ダルベツコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）］中単層培普株として細胞を維持した。

細胞を０．０５％トリプシンおよび°０．０２％ＥＤＴＡ溶液で処理して集め、血球形で計測した。

間接免疫螢光検査法細胞をトリプシン化（ｔｒＶｌ）ＳｉｎｉＺａｔｉＯｎ）で集め、ウェル（直径６＃）当り５〜２０Ｘ１０３の密度でテフロン被覆条ウェルスライド（メロイ　ラボ（）ｌｅｌｏｙ　Ｌａｂｓ））上に置いた。実験開始前に細胞を３７°Ｃで約１８時間保持した。培地を除去し、粘着細胞を０．５ｍＭ　Ｃａ　Ｃ＋　２および０．５ｍＭＭ（］　Ｃｌ　２を含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ、　ＮａＣＩ　。

０．１４Ｍ；ＫＣＩ　、　３１１１Ｈ；Ｎａ２’ＨＰ０４Ｘ７Ｈ２０、８ｍＭ；およびＫＨ２ＰＯ４，１５１１１８）で１度洗浄した。その後、細胞を２３℃で２０〜３０分間で２５マイクロリツターのパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中で０．５％）溶液を加え、その位置で（ｉｎ　５ｉｔｕ）で固定した。細胞を洗浄し、細胞内抗原を２３°Ｃで５分間０．２％（ｖ：ｖ）　Ｎ　Ｐ　４０を含むＰＢＳを加えることによりざらした。その後、過剰のアルデヒド基を、２３℃で少なくとも１５分間結合バッファ’−（Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒｓ）［ｐＨ６，８で５０ｍＨＢＥＳ（Ｎ、Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタン　スルホニツク　アシッド）、０．１％（ｗ：ｖ）ＢＳＡおよび１５％ＦＣ３を含むＤ）ＩＥ旧を加えてブロックした。抗体を結合バッファー中で１０μ９／／ｄに希釈し、各ウェル当り全容積２０〜２５マイクロリツターとした。スライド（ｓｌｉｄｅ）を４℃で１時間インキュベートし、結合バッファーで洗浄した。フルオロセイン　イソシアネート共役化（ＦＩＩＧ）第２抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩ（ＩＭ）を４℃で１時間で加えた。使用したＦＩＴＣ共役体の希釈をバックグラウンド比に対するオプショナル　シグナル（ｏｐｔｉｏｎａｌ　ｓｉｇｎａｌ＞を発生させることにより実験的に決定した。インキュベーション後、スライドを結合バッファーおよび水で洗浄し、空気乾燥した。小容量の色あせのない（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ）溶液［ゼネチイック　シイステンズ　コーポレーション（Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｙｓｔｅｎｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ月およびカバーグラスを加え、スライドをロイツ　オルソプランケイ光分光顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ　０ｒｔｈｏｐｌａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して測定した。スライドを４０Ｘオイル　イマーション　オブジェクジョン（ｏｉｌ　ｉｍｍｅｒｓｉｏｎｏｂｊｅｃｔ　１ｏｎ）のもとで調べ、コダック　トライ　Ｘ　パンフィルムで写真にとった。

代謝性標識細胞をトリプシン化（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）により集めた。ト１、Ｊ　ハン７　／Ｌ／−インクルージヨン（ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｅｎｃｌｕｓｉｏｎ）により測定した生存能は通常９５％より大きかった。

４Ｘ１０６細胞を遠心分離により集め、アミノ酸メチオニンを除いた１ｒ１１ｆ！のグロース培地（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ）中に懸濁さセタ。３”Ｓ−、＜チオニン（８００Ｃｉ／ｍ−Ｅル）　ヲ最終濃度０．５ｍＣ１／−まで加え、３７℃で１〜６時間回転しながらインキュベートした。その後、標識化細胞を遠心分離によって集め、次の手技前に洗浄した。ある場合には、放射性標識化細胞懸濁液を標識化されて“いないメチオニンおよび１０％ＦＣ３を含むグロース培地（Ｇｒｏｗｔｈ　）ｔｅｄｉｕｍ）で１０倍に希釈し、１００ｍの組織培養ディシュに加え、３７℃でさらに１８時間インキュベートした。その後、使用前に粘着網３目−グルコサミンを有する標識細胞の場合には類似標識処方（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を使用した。最初に、内部グルコースプールを１０％透析化ＦＣ３を含むグルコースを含まないグロース培地［Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ］中で４〜２４時間インキュベートすることで除去した。飢餓後に〉９０％生存能を示す細胞母集団を次の実験に使用した。細胞を上記の如く集め、Ｉ）Ｈ７゜４で１０％透析化ＦＣ３，０，ＯＩＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンサルホニツク　アシッド）および０．５Ｍ　Ｃｉ　３＠−グルコサミン［４０Ｃｉ／ｍモル］を含む１ｍｌのグルコースを含まないグロース培地（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ）中に再懸濁さセタ。３７℃で３時間回転して標識化後、細胞を遠心分離で集め、ＰＢＳで洗グリーンウッド等（１９６３）バイオケミカル　ジャーナルで、タンパク質を１２５１で放射性標識化した。タンパク質サンプル（５０μ９）を１〜２ｍＣ１１２５Ｉ（キャリャーノない）を含むＰＢＳ中へ０．５ｄに希釈した。１ＯＩｇの新たに作られたクロラミンＴ（１０ μ３を含む）溶・液を加え、ＰＢＳで平衡にしたセフ１デックスＧ−Ｉ　Ｑ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０）カラムにおけるクロマトグラフィーで除去した。この研究で使用された標識化モノクローナル抗体の比活性はナノモル当り約３Ｘ１０９であった。放射性標識化する前にＬ３抗原を含むサンプルをセファデックスＧ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０＞スピンカラムで脱塩した。

１、抽出物の調製代謝性標識化細胞を遠心分離で集め、ｄ当り２〜４Ｘ１０６細胞の比率でＮａ　Ｃｌ　、０．１５Ｍ　；　Ｎａ　ＨＰＯ：０．０５Ｍ：デオキシコールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｙ：ｙｃｈｏｌａｔｅ）１％（Ｗ：Ｖ）；トリトン　Ｘ−１００（丁ｒｉｔｏｎ　ｘ−１００）、１％（Ｗ：Ｖ）および５ｏｓｏ、ｉ％（Ｗ：Ｖ）を含むＲＩＰＡバッファーに溶解させた。４℃で１０分間のインキュベーション後、その混合物を遠心分離１　（１４７，０００Ｘｇ、　３０分間Ｔｉ　７０．１　ローター）で清浄化した。上澄液を除き、含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターにより決定した。

ｃｐｍ（ｌ沈降性）または３日−グルコサミンに対して４Ｘ１０６　（酸沈随性）を含む細胞溶解産物のアリコートを４℃で０．５〜１時間、１μ３の抗体でインキュベートした。

標識化培養培地を分析した時に、分析した全細胞抽出物の割合に等価なアルコートを使用した。親和精製ヤギ抗マウス免疫グロブリン（１〜２μ３；ヤギをマウス免疫グロブリンで免疫化調製した）を加え、４℃でインキュさ一トし、ざらに１０〜６０分間続けた。５０μｐのホルマリン固定化スタフィロコッカス・アウレウス（パンソルビン）の１０％溶液を加え、４℃で５分間インキュベート後、沈降物を遠心分離で集めた（使用前に、Ｐａｎ５ＯＩ”ｂｉｎを０．５％（Ｖ：Ｖ）ＮＰ４０溶液で１度、０．０５％（ｖ：ｖ）　ＮＰ４０溶液で１度洗浄し、１■／ｄオバルブミンを含む後のバッフ１−中に再懸濁させた）。沈降物をＴＮＥＮバッファー（トリス　ヒドロキシメチルアミノメタン、ｐＨ８，０，０，０２）１：ＮａＣｌ、　０．１）１；ＥＤＴＡ　。

０．０１）１；およびＭＰ−４０，０，５％（Ｗ：Ｖ））で３〜４回洗浄し、使用まで一２０℃凍結して貯蔵した。

上記ラエムリ（ｔａｅｍｍ　＋　ｉ）に従ってＳＤＳ　ＰＡＧＥを実施した。最も頻繁に使用された溶解ゲルは１０〜２０％の直線的アクリルアミド段階度および５％のアクリルアミドを含んだ積み重ねたゲルであった。サンプルを５％の２ −メルカプトエタノールを含むサンプルバッファー中で沸騰させ、電気泳動前に免疫吸着剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ　）を遠心分離で除いた。分子量基準は、１４Ｇ−メチレート化タンパク質混合物（ＡｍｅｒＳｈａｍ）またはプレスティント（ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ）基準（ＢＲＬ）のいずれかであった。使用された基準タンパクの分子量は、ミオシン（２００，０００＞　、ホスホリラーゼｂ（９２゜４００）、生血セラムアルブミン（ＢＳＡ）（６９，０００）　、オバルミン（４６，０００）、キモトリプシノゲン（２６，０００）、ベータラクトグロブリン（１８，４００）、リソチーム（１４，３００）およびシトクロムＣ（１２，３００）であった。電気泳動後、ゲルを真空下で乾燥し、放射標識タンパク質の位置をコグツクＸ−線フイルムを用いるオートラジオグラフィーで決定した。

１２５Ｉ−標識化［３抗原を含む免疫沈降物を記載のごとり調製し、５％（Ｖ：Ｖ）の２−メルカプトエタノール％（Ｖ：Ｖ）　Ｎ　Ｐ　４　０を含む５０μｐの溶液に再懸濁させた。

サンプルを９５°Ｃで５分間加熱し、免疫吸着剤（　ｉ　ｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ　）を遠心分離で除去した。サンプルにアムホリン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓＨｐＨ３．５　〜１０　；最終濃度４％）を混合し、固体尿素を飽和まで加えた。オフ７レル（１９７５）ジャーナル　バイオロジー　ケミカル　２５０；４００７　〜４０２１　［０’　Ｆａｒｒｅｌ　Ｉ　（１９７５）Ｊ。

Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０；４００７−４０２１１の方法に従って等電点電気泳動（Ｉｓｏｅｌｅｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｑ）およびＳＤＳ　ＰＡＧＥを実施した。標準タンパク質マーカー（バイオラッド　ＢｉＯ　Ｒａｄ）をＩＥＦ次元中で分離を追跡するために使用した。得られるｐＨ段階度を平行に実施したブランクゲルから決定した。

間浸し、得られる溶液のｐＨを決定した。

３、模範電気泳動：血清タンパク質電気泳動法を製造手順に従って模範装置（ベックマン）であらかじめ形成されたアガロースゲルを使用して導いた。

イムノブロッティング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）　：分析されるタンパク質をＳＤＳ　ＰＡＧＥまたはパラボン（Ｐａｒａｇｏｎ）のいずれかで分離した。ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより分離したサンプルをバーネット（１９８１）アナル　バイオケミストリー　１１２；　１９５　〜２０３［Ｂｕｒｎｅｔｔｅ（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　１１２；１９５−２０３コの記載のこと＜５Ｖ／ｃｍで４°Ｃにおいて約１８時間電気泳動的にニトロセルロースに移した。

バラボンにより分離したサンプルを一枚のニトロセルロースペーパーを有するエレクトロホレトグラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ）の上に横たえることによってニトロセルロースに移した。ニトロセルロースを使用前にＳＤＳなしで、上記のように、バーネットのトランスファーバッファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｂｕｆｆｅｒ）中で水和した。厚さ約１インチの一山の紙タオルをニトロセルロース上に置き、ガラスプレートおよび試薬びんで計量した。移転後グルの着色（ｓｔｒａｉｎｉｒｏ７）により判定されたように、移転は１時間以内で完了した。ニトロセルロースプロット（ｂｌｏｔ）をプロット−（ＢＩＯｔｔＯ）中で１時間のインキュベーションで、カクテルに基づくシルクでブロックした（ジョンソン等　ジーン　アナリティカル　テクノロジー（１９８４）　１：３− ８（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ。

丁ｅｃｈｎｏｌ（１９８４）　１：３−８）０１％（ｗ：ｖ）カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）脱脂粉乳および０．２％（Ｖ：Ｖ）のＮＰ−４０を含むＰＢＳ）、１３抗原を２３℃で１時間ブ０ットー（Ｂｌｏｔｔｏ）中の４　〜４ｘ１０　ｃｐｍ／ｍの１２５１　１３抗体を有するブ０ツト（ｂｌｏｔｓ）のインキュベーションにより示した。プロットをプロット−（Ｂｌｏｔｔｏ）で広範に洗浄し、オートラジオグラフィック（ａＵｔｏｒａｄｉＯｇｒａｐｈｉｃ）暴露前に乾燥した。

１２５Ｉ　ｃ３抗体の結合カル−１細胞（Ｃａｌｕ−Ｉ　Ｃｅｌｌｓ）（ａ　〜１０ｘ１０４　）を実験開始前１８時間に４８ウエル細胞培養デイシユに置いた。細胞をＰＢＳで洗浄し、２３℃で２０分間ＰＢＳ中の０．５％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。単層（ｍｏｎｏ　Ｉ　ａｓｊｅｒ　）をＰＢＳで洗浄し、２３°Ｃで５分間０．２％　ＮＰ−４０含有ＰＢＳ処理で浸透性を与えた。各種濃度の１２５■標識化抗体を２３°Ｃで６０分間で０．１ｄの最終容積に加えた。その後、単層を結合バッファーで広範に洗浄し、０．５Ｍ　ＮａＯＨの添加により溶けやすくした。放射性活性を結合した細胞をガンマカウンターで測定した。サンプルを２通り検定した：副すンプルは一般に２．０％以下で変化した。非−特異抗体結合を測定するため、通常９０％以上の１２５　Ｉ−標識化抗体結合を減少させる５０〜１００倍過剰の標識化してないし３抗体で同一ウェルをインキ１ベートした。結合データをスカツチャード（１９４９）アン、エヌ．ワイ．アカデミーサイエンス　５１　：６６０−６７２　［Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　（１９４９）八ｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．八Ｃａｄ．　Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２］に従って分析すると、　Ｉ　Ｌ３抗体に対して親和定数（にａ）として約１Ｘ１０８Ｍ−１と測定された。

１２５■−１３抗体の添加前に細胞単層をＮＰ４０で処理しないと抗体結合性は１０倍以上に減少した。

肱含追植登負冗葦Ｌ３抗原活性を、カル−１セルズ（ｃａｌｕ−１　ｃｅｌｌｓ）のフｔルマリン固定化単層（ｍｏｎｏ　ｌ　ａｙｅｒ　）に対する１２５１−標識化Ｌ３抗体の結合を抑制する抗原の能力を決定することにより測定した。細胞単層を上記のこと＜Ｆｌ製した。　Ｉ−Ｌ３抗体をＬ３抗原活性を含有する濃度０．４μｇ／威の濃度の存在下または不存在下に細胞に加えた。最終検定容積はｏ．　ｌｒｄｌであった。これらの条件のもとで、結合に対して競合する標識化してないＬ３抗体活性により判断すると１２５１　Ｌ３抗体の結合は９５％以上特異であった。

各種希釈の試験溶液を加え、　Ｉ−標識化抗体の結合を上記のように測定した。

培養培地中および正常ヒト血清中で見い出されたＬ３抗原の精製の各種段階に関する典型的な抑制曲線は、第１図（追加の物質）中として見られる。Ｌ３抗原活性の１単位は、０．４μ９／ｄで加えられた５０％の１２５１　Ｌ３抗体により結合を抑制するために必要量として定義される。

グリコシダーゼ処理３５３−メチオニンまたは１２５■−標識化Ｌ３抗原の免疫沈降物を次のように調製した。ペレット化免疫吸着剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎｔ　）を２５ μρの消化バッフ１−に再懸濁させ、５ミリユニツトの適正な酵素を含む５μりの容積物を加え、サンプルを３７°Ｃで１８時間インキュベートした。濃縮したＳＤＳ　ＰＡＧＥ　サンプル　バッファーを加え、サンプルを電気泳動にかけた。ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）処理のため消化バッファーは次のものを含んでいた：Ｎａ　ＣＩ　０．１５Ｍ　；酢酸ナトリウムｐＨ　５．３，　０．０５Ｍ　：　ＣａＣＩ２，０．１％（Ｗ：Ｖ）；およびフェニルメチルスルホニルフルオライド、０．１％（Ｗ：Ｖ）。エンドグルコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ　Ｈ）９８理のため、消化バッファーは次のものを含んでいたニドリス −ＨＣｌ　ＤＨ６，５，０，０２５Ｍ：ＳＯ３，０，２％（Ｗ：Ｖ）；およびフェニルメチルスルホニルフルオライド、０．１％（Ｗ：Ｖ）。

久ンパク買状定タンパク質濃度を基準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドホード（１９７６）アナル　バイオケミストリー７２：２４８−２５４［Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２：２４８−２５４］の方法で決定した。

Ｌ３セファロースの調製凍結乾燥化ＣＮＢｒ−活性化−セファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）４Ｂを４ ℃で３０〜６０分間１ｍＭＨＣｌで再構成した。

この樹脂を同一溶液で１度洗浄し、遠心分離で集め、３．５ｍｇ／ｄの１Ｍ　ＮａＣｌ溶液およびｐＨ８，３で０．２Ｍの重炭酸ナトリウムを混合した。混合物を４℃で回転しながら１６時間インキュベートした。樹脂を遠心分離で集め、過剰の活性基をｐＨ８，３で１〜４容積の０．２５Ｍグリシン溶液添加によりブロックした。その後、樹脂を遠心分離で集め、使用前にＰＢＳで数回洗浄した。カップリング効率をカップリング前後の抗体溶液の２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより検定し、充填樹脂１ｄ当り約１０＃１ｇの１３抗体であると測定された。

グル染色ＳＤＳ　ＰＡＧＥ後、タンパク質バンドの位置をクーマシープル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色または商業的シルバー（ビオラッドＢｉｏ　Ｒａｄ）または染色キットを基礎とするニッケル（コダック）により決定した。

エドマン分解によるアミノ末端配列培養培地からのＬ３抗原を０．１Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，５および０゜１％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　（Ｗ：Ｖ）を含む０．１ｍ９の容積中のジチオエリスリトール（２０ｍＭ）で５０℃で２時間還元した。その後、抗原を２０℃で３０分間ヨードアセトアミド（４５ｍＭ）処理し、Ｓ−カルボキシアミオドメチレート化（Ｓ −ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）　Ｌ／、１０％アクリルアミドゲル（１５，厚み）の調製用ＳＤＳ　ＰＡＧＥにかけた。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＯＯｍａＳＳｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）（１０％酢酸および３０％プロパツール中で０．５重量％）で染色し、酢酸（５％Ｖ：Ｖ）およびメタノール（１７％Ｖ：Ｖ）で脱色した。染色したし３抗原バンドをカミソリ刃（ｒａｚｏｒ’　ｂｌａｄｅ）で切除し、直ちにＥＣＬＩ−０４０エレクトロエリニーター／コンセントレータ−（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｏｒ／Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）　（シー、ビー、ニス、サイエンティフィック　コーポレーション、サンジエゴ、カルフォルニアｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ））を使用してエレクトロエリューション（ｅｌｅｃｔｒＯｅｌｔｊｔｉｏｎ）および電気泳動にかけた。サンプルをカルボキシアミドメチレート化（ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ＞されないことを除いては、血清由来し３抗原は同様に進められた。その方法の全回収率は、銀染色を有する分析ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質量の評価に基づいて約８０％であった。自動化エドマン分解を約１００ｐモルのＳ−カルボキシアミドメチル化（Ｓ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）条件下培地誘導Ｌ３抗原（同一化Ｎｅｔ−６の生産量に基づく）および３８理モルのセラム誘導非修飾し３抗原（同一化Ｖａ１−１の生産量に基づく）を使用して気相セクウエンサー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）中で行なった（モデル４７０Ａ，アプライドバイオシステムズ，インコーポレーテッド，フォスターシイテ酸を、溶出用に酢酸ナトリウムバッフ１−／テトラヒドロフラン／アセトニトリルグラジェントを使用するアイビーエムインスツルメンツシアノカラム（ＩＢＭ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ’Ｃｙａｎｏ　ｃｏｌｕｍｎ）を有する逆相（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ）　Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ　（検出ユニット、２ｐモル）で分析した（アプライド　バイオシステムズ，タンパク質配列ユーザーズブルティン（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）ＮＯ．２．　１９８４）。

モノクローナル抗体を３ケ月令ＢＡＬＢ／Ｃマウスを４つの異なる源の１つのヒト組織で免疫化することにより製造した：（１）転位性（ｍｅｔａＳｔｉＣ）非 −小細胞肺癌を有する患者からの胸膜滲出、（２）非−小細胞肺癌からの培養化細胞、および（３）３ｍ４ケ月令ヒト胚からの肺組織、約１０７セルでマウス膜腔内へ３〜４回注入することにより免疫処置を行なった。最終免疫の後３日で、牌臓を除き、培養培地に懸濁させ、ＮＳ１マウス骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と融合した（上記のコーラ−およびミルシュタイン（に６ｈｌｅｒおよび＋ｉ　ｌｓｔｅｉｎ））。混合物を単一融合細胞（クローンズ）から生ずる低密度培養を形成するために接種した；ハイブリジゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）用に使用した技術は、イエー等インド、ジエイ．キャンサー（１９７９）２９：２６９−２７５［Ｙｅｈ，　ｅｔａｌ．　、　Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９７９）２９：２６９−２７５　３ですでに記載した。

ハイブリッド細胞からの上澄み液は、酵素結合免疫吸着剤検定法およびオートラジオグラフィー的間接１２５Ｉ−標識化タンパク質Ａ検定法［ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ１２５Ｉ−ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｐｒｏｔｅ　ｉｎ　Ａ　ａｓｓｅｙｌ　（ブラウンら，ジャーナル　オブ　イムノロジー　メソッズ（１９７９年）　３１：２０１〜２０９［Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．　、　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈ．　（１９７９）３１　：２０１−２０９］　）の双方を用いることによって、とりわけ細胞膜を含有する免疫処置に用いられた腫瘍からの抽出物に対してスクリーニングされた。これらの抽出物は、コルカーら［Ｃｏｌｃｈｅｒ　ｅｔａｌ．］　（キャンサー　リサーチ（１９８１年）　４２　：　１４５１〜１４５ｇ［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　、　（１９８１）　４２：１４５１−１４５９］）　；イエイら（上記）から修正された方法を用いて調製された。このために、組織はＰＢＳで洗浄されそして懸濁され、完全な腫瘍に関するものは、ステラ・レス鋼製ふるいを通して圧搾することによってなされた。この後に、１　ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（カルビオケムーベーリング　コーポレーション　カルフォルニア州すンディエゴ［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ］）を含む１ｍＭＮａＨＣＯ３が添加され、原料は、次にデューンス［ｏｏｕｎｃｅ］ホモジナイザーの８乳棒の５０ストロークで、氷上において均質化された。２７．０ＯＯＸ　ｇで１５分間の遠心分離の後、上澄み液が除去され、そしてペレットはＰＢＳ中に再懸濁すれ、１分間音波処理され、−ｔｏ′ｃで貯蔵された。

細胞膜抽出物に結合する抗体を産生じたハイブリドーマは、クローン化され、試験管内で増殖され、そして抗体特異性に関してさらに試験された。この試験上記した免疫組織学的技術を用いることによって行なわれ、肺癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切片に結合するための抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫に対する顕性特異性の抗体を産生するこれらのハイブリドーマは再クローンされ、増殖され、そしてプリスタン処理された３力月齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス中へ注射され、そこで、これらは腹水腫瘍として増殖した。

腹水中へ分泌される抗体は、タンパク質Ａセファロース［５ｅｐｈａｒｏｓｅ　］において（エイら、イムノケミストリー。

（１９７８年）　１５：４２９［Ｅｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７８）　１５：４２９］）あるいはセファクリルＳ　−３００［５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００１中でのゲル濾過によって精製された。精製抗体は、免疫組織学による付加的な特異性試験、該抗体が細胞表面に結合したことを測定するための完全細胞にあける結合検定、および上記したような放射性免疫沈降試験を含むなお一層の特性づけのために用いられた。

モノクローナル抗体Ｌ３．Ｌ５およびＬ１８を上記のごとく対応するハイブリドーマから産生じた。これら抗体は、本明ｉｓの上記の特性を示した。

Ｌ３．Ｌ５およびＬ１８で登録された細胞系は１９８４年１０月４日にＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，（アメリカン　タイプ　カルチャーコレクション、　１２３０１　パークローン　デーアール５．ロツクヴイレ、マリ−ランド２０８５２（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、）ｌａｒｙｌａｎｄ２０８５２）に寄託され、そしてそれぞれアクセツションナンバー　ＨＢ８６２６．　ＨＢ８６２７ｔ５よび１１８８６２８で受入れられた。細胞系Ｌ３は１９８４年１０月２５日に再寄託された。

実施例　２血清無し培養培地からＬ３抗原の精製１、血清無し状態の培地の調製カル１細胞（ＣＡＬＵ−Ｉ　Ｃｅ１ｌｓ）は、グロース培地（ＧｒｏＷｔｈＭｅｄｉｕｍ）の存在の下で回転ボトル（８５０ｃＩｊ）の中で集密まで増殖された単層は５０ｄの血清無しグロース培地を用いて３回洗浄され、３７℃の下で３０分間の間前記細胞に置かれて第２の洗浄がなされた。細胞はそれから１５Ｍの血清無しグロース培地の存在下でインキュベートされた。３日後に、前記培地は集められ、遠心分離機にかけられて浮遊細胞を取り除き、使用時まで一７０℃に冷凍されて保存ざ血清無し培地（７９（７！ｓ）は、限外濾過膜（アミコンＰ）ＩＩＯ膜、　Ａｍ１ＣＯｎ、ＰＭＩＯｍｅｍｂｒａｎｅ）によって１７ｄの容積にまで濃縮された。この濃縮物は移され前記膜はＰＢＳ　（１１威）によって一度洗浄された。洗浄物と濃縮物は合わせられ、Ｔｉ　７０ローター（ベックマン、　ＢｅＣｋｍａｎ）内におイエ３０分間、１４７，０ＯＯＸ（］で遠心分離機にかけられた。上澄み液は多量の抗原活性を包含していると認められ、以後濃縮物と言う。

３、免疫親和性クロマトグラフィーこの濃縮物はセファロースＣ１４Ｂのカラム（１，５ｄ＞に送られて、セファ０ −スに対して親和性を持つ物質が取り除かれた。カラムはそれから３威のＰＢＳによって洗浄された。この通過流は洗浄物に合わせられ、セファロース４Ｂ（１０ｍｇ’　Ｌ３／威　レジン）に結合された容積１ｍｌの抗体に加えられた。この混合物は４℃のもとて１８時間回転状態に保たれ、それから皮下注射器を用いて作られたカラムの中に注がれた。前記通過流は集められ、樹脂はＰＢＳ（１（７）と５ＭのＮａ　Ｃ＋　（５ｄ）及び０．０２Ｍの酢酸アンモニウム（１０ｒｄ）の溶液とにより洗浄された。し３抗原は、新たに作られたトリエチルアミン溶液を加えることによってカラムから溶出された。Ｌ３抗原活性はｐＨの上昇に対して不安定なので、流出物のｐＨは、２Ｍの酢酸アンモニウムｏ、ｉｙを包含するチューブ内における分画（０，５ＩｎＩｌ’）を集めることによって調製された。Ｌ３活性を包含する分画は、競合的結合検定法を用いることによって同定され、プールされ、更に一２０℃に冷凍保存された。この結果は第１表に要約して示されている。

実施例　３血清からのＬ３抗原の精製１、血清の収集血液は腫瘍患者又は正常の個体から採血され、室温で１０〜９０分間凝固された。サンプルはその後、ソーパルクリニカル（Ｓｏｒｖａｌｌ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ）遠心分離機により毎分１６００回転で１０分間遠心分離される前に、３０分から５時指４〜６℃で保存された。血清は凝血から分離され、分けられてそして使用されるまで一７０’Ｃで冷凍保存された。Ｌ３抗原活性レベルは、同一個体からの血清（Ｓｅｒｕｍ）又はプラズマ（Ｐｌａｓｍａ）にあっては、大きくは相違しなかった。溶解された凝血分は、抗原活性が冷凍と溶解との繰り返しに対して敏感であることが認識されたので、一般には再冷凍すべきでない。Ｌ３抗原活性の調整のために、新たに冷凍された血清の凝血分１０ｍｊ２が溶解され、使用前に遠心分離機によって１４７，０００Ｘ（ｌで６０分の間（Ｔｉ　７０．１０ −ター）により浄化された。

２、ＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅ　ｌ　）クロ？ト’ｊ　７　’７−１ ’　−ＤＥＡＥセファセルのカラム１０ｍ１に注がれ、ＰＥバッファー（リン酸ナトリウム０．０２）１．　ｐＨ７，１２，０，００５）１のＥＤＴＡ）により平衡状態になった。分離された血清は、イオン交換カラムに供される前に、ＰＥバッファーによって１３０ｄの容積に希釈化された。サンプルの供給と溶離に際して、０．５ｄ／ｍｉｎの割合での流れが維持された。カラムの流れは元の血清タンパク質の５４％が（２８０ｎｍでの吸収により判定されて）含まれ、Ｌ３抗原活性は検知し得ない。このカラムはそれから多量のＰＥバッファーによって洗浄された。

Ｌ３抗原活性の溶離は、ＰＥバッファー内で、Ｏ−０，５ＭＮａ　Ｃｌに対して５０ｍ１の割合でなされた。溶離の間に、１１ｄ！の分画が集められた。この割合で続いて供給され、カラムはＰＥバッファー内で０．５ＭのＮａ　Ｃ１により洗浄され、最終的に同一のバッファー内で１．５ＭのＮａ　Ｃ１により洗浄された。Ｌ３抗原活性を包含する分画は、競合的阻止検定法を用いて同定され、プールされた。Ｌ３抗原活性は、溶離された血清タンパク質の塊のあとにわずかに尾を引いた。

いくつかの実験では、Ｌ３抗原活性は放射性標識化と免疫沈降分析の前に、僅かに異なった手順で清浄化された。

血清タンパク質はまず３０％の硫酸アンモニウムによって沈澱させられた。この沈澱物はＮ２０で分解され、ＤＥＡＥセファセルのカラムに供給される前に（セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５で）除塩される。Ｌ３活性の溶出はＮａＣ１溶液を加えることによって達成される。Ｎａ　Ｃ１を０、２５Ｍと０．５Ｍの間に溶離する分画は、Ｌ３抗原活性により高められ、その後のＬ３の放射性標識化のために用いられた。この方式で調製された抗原は、３．０００倍の清浄よりも多いものから沈澱されて放射性標識化された抗原からフィンガープリント（ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｉｎｔ）されるプロテアーゼによっては区別つけられない。

３、免疫親和性クロマトグラフィーＤＥＡＥセフ７セル（Ｓｅｐｈａｃｅ　ｌ　）のカラム（１４ｒｄ）からプールされた分画は、セフ７セルＣＬ４Ｂのカラム８．４−に供給され、このカラムは１７ｄのＰＢＳにより洗浄された。この洗浄物はそれから通過流に合わせられ、この混合物は４℃での回転によって、セフ１０−ズ（１０ｍｙ　１３／ｍレジン）に結合された容積１．５ｉの抗体によって１８時間で平衡化された。この混合物はカラムの中に注がれ、レジンは続いてＰＢＳ（４２ｄ）により洗浄された（ここでこのＰＢＳは０．２％（ｖ：Ｖ）ＮＰ４０（２８ｍ！りＰＢＳ　（１４ｄ）と、　０．０２８の酢酸アンモニウム（２８ｄ＞と、５８　ＮａＣ１（２８ＩｎＩｌ＞と、更に０．０２Ｍ　’の酢酸アンモニウム（５ｍｌ！　’）とを包含した）。Ｌ３抗原は上述したように、０．０７５Ｍのトリエチルアミン８．４− を加えることにより溶離された。この結果は第２表と第３表に要約して示されている。

Ｌ３抗体及び抗体４６Ｓ、１２Ｓの競合的結合標識されていない抗体４６５．１２３又は標識されていないＬ３抗体は、１２５ｉ−Ｌａ抗体（最終濃度０．３５ μｇ／ｍりと共に混合され、フォルマリン固定された肺癌細胞（５０，ＯＱＯ／ウェル）に加えられた。標識されていない抗体は、ハイブリドーマ上澄み液として用いられ、それぞれの抗体は最終検定における原容最の１／２に希釈された。

使用された抗体４６５．１２３溶液は、３５ｓ−メチオニン標識化細胞抽出物から精製されたＬ３抗体１マイクログラムにより沈降させられたものと同価の多くの抗原を沈降させるために十分な抗体を含んでいた。第４表に示す結果は、抗体４６５．１２３が、１２５Ｉ−１３抗体の結合に対して競合しないことを示している。このように、この二つの抗体は、別個のエピトープと認められ、したがって相異なった抗体であり、機能的等側体ではない。

ＣＡＬＵ−１ヒト肺癌細胞は、ブラウンら［ＢＩ’ＯＷｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ（ジャーナル　オブ　イムノロジー［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、］第１２７巻第５３９〜５４６頁（１９８１年））によって説明されたヨウ素化方法によって触媒化されたラクトパーオキダーセ［Ｉａｃｔｏｐｅｒ。

ｘｉｄａｓｅ］を用いて表面に標識された。Ｌ５抗原（抗体Ｌ５により限定される抗原のこと）は、細胞抽出物から沈澱せられ、還元状態で実施したニスデーニス−パージ［５Ｏ３−ＰＡＧＥＩによって分析された。分析する際に適宜、Ｌ５抗原は、Ｍ　ｒ１３５　、０００の単一のポリベプ°チド鎖として移動した。

アーゼで処理され、上記のクレベランドら［Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　ｅｔａｌ、］によって述べられたニスディーニス−パージ［５ＤＳ−ＰＡＧＥＩによって再び分析された。Ｖ８切断フラグメントのヨウ素化によって細胞表面に結果的に生じた“フィンガープリント”　［”ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ”　］は、Ｌ５抗原の診断に役立つ。すなわち、Ｍｒ　２４，０００及び１６，０００の切断フラグメントはＬ５抗原としての特性を示し、同様な分子量を有する他の抗原からＬ５抗原を見分けることになる。

（以下余白）第３表濃度＝５．８±２．６　ｕｇ／ｍ！！１分子量：　９４　、０００　形態　■ ７６、０００　形態　■ ２６．０００　形態　■ 移動度：　α−２ＰＩ：　４．２〜５．０（形態工及び形態■）Ｎ−末端アミノ酸　ＶＡＬ（形態 ■）１）７つの正常かつ健康な個体からの平均値（±標準偏差）として決定した。血清は、基準として培養培地から、免疫親和性精製されたＬ３抗原を用いた競合的結合検定法により、容積で５．７％の最終濃度状態で試験された。その値は、６６％に評価せられた（銀焼付けＳＯ３ＰＡＧＥゲルの濃度定量的走査によって）Ｒ準の製剤の純度に補正した。

な　し　９５２４　（１００）４６５．１２Ｓ　１００２８　（１０５）本発明は上述した実施例を特に参照することにより詳細に説明された。しかして、本発明の精神及び範囲内で、種々の変更及び改変を実施することが可能であることが理解されるであろう。

手続ネ甫正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８５１０２１３２゜シアトル　ファースト　アベニュー３０Ｑ５名　称　オンコーゲン代表者　シモンズ、ブラッドレイ、ダブリ１−国　籍　アメリカ合衆国６、補正の対象（１）特許法１８４条の５第１項の規定による円面の「特許出願人Ｊ（３）代理権を証明する書面７、補正の内容（１）別紙特許法１８４条の５第１項の規定による書面の通り（２）別紙明細書及び請求の範囲の浄書のとおり（内容に変更なし）（３）別紙委任状およびその訳文のとおり８、更正の理由（１）誤記の生じた理由本願特許出願人の名称を「オンコーゲン」とするところを「オンコーグン　リミテッド　パートナ−シップ」と誤記したのは錯誤によるものであります。

（２）誤記が意図されたものではないこと出願人の名称の誤記は単に過失により、合資会社の意である「リミテッド　パートナ−シップ」を出願人の名称に加えたものであって、故意作為的に成鳥申請しようとしたものでは決してありません。。

（３）更正の結果名称の変更となるものではないこと誤ってリミテッド　パートナ−シップを加えた出願人の名称「オンコーゲン　リミテッド　パートナ−シップ」を本来表示されるべき「オンコーグン」と訂正することは別紙添付の宣誓供述書及びその訳文のとおり、何ら法人を変更するものではありません。

９、添付書類（１）宣誓供述書及びその訳文　各１通（２）５去／Ｊバ崖ルｔ４す１及び°° 和ま紋　Ａ戸１１１国際調査報告ｐｒ、Ｔ／＋ｌ５ＩＩＳ／Ｑ：’１１

Claims

【特許請求の範囲】１．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ８６２６の識別特性を有するハイブリッド連続細胞系の培養株から得られるモノクローナル抗体であって、ヒト非小細胞肺癌細胞上の決定基に結合し、また該癌細胞によって分泌されたタンパク質抗原上の決定基に結合するモノクローナル抗体、ならびに該抗体の機能的等価体、結合フラグメントおよび免疫複合体。２．１ｇＧクラスのものである請求の範囲第１項の抗体。３．請求の範囲第１項の抗体を分泌する識別特性を有する細胞系。４．検知可能な信号を発し得る標識に接合された請求の範囲第１項のモノクローナル抗体。５．標識が螢光素である請求の範囲第４項のモノクローナル抗体。６．請求の範囲第１項の抗体を発現し得るマウスハイブリドーマ。７．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ８６２８の識別特性を有するハイブリッド連続細胞系の培養株から得られるモノクローナル抗体であって、ヒト非小細胞肺癌細胞の細胞表面タンパク質抗原に結合し、またポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された場合に約７２，０００ドルトンの分子量を有するモノクローナル抗体、ならびに該抗体の機能的等価体、結合フラグメントおよび免疫複合体。８．請求の範囲第７項の抗体を分泌する識別特性を有する細胞系。９．検知可能な信号を発し得る標識に接合された請求の範囲第７項のモノクローナル抗体。１０．標識が螢光素である請求の範囲第９項のモノクローナル抗体。１１．請求の範囲第７項の抗体を発現し得るマウスハイブリドーマ系。１２．請求の範囲第７項の抗体からなる組成物。１３．（ａ）ヒト非小細胞肺癌細胞の細胞表面抗原に結合し、また該癌細胞より分泌されたタンパク質抗原上の決定基に結合する抗体を産生するハイブリツト連続細胞系（ここで該細胞系は、脾細胞と同じ動物種から誘導された骨髄腫（ミエローマ）と融合された、該細胞表面抗原で免疫処置された動物脾細胞の細胞ハイブリットからなり、また該細胞系はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ８６２６の識別特性を有するものである。）、および（ｂ）該細胞系のための培養培地からなる組成物。１４．（ａ）ヒト非小細胞肺癌細胞の細胞表面抗原に結合する抗体を産生するハイブリッド連続細胞系（ここで該細胞系は、脾細胞と同じ動物種から誘導された骨髄腫と融合された、該細胞表面抗原を免疫処置された動物脾細胞された動物脾細胞の細胞ハイブリッドからなり、また該細胞系はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ８６２８の識別特性法。４３．サンプルが血清である請求の範囲第４２項の方法。４４．悪性細胞を含むことが予期されるサンプルにおける悪性細胞の検知のための方法であって、該サンプルを請求の範囲第２６項の抗原の存在に関して調べることからなる方法。