JPH0296658A - 肺癌の早期検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本願発明は癌の早期診断に関し、更に詳細には肺癌の早
期検出方法およびアシセイキットに関する。

本発明の背景 肺癌は依然として男女両性間における癌の主要な原因で
ある。臨床癌に先立って、１つまたはそれ以上の新生物
抗原の発現が認められると、幾つかの可能性のある治療
法が開けてくる。

ヒトでは４つのタイプの肺癌、即ち落屑性、アデノ、小
細胞および大細胞タイプの肺癌が見い出されている。各
腫瘍は特異的な分化徴候または表面表現型決定基を発現
し、それら全てによってこれら腫瘍細胞が正常細胞と区
別される。モノクローナル抗体診断技術の発展によって
、正常細胞を癌細胞と識別でき、そして癌細胞のタイプ
を他の癌細胞のタイプと識別できる試薬の製造が促進さ
れてきた。

気管支上皮細胞の形態学的異型性の喀痰細胞学スクリー
ニングはこれまでのところ定期的な、早期段階の肺癌検
出および治療にまでは至っていない。このことは、Ａｍ
、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、１３０．５４５〜５４９
、５５５〜５６０．５６１〜５６５および５６５〜５７
０．１９８４年に報告されているように、ナショナルキ
ャンサーインスティチュート（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａ
ｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）が後援した３つの機関に
よる大規模な合同研究で最も説得力をもって示された。

レントゲン写真スクリーニング単独と比べて、喀痰細胞
学スクリーニングを加えることが肺癌検出を顕著に高め
肺癌の死亡率を減少させるかどうかを決定するための研
究の１部として、ジョーンズホプキンスラングプロジェ
クト（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　ＬｕｎｇＰｒｏｊ
ｅｃｔ）は、４５才およびそれ以上の年令の男性喫煙者
から５乃至８年間に亘って連続的に吐きされた痰の細胞
学的検体および胸部レントゲン写真を得た。　１９７３
年から１９７７年までに、これら高危険度の個人を１０
，３８４人補充した。その半分を無作為抽出して細胞学
スクリーニングおよび胸部レントゲン写真を受けさせ、
他の半分はレントゲン写真だけでスクリーニングした。

細胞学スクリーニングは、余りにも疑似陰性が多く、感
度が不十分であることが見い出された。

小細胞および非−小細胞のヒト肺癌の抗原に対して産生
された数種のマウスモノクローナル抗体は腫瘍生物学、
肺癌免疫局在を研究しそして腫瘍起源に手がかりを与え
るために免疫組織化学的アッセイに使用されてきた。こ
れら抗体によって認識される抗原は種々の腫瘍並びに正
常な胎児組織で発現される。小細胞肺癌の抗原に関する
第１回国際ワークショップの会議録、ソーアミ（Ｓｏｕ
ｈａＩｌｉ）等、Ｌａｎｃｅｔ　２（８５５４）、３２
５〜３２６．１９８７年で要約されているように、肺の
小細胞および非−小細胞癌を研究するために調査されて
いるモノクローナル抗体は１００個近くもある。このワ
ークショップは、抗体の中央登録コード化を支持し、そ
の後援々の正常組織および新生物組織を盲染色した。そ
の結果の統計的な分析から、類似する複数の抗原決定基
が２つまたはそれ以上のモノクローナル抗体試薬によっ
て認識されることを示唆する反応性集団が定義されるこ
とになった。研究した抗原のいずれもが小細胞肺癌に特
異的でなかったしまた研究した小細胞肺癌検体の全てに
普遍的に存在していなかった。

これらの抗原決定基は、厳密な腫瘍マーカーというより
はむしろ分化のマーカーであると思われる。発癌物質に
暴露された個人での進行性新生物分化は、肺新生物の明
白な発生前に気管支上皮におけるこれらマーカーの発現
を増加させることがある。

マルシャイン（Ｍｕｌｓｌｉｉｎｓ）等は、米国特許第
４，５６９，７８８号中で、ヒトの非−小細胞肺癌を検
出し、そしてこのタイプの癌を他の全てのタイプの肺癌
および正常な相識細胞から区別するために使用できるモ
ノクローナル抗体を開示している。これら２つの抗体は
、腫瘍相識を試験することによって非−小細胞肺癌を他
の形態の肺癌から識別するためにキット形態で使用する
ことができる。

ヒトの癌を決定するために使用される他のモノクローナ
ル抗体の中には、ヒロハシ（Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ）等に
付与された米国特許第４，６８３，２００号のＩｇＭク
ラスのモノクローナル抗体がある。この特許で開示され
たモノクローナル抗体はヒト肺癌と反応性であり、癌に
罹っている患者の血清診断に使用することができる。

ルーア（Ｌｏｏｒ）等の米国特許第４　、６９０　、８
９０号は、各抗原に対する有効量の少なくとも１つのモ
ノクローナル抗体を含有する免疫測定二重サンドイツチ
アタセイを使用して少なくとも２つの抗原を検出する方
法を開示している。この技術はプロスタチン酸（Ｐｒｏ
ｓｔａｔｉｃ　ａｃｉｄ）ホスファターゼおよび前立腺
抗原を７ツセイするのに特に有用である。

タンズウェル（Ｔａｎｓｔｓｅｌｌ）等の第４，６２４
，９３０号は３つのレセプターと共にインキュベートす
ることによって多価抗体の存在を測定する方法を開示し
ており、その際第１のレセプターは完全抗体またはハプ
テンと共有結合した抗体であり、第２のレセプターは第
１のレセプターの１部とだけ結合し得る抗体であり、そ
して第３のレセプター（これは第２のレセプターと交叉
反応をしてはならない）は第１のレセプターが得られる
動物種とは異なる動物種から得られる抗原と結合可能な
抗体であることができる。

本発明の要約 上記したような先行技術における欠陥を克服することが
本願発明の１つの目的である。

肺癌の早期診断を提供することが本願発明のもう１つの
目的である。

肺癌の早期診断に使用するキットおよび技術を提供する
ことが本願発明の更にもう１つの目的である。

本願発明によれば、肺癌の発生に関連して増加して存在
する抗原を発現する細胞を検出するためにモノクローナ
ル抗体を使用することによって、従来検出可能であった
よりはるかに早い段階で。

成る場合には他の如何なるアッセイ法によるより２年以
上早く肺癌を検出することができる１本願発明の方法は
気管支液体または痰中の抗原の存在をアッセイすること
からなり、その際該方法では腫瘍関連抗原１分化抗原、
クラス■若しくはクラス■抗原、または正常気管支細胞
対異形成気管支細胞対新生物気管支細胞で分化して発現
される全ての抗原を認識する抗体が使用される１本方法
は。

報告された上述のジョーンズホブキンスの研究を含む全
ての以前のアッセイ方法より肺癌検出ではるかに敏感に
反応することが見い出された。

本願発明による方法で使用可能な検出系には標準的な免
疫測定検出系があり、これにはエリザ（ＥＬＩＳＡ）法
、細胞選別アッセイまたは蛍光活性化細胞選別アッセイ
、ウェスターン法アッセイ、免疫沈降アッセイ、比色ア
ッセイまたはデンシトメトリーに基づくアッセイ等が含
まれる。

本願発明の技術を使用して、小細胞の糖脂質抗原および
非−小細胞肺癌の蛋白質抗原に対するネズミモノクロー
ナル抗体を、上記のジョーンズホブキンスラングプロジ
ェクトに参加した人々から得た保存痰検体に適用した。

本来、痰の細胞学スクリーニングの有効性を評価するた
めに行った上記研究では、高危険度の参加者の半分（現
在１日当たり少なくとも１箱のタバコを吸っている、少
なくとも４５才の男性５２２６人）を無作為に割り当て
て細胞病理学分析の検体を作った。その後の５年から８
年に亘る定期スクリーニング中に、６２６人（１２％）
は中程度またはより大きい異型性を示した。この内６９
人（癌に進行した者２６人、進行しなかった者４３人）
を無作為に選択して、盲検の改良モノクローナル抗体免
疫染色プロトコール用とした。形態学的異型性を有する
満足のゆく検体は、最終的に癌に進行した２２人の患者
の内１４人で陽性に免疫染色され（感度６４％）、肺癌
に進行しなかった４０人の患者の内３５人で非反応性（
特異性８８％）であった。染色されなかった、疑似陰性
異型性を再検討すると、それらは平均して癌診断のＢ７
ケ月前に集められていたことが示された。対照的に、真
の陽性検体は診断の２４ケ月前に集められていた。元々
は疑似陰性であった人の、より後の平均して癌の２６ケ
月前の検体は陽性に染色され、感度は旧％に改良された
。７乃至８年間の追跡スクリーニング中に肺癌を発現し
なかったヒトから集めた真の陰性の検体での特異性は８
８％であった。

かくして、本願発明のアッセイ法では、以前の３研究所
の合同研究で集めた試料を使用して、患者が肺癌の臨床
的徴候を示すより２年前までにそれら患者の肺癌を確認
した。このアッセイ法は非常に早期の段階の肺癌を検出
するこれまでの研究で使用された方法よりはるかに敏感
に反応した。

それ故、臨床癌の２年前に新生物抗原発現を認識するこ
とが肺癌阻止、検出および治療の研究の価値ある中間終
了点となろう。

本発明の詳細な説明 本願発明によれば、抗原存在の増加が肺癌の発生と関連
する抗原を発現する気管支液体または痰中の細胞を検出
するために抗体が使用される。本アッセイは喫煙者、ア
スベストにさらされている労働者等を含む肺癌の危険性
のある患者に特に有用である６本アッセイはエリザ法、
放射性イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学ルミ
ネセンス　イムノアッセイ、細胞選別または蛍光活性化
細胞選別アッセイ、ウェスターン法アッセイ、免疫沈降
アッセイ、比色またはデンシトメトリーに基づくアッセ
イ等を含む任意の慣用タイプのイムノアッセイであるこ
とができる。

上記した細胞スクリーニングは超音波的にエアゾール化
した平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ　Ｂ５５）の２５分間吸
入かまたは高張塩類溶液の１５分間吸入かのいずれかの
痰誘導からなっていた。得られた痰の分別物はパパニコ
ロー（Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ）染色および解釈用に
スライドガラス上に塗布した。残りの材料はホモジネー
トし、濃縮し、そしてサツコマンノ（Ｓａｅｃｏｍａｎ
ｎｏ）等、Ａｃｔａ　Ｃｙｔｏｌ、　７．３０５〜３１
０．１９６３年に記載されているようにして、標準法を
使用してサツコマンノの保存溶液（ｓｐｓ、５０％エタ
ノール中２％のポリエチレングリコール）中に入れた。

スライドはまた、５Ｐｓ−保存材料からもパパニコロニ
ー染色用に調製された。誘導後４ケ月目そして更に８ケ
月目に、　　ｓｐｓの瓶をこれら参加者に郵送した。そ
の後３日間の毎朝、　　ｓｐｓを含有する瓶に痰を吐き
出し、こうして集めた検体は細胞学分析のため研究所に
返送された。

前記したように、５２２６人の男性を細胞学的スクリー
ニングを受けるために割り当てた。本プロジェクトの進
行中に、これら参加者の６２６人（１２％）は１つまた
はそれ以上の検体で、上部気道癌および変形性胸部外−
次物を除いて、中程度またはより大きい異型性を有して
いた。痰細胞学で少なくとも中程度の異型性を有する者
には第２の痰誘導を受けさせた。このような検体は全て
、ｓＰｓに入れ、将来研究するために所蔵した。

これら６２６人の参加者の最初の異型性細胞学検体は表
１に示すように４つの群に分けた。２つの群は２回のス
クリーニングで中程度の異型性を示す痰を有する参加者
からなっていた。即ち、１群。

肺癌が発生しなかった５３７人（８６％）および■群、
肺癌に進行した４０人（６，４％）からなっていた。４
つの主要な肺癌細胞型は全て■群で示された２１２人は
落屑性であり、９人は小細胞であり、７人は腺型であり
、８人は大細胞でありそして４人はその他または混合型
であった。

■および■群は少なくとも２回顕著な異型性を有した参
加者からなっていた。■群は癌に進行しなかった３人（
０，５％）からなっていた。■群は非−小細胞肺癌に進
行した４６人（７，４％）からなっており、４１人は落
屑性に、３人は腺癌に、そして２人は大細胞癌に進行し
た。この範躊には小細胞癌はなかった。実際、ジョーン
ズホプキンスラングプロジェクトの研究で検出された小
細胞癌は全てスクリーニング中にレントゲン写真によっ
て検出されたかまたは臨床的に注目されたかのどちらが
であった。

表１ 貯蔵病検体を有するＪＨＬＰ参加者の異型性の強さおよ
び肺癌発生による割当て ６２６人（１００％）　　中程度の異型性５３７人（８
６％）　　　１群　　異型性く顕著（×２）肺癌なし ４０人（６６４％）　　ｍ群　　異型性〈顕著（×２）
１２人　落屑性 ９人　小細胞 ７人　線型 ８人　大細胞 ４人　その他、混合型 ３人（０，５％）　　ｍ群　　異型性≧顕著（×２）肺
癌なし ４６人（７，４％）　　■群　　異型性≧顕著（×２）
４１人　落屑性 ３人　線型 ２人　大細胞 総６２６人の検体から、即ちこれら４つの群から得た試
料を無作為に選択して免疫染色した。サンプリングした
フラクションは表２に示す、癌に進行しなかった５３７
人の内、平均して９６．８ケ月（３４ケ月から１４２ケ
月の範囲）の間追跡した１群の４０人は無作為に選択し
た。癌に進行した者、即ちｍ群の４０人および■群の４
６人の内、各細胞型層、即ち群■および■からそれぞれ
１５人および１１人の対象を無作為に選択した０群■の
３症例（癌に進行しなかった顕著な異型性）は全てを選
択した。これら手順によって総６９例の選択が得られ１
次いで１それらを下記の盲検のモノクローナル抗体免疫
染色プロトコールのためにコード化した。

表２ サンプリングフラクション ｎ　　選択　　　％ １ｎ−５３７４０７，４ ｎ群”　　　４０　　　１５　　　３７．５■群　　　
３　　　３　　１００．０ ■群’　　　４６　　　１１　　　２３．９小細胞癌（
コード番号５３４Ｆ８．６００Ａ６および６２４Ｈ１２
）の糖脂質抗原および非−小細胞癌（コード番号７０２
Ａ６．７０３Ｄ４および７０４Ａ＋）の蛋白質抗原に特
異性を有するＮＣｌ−ネイビーメディカルオンコロジ−
ブランチ（Ｎａｖｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ　Ｂｒａｎｃｈ）のモノクローナル抗体の特徴は以前
に報告されている。ファージオン（Ｆａｒｇｉｏｎ）等
、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４６゜２６３３〜２６３
Ｊｌ、１９８６年；マルシャイン（Ｍｕｌｓｈｉｎｅ）
等、Ｊ、　Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１．１．３１．４９７〜５
０２．　１９８３年；ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）等、　Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４４．２０５２〜２０６１．１
９８４年：スビタルニク（Ｓｐｉｔａｌｎｉｋ）等、Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

４６、４７５１〜４７５５参照。１つのＳＣＣＭａｂ（
６２４Ｈ１２）および１つのＮ５ＣＣＭａｂ（７０３０
４）をこの研究のために選択した。これらのモノクロー
ナル抗体は米国特許節４，５６９，７８８号の主題であ
り、参考文献として本願明細書に組み入れる。ビオチン
化した抗−ラットＩｇＭはチムドラボラトリーズ（Ｚｙ
ｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）　（カリフォルニア州すウスサンフランシス
コ）から購入した。ビオチン化した抗−マウスＩｇＧ、
抗−ウマＩｇＧ、抗−ウサギＩｇＧ、およびアビジン−
ビオチン−ペルオキシダーゼコンプレックス（ＡＢＣ）
試薬は全てベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）　（カリフォルニア州バーリンゲーム）から
購入した。

ジョーンズホプキンスオンコロジーセンターで維持され
ている細胞株から得た小細胞癌（ＳＣＣ）および非−小
細胞肺癌（ＮＳＣＣ）肺腫瘍細胞はＳＦ３中で保存し、
陽性対照として使用した。各々ＳＦ３中で貯蔵した痰検
体および対照細胞は短時間回転させて再）！！濁させ１
次いでシャンドンサザンインスッルメント（Ｓｈａｎｄ
ｏｎ　５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍａｎｔｓ）　
（ペンシルベニア州セビックレイ）から購入したサイト
スピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）遠心装置を使用してスライ
ドガラス上に置いた。

１つの「実施」からその次の「実施」までの変動が本研
究の結果全体に影響を与える可能性があるので、各痰検
体の多数のスライドを染色して染色変動の影響を最小に
した。多くの場合、１０個のスライドを染色した。即ち
２種（ＳＣＣおよびＮ５ＣＣ）の抗体の各々で５個ずつ
染色した０個々の検体は各検体の少なくとも１つのスラ
イドを２つの各抗体で別々に染色してＳＣＣおよびＮ５
ＣＣ抗体との交叉反応性も評価した。

本方法で使用した染色プロトコールの完全な説明はグプ
タ（Ｇｕｐｔａ）等、　　Ｄｉａｇｎ、　Ｃｙｔｏｐａ
ｔｈｏＪ、、　１゜１３３〜１３６．１９８５年に含ま
れている。本方法を通して、スライドは低くセットした
磁気撹拌器を使用して、０．０１Ｎのりん酸緩衝生理、
食塩水（ｐＨ７，４）で洗浄した。インキュベーション
は全て密閉した加湿室中室温（２５℃）で実施した。簡
単に言えば、免疫染色法はマーカー特異性の第１の抗体
溶液、次いで厘次、ビオチン化した第２の抗体溶液（第
１の抗体溶液が生じる免疫グロブリンの種／サブクラス
に対して向けられる）、ビオチン化した第３の抗体溶液
（第２の抗体に対して向けられる）、アビジン−ビオチ
ン−コンプレックス（ＡＢＣ）試薬、そして最後に基質
−色素原溶液（ＰＢＳ中０．０１％の過酸化水素および
０．０５％のジアミノベンチジン）の適用に関係してい
た０次いで検体は、０．１２５％のメチレンブルーで逆
染色し、定型的な方法によりスライドに載せた。

完成した標本は、検体がその後肺癌に進行した参加者か
ら作成されたか否かを知らない２人の観察者が別々に評
価した。その結果は、コード化した確認書並びに使用し
た抗体および対照検体のようなプロトコールの技術的特
徴に関係するデータの記録手段が含まれている特別にデ
ザインした報告書に記録した。即ち、上皮（異型および
新生物の）細胞および炎症性細胞の数と型並びに陽性に
染色した細胞の定性的および定量的特徴を記録した。

染色強度は、陽性対照と比較して陰性乃至擬陽性（±）
から強度に陽性（４＋）までの範囲の尺度を使用して２
人の［１者が別々に等級分けした。モノクローナル抗体
（抗−５ＣＣおよび抗−ＮＳＣＣ）のどちらかのセット
との各肺癌症例の免疫細胞化学反応性は、各標本に与え
られた得点の合計を各検体の標本の総数で割って決定し
た。２＋またはそれ以上の染色強度だけを疑いのない陽
性とした。陰性検体は２＋の強度で染色しなかった異型
細胞を含む検体として定義した。腫瘍または異型細胞の
完全な不存在、炎症性細胞の不確定量の存在、スライド
全体の非特異的「パックグランランド」染色または非特
異的染色の過剰な値の存在は検体を満足的でないと記録
する根拠であるとみなした。表３参照。

表３ 染色の定義 ！、満足的でない 検体品質（４〜８年間保存） １、弁脚性材料だけを含有 ２４　　過剰炎症 ３、過剰の細胞変性 ４、異型細胞を有さない原性材料 技術的 １、過度の「バックグランド」染色 ２、染色の完全な欠如 ■、陰性 異型細胞が検体に存在するが染色なし ■、陽性 染色≧２＋／４＋ 選択した６９検体の内、２６検体は肺癌に進行した参加
者から得た。これらの内４２（１５％）は満足的でない
ものであり、表４に示すように、肺癌に進行しなかった
４３人の参加者中に見られた満足的でない染色検体の割
合（７％）と有意には違ってぃなかった。満足的でない
染色を有する参加者は解析がら除いた。肺癌に進行した
参加者がら得た満足的でない検体の内、３分の２（２２
の内１４）は抗体と陽性の反応性を示した（感度６４％
）。対照的に、肺癌に進行しなかった者の４０の内３５
（特異性８８％）は染色しなかった。最終的に肺癌が発
生する参加者がら得た前癌性検体がＳＣＣかまたはＮ５
ＣＣモノクロ一ナル抗体かのどちらかで染色する可能性
は非常に有意であった。　（ＯＲ：１２．２５．９５％
Ｃ，１，＝　２．３２〜３６．０８、ｐ＝０．０Ｏ０４
）。

表４ Ｊ　）ｉ　Ｌ　Ｐが貯蔵した最初の異型性痰検体に適用
したモノクローナルＡｂ表面マーカーのダブル−ブリッ
ジイムノベルオキシダーゼ染色の結果 肺癌　　肺癌なし 総計 満足的 染色＋　　　　１４　　　　５　　　　１９小計　　　
　　２２　　　　４０　　　　６２満足的でない　　　
４　　　３　　　７総計　　　　　　２６　　　　４３
　　　　６９次いで、染色パターンを２種（ＳＣＣ，Ｎ
５ＣＣ）の抗体細胞型について別々に試験した１表５に
示されるように、バパニコロー塗布の結果は顕著な異型
性より小さかったが小細胞肺癌を発生した５人の参加者
の内５入金てが小細胞抗体で染色された。

この表には示されていないが、小細胞前癌性検体も全て
非−小細胞抗体で染色された（１００％陽性の交叉−染
色）。

表５ 細胞型に特異的なモノクローナルＡｂ表面マーカーのタ
ブルーブリッジイムノベルオキシダーゼの結果 小細胞Ａｂ 小細胞癌を有する者の総数 染色された ％ バパニコロー塗布 く顕著（×２）≧顕著（×２） 非小細胞Ａｂ 非小細胞癌を有する者の総数　　　９８染色された　　
　　　　　２７ ％　　　　　　　　　２２８８ 表５に示されるように、痰細胞学パパニコロー塗布結果
は顕著な異型性より小さかったが非−小細胞癌に進行し
た９人の参加者の内、２人（２２％）しか非−細胞抗体
で染色されなかった。対照的に、異型性が２回顕著であ
ったかまたは明らかな癌を示したとき、非−小細胞前癌
性検体の内の１例を除く全て（８例の内７例、または８
８％）は非−小細胞抗体で染色された。これら１７のＮ
５ＣＣ検体の中で。

１例（顕著な異型性）しか小細胞抗体で染色されなかっ
た（６％陽性の交叉−染色）。

２２例の疑似陰性異型性（染色されなかった）の内８例
を再検討して、表６に示されるように、それらは平均し
て癌が診断される５７ケ月前に集められたことが示され
た。対照的に、真の陽性検体（２２の異型性の内１４）
は診断より約２４ケ月前に集められていた。癌を発生し
なかった参加者は７年から８年間追跡した。この癌に罹
っていない期間の持続によってこれら後者の検体は真の
陰性であると認められる。

１期の肺癌が痰細胞学の形態学的変化によって検出可能
であり、上首尾に切除が行われ、そして肺癌死亡率の低
下がもたらされるという仮説はジョーンズホブキンスラ
ングプロジェクトの研究の結果によっては支持されてい
なかった。痰細胞学スクリーニングに加えて胸部レント
ゲン写真を受けた二重スクリーン群とレントゲン写真で
スクリニングした群は同一の生存率および死亡率を有し
ていた。検出と介在の双方の失敗が上記結果の原因であ
った。残念乍ら、スクリーニング期間中に生じた新たな
癌の５１％は「休止期間」であったかまたは定期的な細
胞学スクリーニングによってもレントゲン写真スクリー
ニングによっても検出されなかった臨床症例であった。

更に、検出された半分の内５７％だけが外科的介在に対
して十分良好に局在していた、即ち１期６本プロジェク
トの生存もより初期の研究の生存と比較した。二重スク
リーン群および対照群の双方で全体の年令−および喫煙
−調整肺癌死亡率はスクリーニングしなかった集団の死
亡率より小さかった。それ故、胸部写真に痰の細胞形態
学スクリーニングを加えたことによる死亡率の利益はな
かったと結論された６二重スクリーン群での肺癌のほぼ
３分の２　（２３３の内１４７．または６３％）は細胞
形態学が陽性でなかった者で生起した。このｗ４察は、
異型性の不存在と比較すると、形態学的異型性の存在が
その後に続く肺癌の発生に対して十分敏感に反応する中
間指示物ではないことを示している。そうではあるが、
異型性が存在するとき、それは癌が発生する危険性の高
いことを反映する合理的な前兆であることが示された。

８年から１０年間のスクリーニング中、異型性を有して
いない参加者４６００人中で発生した１４７例（３％）
の肺癌と比べて、少なくとも中程度の異型性を有する６
２６人の内８６人（１４％）が肺癌に進行した。更に、
異なる細胞型が全てこれらの異型性検体中で示される。

最終的に生じる肺癌の細胞型は前癌異型性での別個の形
態学的特徴によって区別することはできなかった。それ
にも拘らず、大部分の肺癌症例では、痰の細胞学での前
癌の形態学的変化は明らかでなかった。このことは、剥
離した上皮細胞の検査が早期検出の中間終了点を提供で
きる場合、形態学的規準は他の指標によって補オつれな
ければならないことを示唆している。

計画によって、少なくとも中程度の異型性形態学を示し
た各対象の入手可能な最初の検体を染色した。最終的に
癌が発生した免疫染色陽性老中、表６に示されるように
、痰検体は臨床的肺癌が発生する約２年（２３，８ケ月
）前に集められていた。癌になったが検体は染色されな
かった（疑似陰性）者のデータの再検討に際しては、痰
採集時期と肺癌発生時期との間の４年以上（５７，２ケ
月）の平均間隔が抗体結合の可能性に悪影響を与えたで
あろうと仮定した。腫瘍進行に関連Ｉ、た細胞分化が膜
の糖脂質抗原の実質的変化を導くことが可能であった。

抗原は臨床的癌より４年程も前には発現していなかった
だろうが、癌の臨床的徴候より２年前には発現していた
ことも可能である。

表６ 最初の異型性病検体採集からの癌の発生までまたは最後
の追跡までの平均持続月数 肺　癌　　　肺癌なし 染色＋　　２３．８　　　　８３゜８ 染色−５７，２９６，７ 表′２ 非小細胞癌に進行した者の、く顕著な（×２）のババニ
コロー塗布形態学を有する痰検体の染色結果最初の異型
　最後の入手 性検体°　　可能な検体本 非小細胞癌を有する者の総数　　　９９染色した　　　
　　　　２８ ％　　　　　　　　　２２８９ °平均：癌の４０ケ月前 本平均：ｉの２６ケ月前 表８ Ｊ）ＩＬＰが貯蔵した最も新しい異型性病検体に適用し
たモノクローナルＡｂ表面マーカーのダブル−ブリッジ
イムノベルオキシダーゼ染色の結果肺癌　　肺癌なし　
　総計 満足的 染色＋　　　　　２０　　　　５　　　　２５小計　　
　　　２２　　　　４０　　　　６２満足的でない　　
　４　　　３　　　７総計　　　　　　２６　　　　４
３　　　　６９感度＝９１％　０．１＋、＝７０ 特異性＝８８％　９５％Ｃ，１，＝　１０．４６〜２９
７．８力イ二乗＝３５．６３、Ｐ（ＩＸＩＯ−”表５に
示されるように、非−小細胞癌に進行し続け、少なくと
も２回顕著な異型性より小さかった９人の参加者の内、
２人（２２％）だけが免疫染色陽性であった。これらの
参加者では、痰検体採集と肺癌発生との間の平均間隔は
１表７に示されるように、　４０ケ月であった。これら
の者から得た。

より新しい検体（平均して癌より２６ケ月前）も同様に
免疫染色するために選択した。より初期の結果と対照し
て、これら後者の９検体の内８検体（８９％）に免疫染
色を続けた。染色されなかった１つの検体は技術的に満
足できるものでなかった。感度衣の再作成、即ち表８は
、２年以内に肺癌に進行した者の内２人を除いて全員が
染色されたこと。

即ち９１％の感度を示している。肺癌に進行しなかった
者の特異性は８８％のままであった。それ故、肺癌に進
行する者の３分のＪだけに初期に生じる形態学的な上皮
細胞変化に加えて、癌より少なくとも２年前に発現する
。肺癌患者の９０％以上から得られる剥離痰細胞上に細
胞表面マーカーが存在するように思われる。

顕著な異型性を有する３人の参加者は畏期間追跡したが
、肺癌は発生しなかった（群■）、３人の内１人は異型
性痰の後９８１ケ月生存している。彼の異型性病検体は
Ｎ５ＣＣもＳＣＣ免疫染色のどちらも続けることはでき
なかったが、以後正常に戻っていた。別の１人は異型性
痰の８９ケ月後に心血管症で死亡した。彼の痰検体も免
疫染色を続けることはできなかったが、正常に戻ってい
た。３ｉ目の人は彼の異型性痰の８６ケ月後に結賜癌で
死亡した。

彼の痰検体はＮ５ＣＣ染色を続けたがＳＣＣ染色は続け
なかった。そして該検体には最後の検査時に中程度の異
型性が残っていた。それ故、これらの結果は上記した高
いＭａｂ特異性と一致している。

上記アッセイに使用した小細胞抗体は、上述の（ＳＣＣ
−Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）クラスター（Ｃ
１ｕｓｔｅｒ）　５抗原によって定義された結合親和性
を示さなかった。これら抗原の部位は組織固定後に保持
されており、他のＳＣＣ抗原より特異的であるように思
われる。該抗原は、成る程度他の神経内分泌１．を壇上
に存在しそしてＮ５ＣＣ腫瘍では僅かしか存在しない１
００ＫＯの糖蛋白質で発現されるように思われる。

通常の潜在性胸膜幹細胞から得たＳＣＣおよびＮ５ＣＣ
の通常の病因論によって、実施したアッセイでの異なる
腫瘍型間で観察された交叉反応性の幾つかは説明するこ
とができる。

使用した大部分の検体は５年から８年までの間貯淑した
ままであったことに注意すべきである。

かくして、細胞材料はこの期間中に品質が低下した可能
性がある。第２に、検体ホモジネート化法の過酷さによ
って細胞表面上の抗原が破壊または改変され、その結果
どんな染色も完全に欠如することがあったろう。

自動染色法は変動を減少させそして技術的に不満足なス
ライドの頻度を減少させる。染色の自動定量によって、
解釈における主観可能性が最小になる。

本願発明のアッセイは抗体、試験すべき気管支細胞また
は痰細胞および適当なスクリーン技術、例えばイムノア
ッセイ、免疫沈降アッセイ、または免疫組織化学アッセ
イからなる診断キットで使用するのに適している。標的
細胞の外部供給源はキットの成分に加える。キットには
アッセイで使用する抗体源およびアッセイ用のスクリー
ニング手段が含まれる。

典型的なキットはモノクローナル抗体用の容器手段、上
記標的細胞をモノクローナル抗体と結合させるためのプ
レートまたはスライド手段並びに上記容器手段、上記プ
レートまたはスライド手段および上記検出手段を組み合
せするための包装手段からなる。

臨床的癌より前に１つまたはそれ以上の新生物抗原の発
現が認識されると幾つかの可能性のある代替治療法が利
用できる。進取的な選択的気管支鏡検査法およびより早
い時期の外科かまたはレーザー光線療法かのいずれかが
、新たに検出された本来の場所の癌または微小浸潤性癌
のために考慮されよう、治療した肺癌の治療的モニタリ
ング中には早期検出および局部治療も適切であろう。し
かし乍ら、栄養介在がモノクローナル抗体によって検出
可能な前癌期から腫瘍への進行を停止させるかまたは元
に戻すのに有効である場合、肺癌患者の生存に対して最
大の効果が生じろであろう。

本発明は成る特定の実施態様に関連して上記したが、多
くの変更が可能であり、また代替材料および試薬が本発
明から離れることなく使用できることが理解されよう。

このような変更および代替は実験を要する場合もあるが
、これは定型的な試験に関わるにすぎないものである。

特定の実施態様に関する上記記載は本発明の一般的性質
を十分明らかにしているので、他のものは、現在の知識
を適用することによって、一般的な概念から離れること
なく、このような特定の実Ｍ１態様を容易に修正しおよ
び／または種々の適用に適合させることができ、その結
果このような適合および修正は、開示された実施態様の
均等物の意味および範囲内に包含されるように意図する
ものである１本願明細書の語法または用５５は説明する
ためであって限定するためのものではないことを理解す
べきである。

代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、身体から試料、特に痰若しくは気管支液体または他
   の任意の肺組織若しくは局所リンパ節を含む気道物質を
   得、そして 上記試料をモノクローナル抗体で抗原の存在（この存在
   の増加は肺癌の発生と関係がある）についてアッセイす
   る、 ことからなる肺癌の早期検出方法。 ２、抗原が、腫瘍関連抗原、分化抗原およびクラス I
   またはII抗原からなる群から選択される特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３、モノクローナル抗体が、７０４Ａ１と称されるＩｇ
   Ｇ２ＡＫモノクローナル抗体および７０３Ｄ４と称され
   るＩｇＧ２ＡＫモノクローナル抗体、ＩｇＭモノクロー
   ナル抗体５３４Ｆ８、６２４Ａ１２、６００Ａ６からな
   る群から選択される特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。 ４、定量および定性アッセイが免疫染色アッセイ、エリ
   ザ法アッセイ、細胞選別アッセイ、蛍光アッセイ、ウェ
   スターン法アッセイ、免疫沈降アッセイ、比色アッセイ
   およびデンシトメトリーに基づくアッセイからなる群か
   ら選択される特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、免疫染色が、 マーカーに特異的な第１の抗体溶液を適用し、ビオチン
   化した第２の抗体溶液を適用し、その際該第２の抗体は
   第１の抗体が生じる免疫グロブリン種に対して向けられ
   ている、 上記第２の抗体に対して向けられるビオチン化した第３
   の抗体溶液を適用し、 アビジン−ビオチン−コンプレックス試薬および色素原
   基質溶液を適用し、そして 検体をメチレンブルーで交叉染色し、この検体を読み取
   りのためスライドに載せること、からなること並びに他
   の認められた免疫染色変法である特許請求の範囲第４項
   に記載の方法。 ６、放射性同位元素標識、色素産生性標識、酵素標識か
   らなる群から選択される検出手段、肺癌の発生に関連し
   て存在が増加する抗原に対するモノクローナル抗体、 痰気管支液体から得た標的細胞または上記抗原を試験す
   るための他の肺細胞に関連して使用されるキットの上記
   要素、その際該キットには上記標的細胞と上記モノクロ
   ーナル抗体とを組み合せるための容器手段並びに該容器
   手段、上記組合せ手段および上記検出手段を組み合せる
   ための包装手段が含まれる、 からなる肺癌の早期診断用の断診キット。