WO2022230991A1 - 口腔腫瘍性病変の検出方法、検査試薬、検査キット、及び治療用組成物 - Google Patents

口腔腫瘍性病変の検出方法、検査試薬、検査キット、及び治療用組成物 Download PDF

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百合 野田
幸治 蔦
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学校法人関西医科大学
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Definitions

  • the present invention relates to methods for detecting oral neoplastic lesions, test reagents, test kits, and therapeutic compositions.
  • Non-Patent Document 2 phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein
  • Non-Patent Document 3 cervical cancer
  • gastric cancer Non-Patent Document 4
  • ovarian cancer Non-Patent Document 5
  • OS overall survival
  • PFS progression-free survival
  • An object of the present invention is to provide biomarkers that enable early detection and diagnosis of oral cancer and precancerous lesions.
  • MLKL mixed lineage kinase domain-like protein
  • Section 1 A method for detecting oral neoplastic lesions, comprising detecting phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) in oral tissues or oral cavity-derived cells collected from a subject.
  • Section 2. Item 2. The detection method according to Item 1, wherein the oral neoplastic lesion is squamous cell carcinoma or dysplasia.
  • Item 3. Item 3. The detection method according to Item 2, wherein the squamous cell carcinoma is well-differentiated squamous cell carcinoma.
  • Section 4. Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the oral tissue is the superficial layer of squamous epithelium, or the oral cavity-derived cells are derived from the superficial layer.
  • a method of using phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) to detect oral neoplastic lesions in the oral cavity Item 6. 5. A test reagent for use in the detection method according to any one of Items 1 to 4, comprising an anti-phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) antibody. Item 7. Item 6. A test kit for use in the detection method according to any one of Items 1 to 4, comprising the test reagent according to Item 6. Item 8. A test reagent comprising an anti-phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) antibody for detecting oral neoplastic lesions for use in the oral cavity. Item 9. Item 9.
  • a test kit for detecting oral neoplastic lesions for use in the oral cavity comprising the test reagent according to Item 8.
  • Item 10 A therapeutic composition comprising an anti-phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) antibody for treating oral neoplastic lesions for use in photoimmunotherapy.
  • MLKL mixed lineage kinase domain-like protein
  • biomarkers for oral cancer and precancerous lesions.
  • the biomarkers can also be targets for photoimmunotherapy and the like.
  • FIG. 1a shows the results for inflamed tissue.
  • the left image of FIG. 1a is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 1a is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 1b shows the results of tissue undergoing hyperplasia.
  • the left image of FIG. 1b is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 1b is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 1c shows an example of positive p-MLKL in inflammatory lesions.
  • the left image of FIG. 1c is an HE-stained image
  • FIG. 1c is an immunostained image of p-MLKL. Immunostaining images of p-MLKL in premalignant lesions (OED) are shown.
  • Figure 2a shows the histological results of a mild dysplasia case. The left image of FIG. 2a is an HE-stained image, and the right image of FIG. 2a is an immunostained image of p-MLKL.
  • Figure 2b shows the histological results of a moderate dysplasia case. The left image of FIG. 2b is an HE-stained image, and the right image of FIG. 2b is an immunostained image of p-MLKL.
  • Figure 2c shows the histological results of a high-grade dysplasia case. Fig.
  • FIG. 2c left is an HE-stained image
  • Fig. 2c right is an immunostained image of p-MLKL.
  • Immunostaining images of p-MLKL in squamous cell carcinoma are shown.
  • Figures 3a and 3b show the results of tissues in which p-MLKL signals were strongly positive.
  • the left images of FIGS. 3a and 3b are HE-stained images
  • the right images of FIGS. 3a and 3b are immunostained images of p-MLKL.
  • FIG. 3c shows the results for tissues that were moderately positive for p-MLKL signal.
  • Fig. 3c left is an HE-stained image
  • Fig. 3c right is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 4a shows the histological results of a well-differentiated squamous cell carcinoma case.
  • the left image of FIG. 4a is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 4a is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 4b shows the histological results of a case of Basaloid squamous cell carcinoma.
  • the left image of FIG. 4b is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 4b is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 4c shows the tissue results of a poorly differentiated squamous cell carcinoma case in which the p-MLKL signal became positive.
  • FIG. 4c left is an HE-stained image and Fig. 4c right is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 5 shows the positive rate of p-MLKL in non-neoplastic tissues, premalignant lesions (OED), and squamous cell carcinoma (OSCC). Numerical values in the table indicate "positive number (positive rate (%)”.
  • FIG. 6 shows the results of sensitivity, specificity, PPV, and NPV regarding detection of oral squamous cell carcinoma using p-MLKL.
  • FIG. 6a shows the test accuracy when p-MLKL was determined to be positive in the surface layer.
  • Figure 6b shows the accuracy of the test when p-MLKL was tested positive in either superficial or sublayer.
  • FIG. 7a shows the test accuracy when p-MLKL was determined to be positive in the surface layer.
  • Figure 7b shows the accuracy of the test when p-MLKL was tested positive in either superficial or sublayer.
  • Certain embodiments of the present invention relate to methods for detecting oral neoplastic lesions.
  • the detection method involves detecting phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) in oral tissue taken from a subject.
  • MLKL mixed lineage kinase domain-like protein
  • oral neoplastic lesions can include squamous cell carcinoma, dysplasia that can be said to be precancerous lesions thereof, non-neoplastic inflammation, and the like.
  • the oral neoplastic lesion is squamous cell carcinoma or dysplasia.
  • Squamous cell carcinoma can include well differentiated squamous cell carcinoma, moderately differentiated squamous cell carcinoma, and poorly differentiated squamous cell carcinoma.
  • Squamous cell carcinoma is more preferably well-differentiated squamous cell carcinoma.
  • Dysplasia can include mild dysplasia, moderate dysplasia, and high-grade dysplasia. Moderate dysplasia and high-grade dysplasia are more preferred as dysplasia.
  • MLKL Mixed lineage kinase domain-like protein
  • necroptosis a type of cell death that is involved in the development of organisms and the growth of cancer.
  • Non-phosphorylated MLKL is phosphorylated in the cytoplasm by necroptosis stimulation, which inhibits the activity of caspase 8, an apoptosis-related factor. It has been reported that phosphorylated MLKL (also called p-MLKL) translocates to the plasma membrane, forms membrane pores, and promotes the influx of extracellular matrix into the cytoplasm, thereby participating in the development of necroptosis.
  • the 358th serine (Ser 358) from the N-terminal side and the 345th serine (Ser 345) from the N-terminal side have been reported.
  • the subject may or may not be a patient suspected of having an oral neoplastic lesion.
  • the oral tissues collected from the subject are not limited as long as p-MLKL can be detected.
  • tissue collected by biopsy, tissue resected by surgery, tissue (cell population) contained in a scraped sample of oral mucosa, tissue (cell population) contained in a stamped sample of oral tissue (cell population), tissue contained in saliva ( population of cells), etc. can be used as oral tissue.
  • tissue collected by biopsy, tissue resected by surgery, tissue (cell population) contained in a scraped sample of oral mucosa, tissue (cell population) contained in a stamped sample of oral tissue (cell population), tissue contained in saliva ( population of cells), etc. can be used as oral tissue.
  • a scraping sample of the oral mucosa can be collected by directly scraping the oral cavity of the patient with a cotton swab or slide glass.
  • An imprinted sample of oral tissue can be collected by pressing a biopsy tissue or resected tissue against a slide glass.
  • Tissues contained in saliva can be collected by centrifugation or filtering after
  • the biopsy tissue or resected tissue should be treated with a known fixative such as formalin and paraformaldehyde before detecting p-MLKL.
  • a fixative such as formalin and paraformaldehyde
  • paraffin-embedded blocks are prepared.
  • a biopsy tissue or resected tissue is fixed or not fixed, and then embedded in a resin for producing a frozen block such as OCT Compound (registered trademark) to produce a frozen block.
  • the prepared paraffin-embedded block or frozen block is sliced to prepare a tissue section, which is used for the detection of p-MLKL.
  • Scraping samples, stamped samples, tissues contained in saliva, or cells derived from the oral cavity can be used for the detection of p-MLKL after fixing the slide glass to which they are attached with alcohol or the like.
  • the method for detecting p-MLKL is not limited as long as p-MLKL can be detected in the oral tissue collected from the subject. Detection of p-MLKL can be performed, for example, by immunostaining.
  • a known method can be used for immunostaining. For example, a thin section prepared from a paraffin-embedded block is subjected to deparaffinization and hydrophilic treatment, followed by blocking and reaction with an anti-p-MLKL antibody. If necessary, antigen activation treatment, endogenous peroxidase inactivation treatment, or endogenous alkaline phosphatase inactivation treatment may be performed before blocking.
  • the antigen retrieval treatment can be performed, for example, by immersing the section in a citrate buffer of about pH 5.8 to 9.0 at about 95°C to 100°C for about 20 to 40 minutes. However, other methods may be adopted for this treatment as long as they can activate the antigen.
  • inactivation treatment of endogenous peroxidase is also known, and can be performed by adding hydrogen peroxide and using methanol or the like.
  • Endogenous alkaline phosphatase inactivation treatment is also known, and can be performed using alcohol to which hydrochloric acid has been added, or an aqueous acetic acid solution.
  • sections prepared from frozen blocks are blocked after washing the embedding resin with water or buffer, and reacted with anti-p-MLKL antibody.
  • Antigen activation, endogenous peroxidase inactivation, or endogenous alkaline phosphatase inactivation may be performed prior to blocking according to the methods described above.
  • the scraped sample, the stamped sample, or the tissue contained in saliva is washed with water or the embedding resin with a buffer, then blocked and reacted with the anti-p-MLKL antibody.
  • Antigen activation, endogenous peroxidase inactivation, or endogenous alkaline phosphatase inactivation may be performed prior to blocking according to the methods described above.
  • Anti-MLKL (phospho S358) (Clone ID: EPR9514; Catalog No. ab187091, RRID: AB_2619685; Abcam), Phospho-MLKL (Ser358) Polyclonal Antibody (PA5105678; Thermo Fisher), Phospho-MLKL (Ser358) used for immunostaining ) (D6H3V) Rabbit mAb (#91689 Cell signaling), Phospho-MLKL (Ser345) Antibody (Mouse Specific) (#62233 Cell signaling), Phospho-MLKL (Ser358) (D6H3V) Rabbit mAb (#91689 Abcam), Anti- MLKL (phospho S358) antibody [EPR9514] (ab187091; Abcam), MLKL phospho (Ser358) antibody (ARG40184; arigo biolaboratories, Phospho-MLKL (Ser345) Antibody, clone 7C6.1 (Sigma Aldrich),
  • Immunostaining may be a direct method or an indirect method.
  • the anti-p-MLKL antibody is directly labeled with a fluorescent substance, peroxidase, alkaline phosphatase, or other labeling substance, and the signal from these labeling substances is used as an index to bind to p-MLKL in the tissue on the slide glass.
  • Anti-p-MLKL antibody is detected.
  • unlabeled anti-p-MLKL antibody primary antibody
  • unlabeled anti-p-MLKL antibody primary antibody
  • a secondary antibody that can bind to the primary antibody.
  • the secondary antibody is labeled with a fluorescent substance, peroxidase, alkaline phosphatase, or other labeling substance, and anti-p-MLKL bound to p-MLKL in the tissue on the slide glass using the signal from these labeling substances as an indicator. Perform antibody detection.
  • the labeling substance is a fluorescent dye
  • p-MLKL in the tissue on the slide glass is detected by confirming the fluorescent signal emitted from the fluorescent dye with a fluorescence microscope.
  • the labeling substance is peroxidase
  • diaminobenzidine DAB
  • p-MLKL in the tissue on the slide glass is detected by confirming the chromogenic signal of the substrate with an optical microscope.
  • the labeling substance is alkaline phosphatase
  • new fuchsin is used as a substrate
  • p-MLKL in the tissue on the slide glass is detected by confirming the chromogenic signal of the substrate with an optical microscope. After immunostaining, counterstaining may be performed.
  • the determination of whether the p-MLKL signal in the tissue is positive or negative can be made by the following method.
  • the signal distribution area of p-MLKL in two fields of view can be scored as " ⁇ 10%" or ">10%".
  • One field of view can be, for example, a 100x field of view (objective 10x eyepiece 10x).
  • staining intensity can be scored as 0 (no signal), 1 (mild), 2 (moderate), or 3 (strong).
  • a distribution area ⁇ 10% and a staining intensity of 0 and 1 can be defined as negative staining, and a distribution > 10% and a staining intensity of 2 or 3 as positive staining.
  • the squamous epithelial tissue in the oral cavity is composed of five layers from the oral cavity side: the stratum corneum, the intermediate or granular layer, the spinous layer, and the basal layer.
  • a layer consisting of the stratum corneum and the intermediate or granular layer is classified as the superficial layer, and the spinous layer and the basal layer are classified as the lower layer.
  • p-MLKL can appear in both the superficial layer and the lower layer, it is preferable to detect p-MLKL in the superficial layer in this embodiment.
  • Immunoassays include Enzyme-Immuno assay (EIA) using an enzyme as a labeling substance, Fluorescence-Immuno assay (FIA) using a fluorescent substance as a labeling substance, Radio-immuno assay (using a radioactive isotope as a labeling substance), immunochromatography Gram-based lateral flow immunoassays may be included.
  • EIA includes an ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method in which an antigen is sandwiched between an antigen-capturing antibody and a detecting antibody and detected.
  • Antibodies used in immunoassays can be, for example, the antibodies described in (1) above.
  • the specimen used for immunoassay is not limited as long as it contains cells derived from the oral cavity.
  • Specimens may include immunoassay scraping samples obtained by scraping the oral cavity with a cotton swab or the like, saliva, and the like.
  • a scraping sample for immunoassay or saliva itself may be used as a specimen.
  • a scraped sample for immunoassay or saliva to which a solubilizing agent that degrades cell membranes and mucus in saliva may be used as a sample.
  • an anti-p-MLKL antibody for antigen capture is immobilized in advance on a solid phase such as a microplate, fluorescent beads, or magnetic beads, and the immobilized anti-p-MLKL antibody and p-MLKL in the sample form a complex.
  • a solid phase such as a microplate, fluorescent beads, or magnetic beads
  • the immobilized anti-p-MLKL antibody and p-MLKL in the sample form a complex.
  • p-MLKL contained in the sample can be detected, or p-MLKL can be detected. Concentration can be measured.
  • a complex may be first formed between an anti-p-MLKL antibody for antigen capture and p-MLKL in the specimen, and then the complex may be immobilized on a solid phase.
  • the method for immobilizing the anti-p-MLKL antibody for antigen capture onto the solid phase is not particularly limited. This can be done directly, using known methods, or indirectly through another material. Direct binding includes, for example, physical adsorption and the like. Specifically, using an immunoplate or the like, each complementary antibody can be physically bound directly to a microplate. Alternatively, an anti-p-MLKL antibody for antigen capture may be indirectly immobilized on a solid phase. Indirect immobilization of capture antibodies to fluorescent beads, magnetic beads, etc. is known.
  • the shape of the solid phase is not particularly limited, and examples include microplates, microtubes, test tubes, beads, and membranes.
  • the material of the solid phase is not particularly limited, and for example, polystyrene, polypropylene and the like can be used for microplates, microtubes, test tubes and the like.
  • polystyrene Xmap registered trademark
  • MagPlex registered trademark
  • microspheres Luminex
  • membranes nitrocellulose filters, nylon filters, paper and the like can be used.
  • the method may include an operation of washing the solid phase following formation of the complex.
  • PBS or the like containing a surfactant or the like can be used.
  • the complex is detected by using a detection anti-p-MLKL antibody labeled with a labeling substance in the case of a conventional immunoassay method, or by using an unlabeled anti-p-MLKL antibody. It can be performed using an anti-immunoglobulin antibody or the like labeled with a labeling substance capable of binding.
  • a labeled anti-p-MLKL antibody is used for detection.
  • the epitope of the anti-p-MLKL antibody antigen used for detection is different from the epitope of the anti-p-MLKL antibody antigen used for antigen capture.
  • a competitor is a peptide or protein having an epitope recognized by the same capturing antibody as p-MLKL in the sample.
  • a competitor may be isolated from an individual, or may be genetically engineered or chemically synthesized.
  • the anti-p-MLKL antibody, the labeled anti-immunoglobulin antibody, or the labeling substance labeled with the competitor used for detection is not particularly limited as long as it produces a detectable signal.
  • Examples include fluorescent substances, radioactive isotopes, metal nanoparticles and enzymes. Enzymes include alkaline phosphatase, peroxidase and the like. Examples of fluorescent substances include fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, fluorescent dyes such as Alexa Fluor (registered trademark), and fluorescent proteins such as GFP. Radioisotopes include 125 I, 14 C, 32 P, and the like. Examples of metal nanoparticles include gold nanoparticles and silver nanoparticles. Among these, gold nanoparticles, alkaline phosphatase, or peroxidase are preferred as the labeling substance.
  • the anti-p-MLKL antibody used for detection is obtained by labeling each antibody with the above labeling substance by a labeling method known in the art.
  • the label may be labeled using a commercially available labeling kit or the like.
  • the labeled immunoglobulin antibody may be labeled using the same method as for the anti-p-MLKL antibody, or commercially available products may be used.
  • the p-MLKL contained in the sample can be detected or the p-MLKL concentration can be measured by detecting the signal generated by the labeling substance of the detection antibody contained in the complex.
  • detecting a signal includes qualitative detection of the presence or absence of a signal, quantification of signal intensity, and semi-quantitative detection of signal intensity.
  • Semi-quantitative detection means that the intensity of the signal is indicated in stages such as “no signal”, “weak”, “medium”, “strong”, and the like.
  • the intensity of the signal is preferably detected quantitatively or semi-quantitatively.
  • a known method can be used to detect a signal.
  • a measurement method can be appropriately selected according to the type of signal derived from the labeling substance.
  • the labeling substance is an enzyme
  • a signal such as light or color generated by reacting a substrate with the enzyme can be measured visually, with a fluorometer, luminometer, spectrophotometer, or the like.
  • the substrate for the enzyme can be appropriately selected from known substrates according to the type of enzyme.
  • the substrate is CDP-Star (registered trademark) (4-chloro-3-(methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyloxy [3.3.1.13,7]Decan]-4-yl)phenyl phosphate disodium), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), 5- chromogenic substrates such as disodium bromo-6-chloro-indolyl phosphate, p-nitrophenyl phosphate and the like;
  • TMB tetramethylbenzidine
  • the labeling substance is a radioactive isotope
  • radiation as a signal can be measured using a known device such as a scintillation counter.
  • fluorescence as a signal can be measured using a known device such as a fluorescence microplate reader, Luminex (registered trademark) system (Luminex). Note that the excitation wavelength and fluorescence wavelength can be appropriately determined according to the type of fluorescent substance used.
  • the labeling substance is gold nanoparticles
  • the red color of the gold nanoparticles aggregated by the antigen-antibody reaction may be detected as a signal. may be detected. Color development by metal nanoparticles or color development by silver sensitization may be confirmed visually, or the density may be measured optically.
  • Immunoassays using metal nanoparticles as labeling substances are, for example, lateral flow immunoassays in which capture antibodies and detection antibodies are carried on a nitrocellulose filter, and specimens are reacted with capture antibodies and detection antibodies and antigens according to the principle of chromatography. It is preferable to use
  • the signal detection result can be used as the concentration value of p-MLKL.
  • the measured value of the signal intensity itself or a value calculated from the measured value of the signal intensity can be used as the concentration value of p-MLKL.
  • the p-MLKL concentration value can be determined based on a predetermined reference value.
  • the predetermined reference value is not limited as long as it is a value that can most accurately classify whether p-MLKL is positive or negative.
  • the "most accurately classifiable value" can be appropriately set based on indices such as sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value depending on the purpose of the test.
  • the predetermined reference value may be the value of p-MLKL concentration in individuals without oral neoplastic lesions, the average value thereof, or the like.
  • the subject's p-MLKL concentration value is higher than a predetermined reference value, it means that p-MLKL has been detected.
  • the p-MLKL concentration value of the subject is equal to or lower than the predetermined reference value, it means that p-MLKL was not detected.
  • the p-MLKL concentration value of the subject is higher than a predetermined reference value, it can be determined that the subject has an oral neoplastic lesion. Also, if the value of the p-MLKL concentration of the subject is equal to or less than a predetermined reference value, it can be determined that the subject does not have an oral neoplastic lesion.
  • the region to be examined (also called the region of interest) in the oral cavity is directly labeled with a fluorescent substance, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, or other labeling substance.
  • Anti-p-MLKL antibody is applied, and after washing, the signal of the labeling substance is detected.
  • the labeling substance is a fluorescent substance
  • a fluorescence signal is detected.
  • a chemiluminescent substrate is used to detect the luminescence signal. The signal can be detected using a bioimaging analyzer or the like.
  • Test Reagents and Test Kits for Use in In Vitro Detection Methods An embodiment of the present invention includes the above 1. 2. Regarding the test reagent for detecting p-MLKL used in the method for detecting oral neoplastic lesions described in .
  • a test reagent for detecting p-MLKL contains one or more anti-p-MLKL antibodies (eg, primary antibodies) capable of binding at least a portion of p-MLKL.
  • anti-p-MLKL antibodies eg, primary antibodies
  • Any of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and fragments thereof eg, Fab, F(ab'), F(ab) 2 , etc.
  • the antibody may be one screened from an antibody library, or may be a chimeric antibody, scFv, or the like.
  • the anti-p-MLKL antibody preferably binds to MLKL phosphorylated at Ser 358 or Ser 345, for example.
  • the commercially available antibody described in 1 above may be used as the anti-p-MLKL antibody.
  • the antibody does not necessarily have to be purified, and may be antiserum containing the antibody, ascites, an immunoglobulin fraction fractionated therefrom, or the like.
  • test reagents include stabilizers such as ⁇ -mercaptoethanol and DTT; protective agents such as albumin; surfactants such as polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate and polyoxyethylene (10) octylphenyl ether; At least one preservative such as sodium azide may be included.
  • Antibodies that bind to p-MLKL may be labeled with enzymes or fluorescent dyes.
  • the p-MLKL detection test reagent may be provided as a test kit that includes a package insert that describes the test reagent and how to use the reagent, or the URL of the web page that describes how to use the reagent.
  • the test kit may contain a secondary antibody labeled with metal nanoparticles, an enzyme, or a fluorescent dye.
  • the test kit may contain a substrate that reacts with the enzyme.
  • the primary antibody contained in the test kit may be bound to the carrier described in 1.(2) above as a capture antibody.
  • the primary antibody which is the capture antibody
  • the secondary antibody which is the detection antibody
  • a dissolving agent for dissolving the sample may be included in the kit.
  • test Reagents and Test Kits for Use in In Vivo Detection Methods Certain embodiments of the present invention are described in 2. above. 1. relates to a test reagent for detecting p-MLKL used in the method for detecting oral neoplastic lesions in the oral cavity. For a description of the test reagent for detecting p-MLKL, see 3. above. is hereby incorporated by reference.
  • the p-MLKL detection test reagent may be provided as a test kit that includes a package insert that describes the test reagent and how to use the reagent, or the URL of the web page that describes how to use the reagent.
  • the test kit may contain a secondary antibody labeled with an enzyme or a fluorescent dye.
  • the test kit may contain a substrate that reacts with the enzyme.
  • Photoimmunotherapy and therapeutic composition for treating oral neoplastic lesions used in photoimmunotherapy is a method of killing target cells by irradiating them with light of
  • photosensitizers include IRdye700DX (IR700) dye, which is a soluble silicon phthalocyanine derivative.
  • the wavelength of the light to be irradiated is from red to near-infrared wavelengths, eg, 680 nm to 700 nm.
  • Light irradiation can be performed, for example, at about 150 mW/cm 2 in the range of 8 to 32 Jules/cm 2 .
  • the therapeutic composition contains an anti-p-MLKL antibody conjugated with a photosensitizer.
  • a description of the antibody can be found in 3. above. is incorporated herein by reference.
  • Tissue Preparation Tissues taken from patients were formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE), and tissue microarrays (TMA) were prepared. Sections with a thickness of 4 ⁇ m were prepared from a single case, immunostained for p-MLKL, and tumor sites showing stronger staining intensity were used for analysis. On the paraffin-embedded block corresponding to the section, the area of tumor that showed stronger staining intensity was marked and punched out with a 2 mm biopsy needle. A paraffin block piece obtained by punching was embedded in another paraffin to prepare a TMA. A TMA sample was prepared by slicing TMA to a thickness of 4 ⁇ m.
  • TMA specimens were immunostained for p-MLKL.
  • Immunohistochemical staining of TMA specimens with Anti-MLKL (phospho S358) (Clone ID: EPR9514; Catalog No. ab187091, RRID: AB_2619685; Abcam; dilution ratio 1:250) was performed on the BOND III automated stainer (Leica Biosystems, Melbourne, Australia). At this time, antigen retrieval was performed at pH 6 at 100°C for 40 minutes.
  • BOND Epitope Retrieval Solution 1 (#AR9961) citrate-based buffer (pH 6.0) was used as the antigen retrieval solution.
  • the stained specimens were scored under a light microscope by two pathologists (Y.N. and K.T.). Scoring of p-MLKL was performed in two regions: (i) the superficial layer, which includes the stratum corneum and granular or intermediate layers, and (ii) the lower layer, which includes the spinous and basal layers.
  • the distribution of p-MLKL was scored as ' ⁇ 10%' or '>10%' in area of distribution for two regions, with staining intensity of 0 (no staining), 1 (mild), 2 (moderate). , or 3 (strong).
  • a distribution area ⁇ 10% with a staining intensity of 0 and 1 was defined as negative, a distribution > 10% with a staining intensity of 2 or 3 as positive. Staining intensity was evaluated with a positive signal in the cell membrane or cytoplasm.
  • FIG. 1 shows immunostained images of p-MLKL in non-neoplastic lesion cases.
  • FIG. 1a shows the results for inflamed tissue.
  • the left image of FIG. 1a is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 1a is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 1b shows the results of tissue undergoing hyperplasia.
  • FIG. 1b left is an HE-stained image
  • FIG. 1b right is an immunostained image of p-MLKL.
  • 34 (97%) of 35 non-neoplastic inflammation, hyperplasia, and normal cases were negative.
  • FIG. 1c A positive signal of p-MLKL was confirmed in the granular layer/intermediate layer in one case with inflammation.
  • the results are shown in FIG. 1c.
  • the left image of FIG. 1c is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 1c is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 2 shows an immunostaining image of p-MLKL in a precancerous lesion (OED).
  • Figure 2a shows the histological results of a mild dysplasia case.
  • the left image of FIG. 2a is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 2a is an immunostained image of p-MLKL.
  • Figure 2b shows the histological results of a moderate dysplasia case.
  • Fig. 2b left is an HE-stained image
  • Fig. 2b right is an immunostained image of p-MLKL.
  • Figure 2c shows the histological results of a high-grade dysplasia case.
  • Fig. 2c left is an HE-stained image
  • 2c right is an immunostained image of p-MLKL.
  • the p-MLKL signal was confirmed in either the surface or lower layer in 73 cases (59%), and was confirmed in the surface layer in 62 cases (50%).
  • FIG. 3 shows immunostained images of p-MLKL in squamous cell carcinoma.
  • Figures 3a and 3b show the results of tissues in which p-MLKL signals were strongly positive.
  • the left images of FIGS. 3a and 3b are HE-stained images, and the right images of FIGS. 3a and 3b are immunostained images of p-MLKL.
  • Figure 3c shows the results for tissues with moderate p-MLKL signal.
  • Fig. 3c left is an HE-stained image
  • Fig. 3c right is an immunostained image of p-MLKL.
  • the p-MLKL signal was confirmed in either the superficial or lower layer in 84 cases (71%), and was confirmed in the superficial layer in 76 cases (64%). was done.
  • FIG. 4 shows an immunostained image of p-MLKL in squamous cell carcinoma.
  • Figure 4a shows the histological results of a well-differentiated squamous cell carcinoma case.
  • the left image of FIG. 4a is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 4a is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 4b shows the tissue results of a case of Basaloid squamous cell carcinoma, a subtype of poorly differentiated squamous cell carcinoma.
  • the left image of FIG. 4b is an HE-stained image
  • the right image of FIG. 4b is an immunostained image of p-MLKL.
  • FIG. 4c shows the tissue results of a poorly differentiated squamous cell carcinoma case in which the p-MLKL signal became positive.
  • Fig. 4c left is an HE-stained image and
  • Fig. 4c right is an immunostained image of p-MLKL.
  • p-MLKL positive signals were frequently observed in well-differentiated OSCC (53 cases, 85%), and a tendency for positive signals to be distributed in the superficial layer and keratinocytes was confirmed.
  • FIG. 6 shows the results of sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) for detection of oral squamous cell carcinoma using p-MLKL.
  • PPV positive predictive value
  • NPV negative predictive value
  • the detection sensitivity of well-differentiated squamous cell carcinoma is 90%, the specificity is 97%, and the PPV is 98%. If collected, p-MLKL may be used as an index to identify well-differentiated squamous cell carcinoma.
  • Figure 7 shows the results of obtaining sensitivity, specificity, PPV, and NPV in precancerous lesions when p-MLKL was used. Regarding the accuracy of the test when p-MLKL was positive in the superficial layers, approximately 50% to 70% of the moderately to severely dysplastic tissues requiring treatment were positive (Fig. 7a).

Abstract

本発明は、口腔癌や前癌病変を早期に発見し、診断が可能なバイオマーカーを提供することを課題とする。　被検者から採取された口腔組織、又は口腔由来細胞におけるリン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）を検出することを含む、口腔腫瘍性病変の検出方法により、課題を解決する。

Description

口腔腫瘍性病変の検出方法、検査試薬、検査キット、及び治療用組成物
　本発明は、口腔腫瘍性病変の検出方法、検査試薬、検査キット、及び治療用組成物に関する。
　本邦の口腔癌患者数は、過去30年間で約3倍に増加し、年間約22500人の発症、7900人超の死亡が予測されている。しかしながら、舌、歯肉、頬粘膜、口底、口蓋に生じる口腔癌や前癌病変の認知度は依然として低く、発見や診断の遅れから、多くが進行した状態で発見されるため５年生存率は60％と低い（非特許文献１）。また、進行した状態で発見されることから、発見後に、拡大手術の適応例が多く、外科的切除で生じた構音、摂食障害、顔貌変化でその後の生活に支障が生じる場合が少なくない。
　一方、リン酸化型のmixed lineage kinase domain-like protein（p-MLKL）は、大腸癌（非特許文献２）、子宮頸癌（非特許文献３）、胃癌（非特許文献４）、卵巣癌（非特許文献５）では、タンパク質レベルで、腫瘍におけるp-MLKLの発現低下と、予後の悪化や化学療法抵抗性との間に相関が見出されている。また、近年、口腔扁平上皮癌において、p-MLKLの存在量の増加は、全期間生存率（OS）の低下や無増悪生存率（PFS）の低下を来すことが報告されている（非特許文献６）。
Mortality database No. of deaths-Malignant neoplasm of lip, oral cavity and pharynx, both sexes. WHO. Li X, et al. Technol Cancer Res Treat. 2017;16(4):428-434. Ruan J, et al. Int J Clin Exp Pathol. ;8(11):15035-8. Sun W, et al. Oncol Lett. 2019 ;18(4):3830-3836. He L, et al. Onco Targets Ther. 2013;6:1539-43. Li J, et al. Cell Death Dis. 2020;11(5):391.
　上記の現状に鑑みると、口腔癌や前癌病変のQOLや生存率を改善するためには、病変の早期発見、適切な診断、及び早期治療が重要である。しかし、現状では、口腔癌や前癌病変を早期に発見し、診断が可能なバイオマーカーは見つかっていない。
　本発明は、口腔癌や前癌病変を早期に発見し、診断が可能なバイオマーカーを提供することを課題とする。
　本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、口腔癌や前癌病変において、リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）の存在量が増加すること見出した。　本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
　項１．被検者から採取された口腔組織、又は口腔由来細胞におけるリン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）を検出することを含む、口腔腫瘍性病変の検出方法。
　項２．前記口腔腫瘍性病変が、扁平上皮癌、又は異形成である、項１に記載の検出方法。
　項３．前記扁平上皮癌が、高分化扁平上皮癌である、項２に記載の検出方法。
　項４．前記口腔組織が扁平上皮の表層であるか、口腔由来細胞が表層に由来する、項１から３のいずれか一項に記載の方法。
　項５．口腔内において、口腔腫瘍性病変を検出するための、リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）の使用方法。
　項６．抗リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）抗体を含む、項１から４のいずれか一項に記載の検出方法に使用するための検査試薬。
　項７．項６に記載の検査試薬を含む、項１から４のいずれか一項に記載の検出方法に使用するための検査キット。
　項８．口腔内において使用される、口腔腫瘍性病変を検出するための抗リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）抗体を含む、検査試薬。
　項９．項８に記載の検査試薬を含む、口腔内において使用される、口腔腫瘍性病変を検出するための検査キット。
　項１０．光免疫療法において使用される、口腔腫瘍性病変を治療するための抗リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）抗体を含む治療用組成物。
　口腔癌や前癌病変に特性の高い、バイオマーカーを提供できる。また、前記バイオマーカーは、光免疫療法等の標的となり得る。
非腫瘍性病変症例におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図１aは、炎症を起こしている組織の結果を示す。図１a左は、HE染色画像であり、図１a右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図１bは、過形成を起こしている組織の結果を示す。図１b左は、HE染色画像であり、図１b右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図１cは、炎症病変において、p-MLKLが陽性となった例を示す。図１c左は、HE染色画像であり、図１c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。 前癌病変（OED）におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図２aは、軽度異形成症例の組織の結果を示す。図２a左は、HE染色画像であり、図２a右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図２bは、中等度異形成症例の組織の結果を示す。図２b左は、HE染色画像であり、図２b右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図２cは、高度異形成症例の組織の結果を示す。図２c 左は、HE染色画像であり、図２c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。 扁平上皮癌におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図３a及び図３bは、p-MLKLのシグナルが強陽性であった組織の結果を示す。図３a及び図３bの左は、HE染色画像であり、図３a及び図３bの右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図３cは、p-MLKLのシグナルが中等度陽性であった組織の結果を示す。図３c左は、HE染色画像であり、図３c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。 扁平上皮癌におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図４aは、高分化扁平上皮癌症例の組織の結果を示す。図４a左は、HE染色画像であり、図４a右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図４bは、類基底細胞癌（Basaloid squamous cell carcinoma）症例の組織の結果を示す。図４b左は、HE染色画像であり、図４b右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図４cは、低分化扁平上皮癌症例において、p-MLKLのシグナルが陽性になった例の組織の結果を示す。図４c左は、HE染色画像であり、図４c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。 図５は、非腫瘍性組織、前癌病変（OED）、扁平上皮癌（OSCC）におけるp-MLKLの陽性率を示す。表内の数値は、「陽性数（陽性率（％）」を示す。 図６は、p-MLKLを用いた場合の口腔扁平上皮癌の検出に関する感度、特異度、PPV、NPVを求めた結果を示す。図６aは表層においてp-MLKLが陽性と判定された場合の検査精度を示す。図６bは表層又は下層のいずれかにおいてp-MLKLが陽性と判定された場合の検査精度を示す。 図は、p-MLKLを用いた異形成の検出に関する感度、特異度、PPV、NPVを求めた結果を示す。図７aは表層においてp-MLKLが陽性と判定された場合の検査精度を示す。図７bは表層又は下層のいずれかにおいてp-MLKLが陽性と判定された場合の検査精度を示す。
１．口腔腫瘍性病変の検出方法
　本発明のある実施形態は、口腔腫瘍性病変の検出方法に関する。検出方法は、被検者から採取された口腔組織におけるリン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）を検出することを含む。
　本明細書において、口腔腫瘍性病変には、扁平上皮癌、その前癌病変ともいえる異形成、非腫瘍性の炎症等を含み得る。検出方法において、口腔腫瘍性病変は、扁平上皮癌、又は異形成であることが好ましい。扁平上皮癌には、高分化扁平上皮癌、中分化扁平上皮癌、及び低分化扁平上皮癌を含み得る。扁平上皮癌として、高分化扁平上皮癌がより好ましい。異形成には、軽度異形成、中等度異形成、及び高度異形成を含み得る。異形成として、中等度異形成、及び高度異形成がより好ましい。
　mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）は、生物の発生や癌の増殖に関与する細胞死の一種であるネクロプトーシスの発生に重要な働きを行う細胞質内及び、膜に存在するタンパク質である。非リン酸化状態のMLKLは、ネクロプトーシス刺激によって、アポトーシス関連因子のCaspase 8の活性が阻害されることで、細胞質内でMLKLのリン酸化が起る。リン酸化MLKL（p-MLKLともいう）は細胞膜へ移行し、膜孔を形成し、細胞質内への細胞外基質流入を促すことで、ネクロプトーシスの発生に関与することが報告されている。MLKLのリン酸化部位としては、N末端側から358番目のセリン（Ser 358）、N末端側から345番目のセリン（Ser 345）が報告されている。本明細書において、MLKLのSer358のリン酸化を検出することが好ましい。
　被検者は、口腔腫瘍性病変を疑う患者であってもよく、疑わない患者であってもよい。
　被検者から採取される口腔組織は、p-MLKLを検出できる限り制限されない。例えば、生検により採取された組織、手術による切除組織、口腔粘膜の擦過試料に含まれる組織（細胞の集団）、口腔組織の捺印試料に含まれる組織（細胞集団）、唾液に含まれる組織（細胞の集団）等を口腔組織として使用することができる。さらに、口腔由来細胞として、口腔粘膜の擦過試料に含まれる細胞、口腔粘膜の捺印試料に含まれる細胞、唾液に含まれ細胞等を使用することができる。口腔粘膜の擦過試料は、綿棒やスライドグラスで、直接患者の口腔内を擦過することで採取することができる。口腔組織の捺印試料は、生検組織や切除組織をスライドグラスに押しつけることで、採取することができる。唾液に含まれる組織は、被検者から唾液を採取した後、遠心分離やフィルタリングにより組織を回収することができる。
（１）免疫染色によるp-MLKLの検出
　免疫染色によってp-MLKLを検出する場合、生検組織、又は切除組織は、p-MLKLを検出する前にホルマリン、及びパラホルムアルデヒド等の公知の固定液で固定してから、パラフィン包埋ブロックを作製する。あるいは、生検組織、又は切除組織を固定してから、若しくは固定せずに、ＯＣＴコンパウンド（登録商標）等の凍結ブロック作製用の樹脂に包埋し、凍結ブロックを作製する。作製したパラフィン包埋ブロック、又は凍結ブロックを薄切して組織切片を作製し、p-MLKLの検出に供する。
　擦過試料、捺印試料、又は唾液に含まれる組織、又は口腔由来細胞は、これらを付着させたスライドグラスを、アルコール等で固定してから、p-MLKLの検出に供することができる。
　p-MLKLの検出方法は、被検者から採取された口腔組織において、p-MLKLを検出できる限り制限されない。p-MLKLの検出は、例えば免疫染色で行うことができる。
　免疫染色は、公知の方法を使用することができる。例えば、パラフィン包埋ブロックから作製された薄切切片は、脱パラフィン処理、親水処理を行った後に、ブロッキングを行い、抗p-MLKL抗体と反応させる。必要に応じて、ブロッキングの前に、抗原の賦活化処理、内因性ペルオキシダーゼの不活化処理又は内因性アルカリフォスファターゼの不活化処理を行ってもよい。抗原賦活化処理は、例えば、95℃から100℃程度のpH 5.8～9.0程度のクエン酸バッファーに、20分から40分程切片を浸漬することにより行うことができる。しかし、この処理は、抗原を賦活化できる限り他の方法を採用してもよい。また、内因性ペルオキシダーゼの不活化処理も、公知であり、過酸化水素を加えメタノール等を使用して行うことができる。内因性アルカリフォスファターゼの不活化処理も、公知であり、塩酸を添加したアルコールや、酢酸水溶液を使用して行うことができる。
　また、凍結ブロックから作製した切片は、水や、バッファーで包埋用の樹脂を洗浄した後、ブロッキングを行い、抗p-MLKL抗体と反応させる。上述の方法に従って、ブロッキングの前に、抗原の賦活化処理、内因性ペルオキシダーゼの不活化処理又は内因性アルカリフォスファターゼの不活化処理を行ってもよい。
　擦過試料、捺印試料、又は唾液に含まれる組織は、固定後、水や、バッファーで包埋用の樹脂を洗浄した後、ブロッキングを行い、抗p-MLKL抗体と反応させる。上述の方法に従って、ブロッキングの前に、抗原の賦活化処理、内因性ペルオキシダーゼの不活化処理又は内因性アルカリフォスファターゼの不活化処理を行ってもよい。
　免疫染色に使用する、Anti-MLKL (phospho S358)（Clone ID：EPR9514；カタログ番号ab187091、RRID：AB_2619685；Abcam）、Phospho-MLKL (Ser358) Polyclonal Antibody（PA5105678；Thermo Fisher）、Phospho-MLKL (Ser358) (D6H3V) Rabbit mAb （#91689 Cell signaling）、Phospho-MLKL (Ser345) Antibody (Mouse Specific) （#62233 Cell signaling）、Phospho-MLKL (Ser358) (D6H3V) Rabbit mAb（ #91689 Abcam）、Anti-MLKL (phospho S358) antibody [EPR9514] （ab187091；Abcam）、MLKL phospho (Ser358) antibody （ARG40184；arigo biolaboratories、Phospho-MLKL (Ser345) Antibody, clone 7C6.1（Sigma Aldrich）、MLKL (phospho Ser358) antibody （＃GTX00973 Gene Tex）、Anti-Phospho-MLKL (S358) Monoclonal Antibody（＃MP00535 Boster Biological Technology）、Anti-phospho-MLKL (S358) antibody (STJ97776)（St John's Laboratory Ltd）、Human Phospho-MLKL (T357) Antibody（＃MAB9187-SP R&D）、Human Phospho-MLKL (T357) Antibody（＃MAB9187-SP R&D）、Recombinant Anti-MLKL (phospho S358) antibody [EPR9514] (ab187091；Abcam)、Recombinant Anti-MLKL (phospho S345) antibody [EPR9515(2)] (ab196436；Abcam)、Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody Phospho-MLKL (Ser345)  (JM92-37；ThermoFisher) 等を使用することができる。
　免疫染色は、直接法であっても間接法であってもよい。直接法の場合、抗p-MLKL抗体に直接蛍光物質、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の標識物質を標識して、これらの標識物質からのシグナルを指標としてスライドグラス上の組織中のp-MLKLと結合した抗p-MLKL抗体の検出を行う。間接法の場合、未標識の抗p-MLKL抗体（一次抗体）をスライドグラス上の組織中のp-MLKLと反応させ、バッファー等で洗浄後、一次抗体と結合可能な二次抗体と反応させる。二次抗体には、蛍光物質、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の標識物質が標識されており、これらの標識物質からのシグナルを指標としてスライドグラス上の組織中のp-MLKLと結合した抗p-MLKL抗体の検出を行う。
　標識物質が蛍光色素である場合には、蛍光色素から発せられる蛍光シグナルを蛍光顕微鏡で確認することにより、スライドグラス上の組織中のp-MLKLを検出する。
　標識物質が、ペルオキシダーゼである場合、例えば、基質としてジアミノベンジジン（DAB）を使用して、基質の発色シグナルを光学顕微鏡で確認することにより、スライドグラス上の組織中のp-MLKLを検出する。
　標識物質が、アルカリフォスファターゼである場合、例えば、基質としてニューフクシンを使用して、基質の発色シグナルを光学顕微鏡で確認することにより、スライドグラス上の組織中のp-MLKLを検出する。
　免疫染色後は、対比染色を行ってもよい。
　組織内におけるp-MLKLのシグナルが陽性であるか陰性であるかの判定は、次の方法によって、行うことができる。
　例えば、2つの視野で p-MLKLのシグナル分布面積が「≦10％」又は「＞10％」としてスコア付けできる。１視野は、例えば、１００倍視野（対物１０倍×接眼１０倍）とすることができる。
　また、染色強度は０（シグナルなし）、１（軽度）、２（中程度）、又は３（強い）としてスコア付けできる。分布面積≦10％かつ染色強度０及び１を染色陰性、分布＞10％かつ染色強度２又は３の強度を染色陽性と定義することができる。
　また、口腔内の扁平上皮組織は、口腔側から、角質層、中間層又は顆粒層、有棘層、及び基底層の５つの層から構成されている。角質層と、中間層又は顆粒層とからなる層を表層と分類し、有棘層と、基底層を下層に分類する。p-MLKLは、表層及び下層のいずれの層にも出現し得るが、本実施形態において、表層におけるp-MLKLを検出することが好ましい。
（２）イムノアッセイによるp-MLKLの検出
　被検者から採取された口腔由来細胞におけるp-MLKLは、イムノアッセイ、競合イムノアッセイ等により検出することができる。イムノアッセイには、標識物質として酵素を使用するEnzyme-Immuno assay（EIA）、標識物質として蛍光物質を使用するFluorescence -Immuno assay（FIA）、標識物質として放射性同位体を使用するRadio-immuno assay、イムノクロマトグラムを利用するラテラルフローイムノアッセイを含み得る。EIAには、抗原を抗原捕捉用抗体と検出用抗体によりサンドイッチして検出するELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法を含む。
　イムノアッセイに使用する抗体は、例えば、上記（１）で述べた抗体を使用することができる。
　イムノアッセイに使用する検体は、口腔由来細胞を含む限り制限されない。検体には、口腔内を綿棒等で擦過し採取したイムノアッセイ用擦過試料、唾液等を含み得る。検体として、イムノアッセイ用擦過試料、唾液自体を用いてもよい。また、細胞からp-MLKLを遊離するため、イムノアッセイ用擦過試料又は唾液に、細胞膜や唾液中の粘液を分解する溶解剤を添加したものを検体として使用してもよい。
　ELISA法では、あらかじめ抗原捕捉用の抗p-MLKL抗体をマイクロプレート、蛍光ビーズ、又は磁気ビーズ等の固相上に固定化し、固定化された抗p-MLKL抗体と検体中のp-MLKLの複合体を形成させる。固相上に固定化された当該複合体又は固相上で形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、検体に含まれp-MLKLの検出、又はp-MLKLの濃度を測定することができる。また、本方法では、先に抗原捕捉用の抗p-MLKL抗体と検体中のp-MLKLとの複合体を形成させてから、当該複合体を固相に固定化してもよい。
　抗原捕捉用の抗p-MLKL抗体の固相への固定の方法は、特に限定されない。公知の方法を使用して、直接的に、又は別の物質を介して間接的に行うことができる。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。具体的には、イムノプレート等を使用して、直接各補足抗体をマイクロプレートに物理的に結合させることができる。また、抗原捕捉用の抗p-MLKL抗体を間接的に固相に固定してもよい。蛍光ビーズ、磁気ビーズ等への間接的な捕捉抗体の固相は、公知である。
　固相の形状は特に限定されず、例えば、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管、ビーズ、膜等が挙げられる。固相の素材は特に限定されず、例えば、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管等には、ポリスチレン、ポリプロピレン等を使用することができる。また、ビーズの場合には、ポリスチレンXmap（登録商標）ビーズ（Luminex社）やMagPlex（登録商標）ミクロスフェア（Luminex社）等を使用することができる。膜の場合には、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、紙等を使用することができる。
　本方法においては、前記複合体の形成に続いて、固相を洗浄する操作を含んでもよい。洗浄する場合には、界面活性剤等を含むＰＢＳ等を使用することができる。
　本方法において、前記複合体の検出は、通常のイムノアッセイ法の場合には、標識物質で標識された検出用の抗p-MLKL抗体を使用して行うか、未標識の抗p-MLKL抗体と結合することができる標識物質で標識された抗イムノグロブリン抗体等を使用して行うことができる。標識された検出用の抗p-MLKL抗体を使用することが好ましい。また、検出に用いられる抗p-MLKL抗体の抗原におけるエピトープと抗原捕捉に用いられる抗p-MLKL抗体の抗原におけるエピトープとは異なることが好ましい。
　競合イムノアッセイ法によって、p-MLKLの検出、又はp-MLKLの濃度を測定する場合には、標識物質で標識されたコンペティターの存在下で、検体中のp-MLKLを捕捉用の抗p-MLKL抗体と接触させる。コンペティターは、検体中のp-MLKLと同じ捕捉用抗体によって認識されるエピトープを有するペプチドやタンパク質である。コンペティターは個体から単離されたものであってもよく、遺伝子工学的に、又は化学的に合成されたものであってもよい。
　検出に用いられる抗p-MLKL抗体、標識抗イムノグロブリン抗体又はコンペティターに標識される標識物質は、検出可能なシグナルが生じる限り、特に限定されない。例えば、蛍光物質、放射性同位元素、金属ナノ粒子及び酵素等が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、Alexa Fluor（登録商標）などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125I、14C、32Pなどが挙げられる。金属ナノ粒子としては、金ナノ粒子、銀ナノ粒子を挙げることができる。これらの中でも、標識物質として、金ナノ粒子、アルカリフォスファターゼ、又はペルオキシダーゼが好ましい。
　検出に用いられる抗p-MLKL抗体は、当該技術において公知の標識方法により、各抗体を上記の標識物質で標識して得られる。標識は、市販のラベリングキットなどを用いて標識してもよい。また、標識イムノグロブリン抗体は、抗p-MLKL抗体の標識と同じ手法を用いて標識してもよいし、市販のものを使用してもよい。
　本方法では、複合体に含まれる検出抗体の標識物質により生じるシグナルを検出することにより、検体に含まれるp-MLKLの検出、又はp-MLKLの濃度を測定できる。ここで、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本方法では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。
　シグナルを検出する方法は、公知の方法を使用することができる。本方法では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択することができる。例えば、標識物質が酵素である場合、前記酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、目視、フルオロメーター、ルミノメーター、分光光度計などにより測定することにより行うことができる。
　酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合、基質としては、CDP-Star（登録商標）（４－クロロ－３－（メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル）フェニルリン酸２ナトリウム）等の化学発光基質、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸（BCIP）、５－ブロモ－６－クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ－ニトロフェニルリン酸等の発色基質が挙げられる。標識物質がペルオキシダーゼである場合には、テトラメチルベンジジン（TMB）等が挙げられる。
　標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダー、Luminex（登録商標）システム（Luminex社）等の公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
　標識物質が金ナノ粒子である場合、抗原抗体反応により凝集した金ナノ粒子の赤色をシグナルとして検出してもよいが、還元剤の存在下で金ナノ粒子に銀イオンを吸着させる銀増感によって検出してもよい。金属ナノ粒子による発色、又は銀増感による発色は、目視で確認してもよいが、光学的に濃度を測定してもよい。標識物質に金属ナノ粒子を用いるイムノアッセイは、例えば、ニトロセルロースフィルターに、捕捉抗体と、検出抗体を担持させ、検体をクロマトグラフィーの原理により、捕捉抗体及び検出抗体と、抗原を反応させるラテラルフローイムノアッセイで行うことが好ましい。
　シグナルの検出結果は、p-MLKLの濃度の値として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該シグナル強度の測定値から算出される値を、p-MLKLの濃度の値として用いることができる。
　p-MLKLの濃度の値を用いて、p-MLKLが検出されているか否かを判定する場合、p-MLKLの濃度の値を所定の基準値に基づいて決定することができる。所定の基準値は、p-MLKLが陽性であるか、陰性であるかを最も精度よく分類できる値である限り制限されない。「最も精度よく分類できる値」は、検査の目的によって感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの指標に基づいて適宜設定することができる。また、所定の基準値は、口腔腫瘍性病変を有さない者のp-MLKLの濃度の値、その平均値等であってもよい。
　被検者のp-MLKLの濃度の値が、所定の基準値よりも高い場合、p-MLKLが検出されたことを意味する。また、被検者のp-MLKLの濃度の値が、所定の基準値以下である場合、p-MLKLが検出されなかったことを意味する。
　被検者のp-MLKLの濃度の値が、所定の基準値よりも高い場合、前記被検者が口腔腫瘍性病変を有していると決定することができる。また、被検者のp-MLKLの濃度の値が、所定の基準値以下である場合、前記被検者が口腔腫瘍性病変を有していないと決定することができる。
２．口腔内において口腔腫瘍性病変を検出するためのp-MLKLの使用方法
　上記１．で述べたように、p-MLKLは、扁平上皮組織の表層に出現するため、組織や資料を採取しなくても、被検者の口腔内において、直接表層のp-MLKLを検出することができる。表層のp-MLKLの検出は、上記１．と同様に免疫染色を使用して行うことができる。
　但し、この場合、固定液による固定はできないため、口腔内を清浄してから、口腔内の検査したい領域（興味領域ともいう）に直接蛍光物質、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ等の標識物質を標識した抗p-MLKL抗体を塗布し、洗浄後、標識物質のシグナルを検出する。標識物質が蛍光物質の場合、蛍光シグナルを検出する。標識物質としてペルオキシダーゼ、又はアルカリフォスファターゼを使用する場合、化学発光基質を使用して、発光シグナルを検出する。シグナルは、バイオイメージングアナライザー等を使用して検出可能である。
３．in vitroにおいて検出方法に使用するための検査試薬及び検査キット
　本発明のある実施形態は、上記１．で述べた、口腔腫瘍性病変の検出方法に使用するp-MLKL検出用検査試薬に関する。
　p-MLKL検出用検査試薬は、少なくともp-MLKLの一部に結合可能な一種又は複数の抗p-MLKL抗体（例えば、一次抗体）を含む。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Fab、F(ab’)、F(ab)2等）のいずれも用いることができる。抗田の免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、scFv等であってもよい。抗p-MLKL抗体は、例えば、Ser 358、又はSer 345がリン酸化されたMLKLと結合することが好ましい。また、抗p-MLKL抗体として、上記１において述べた市販の抗体を使用してもよい。
　また、抗体は必ずしも精製されている必要はなく、抗体を含む抗血清、腹水、これらから画分された免疫グロブリン画分等であってもよい。
　検査試薬に含まれる抗体は、乾燥状態であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファーに溶解されていてもよい。さらに、検査試薬は、β－メルカプトエタノール、DTT等の安定化剤；アルブミン等の保護剤；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤等の少なくとも一つを含んでいてもよい。
　p-MLKLと結合する抗体は、酵素や蛍光色素で標識されていてもよい。
　p-MLKL検出用検査試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した、又は試薬の使用方法を記載するウェブページのURLが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、p-MLKLと結合する抗体が未標識の一次抗体である場合には、検査キットに、金属ナノ粒子、酵素、又は蛍光色素で標識された二次抗体が含まれていてもよい。さらに、検査キットには前記酵素と反応する基質が含まれていてもよい。さらに検査キットに含まれる一次抗体は、上記1.（２）で述べた担体に捕捉用抗体として担体と結合していてもよい。さらに、ラテラルフローイムノアッセイを行う検査キットの場合、捕捉用抗体である一次抗体は、検出用抗体である二次抗体とともに、膜にしみこませ、乾燥された状態でキット化されていてもよい。この場合、検体を溶解する溶解剤がキットに同包されていてもよい。
４．in vivoにおいて検出方法に使用するための検査試薬及び検査キット
　本発明のある実施形態は、上記２．で述べた、口腔内で口腔腫瘍性病変の検出方法に使用するp-MLKL検出用検査試薬に関する。
　p-MLKL検出用検査試薬に関する説明は、上記３．の記載をここに援用する。
　p-MLKL検出用検査試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した、又は試薬の使用方法を記載するウェブページのURLが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、p-MLKLと結合する抗体が未標識の一次抗体である場合には、検査キットに酵素、又は蛍光色素で標識された二次抗体が含まれていてもよい。さらに、検査キットには前記酵素と反応する基質が含まれていてもよい。
５．光免疫療法、及び光免疫療法に使用する、口腔腫瘍性病変を治療するための治療用組成物
　光免疫療法は、抗体に光感受性物質を結合させた複合体を標的細胞に結合させ、所定波長の光を照射することで、標的細胞を死滅させる方法である。光感受性物質としては、例えば、溶性シリコンフタロシアニン誘導体であるIRdye700DX（IR700）色素を挙げることができる。照射する光の波長は、赤色から近赤外波長、例えば680nmから700nmである。光照射は、例えば、8から32 Jules/cm2 の範囲で、150 mW/cm2程度行うことができる。
　治療用組成物は、光感受性物質を結合させた抗p-MLKL抗体を含む。抗体の説明は、上記３．の説明をここに援用する。
　以下に実施例を示して、本発明の内容をより詳細に説明するが、本発明は、実施例に限定して解釈されるものではない。
Ｉ．材料と方法
１．症例
　2016年1月から2020年12月の間に関西医科大学病院の耳鼻咽喉科頭頸部外科で外科的切除を受けた276名の患者について検討した（表1）。276名中118名が口腔扁平上皮癌（OSCC）症例（高分化：62名、中分化：24名、低分化：32名）であり、123名が前癌病変／異形成症例（軽度：35名、中等度：49名、高度：39名）であり、35名が非腫瘍性病変（過形成：7、炎症：13、腫瘍近傍に存在する正常組織：15）であった。手術前に治療を受けた患者はいなかった。腫瘍の組織学的グレードは、WHOグレーディングシステムに従って分類した。
　この研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、関西医科大学病院の施設内審査委員会の承認を受けた（承認＃2020289）。また、本研究については、患者からインフォームドコンセントを得た上で行った。
２．組織の準備
　患者から採取した組織について、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）を行い、組織マイクロアレイ（TMA）を作製した。単一の症例から作製した、厚さ4 μmの切片を作製し、p-MLKLの免疫染色を行い、より強い染色強度を示した腫瘍部位を解析に使用した。前記切片に対応するパラフィン包埋ブロック上で、より強い染色強度を示した腫瘍部の領域をマークし、2 mmの生検針でその部分を打ち抜いた。打ち抜いて得られたパラフィンブロック片を、別のパラフィンに包埋し、TMAを作製した。TMAを、厚さ4μmに薄切しTMA標本を作製した。
３．免疫組織化学的解析
　TMA標本について、p-MLKLの免疫染色を行った。Anti-MLKL (phospho S358)（Clone ID：EPR9514；カタログ番号ab187091、RRID：AB_2619685；Abcam；希釈率1：250）によるTMA標本の免疫組織化学染色は、標準プロトコルに従ってBOND III全自動染色装置（Leica Biosystems、オーストラリア、メルボルン）を使用して行った。このとき、抗原賦活化はpH6にて、100℃で40分行った。抗原賦活化処理液として、BOND Epitope Retrieval Solution 1(#AR9961) クエン酸ベース緩衝液(pH6.0)を使用した。検出システムはBOND Polymer Refine Detection(#DS9800)コンパクトポリマー検出システム（HRP標識・DAB発色）を使用した。
　染色後の標本について、2人の病理医（Y.N.およびK.T.）によって光学顕微鏡下でスコア付けした。p-MLKLのスコアリングは、（ｉ）角質層と顆粒層又は中間層を含む表層と、（ｉｉ）有棘細胞層と基底細胞層を含む下層、の２つの領域について行った。p-MLKLの分布は、２つの領域について、分布面積が「≦10％」又は「＞10％」としてスコア付けし、染色強度は０（染色なし）、１（軽度）、２（中程度）、又は３（強い）としてスコア付けした。分布面積≦10％、染色強度０及び１を陰性、分布＞10％、染色強度２又は３の強度を陽性と定義した。染色強度は、細胞膜又は細胞質に陽性シグナルがあるものを評価した。
ＩＩ．結果
１．非腫瘍性病変症例
　図１に、非腫瘍性病変症例におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図１aは、炎症を起こしている組織の結果を示す。図１a左は、HE染色画像であり、図１a右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図１bは、過形成を起こしている組織の結果を示す。図１b 左は、HE染色画像であり、図１b右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図５上段に示す様に非腫瘍性の炎症、過形成、正常合計35例中、34例(97%)が陰性であった。炎症を来している1症例で、顆粒層／中間層にp-MLKLの陽性シグナルが確認された。その結果を図１cに示す。図１c左は、HE染色画像であり、図１c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。
２．前癌病変症例
　図２に、前癌病変（OED）におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図２aは、軽度異形成症例の組織の結果を示す。図２a左は、HE染色画像であり、図２a右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図２bは、中等度異形成症例の組織の結果を示す。図２b 左は、HE染色画像であり、図２b右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図２cは、高度異形成症例の組織の結果を示す。図２c 左は、HE染色画像であり、図２c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図５中段に示すように、p-MLKLのシグナルは、73例(59%)で表層及び下層のいずれかの領域に確認され、62例(50％)で、表層に確認された。
３．癌症例
　図３に、扁平上皮癌におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図３a及び図３bは、p-MLKLのシグナルが強陽性であった組織の結果を示す。図３a及び図３bの左は、HE染色画像であり、図３a及び図３bの右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図３cは、p-MLKLのシグナルが中等度であった組織の結果を示す。図３c左は、HE染色画像であり、図３c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図５下段に示すように、p-MLKLのシグナルは、84例（71%）の症例において、表層及び下層のいずれかの領域で確認され、76例（64％）の症例において、表層に確認された。
　図４に、扁平上皮癌におけるp-MLKLの免疫染色画像を示す。図４aは、高分化扁平上皮癌症例の組織の結果を示す。図４a左は、HE染色画像であり、図４a右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図４bは、低分化扁平上皮癌の亜型である基底細胞癌（Basaloid squamous cell carcinoma）症例の組織の結果を示す。図４b左は、HE染色画像であり、図４b右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図４cは、低分化扁平上皮癌症例において、p-MLKLのシグナルが陽性になった例の組織の結果を示す。図４c左は、HE染色画像であり、図４c右は、p-MLKLの免疫染色画像である。図５下段に示すようにp-MLKLの陽性シグナルは、高分化OSCCで高頻度にみられ（53例、85%）、表層や角化細胞に陽性シグナルが分布する傾向が確認された。
４．総括
　図６に、p-MLKLを用いた場合の口腔扁平上皮癌の検出に関する感度、特異度、陽性的中率（PPV）、陰性的中率（NPV）を求めた結果を示す。表層においてp-MLKLが陽性と判定された場合の検査精度に関し、高分化扁平上皮癌の感度、特異度、PPV、NPVが最も高い値を示した（図６a）。このことから、p-MLKLの検出は、腫瘍であるか否かの判別が最も難しい高分化扁平上皮癌の検出に有用であると考えられた。
　また、表層、又は下層のいずれか一方に陽性シグナルがある場合、高分化扁平上皮癌の検出感度は90％、特異度は97％、PPVは98％であり、生検等で的確に組織が採取されていれば、p-MLKLを指標に高分化扁平上皮癌を特定できる可能性が示された。
　図７に、p-MLKLを用いた場合の前癌病変における感度、特異度、PPV、NPVを求めた結果を示す。表層においてp-MLKLが陽性と判定された場合の検査精度に関し、治療が必要な中等度から高度の異形成組織において約50％から70％が陽性となった（図７a）。
　また、表層、又は下層のいずれか一方にp-MLKLのシグナルがある場合、中等度から高度の異形成の検出感度は87％から74％であった（図７b）。このことから、p-MLKLは、高度異形成組織、又は細胞の検出にも有用であると考えられた。

Claims (10)

  1. 　被検者から採取された口腔組織、又は口腔由来細胞におけるリン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）を検出することを含む、口腔腫瘍性病変の検出方法。
  2. 　前記口腔腫瘍性病変が、扁平上皮癌、又は異形成である、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記扁平上皮癌が、高分化扁平上皮癌である、請求項２に記載の検出方法。
  4. 　前記口腔組織が扁平上皮の表層であるか、口腔由来細胞が表層に由来する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　口腔内において、口腔腫瘍性病変を検出するための、リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）の使用方法。
  6. 　抗リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）抗体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法に使用するための検査試薬。
  7. 　請求項６に記載の検査試薬を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の検出方法に使用するための検査キット。
  8. 　口腔内において使用される、口腔腫瘍性病変を検出するための抗リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）抗体を含む、検査試薬。
  9. 　請求項８に記載の検査試薬を含む、口腔内において使用される、口腔腫瘍性病変を検出するための検査キット。
  10. 　光免疫療法において使用される、口腔腫瘍性病変を治療するための抗リン酸化mixed lineage kinase domain-like protein（MLKL）抗体を含む治療用組成物。
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