JP2017067718A - 肝疾患の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】血液由来検体中のこれらの肝疾患の新たな診断マーカーの提供。
【解決手段】血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3ζ/δを測定することを特徴とする肝疾患の判定方法。
【選択図】なし
【解決手段】血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3ζ/δを測定することを特徴とする肝疾患の判定方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、オートファジー機能障害関連肝疾患や非アルコール性脂肪性肝疾患等の肝疾患の判定方法及び診断薬に関する。
細胞内蛋白分解機能の一つであるオートファジーは、細胞保護的に作用し、オートファジー機能の破錠は種々の疾病の発症に関与している。
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は肥満人口増加に伴って増えてきている。NAFLDの中には肝炎症や線維化を伴った非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)という病態が含まれる。NASHは肝硬変や肝癌に移行する病態であるため、早期の診断や治療介入が必要と思われるが、確定診断のためには侵襲的な検査である肝生検を行い、病理学的に診断する必要がある。
NASH患者の肝組織では蛋白凝集体であるMallory−Denk bodyが観察され、この蛋白凝集体形成にはオートファジーによって特異的に分解されるp62が関与しておりオートファジー機能異常がNASH病態形成に関与するものと考えられている(非特許文献1)。
NASH患者の肝組織では蛋白凝集体であるMallory−Denk bodyが観察され、この蛋白凝集体形成にはオートファジーによって特異的に分解されるp62が関与しておりオートファジー機能異常がNASH病態形成に関与するものと考えられている(非特許文献1)。
一方、核マトリクス蛋白の変性、量的変化は細胞増殖や核内シグナル伝達に影響を与え発癌に関与すると考えられている。細胞死において核マトリクス蛋白の非可溶成分が血中に放出されることから、変性した核マトリクス蛋白の検出は新規腫瘍マーカーとして有望視されている(非特許文献2〜4)。
Hepatol Res.2014 Sep;44(9):1026−36
CANCER RESEARCH 52,422−427,1992
Proc Natl Acad Sci USA.87(12):4605−9,1990
J Cell Biochem.1;91(2):365−74,2004
Exp.Cell Res.,ISO:460−466,1989.
オートファジー機能障害関連肝疾患やNAFLD等の肝疾患は、肝生検による確定診断が必要であり、血液由来検体を用いた新たな診断手段の開発が望まれている。従って、本発明の課題は、血液由来検体中のこれらの肝疾患の新たな診断マーカーを提供することにある。
そこで本発明者は、オートファジー欠損肝組織及び脂肪肝モデルマウスより核マトリクス蛋白を単離し、それらの核マトリクス蛋白とオートファジー欠損肝組織及び脂肪肝の関係を検討したところ、オートファジー欠損肝組織と脂肪肝で特異的に発現が増加している核マトリクス蛋白を多数見出した。さらに、それらの核マトリクス蛋白のうち、インポーチンα4、インポーチンβ1及び14−3−3ζ/δは、血液中でも検出されるものであることから、これらの3成分の血液中の濃度を測定すれば、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患が判定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は次の〔1〕〜〔5〕の発明を提供するものである。
〔1〕血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δを測定することを特徴とする肝疾患の判定方法。
〔2〕肝疾患が、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患である〔1〕記載の判定方法。
〔3〕血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの濃度が、健常者の血液由来検体中の濃度に比べて高い場合に、肝疾患であると判定する〔1〕又は〔2〕記載の方法。
〔4〕血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3ζ/δの測定試薬を含有する肝疾患診断薬。
〔5〕肝疾患が、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患である〔4〕記載の診断薬。
〔2〕肝疾患が、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患である〔1〕記載の判定方法。
〔3〕血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの濃度が、健常者の血液由来検体中の濃度に比べて高い場合に、肝疾患であると判定する〔1〕又は〔2〕記載の方法。
〔4〕血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3ζ/δの測定試薬を含有する肝疾患診断薬。
〔5〕肝疾患が、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患である〔4〕記載の診断薬。
本発明方法によれば、血液中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの濃度を測定することにより、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患が診断でき、早期治療が可能となる。
本発明の測定対象、すなわち肝疾患マーカーであるインポーチンα4及びインポーチンβは、核局在信号(nuclear localization signal.NLS)に結合してタンパク質を細胞核の中に運び込む役割を担う輸送タンパク質である。しかし、これらのマーカーが肝疾患に関与していることは知られていない。
また、14−3−3z/δは、細胞内でのシグナル伝達に関与するタンパク質であり、Creutzfeldt−Jakob病患者の脳脊髄液に増加することが知られている。しかし、14−3−3z/δと肝疾患の関係は全く知られていない。
また、14−3−3z/δは、細胞内でのシグナル伝達に関与するタンパク質であり、Creutzfeldt−Jakob病患者の脳脊髄液に増加することが知られている。しかし、14−3−3z/δと肝疾患の関係は全く知られていない。
本発明で用いる検体は、肝組織ではなく、血液由来検体である。血液由来検体としては、インポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3z/δが存在していればよく、血清、血漿が好ましい。
血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの測定手段としては、免疫学的測定法、液体クロマトグラフィー等が挙げられるが、定量性、簡便性の点から免疫学的測定法が好ましい。
免疫学的測定法としては、酵素標識免疫学的測定(EIA)、放射性同位元素標識免疫学的測定(RIA)、蛍光標識免疫学的測定、凝集法、比濁法、ウェスタンブロット法等が挙げられる。
免疫学的測定には、抗インポーチンα4抗体、抗インポーチンβ抗体又は抗14−3−3z/δ抗体が用いられるが、これらは市販品を使用することができる。
免疫学的測定法としては、酵素標識免疫学的測定(EIA)、放射性同位元素標識免疫学的測定(RIA)、蛍光標識免疫学的測定、凝集法、比濁法、ウェスタンブロット法等が挙げられる。
免疫学的測定には、抗インポーチンα4抗体、抗インポーチンβ抗体又は抗14−3−3z/δ抗体が用いられるが、これらは市販品を使用することができる。
本発明の具体的な免疫学的測定方法としては、ELISA(酵素免疫測定法)、CLEIA(化学発光酵素免疫測定法)、RIA(ラジオイムノアッセイ)、LTIA(ラテックス免疫比濁法)などの公知の方法を使用することができる。ELISAの場合、例えば、インポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δを認識する抗体を結合させた不溶性担体と酵素標識抗体を組み合せる方法が挙げられる。
ELISAやLTIAに使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用され工業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。ELISAにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン等の96穴のマイクロプレート、LTIAにおいてはポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持(感作)方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。
反応は、例えば、pHを制御するためのリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝成分、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩化ナトリウムなど、安定化剤としてのウシ血清アルブミン(BSA)、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、酵素の阻害剤等の添加剤を適宜溶解させても良い。
ELISAにおける酵素標識抗体は、公知の方法によって調製することができる。例えば、石川らの方法(マレイミド法:「酵素免疫測定法 第3版 医学書院」)等に従い、抗体をそのまま、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してF(ab’)2又はFab’とした後、酵素で標識することができる。標識に使用する酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。さらに、酵素活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてo−フェニレンジアミン、3,3’,5,5’−テトラメチルベンチジン、2,2’−アジノジ−(3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸)アンモニウム塩等を用いることができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基質としてp−ニトロフェニルフォスフェート等を、酵素にβ−D−ガラクトシダーゼを用いる場合は、基質としてβ−D−ガラクトピラノシド等を、酵素にグルコースオキシダーゼを用いる場合は、ペルオキシダーゼの共存下で、グルコースオキシダーゼの基質としてβ−D−グルコース、発色剤として酵素がペルオキシダーゼである場合に使用した発色剤等を用いることができる。
ELISAにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素がペルオキシダーゼ、基質が過酸化水素、発色剤がo−フェニレンジアミンの場合、酵素反応生成物固有の波長、492nmにおける吸光度として96穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である。
LTIAにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度程度と測定試料の濁度程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法(凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる)、粒度分布による測定法(凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる)、積分球濁度法(凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する)などの種々の方式が利用可能である。
血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの濃度が、健常者のその濃度に比べて高い場合には、肝疾患、特にオートファジー機能障害関連肝疾患又はNAFLDであると判定できる。
オートファジー機能障害関連肝疾患には、α1−アンチトリプシン欠損症、肝癌、アルコール性肝炎、肝癌が含まれる。またNAFLDには、NASHが含まれる。
オートファジー機能障害関連肝疾患には、α1−アンチトリプシン欠損症、肝癌、アルコール性肝炎、肝癌が含まれる。またNAFLDには、NASHが含まれる。
本発明の血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの測定試薬としては、前記のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの免疫学的測定試薬が挙げられる。インポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δの免疫学的測定試薬には、インポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3z/δを認識する抗体及び酵素標識抗体が含まれる。
本発明の判定方法によれば、オートファジー機能障害関連肝疾患、NAFLD等が非侵襲的に判定できるので、早期に治療方針が決定できる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例1
(方法)
(1)オートファジー欠損肝組織(Atg7 KO)の作製
肝特異的Atg7F/F,:Alb−Creマウス(J Cell Biol.2005 9;169(3):425−34.)を全身麻酔下で開腹し、下大静脈にカテーテルを挿入し、下大静脈から門脈に逆行的にリン酸緩衝生理食塩水を還流し、肝内の血球成分除去を行った。その後、肝組織を採取し、液体窒素を用いて凍結保存した。
(2)脂肪肝モデルマウスから肝組織の採取
肥満モデルマウスKKAyマウスを全身麻酔下で開腹し、下大静脈にカテーテルを挿入し、下大静脈から門脈に逆行的にリン酸緩衝生理食塩水を還流し、肝内の血球成分除去を行った。その後、肝組織を採取し、液体窒素を用いて凍結保存した。
(3)上記のAtg7 KO及びKKAyマウスならびにそれぞれのコントロールとなる野生マウス及びC57BL/6Jマウスの肝組織からQプロテオーム核蛋白キット(QIAGEN社 Q−proteome nuclear protein kit cat.NO 37582)を用いて核蛋白不溶性画分を抽出した。核蛋白15μg 1PG Buffer pH3〜10のストリップ上に分離し、7.5%SDS−PAGEに付し、次いで銀染色した。
(方法)
(1)オートファジー欠損肝組織(Atg7 KO)の作製
肝特異的Atg7F/F,:Alb−Creマウス(J Cell Biol.2005 9;169(3):425−34.)を全身麻酔下で開腹し、下大静脈にカテーテルを挿入し、下大静脈から門脈に逆行的にリン酸緩衝生理食塩水を還流し、肝内の血球成分除去を行った。その後、肝組織を採取し、液体窒素を用いて凍結保存した。
(2)脂肪肝モデルマウスから肝組織の採取
肥満モデルマウスKKAyマウスを全身麻酔下で開腹し、下大静脈にカテーテルを挿入し、下大静脈から門脈に逆行的にリン酸緩衝生理食塩水を還流し、肝内の血球成分除去を行った。その後、肝組織を採取し、液体窒素を用いて凍結保存した。
(3)上記のAtg7 KO及びKKAyマウスならびにそれぞれのコントロールとなる野生マウス及びC57BL/6Jマウスの肝組織からQプロテオーム核蛋白キット(QIAGEN社 Q−proteome nuclear protein kit cat.NO 37582)を用いて核蛋白不溶性画分を抽出した。核蛋白15μg 1PG Buffer pH3〜10のストリップ上に分離し、7.5%SDS−PAGEに付し、次いで銀染色した。
(結果)
二次元電気泳動像を図1に示す。図1から、コントロール群では検出されない核マトリクス蛋白が、Atg7 KO及びKK−Ayでは複数あることがわかる。
二次元電気泳動像を図1に示す。図1から、コントロール群では検出されない核マトリクス蛋白が、Atg7 KO及びKK−Ayでは複数あることがわかる。
オートファジー欠損肝組織(Atg7 KO)及び脂肪肝モデル(KK−Ay)で発現増加が観察された核マトリクス蛋白のスポットを質量分析器によって同定した。その結果を表1に示す。
実施例2
実施例1で得られた核マトリクス蛋白とマウス肝組織薄切切片を用いてインポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δの一次抗体(abcam社)によるウェスタンブロット及び免疫染色した。その結果を図2及び図3に示す。
図2及び図3より、野生マウス、C57BL/6Jマウスからの核マトリクス蛋白よりもAtg7 KO及びKKAyマウスからの核マトリクス蛋白でインポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δはより多く発現しており、さらにこれらの蛋白はAtg7 KO及びKKAyマウス肝細胞の核に局在していた。
実施例1で得られた核マトリクス蛋白とマウス肝組織薄切切片を用いてインポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δの一次抗体(abcam社)によるウェスタンブロット及び免疫染色した。その結果を図2及び図3に示す。
図2及び図3より、野生マウス、C57BL/6Jマウスからの核マトリクス蛋白よりもAtg7 KO及びKKAyマウスからの核マトリクス蛋白でインポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δはより多く発現しており、さらにこれらの蛋白はAtg7 KO及びKKAyマウス肝細胞の核に局在していた。
実施例3
インポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δの一次抗体を用いて、ウェスタンブロット法により、C57BL/6Jマウス血清中及びKKAyマウス血清中のインポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δ濃度を測定した。その結果を図4に示す。
図4より、脂肪肝モデルKKAyマウス血清中のインポーチン4α、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δの濃度は、BL6(正常マウス)に比べて有意に高いことが判明した。
インポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δの一次抗体を用いて、ウェスタンブロット法により、C57BL/6Jマウス血清中及びKKAyマウス血清中のインポーチンα4、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δ濃度を測定した。その結果を図4に示す。
図4より、脂肪肝モデルKKAyマウス血清中のインポーチン4α、インポーチンβ及び14−3−3ζ/δの濃度は、BL6(正常マウス)に比べて有意に高いことが判明した。
Claims (5)
- 血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3ζ/δを測定することを特徴とする肝疾患の判定方法。
- 肝疾患が、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患である請求項1記載の判定方法。
- 血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3ζ/δの濃度が、健常者の血液由来検体中の濃度に比べて高い場合に、肝疾患であると判定する請求項1又は2記載の方法。
- 血液由来検体中のインポーチンα4、インポーチンβ又は14−3−3ζ/δの測定試薬を含有する肝疾患診断薬。
- 肝疾患が、オートファジー機能障害関連肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患である請求項4記載の診断薬。
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JP2015196555A JP2017067718A (ja) | 2015-10-02 | 2015-10-02 | 肝疾患の判定方法 |
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