KR101142443B1 - 폐암 진단용 Ｃｏｌ１０Ａ１ 마커 및 이를 이용한 진단 키트 - Google Patents

폐암 진단용 Ｃｏｌ１０Ａ１ 마커 및 이를 이용한 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐암 진단용 Col10A1 마커 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 Col10A1이 폐암 세포주 뿐만 아니라, 실제 폐암 환자의 혈청 내에 존재하며, Col10A1의 발현량, 민감도 및 특이도가 정상인에 비하여 폐암 환자에서 높음을 확인함으로써, Col10A1을 폐암 진단용 마커로서, 이를 포함한 키트 및 면역 스크립트를 폐암 진단용으로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

Description

폐암 진단용 Ｃｏｌ１０Ａ１ 마커 및 이를 이용한 진단 키트{Protein marker Col１０A１ for lung cancer and diagnosis kit for lung cancer using an antibody against the same}
Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 또는 모니터링 키트 및 면역크로마토그래피 스트립 및 Col10A1을 이용한 폐암 진단 방법에 관한 것이다.
2008년에 발표된 한국중앙암등록본부 자료에 의하면 2003-2005년 우리나라 연 평균 암발생 중 폐암은 남녀를 합쳐서 전체 암 발생의 12.1%로 2위를 차지하였다. 인구 10만 명당 조발생률은 33.2건이다. 남녀의 성비는 3.83:1로 남자에게서 더 자주 발생하였고, 발생건수로는 남성의 암 중에서 2위를 차지하였고 여성의 암 중에서 5위를 차지하였다. 남녀를 합쳐서 본 연령대별로는 60대가 34.3%로 가장 많고, 70대가 31.0%, 50대가 14.6%의 순이다(보건복지가족부 중앙암등록본부 2008년 10월 15일 발표 자료). 더욱이 흡연인구의 증가와 대기 오염 등의 원인으로 우리나라에서도 급속히 증가하고 있는 종양이며 암의 종류별 사망률은 21.4%로 1위이고, 남자에게서는 24.9%, 여자 15.1%로 각각 1위, 2위이다(2006년 사망원인통계연보, 통계청).
폐암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직 침범 또는 기도폐쇄, 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 환자의 10-15% 정도는 아무런 증상 없이 정기 검진에서 진단된다. 또한, 대부분의 폐암이 진단 당시에 상당히 진행된 상태로 진단되므로 완치가 어려운 경우들이 대부분이라는 문제가 있다. 따라서 폐암을 조기에 진단하여 폐암으로 인한 사망률을 줄이는 것이 시급한 문제이다(Wulfkuhle et al., Nat. Rev. Cancer 3, 267-275.(2003)).
폐암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 사용되고 있는데, 현재까지는 종양의 크기를 측정하고, 림프절로의 전이 유무를 조사하거나, 폐 종양 조직이나 림프절 등을 생검하여 면역조직화학방법으로 분석하거나 흉부 전산화 단층 촬영, 기관지 내시경 등을 이용하고 있다(Manser et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 10, 266-271. (2004)). 그러나, 흉부단층 촬영의 경우 폐암의 크기가 약 0.1 cm 이상 되어야 측정가능한데, 이 시기는 이미 암이 다른 조직으로 전이되었을 가능성이 높으며, 내시경이 기관지로 삽입되어 폐 내부를 직접 관찰할 수 있는 기관지 내시경 방법은 폐 말단에 있는 종양을 관찰하기 곤란한 한계를 가지고 있다.
따라서, 폐암의 마커들을 이용하여 암을 진단하기 위한 시도들이 진행되었는데, 다중의 표적 유전자나 단백질의 발현을 조사함으로써 폐암 진단 마커를 발굴한 연구는 이미 보고되었으며(Hibi et al., Am. J. Pathol. 1999, 155: 711-715;Brechot et al. Eur. J. Cancer 1997, 33: 385-391; Pastor et al., Eur. Respir. J. 1997, 10: 603-609; Morita et al., Int. J. Cancer 1998, 78: 286-292), 마이크로어레이 기술을 이용하여 폐암 마커 유전자를 발굴하고 암을 진단하려는 보고도 있었다. 또한, 환자의 혈액에서 아스파테이트 아미노트랜스퍼래이즈 (AST, Aspartate aminotransferase), 알라닌 트랜스아미내이즈(ALT, Alanine transaminase), 총 빌리루빈 (Total bilirubin) 혹은 크레아티닌(Creatinine)의 농도를 측정하여 폐암을 진단하려는 시도가 있었다(Fishman et al., Cancer Res. 28,150-154 (1968), Nagamine et al., Clin. Chem. 29, 379-381 (1983), Muggia et al., 1, 217-228. (1974)). 그러나, 이러한 종양 마커들에 대한 연구에도 불구하고 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐 공식적으로 권장되고 있는 폐암 혈액 마커는 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 폐암 세포에서 발현이 증가하는 단백질들을 발굴하였고, 콜라젠 10(collagen X)을 구성하는 Col10A1 단백질이 폐암 특이적으로 폐암 세포주 뿐만 아니라 실제 폐암 환자의 혈액에 존재하며, Col10A1 단백질의 발현량, 민감도 및 특이도가 정상인에 비하여 폐암환자의 혈액에서 현저히 높음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Col10A1을 마커로 이용하는 폐암 진단용 또는 모니터링 키트 및 이를 포함하는 면역크로마토그래피 스트립을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Col10A1을 이용한 폐암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 또는 모니터링 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 Col10A1을 단백질 마커로 이용한 폐암 진단방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 예후 모니터링 키트를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명은 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 예후 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 Col10A1은 폐암 세포주의 배양액뿐만 아니라, 폐암 환자의 혈액에서 존재하며, 정상인에 비해서 폐암 환자의 혈액에 더 많은 양이 존재하고 있으며, 적은 양으로도 민감하게 폐암을 진단할 수 있으므로, 폐암 진단용 또는 모니터링 키트, 면역크로마토그래피 스트립 및 폐암 진단에 있어서, 단백질 마커로서 이용될 수 있다.
도 1은 폐암 세포주의 배양액에서 Col10A1의 존재를 확인한 효소면역 측정법의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 혈액에서 Col10A1의 발현량을 정상인과 비교한 효소면역 측정법의 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 또는 모니터링 키트를 제공하는 것이다.
상기 항-Col10A1 항체는 Col10A1 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하고, 상기 Col10A1은 인간의 Col10A1인 것이 바람직하고, 서열번호 1로 기재되는 Col10A1 아미노산 서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프(epitope)와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.
다클론 항체는 상기 Col10A1 단백질을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 쥐, 래트, 닭, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있고, 토끼를 숙주로 함이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 및 쥐 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).
또한, 상기 Col10A1 단백질에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al ., Science 254: 1275-1281, 1989).
상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서 Col10A1은 어피메트릭스(Affymetrix)사의 데이타베이스를 이용하여, 암 조직에서 Col10A1의 발현을 통하여, 정상 및 폐암 조직에서의 Col10A1의 발현량을 합산하여 14종의 암 환자 혈액에서 예상되는 Col10A1의 발현량을 추정한 결과, 폐암을 포함한 흉부암 및 두부경부암에서 Col10A1의 발현이 다른 암에 비하여 높음을 확인할 수 있었다(표 1 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시양태에서 Col10A1과 폐암과의 관련성을 증명하기 위하여, 우선 폐암 세포주를 이용하여 세포 배양액에서 Col10A1의 발현량을 분석한 결과, 폐암 세포주에 따른 Col10A1 발현량의 차이를 나타내었지만, 대조군인 신장세포주에 비하여 많은 량이 발현되고 있었으며, 이러한 발현은 배양 일수가 증가할수록 커지는 경향성을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
아울러, 본 발명의 구체적인 실시양태에서 폐암 세포주에서 발현이 확인된 Col10A1의 발현을 실제 폐암 환자의 혈액에서 관찰한 결과, 정상인에 비하여 폐암 환자에서 Col10A1의 발현량이 많았으며, 민감도 및 특이도 역시 정상인과 비교하여 높음을 확인하였다(도 2 및 표 2 참조).
따라서, Col10A1이 폐암 세포주 뿐만 아니라 실제 폐암 환자의 혈액에서 정상인에 비하여 높은 수준 발현되며, 그 민감도와 특이도가 뛰어남을 확인함으로써, Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 키트를 폐암 진단용 또는 모니터링용으로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 폐암 진단용 또는 모니터링 키트는 Col10A1 특이적인 프라이머를 필수 구성요소로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 있다. Col10A1 특이적인 프라이머를 이용한 Col10A1 검출 시, PCR 증폭반응에 적용되는 경우, 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 또는 모니터링 키트에 있어서, 항-Col10A1 항체는 발색효소, 발색물질 또는 형광분자에 결합된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 또는 모니터링 키트에 있어서, 항-Col10A1 항체는 바이오틴, 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대해 바이오틴과 본질적으로 동일한 결합 작용을 갖는 바이오틴 유도체인 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소, 발색물질 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트가 상기 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 발색 효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것이 바람직하며, 상기 발색물질은 콜로이드 골드(coloid gold)인 것이 바람직하며, 형광분자는 FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 폐암 진단용 또는 모니터링 키트는 항원-항체 결합반응, 또는 단백질-리간드 결합반응을 통하여 결합 반응을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 폐암을 진단할 수 있으며, 상기 결합 반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블랏, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 폐암 진단용 또는 모니터링 키트는 지지체로 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 폐암 진단용 또는 모니터링 키트는 표지체로 발색효소, 발색물질 또는 형광분자는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 폐암 진단용 또는 모니터링 키트는 세척액으로 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 Col10A1에 특이적인 항체를 이용하여 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서 Col10A1와 폐암과의 관계를 폐암 세포주 및 실제 폐암 환자를 통해서 확인하였으며, Col10A1의 발현량 및 민감도가 폐암에서 유의하게 높으므로, Col10A1에 특이적인 항체를 포함한 면역크로마토그래피 스트립을 폐암 진단용으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은 접착성 플라스틱 지지체와, 상기 접착성 플라스틱 지지체에 부착되어 있는 검체 패드, 컨쥬게이트 패드, 신호검출 패드 및 흡수 패드로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 면역크로마토그래피 스트립은 하기와 같은 구성을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 지지체;
2) 상기 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검 시료를 부착하는 검체 패드;
3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 피검 시료에 함유된 Col10A1 단백질과 특이적으로 결합하는 제 1 항체 컨쥬게이트를 함유하는 컨쥬게이트 패드;
4) 상기 컨쥬게이트 패드와 연동되어 있고, 상기 컨쥬게이트에 결합하는 제 2 항체가 선형으로 고정된 검출 라인(test line) 및 항-제 1 항체 면역글로불린이 고정된 대조 라인(control line)을 포함하는, 신호검출 패드; 및
5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드.
상기 구성에 있어서, 단계 3)의 발색제는 콜로이드성 골드 파티클(gold particle) 또는 HRP(horseradish peroxidase)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 구성에 있어서, 단계 4)의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오즈 막으로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 구성에 있어서, 단계 4)의 제 1 항체는 Col10A1 단백질과 특이적으로 결합하는 단일클론(monoclonal) 또는 다클론(polyclonal) 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 구성에 있어서, 단계 4)의 제 2 항체는 제 1차 항체-컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 구성에 있어서, 단계 5)의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공극(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 다공성 지지체의 상부면에 부착된 다공성 필름층을 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 흡수제는 염화칼슘, 염화마그네슘, 규조토, 벤토나이트, 백운석, 석고, 실리카겔 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타나면, 피검 시료를 폐암의 양성 시료로 판정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 우선 피검 시료인 혈장을 상기 검체 패드를 통해 면역크로마토그래피 스트립으로 공급된다. 상기 검체 패드는, 분석물질에 대한 선택성을 보다 향상시키기 위해 또는 상기 피검 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 필터링의 기능을 추가로 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 검체 패드의 상류에 분석물질과 컨쥬게이트 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 함유하는 보조 패드를 추가로 구비할 수 있다. 상기 검체 패드를 통해 도입된 혈액은 크로마토그래피적 이동을 통해 상기 검체 패드의 상류에 위치하는 컨쥬게이트 패드로 이동한다. 상기 컨쥬게이트 패드는 혈액에 함유되어 있는 Col10A1 단백질과 특이적으로 결합하는 컨쥬게이트가 함유되어 있다. 상기 컨쥬게이트는 금입자, 라텍스 입자, 형광물질, 및 효소 등에 의해 레이블링된다. 상기 컨쥬게이트 패드를 통과한 피검 시료는 신호검출 패드로 이동한다. 상기 신호검출 패드는 상기 피검 시료에 분석물질이 존재하는 지의 여부를 검출하는 검출라인과, 분석물질의 존재 유무와 관계없이 분석 키트가 정상적으로 작동하였는지 여부를 확인하는 대조라인을 포함한다. 이를 위해, 상기 검출라인에는 분석물질과 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트 사이의 결합 산물에 선택적이고 특이적으로 결합하는 물질(또는 신호검출물질)이 코팅되고, 상기 대조라인에는 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 물질이 코팅되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 신호검출 패드는 다공성 멤브레인 패드로 구성되며, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론 등으로 이루어질 수 있다.
또한, Col10A1 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 또는 모니터링용 바이오 센서를 제공한다.
상기 바이오 센서는 피검 대상자의 세포, 조직, 기관 등과 같은 생체조직으로부터 생체 활동 전위에 의해 방사되는 미세한 전자기장과 그의 변화량을 단일 또는 다채널의 바이오센서와 이를 포함하는 질병 진단시스템에 의해 정전용량과 그의 변화량으로 감지하는 바이오 센서를 이용하므로, 폐암의 진단용 또는 모니터링을 위한 수단으로 이용할 수 있다.
상기 바이오 센서는 Col10A1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 폐암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단이 포함되며, 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체 또는 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체 등을 사용함이 바람직하다.
특히, 검출수단으로서 이차항체-신호물질의 복합체를 사용할 경우, 신호물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광물질(예를 들어, Cy-3, Cy-5,FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등) 등을 사용함이 바람직하고, 효소를 신호물질로서 사용할 경우에는 폐암 진단용 키트에 전기 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.
또한, Col10A1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물분자들이 고형기질에 집적된 흉부암 모니터링, 진단 및 스크리닝용 바이오칩을 제공한다.
상기 생물분자는 항체 또는 앱타머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 고형기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, Col10A1의 양을 피검대상으로부터 탐색하기 위한 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 시료를 Col10A1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한 여러 종류의 항체가 고정된 플레이트에 반응시킨 후, 결합된 단백질을 질량분석(mass spectrometry) 방법으로 분석하는 폐암 진단용 또는 모니터링 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Col10A1를 단백질 마커로 이용한 폐암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시양태에서 Col10A1 단백질과 폐암과의 관계를 폐암 세포주 및 실제 폐암 환자를 통해서 확인하였으며, Col10A1의 발현량 및 민감도가 폐암에서 유의하게 높으므로, Col10A1를 폐암 진단에 유용하게 사용할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 폐암 진단 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
1) 피검체로부터 유래한 혈액시료에서 Col10A1의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 Col10A1의 발현량과 정상 혈액시료의 Col10A1의 발현량을 비교하는 단계; 및
3) Col10A1 발현량이 정상 대조군에 비해 증가하는 경우 폐암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 피검체는 인간을 포함한 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간, 유인원류, 소, 돼지, 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개 또는 고양이를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 Col10A1의 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러 본 발명은 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 예후 모니터링 키트 및 Col10A1에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 예후 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태에서 Col10A1 단백질과 폐암과의 관계를 폐암 세포주 및 실제 폐암 환자를 통해서 확인하였으며, Col10A1의 발현량 및 민감도가 폐암에서 유의하게 높으므로, Col10A1의 발현량을 폐암 예후 모니터링 방법 및 키트에 유용하게 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양
세포주에서의 단백질 분비를 관찰하기 위하여 폐암 세포주 A549(lung carcinoma), H460(lung adenocarcinoma)(Zhu et al., British J. Cancer, 94, 1936-1941 (2006)), 비소세포암주 HOP92(Zhong et al., J. Biol. Chem. 284, 23225-23233. (2009)) 및 대조군으로 293T(인간 배아 신장 세포주, human embryonic kidney cell line)(Senechal et. al., Human Mol. Genetics 14, 1613-1620, (2005)) 세포를 배양하였다. A549, H460, HOP92 세포주는 RPMI1640 배지 (Invitrogen)에 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum)(FBS, Invitrogen)을 첨가하여 습도가 유지된 5% CO2 37oC 배양기에서 배양하였으며, 293T 세포주는 Dulbecco's modification of Eagle's medium(DMEM)(Invitrogen)에 10% FBS를 첨가한 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 1 × 105 세포를 60 mm 배양접시에 분주하였으며, 2일, 3일 후 배지를 취하여 하기 실험에 사용하였다.
< 실험예 1> 암환자 혈액에서 Col10A1 의 발현 측정
어피메트릭스(Affymetrix)사의 데이타베이스를 기반으로 암 조직에서의 Col10A1의 발현 정보를 분석하고자 하였다. 폐암 혈액에서의 Col10A1의 발현량을 추정하기 위하여, 정상조직에서 발현되어 혈액에서 Col10A1이 분비될 수 있는 가능성을 고려하여 폐암 조직 이외의 모든 조직에서 발현되는 Col10A1 값을 정상 및 폐암의 조직에서 각각 발현되는 값에 더하여 폐암 환자의 혈액에 분비될 것으로 추정되는 값을 분석하였다.
그 결과 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 14종의 암 환자 혈액에 분비되는 Col10A1의 발현량은 흉부암에 이어 폐암에서 높은 수치를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다(표 1).
암 종류별 Col10A1의 혈액 내 발현량
종양 종류 FC(Log2) p-value
방광암 0.44 1.4E-02
뇌종양 0.01 1.1E-05
흉부암 1.30 5.6E-98
자궁경부암 0.34 3.5E-02
대장암 0.25 6.4E-24
두경부암 0.71 5.8E-05
신장암 0.03 9.0E-04
감암 0.03 4.2E-04
폐암 0.80 7.0E-39
자궁암 0.57 1.3E-02
췌장암 0.66 7.0E-03
전립선암 0.13 3.0E-03
위암 0.40 2.7E-07
갑상선암 0.31 7.2E-04
※ FC=fold change Log2
< 실험예 2> 폐암 세포주 배양액에서 Col10A1 의 검출
상기 <실시예 1>에서 배양한 폐암 세포 주 A549, 폐 선암 세포주 H460, 비소 폐암 주 HOP92 및 293T 세포를 이용하여, Col10A1의 존재유무를 상기 세포의 배양액 100 ㎕를 취하여 Col10A1의 존재를 확인하였다.
구체적으로 Col10A1의 존재를 확인하기 위하여, 효소면역측정법인 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였다. Col10A1에 특이적인 포집 항체로는 생쥐 단일클론 항체 ab49945(Abcam)를 코팅 용액[1 ℓ 기준 1.59 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 2 ㎖ 10% NaN3, pH 9.5]에 녹여 웰 당 1 ㎍씩 96-웰 플레이트(Nunc #439454)에 24시간 처리하여 코팅하였다. 비특이적 결합을 억제하기 위하여 웰 당 200 ㎕의 블로킹 용액[0.1% BSA (Bovine serum albumin), 0.02% 티메로살(Thimerosal)이 포함된 PBS]을 상온에서 2시간 처리하였다. 2시간 후, 웰에서 블로킹 용액을 버린 후 웰을 워싱(washing)용액[0.02% Thimerosal, 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 포함된 PBS]으로 5번 세척하고, 각각의 세포주 배양액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 대조군으로는 동일한 시간 배양한 293T 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney cell line) 배양액을 동일한 양으로 사용하였다. 상기 코팅한 플레이트를 2 ~ 3시간 상온에서 반응을 유도한 후 200 ㎕의 워싱용액으로 5회 세척하였다. Col10A1를 검출하기 위한 1차 항체는, ab64883(abcam) 토끼 항체를 1:2,000으로 PBS에 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가한 후 상온에서 2 ~ 3시간 반응시켰다. 반응 후, 웰 당 200 ㎕ 의 워싱용액으로 5회 세척한 후, HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 항-토끼-염소 항체를 PBS에 1:5,000 ~ 10,000으로 희석하여 각 웰에 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 워싱용액으로 5회 세척하였다. 퍼옥시데이즈 발색을 위하여 각 웰에 50 ㎕의 TMB 기질용액(GenDEPOT)을 첨가하여 상온에서 10분 반응한 후, 다시 50 ㎕의 정지용액(GenDEPOT)을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 실험에 사용한 3종류의 폐암 세포주에서 Col10A1의 존재를 확인할 수 있었으며, 대조군으로 사용한 293T 인간 배아 신장 세포주에 비하여 배양하는 기간이 길어질수록 현저히 발현량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 폐암 세포주를 비교하여 살펴보면, 폐 선암 세포주 H460, 폐암 세포 주 A549, 비소 폐암 주 HOP92 순으로 Col10A1의 분비량이 증가하고 있으며, 이러한 경향성은 배양 시간이 증가할수록 증가되는 경향성을 확인할 수 있었다(도 1).
< 실험예 2> 폐암환자 혈액에서 Col1 0A1의 검출
폐암 세포주의 배양액에서 검출된 Col10A1가 실제 폐암 환자의 혈액에서 존재하는지 확인하기 위하여, 국립암센터에서 제공한 폐암환자 83인의 혈액과 정상인 5인의 혈액을 이용하여 Col10A1의 혈액 중에 존재하는 양을 ELISA 실험을 통해서 비교하였다. 적혈구와 혈소판을 제거한 혈청 100 ㎕를 상기 효소면역측정법 실험을 이용하여 분석하였다.
Col10A1에 특이적인 포집 항체로는 생쥐 단일클론 항체 ab49945(Abcam)를 코팅 용액[1 ℓ 기준 1.59 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3, 2 ㎖ 10% NaN3, pH 9.5]에 녹여 웰 당 1 ㎍씩 96-웰 플레이트(Nunc #439454)에 24시간 처리하여 코팅하였다. 비특이적 결합을 억제하기 위하여 웰 당 200 ㎕의 블로킹 용액[0.1% BSA (Bovine serum albumin), 0.02% 티메로살(Thimerosal)이 포함된 PBS]을 상온에서 2시간 처리하였다. 2시간 후, 웰에서 블로킹 용액을 버린 후 웰을 워싱(washing)용액[0.02% Thimerosal, 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 포함된 PBS]으로 5번 세척하고, 각각의 세포주 배양액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 대조군으로는 3일 배양한 293T 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney cell line) 배양액을 동일한 양으로 사용하였다. 상기 코팅한 플레이트를 2 ~ 3시간 상온에서 반응을 유도한 후 200 ㎕의 워싱용액으로 5회 세척하였다. Col10A1를 검출하기 위한 1차 항체는, ab64883(abcam) 토끼 항체를 1:2,000으로 PBS에 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가한 후 상온에서 2 ~ 3시간 반응시켰다. 반응 후, 웰 당 200 ㎕ 의 워싱용액으로 5회 세척한 후, HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 항-토끼-염소 항체를 PBS에 1:5,000 ~ 10,000으로 희석하여 각 웰에 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 워싱용액으로 5회 세척하였다. 퍼옥시데이즈 발색을 위하여 각 웰에 50 ㎕의 TMB 기질용액(GenDEPOT)을 첨가하여 상온에서 10분 반응한 후, 다시 50 ㎕의 정지용액(GenDEPOT)을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 정상인 시료에서 측정된 흡광도는 평균 0.922이고 최고는 0.998이었으며, 환자 시료에서 측정된 값의 평균은 1.337, 최저값은 1.000, 최고값은 2.067 이었다. 환자의 시료 중 정상인 시료의 최고값보다 낮은 것은 없었다. 정상인의 시료수가 적기는 하지만 검사한 결과는 친화도와 특이도는 각각 100%였다(표 2). 정상인의 혈액에서 나타난 높은 흡광도로 인하여 정상인과 환자간의 흡광도 값의 차이가 적음에도 불구하고, 정상인 혈액에서 측정된 흡광도의 최고값을 기준으로 환자 혈액에서 Col10A1의 민감도 및 특이도를 계산할 때 매우 높은 민감도와 특이도를 보임을 알 수 있는 바, 폐암 마커로서 활용도가 높을 것이다(도 2).
정상인의 혈액 최고 흡광도를 기준으로 하였을 때의 민감도 및 특이도 비교.
시료 (총 89개)
 정상 환자
6 83
최대량 흡광도 0.998 2.067
최소량 흡광도 0.815 1.000
평균 흡광도 0.922 1.337
흡광도
0.998 기준
(정상인의 최대)
 흡광도 0.998 6 0
흡광도 > 0.998 0 83
민감도 (Sensitivity) 100
민감도 = (83/83) x 100
특이도
(Specificity)		 100
특이도 = (6/6) x 100
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 Col10A1는 폐암 세포주의 배양액뿐만 아니라, 폐암 환자의 혈액에서 존재하며, 정상인에 비해서 폐암 환자의 혈액에 더 많은 양이 존재하고 있으며, 적은 양으로도 민감하게 폐암을 진단할 수 있으므로, 폐암 진단용 단백질 마커로서 Col10A1를 이용하여, 진단용 키트 및 면역크로마토그래피 스트립 및 폐암 진단에 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (22)

  1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1)에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1)에 특이적인 항체는 발색효소, 발색물질 또는 형광분자에 결합된 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  3. 제 2항에 있어서, 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  4. 제 2항에 있어서, 발색물질은 콜로이드 골드(colloid gold)인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  5. 제 2항에 있어서, 형광분자는 FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1)에 특이적인 항체는 리간드에 결합된 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 리간드는 바이오틴, 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대해 바이오틴과 본질적으로 동일한 결합 작용을 갖는 바이오틴 유도체인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  8. 제 6항에 있어서, 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소, 발색물질 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  9. 제 8항에 있어서, 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  10. 제 6항에 있어서, 발색물질은 콜로이드 골드(colloid gold)인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  11. 제 8항에 있어서, 형광분자는 FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) 또는 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 키트.
  12. 1) 지지체;
    2) 상기 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검 시료를 부착하는 검체 패드;
    3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 피검 시료에 함유된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1) 단백질과 특이적으로 결합하는 제 1 항체 컨쥬게이트를 함유하는 컨쥬게이트 패드;
    4) 상기 컨쥬게이트 패드와 연동되어 있고, 상기 컨쥬게이트에 결합하는 제 2 항체가 선형으로 고정된 검출 라인(test line) 및 항-제 1 항체 면역글로불린이 고정된 대조 라인(control line)을 포함하는, 신호검출 패드; 및
    5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  13. 삭제
  14. 제 12항에 있어서, 단계 4)의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰 및 나일론으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  15. 제 12항에 있어서, 단계 4)의 제 1 항체는 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1) 단백질과 특이적으로 결합하는 단일 또는 단클론(monoclonal) 또는 다클론(polyclonal) 항체인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  16. 제 12항에 있어서, 단계 4)의 제 2 항체는 제 1차 항체-컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  17. 제 12항에 있어서, 단계 5)의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  18. 제 12항에 있어서, 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타나면, 피검 시료를 폐암의 양성 시료로 판정하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  19. 1) 피검체로부터 유래한 혈액시료에서 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1)의 발현량을 측정하는 단계;
    2) 단계 1)의 Col10A1의 발현량과 정상 혈액시료의 Col10A1의 발현량을 비교하는 단계; 및
    3) Col10A1 발현량이 정상 대조군에 비해 증가하는 경우 폐암에 걸릴 위험이 정상 대조군에 비해 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는 폐암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 단계 1)의 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1)의 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
  21. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 Col10A1(Collagen, type X, alpha 1)에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 예후 모니터링 키트.
  22. 삭제
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