DK170619B1 - Monoklonale antistoffer og fragmenter deraf med antigener knyttet til humane ikke-småcellede lungecarcinomer - Google Patents

Description

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale anti stoffer og fragmenter deraf mod antigener knyttet til humane ikke-småcellede lungecarcinomer.

DK 170619 B1

Humane lungecarcinomer er ansvarlige for de fleste 5 dødsfald af cancer blandt mænd og er ved at passere bryst-carcinom som den mest hyppige årsag til cancerdød blandt kvinder (Cancer Pacts and Figures, 1983). Denne sygdom kan opdeles i fire histologiske hovedtyper, nemlig den epider-moide type (30%) , adenocarcinom (35%), storcellet udif-10 ferentieret type (15%) og småcellet type (20%) . De fleste tilfælde af lungecarcinomer er uhelbredelige ved kemoterapi og stråleterapi. Småcellede lungecarcinomer kan reagere på kemoterapi og stråleterapi med en reduktion af størrelsen, men ikke med total helbredelse. Komplet kirurgisk 15 fjernelse af tumorer synes at være den eneste effektive behandling. Desværre har imidlertid færre end 30% af lungecancerpatienter tumorer, der kan fjernes fuldstændigt på diagnosticeringstidspunktet, og af disse overlever mindre end 1/3 fem år efter tilsyneladende fuldstændig kirurgisk 0 o · fjernelse af alt tumorvæv. Der foreligger derfor et stort behov for metoder, der vil muliggøre en tidligere diagnosticering af lungecancer, en bedre definition af graden af spredning af cancere og en mere effektiv behandling.

Monoklonale antistoffer kan anvendes til alle dis- 25 © se formal. En nødvendig betingelse er imidlertid at finde antistoffer mod antigener, der er mere stærkt ekspri-meret i lungecancervæv end i normalt væv hos voksne. På baggrund af den kendte heterogenitet af tumorcellepopulationer, tilstedeværelsen af flere determinanter på det samme 30 antigenmolekyle, de forventede forskelle mellem antigener med hensyn til deres egnethed som diagnostiske mærkestoffer i sammenligning med terapeutiske mål, og de forskellige biologiske karakteristika af forskellige antistoffer overfor det samme antigen, kan et antal forskellige antistof-35 fer være nødvendige.

DK 170619 B1 2

Monoklonale antistoffer mod lungecancerantigener er beskrevet af Sikora et al., Br. J. Cancer (1981) 43;-696-700; Cuttitta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

(1981) TB_: 4591-4595; Varki et al., Cancer Research (1984) * 5 j[4:681-687; Moody, T.W. et al., Science, (1981) 214:1246- -1248; Minna, J.D. et al., In Vitro 3/7 (12):1058-1070 * (12-1981); Kennel, A.J. et al., Cancer Research, 41(9,PT1):-3465-3470. Chem. Abst. 95 (15):1308502; Baylin, A.B. et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. _79_: 4650-4654 (8-1982) ; 10 Carney, D.N. et al., Pathobiology Annual 1982, 12:115-136 (1982) ; Gazdar, A.F. et al., Seminars in Oncology, 10:- 3-19(3-1983); Hollinshead, A.C. et al., Cancer Detec.

Prevent., 6^:185-191 (1983); Mulshine, J.T. et al., J.

Immunol., 131(1):497-502 (1983); Huang, L.C. et al., Arch.

15 Bioch. Biophys., 220 (1):318-320 (1983); Saji, S. et al.,

Hybridoma, 3(2):119-130 (1984), Bio. Abst. 79005569;

Bosslet, K. et al., Behring Inst. Mitt., _74:27-34 (1984),

Chem. Abst. CA101(9):70668b; Rosen, A.T. et al., Cancer Research, 44(5):2052-2061 (1984), Bio. Abst. 79014658; 20 Van Muijen, G.N.P. et al., Amer. J. Pathol., 116(3):363--369 (1984), Bio. Abst. 79023605; Princler, G.J. et al.,

Cancer Research, 4_2:843-848 (3-1982); Mazauric, T. et al.,

Cancer Research, 42:150-154 (1-1982); Braatz, J.A. et al.,

Cancer Research, 42^:849-855 (3-1982); Sobol, R.E. et 25 al., Fed. Proc., 41(3):409. Abst. 816 (4-1982); Natali et al., 1982, Cancer Res. 42:583-589; og Abrams et al., 1981, ASCO Abstracts 22, s. 373, C-163.

Kontinuerlige kulturer af fusionerede celler, der udskiller antistof med forud defineret specificitet 30 er beskrevet af Kohier et al., Nature (1975) 265:495- -497. Metoder til fremstilling af tumorantistoffer er be- r skrevet i US-patentskrift nr. 4.172.124.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte monoklonale antistoffer og fragmenter deraf, som define- ' 35 rer determinantsæder på sådanne antigener af humane ikke--småcellede lungecarcinomceller (NSCLC). Udtrykket "NSCLC- DK 170619 B1 3 -celler" omfatter epidermoide carcinomceller, adenocar-cinomceller og storcellede udifferentierede carcinomcel-ler. Determinantsæderne kan også findes på antigener af visse andre carcinomer, f.eks. nogle brystcarcinomer, og 5 antistofferne ifølge opfindelsen vil derfor også bindes til disse andre carcinomceller. De monoklonale antistoffer bindes i mindre grad til normale celler hos voksne end til tumorceller. Udtrykket "binding i mindre omfang" betyder, at bindingen ikke vil være påviselig ved immuno-10 histologiske metoder, eller at bindingen vil være ca. fire til fem gange mindre end bindingen til NSCLC-celler som bestemt ved immunohistologiske metoder. De monoklonale antistoffer udskilles af muse-hybridomer.

Den foreliggende opfindelse angår nærmere bestemt: 15 1) et monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende sted bindes til en epitop af et L3-antigen, hvilket antigen omfatter: a) et proteinantigen, som har en molekylvægt på ca.

76.000, og som er en celleoverfladedeterminant af humant 20 ikke-småcellet lungecarcinoma, og b) proteinantigener med en molekylvægt på- henholdsvis 94.000, 76.000 og 26.000 (form-I-, form-II-, form-III-anti-gen), og som udskilles af humant ikke-småcellet lungecarcinoma, 25 hvor det monoklonale antistof produceres af et hybridom med identifikationskarakteristikaene af A.T.C.C. HB8626, 2) et monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende sted bindes til et protein, der har en molekylvægt på ca.

30 140.000, og som er en celleoverfladedeterminant af humant ikke-småcellet lungecarcinoma, hvor det monoklonale antistof produceres af et hydridom med identifikationskarakteristikaene af A.T.C.C. HB8627, 3) et monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende 35 sted kompetitivt inhiberer den immunospecifikke binding af et monoklonalt antistof produceret af hybridomet A.T.C.C.

DK 170619 B1 4 HB8626, 4) et monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende sted kompetitivt inhiberer immunospecifik binding af et monoklonalt antistof produceret af hybridomet A.T.C.C.

5 HB8627, og 5) et Fab-, (F(ab*)2“ eller Fv-fragment af et mono- 4 klonalt antistof ifølge opfindelsen med samme bindingsegenskaber som det monoklonale antistof.

I den ovennævnte reference Natali et al., 1982, Cancer 10 Res. 42:583-589, beskrives et monoklonalt antistof 465.12S, som bindes til L3-antigenet, men til en anden epitop end L3-antistoffet ifølge opfindelsen. 465.12S er således et antistof, som adskiller sig tydeligt fra antistoffet ifølge opfindelsen, hvilket er demonstreret i eksempel 4 nedenfor 15 i den foreliggende beskrivelse. I dette eksempel er det vist, at 465.12S-antistoffet ikke konkurrerer med L3-anti-stoffet om binding til carcinomaceller, hvilket demonstrerer, at L3- og 465.12S-antistofferne reagerer med forskellige epitoper på L3-antigenet og ikke er funktionelt ækvivalente.

20 I den ovennævnte reference Mazauric et al., 1982,

Cancer Res. 42:150-154, beskrives et antal forskellige monoklonale antistoffer mod humane lungetumorer. Imidlertid bindes ingen af disse antistoffer til L3-antigenet beskrevet i den foreliggende beskrivelse. Mazauric et al. bekriver 25 således molekylvægtene af hvert af antigenerne, hvortil antistofferne bindes, og ingen af disse antigener har molekylvægte på 94.000, 76.000 eller 26.000 som beskrevet for de forskellige former af L3-antigenet i den foreliggende beskrivelse. Antistofferne ifølge Mazauric et al. bindes 30 altså ikke til L3-antigenet og adskiller sig derfor tydeligt fra L3-antistoffet ifølge opfindelsen.

I den ovennævnte reference Abrams et al., 191, ASCO Abstracts 22, s. 373, C-163, beskrives det monoklonale antistof 505, som bindes til ikke-småcellede lungecarcinomaer, 35 visse andre humane tumorer, såsom hypernephroma og melanoma, og dyrkede humane hudcellelinier. Desuden bindes det be- DK 170619 B1 5 skrevne antistof ikke til normalt humant lunge-, levereller nyrevæv. Den beskrevne reaktivitet af 505-antistoffet er således tydeligt forskellig fra reaktiviteten af L3-anti-stoffet beskrevet i den foreliggende ansøgning.

5 I den ovennævnte reference Bosslet et al., 1984,

Chem. Abstr. 101:70668b, beskrives et monoklonalt antistof BW 166/6, som angives at binde til to molekyler, som er løst knyttet til cellemembranen af lungecarcinomaer. Der antydes intet om, at dette antistof er specifikt for ik-10 ke-småcellede lungecarcinomaer, eller at antistoffet bindes til L3-antigenet. Faktisk tyder det, der anføres i denne reference på, at antistoffet ikke bindes til et enkelt L3--antigen på overfladen af ikke-småcelle lungecarcinomaer, men til to molekyler, som er løst knyttet til celleoverfla-15 derne af lungecarcinomaer generelt.

Antistoffet ifølge opfindelsen adskiller sig således tydeligt fra antistofferne beskrevet i de nævnte referencer.

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er anvendelige ved diagnostiske metoder. Én sådan metode in-20 volverer bestemmelse af tilstedeværelsen af NSCLC-celler i en prøve, der mistænkes for at indeholde sådanne celler. Prøven bringes i kontakt med det monoklonale antistof, der kan skelne sådanne celler fra andre celletyper, som kan være til stede i prøven. Kontakteringen gennemføres på under 25 betingelser til binding af antistoffet til sådanne celler. Efter kontakteringen bestemmes tilstedeværelsen eller fraværelsen af binding af antistoffet til cellerne i prøven. Denne binding står i sammenhæng med tilstedeværelsen eller fraværelsen af NSCLC-celler i prøven. Generelt bringes prø-30 ven i kontakt med en mærket specifik bindingspartner for det monoklonale antistof. Dette mærkestof er i stand til at give et detekterbart signal.

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan f.eks. fremstilles ved standardmetoderne ifølge Kohier og 35 Milstein (se ovenfor). Som immunogen anvendes f.eks. humane lungecarcinomceller fra lungehinde-væskeudtrædning eller DK 170619 B1 6 dyrkede celler fra humant ikke-småcellet lungecarcinom eller celler fra en normal fosterlunge. Disse celler injiceres i en mus, og efter et tilstrækkeligt tidsrum aflives musen, og miltcellerne isoleres. Miltcellechromosomerne, der koder 5 for de ønskede immunoglobuliner, gøres udødelige ved at fusionere miltcellerne med myelomceller eller med lymphom- * celler, i almindelighed i nærværelse af polyethylenglycol.

De resulterende celler, der indeholder de fusionerede hy-bridomer, får lov at vokse i et selektivt medium, såsom 10 HAT-medium, og de overlevende celler dyrkes i et sådant medium under anvendelse af grænsefortyndingsbetingelser. Cellerne dyrkes i en egnet beholder, f.eks. i mikrotiterpla-der, og den ovenstående væske screenes for monoklonale antistoffer, der har den ønskede specificitet.

15 Der eksisterer forskellige metoder til forbedring af udbytterne af monoklonale antistoffer, såsom injektion af hybridomcellerne i bughulen hos et pattedyr, der accepterer cellerne, og høstning af ascitesvæsken. Hvis der opsamles en utilstrækkelig mængde af det monoklonale anti-20 stof i ascitesvæsken, høstes antistoffet fra værtsdyrets blod. Der eksisterer forskellige konventionelle metoder til isolering og rensning af de monoklonale antistoffer for at befri de monoklonale antistoffer for andre proteiner og andre forureninger (se Kohier og Milstein ovenfor).

25 Ét monoklonalt antistof ifølge den foreliggende op findelse er det hidtil ukendte antistof, der betegnes L3.

Dette monoklonale antistof definerer et determinantsæde på et celleassocieret antigen med en Mr på 76.000 ved SDS-PAGE, der er karakteristisk for humane NSCLC-celler, dvs. maligne 30 celler, og et determinantsæde på proteinantigener, der udskilles i kulturmediet af NSCLC-cellerne (form I-, II- og * III-antigen). Antistoffet er af IgGi-isotype. L3-Antistoffet bindes i mindre grad til visse normale celler. L3-Antistoffet produceres af L3-musehybridomer.

35 Form I-L3-antigen har en Mr på 94.000 ved en-di- mensional gelelektroforese på natriumdodecylsulfat-poly- 0 7 DK 170619 B1 acrylamid (SDS-PAGE). Form II-L3-antigen har en Mr på 76.000 ved SDS-PAGE, og form III-L3-antigen har en Mr på 26.000 ved SDS-PAGE.

Form I-L3-antigen kan renses 90 gange fra kultur-5 medier ved affinitetschromatografi (tabel I) og affinitets-chromatografi efterfulgt af acrylamidgelmetoder til dannelse af præparater, der indeholder mere end 70 hhv. 90 vægtprocent af form I-L3-antigen, som er et glycoprotein. Præparatet fremstillet ved affinitetschromatografirensning har 10 en specifik aktivitet på 46.500 enheder/mg i sammenligning med 522 enheder/mg for kulturmediet. Den specifikke aktivitet defineres som den mængde antigen, der er nødvendig 125 til at inhibere bindingen af I-mærket L3-antistof 50% ved en kompetitiv bindingsbestemmelse, hvorved der anven-15 des formalinfikserede monolag af Calu-l-celler. Præparater fremstillet ud fra kulturmediet ved affinitetschromatografi indeholder mere end 70% form I-antigen og for det meste mindre end 30% uspecificeret proteinmateriale med en Mr på ca. 50.000-200.000 ved SDS-PAGE indeholdende mindre mæng-20 der, ca. 10-20%, af form Il-antigen. Til stede i præparatet er også spormængder af form III-antigen.

Til bestemmelse af forholdet mellem cellulære og ekstracellulære former af L3-antigenet radiomærkes celler 35 med S-methionm, og der gennemføres et radiomærknings-25 forsøg. Cellerne mærkes i én time med S-methionin, anbringes i medium indeholdende umærket methionin i forskellige tidsrum og underkastes immunoudfældningsanalyse. Til at begynde med findes al specifik immunoudfældelig celleassocieret radioaktivitet i et protein med en Mr på 76.000.

30 De andre observerede mærkede proteiner findes også i prøver, hvorfra antistof er udeladt. Under udvekslingsperioden falder radioaktiviteten i formen med en Mr på 76.000, medens radioaktiviteten, der findes i formen frigjort til mediet (Mr 94.000), stiger. Radioaktiviteten i den celle-35 associerede form forsvinder med samme kinetiske forhold, som radioaktiviteten i den frigjorte form viser sig. t^^ for begge processer bestemmes ved densitometrisk analyse 8 0 DK 170619 B1 til at være ca. 1,5 timer. Disse resultater tyder pa, at den celleassocierede form med en Mr på 76.000 af antigenet er en forløber for formen med en Mr på 94.000 (form I-L3--antigen).

Da L3-antigenet er et glycoprotein, er det tænke-5 ligt, at det er kulhydratmodifikationer, der bevirker en tilsyneladende forøgelse af størrelsen af L3-antigenet, der observeres under dets frigørelse fra cellen. Denne mulighed undersøges ved at behandle immunopræcipitater inde-holdende de cellulære og frigjorte former af molekylet med glycosidaser med kendt specificitet. Størrelsen af det celleassocierede L3-antigen nedsættes til en Mr på 59.000 ved behandling med endoglycosidase H (Endo H), men påvirkes ikke af neuraminidase, hvilket viser, at det indeholder N-bundne oligosaccharider med højt mannoseindhold (se 15

Tarentino et al., 1974, J. Biol. Chem. 249:811-817). Dette resultat stemmer overens med observationen af, at modningen er følsom for tynicamycin, der er en kendt inhibitor for N-bundet glycosylering (Lehle et al., 1976, FEBS Let-2Q ters, 71.:167-170). I modsætning hertil er det frigjorte antigen Endo-H-resistent, men reduceres i størrelse til en Mr på 80.000 ved neuraminidasebehandling, hvilket viser tilstedeværelse af terminale sialinsyrerester på form I--L3-antigen. Omdannelsen af L3-antigen fra en celle-asso-25 cieret form til en frigjort form ledsages således af modning af N-bundne kulhydratsidekæder.

Den aminosyreterminale sekvens af form I-L3-anti-gen bestemmes ved konventionelle metoder på præparatet renset ved en kombination af affinitetschromatografi og 30 acrylamidgel-separationsmetoder. Denne sekvens (a) er følgende : 15 10 15

V-N-D-G-D-M-R-L-A-D-G-G-A-T-N-Q

og er yderligere defineret på følgende måde: 35 20 25 30

a-G-R-V-E-I-F-Y-R-G-Q-W-G-T-V

De ovenfor anførte enkelbogstavssymboler for aminosyrerne har deres sædvanlige betydning, hvor 0 9 DK 170619 B1 V betyder valin, N betyder asparagin, D betyder asparagin-syre, G betyder glycin, M betyder methionin, R betyder ar-ginin, L betyder leucin, A betyder alanin, T betyder threonin, Q betyder glutamin, E betyder glutaminsyre, 5 I betyder isoleucin, F betyder phenylalanin, Y betyder tyrosin og W betyder tryptophan. Det ovenfor anførte fås som en enkelt sekvens for præparatet indeholdende form I--L3-antigen, hvad enten form II-L3-antigen er til stede eller ej.

10 Sammenligning af de ovenfor anførte 30 N-terminale aminosyrer af L3-antigenet med proteinsekvenser, der findes i National Biomedical Research Foundation-proteinban-ken (marts 1985-udgave) viser ikke nogen væsentlige homo-logier. Sekvensen af form I-L3-antigen sammenlignes også 15 med sekvenserne af flere serumproteiner, der ikke i øjeblikket er anført i denne database, herunder human Cl--esterase-inhibitor og human α-2-thiolproteinase-inhibi-tor. Ingen af disse sekvenser viser nogen væsentlig homo-logi med den N-terminale sekvens af form I-L3-antigen.

20 Det er blevet konstateret, at form I-L3-antigen er til stede i normalt humant serum, og form I-L3-antigen er blevet renset fra serum. Egenskaberne af L3-antigenet fra serum er sammenfattet i tabel III. Form I-L3-antigen kan renses mere end 3.000 gange fra normalt humant serum 25 med et udbytte på 39% (tabel II). Analyse af det rensede materiale ved SDS-PAGE viser, at de væsentlige komponenter er proteiner, der vandrer sammen med form I- og form II--komponenter renset fra kulturmedium. Ingen af formerne er en væsentlig komponent af udgangs-serumprøven. Det er be-30 mærke1sesværdigt, at både form I- og II-L3-antigener fra serum opløses i to tydelige komponenter på den oprindelige gel, hvilket muligvis er et tegn på mikroheterogenitet på grund af glycosyleringsforskelle. Begge former er reaktive ifølge immunoblottinganalyse og ifølge radioiodering 35 og immunopræcipitation. Ligesom med antigenet renset fra kulturmedium påvises en yderligere form med en Mr på 26.000 DK 170619 B1 10 o (form III-L3-antigen) efter immunopræcipitation. Præparatet fremstillet ved immunoaffinitetschromatografi indeholder mere end 50 vægtprocent af form I-L3-antigen, idet det resterende materiale er form II-L3-antigen, transferrin 5 og uspecificerede proteiner med en Mr på ca. 50.000- -200.000 ved SDS-PAGE. Dette præparat har en specifik ak- ; tivitet på 45.500 enheder/mg i sammenligning med 13,3 enheder /mg for normalt humant serum.

Disse resultater viser, at L3-antigenaktivitet udio trykkes på to komponenter (form I og II), der findes i både kulturmedium og serum. Yderligere rensning af form I--L3-antigen fra serum ved præparativ SDS-PAGE giver præparater, der overvejende indeholder form I-L3-antigen i en mængde på mere end 90 vægtprocent og variable spormængder af 15 form Il-antigen, idet det resterende materiale er transferrin og uspecificerede proteiner med en Mr på ca.

50.000-200.000.

125 . . .

I-Mærkede og immunopræcipiterede antigener renset fra både serum og kulturmedium ved todimensional iso-20 elektrisk fokusering/SDS-PAGE sammenlignes. De todimensionale mobiliteter af de antigener ligner hinanden meget, idet både form I- og form Il-komponenterne vandrer som heterogene stoffer i pH-værdiområdet 4,2-5,0. Form I-L3--antigen fra begge kilder udviser også to mindre komponen-25 ter, der vandrer ved omtrentlige pH-værdier på 5,8 og 6,2. Kulhydratsammensætningen af begge antigener undersøges også ved afprøvning af glycosidasefølsomhed. Form I- og form II-L3-antigener fra begge kilder viser sig at være Endo-H--resistente, medens neuraminidasebehandling af begge med-30 fører fremkomst af det karakteristiske fragment med en Mr på 80.000, der observeres efter behandling af metabolisk mærket antigen. Neuraminidasefølsomheden af form II--antigen viser, at det er forskelligt fra den celleassocierede form af L3-antigenet med en Mr på 76.000.

35 Til bekræftelse af, at de to molekyler ligner hinanden strukturelt, underkastes form I-molekyler fra beg- DK 170619 B1 11 o ge kilder en række af partielle proteasespaltningsreaktio-ner som beskrevet af Cleveland et al., (1977) J. Biol.

Chem., 252:1102-1106. De radiomærkede form I-antigener renset fra både kulturmedium og serum udskæres fra en 5 præparativ SDS-PAGE-gel og underkastes en fingeraftryksbestemmelse med V8-protease. De to molekyler giver identiske partielle spaltningsmønstre, idet der observeres mindst fem forskellige partielle spaltningsprodukter (Mr = 76.000, 49.000, 31.000, 20.000 og 14.300) i begge til-10 fælde. Disse resultater viser, at L3-antigener renset fra kulturmedium og humant serum er nært beslægtede.

Relationerne mellem de tre molekylvægtformer af L3-antigen fra serum er også undersøgt. De samlede fingeraftryksbestemmelser for form I og II ligner hinanden ganske 15 meget, omend form Il-molekylet ikke giver fragmenter med en Mr på 31.000 og 14.300, der fås fra form I-molekylet. Mønstrene tyder på, at form I- og form Il-molekylerne er nært beslægtede. Form III-antigenet har et partielt spaltningsprodukt med en Mr på 14.300 fælles med de større an-20 tigenformer, der findes i serum, hvilket kan tyde på, at form III-antigenet også er strukturelt beslægtet med form I-antigen. De store strukturmæssige ligheder mellem de forskellige former tyder på, at form II- og III-moleky-lerne er afledt af form I-antigen.

25 For at bestemme, om L3-antigenet er beskrevet tid ligere som en antigenkomponent af en anden tumortype end lungecarcinom, er der gennemført en litteraturundersøgelse for udskilte tumorassocierede antigener. Der er herved blevet fundet flere rapporter om melanom-udskilte proteinan-30 tigener, der har en størrelse og en kulhydratsammensætning, der ligner L3-antigenets størrelse og kulturhydratsammen-sætning. Natali et al., (1982) Cancer Res. 42:583-589;

Bumol et al., (1982) Hybridoma 1^:283-292; og Wilson et al., (1981) Int. J. Cancer 28:293-300.

35 Små mængder af et af de tidligere beskrevne mono- klonale antistoffer (465.12S; Natali et al., se ovenfor) DK 170619 B1 12 stod til rådighed for opfinderne på grund af deres deltagelse i the First International Workshop on Melanoma Associated Antigens. Dette antistof er anvendt ved et sek-vens-immunopræcipitationsforsøg til undersøgelse for identitet af L3-antigenet og antigenet/ der genkendes af an-5 tistof 465.12S. Begge antistoffer udfælder specifikt et » proteinmateriale med en Mr på 94.000 fra kulturmedium af 35 celler, der er metabolisk mærket med S-methionin. Fjernelse fra kulturmediet af enten L3-antigen eller 465.12S--antigen ved immunopræcipitation medfører sideløbende fjernelse af antigenaktivitet af det alternative antigen. Dette viser, at de antigene determinanter, der genkendes af begge antistoffer, bæres på det samme molekyle (tabel III). Imidlertid er epitoperne, der genkendes af de to antistof-15 fer, tilsyneladende forskellige, idet det ikke har været muligt at påvise kompetitiv virkning af antistof 465.12S 125 ved binding af I-L3-antistof.

Et andet monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, er L5, som definerer et determinantsæde på et celle- 2Q overflade-proteinantigen, der er karakteristisk for humane NSCLC-celler. Molekylvægten af proteinet, som bestemt ved den ovenfor beskrevne metode og ved en metode baseret på 125 I-mærknmg, er ca. 135.000. Dette antistof er af IgM--klassen. L5-Antistoffet bindes ikke påviseligt til nor-25 male celler, såsom fibroblaster, endotheliale celler og epithelceller i de større organer. L5-Antistoffet fremstilles af L5-musehybridomer. L5-Antigenet har to karakteristiske V8-proteasefragmenter med en Mr på 24.000 og 16.000 som vist ved en metode beskrevet af Cleveland et 30 al., (1977), J. Biol. Chem. 252:1102-1106. L5-Antigenet er således forskelligt fra andre antigener med lignende molekylvægt.

Fab-, F(ab1)2“ og Fv-fragmenterne af de monoklonale antistoffer, fås ved konventionelle metoder. F.eks. kan 35 fragmenterne fremstilles ved peptidasenedbrydning af antistoffet ved anvendelse af papain eller pepsin.

DK 170619 B1 13

Selv om de ovenfor anførte specifikke eksempler på de hidtil ukendte antistoffer ifølge opfindelsen er rettet på antistoffer, der bindes til specifikke determinantsæder på de respektive antigener og er af specifikke klas-5 ser og isotyper fra en muse-kilde, skal dette ikke opfattes som en begrænsning. De ovenfor anførte antistoffer og antistoffer, der er funktionelt ækvivalente med de ovenfor anførte antistoffer, hvad enten de er fra en muse-kilde, en pattedyr-kilde, herunder humane eller andre kilder, el-10 let kombinationer deraf, er omfattet af opfindelsen ligesom andre klasser, såsom IgM, IgA, IgE og lignende, herunder isotyper i sådanne klasser. Med udtrykket "funktionel ækvivalens" menes, at antistoffet er i stand til at binde til det ovenfor beskrevne determinantsæde og er i 15 stand til at virke kompetitivt med et bestemt antistof i-følge opfindelsen for et sådant sæde. Dette betyder, at et sådant antistof, når det kombineres med en prøve, der indeholder celler eller cellefragmenter med et sådant determinantsæde, vil bindes til dette determinantsæde og vil 20 forhindre et antistof ifølge opfindelsen i at blive bundet til et sådant sæde.

Antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes til bestemmelse af tilstedeværelse af en malign tilstand i lungevæg. Med udtrykket "malign tilstand" menes tilstedeværelsen 25 af dysplastiske tilstande, herunder carcinom in situ, neo-plastiske celler, maligne celler eller tumorceller eller lignende. Prøven bringes i kontakt med eller kombineres med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen. Kontakteringen gennemføres under betingelser til binding af anti-30 stoffet til de maligne celler. Efter kontakten observeres tilstedeværelsen af binding af antistoffet til de maligne celler i prøven. Dette betyder, at prøven undersøges for immunkomplekser af antistoffet og det antigene sæde. Denne immunkompleksdannelse hænger sammen med tilstedeværel-35 sen af maligne celler i prøven.

DK 170619 B1 14

Et særligt eksempel, der er illustrerende og ikke begrænsende, på en metode af den nævnte art er en metode til påvisning af tumorceller i fjernet væv. Metoden anvendes på en prøve, som er et tværsnit af tumoren, der er fremstil-5 let efter fjernelse af tumoren. Tumoren, som er fjernet, behandles til fremstilling af tværsnit, og denne behandling < involverer til at begynde med frysning af tumoren eller vævet, idet der normalt fryses umiddelbart efter udtagelsen.

Det frosne lag af væv opskæres derefter til snit, idet der 10 f.eks. anvendes en cryostat.

Snittet af tumoren, der er fremstillet som ovenfor beskrevet, bringes i kontakt med et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen og derefter med et andet antistof, der er rettet mod det ovennævnte monoklonale antistof, hvilket 15 andet antistof er mærket med et påviseligt mærkestof.

Den udtagne prøve, f.eks. snittet af tumoren, bringes i kontakt med det første monoklonale antistof under betingelser til binding af antistoffet til de maligne celler. Inkuberingen gennemføres i almindelighed i et vandigt me-20 dium, f.eks. phosphatpufret saltopløsning indeholdende en lille mængde natriumazid, i en egnet beholder, f.eks. en petriskål af glas, i et tidsrum på ca. 15-30 minutter ved en temperatur på ca. 20-30°C. Den anvendte mængde antistof er sædvanligvis tilstrækkelig til at give en påviselig bin-25 ding, dvs. til at give et påviseligt antal immunkomplekser mellem antistoffet og det pågældende determinant- eller -antigensæde.

Efter inkuberingen vaskes snittet til nedsættelse eller fjernelse af ikke-specifikt bundet antistof, og det 30 undersøges derefter for at observere de ovennævnte komplekser, der fremkommer ved binding af det monoklonale antistof til celler i prøven, der har det antigene sæde. Bindingen hænger sammen med tilstedeværelsen af maligne celler i snittet. I overensstemmelse hermed bestemmes bindin-35 gen f.eks. ved at bringe prøven i kontakt med en mærket specifik bindingspartner for det monoklonale antistof.

15 DK 170619 B1 0 Mærkestoffet er i stand til at give et påviseligt signal og kan være et radioaktivt mærkestof, en chromophor, såsom et fluorescerende stof, et enzym eller lignende.

Et eksempel på en teknik, hvorved der anvendes 5 den ovenfor anførte metode, er immunofluorescensfarvning.

Ved denne teknik fikseres frosne snit af tumoren på en glasplade med acetone og inkuberes med det monoklonale antistof i f.eks. en petriskål. Efter vaskning med en passende puffer, f.eks. phosphatpufret saltopløsning, anbrin-10 ges snittet i en petriskål og bringes i kontakt me'd den mærkede specifikke bindingspartner for det monoklonale antistof, der f.eks. kan være et mærket antistof, der er specifikt for det anvendte monoklonale antistof. Da det monoklonale antistof for det meste vil være afledt fra en 15 muse-kilde, kan der anvendes et mærket anti-muse-immunoglobulin, der er specifikt for det monoklonale antistof. Sådanne immunoglobuliner kan dannes ved standardmetoder ved injektion af muse-antistof i et egnet værtsdyr, hvorefter der ventes et passende tidsrum, og anti-muse-immuno-20 globulinerne høstes fra blodet af værtsdyret.

Efter en anden vaskning af pladen med f.eks. en vandig puffer kan snittene dækkes med en monteringsvæske for fluorescerende antistof og et dækglas og derefter undersøges med et fluorescensmikroskop til bestemmelse af 25 bindingen af det monoklonale antistof til snittet. Bestemmelsen af bindingen kan også omfatte en identifikation af placeringen af en sådan binding i prøven.

Bindingen af det monoklonale antistof til prøven kan også bestemmes ved anvendelse af et monoklonalt anti-30 stof, der er covalent konjugeret til et mærkestof, der kan give et påviseligt signal, såsom et radioaktivt stof, en chromophor, inkl. farvestoffer og fluorescerende stoffer, eller et enzym. Antallet af mærkninger, der anvendes pr. molekyle antistof, bestemmes i almindelighed af kravene ved 35 den diagnostiske metode, hvorved det mærkede antistof anvendes, og tilgængeligheden af sæder til binding af mær- 16 DK 170619 B1 0 kestoffet til antistoffet.

Metoder til konjugering af mærkestoffer til antistoffer og antistoffragmenter er velkendte. Sådanne metoder er f.eks. beskrevet i US-patentskrift nr. 4.220.450, 5 4.235.869, 3.935.074 og 3.996.345.

Et andet eksempel på en teknik, hvorved det mono-klonale antistof ifølge opfindelsen kan anvendes, er immu-noperoxidasemærkning (Sternberger, Immunocytochemistry,

John Wiley & Sons, New York, 1979, side 104-169, som modi-10 ficeret af Garrigues et al., Int. J. Cancer (1982)·29:511--515). Vævet, der skal undersøges, fikseres med et egnet opløsningsmiddel, såsom acetone, på et underlag, såsom en glasplade. Derefter inkuberes vævet med det monoklonale antistof og vaskes derefter frit for ikke-bundet antistof.

15 Derpå inkuberes vævet med kanin-anti-muse-IgG, vaskes til fjernelse af ikke-bundet antistof, kombineres med muse--peroxidase-anti-peroxidase-kompleks, vaskes til fjernelse af ikke-bundet konjugat og behandles derefter med substrat for enzymet. Efter denne behandling undersøges pla-20 den for et påviseligt signal.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes ved en metode til bestemmelse af tilstedeværelsen af en malign tilstand i en afstødt celleprøve fra lungen, såsom opspyt.

Med udtrykket "afstødt" menes, at prøven indeholder iso- 25 lerede celler eller klumper af celler, der fås ved at skrabe eller skylle overfladen af væv, idet disse celler fjernes enkeltvis eller i flager. Der skal skelnes mellem prøven med afstødte celler og prøver af udskåret væv, der f.eks. fås ved biopsy. Kontakten mellem prøven og antistof-30 fet gennemføres under betingelser til binding af antistoffet til det antigene sæde. Efter kontakten bestemmes tilstedeværelsen eller fraværelsen af binding af antistoffet til det antigene sæde, og den hænger sammen med tilstedeværelsen eller fraværelsen af en malign tilstand i lungen.

Til bestemmelse af tilstedeværelsen af en malign tilstand i lungen vil en spytprøve give den prøve af af- 35 17 DK 170619 B1 0 stødte celler, der skal anvendes ved metoden. Metoden kan være anvendelig til påvisning af en malign tilstand i prøver af afstødte celler fra bronkierne, mave-tarmkanalen, herunder svælget, munden osv.

5 Prøven af afstødte celler bringes derefter i kon takt med det ovennævnte antistof under betingelser til binding af antistoffet til det specifikke antigensæde i prøven til dannelse af antigen-antistof-komplekser. Dette antigene sæde kan være til stede på celler eller cellefragmen-10 ter i prøven. Generelt placeres prøven på et passende underlag, f.eks. en plade, sædvanligvis af glas eller et andet egnet materiale. Prøven af afstødte celler udstryges i almindelighed på pladen, således at der fås et tyndt lag af prøven på pladens overflade. Kontakten mellem antistoffet 15 og prøven gennemføres i almindelighed i et vandigt pufret medium. Pufferne, som kan anvendes, omfatter phosphat, tris, hydrogencarbonat osv. pH-værdien er afhængig af naturen af prøven og antistoffet og er i almindelighed i området fra ca. 5 til 8. Det vandige medium kan desuden indeholde or-20 ganiske polære opløsningsmidler i en mængde på ca. 0 til 40%. De organiske polære opløsningsmidler er vandopløselige og har i almindelighed ca. 1-10 carbonatomer og ca.

1-4 oxygenatomer. Antistoffet vil være til stede i det vandige medium i en koncentration på ca. 1-100 Mg/ml, fortrins-25 vis ca. 10-20 μg/ml. Temperaturen under kontakten mellem prøven og antistoffet er sædvanligvis ca. 4-40°C, fortrinsvis ca. 10-30°C. Kontakttiden er sædvanligvis ca. 15-120 minutter, fortrinsvis ca. 30-60 minutter.

Efter tidsrummet med kontakt mellem prøven og an-30 tistoffet behandles underlaget i almindelighed til fjernelse af ikke-omsat antistof. Dette sker normalt ved at vaske underlaget med et vandigt, sædvanligvis pufret medium. Generelt bør mængden af vaskeopløsning være tilstrækkelig til at fjerne det ikke-omsatte antistof.

35 Derefter observeres tilstedeværelsen af binding af 0 18 DK 170619 B1 antistoffet til antigensædet i prøven, idet denne binding hænger sammen med tilstedeværelsen af en malign tilstand på stedet. Dette betyder, at prøven undersøges til bestemmelse af antallet af dannede antigen-antistof-komplekser 5 (immunkomplekser). Det skal bemærkes, at der i nogle tilfælde kan findes meget små antal af det omhandlede antigene ' sæde i prøven af afstødte celler. Når der tale om en malign tilstand vil der imidlertid være et stort antal antigene sæder til stede, og denne sidstnævnte tilstand kan let skel-10 nes fra den ikke-maligne tilstand ved den foreliggende metode, fordi et stort antal antigen-antistof-komplekser vil kunne måles, når der foreligger en malign tilstand. For at muliggøre bestemmelse af tilstedeværelsen af binding inkorporeres der midler til dannelse af et påviseligt signal i 15 bestemmelsessystemet. F.eks. kan antistoffet anvendt ved bestemmelsen konjugeres til et mærkestof, der er i stand til at give et påviseligt signal. Mærkestoffet kan være et radioaktivt stof, en chromophor, inkl. farvestoffer og fluorescerende stoffer, et enzym eller lignende. Antallet 20 af mærkestoffer, der anvendes til antistoffet, bestemmes i almindelighed af metodens krav og tilgængeligheden af sæder til binding af mærkestoffet til antistoffet.

Alternativt kan man bringe den vaskede plade i kontakt med en mærket specifik bindingspartner for anti-25 stoffet, der f.eks. kan være et mærket antistof, som er specifikt for det anvendte antistof. Når det monoklonale antistof er afledt fra en muse-kilde, kan der anvendes et mærket anti-muse-immunoglobulin, der er specifikt for antistoffet anvendt ved metoden. Sådanne immunoglobuliner 30 kan dannes ved standardmetoder ved injektion af det monoklonale antistof i et egnet værtsdyr, hvorefter der ventes et passende tidsrum, og anti-muse-immunoglobulinerne høstes fra blodet af værtsdyret. Når der anvendes en mærket specifik bindingspartner for antistoffet, skal pladen vas-35 kes igen med vandigt medium, før pladen undersøges for fluorescens.

0 19 DK 170619 B1

Til bestemmelse af tilstedeværelsen af binding mellem antistoffet og celleprøven/ når der anvendes et fluorescerende mærkestof, kan man undersøge pladen for fluorescens, sædvanligvis ved anvendelse af et fluorescens-mikroskop.

5 Hvis der anvendes et andet mærkestof end et fluorescerende stof, kan man undersøge pladen eller prøven for dannelse af et bundfald, en farve eller lignende.

Den ovenfor anførte beskrivelse angår primært anvendelsen af antistofferne ifølge opfindelsen ved immuno-10 fluorescensmetoder. Imidlertid kan antistofferne ifølge opfindelsen anvendes ved de fleste bestemmelser, der involverer antigen-antistof-reaktioner. Bestemmelserne kan være homogene eller heterogene. Ved en homogen bestemmelsesmetode kan prøven være en biologisk væske, såsom serum, 15 urin og lignende, eller prøven kan lyseres og klares til fjernelse af nedbrudt materiale. L3-Antistof er f.eks.blevet anvendt til at måle koncentrationen af det tilsvarende antigen, dvs. form I-, II- eller III-L3-antigen i serum fra cancerpatienter, og visse cancerpatienter har vist sig 20 at have forhøjede niveauer af dette antigen i sammenligning med normale kontroller. Den immunologiske reaktion involverer sædvanligvis det specifikke antistof, en mærket analyt og prøven, der skal undersøges. Signalet fra mærkestoffet modificeres, direkte eller indirekte, ved bin-25 ding af antistoffet til den mærkede analyt. Både den immunologiske reaktion og påvisningen af dennes omfang kan gennemføres i en homogen opløsning. Immunokemiske mærkestoffer, som kan anvendes, omfatter frie radikaler, fluorescerende farvestoffer, enzymer, bacteriophager, coenzymer osv.

30 Ved en heterogen bestemmelsesmetode er reagenser ne sædvanligvis prøven, det specifikke antistof og et middel til tilvejebringelse af et påviseligt signal. Prøven anbringes i almindelighed på et underlag, såsom en plade, og bringes i kontakt med antistoffet i væskefase. Underla-35 get skilles derefter fra væskefasen, og understøtningsfasen eller væskefasen undersøges for et påviseligt signal DK 170619 B1 20 ved anvendelse af midler til tilvejebringelse af et sådant signal. Signalet står i sammenhæng med tilstedeværelsen af analyten i prøven. Midler til tilvejebringelse af et påviseligt signal omfatter anvendelse af radioaktive mærkestof-5 fer, fluorescerende stoffer, enzymer osv. Eksempler på heterogene immunobestemmelser er radioimmunobestemmelse, , immunofluorescensmetoder, enzymbundne immunobestemmelser og lignende.

Vedrørende en mere detaljeret diskussion af de o-10 venfor anførte immunobestemmelsesmetoder, se "Enzyme-Im-munoassay," Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton,

Florida, 1980. Se også f.eks. US-patentskrift nr. 3.690.834, 3.791.932, 3.817.837, 3.850.578, 3.853.987, 3.867.517, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345 og 4.098.876.

15 Denne opregning skal ikke betragtes som udtømmende.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan også anvendes til billeddannelse af metastaser hos patienter med NSCLC på samme måde som beskrevet for malignt melanom i J. Nucl.

Med. (1983) 24^123-129 og i J. Clin. Invest. (1983) 72:-20 2101-2114. Antistoffet eller fragmenter deraf radiomærkes og indgives intravenøst til en patient, hvorefter der foretages billeddannelse ved anvendelse af f.eks. et gammakamera eller lignende.

De ovenfor beskrevne metoder kan gennemføres ved 25 hjælp af diagnostiske sæt. Et diagnostisk sæt kan i en emballeret kombination omfatte a) et monoklonalt antistof, som defineret mere specifikt ovenfor, og b) et konjugat af en specifik bindingspartner for det ovenfor anførte mono-klonale antistof og et mærkestof, der er i stand til at 30 give et påviseligt signal. Reagenserne kan også omfatte hjælpestoffer, såsom puffere og proteinstabiliserende midler, f.eks. polysaccharider og lignende, som kan være nødvendige til gennemførelse af sådanne metoder. Det diagnostiske sæt kan endvidere om fornødent indeholde andre medlemmer af det ♦ 35 signalgivende system, hvoraf mærkestoffet er et medlem, midler til reduktion af baggrundsinterferens ved en prøve, DK 170619 B1 21 kontrolreagenser, apparatur til gennemførelse af en prøve og lignende. Et diagnostisk sæt kan også omfatte et konjugat af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen og et mærkestof, der er i stand til at give et påviseligt signal. Hjæl-5 pestoffer som ovenfor nævnt kan også være til stede.

Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes terapeutisk. Antistoffer med de rette biologiske egenskaber kan anvendes direkte som terapeutiske midler. Alternativt kan antistofferne bindes til et toxin til dannelse af et immuno-10 toxin eller til et radioaktivt materiale eller lægemiddel til dannelse af et radiofarmaceutisk middel eller et farmaceutisk middel. Metoder til fremstilling af immunotoxi-ner og radiofarmaceutiske midler af antistoffer er velkendte (se f.eks. Cancer Treatment Reports (1984) 68:317-328).

15 En anden terapeutisk anvendelse af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er immunisering af en patient med et antistof af anti-idiotype dannet ved anvendelse af et af de her omhandlede monoklonale antistoffer som immunogen, en sådan immunisering kan fremkalde en aktiv 0 Π anti-tumor-aktivitet (se f.eks. Nepom et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. (1984) 8_1: 2864-2867) . Ved en lignende metode kan patienten immuniseres med antigenet i renset form, et peptidfragment af antigenet eller en modificeret form af antigenet.

25

Et særlig attraktivt aspekt af den foreliggende opfindelse er, at L3-antistoffet kan anvendes i kombination med andre antistoffer. Kombinationen kan være effektiv til påvisning af i det mindste de ovennævnte typer af lunge- carcinomer, nemlig storcellet udifferentieret lungecarcinom, 30 adenocarcinom og epidermoidcarcinom.

Nogle af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen definerer også determinantsæder på antigener associeret med andre carcinomer, såsom brystcarcinom og epidermoide 25 vulva-carcinomer. Følgelig kan de her omhandlede antistoffer finde anvendelse i diagnostiske og terapeutiske produkter, der er rettet på sådanne carcinomer.

22 DK 170619 B1 0

EKSEMPLER

Den foreliggende opfindelse illustreres yderligere i de følgende eksempler. Der beskrives først et antal anvendte procedurer.

5 s

Materiale

Kulturmedier fås fra Gibco. Kalvefosterserum fås fra Gibco eller Hyclone. "Teflon"-overtrukne flerhuls mikroskopplader (12 huller) fås fra Meloy. Plast-kulturplader 10 fås fra Corning eller Costar. V8-Protease og kvægserum- albumin fås fra Sigma. Neuraminidase og "Pansorbin" (formalin-f ikseret S. aureus) fås fra Calbiochem. Endoglycosi-dase H fås fra Miles. Nitrocellulose (BA85, 0,45 μπι) fås fra Schleicher og Schuell. Protein A - "Sepharose", CNBr-ak-15 tiveret "Sepharose 4B", "Sephadex G-10", "DEAE Sephacel" og protein A-konjugeret "Sepharose CL4B" fås fra Pharmacia. NP-40 fås fra Particle Data Ltd. Polyethylenglycol, røntgenfilm og "Kodavue"-farvningssættet fås fra Kodak.

Acrylamid og sølvfarvningssæt fås fra BioRad. Forud far-20 vede molekylvægtsmarkører fås fra Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland (BRL). "^C-methylerede molekyl- O O ET «i *y c vægtsmarkører, H-glucosamin, S-methionin og °I fås fra Amersham. FITC-konjugeret gede-anti-muse-immunoglobulin fås fra Tago. Paragon-serumproteinelektrophoreseapparatet fås 25 fra Beckman. Ampholiner fås fra LKB.

Immunohistoloqisk teknik

Til immunohistologiske undersøgelser på frosne snit anvendes metoden med ikke-mærket antistof ifølge 30 Sternberger, Immunochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1979, pp:104-169, som modificeret af Garrigues et al., i Int. J. Cancer (1982) _29:511-515. Vævet til disse prøver fås kirurgisk og fryses inden 4 timer efter fjernelsen i isopentan, der er for-kølet i flydende nitrogen. Vævet op-35 bevares derefter i flydende nitrogen eller ved -70°C indtil anvendelsen. Kanin-anti-muse-IgG (Sternberger-Meyer DK 170619 B1 0 23

Immunochemicals, Inc., Jarettsville, MD) anvendes i en fortynding på 1:50. Museperoxidase-antiperoxidase-kompleks (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc.) indeholdende 2 mg/ml specifikt renset PAP anvendes i en fortynding på 5 1:80. Frosne snit præpareres, tørres, behandles med acetone og tørres (Garrigues et al., 1982). Snit, der skal anvendes til histologisk vurdering, farves med hæmatoxylin. Til nedsættelse af ikke-specifik baggrund præinkuberes snittene med normalt humant serum fortyndet 1:5 (Garrigues et al.,

10 1982). Muse-antistoffer, gede-anti-muse-IgG og muse-PAP

fortyndes i en opløsning af 10% normalt humant serum og 3% kaninserum.

Farvningsproceduren består i at behandle en række af snit med enten specifikt antistof eller kontrolantistof 15 i 2,5 timer, inkubere i 30 minutter med kanin-anti-muse- -IgG fortyndet 1:50 og behandle i 30 minutter med muse-PAP--kompleks fortyndet 1:80. Efter hver behandling med antistof vaskes pladerne to gange i phosphatpufret saltopløsning (PBS). Den immunohistokemiske reaktion fremkaldes med 20 frisk fremstillet 0,5% 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydro- chlorid (Sigma, St. Louis. MO) og 0,01% hydrogenperoxid i 0,05 M tris-puffer, pH-værdi 7,6, i 8 minutter. Yderligere behandling med en 1%'s osmiumtetraoxid-opløsning i destilleret vand i 20 minutter intensiverer farvningen. Snittene 25 skylles med vand, dehydreres i alkohol, klares i xylen og monteres på plader.

Pladerne undersøges hver især under en kodebeteg-nelse, og de kodede prøver kontrolleres af en uafhængig person. Typiske plader fotograferes ved anvendelse af dif-30 ferential-interferens-kontrastoptik (Zeiss-Momarski). Graden af antistoffarvning vurderes som 0 (ingen reaktivitet), + (få positive celler), ++ (mindst 1/3 af cellerne er positive) , +++ (de fleste celler er positive), og ++++ (næsten alle celler er stærkt positive). Da forskellen mellem 35 værdien + og værdien 0 er mindre klar end forskellen mellem ++ og +, blev det besluttet at regne en farvning vur- 24 DK 170619 B1 o deret som ++ eller kraftigere som "positiv". Både neoplas-tiske celler og stromaceller blev observeret i tumorprøver.

Den registrerede farvning refererer til tumorceliernes farvning, idet stromacellerne enten ikke blev farvet eller blev 5 farvet mere svagt end tumorcellerne.

i

Bestemmelse af antigenplacering

Den subcellulære placering af antigener bestemmes ved måling af antistofbinding til celler før eller efter 10 permeabilisering med ikke-ionisk detergent. Antistoffer, der bindes til celleoverfladen af intakte dyrkede celler, identificeres ved enten direkte bindingsbestemmelser med 125 I-mærket antistof (Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. (1981a) 78.:339“543) eller ved indirekte fluorescens 15 under anvendelse af en (FACS) II-cellesorterer. Antistoffer, der bindes til intracellulære steder, bestemmes ved . 125 direkte binding af I-mærket antistof til celler efter fiksering med paraformaldehyd og efterfølgende permeabilisering med det ikke-ioniske detergent NP-40.

20 25 30 35 25 DK 170619 B1 0

Bindingsbestemmelser a) Til bindingsbestemmelser gennemført ved anvendelse af radiomærkede antistoffer (Brown et al., se ovenfor), inkuberes dyrkede celler (10^) ved 4°C i 30 minutter med 6 X25 5 10 cpm I-mærket antistof i 100 μΐ varme-aktiveret (30 minutter ved 56°C) kalvefosterserum i kulturmedium. Efter tilsætning af 5 ml PBS fraskilles cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 250 g. Den ovenstående væske 125 frasuges, og bundfaldet tælles for I. Til måling af ikke-10 -specifik binding gennemføres der parallelle inkuberinger med 10 pg ikke-mærket antistof som kompetitor (Brown, et al., supra). I nogle tilfælde gennemføres der bindingsbestemmelser på analog måde på celle-monolag bundet til plast--dyrkningsplader.

15 b) Til bindingsbestemmelser gennemført på en FACS II-cel-lesorterer fjernes cellerne fra deres underlag ved anvendelse af PBS indeholdende 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre 5 (EDTA). Prøver indeholdende 1 x 10 celler inkuberes først med monoklonalt antistof ved en koncentration på 2 pg/ml 20 efterfulgt af fluorescein-konjugeret gede-anti-muse-anti-stof ved en fortynding på 1:200. Cellerne vaskes derefter og resuspenderes i kulturmedium. Umiddelbart før FACS--analyse tilsættes der propidium-iodid til en slutkoncen-tration på 1 pg/ml til farvning af ikke-levedygtige celler.

25 Ved FACS-analyse fjernes celler, der fluorescerer rødt, elektronisk, således at kun levedygtige celler undersøges.

Den gennemsnitlige intensitet af fluorescein-fluorescensen bestemmes derefter for hvert antistof. Negative kontroller består af prøver, hvori det monoklonale antistof er ude-30 ladt. Positive kontroller består af monoklonale antistoffer mod HLA type l-histokompatibilitets-antigener. Farvningen betragtes som positiv, hvis den gennemsnitlige opnåede fluorescens er mindst 3 gange baggrunden.

35 0 26 DK 170619 B1

Proteinantigen-bestemmelse

Til identificering af proteinantigener bliver lun- gecarcinomceller eller humane embryoniske lungeceller over- 35 flade-radioioderet eller mærket metabolisk med S-methio-5 nin. Antigener isoleres fra cellelysater ved inkubering med monoklonalt antistof, tilsætning af gede-anti-muse--IgG og adsorption til S. aureus. Immunopræcipitater vaskes og analyseres ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gel-elektrophorese (SDS-PAGE) (10-20% acrylamid) som be-10 skrevet af Brown et al. (se ovenfor).

35 .

S-Methioninmærknmq

Hybridomceller, der producerer et bestemt antistof, podes i mikrotiterhuller i methioninfrit Dulbecco's Mini- 15 mum Essential Medium (DMEM) indeholdende 25 mM Hepes-puf- fer, 4 mM L-glutamin, 4,5 g/liter glucose, 10 mM ikke- -essentielle aminosyrer, 100 enheder/ml penicillin, 100 pg/- ml streptomycin og 15% varmeinaktiveret serum fra nyfødte kalve (NCS). Cellerne kontakteres i 6 timer med 0,1 mCi 35 o 20 S-methionin ved 37 C, og den ovenstående væske fjernes og centrifugeres til fjernelse af celler.

Isotypebestemmelse a) Ouchterlony-immunodiffusion 25 En portion af ovenstående væske fra bestemte hy bridomceller placeres i midterhullet i en 2%'s agarplade. Monospecifikke kanin-anti-muse-Ig-isotype-antistoffer (Meloy) placeres i de ydre huller, og pladen inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur og natten over ved 4°C.

30 b) Fleksible 96 huls plader af polyvinylchlorid (Costar) overtrækkes med 0,1 mg/ml gede-anti-muse-Ig-anti-stoffer i 2 timer ved 37°C og modovertrækkes med en 3%'s BSA-opløsning i 2 timer ved 37°C. Hybridom-supernatanten inkuberes derefter ved 37°C i 2 timer. Efter vaskning med 35 PBS-kvægserumalbumin (BSA) inkuberes pladerne ved 37°C i 2 timer med monospecifikke kanin-anti-muse-Ig-isotype-anti- 0 27 DK 170619 B1 stoffer koblet til peroxidase (Zymed). Efter vaskning inkuberes pladerne med 1 mg/ml orthophenylendiamin og 0,03% hydrogenperoxid i 0,1 M citratpuffer med en pH-værdi på 4,5. Den optiske tæthed ved 630 nm bestemmes på en Dynatec-5 -ELISA-plade-læser.

Staphylokok-protein-A-bindingsbestemmelse

Mikrotiterhuller inkuberes med 5% NCS i PBS plus 0,02% natriumazid, og den ovenstående væske frasuges.

7 10 25 μΐ af en suspension af epidermale celler (2 x 10 cel ler /ml) sættes til hvert hul og inkuberes med 25 μΐ af et bestemt antistof i én time ved stuetemperatur. Pladerne centrifugeres ved 1200 o/m i 7 minutter, vaskes 2 gange 19 5 med 50% NCS/PBS/NaN^ og 25 μΐ I-staphylokok-protein 15 A (ca. 50.000 cpm/25 μΐ)tilsættes. Pladerne inkuberes i én time ved 25°C, vaskes to gange med 5% NCS/PBS/NaN^ og tørres. Bunden af hullerne skæres fra og tælles i en gammatæller.

Cellekultur 20 Calu-l-lungecarcinomceller fås fra American Type

Culture Collection. Cellerne holdes i monolagskultur i et vækstmedium (Dulbecco's modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 50 enheder penicillin pr. ml, 50 μg streptomycin pr. ml og 10 volumenprocent kalvefosterserum 25 (FCS)). Cellerne opsamles ved behandling med en opløsning af 0,05% trypsin og 0,02% EDTA og tælles med et hæmacyto-meter.

Indirekte immunofluorescens 30 Celler opsamles ved trypsinering og udplades ved en tæthed på 5-20 xlO pr. hul (6 mm i diameter) på "teflon"-overtrukne flerhulsplader (Meloy Labs). Cellerne holdes ved 37°C i ca. 18 timer før forsøgets begyndelse.

Mediet opsuges, og vedhæftende celler vaskes én gang med 35 phosphatpufret saltopløsning (PBS, 0,14M NaCl, 3 mM KCI,

8 mM Na2HP04,7H20, og 15 mM KH2P04) indeholdende 0,5 mM

0 28 DK 170619 B1

CaCl.2 og 0,5 mM MgC^· Cellerne fikseres derefter in situ ved tilsætning af 25 μΐ af en opløsning af paraformalde-hyd (0,5% i PBS) i 20-30 minutter ved 23°C. Hullerne vaskes, og de intracellulære antigener frilægges ved tilsæt-5 ning af PBS indeholdende 0,2 volumenprocent NP40 i 5 minutter ved 23°C. Overskydende aldehydgrupper blokeres derefter ved tilsætning af bindingspuffer (DMEM indeholdende 50 mM BES (N,N-bis-[2-hydroxyethyl]-2-aminoethansulfon-syre) med en pH-værdi på 6,8, 0,1% (vægt/volumen) BSA og 10 15% FCS) i mindst 15 minutter ved 23°C. Antistofferne for tyndes til en koncentration på 10 Mg/ml i bindingspuffer og anbringes i et totalt volumen på 20-25 μΐ pr. hul. Pladerne inkuberes ved 4°C i én time og vaskes med bindingspuffer. Et fluorescein-isothiocyanat-konjugeret (FITC) 15 sekundært antistof (gede-anti-muse-IgG og -IgM) tilsættes derefter i 1 time ved 4°C. Den anvendte fortynding af FITC-konjugat bestemmes eksperimentelt som den fortynding, der giver det optimale forhold mellem signal og baggrund. Efter denne inkubering vaskes pladerne med bindingspuffer 20 og vand og lufttørres. Et lille volumen af en anti-fade- -opløsning (Genetic Systems Corporation) og et dækglas tilføjes, og pladerne undersøges ved anvendelse af et Leitz Orthoplan fluorescensmikroskop. Pladerne undersøges under et 40 ganges olieimmersionsobjektiv og fotograferes med 25 Kodak Tri X Pan-film.

Metabolisk mærkning 35 A. S-Methionm

Cellerne opsamles ved trypsinering. Levedygtighe-30 den, bestemt ved trypanblåt-indeslutning, er sædvanligvis /Γ større end 95%. 4 x 10 celler opsamles ved centrifugering og suspenderes i et volumen på 1 ml vækstmedium, 35 minus aminosyren methionin. Der tilsættes S-methionon (800 Ci/mmol) til en slutkoncentration på 0,5 mCi/ml, og 35 cellerne inkuberes under rotation ved 37°C i 1-6 timer.

Mærkede celler opsamles derefter ved centrifugering og vas- 0 29 DK 170619 B1

kes før den videre manipulering. I nogle tilfælde fortyndes den radiomærkede cellesuspension 10 gange med vækstmedium indeholdende ikke-mærket methionin og 10% FCS, sættes til en 100 mm vævskulturskål og inkuberes ved 37°C i yderligere 5 18 timer. De vedhæftende celler vaskes derefter med PBS

før anvendelsen.

3 B. H-Glucosamm

En lignende mærkningsprocedure anvendes ved mærk- 3 10 nmg af celler med H-glucosamin. Interne glucosereserver fjernes først ved inkubering i glucosefrit vækstmedium indeholdende 10% dialyseret FCS i et tidsrum på 4-24 timer.

Kun cellepopulationer, der udviser en levedygtighed på o-ver 90% efter inkubering i glucosefrit medium, anvendes 15 til de efterfølgende forsøg. Cellerne opsamles som ovenfor beskrevet og resuspenderes i et volumen på 1 ml glucosefrit vækstmedium indeholdende 10% dialyseret FCS, 0,01 M HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre) med 3 en pH-værdi på 7,4 og 0,5 M Ci H-glucosamin (40 Ci/mmol).

20 Efter mærkning ved 37°C under rotation i et tidsrum på 3 timer opsamles cellerne ved centrifugering og vaskes med PBS.

Ioderinger 125 25 Proteinerne radiomærkes med I ved anvendelse af chloramin T-proceduren beskrevet af Greenwood et al., (1963) Biochem. J. _89_: 114-123. Proteinprøver på 50 Mg for- 125 tyndes til 0,5 ml i PBS indeholdende 1-2 m Ci I (bærerfrit) . 10 μΐ af en frisk fremstillet opløsning af 30 chloramin T (indeholdende 10 Mg) tilsættes, og omsætningen fortsættes i et tidsrum på 5 minutter ved 23°C. Reaktionen afsluttes ved tilsætning af opløsninger indeholdende 125 20 Mg Na2S2°5 °9 3 Mg Kl. Ikke-omsat I fjernes ved chromatografi på en søjle af "Sephadex G-10" ækvilibreret 35 med PBS indeholdende 1 mg/ml kvægserumalbumin. Den specifikke aktivitet af de mærkede monoklonale antistoffer, der

O

30 DK 170619 B1 9 anvendes ved denne undersøgelse, er ca. 3 x 10 cpm pr. nanomol. Prøver indeholdende L3-antigen afsaltes på en spindesøjle af "Sephadex G-10" før radiomærkningen.

5 Iimnunopræcipitationsanalyse 1. Fremstilling af ekstrakt

Metabolisk mærkede celler opsamles ved centrifugering og solubiliseres i RIPA-puffer indeholdende 0,15 M NaCl, 0,05 M Na2HPO^, 1% (vægt/volumen) natriumdeoxycho-10 lat, 1% (vægt/volumen) "Triton X-100" og 0,1% (vægt/volu-

C

men) SDS) ved et forhold på 2-4 x 10 celler pr. ml. Efter inkubering i 10 minutter ved 4°C klares blandingen ved centrifugering (147.000 g i 30 minutter, Ti 70.1-ro-tor). Den ovenstående væske fjernes, og inkorporeringen 15 af radioaktivitet bestemmes ved væskescintillationstælling.

2. Immunopræcipitation 7

Portioner af cellelysat indeholdende 1-2 x 10 3 5 125 6 cpm (syreudfældeligt) ’’s-methionin og I eller 4 x 10 3 20 cpm (syreudfældeligt) H-glucosamin inkuberes med 1 pg antistof i 0,5-1 time ved 4°C. Når det mærkede kulturmedium analyseres, anvendes der en portion, der svarer til den protentiske andel af den totale celleekstrakt, der analyseres. En opløsning indeholdende affinitetsrenset gede-25 -anti-muse-immunoglobulin (1-2 pg, fremstillet ved immunisering af en ged med muse-immunoglobulin) tilsættes, og inkuberingen ved 4°C fortsættes i yderligere 10-60 minutter. 50 μΐ af en 10%'s opløsning af formalinfikserede Staphylococcus aureus ("Pansorbin") tilsættes, og efter 30 5 minutters inkubering ved 4°C opsamles immunopræcipita- ter ved centrifugering (før anvendelsen vaskes "Pansorbin" én gang i en opløsning af 0,5 volumenprocent NP-40, én gang i en opløsning af 0,05 volumenprocent NP-40 og re-suspenderes i sidstnævnte puffer indeholdende 1 mg/ml 35 ovalbumin). Præcipitaterne vaskes 3-4 gange i TNEN-puffer (0,02 M tris-hydroxymethylaminomethan, pH-værdi 8,0, 0 31 DK 170619 B1 0,1 M NaCl, 0,01 M EDTA og 0,5% (vægt/volumen) NP-40) og opbevares nedfrosset til -20°C indtil anvendelsen.

Elektrophorese 5 1. SDS-Polyacrylamidgel-elektrophorese (SDS-PAGE) ' SDS-PAGE gennemføres ifølge Laemmli, se ovenfor.

Den opløsende gel (0,75 mm) der anvendes hyppigst, er 10-20%'s lineær acrylamidgradient, og stablingsgelen indeholder 5% acrylamid. Prøverne koges i prøvepuffer inde-10 holdende 5% 2-mercaptoethanol, og immunoabsorbensen fjernes ved centrifugering før elektrophorese. Molekylvægts- 14 standarderne er enten en C-methyleret proteinblanding (Amersham) eller forud farvede standarder (BRL). Molekylvægtene af de anvendte standardproteiner er myosin 15 (200.000), phosphorylase b (92.400), kvægserumalbumin (BSA) (69.000), ovalbumin (46.000), chymotrypsinogen (26.000), betalactoglobulin (18.400), lysozym (14.300) og cytochrom c (12.300). Efter elektrophorese tørres gelerne i vakuum, og positionerne af radiomærkede proteiner be-20 stemmes ved autoradiografi på Kodak røntgenfilm.

2. Todimensional isoelektrisk fokusering (IEF)/SDS-

PAGE

125

Immunopræcipitater indeholdende I-mærket L3-25 -antigen fremstilles som beskrevet og resuspenderes i 50 μΐ af en opløsning indeholdende 5 volumenprocent 2--mercaptoethanol og 1 volumenprocent NP-40. Prøverne opvarmes til 95°C i 5 minutter, og immunoabsorbensen fjernes ved centrifugering. Prøverne blandes med ampholiner 30 (pH-værdiområde 3,5-10, slutkoncentration 4%), og der til sættes fast urinstof indtil mætning. Den isoelektriske fokusering og SDS-PAGE gennemføres ved proceduren ifølge O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250:4007-4021. Standard--proteinmarkører (BioRad) anvendes til at overvåge sepa-35 rationen i IEF-dimensionen. Den resulterende pH-værdigra- dient bestemmes ved hjælp af en "tom" gel, der køres paral- 32 DK 170619 B1

O

lelt. Gelen opskæres i skiver på 0,5 cm, skiverne gennemvædes i 1 ml destilleret vand i én time, og pH-værdien af den resulterende opløsning bestemmes.

5 3. Paraqon-elektrophorese

Serumprotein-elektrophorese gennemføres under an- ' vendelse af forud dannede agarosegeler på et Paragon-appa-rat (Beckman) ifølge producentens anvisninger.

10 Immunoblotting

Proteiner, der skal analyseres, separeres ved enten SDS-PAGE eller Paragon. Prøver separeret ved SDS-PAGE overføres elektrophoretisk til nitrocellulose som beskrevet af Burnette (1981) Anal. Biochem. 112:195-203 ved 15 5 V/cm i et tidsrum på ca. 18 timer ved 4°C. Prøver sepa reret ved Paragon overføres til nitrocellulose ved at lægge elektrophorese-grammet over et ark af nitrocellulosepapir. Nitrocellulose hydreres i overføringspufferen ifølge Burnette, se ovenfor, uden SDS før anvendelsen. En sta-20 bel papirservietter med en tykkelse på ca. 2,5 cm anbringes over nitrocellulosen og holdes nede ved hjælp af en glasplade og en reagensflaske. Overføringen er fuldstændig i løbet af en periode på én time som vurderet ved farvning af gelen efter overføringen. Nitrocellulosepletterne 25 blokeres ved en 1-times inkubering i "Blotto", en mælkebaseret blanding (Johnson et al., Gene Anal. Technol.

(1984) JL: 3—8) (PBS indeholdende 1% (vægt/volumen) "Carnation" fedtfri tørmælk og 0,2 volumenprocent NP-40). L3--Antigenet påvises ved inkubering af pletterne med 30 1-4 x 10^ cpm/ml ^^^I-L3-antistof i "Blotto" i én time ved 23°C. Pletterne vaskes grundigt med "Blotto" og tørres før autoradiografisk eksponering.

1 25

Bindinq af I-L3-antistof 4 35 Calu-l-celler (4-10 x 10 ) udplades i cellekul turskåle med 48 huller 18 timer før forsøgets start. Cel- DK 170619 Bl 33 0 lerne vaskes med PBS og fikseres med en opløsning af 0,5% paraformaldehyd i PBS i et tidsrum på 20 minutter ved 23°C.

Monolagene vaskes med PBS og permeabiliseres ved behandling med PBS indeholdende 0,2% NP-40 i 5 minutter ved 23°C. For- 125 5 skellige koncentrationer af I-mærket antistof tilsættes til et slutvolumen på 0,1 ml i et tidsrum på 60 minutter ved 23°C. Monolagene vaskes derefter grundigt med bindingspuffer og solubiliseres ved tilsætning af 0,5 M natriumhydroxidopløsning. Den cellebundne radioaktivitet 10 bestemmes på en gammatæller. Der gennemføres dobbeltbestemmelser af prøverne. Dobbeltbestemmelserne varierer i almindelighed mindre end 20%. Til måling af ikke-specifik antistofbinding inkuberes identiske huller med et 50-100 ganges overskud af ikke-mærket L3-antistof, hvilket sædvan- 125 15 ligvis nedsætter bindingen af I-mærket antistof med mere end 90%. Når bindingsresultaterne analyseres ifølge

Scatchard (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. jy.:660-672, bestem-

8 —I

mes der en affinitetskonstant (K ) på ca. 1 x 10 M for 125 a I-L3-antistof. Bindingen af antistof nedsættes mere end 2o 10 gange, hvis cellemonolagene ikke behandles med NP-40 . . 125 før tilsætning af I-L3-antistof.

Kompetitiv bindingsbestemmelse L3-Antigenaktivitet måles ved bestemmelse af evnen . 125 25 af antigenet til at mhibere binding af I-mærket L3- -antistof til formalinfikserede monolag af Calu-l-celler.

125

Cellemonolagene fremstilles som ovenfor beskrevet. I- -L3-Antistof sættes til cellerne i en koncentration på 0,4 Mg/ml i nærværelse eller fraværelse af opløsninger in- 30 deholdende L3-antigenaktivitet. Slutbestemmelsesvolumenet 125 er 0,1 ml. Under disse betingelser er bindingen af I- -L3-antistof mere end 95% specifik, som vurderet ved evnen af ikke-mærket L3-antistof til at konkurrere om bindingen.

Forskellige fortyndinger af testopløsningerne tilsættes, 125 35 og bindingen af I-mærket antistof måles som ovenfor beskrevet. Typiske inhiberingskurver for forskellige stadier 0 34 DK 170619 B1 af rensning af L3-antigen fra kulturmedium og fra normalt humant serum er vist i fig. 1/ supplerende materiale. En enhed L3-antigenaktivitet defineres som den mængde, der er nødvendig for at bevirke en 50%'s inhibering af bindin-125 5 gen af I-L3-antistof tilsat i en mængde på 0,4 μg/ml.

Glycosidasebehandlinger . . 35 125

Immunopræcipitater af S-methionin- eller I- -mærket L3-antigen fremstilles som beskrevet. Den fraskil-10 te immunoabsorbens resuspenderes i et volumen på 25 μΐ nedbrydningspuffer, et volumen på 5 μΐ indeholdende 5 milli-enheder af det pågældende enzym tilsættes, og prøverne inkuberes ved 37°C i 18 timer. Koncentreret SDS-PAGE-prøve-puffer tilsættes, og prøverne underkastes elektrophorese.

15 Til neuraminidasebehandling indeholder nedbrydningspufferen 0,15 M NaCl, 0,05 M natriumacetat, pH-værdi 5,3, 0,1% (vægt/volumen) CaC^ og 0,1% (vægt/volumen) phenylmethyl-sulfonylfluorid. Til endoglycosidase H-behandling (Endo--H-behandling) indeholder nedbrydningspufferen 0,025 M 20 tris-HCl med en pH-værdi på 6,5, 0,2% (vægt/volumen) SDS og 0,1% (vægt/volumen) phenylmethylsulfonylfluorid.

Proteinbestemmelser

Proteinkoncentrationer bestemmes ved metoden i-25 følge Bradford (1976) Anal. Biochem. ^72.:248-254 under anvendelse af kvægserumalbumin som standard.

Fremstilling af L3-uSepharose"

Lyofiliseret CNBr-aktiveret "Sepharose 4B" re-30 konstitueres i 1 mM saltsyre ved 4°C i 30-60 minutter.

Harpiksen vaskes én gang i den samme opløsning, opsamles ved centrifugering, blandes med L3-antistof i en mængde på 3,5 mg/ml i en opløsning af 1 M natriumchlorid og 0,2 M natriumhydrogencarbonat med en pH-værdi på 8,3. Blandin-35 gen inkuberes ved 4°C under rotation i et tidsrum på 16 timer. Harpiksen opsamles ved centrifugering, og oversky- 0 35 DK 170619 B1 dende aktive grupper blokeres ved tilsætning af 1-4 voluminer af en opløsning af 0,25 M glycin med en pH-værdi på 8,3. Harpiksen opsamles derefter ved centrifugering og vaskes flere gange i PBS før anvendelsen. Koblingseffektivi-5 teten vurderes ved måling af absorptionen ved 280 nm af antistofopløsningen før og efter kobling og bestemmes til at være ca. 10 mg L3-antistof pr. ml pakket harpiks.

Gelfarvning 10 Efter SDS-PAGE bestemmes positionerne af protein båndene ved farvning med Coomassie blue eller på kommercielle sølvbaserede (BioRad) eller nikkelbaserede (Kodak) farvningssæt.

15 Aminoterminal sekvensbestemmelse ved Edman-nedbrydning L3-Antigen fra kulturmedium reduceres med dithio-threitol (20 mM) i et volumen på 0,1 ml af en opløsning indeholdende 0,1 M tris-HCl, pH-værdi 8,5, og 0,1% (vægt/-volumen) SDS i 2 timer ved 50°C. Antigenet bliver deref-20 ter S-carboxamidomethyleret ved behandling med iodacetamid (45 mM) i 30 minutter ved 20°C og underkastet præparativ SDS-PAGE på en 10%'s acrylamidgel (1,5 mm tyk). Efter elek-trophorese farves gelen med Coomassie Brilliant Blue (0,5 vægtprocent i 10% eddikesyre og 30% isopropanol), og 25 affarves i en opløsning af eddikesyre (5 volumenprocent) og methanol (17 volumenprocent). Det farvede L3-antigen-bånd udskæres med et barberblad og underkastes omgående elektroeluering og elektrodialyse med en ECU-040 Electro-elutor/Concentrator (C.B.S. Scientific Co., San Diego, 30 Ca). Serumafledt L3-antigen behandles på samme måde, bortset fra at prøven ikke carboxamidomethyleres. Det samlede udbytte ved proceduren er ca. 80%, baseret på en vurdering af mængden af protein ved analytisk SDS-PAGE med sølvfarvning. Der gennemføres en automatiseret Edman-nedbrydning 35 med ca. 100 pmol af S-carboxamidomethyleret konditioneret medium-afledt L3-antigen (baseret på udbyttet af identifi- 0 36 DK 170619 B1 ceret Met-6) og 38 pmol af serumafledt umodificeret L3--antigen (baseret på udbyttet af identificeret Val-1) i et gasfase-sekvensbestemmelsesapparat (Model 370Af Applied Biosystems, Inc. Foster City, Ca). Phenylthiohydrantoin-5 -aminosyrer analyseres ved reversfase-HPLC (detektions- enhed, 2 pmol) med en IBM Instruments' Cyano-søjle under ' anvendelse af en natriumacetatpuffer/tetrahydrofuran/ace-tonitrilgradient til eluering (Applied Biosystems, Protein Sequence Users Bulletin No. 2, 1984).

10 EKSEMPEL 1

Fremstilling af monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer fremstilles ved at immunisere 3 måneder gamle BALB/c-mus med humane væv fra en af fire 15 forskellige kilder: (1) pleural udtrædningsvæske fra patienter med metastatisk ikke-småcellet lungecarcinom, (2) dyrkede celler fra ikke-småcellet lungecarcinom, og (3) lungevæv fra 3-4 måneder gamle menneskefostre. Immuniseringerne gennemføres ved, at mus modtager intraperitoneale injek- 7 20 tioner 3-4 gange med ca. 10 celler. Tre dage efter den sidste immunisering fjernes miltene, suspenderes i kulturmedium og fusioneres med NSl-musemyelomceller (KShler og Milstein, se ovenfor). Blandingerne udpodes til dannelse af kulturer med lav tæthed, der stammer fra enkelte fusio-25 nerede celler (kloner). Metoderne anvendt til hybridiserin-gen er beskrevet af Yeh et al., Int. J. Cancer (1979) 29^:269-275.

De ovenstående væsker fra hybride celler screenes ved anvendelse af både en ELISA-bestemmelse og en auto- 125 30 radiografisk indirekte I-mærket protein A-bestemmelse (Brown et al., J. Ummunol. Meth. (1979) 3^:201-209) mod ekstrakter fra tumorerne anvendt til immunisering, der bl.a. indeholder cellemembraner. Disse ekstrakter fremstilles ved anvendelse af en modificeret procedure ifølge 35 Colcher et al., Cancer Res., (1981) 42^:1451-1459; Yeh et al., se ovenfor. Til dette formål vaskes vævene med 0 37 DK 170619 B1 PBS og suspenderes, hvilket for intakte tumorers vedkommende gøres ved at presse dem gennem en sigte af rustfrit stål. Herefter tilsættes der 1 mM natriumhydrogencarbonat indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (Calbiochem-5 -Behring Corp., San Diego, CA), og materialet homogeniseres derefter på is med 50 bevægelser af B-pistillen af en Dounce--homogenisator. Efter centrifugering i 15 minutter ved 27.000 g fjernes den ovenstående væske, og bundfaldet re-suspenderes i PBS, lydbehandles i ét minut og oplagres ved 10 -70°C.

Hybridomer, der producerer antistoffer, som bindes til cellemembranekstrakter, klones, formeres in vitro og afprøves yderligere for antistofspecificitet. Denne afprøvning gennemføres ved anvendelse af den ovenfor beskrev-15 ne immunohistologiske teknik, hvorved evnen af antistoffer til at binde til frosne snit af lungecarcinomer, andre tumorer og normalt humant væv afprøves. Hybridomer, der producerer antistof med tilsyneladende specificitet for human lungecancer, reklones, formeres og injiceres i pri-20 stan-forbehandlede 3 måneder gamle BALB/c-mus, hvor de vokser som ascites-tumorer.

Antistoffer, som udskilles i ascitesvæsken, renses på protein A-"Sepharose" (Ey et al., Immunochemistry (1978) 15:429) eller ved gelfiltrering i "Sephacryl S-300". De 25 rensede antistoffer anvendes til yderligere karakterise ring, som omfatter yderligere specificitetsprøver ved im-munohistologi, bindingsbestemmelser på intakte celler til bestemmelse af, hvilke antistoffer der bindes til celleoverfladen, og radioimmunopræcipitationsforsøg som ovenfor 30 beskrevet.

De monoklonale antistoffer L3 og L5 fremstilles ud fra de tilsvarende hybridomer som ovenfor beskrevet. Disse antistoffer udviser de egenskaber, som er anført o-venfor i den foreliggende beskrivelse.

35 Cellelinierne betegnet L3 og L5 er deponeret hos A.T.C.C. (American Type Culture Collection, 12301 0 38 DK 170619 B1

Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852) den 4. oktober 1984 og har modtaget deponeringsnumrene HB8626 og HB8627 Cellelinien L3 er deponeret igen den 25. oktober 1984.

5 EKSEMPEL 2 ,

Rensning af L3-antiqen fra serumfrit kulturmedium 1. Fremstilling af serumfrit konditioneret medium

Calu-l-celler dyrkes indtil sammenflydning i rul-2 10 leflasker (850 cm ) i nærværelse af vækstmedium. Monolagene vaskes 3 gange med 50 ml serumfrit vækstmedium, idet den anden vaskevæske efterlades på cellerne i 30 minutter ved 37°C. Cellerne inkuberes derefter i nærværelse af 150 ml serumfrit vækstmedium. Efter 3 dage opsamles mediet, 15 centrifugeres til fjernelse af flydende celler og opbevares i frosset tilstand ved -70°C indtil anvendelsen.

2. Fremstilling af koncentrat 790 ml Serumfrit medium koncentreres til et volu-20 men på 17 ml ved ultrafiltrering (Amicon, PMlO-membran). Koncentratet fjernes, og membranen vaskes én gang med 11 ml PBS. Vaskevæsken og koncentratet forenes, og blandingen centrifugeres ved 147.000 g i 30 minutter i en Ti70-ro-tor (Beckman). Den ovenstående væske viser sig at inde-25 holde det meste af L3-antigenaktiviteten og betegnes i det følgende koncentratet.

3. Immunoaffinitetschromatografi

Koncentratet ledes over en søjle (1,5 ml) af 30 "Sepharose C14B" til fjernelse af stoffer, der har affinitet til "Sepharose". Søjlen vaskes derefter med 3 ml PBS. Eluatet kombineres med vaskevæsken og sættes til et pakket volumen på 1 ml L3-antistof-konjugeret "Sepharose 4B" (10 mg L3/ml harpiks). Blandingen holdes ved 4°C 35 under rotation i en periode på 18 timer og hældes derefter på en søjle fremstillet ved hjælp af en injektions- 0 39 DK 170619 B1 sprøjte. Eluatet opsamles, og harpiksen vaskes med 10 ml PBS og opløsninger af 5 M natriumchlorid (5 ml) og 0,02 M ammoniumacetat (10 ml). L3-Antigenet elueres fra søjlen ved tilsætning af en frisk fremstillet opløsning af tri-5 ethylamin (75 mM). Da L3-antigenaktiviteten er labil ved forhøjet pH-værdi, indstilles pH-værdien af eluatet ved opsamling af fraktioner (0,5 ml) i rør indeholdende 0,1 ml 2 M ammoniumphosphat. Fraktioner indeholdende L3-aktivi-tet identificeres ved anvendelse af en kompetitiv bindings-10 bestemmelse, pooles og opbevares i frosset tilstand ved -20°C. Resultaterne er sammenfattet i tabel I.

EKSEMPEL 3

Rensning af L3-antiqen fra serum 15 1. Opsamling af serum

Der tages blodprøver fra tumorpatienter eller normale personer, og disse får lov at koagulere i 10-90 minutter ved stuetemperatur. Prøverne opbevares derefter ved 4-6°C i 30 minutter til 5 timer før centrifugering i 10 20 minutter ved 1600 o/m i en klinisk Sorvall-centrifuge. Serumet skilles fra koagulatet, deles i portioner og opbevares i frosset tilstand ved -70°C indtil anvendelsen. Niveauerne af L3-antigenaktivitet er ikke væsentligt forskellige i serum eller plasma fra den samme person. Optøede 25 portioner bliver i almindelighed ikke frosset igen, da den antigene aktivitet viser sig at være følsom for gentagen frysning-optøning. Til rensning af L3-antigenaktiviteten optøs en portion på 10 ml frisk frosset serum og klares før anvendelsen ved centrifugering ved 147.000 g i 60 minutter 30 (Ti 70.1-rotor).

2. llDEAE-Sephacel"-chromatograf i

En 10 ml's søjle af "DEAE-Sephacel" dannes og æk-vilibreres med PE-puffer (0,02 M natriumphosphat, pH-vær-35 di 7,12, og 0,005 M EDTA). Klaret serum fortyndes til et volumen på 130 ml med PE-puffer før anbringelsen på ion-

O

40 DK 170619 B1 byttersøj len. Der opretholdes en strømningshastighed på 0,5 ml/minut under påføringen og elueringen af prøven. Elu-atet indeholder 54% af proteinet i serumet til at begynde med (som vurderet ved absorptionen ved 280 nm) og ingen 5 påviselig L3-antigenaktivitet. Søjlen vaskes derefter med 10 søjlevoluminer PE-puffer. L3-Antigenaktiviteten elueres f med en 50 ml's gradient af 0 til 0,5 M natriumchlorid i PE-puffer. Fraktioner på 1 ml opsamles ved elueringen. Efter anvendelse af gradienten vaskes søjlen med 0,5 M na-10 triumchlorid i PE og til slut med 1,5 M natriumchlorid i den samme puffer. Fraktionerne indeholdende L3-antigenak-tivitet identificeres ved anvendelse af en kompetitiv in-hiberingsbestemmelse og pooles. L3-antigenaktiviteten elueres lidt senere end hovedmassen af de eluerede serumpro-15 teiner.

Ved nogle forsøg renses L3-antigenaktiviteten delvis før radiomærkning og immunopræcipitationsanalyse ved en procedure, der er lidt anderledes. Serumproteiner udfældes først med 30%’s ammoniumsulfat. Præcipitatet opløses 20 i vand og afsaltes (på "Sephadex G-25") før påføring på en søjle af "DEAE-Sephacel". Der opnås eluering af L3-aktivi-tet ved trinvis tilsætning af opløsninger af natriumchlorid. En fraktion, der elueres mellem 0,25 og 0,5 M natriumchlorid, er beriget med L3-antigenaktivitet og anvendes 25 til efterfølgende radiomærkning af L3. Antigenet fremstillet på denne måde kan ved protease-fingeraftryksbestemmelse ikke skelnes fra radiomærket antigen udfældet fra præparater, der er renset mere end 3.000 gange.

30 3. Immunoaffinitetschromatografi

Poolede fraktioner fra en "DEAE-Sephacel"-søjle (14 ml) anbringes på en 8,4 ml's søjle af "Sephacel Cl 4B", og søjlen vaskes med 17 ml PBS. Vaskevæsken forenes derefter med eluatet, og blandingen ækvilibreres i 18 timer 35 med 1,5 ml pakket volumen af antistof L3-konjugeret "Sepharose" (10 mg L3/ml harpiks) ved rotation ved 4°C.

0 41 DK 170619 B1

Blandingen anbringes på en søjle, og harpiksen vaskes successivt med PBS (42 ml), PBS indeholdende 0,2 volumenprocent NP-40 (28 ml), PBS (14 ml), 0,02 M ammoniumacetat (28 ml), 5 M natriumchlorid (28 ml) og til slut 0,02 M 5 ammoniumacetat (5 ml). L3-Antigenet elueres ved tilsætning af 8,4 ml 0,075 M triethylamin som beskrevet ovenfor. Resultaterne er sammenfattet i tabel II og III.

EKSEMPEL 4

10 Kompetitiv binding af L3-antistof og antistof 465.12S

Ikke-mærket antistof 465.12S eller ikke-mærket 125 L3-antistof blandes med I-L3-antistof (slutkoncentra-tion 0,35 Mg/ml) og sættes til formalinfikserede Hl25-lun-gecarcinomceller (50.000 pr. hul). Ikke-mærkede antistof-15 fer anvendes som hypridom-supernatanter. De fortyndes hver især til det halve af det oprindelige volumen ved den sluttelige bestemmelse. Den anvendte opløsning af antistof 465.12S indeholder tilstrækkeligt med antistof til at ud-35 fælde, fra S-methionm mærkede celleekstrakter, en 2o mængde antigen, der svarer til den, der udfældes af 1

Mg renset L3-antistof. Resultaterne anført i tabel IV vi- . 125 ser, at 465.12S ikke konkurrerer om binding med I-L3--antistof. De to antistoffer genkender således forskellige epitoper og er derfor forskellige antistoffer og ikke funk-25 tionelle ækvivalenter.

EKSEMPEL 5

Spaltningsfragmenter af L5-antiqen

Calu-1 humane lungecarcinomceller overflademærkes 30 ved anvendelse af lactoperoxidasekatalyseret iodering som be skrevet af Brown et al., J. Immunol. 127:539-546, 1981. L5-Antigenet, (som er antigenet defineret af antistof L5) udfældes fra celleekstrakter og analyseres ved SDS-PAGE under reducerende betingelser. Ved analyse på denne måde vandrer L5-35 -antigen som en enkelt polypeptidkæde med en Mr på 135.000. Området af gelen indeholdende L5-antigenet udskæres, be- 42 DK 170619 B1 0 handles med den angivne mængde Staphylococcus aureus-v8--protease og analyseres igen ved SDS-PAGE som beskrevet af Cleveland et al., se ovenfor. De resulterende "fingeraftryk" af celleoverflade-ioderede v8-spaltningsfragmenter 5 er diagnostiske for L5-antigenet, dvs. fragmenter med en

Mr på 24.000 og 16.000 er karakteristiske for L5-antigenet og adskiller L5-antigenet fra andre antigener med lignende molekylvægt.

10 15 20 25 30

C

35 DK 170619 B1 43 S-4 (1)

rH

i—! Φ ϋ 71 ε

d d I

Ml 5-4 Φ ro cn Φ tn u tn 03 c c 00 -Η P 03 <4-4 -H 54 O H -P d 0 <0 · (ti d o * cicn+JMtncM Φ 03 -p H CM 03 (ti d Ai ^ .F* & C M CO g Φ (ti ΓΟ · <4-4 54 § φφ d * O φ

•H ffj 4-4 Λ in -P . M

£ CM 03 a φ -P I -H £ 1 tJ H tn CO -P 0) p g (ti £ co ^ C 03 tj 4J\ £ 4-><ί - CM (TJ ^ +3 Φ 54 CM O O 54 0) 4 CO ® ° ” I Φ

r-4 ·γ4 -P Φ CM 03 o o -Η -P Φ M r- O CM CO

d 4-4 -μ Ό in o m β 4-4 -Η Ό m r-i-i-r-i 44 -Η > φ >—I lo *H > Φ · ,, ,.

u-r4Æ (ti o -h ,d m · -d -d (ti Φ -P d 54 Φ -P d Μ<£φφ 54 CuM Φ d CU^ Φ V ^ >

^ W .ρω,*~ OKU

4J φ O £ A! Φ Φ -P Φ Tj i w 4J 4J -Η -P m Η Φ 1-1 -p^OO IT) > 4-> —· O 03 03 m ,0

> >-, c*P O Γ" CO ·Η >ic#P O t'' CO *CM

-H 43 H -t-3 -Q — —4 r-jp-ΙΦ jj ηο M 13 (ti 03

X O (ti D d 4-1 M

7a H c < (ti Φ

H C CM ΗφΓΜ S

qj 4-> -—. tn-P.— —1 o1 E

φ p O O O r-4 ·Η φ p O O O VOCCU

M.r4 +j φ o o r- φ -P -P Φ o m cq+j ·ηΌ «σι 43 d -ηΌοοο ld 03 <ο o! rijc >φ .· · (ti(0 >φ ·· · <-< c φ

Enrti ·Ηί CO cm 40 EhI -Η ,β Η Οι "=* — -ΗΛ I -P d Η H co-ppr-l Λ03 3 s® J % -Η ξ

M ^ IH O (ti -H

IH (ti 4-4 T3 (C Η Η Ή ? 5

C 03 tn C d d -H

Cn -η co C -Η β ·Η Λ β 0)^ Kl Cl Η -Η Φ ^ Ή W |4 -η +) tu >· - »- d 4-)tnooo - Φ Φ d 0 £ m H o 03 OScorH o Φ -Q >

03 p CO r-4 d p —' 00 r-4 tn -H -H

d pu φ (¾ ^ £ -p

φ (¾ ·©. β -P

« 4-1 -Η -P

^ -Η Φ d 00 CM d „ ’“j B· φ._φ^ β·Η£

£ I—I ΟΓ··* "<J* £ H O ^ O

d £ i—l CM d £ M r-4 r-4 dJ Ai cn Η ’ ’ o »4 n 0 4-3 ·Ρ β <> > Φ Ό Φ ^ ε d ό Φ I I Tti > Ό cn 03 φ Ό Φ +3 -P > Ό· > φ φ d

4J ψ) 4-3 -P <3P

nj -r-4 r-4 -H £ Φ O

p β Od Φ Ό m -P -H O ·γ4 -p tn £ β 4-4 Ε Οι Ί4 03 β Ό φ d φ 4-1 φ Φ d I 4-4 φ 0) « Φ > -HOitiH > -Η M (ti M CO 2 £ •Q. Ό β I το © Ό <1 I ‘ro p ΦΟοο^ U ΦΜοοΌ — ^

PM f1· 20(-^03 r-4 CM

44 DK 170619 B1 0

TABEL III

Karakteristika af L3-antigen i normalt humant serum

Koncentration: 5,8 + 2,6 pg/ml^

5 Molekylvægt: 94.000 form I

76.000 form II r

26.000 form III

Mobilitet: alfa-2 pi: 4,2-5,0 (form I og II) 10 N-terminal aminosyre: Val (form I) 1) Bestemt som middelværdien (+ standardafvigelsen) hos syv normale sunde personer. Serumprøverne undersøges ved en slutkoncentration på 5,7 volumenprocent ved den 15 kompetitive bindingsbestemmelse under anvendelse af immunoaffinitetsrenset L3-antigen fra kulturmedium som standard. Værdierne er korrigeret for renheden af standardpræparatet, der vurderes til 66% (ved densitometrisk scanning af en sølvfarvet SDS-PAGE-gel).

20

TABEL IV

125

Ikke-mærket antistof I-L3-antistof-bundet (cpm) 25 Intet 9524 (100) 465.12S 10028 (105) L3 1194 ( 12) 30 Λ 35

Claims (8)

1. Monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende sted bindes til en epitop af et L3-antigen, hvilket antigen omfatter: 5 a) et proteinantigen, som har en molekylvægt på ca. 76.000, og som er en celleoverfladedeterminant af humant ikke-småcellet lungecarcinoma, og b) proteinantigener med en molekylvægt på henholdsvis 94.000, 76.000 og 26.000 (form-I-, form-II-, form-III-anti-10 gen), og som udskilles af humant ikke-småcellet lungecarcinoma, hvor det monoklonale antistof produceres af et hybridom med identifikationskarakteristikaene af A.T.C.C. HB8626.

2. Monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende sted bindes til et protein, der har en molekylvægt på ca. 140.000, og som er en celleoverfladedeterminant af humant ikke-småcellet lungecarcinoma, hvor det monoklonale antistof produceres af et hydridom med identifikationskarakteristi- 20 kaene af A.T.C.C. HB8627.

3. Monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende sted kompetitivt inhiberer den immunospecifikke binding af et monoklonalt antistof produceret af hybridomet A.T.C.C. HB8626.

4. Monoklonalt antistof, hvis antigenkombinerende sted kompetitivt inhiberer immunospecifik binding af et monoklonalt antistof produceret af hybridomet A.T.C.C. HB8627.

5. Monoklonalt antistof ifølge krav 1-4, konjugeret 30 til et mærkestof, der er i stand til at give et påviseligt signal.

6. Monoklonalt antistof ifølge krav 5, hvor mærkestoffet omfatter et fluorescerende stof.

7. Monoklonalt antistof ifølge krav 1-4, som omfatter 35 en IgG-isotype. DK 170619 B1

8. Fab-, (F(ab')2“· eller Fv-fragment af et monoklonalt antistof ifølge krav 1-7 med samme bindingsegenskaber som det monoklonale antistof. »