JPH06296497A - ヒト非小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体 - Google Patents

ヒト非小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体

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JPH06296497A JP6001441A JP144194A JPH06296497A JP H06296497 A JPH06296497 A JP H06296497A JP 6001441 A JP6001441 A JP 6001441A JP 144194 A JP144194 A JP 144194A JP H06296497 A JPH06296497 A JP H06296497A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 モノクローナル抗体の抗原結合部位が、ヒト
非- 小細胞肺癌の細胞表面決定基である約135,000 ダル
トンの分子量を有するタンパク質抗原に結合することを
特徴とするモノクローナル抗体。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体は、乳癌および
陰門の表皮細胞癌のような癌に対して向けられた診断的
あるいは治療的製品における使用を見い出し得るもので
ある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト非小細胞肺癌(NSC
LC）の抗原における決定基部位を限定するモノクローナ
ル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景 １．発明の分野 ヒト肺癌は男性における癌腫による多くの死亡の原因と
なるものであり、また女性における癌腫死亡の最も頻繁
な原因としての乳癌の侵襲の過程である（キャンサー
ファクツ アンド フィガーズ，1983年〔Cancer Facts
and Figures,1983〕) 。この疾患は、４つの主な組
織学的タイプ、すなわち類表皮腫（エピデルモイド)(30
%)、腺癌(35%）、未分化大細胞(15%）および小細胞(20
%）に分けることができる。肺癌の多くの症例は、化学
療法および照射療法によって治癒不可能である。小細胞
肺癌は、大きさにおける低減によって化学療法および照
射療法に応答するが、全体的な治癒ではない。腫瘍の完
全な外科手術的除去が唯一有効な療法であると見なされ
ている。しかしながら、予期せぬことには、肺癌患者の
３０％未満が、診断で完全に切除され得る腫瘍を有して
おり、また肺癌患者の１／３未満が、外科手術的完全除
去の後５年間生存している。それゆえ、肺癌のより早期
の診断、癌延展の程度のより良好な限定、およびより効
果的な療法を可能とする方法に対する大きな必要性が存
在する。
【０００３】モノクローナル抗体は、これらのすべての
目的のために用いられ得るものである。しかしながら、
必須条件は、正常成人組織においてよりもより肺癌にお
いて強く発現される抗原に対する抗体を見出すことであ
る。腫瘍細胞集団の公知の不均質性、同じ抗原における
いくつかの決定基の存在、治療学的標的と比較した場合
における診断マーカーとしてのこれらの好適性に関する
抗体間の予期された違い、および同じ抗原に対する異な
る抗体の異なる生物学的特性の見地において、いくつか
の異なる抗体が必要とされる。 ２．先行技術の記載 肺癌抗原に対するモノクローナル抗体は、シコラら[Sik
ora et al.](ブリテッシュ ジャーナル オブ キャン
サー（1981年)[Br.J.Cancer(1981)]第43巻第 696〜 700
頁）や、カッチタら[Cuttitta et al.](プロセス オブ
ナショナルアカデミー サイエンス アメリカ合衆国
（1981年)[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1981)]第78巻第
4591〜4595頁）や、バーキら[Varki et al.]（キャン
サーリサーチ（1984年)[Cancer Research (1984)］第44
巻第 3681〜 687頁）や、ティー．ダブリュー．マンデ
ィーら[Mondy,T.W. et al.](サイエンス（1981年)[Scie
nce(1981）］第 214巻第1246〜1248頁）や、ジェー．デ
ィー．ミナら[Minna,J.D. et al.](イン ビトロ[In Vi
tro]第17(12)第1058〜1070頁(12-1981年))や、エイ．ジ
ェー．ケンネルら[Kennel,A.J.et al.](キャンサー リ
サーチ[Cancer Research］第41(9,PT1）第3465〜3470
頁、ケミカル アブストラクト[Chem.Abst.]第95(15)第
1308502)や、エイ．ビー．バイリンら[Baylin,A.B.et a
l.](プロセスオブナショナル アカデミー サイエンス
アメリカ合衆国[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A]第79巻第
4650〜4654頁（8-1982年))や、ディー．エヌ．カーネイ
ら[Carney,D.N.et al.](パソバイオロジー アニュアル
[Pathobiology Annual］1982年第12第 115〜 136頁（19
82年))や、エイ．エフ．ガズダーら[Gazdar,A.F.et a
l.](セミナーズ イン オンコロジ―[Seminars in Onc
ology]第10巻第 3〜19頁（3-1983年))や、エイ．シー．
ホリンスヘッドら[Hollinshead,A.C．et al.](キャンサ
ー ディテクター プレベント[Cancer Detec.Preven
t.］第 6巻第 185〜191頁（1983年))や、ジェイ．ティ
ー．マルシャインら[Mulshine,J.T.et al.](ジェイ イ
ムノール[J.Immunol.]第131(1)第 497〜 502頁（1983
年))や、エル．シー．ヒュアングら[Huang,L.C.et al.]
（アーキテクチャ オブ バイオケミストリー アンド
バイオフィジィックス[Arch.Bioch.Biophys.］第220
(1) 第 318〜 320頁（1983年))や、エス．サージら[Saj
i,S.et al.](ハイブリドーマ第3(2)第 119〜 130頁（19
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リング インストミット[Behring Inst.Mitt.]第74巻第
27〜34頁（1984年）、ケミストリー アブストラクト[C
hem.Abst.]CA101(9)第706686）や、エイ．ティー．ロー
ゼンら[Rosen,A.T.et al.]（キャンサー リサーチ[Can
cer Research］第44(5）第2052〜2061頁（1984年）、バ
イオ アブストラクト[Bio．Abst.]第79014658）や、ジ
ー．エヌ．ピー．バン ムイ ジェンら[Van Muijen,G.
N.P.et al.](アマー ジェイ パトール[Amer J.Patho
l.]第 116(3）第 363〜 369頁（1984年）、バイオ ア
ブストラクト[Bio Abst.］第79023605）や、ジー．ジェ
イ．プリンクラーら[Princler,G.J.et al.］（キャンサ
ー リサーチ[Cancer Research］第42巻第 843〜 848頁
（3-1982年))や、ティー．マザーリックら[Mazauric,T.
et al.](キャンサー リサーチ[Cancer Research］第42
巻第 150〜 154頁(1-1982 年))や、ジェイ．エイ．ブラ
ーツら[Braatz,J.A.et al.］（キャンサー リサーチ
[Cancer Research］第42巻第 849〜 855頁（3-1982年))
や、アール．イー．ソボルら[Sobol,R.E.etal.]（フェ
ド プロク[Fed.Proc.］第 41(3)第 409、アブストラク
ト[Abst.］第816(4-1982))によって述べられている。
【０００４】あらかじめ定められた特異性の抗体を分泌
する融合細胞の連続培養が、コーラーら[Kohler et a
l.](ネイチャー（1975年） 265:495〜497[Nature(1975)
265:495-497])によって述べられている。腫瘍抗体の生
産手段は、米国特許第 4,172,124号に述べられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト非小細
胞肺癌(NSCLC）の抗原における決定基部位を限定するモ
ノクローナル抗体に関する。“NSCLC 細胞”なる用語
は、類表皮腫癌細胞、腺癌細胞および未分化大細胞癌細
胞を含むものである。決定基部位はまた、例えば、乳房
のいくつかの癌などのいくつかの他の癌の抗原において
見い出されることができ、そして、これゆえ本発明の抗
体は、これらの他の癌細胞に対しても結合する。これら
のモノクローナル抗体は、腫瘍細胞に対するよりも低い
度合で正常成人細胞に結合する。“より低い度合での結
合”なる用語は、結合が免疫組織学的技術によって検知
することが不可能であろうこと、若しくは、結合が、免
疫組織学的技術によって決定されるようにNSCLC細胞に
対して結合するよりも約４から５倍程小さいであろうこ
とを意味する。このモノクローナル抗体は、マウスハイ
ブリドーマによって分泌される。
【０００６】本発明はまた、本発明に係るモノクローナ
ル抗体を用いるいくつかの診断方法にも関係している。
このような方法のひとつは、NSCLC 細胞の存在の、この
ような細胞を含んでいるであろうと疑われる検体におけ
る、測定を包含するものである。この検体は、モノクロ
ーナル抗体と接触させられ、そしてこのことは、この検
体において存在し得る他の細胞タイプから、このような
細胞を識別できるものである。接触は、抗体のこのよう
な細胞への結合のための条件下で行なわれる。接触の
後、検体における抗体のこのような細胞への結合の存在
あるいは不在が測定される。この結合は、検体における
NSCLC 細胞の存在あるいは不在に関連するものである。
一般に、検体は、モノクローナル抗体に関する標識され
た特異的結合パートナーと接触させられる。この標識
は、検知可能な信号を発し得るものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトNSCLC 細
胞上の抗原に特異的な抗体ならびにこのような抗体の機
能的等価体、結合フラグメントおよび免疫複合体、さら
にこのような抗体を用いるある診断方法に関するもので
ある。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、ケーラ
ーとミルスタイン（上記）の標準的技術によって製造さ
れ得る。例えば、複数の滲出液からのヒト肺癌細胞ある
いはヒト非小細胞肺癌からの培養細胞、または正常胎児
肺からの細胞が免疫原として用いられる。これらの細胞
はマウス中へ注入され、十分な時間の後、マウスは屠殺
されそして脾細胞が得られる。所望される免疫グロブリ
ンに関しコード化する脾細胞染色体は、該脾細胞を、骨
髄腫細胞とあるいはリンパ腫細胞と、通常ポリエチレン
グリコールの存在下において、融合することによって不
滅化される。融合されたハイブリドーマを含む得られた
細胞は、ＨＡＴ培地などのごとき選択培地において増殖
させられ、そして生存細胞がこのような培地において限
界希釈条件を用いて増殖される。細胞は、例えばマイク
ロタイターウェルなどのような適当な容器中にて増殖さ
れ、そして上澄み液が所望の特異性を有するモノクロー
ナル抗体に関してスクリーニングされた。
【０００８】モノクローナル抗体の収率を高めるために
種々の技術が存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け
入れる哺乳動物宿主の腹腔内へハイブリドーマ細胞を注
入し、そして腹水を収穫するといったようなことがあ
る。腹水中に十分な量のモノクローナル抗体が集められ
ない場合、該抗体は宿主の血液から収穫される。種々の
周知の方法が、モノクローナル抗体を他のタンパク質あ
るいは他の不純物から遊離するための、モノクローナル
抗体の単離および精製に関して存在する（ケーラーとミ
ルスタイン、前掲、を参照のこと）。
【０００９】本発明のこのようなモノクローナル抗体の
１つは、Ｌ３と呼ばれる新規なモノクローナル抗体で例
示される。このモノクローナル抗体は、ヒトNSCLC 細
胞、すなわち悪性細胞のドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による分子量が
76,000の特性を有する細胞関連抗原における決定基部
位、およびNSCLC 細胞により培養培地中へ分泌されたタ
ンパク質抗原（形態Ｉ，IIおよびIII抗原）における決
定基部位を限定する。この抗体はＩg Ｇ1 イソタイプで
ある。このＬ３抗体は、Ｌ３マウスハイブリドーマによ
って産生される。
【００１０】形態ＩのＬ３抗原は、ドデシル硫酸ナトリ
ウム- ポリアクリルアミド一次元ゲル電気泳動(SDS-PAG
E)において、94,000の分子量を有するものである。形態
IIのＬ３の抗原はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて76,000の分
子量を有し、また形態IIIのＬ３抗原はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにおいて26,000の分子量を有する。形態ＩのＬ３抗原
は、培養培地からアフィニティークロマトグラフィーに
よって９倍に精製され得（第１表）、そしてアフィニテ
ィークロマトグラフィーは、糖タンパク質の１つである
形態ＩのＬ３抗原をそれぞれ７０％および９０％より以
上含む組成物を与えるためのアクリルアミドゲル技術に
続かれる。アフィニティークロマトグラフィー精製から
得られた組成物は、培養培地についての 522単位／mgに
対して46,500単位／mgの比活性を有している。この比活
性は、Ｃalu −１細胞のホルマリン固定化単層を用いる
競合的結合検定において、125I標識されたＬ３抗体の結
合を５０％まで阻止するのに必要とされる抗原の量とし
て定義される。アフィニティークロマトグラフィーによ
り培養培地から得られた組成物は、形態Ｉの抗原を７０
％以上含み、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで約50,000〜 20
0,000の間の分子量の非特異的タンパク質物質である３
０％未満の多くの部分は、より少ない量である約１０〜
２０％の形態IIの抗原を含むものである。組成物中に
は、微量の形態IIIの抗原がまた存在する。
【００１１】Ｌ３抗原の細胞および細胞外形態の間の関
係を決定するために、細胞は35Ｓメチオニンで放射性標
識され、そしてパルス追跡実験が行なわれた。細胞は１
時間の間35Ｓメチオニンでパルス標識され、標識されて
いないメチオニンを含む培地中へ種々の時間置かれ、そ
して免疫沈降分析がなされた。最初に、すべての特異的
免疫沈降可能細胞結合放射能が分子量76,000タンパク質
において見出された。
【００１２】観察された他の標識されたタンパク質はま
た、抗体が除かれたサンプルにおいても見出された。追
跡期間の間、分子量76,000の形態における放射能は、減
少し、一方、培地中へ放出された形態(MW94,000)におい
て見出された放射能は増加した。細胞結合形態における
放射能は、放出された形態において表われた放射能と同
様の動力学を有して消失し；双方のプロセスに関するｔ
1/2 が、濃度定量的分析によって約 1.5時間であると測
定された。これらの結果は、抗原の細胞結合した分子量
76,000形態が、分子量94,000の形態の先駆体（形態Ｉの
Ｌ３抗原）であることを示唆するものである。
【００１３】このＬ３抗原が糖タンパク質であるゆえ
に、炭水化物修飾は、細胞からの放出の間の観察された
Ｌ３抗原のサイズにおける明白な増加についての想像さ
れる説明となるであろう。この可能性は、該分子の細胞
形態および放出された形態を含む免疫沈降物を公知の特
異性のグリコシダーゼで処理することにより調べられ
た。細胞結合Ｌ３抗原のサイズは、分子量59,000に、エ
ンドグリコシダーゼＨ(Endo H)での処理によって低減さ
れたが、ノイラミニダーゼによっては影響されず、この
ことは、それがN-架橋高マンノースオリゴ糖を含んでい
ることを示すものであった（タレンチノら，1974年 ジ
ェイ．バイオル．ケム．， 249:811〜 817[Tarentino,1
974,J.Biol.Chem. 249:811-817］を参照のこと）。この
結果は、成熟が、N-架橋グリコシル化の公知の阻止剤で
ある、ツニカマイシンに感応性である発見と一致する
（レホルら，1976年 エフイービーエス レターズ，7
1:167〜170[Lehle,et al.,1976,FEBS Letters，71:167-
170])。これに対して、放出された抗原は、Ｅndo Ｈ耐
性であるが、ノイラミニダーゼ処理によって分子量80,0
00にサイズにおいて低減され、このことは形態ＩのＬ３
抗原における末端シアル酸残基の存在を示すものであ
る。これゆえ、細胞結合形態から放出形態へのＬ３抗原
の転化はN-架橋炭水化物側鎖の成熟によって達成され
る。
【００１４】形態ＩのＬ３抗原のアミノ酸末端配列は、
アフィニティークロマトグラフィーおよびアクリルアミ
ドゲル分離技術の組合せにより精製された組成物におい
て、周知の技術を用いて決定された。この配列（α）
は、以下の通りであった。 そしてさらに以下のように定義された。
【００１５】 アミノ酸に関する上記１文字記号は、V=バリン、N=アス
パラギン、D=アスパラギン酸、G=グリシン、M=メチオニ
ン、R=アルギニン、L=ロイシン、A=アラニン、T=トレオ
ニン、Q=グルタミン、E=グルタミン酸、I=イソロイシ
ン、F=フェニルアラニン、Y=チロシンおよびW=トリプト
ファンであるこれらの周知の意味を有する。上記は、形
態IIのＬ３抗原が存在しようがしまいが、形態ＩのＬ３
抗原を含有する組成物に関する単一配列として得られ
る。
【００１６】Ｌ３抗原の上記の３０のN-末端アミノ酸配
列の、ザ ナショナル バイオケミカル リサーチ フ
ァウンデーション プロテイン バンク[the National
Biochemical Research Foundation protein bank](1985
年 3月出版）において存在するタンパク質配列との比較
は、顕著な相同を何ら表わさなかった。形態ＩのＬ３抗
原の配列はまた、ヒトC1- エステラーゼインヒビターお
よびヒトα-2- チオールプロテイナーゼインヒビターを
含む、現在このデータベースに列挙されていない、いく
つかの血清タンパク質のものと比較された。これらの配
列のいずれも形態ＩのＬ３抗原のN-末端配列と何ら顕著
な相同を表わすものではなかった。
【００１７】我々は、形態ＩのＬ３抗原が正常ヒト血清
中に存在し、そして血清から形態ＩのＬ３抗原が精製さ
れることを確定した。血清からの該Ｌ３抗原の特性が第
３表に概要される。形態ＩのＬ３抗原は、３９％の収率
を有して正常ヒト血清から3000倍容以上で精製され得る
（第２表）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製物質の分析
は、主要成分が、培養培地から精製された形態Ｉおよび
形態II成分（いずれの形態も最初の血清サンプルの主要
成分ではない）と共泳動したタンパク質であることを明
らかにした。血清からの形態Ｉおよび形態IIのＬ３抗原
の双方が、もとのゲルにおいて２つの別個な成分に分割
されることは、注目すべきことであり、このことはおそ
らくグリコシル化相違に帰因するミクロ異質性を示す。
双方の形態とも、イムノブロッティング分析に続いて、
また放射性ヨウ素化および免疫沈降の後に反応的であ
る。培養培地から精製された抗原での場合、免疫沈降の
後に、さらに別の形態である分子量26,000（形態IIIのL
3抗原）が検知される。イムノアフィニティークロマト
グラフィーによって得られた組成物は、形態ＩのＬ３抗
原を５０重量％より多く含み、残部物質は、形態IIIの
Ｌ３抗原、トランスフェリンおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで
約50,000〜 200,000の分子量の非特異的タンパク質から
なる。この組成物は、正常ヒト血清についての13.3単位
／mgに対して45,500単位／mgの比活性を有する。
【００１８】これらの結果は、Ｌ３抗原活性が、培養培
地および血清の双方において見出された２つの成分（形
態Ｉおよび形態II）において発現されることを示してい
る。適当なＳＤＳ−ＰＡＧＥによる血清からの形態Ｉの
Ｌ３抗原の更なる精製は、９０重量％より多いレベルで
形態ＩのＬ３抗原を卓越して含有し、不定微量の形態II
抗原と、トランスフェリンおよび約50,000〜 200,000の
分子量の非特異的タンパク質である残余物質を含むもの
である。
【００１９】二次元等電点電気泳動−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により血清および培養培地の双方から精製される、 125
Ｉ標識され免疫沈降された抗原が比較された。双方の抗
原の二次元移動度はきわめて類似しており、 4.2〜 5.0
の pＨ範囲で異質種として泳動する形態Ｉおよび形態II
成分を有していた。双方の源からの形態ＩのＬ３抗原は
また、 5.8および 6.2の概算 pＨ値で泳動する２つのよ
り小さい成分を示す。双方の抗原の炭水化物組成は、ま
たグリコシダーゼ感応性に関して試験することによって
調べられた。双方の源からの形態Ｉおよび形態IIのＬ３
抗原は、ＥndoＨ耐性であり、一方双方のノイラミニダ
ーゼ処理は、代射的標識された抗原の処理に続き見られ
る特徴的な分子量80,000のフラグメントの出現をもたら
すものであることが見出された。形態II抗原のノイラミ
ニダーゼ感受性は、これがＬ３抗原の分子量76,000の細
胞結合形態とは異なるものであることを示すものであ
る。
【００２０】双方の分子が構造的に同様であることを確
認するために、我々は、双方の形態からの形態Ｉ分子を
クレベランドら，（1977年）ジェイ．バイオル．ケ
ム．,252：1102〜1106[Cleveland et al.,(1977),J.Bio
l.Chem．252:1102-1106 ］によって述べられるような一
連の部分プロテアーゼ開裂反応にかけた。培養培地およ
び血清の双方から精製された、放射標識化形態Ｉ抗原
が、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り取られ、そし
てＶ８プロテアーゼでフィンガープリントされた。双方
の分子は同一の部分開裂パターンを生じ、少なくとも５
つの制限的部分開裂生成物が、双方の場合において観察
される（分子量＝76,000，49,000，31,000，20,000およ
び14,300）。これらの結果は、培養培地およびヒト血清
から精製されたＬ３抗原がかなり関連あるものであるこ
とを示すものである。
【００２１】我々は次に、血清からのＬ３抗原の３つの
形態の間の関係を研究した。形態Ｉおよび形態IIに関す
るすべてのフィンガープリントは、形態II分子が形態Ｉ
分子から誘導される分子量31,000および分子量14,300の
フラグメントを生じないものであるが、極めて類似して
いるものである。このパターンは形態Ｉおよび形態IIの
分子が極めて関連のあるものであることを暗示するもの
である。形態III抗原は、血清中に見られるより大きな
抗原性形態と分子量14,300の部分開裂生成物を共有し、
このことは、形態III抗原も、形態Ｉ抗原に構造的に関
連することを示すものである。種々の形態の間の構造に
おいて極めて類似することは、形態IIおよびIII分子が
形態Ｉから誘導されることを暗示するものである。
【００２２】Ｌ３抗原が、肺癌以外の腫瘍タイプの抗原
性成分として過去に述べられたかどうかを決めるため
に、放出あるいは分泌された腫瘍関連抗原に関するコン
ピュータに援助された文献サーチが行なわれた。我々
は、Ｌ３抗原と同様のサイズでかつ炭水化物組成であ
る、黒色腫分泌タンパク質抗原のいくつかの報告（ナタ
リら（1982年），キャンサー レス．42:583〜589;ブモ
ールら，（1982年）ハイブリドーマ 1:283〜292;および
ウィルソンら，（1981年），イント．ジェイ．キャンサ
ー 28:293〜300[Natali et al.(1982)Cancer Res.42
:583-589;Bumol et al.,(1982)Hybridoma 1:283-29
2;and Wilson et al.,(1981)Int.J.Cancer 28:293-30
0])を発見した。
【００２３】少量の以前に記載されたモノクローナル抗
体の１つ[465.12S；前記ナタリら(Natali et al.)]は、
黒色腫関連抗原に関する第１回国際会議(First Interna
tional Workshop on Melanoma Associated Antigens)の
出席者を通じて入手できた。本発明者らは、この抗体を
遂次免疫沈降実験に使用してＬ３抗原と抗体465.12Sに
より認識された抗原との同一性について試験を行なっ
た。両抗体は、35Ｓ−メチオニンで代謝的に標識された
細胞の培養培地からＭr 94,000タンパク質を特異的に沈
降させる。免疫沈降法によるＬ３または 465.12S抗原の
いずれかについての培養培地の枯渇は、他方の抗原の抗
原活性の随伴枯渇を生起する。これは、両抗体により認
識される抗原決定基が同一分子上で運搬されることを示
す（第３表）。しかしながら、この二つの抗体により認
識されたエピトープは、 125Ｉ−Ｌ３抗体の結合に関す
る抗体 465.12Sの競合を検出できなかったので、明らか
に異なる。
【００２４】Ｌ５と命名されている本発明の他の抗体
は、ヒトNSCLC 細胞に特有な細胞表面タンパク質抗原上
の決定基部位を決定する。上記方法および 125Ｉ標識法
により決定されたように、該タンパク質の分子量は、約
135,000ダルトンである。この抗体はＩg Ｍクラスのも
のである。該Ｌ５抗体は、主要器官の線維芽細胞類、内
皮細胞類および上皮細胞類のような正常な細胞とは検出
可能に結合しない。該Ｌ５抗体は、Ｌ５ネズミハイブリ
ドーマから産生される。Ｌ５抗原は、クリーブランドら
がジャーナル，オブ，バイオロジカル，ケミストリー第
225号第1102〜1106号[Cleveland et al.(1977)J.Biol.
Chem.252:1102-1106］に記載している方法に示されてい
るように、Ｍr 24,000および16,000の二つの特徴的なＶ
８プロテアーゼフラグメントを有している。したがっ
て、Ｌ５抗原は、同様な分子量の他の抗原からは区別さ
れる。
【００２５】本発明の他のモノクローナル抗体は、Ｌ１
８と命名され、かつヒトNSCLC 細胞に特有な他の細胞表
面タンパク質抗原上の決定基部位を決定する。このタン
パク質の分子量は、前記両方法とで決定して約72,000ダ
ルトンである。該抗体は、Ｉg Ｇ1 アイソタイプのもの
である。このＬ１８抗体は、若干の正常細胞、特に脾臓
の細胞に弱い程度に結合する。また、本発明の範囲内に
は、Ｆab、Ｆ(ab')2、Ｆv フラグメント等の前記モノク
ローナル抗体の有用な結合フラグメントも含まれる。こ
の抗体フラグメントは、常法により得られる。例えば、
有用な結合フラグメントは、パパインまたはペプシンを
用いる抗体のペプチダーゼ分解により産生される。有用
な結合フラグメントという用語は、該フラグメントがそ
の同一起源抗原上の結合部位について抗体と競合するこ
とを意味する。
【００２６】本発明の新規な抗体の上記の特定の例は、
それぞれの抗原上の特異的決定基部位に結合しかつマウ
ス源からの特異なクラスおよびイソタイプのものである
抗体を目的とするものであるが、これは何ら限定を意味
するものではない。上記抗体類、ならびにマウス源、ヒ
トを含むその他の哺乳動物源もしくは他の源またはこれ
らの組合せのいずれかからの上記抗体類と機能的等価性
を有する抗体類が、本発明において、このようなクラス
内のイソタイプを含めてＩg Ｍ、Ｉg Ａ、ＩgＥ等のご
とき他のクラスのものも同様に用いられ得る。“機能的
等価性”なる用語は、抗体が上記に述べた決定基部位に
結合することができ、そしてこのような部位に関して本
発明の特定の抗体と競合し得ることを意味する。すなわ
ち、このような抗体は、このような決定基部位を有する
細胞もしくは細胞フラグメントまたは分泌された抗原を
含有する検体と組合せられた場合に、このような決定基
部位に結合し、そしてこのような部位への結合から本発
明の抗体を阻害するものであろう。 本発明の一方法
は、肺組織において悪性状態の存在を測定することを含
むものである。「悪性状態」なる用語は、がん（腫）(c
arcinoma）を同時に含む形成異常(dysplasti）の、新生
物形成(neoplastic)の悪性のまたは腫瘍性の細胞等の存
在を表わす。この検体は、本発明のモノクローナル抗体
と接触されるかあるいは組み合わされる。接触は抗体の
悪性細胞への結合のための条件下で行なわれる。接触の
後、検体における悪性細胞への抗体の結合の存在が観察
される。すなわち、検体は、抗体と抗原部位との免疫複
合体に関して調べられる。この免疫複合体形成は、検体
における悪性細胞の存在に関するものである。
【００２７】本発明による方法の特定の例（説明のため
に挙げられるもので本発明を限定するものではない）
は、切除組織における腫瘍細胞の検知方法である。上記
方法は、腫瘍の除去の後に得られた腫瘍の一切片である
検体に対して適用される。切除された腫瘍は、切片を得
るために処理され、この処理は、最初に、腫瘍もしくは
組織を冷凍すること、通常は切除直後の冷凍を含むもの
である。組織の冷凍層は、次に、例えば低温槽を用い
て、切片へと切断される。
【００２８】上記のようにして得られた腫瘍の切片は、
本発明のモノクローナル抗体と接触させられ、そして次
に検知可能な標識で標識された、上記モノクローナル抗
体に対して向けられた第２の抗体と接触させられる。切
除された検体、例えば腫瘍の切片は、第１のモノクロー
ナル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条件下
で接触させられる。インキュベーションは、例えばガラ
ス製ペトリ皿のような適当な容器において、約２０〜３
０℃の温度で約１５〜３０分間の間、例えば少量のアジ
化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような
水性媒体中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、
通常検知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の
決定基ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能
な数を提供するのに十分なものである。
【００２９】インキュベーションに続き、切片は、非特
異的に結合した抗体を低減ないし消去するために洗浄さ
れ、そして次に、抗原部位を保持する検体の細胞へのモ
ノクローナル抗体の結合によるものである上記の複合体
を観察するために調べられる。結合は、切片における悪
性細胞の存在と関係している。従って、結合は、例え
ば、検体を該モノクローナル抗体に関する標識された特
異的結合パートナーと接触させることによって測定され
る。標識は検知可能な信号を発し得るものであり、放射
性標識、例えば蛍光体などのような発色団、酵素などで
あり得る。
【００３０】上記のアプローチを用いる技術の一例は、
免疫蛍光染色法である。この技術において、腫瘍の冷凍
切片は、アセトンを用いてガラス製スライド上に固定さ
れ、そして例えばペトリ皿にて、モノクローナル抗体と
インキュベートされる。例えばリン酸緩衝食塩水などの
ような適当な緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿
上に移され、そして例えば、用いられたモノクローナル
抗体に関して特異的な標識化抗体であり得る、モノクロ
ーナル抗体に関する標識された特異的結合パートナーと
接触させられる。ほとんどの場合において、モノクロー
ナル抗体はマウス源由来のものであるので、モノクロー
ナル抗体に関し特異的な標識された抗マウス免疫グロブ
リンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適
当な宿主をマウス抗体で注射し、十分な時間をおき、そ
して注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリン
を収獲することによる標準的技術により産生され得る。
【００３１】該スライドの、例えば水性緩衝液を用いて
の二度目の洗浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およ
びカバーグラスで覆われ、そして次に該切片に対するモ
ノクローナル抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で
調べられた。結合の測定はまた、検体中でこのような結
合の位置の識別をも含むものである。検体へのモノクロ
ーナル抗体の結合はまた、放射性物質、染料および蛍光
体を含む発色団、あるいは酵素などのような検知可能な
信号を発し得る標識に共有結合されたモノクローナル抗
体を用いることによって測定され得る。抗体当りの用い
られた標識の数は、標識された抗体が用いられる診断方
法の必要条件および抗体へ標識を結合するための部位の
有効性によって通常決定される。
【００３２】抗体および抗体フラグメントへ標識を結合
させるための方法は当分野において周知のものである。
このような方法は、米国特許第 4,220,450号、第 4,23
5,869号、第3,935,074 号および第 3,996,345号中に見
い出される。本発明のモノクローナル抗体が用いられる
技術のさらに別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識化
（ガリギュースら，インターナショナル ジャーナル
オブキャンサー（1982年）29:511〜 515により変更され
たようなステロンベーガー，イムノサイトケミストリ
ー，ジョン ウィリー アンド サンズ，ニューヨー
ク，1979年，第 104〜109 頁[Sternberger,Immunocytoc
hemistry,John Wiley &Sons,New York,1979,pp104-169
as modified by Garrigues et al.,Int.J.Cancer(198
2）29:511-515])である。試験されるべき組織は、ガラ
ス製スライドなどのような支持体上にアセトンなどのよ
うな適当な溶媒を用いて固定される。次に、組織は、モ
ノクローナル抗体とインキュベートされ、そして洗浄さ
れて結合していない抗体が除かれる。次に組織はウサギ
抗マウスＩg Ｇとインキュベートされ、結合していない
抗体を除去するために洗浄され、マウスペルオキシダー
ゼ- 抗ペルオキシダーゼ複合体と組み合わされ、結合し
ていない結合体を除去するために洗浄し、そして次に酵
素に関する基質で処理された。この処理に続き、該スラ
イドは、検知可能な信号に関して調べられた。
【００３３】本発明の抗体は、痰のような肺からの剥脱
性細胞検体における悪性状態の存在を測定する方法に用
いられ得る。“剥脱性”なる用語は、検体が、組織の表
面をこするあるいは洗浄することによって得られた単離
細胞あるいは細胞の凝集物（それらの細胞は個々に、あ
るいは鱗屑ないしは板状において除去される）からなる
ものであることを意味するものである。剥脱性細胞検体
は、生検によって得られたもののような、切除された組
織と区別されるべきである。検体と抗体との間の接触
は、抗原部位への抗体の結合のための条件下で行なわれ
る。接触の後、抗原部位への抗体の結合の存在あるいは
不在が測定され、そしてこれは肺における悪性状態の存
在に関するものである。
【００３４】肺における悪性の存在を測定するために、
痰試料は、この方法において使用される剥脱性細胞検体
を与える。この方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口
を含む胃腸路などからの剥脱性細胞検体における悪性状
態の検知において利用性を見出すものである。剥脱性細
胞検体は次に、抗原- 抗体複合体を形成するために、検
体の特異的抗原部位への抗体の結合のための条件下で前
述の抗体と接触させられた。この抗原部位は、検体にお
ける細胞あるいは細胞フラグメント上に存在され得る。
一般に、検体は例えば通常ガラスあるいはその他の適当
な材料からなるスライドのような適当な支持体上へ載置
される。剥脱性細胞検体は、通常、スライドの表面上に
検体の薄層を与えるようにスライド上に塗抹される。抗
体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝化媒体中にて
行なわれる。用いられる緩衝液は、リン酸塩、トリス、
重炭酸塩などを含む。 pＨは、検体および抗体の性質に
関係し、通常５〜８の範囲内にある。水性媒体は、約０
〜４０％の量の有機極性溶媒をさらに含んでいてもよ
い。有機極性溶媒は水溶性であり、通常約１〜１０個の
炭素原子と約１〜４個の酸素原子を有している。抗体
は、水性媒体中に約１〜 100μg ／ml、好ましくは約１
０〜２０μg ／mlの濃度で存在する。検体と抗体との接
触の間の温度は、約４〜４０℃、好ましくは１０〜３０
℃である。接触の期間は、通常約１５〜 120分、好まし
くは約３０〜６０分間である。
【００３５】検体と抗体との間の接触の後、支持体は通
常未反応抗体を除去するために処理される。通常、これ
は支持体を水性の、通常緩衝化された、媒体で洗浄する
ことによりなされる。次に、検体における抗原部位へ結
合した抗体（ここでこの結合は、該位置での悪性状態の
存在に関係する）の存在が観察される。すなわち、検体
は、形成された抗原- 抗体（免疫）複合体の数を測定す
るために調べられる。いくつかの例においては、問題の
抗原部位の極めて少ない数が、剥脱性細胞検体において
見い出され得ることに注意すべきである。しかしなが
ら、悪性状態においては、多数の抗原部位が存在し、こ
の後者の状態は、多数の抗原- 抗体複合体が、悪性状態
が存在している場合には計測可能であるゆえに、この方
法により、非悪性状態から容易に識別できる。結合の存
在の測定を行なうために、検知可能な信号を発する手段
が、検定系に組み入れられる。例えば、検定において用
いられた抗体を検知可能な信号を発し得る標識へ結合さ
せることができる。標識は、放射性物質、染料および蛍
光体を含む発色団、酵素あるいは同様のものであり得
る。抗体に対して用いられる標識の数は、方法の必要条
件および抗体へ標識を結合させるための部位の有効性に
よって通常決定される。
【００３６】あるいはまた、洗浄されたスライドを、例
えば用いられた抗体に対して特異的な標識された抗体で
あり得る、抗体に対する標識された特異的結合パートナ
ーと接触させることも可能である。モノクローナル抗体
がマウス源由来のものである場合には、該方法において
用いられた抗体に対して特異性の標識された抗マウス免
疫グロブリンが用いられ得る。このような免疫グロブリ
ンは、適当な宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当
な時間をおき、そして注射された宿主の血液から抗マウ
ス免疫グロブリンを収穫することによる標準的技術によ
って産生され得る。抗体に対する標識された特異的結合
パートナーが用いられる場合、スライドは、該スライド
を蛍光に関して調べる前に再度、水性媒体で洗浄されな
ければならない。
【００３７】蛍光体標識が用いられる場合において抗体
と細胞検体との間の結合の存在を測定するために、スラ
イドは、通常は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べ
られる。蛍光体以外の標識が用いられる場合には、スラ
イドないし検体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べ
られる。上記の説明は、免疫蛍光検査技術における本発
明の抗体使用に主として注がれたものである。しかしな
がら本発明の抗体は、抗原−抗体反応を含むほとんどの
検定法において用いられることができるものである。該
検定法群は、均質性[homogeneous］でも不均質性[heter
ogeneous］でもよい。均質性検定方法においては、検体
は、血清、尿および同様なもののごとき生物学的流体で
あり得、または、検体は溶解されそして屑を除去するた
めに清澄化され得る。例えば、抗体Ｌ３が、がん患者か
らの血清中の同起源抗原(cognate antigen）、すなわち
Ｉ型、II型またはIII型のＬ３抗原の濃度を測定するた
めに本発明者らにより用いられ、あるがん患者は、通常
の対照と比較してこの抗原をより高いレベルで持つこと
が見い出された。免疫学的反応は、通常特異的抗体、標
識された被分析物および関心の試料を含むものである。
標識から生じる信号が、抗体の標識された被分析物への
結合において直接的にあるいは間接的に変化される。免
疫学的反応およびその程度の検知の双方が、均質溶液に
おいて行なわれる。用いられ得る免疫化学標識は、フリ
ーラジカル類、蛍光染料類、酵素類、バクテリオファー
ジ類、補酵素類などが含まれる。
【００３８】不均質性検定方法においては、試薬は、通
常、検体、特異性抗体、および検知可能な信号を発する
ための手段である。検体はプレートあるいはスライドな
どのような支持体上に通常載置され、そして液相中で抗
体と接触させられる。支持体は次に液相から分離され、
支持体相あるいは液相のいずれかが、検知可能な信号に
関して、このような信号を発する手段を用いて調べられ
る。この信号は、検体における被分析物の存在に関する
ものである。検知可能な信号を発する手段は、放射性標
識類、蛍光体類、酵素類などの使用を含むものである。
不均質性免疫検定法の例としては、放射性標識免疫検定
法（ラジオイムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素
結合免疫学的検定法などが含まれる。
【００３９】上記の免疫学的検定技術の詳細な論議に関
しては、エドワードティー マギオ[Edward T.Maggio]
(シーアール シー プレス インコーポレーテッド，
ボカラトン，フロリダ，1980年[CRC Press Inc.,Boca R
aton,Florida，1980])による“エンザイム−イムノアッ
セイ[Enzyme-Immunoassay]”を参照のこと。例えば、米
国特許第3,690,834 号、第 3,791,932号、第 3,817,837
号、第 3,850,578号、第 3,853,987号、第 3,867,517
号、第 3,901,654号、第 3,935,074号、第 3,984,533
号、第 3,996,345号および第 4,098,876号（この列挙
は、余す所なく掲げることを意図するものではない）も
また参照のこと。
【００４０】本発明の抗体はまた、ジェイ．ナクル．メ
ド．（1983年）24:123〜129[J.Nucl.Med.(1983) 24:123
-129］中におよびジャーナルオブ クリニカル インベ
スティゲーション（1983年）72：2101〜2114[J.Clin.In
vest.(1983) 72:2101-2114］中に悪性骨髄腫に関して述
べられたものと同様な方法において、NSCLC を保持する
ヒト患者での転移性沈積物を画像とするために用いられ
得る。抗体またはそのフラグメントは、放射性標識さ
れ、そして患者へ静脈内投与され、その後該患者は例え
ばガンマ線カメラなどを用いて画像とされる。
【００４１】本発明はまた、上記に述べた方法を実施す
るための診断キットを含むものである。１つの実施態様
においては、診断キットは、パッケージされた組合せで
(a)上記により詳細に定義されたモノクローナル抗体お
よび(b) 上記モノクローナル抗体に対する特異的結合パ
ートナーと検知可能な信号を発し得る標識との結合体か
らなる。この試薬はまた、このような方法を行なうのに
必要なように緩衝剤、および例えば、ポリサッカライド
類のようなタンパク質安定化剤などのごとき補助的作用
物質をも含み得る。この診断キットはさらにまた、必要
に応じて、該標識が一構成成分である信号発生系の他の
構成成分、試験におけるバックグラウンド干渉を低減す
るための作用物質、対照試薬、試験を行なうための装置
などを含み得るものである。他の実施態様においては、
診断キットは、本発明のモノクローナル抗体と検知可能
な信号を発し得る標識との結合体からなるものである。
上記したような補助的作用物質はまた存在し得る。
【００４２】本発明の抗体は、治療学的に用いられ得
る。固有の生物学的特性を有する抗体は、直接治療剤と
して有用である。また、抗体は、免疫毒素を形成するた
めに毒素へ、また放射線製薬的または製薬的に形成する
ために放射性物質または薬剤へ結合され得る。抗体の免
疫毒素あるいは放射線製薬品を製造する方法は、周知で
ある（例えばキャンサー トリートメント レポーツ
（1984年）68:317〜328[CancerTreatment Reports(198
4) 68:317-328］を参照のこと）。
【００４３】本発明のモノクローナル抗体の他の治療的
用途は、免疫源として本発明のモノクローナル抗体の１
つを使用することにより産生される抗イディオタイプ抗
体での患者免疫処置である。このような免疫処置は、能
動的抗腫瘍活性をもたらし得る（例えば、ネポムら，プ
ロシーディング オブザ ナショナル アカデミーオド
サイエンシズ オブザ ユナイテッド ステート オ
ブ アメリカ（1984年）81：2864〜2867[Nepom et al.,
Proc.Natl.Sci.U.S.A.(1984)81:2864-2867］を参照のこ
と）。同様のアプローチにおいて、患者は、精製形態の
抗原、該抗原のペプチドフラグメント、あるいは該抗原
の修飾形態で免疫化され得る。
【００４４】特に、本発明の興味ある観点は、本発明の
Ｌ３抗体は、他の抗体と組み合わせて使用され得る。こ
の組合せは、少なくとも、前記肺癌のタイプ、特に未分
化細胞肺癌を検出することにおいて有効である。例え
ば、（1984年11月 2日に出願された米国特許出願番号 6
67,521に開示されている）モノクローナル抗体Ｌ３およ
びＬ１８は、有効量、すなわち前記肺癌の全てを検出し
得る組合せを与える量で組み合わされる。
【００４５】本発明のモノクローナル抗体のいくつかは
また、乳癌および陰門の表皮細胞癌のようなその他の癌
に関連する抗原における決定基部位を限定する。従っ
て、本発明の抗体は、このような癌に対して向けられた
診断的あるいは治療的製品における使用を見い出し得る
ものである。
【００４６】
【実施例】本発明は以下に例示される実施例によってさ
らに説明される。使用される多数の方法がまず最初に述
べられる。材料 培養培地はジブコ[Gibco］のものを使用した。ウシ胎児
の血清はジブコまたはハイクロン[Hyclone］のものを使
用した。テフロンで被覆された多数のウェルの顕微鏡用
のスライド（12ウェル）はメロイ[Meloy］のものを使用
した。プラスチック製の培養皿はコーニング[Corning］
またはコスター[Costar]のものを使用した。Ｖ８プロテ
アーゼおよびウシ血清アルブミンはシグマ[Sigma］のも
のを使用した。ノイラミニダーゼおよびパンソルビン[P
ansorbin](フォルマリン固定したスタフィロコッカス・
アウレウス(S.aureus)）はカルバイオケム[Calbiochem]
のものを使用した。エンドグリコシダーゼＨはマイルズ
[Miles］のものを使用した。ニトロセルロース(BA85,0.
45μ）はシュライヒャー [Schleicher]およびシュウェ
ル[Schuell］のものを使用した。プロテインＡ−セファ
ロース[Sepharose］、ＣＮＢr 活性化されたセファロー
ス４Ｂ、セファデックス[Sephadex]Ｇ−１０、ＤＥＡＥ
セファセル[Sephacel]およびプロテインＡ結合したセフ
ァロースＣＬ４Ｂはファーマシア[Pharmacia］のものを
使用した。ＮＰ−４０はパーティクルデータ リミテッ
ド[Particle Data Ltd.]のものを使用した。ポリエチレ
ングリコール、Ｘ線フィルムおよびコダブー[Kodavue]-
染色キットはコダック[Kodak］のものを使用した。アク
リルアミドおよび銀染色キットはバイオ ラッド[BioRa
d]のものを使用した。予め染色された分子量マーカーは
ベセスダ リサーチラボラトリーズ，ベセスダ，メリー
ランド州(BRL)[Bethesda Research Laboratories,Bethe
sda,Maryland(BRL)]のものを使用した。14Ｃ−メチル化
分子量マーカー、 3Ｈ−グルコサミン、35Ｓ−メチオニ
ンおよび 125Ｉはアマーシャム[Amersham]のものを使用
した。ＦＩＴＣ接合されたヒツジ抗マウスイムノグロブ
リンはタゴ[Tago]のものを使用した。パラゴン[Parago
n］血清タンパク質の電気泳動装置はベックマン[Beckma
n］のものを使用した。アンフォリンはエルケイビー[LK
B］のものを使用した。免疫組織学的技法 凍結した切片に関する免疫組織学的研究としては、イム
ノケミストリー，ジョン ウィリーとサンズ，ニューヨ
ーク州，1979年，104-169 頁(Immunochemistry,John Wi
ley & Sons,New York,1979.pp104-169）、ガリギュース
ら(Garrigues et al.)による修正としてイント．ジェ
イ．キャンサー（1982年）29:511-515頁［Int.J.Cancer
(1982)29:511-515］が用いられた。これらの試験につい
ての標的組織は、外科術的に得られ、液体窒素の中であ
らかじめ冷やされたイソペンタンに４時間入れて凍結さ
れた。組織はその後、使用されるまで液体窒素の中また
は−７０℃で保存された。ウサギ抗マウスＩg Ｇ［スタ
ーンバ―ガー−メイヤー イムノケミカルズ，インコー
ポレーテッド．，ジャレッツヴィレ，メリーランド州(S
ternberger-Meyer Immunochemicals,Inc.,Jarettsvill
e,MD)] は５０分の１の希釈で用いられた。マウスペル
オキシダーゼ- 抗ペルオキシダーゼ複合体[PAP，スター
ンバーガー−メイヤー イムノケミカルズ，インコーポ
レーテッド(PAP.Sternberger-Meyer Immunochemicals,I
nc)]は、特別に精製されたＰＡＰを２mg／ml含有してお
り、８０分の１の希釈で用いられた。凍結された切片は
調製され、乾燥されアセトンで処理されそして乾燥され
た［ガリギュースら，1982年(Garrigues et al,198
2)］。組織学的評価のために用いられる切片はヘマトキ
シリンで染色された。非特異的なバックグラウンドを減
少させるために、切片は５分の１に希釈された正常ヒト
血清であらかじめインキュベートされた［ガリギュース
ら，1982年(Garrigues et al.,1982)]。マウス抗体、ヒ
ツジ抗マウスＩg ＧそしてマウスＰＡＰは１０％正常ヒ
ト血清および３％ウサギ血清の溶液で希釈された。
【００４７】染色方法は、特異的または対照抗体で連続
している切片を 2.5時間処理し、５０分の１で希釈され
たウサギ抗マウスＩg Ｇと３０分間インキュベートし、
さらに８０分の１に希釈されたマウスＰＡＰ複合体に３
０分間さらすことによるものであった。抗体を用いたそ
れぞれの処理の後、スライドはリン酸緩衝溶液(PBS）で
２度洗浄された。免疫組織化学的反応は、新鮮に調製さ
れた0.05％ 3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロ
ライド［シグマ，セントルイス, ミズーリー州(Siguma,
St.Louis,MO)］および0.01％過酸化水素で0.05Ｍトリス
緩衝液においてpＨ 7.6で８分間進められた。さらに蒸
留水中で１％ＯsＯ4 溶液への２０分間の暴露は染色を
強めた。
【００４８】スライドはそれぞれコード付けされ、そし
てコード付けされたサンプルは独立した研究所によって
チェックされた。典型的なスライドは差次干渉対比光学
器［ツァイス- モナルスキ(Zeiss-Monarski)］を使用し
て撮影された。抗体の染色の程度は０（反応なし）、＋
（ほとんどの細胞が陽性ではない）、＋＋（少なくとも
細胞の３分の１が陽性）、＋＋＋（ほとんどの細胞が陽
性）、＋＋＋＋（ほとんど全部の細胞が強い陽性を示
す）というように評価された。＋と０の染色の差は＋＋
と＋の染色の差ほど明確に区別されないので、染色の階
級においては＋＋、またはそれ以上を「陽性」として数
えることにした。腫瘍細胞および支質細胞は腫瘍サンプ
ルにおいて観察された；支質細胞は全く染色されないか
または腫瘍細胞よりもさらに弱く染色されるので染色は
腫瘍細胞に関するものが記録された。抗原位置の決定 抗原の細胞下局在は、非イオン性界面活性剤での透過化
の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測する
ことによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面へ
結合する抗体は、 125Ｉ標識された抗体を用いての直接
結合検定法（ブラウンら，プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ
ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（1981
年）78:539〜543[Brown et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.(1981)78:539-543])によってあるいは、(FACS)細胞
識別器を用いる間接蛍光によって同定された。細胞内位
置に結合する抗体は、 125Ｉ標識された抗体を細胞に直
接結合させ、続いて、パラホルムアルデヒドで固定化
し、さらに続いて非イオン性界面活性剤ＮＰ−４０で透
過化することによって測定された。結合検定法 a)放射性標識された抗体を用いることによって行なわれ
る結合検定法（ブラウンら，上記）のために、培養細胞
（106 ）は、培養培地中で熱活性化（56℃で30分間）胎
児ウシ血清 100μl 中の 125Ｉ標識された抗体１０6 cp
m と４℃で３０分間インキュベートされた。ＰＢＳ５ml
の添加の後、細胞は 250×g で１０分間遠心分離するこ
とによってペレット化された。上澄み液は吸い出され、
そしてペレットは 125Ｉに関して計数された。非特異的
結合を計測するために、並行的インキュベーションが競
合物として標識されていない抗体１０μg を用いて行な
われた（ブラウンら，上記）。いくつかの例において
は、結合検定法は、類似の様式においてプラスチック製
培養皿へ付着した細胞単一層上で行なわれた。
【００４９】b)ＦＡＣＳIIセルソーターにおいて行なわ
れる結合検定法のために、細胞は、５ mＭエチレンジア
ミン四酢酸(EDTA)を含むＰＢＳを用いて、それらの基層
から除去された。１×１０5 細胞を含有する試料は最初
に２μg ／mlの濃度でモノクローナル抗体とインキュベ
ートされ、続いて1: 200の希釈でフルオレセイン結合ヤ
ギ抗マウス抗体とインキュベートされた。細胞は次に洗
浄されそして培養培地中に再懸濁された。ＦＡＣＳ分析
の直前に、ヨウ化プロピジウムが非生存細胞を染色する
ために１μg ／mlの最終濃度へと添加された。ＦＡＣＳ
分析の間、赤色蛍光を発する細胞が、生存細胞のみを調
べるために、電子的に追出された。フルオレセイン蛍光
の平均強度が、次にそれぞれの抗体に関して測定され
た。陰性の比較対照はモノクローナル抗体のない試料か
ら構成されており、一方陽性の比較対照は、ＨＬＡタイ
プ１組織適合性抗原に対するモノクローナル抗体からな
るものであった。平均チャンネルフルオレセインが少な
くともバックグラウンドの３倍であった場合に、染色は
陽性であると見なされた。タンパク質抗原測定 タンパク質抗原を同定するために、肺癌腫またはヒト胎
児肺細胞は表面を放射性ヨウ素化され、または35Ｓ−メ
チオニンで代謝的に標識化された。抗原はモノクローナ
ル抗体とのインキュベーションそしてヤギ抗マウスＩg
Ｇの添加およびスタフィロコッカス・アウレウスへの吸
着によって細胞溶解物から単離された。免疫沈澱物は洗
浄され、ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって上述のように分析された［ブラウ
ンら，上記参照(Brown et al．上記参照)]。 35Ｓ- メチオニン標識化 特定の抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、２５ mＭ
ヘペス緩衝液、４ mＭＬ−グルタミン、 4.5 g/lグルコ
ース、１０ mＭ非必須アミノ酸、 100単位／mlペニシリ
ン、 100μg ／mlストレプトマイシンおよび１５％熱失
活化新生子牛血清(NCS) を含有しているメチオニン非含
有ダルベッコ最少必須培地においてマイクロタイターウ
ェルに播かれた。細胞は0.1mＣi 35Ｓ−メチオニンと３
７℃で６時間接触し、そして細胞を分離するために上澄
液は取り出され、遠心分離された。イソタイプ測定 a)オクタロニー免疫拡散法 特定のハイブリドーマの上澄液のアリコートが２％寒天
プレートの中央ウェル中へ入れられた。単特異性ウサギ
抗マウスＩg イソタイプ抗体（メロイ[Meloy])が外側の
ウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、さ
らに４℃で一晩インキュベートされた。
【００５０】b)可撓性ポリ塩化ビニル製の９６ウェルプ
レート（コースター[Coster]）が３７℃で２時間 0.1 m
g/mlヤギ抗マウスＩg 抗体で被覆され、そして３７℃で
２時間３％ＢＳＡ溶液で対向被覆された。ハイブリドー
マ上澄液が次に３７℃で２時間インキュベートされた。
ＰＢＳで洗浄した後、ウシ血清アルブミン(BSA）プレー
トは、３７℃で２時間ペルオキシダーゼに結合した単特
異性ウサギ抗マウスＩg イソタイプ抗体（ザイムド[Zym
ed])とインキュベートされた。洗浄の後、プレートは
0.1Ｍクエン酸緩衝液 pＨ4.5 中の１mg／mlオルソフェ
ニレンジアミンおよび 0.03 ％Ｈ2Ｏ2 とインキュベー
トされた。630nm での光学密度がダイナテックＥＬＩＳ
Ａプレート読取器 [Dynatec ELISA plate reader] にお
いて測定された。黄色ブドウ球菌性プロテインＡ結合検定法 マイクロタイターウェルを、ＰＢＳ中の５％ＮＣＳおよ
び0.02％のＮaＮ3 と共にインキュベートし、上澄液を
吸出した。２５μl の表皮細孔の懸濁液(2×10 7 細胞／
ml）を各ウェルに加え、室温で１時間２５μl の特定の
抗体とインキュベートした。プレートを７分間1200rpm
で遠心分離にかけ、５０％ＮＣＳ／ＰＢＳ／ＮaＮ3 で
２度洗浄し、２５μl の 125Ｉ−黄色ブドウ球菌性プロ
テインＡ（約50,000cpm/25ｌ）を加えた。そのプレート
を２５℃で１時間インキュベートし、５％ＮＣＳ／ＰＢ
Ｓ／ＮaＮ3 で２度洗浄し、乾燥した。ウェルの底を切
り離し、ガンマカウンターで計測した。細胞培養 カル−１肺癌(Calu-1 lung carcinoma）細胞を、アメリ
カン タイプ カルチャー コレクションから得た。増
殖培地〔１ml当り５０ユニットのペニシリン、１ml当り
５０μg のストレプトマイシンおよび１０％(v:v) のウ
シ胎児血清(FCS）を含むダルベッコ改変イーグル培地(D
MEM)〕中単層培養株として細胞を維持した。細胞を0.05
％トリプシンおよび0.02％ＥＤＴＡ溶液で処理して集
め、血球形で計測した。間接免疫蛍光検査法 細胞をトリプシン処理で集め、ウェル（直径 6mm）当り
５〜20×103 の密度でテフロン被覆多ウェルスライド
（メロイ ラボ(Meloy Labs)）上に置いた。実験開始前
に細胞を37℃で約18時間保持した。培地を除去し、付着
細胞を0.5mＭ ＣaＣl2および0.5mＭ ＭgＣl2を含むリン
酸緩衝溶液(PBS, NaCl, 0.14M; KCl, 3mM;Na2HPO4×7H2
O ，8mM;およびKH2PO4，15mM) で１度洗浄した。その
後、細胞を23℃で20〜30分間で25マイクロリッターのパ
ラホルムアルデヒド溶液(PBS中0.5%）を加え、その場で
固定した。細胞を洗浄し、細胞内抗原を23℃で５分間
0.2％(v:v）ＮＰ40を含むＰＢＳを加えることにより露
出させた。その後、過剰のアルデヒド基を、23℃で少な
くとも15分間結合用バッファー[pH6.8の50mM BES(N,N−
ビス［2-ヒドロキシエチル]-2-アミノエタンスルホン
酸），0.1%(w:v)BSAおよび15%FCSを含むDMEM］を加えて
ブロックした。抗体を結合用バッファー中で10μg／ml
に希釈し、各ウェル当り20〜25マイクロリッターの全容
量で加えた。スライドを４℃で１時間インキュベート
し、結合用バッファーで洗浄した。フルオレセインイソ
チオシアネート結合(FITC)第２抗体（ヤギ抗マウスIgG
およびIgM)を４℃で１時間で加えた。使用したＦＩＴＣ
結合体の希釈率は任意のシグナル対バックグラウンド比
をもたらすように実験的に決定した。インキュベーショ
ン後、スライドを結合用バッファーおよび水で洗浄し、
空気乾燥した。小容量の非退色(anti-fade）溶液［ゼネ
チィック システンズ コーポレーション(Genetic Sys
tens Corporation)]およびカバーガラスを加え、スライ
ドをロイツ オルソプラン蛍光分光顕微鏡(Leitz Ortho
plan fluorescence microscope）を使用して測定した。
スライドを40×油浸対物レンズのもとで調べ、コダック
トライ Ｘ パンフィルムで写真にとった。代謝性標識化 Ａ． 35Ｓ−メチオニン 細胞をトリプシン処理により集めた。トリパンブルー排
除により測定した生存能は通常95％より大きかった。４
×106 細胞を遠心分離により集め、アミノ酸メチオニン
を除いた１mlの増殖培地中に懸濁させた。35Ｓ−メチオ
ニン(800Ci／ミリモル）を最終濃度0.5mＣi/mlまで加
え、37℃で１〜６時間回転しながらインキュベートし
た。その後、標識化細胞を遠心分離によって集め、次の
操作前に洗浄した。ある場合には、放射性標識化細胞懸
濁液を標識化されていないメチオニンおよび10％ＦＣＳ
を含む増殖培地で10倍に希釈し、100mmの組織培養皿に
加え、37℃でさらに18時間インキュベートした。その
後、使用前に付着細胞をＰＢＳで洗浄した。 Ｂ． 3Ｈ−グルコサミン 3 Ｈ−グルコサミンで細胞を標識する場合には類似の標
識化プロトコールを使用した。最初に、内部グルコース
プールを10％透析化ＦＣＳを含むがグルコースを含まな
い増殖培地中で４〜24時間インキュベートすることで枯
渇させた。飢餓後に＞90％生存能を示す細胞母集団を次
の実験に使用した。細胞を上記の如く集め、 pＨ 7.4で
10％透析化ＦＣＳ、0.01Ｍ ＨＥＰＥＳ(N-2- ヒドロキ
シエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸）および 0.
5Ｍ Ｃi 3Ｈ− グルコサミン [40Ci/ミリモル］を含む
１mlの無グルコース増殖培地中に再懸濁させた。37℃で
３時間回転して標識化後、細胞を遠心分離で集め、ＰＢ
Ｓで洗浄した。ヨウ素化 グリーンウッド等(1963)バイオケミカル ジャーナル
89:114〜123(Greenwood,et al,(1963)Biochem,J. 89：
114-123)によって記載された方法でクロラミンＴ法を使
用して、タンパク質を125Ｉで放射性標識化した。タン
パク質サンプル（50μｇ）を１〜２ mＣi 125Ｉ（キャ
リヤーなし）を含むＰＢＳ中へ 0.5mlに希釈した。10μ
ｌの新たに作られたクロラミンＴ溶液（10μｇを含む）
を加え、23℃で５分間反応した。反応を20μｇのＮa2Ｓ
2Ｏ5 および３μｇのＫＩを含む溶液を加えて終了させ
た。未反応 125Ｉを１mg／mlのウシ血清アルブミンを含
むＰＢＳで平衡にしたセファデックスＧ-10(Sephadex G
-10 ）カラムにおけるクロマトグラフィーで除去した。
この研究で使用された標識化モノクローナル抗体の比活
性はナノモル当り約３×109cpmであった。放射性標識化
する前にＬ３抗原を含むサンプルをセファデックスＧ-1
0(Sephadex G-10 ）スピンカラムで脱塩した。免疫沈降分析 １．抽出物の調製 代謝性標識化細胞を遠心分離で集め、ml当り２〜４×10
6 細胞の比率でＮaＣl、0.15Ｍ；Ｎa2ＨＰＯ4、0.05
Ｍ；デオキシコール酸ナトリウム１％(w:v);トリトンＸ
-100(Triton x-100)，１％(w:v）およびＳＤＳ 0.1％
(w:v）を含むＲＩＰＡバッファー中で可溶化した。４℃
で10分間のインキュベーション後、その混合物を遠心分
離機（147,000xｇ，30分間 Ti 70.1 ローター）で清澄
化した。上澄液を除き、放射活性の取込みを液体シンチ
レーションカウンターにより測定した。 ２．免疫沈降 35 Ｓ−メチオニンおよび 125Ｉに対して１〜２×107 cp
m(酸沈降性）または 3Ｈ−グルコサミンに対して４×10
6cpm（酸沈降性）を含む細胞溶解産物のアリコートを４
℃で 0.5〜１時間、１μｇの抗体とインキュベートし
た。標識化培養培地を分析した時に、分析した全細胞抽
出物の割合に等価なアリコートを使用した。アフィニテ
ィー精製ヤギ抗マウス免疫グロブリン(1〜 2μｇ；ヤギ
をマウス免疫グロブリンで免疫化して調製した）を含む
溶液を加え、４℃でのインキュベーションをさらに10〜
60分間続けた。50μｌのホルマリン固定化スタフィロコ
ッカス・アウレウス（パンソルビン）の10％溶液を加
え、４℃で５分間インキュベート後、免疫沈降物を遠心
分離で集めた（使用前に、パンソルビンを0.5%(v:v）NP
40溶液で１度、 0.05%(viv）NP40溶液で１度洗浄し、１
mg／mlオバルブミンを含む後者のバッファー中に再懸濁
させた）。沈降物をＴＮＥＮバッファー（トリスヒドロ
キシメチルアミノメタン, pH8.0 ，0.02M; NaCl ，0.1
M; EDTA，0.01M;および NP-40，0.5%(w:v))で３〜４回
洗浄し、使用まで−20℃で凍結して貯蔵した。電気泳動 １．SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS PAGE)：
上記ラエムリ(Laemmli）に従ってＳＤＳ ＰＡＧＥを実
施した。最も頻繁に使用された分離ゲルは10〜20％の直
線的アクリルアミド勾配であり、そしてスタッキングゲ
ルは５％のアクリルアミドを含んでいた。サンプルを５
％の2-メルカプトエタノールを含むサンプルバッファー
中で沸騰させ、電気泳動前に免疫吸着体(immunoabsorbe
nt）を遠心分離で除いた。分子量標準は、14Ｃ−メチル
化タンパク質混合物(Amersham)または予備染色標品(BR
L）のいずれかであった。使用された標準タンパクの分
子量は、ミオシン(200,000）、ホスホリラーゼｂ(92,40
0)、ウシ血清アルブミン(BSA)(69,000）、オバルブミン
(46,000)、キモトリプシノゲン(26,000)、ベータラクト
グロブリン(18,400)、リソチーム(14,300)およびシトク
ロムｃ(12,300)であった。電気泳動後、ゲルを真空下で
乾燥し、放射標識タンパク質の位置をコダックＸ− 線
フィルムを用いるオートラジオグラフィーで決定した。 ２．二次元等電点電気泳動(IEF)-ＳＤＳ ＰＡＧＥ 125 Ｉ−標識化Ｌ３抗原を含む免疫沈降物を記載のごと
く調製し、５％(v:v）の2-メルカプトエタノールおよび
１％(v:v）ＮＰ40を含む50μｌの溶液に再懸濁させた。
サンプルを95℃で５分間加熱し、免疫吸着体(immunoabs
orbent）を遠心分離で除去した。サンプルにアンホリン
(ampholines)(pH3.5〜10；最終濃度4%）を混合し、固体
尿素を飽和まで加えた。オファレル(1975)ジャーナル
バイオロジー ケミカル 250;4007〜4021[O'Farrell(1
975)J.Biol.Chem.250;4007-4021]の方法に従って等電点
電気泳動およびＳＤＳ ＰＡＧＥを実施した。標準タン
パク質マーカー（バイオラッド Bio Rad)をＩＥＦ次元
で分離を追跡するために使用した。得られる pＨ勾配を
平行に実施したブランクゲルから決定した。ゲルを0.5c
mにスライスし、このスライスを１mlの蒸留したＨ2Ｏに
１時間浸し、得られる溶液の pＨを決定した。 ３．パラゴン電気泳動：血清タンパク質電気泳動法を製
造者の指示に従ってパラゴン(Paragon) 装置（ベックマ
ン）であらかじめ形成されたアガロースゲルを使用して
行った。イムノブロッティング ：分析されるタンパク質をＳＤＳ
ＰＡＧＥまたはパラゴン(Paragon）のいずれかで分離
した。ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離したサンプルをバー
ネット(1981)アナル バイオケミストリー 112; 195〜
203[Burnette(1981)Anal.Biochem 112;195-203］の記載
のごとく５Ｖ／cmで４℃において約18時間電気泳動的に
ニトロセルロースに移した。パラゴンにより分離したサ
ンプルは一枚のニトロセルロースペーパーをエレクトロ
ホレトグラム(electrophoretogram)の上に置くことによ
ってニトロセルロースに移した。ニトロセルロースを、
使用前に、ＳＤＳを含まない上記バーネットのトランス
ファーバッファー(transfer buffer）中で水和した。厚
さ約１インチの紙タオルの層をニトロセルロース上に置
き、ガラスプレートおよび試薬びんで押えた。トランス
ファー後ゲルの染色により判定して、トランスファーは
１時間以内で完了した。ニトロセルロースブロットをブ
ロットー(Blotto)つまりミルクをベースとしたカクテル
（ジョンソン等 ジーン アナリティカル テクノロジ
ー(1984) 1:3-8(Johnson et al.,Gene Anal. Technol
(1984）1:3-8))(1%(w:v)カーネーション(Carnation）脱
脂粉乳および 0.2％(v:v）のＮＰ−40を含むＰＢＳ）中
で１時間インキュベートして、ブロックした。Ｌ３抗原
は23℃で１時間ブロットー(Blotto)中の１〜４×106 cp
m/mlの 125Ｉ−Ｌ３抗体とブロットとのインキュベーシ
ョンにより明らかにした。ブロットをブロットー(Blott
o)で十分に洗浄し、オートラジオグラフ暴露前に乾燥し
た。
【００５１】 125Ｉ−Ｌ３抗体の結合 カル−１(Calu-1)細胞(4〜10×104 ）を実験開始の18時
間前に48ウェル細胞培養皿にまいた。細胞をＰＢＳで洗
浄し、23℃で20分間ＰＢＳ中の 0.5％パラホルムアルデ
ヒド溶液で固定した。単層をＰＢＳで洗浄し、23℃で５
分間 0.2％ ＮＰ−40含有ＰＢＳで処理して透過性を与
えた。各種濃度の 125Ｉ標識化抗体を23℃、60分間で
0.1mlの最終容量で加えた。その後、単層を結合用バッ
ファーで十分に洗浄し、 0.5Ｍ ＮaＯＨの添加により
可溶化した。細胞に結合した放射性活性をガンマカウン
ターで測定した。サンプルを２通り検定した：２通りの
サンプルは一般に20％以下で変動した。非−特異的抗体
結合を測定するため、 125Ｉ−標識化抗体結合を通常90
％以上減少させる50〜100倍過剰の標識化してないＬ３
抗体で同一ウェルをインキュベートした。結合データを
スカッチャード(1949)アン．エヌ．ワイ．アカデミーサ
イエンス 51:660-672[Scatchard(1949)Ann.N.Y.Acad.
Sci.51:660-672］に従って分析すると、 125Ｉ−Ｌ３抗
体についての親和定数(Ka)が約１×108 Ｍ-1と測定され
た。 125Ｉ−Ｌ３抗体の添加前に細胞単層をＮＰ40で処
理しないと抗体の結合は10倍以上に減少した。競合的結合検定法 Ｌ３抗原活性は、カル−１細胞のホルマリン固定化単層
に対する 125Ｉ−標識化Ｌ３抗体の結合を抑制する抗原
の能力を決定することにより測定した。細胞単層を上記
のごとく調製した。 125Ｉ−Ｌ３抗体をＬ３抗原活性を
含有する溶液 0.4μｇ／mlの濃度の存在下または不存在
下で細胞に加えた。最終検定容量は 0.1mlであった。こ
れらの条件のもとで、結合に対して競合する標識化して
ないＬ３抗体の能力により判定すると、 125Ｉ−Ｌ３抗
体の結合は95％以上特異的であった。各種希釈の試験溶
液を加え、 125Ｉ−標識化抗体の結合を上記のように測
定した。培養培地中および正常ヒト血清中で見い出され
たＬ３抗原の精製の各種段階に関する典型的な抑制曲線
は、第１図（追加書類）に示してある。Ｌ３抗原活性の
１単位は、 0.4μｇ／mlで加えられた 125Ｉ−Ｌ３抗体
の結合を50％抑制するために必要な量として定義され
る。グリコシダーゼ処理 35 Ｓ−メチオニンまたは 125Ｉ−標識化Ｌ３抗原の免疫
沈降物を上記のように調製した。ペレット化した免疫吸
着体(immunoabsorbant）を25μｌの消化バッファーに再
懸濁させ、５ミリユニットの適当な酵素を含む５μｌの
容積物を加え、サンプルを37℃で18時間インキュベート
した。濃縮したＳＤＳ ＰＡＧＥ サンプルバッファー
を加え、サンプルを電気泳動にかけた。ノイラミニダー
ゼ処理のため消化バッファーは次のものを含んでいた：
ＮaＣl 0.15Ｍ；酢酸ナトリウムpＨ 5.3，0.05Ｍ；Ｃa
Ｃl2，0.1％(w:v);およびフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド，0.1 ％(w:v) 。エンドグリコシダーゼＨ(E
ndo H)処理のため、消化バッファーは次のものを含んで
いた：トリス−ＨＣl pＨ6.5,,0.025 Ｍ；ＳＤＳ,0.2
％(w:v);およびフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド,0.1％(W:V）。タンパク質測定 タンパク質濃度は基準としてウシ血清アルブミンを使用
するブラッドホード(1976)アナル バイオケミストリー
72:248-254[Bradford(1976) Anal.Biochem.72:248-25
4]の方法で測定した。Ｌ３セファロースの調製 凍結乾燥化ＣＮＢr-活性化−セファロース(Sepharose）
４Ｂを４℃で30〜60分間１mＭ ＨＣl で再構成した。こ
の樹脂を同一溶液で１度洗浄し、遠心分離で集め、１Ｍ
ＮaＣl および0.2 Ｍの重炭酸ナトリウムの溶液(pＨ
8.3) 中の3.5mg／mlのＬ３抗体と混合した。混合物を４
℃で回転しながら16時間インキュベートした。樹脂を遠
心分離で集め、過剰の活性基を pＨ 8.3で１〜４倍容量
の0.25Ｍグリシン溶液の添加によりブロックした。その
後、樹脂を遠心分離で集め、使用前にＰＢＳで数回洗浄
した。カップリング効率をカップリング前後の抗体溶液
の280nmにおける吸光度を測定することにより検定し、
充填樹脂１ml当り約１０mgのＬ３抗体であると測定され
た。ゲル染色 ＳＤＳ ＰＡＧＥ後、タンパク質バンドの位置をクーマ
シーブルー(Coomassieblue)染色または商業的銀（バイ
オラッド Bio Rad）またはニッケル（コダック）を基礎
とする染色キットにより決定した。エドマン分解によるアミノ末端配列の決定 培養培地からのＬ３抗原を 0.1Ｍ トリス−ＨＣl 、 p
Ｈ 8.5および 0.1％ＳＤＳ(w:v）を含む 0.1mlの溶液中
のジチオトレイトール(20mM)で50℃で２時間還元した。
その後、抗原を20℃で30分間ヨードアセトアミド(45mM)
処理して、Ｓ−カルボキサミドメチル化し、10％アクリ
ルアミドゲル（15mm厚み）の調製用ＳＤＳ ＰＡＧＥに
かけた。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブ
ルー(10%酢酸および 30%イソプロパノール中で0.5 重量
%)で染色し、酢酸(5%v:v）およびメタノール(17%v:v)の
溶液で脱色した。染色したＬ３抗原バンドをカミソリ刃
で切り出し、直ちにＥＣＵ−040 エレクトロエリュータ
ー／コンセントレーター(Electroelutor/Concentrator)
（シー．ビー．エス．サイエンティフィック コーポレ
ーション．サンジエゴ．カルフォルニア(C.B.S．Scient
ific Co.,San Diego,Ca)）を使用して電気溶出および電
気透析にかけた。サンプルがカルボキサミドメチル化さ
れないことを除いては、血清由来のＬ３抗原を同様に処
理した。その方法の全回収率は、銀染色による分析用Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質量を概算すると、約80
％であった。自動化エドマン分解を約100pモルのＳ−
カルボキサミドメチル化された馴化培地由来のＬ３抗原
（同定されたMet-6 の収量に基づく）および３８ｐモル
の血清由来の非修飾Ｌ３抗原（同定された Val-1の収量
に基づく）を使用して気相シークエンサー中で行なった
（モデル 470A 、アプライドバイオシステムズ，インコ
ーポレーテッド，フォスター シィティ カルフォルニ
ア）。フェニルチオヒダントインアミノ酸を、溶出用に
酢酸ナトリウムバッファー／テトラヒドロフラン／アセ
トニトリル勾配を使用するアイビーエムインスツルメン
ツシアノカラム(IBM Instruments'Cyano column)を用い
る逆相ＨＰＬＣ（検出ユニット，2pモル）で分析した
（アプライド バイオシステムズ，タンパク質配列ユー
ザーズブルティン(Bulletin)NO.2,1984)。例 １ モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体を３ケ月令ＢＡＬＢ／ｃマウスを４
つの異なる源の１つのヒト組織で免疫化することにより
製造した：(1) 転移性非−小細胞肺癌を有する患者から
の胸膜滲出液、(2) 非−小細胞肺癌からの培養細胞、お
よび(3) ３〜４ケ月令ヒト胚からの肺組織。約107 細胞
をマウス腹腔内へ３〜４回注入することにより免疫処置
を行った。最終免疫の３日後、脾臟を取り出し、培養培
地に懸濁させ、ＮＳ１マウス骨髄腫(myeloma) 細胞と融
合させた（上記のケーラーおよびミルシュタイン（Kohl
erおよびMilstein))。混合物を単一融合細胞（クロー
ン）から生ずる低密度培養物を形成するために接種し
た；ハイブリダイゼーションに使用した技術は、イエー
等イント．ジェイ．キャンサー(1979)29:269-275[Yeh,e
t al.,Int.J.Cancer(1979)29:269-275］にすでに記載さ
れている。
【００５２】ハイブリッド細胞からの上澄み液は、ＥＬ
ＩＳＡ検定法およびオートラジオグラフィー的間接 125
Ｉ−標識化プロテインＡ検定法[autoradiographic indi
rect 125I-labelled prote in A assey]（ブラウンら，
ジャーナル オブ イムノロジー メソッズ（1979年）
31:201〜209[Brown et al.,J.Immunol.Meth.(1979)31:2
01-209])の双方を用いることによって、とりわけ細胞膜
を含有する免疫処置に用いられた腫瘍からの抽出物に対
してスクリーニングされた。これらの抽出物は、コルカ
ーら[Colcher et al.]（キャンサー リサーチ（1981
年）42：1451〜1459[Cancer Res.,(1981) 42:1451-145
9])；イェイら（上記）から修正された方法を用いて調
製された。このために、組織はＰＢＳで洗浄されそして
懸濁され、完全な腫瘍については、ステンレス鋼製ふる
いを通して圧搾することによってなされた。この後に、
１mＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（カル
バイオケム− ベーリング コーポレーション カルフ
ォルニア州サンディエゴ[Calbiochem-Behring Corp.,Sa
n Diego,CA])を含む１ mＭ ＮaＨＣＯ3 が添加され、
次にこの物質をデューンス[Dounce]ホモジナイザーのＢ
乳棒の50ストロークで、氷上においてホモジナイズし
た。27,000×g で15分間の遠心分離の後、上澄み液が除
去され、そしてペレットはＰＢＳ中に再懸濁され、１分
間音波処理され、−70℃で貯蔵された。
【００５３】細胞膜抽出物に結合する抗体を産生したハ
イブリドーマは、クローン化され、試験管内で増殖さ
れ、そして抗体特異性に関してさらに試験された。この
試験は上記した免疫組織学的技術を用いることによって
行なわれ、肺癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切
片に結合する抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫に対
して特異性を示す抗体を産生するこれらのハイブリドー
マは再クローンされ、増殖され、そしてプリスタン処理
された３カ月齢ＢＡＬＢ／ｃマウス中へ注射され、そこ
で、これらを腹水腫瘍として増殖させた。
【００５４】腹水中へ分泌される抗体は、プロテインＡ
セファロース[Sepharose］において（エイら，イムノケ
ミストリー，（1978年）15:429[Ey et al.Immunochemis
try(1978) 15:429])あるいはセファクリルＳ−300[Seph
acryl S-300 ］中でのゲル濾過によって精製された。精
製抗体は、免疫組織学による付加的な特異性試験、該抗
体が細胞表面に結合したかを測定するための完全細胞で
の結合検定、および上記したような放射性免疫沈降試験
を含むなお一層の特性づけのために用いられた。
【００５５】モノクローナル抗体Ｌ３、Ｌ５およびＬ18
を上記のごとく対応するハイブリドーマから産生させ
た。これら抗体は、本明細書の上記の特性を示した。Ｌ
３、Ｌ５およびＬ18と呼ばれる細胞系は1984年10月４日
にA.T.C.C.（アメリカン タイプ カルチャー コレク
ション,12301 パークローン デーアール.,ロックヴィ
レ，マリーランド 20852(American Type Culture Colle
ction,12301Parklawn Dr.,Rockville,Maryland 20852)
に寄託され、そしてそれぞれ受託番号HB8626、HB8627お
よびHB8628を指定された。細胞系Ｌ３は1984年10月25日
に再寄託された。例 ２ 無血清馴化培地からのＬ３抗原の精製 １．無血清馴化培地の調製 カル−１細胞を、増殖培地の存在下に回転ボトル(850cm
2）の中で集密まで増殖させた。単層は50mlの無血清増
殖培地を用いて３回洗浄し、２回目の洗液を37℃で30分
間細胞上に放置した。細胞はそれから 150mlの無血清増
殖培地の存在下でインキュベートした。３日後に、前記
培地を集め、遠心分離機にかけて浮遊細胞を取り除き、
使用時まで−70℃で冷凍保存した。 ２．濃縮物の調製 無血清培地(790ml) は、限外濾過（アミコン PM1O 膜．
Amicon.PM1O membrane）によって17mlの容積にまで濃縮
された。この濃縮物は移され、前記膜はＰＢＳ（11ml）
によって一度洗浄された。洗液と濃縮物は合わせられ、
Ｔi 70ローター（ベックマン.Beckman) 内において30分
間、 147,000×g で遠心分離機にかけられた。上澄み液
は大部分のＬ３抗原活性を含んでいると認められ、以後
これを濃縮物と言う。 ３．イムノアフィニティークロマトグラフィー この濃縮物はセファロースＣ14Ｂのカラム(1.5ml）に送
られて、セファロースに対して親和性を持つ物質が取り
除かれた。カラムはそれから３mlのＰＢＳによって洗浄
された。この通過流は洗液に合わせられ、Ｌ３抗体を結
合させたセファロース４Ｂ（10mg L3/ml樹脂）充填容量
１mlに加えられた。この混合物は４℃のもとで18時間回
転状態に保たれ、それから配置皮下注射器を用いて作ら
れたカラムの中に注がれた。前記通過流は集められ、樹
脂はＰＢＳ（10ml）と、５ＭのＮaＣl (5ml）及び0.02
Ｍの酢酸アンモニウム（10ml）の溶液とにより洗浄され
た。Ｌ３抗原は、新たに作られたトリエチルアミン溶液
(75mＭ）を加えることによってカラムから溶出された。
Ｌ３抗原活性は上昇 pＨに対して不安定なので、流出物
の pＨは、２Ｍの酢酸アンモニウム 0.1mlを含有するチ
ューブ内に画分(0.5ml）を集めることによって調整され
た。Ｌ３活性を含む画分は、競合的結合検定法を用いる
ことによって同定され、プールされ、更に−20℃に冷凍
保存された。この結果は第１表に要約して示されてい
る。例 ３ 血清からのＬ３抗原の精製 １．血清の収集 血液は腫瘍患者又は正常の個体から採血され、室温で10
〜90分間凝固された。サンプルはその後、ソーバルクリ
ニカル(Sorvall Clinical)遠心分離機により毎分1600回
転で10分間遠心分離される前に、30分から５時間４〜６
℃で保存された。血清は凝血から分離され、アリコート
に分けられて、使用されるまで−70℃で冷凍保存され
た。Ｌ３抗原活性レベルは、同一個体からの血清又は血
漿にあっては、大きくは相違しなかった。融解されたア
リコートは、抗原活性が冷凍と融解との繰り返しに対し
て敏感であることが確認されたので、一般には再冷凍す
べきでない。Ｌ３抗原活性の精製のために、新たに冷凍
された血清10mlのアリコートが融解され、使用前に 14
7,000×g で60分間遠心分離（Ti 70.1 ローター）によ
り清澄化された。 ２．ＤＥＡＥセファセル(Sephacel)クロマトグラフィー 10mlカラムのＤＥＡＥセファセルを注入し、ＰＥバッフ
ァー（リン酸ナトリウム 0.02M．pH7.12，0.005MのEDT
A）により平衡化した。清澄化した血清は、イオン交換
カラムに供される前に、ＰＥバッファーによって 130ml
の容積に希釈された。サンプルの供給と溶離の間、 0.5
ml／min の流速が維持された。カラムの通過流は元の血
清タンパク質の54％を含み(280nmでの吸光度により判
定）、検出可能なＬ３抗原活性を含んでいなかった。こ
のカラムはそれから10倍カラム容量のＰＥバッファーに
よって洗浄された。Ｌ３抗原活性の溶離は、ＰＥバッフ
ァー中の、０〜 0.5ＭＮaＣl の50ml勾配を用いて達成
された。溶離の間に、１mlの画分が集められた。この勾
配の適用後、カラムはＰＥバッファー中の 0.5ＭのＮa
Ｃl により洗浄され、最終的に同一のバッファー中の
1.5ＭのＮaＣl により洗浄された。Ｌ３抗原活性を含む
画分は、競合的阻止検定法を用いて同定され、プールさ
れた。Ｌ３抗原活性は、大量の血清タンパク質の溶離の
あとにわずかに尾を引いた。
【００５６】いくつかの実験では、Ｌ３抗原活性は放射
性標識化と免疫沈降分析の前に、僅かに異なった手順で
部分精製された。血清タンパク質はまず30％の硫酸アン
モニウムによって沈澱させられた。この沈澱物はＨ2Ｏ
中に溶解され、ＤＥＡＥセファセルのカラムに供給され
る前に（セファデックス(Sephadex)G-25で）脱塩され
た。Ｌ３活性の溶出はＮaＣl 溶液の段階的添加によっ
て達成された。 0.25 Ｍと 0.5ＭのＮaＣl 間に溶離す
る画分は、Ｌ３抗原活性について濃縮され、その後のＬ
３の放射性標識化のために用いられた。この方式で調製
された抗原は、 3,000倍以上に精製された調製物から沈
澱された放射性標識化抗原からのプロテアーゼフィンガ
ープリンティングによって区別することができなかっ
た。 ３．イムノアフィニティークロマトグラフィー ＤＥＡＥセファセル(Sephacel)のカラム（14ml）からプ
ールされた画分は、セファセルＣＬ４Ｂの8.4ml カラム
に供給され、このカラムは17mlのＰＢＳにより洗浄され
た。この洗液はそれから通過流に合わせられ、この混合
物は４℃での回転によって、抗体Ｌ３を結合させたセフ
ァロース（10mg L3/ml樹脂）充填容量1.5ml によって18
時間平衡化された。この混合物はカラムの中に注がれ、
樹脂は続いてPBS(42ml) 、0.2%(v:v)NP40 を含むPBS(28
ml) 、PBS(14ml)、0.02M の酢酸アンモニウム（28m
l）、5M NaCl(28ml）、最後に 0.02Mの酢酸アンモニウ
ム(5ml）を用いて順次洗浄した。Ｌ３抗原は上述したよ
うに、 0.075Ｍのトリエチルアミン 8.4mlを加えること
により溶離された。この結果は第２表と第３表に要約し
て示してある。例 ４ Ｌ３抗体及び抗体465.12Ｓの競合的結合 標識されていない抗体465.12Ｓ又は標識されていないＬ
３抗体は、 125Ｉ−Ｌ３抗体（最終濃度0.35μｇ／ml）
と共に混合され、ホルマリン固定されたＨ125肺癌細胞
(50,000/ウェル）に加えられた。標識されていない抗体
は、ハイブリドーマ上澄み液として用いられ、それぞれ
の抗体は最終検定において原容量の１／２に希釈され
た。使用された抗体465.12Ｓの溶液は、35Ｓ−メチオニ
ン標識化細胞抽出物から、精製されたＬ３抗体１マイク
ログラムにより沈降させられたものと同価の多くの抗原
を沈降させるために十分な抗体を含んでいた。第４表に
示す結果は、抗体465.12Ｓが、 125Ｉ−Ｌ３抗体の結合
に対して競合しないことを示している。かくして、この
二つの抗体は、別個のエピトープを認識し、したがって
相異なった抗体であり、機能的等価体ではない。例 ５ Ｌ５抗原の切断フラグメント ＣＡＬＵ−１ヒト肺癌細胞は、ブラウンら[Brown et a
l. ](ジャーナル オブイムノロジー[J.Immunol.]第 12
7巻第 539〜 546頁（1981年))によって記載され、ラク
トペルオキシダーゼ触媒化ヨウ素化を用いて表面標識さ
れた。Ｌ５抗原（抗体Ｌ５により限定される抗原のこ
と）は、細胞抽出物から沈澱せられ、還元条件下で実施
したSDS-PAGEによって分析された。これに応じて分析す
ると、Ｌ５抗原は、Ｍr135,000の単一のポリペプチド鎖
として移動した。Ｌ５抗原を含むゲル領域は切り出さ
れ、指定量のスタフィロコッカス・アウレウス[Staphyl
ococcus aureus］Ｖ８プロテアーゼで処理され、上記の
クレベランドら[Cleveland etal.]によって述べられたS
DS-PAGEによって再び分析された。細胞表面のヨウ素化
されたＶ８切断フラグメントの結果的に生じた“フィン
ガープリント”は、Ｌ５抗原の診断に役立つ。すなわ
ち、Ｍr 24,000及び16,000の切断フラグメントはＬ５抗
原に特徴的であり、同様な分子量を有する他の抗原から
Ｌ５抗原を見分けることになる。
【００５７】
【００５８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヘルストーム，カール エリック アメリカ合衆国 ワシントン州 98121 シアトル ノース イースト サーバー ドライブ 3925 (72)発明者 ホーン，ダイアン アメリカ合衆国 ワシントン州 98121 シアトル ウェスト オリンピック プレ ース ナンバー404 202 (72)発明者 リンスレイ，ペーター アメリカ合衆国 ワシントン州 98121 シアトル ナインス ウェスト 2430

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 モノクローナル抗体の抗原結合部位が、
    ヒト非- 小細胞肺癌の細胞表面決定基である約135,000
    ダルトンの分子量を有するタンパク質抗原に結合するこ
    とを特徴とするモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】 Fab 、F(ab')2 またはFvフラグメントで
    ある、請求項１記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】 検知可能な信号を発することができる標
    識に結合された、請求項１記載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】 前記標識が蛍光物質である、請求項３記
    載のモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】 IgM イソタイプである、請求項１記載の
    モノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】 マウスハイブリドーマ細胞系により産生
    される、請求項１記載のモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】 前記マウスハイブリドーマがATCCに寄託
    されたHB8627の識別特性を有するハイブリドーマであ
    る、請求項６記載のモノクローナル抗体。
  8. 【請求項８】 Fab 、F(ab')2 またはFvフラグメントで
    ある、請求項７記載のモノクローナル抗体。
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