JPH09210996A - ペプチドと反応する抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法 - Google Patents
ペプチドと反応する抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法Info
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- JPH09210996A JPH09210996A JP4221096A JP4221096A JPH09210996A JP H09210996 A JPH09210996 A JP H09210996A JP 4221096 A JP4221096 A JP 4221096A JP 4221096 A JP4221096 A JP 4221096A JP H09210996 A JPH09210996 A JP H09210996A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＳＴＡ遺伝子のエクソン６によりコードさ
れるポリペプチドのうち少なくとも一部を免疫原とした
抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法。 【効果】 本発明により、ＳＴＡ遺伝子のエクソン６が
コードするポリペプチドの少なくとも一部を免疫原とす
る抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法を提供し、Ｘ
染色体劣性遺伝に伴う各種疾患の発症機序解明の研究等
に役立つものである。
れるポリペプチドのうち少なくとも一部を免疫原とした
抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法。 【効果】 本発明により、ＳＴＡ遺伝子のエクソン６が
コードするポリペプチドの少なくとも一部を免疫原とす
る抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法を提供し、Ｘ
染色体劣性遺伝に伴う各種疾患の発症機序解明の研究等
に役立つものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＳＴＡ遺伝子のエクソ
ン６によりコードされるポリペプチドのうち少なくとも
一部を免疫原とした抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定
方法に関する。更に詳しくは、ＳＴＡ遺伝子のエクソン
６によりコードされるポリペプチドのうちアミノ酸配列
ＳＲＳＳＬＤＬＳＹＹＰＴＳＳＳＴまたはアミノ酸配列
ＦＭＱＡＥＥＧＮＰＦからなるペプチドを免疫原とした
抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法に関する。
ン６によりコードされるポリペプチドのうち少なくとも
一部を免疫原とした抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定
方法に関する。更に詳しくは、ＳＴＡ遺伝子のエクソン
６によりコードされるポリペプチドのうちアミノ酸配列
ＳＲＳＳＬＤＬＳＹＹＰＴＳＳＳＴまたはアミノ酸配列
ＦＭＱＡＥＥＧＮＰＦからなるペプチドを免疫原とした
抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＳＴＡ遺伝子は、筋ジストロフィーの一
型であるＥＤＭＤの発症に密接に関係する遺伝子であ
り、該遺伝子がコードする蛋白質をエメリンと言う（Na
ture Genet. 8, p323-327, 1994 ）。
型であるＥＤＭＤの発症に密接に関係する遺伝子であ
り、該遺伝子がコードする蛋白質をエメリンと言う（Na
ture Genet. 8, p323-327, 1994 ）。
【０００３】ＥＤＭＤは、Emery, A. E. H. と Dreifus
s F. E. らによって報告され（J. Neurolo. Neurosurg.
Psychiatr. 29, p338-342, 1966）、1)肘、アキレス
腱、後頸部筋の拘縮、2)scapulo-humero-peroneal 型の
筋ジストロフィー、3)危篤な伝導障害を伴う心筋症を３
主徴とする疾患である。ＥＤＭＤの疾患遺伝子座はＸｑ
２８にマップされ、この部分のＳＴＡ遺伝子にはいくつ
かの変異が同定されているため（Nature Genetics Vol.
8 p323-327 1994 ）、これらの変異の有無及び遺伝子変
異によって引き起こされる異常蛋白質の有無とＥＤＭＤ
及びその他の各種遺伝子疾患との関連性について、注目
が集まっている。
s F. E. らによって報告され（J. Neurolo. Neurosurg.
Psychiatr. 29, p338-342, 1966）、1)肘、アキレス
腱、後頸部筋の拘縮、2)scapulo-humero-peroneal 型の
筋ジストロフィー、3)危篤な伝導障害を伴う心筋症を３
主徴とする疾患である。ＥＤＭＤの疾患遺伝子座はＸｑ
２８にマップされ、この部分のＳＴＡ遺伝子にはいくつ
かの変異が同定されているため（Nature Genetics Vol.
8 p323-327 1994 ）、これらの変異の有無及び遺伝子変
異によって引き起こされる異常蛋白質の有無とＥＤＭＤ
及びその他の各種遺伝子疾患との関連性について、注目
が集まっている。
【０００４】尚、筋ジストロフィーは遺伝子異常により
発症する遺伝病であり、通常Ｘ染色体劣性の遺伝形式を
示すが、臨床経過、羅患筋の分布及び遺伝形式などの違
いにより大きく病状が異なるため、Duchenne型筋ジスト
ロフィー（ＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（Ｄ
Ｍ）、Becker型筋ジストロフィー（ＢＤＭ）、Emery-Dr
eifuss型（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨＤ）、
肢帯型（ＬＧＭＤ）、先天型（ＣＭＤ）、三好型遠位型
（ＭＤＭＤ）等多系統に分類され、これらの発症機序等
に関する研究が進められている。
発症する遺伝病であり、通常Ｘ染色体劣性の遺伝形式を
示すが、臨床経過、羅患筋の分布及び遺伝形式などの違
いにより大きく病状が異なるため、Duchenne型筋ジスト
ロフィー（ＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（Ｄ
Ｍ）、Becker型筋ジストロフィー（ＢＤＭ）、Emery-Dr
eifuss型（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型（ＦＳＨＤ）、
肢帯型（ＬＧＭＤ）、先天型（ＣＭＤ）、三好型遠位型
（ＭＤＭＤ）等多系統に分類され、これらの発症機序等
に関する研究が進められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ＥＤＭＤ及びその他のＸ染色体劣性遺伝に伴う各種
疾患の発症機序解明及びこれら疾患の鑑別診断に用いる
ことのできる抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法を
提供することにある。
は、ＥＤＭＤ及びその他のＸ染色体劣性遺伝に伴う各種
疾患の発症機序解明及びこれら疾患の鑑別診断に用いる
ことのできる抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法を
提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課
題を解決すべく、ＳＴＡ遺伝子がコードするアミノ酸配
列の一部を合成し、これを免疫原とする抗体作製の研究
を重ねた結果、Ｘ染色体劣性遺伝に伴う疾患の患者細胞
と正常細胞とで反応性の異なる抗体を作成することに成
功し、本発明を完成した。
題を解決すべく、ＳＴＡ遺伝子がコードするアミノ酸配
列の一部を合成し、これを免疫原とする抗体作製の研究
を重ねた結果、Ｘ染色体劣性遺伝に伴う疾患の患者細胞
と正常細胞とで反応性の異なる抗体を作成することに成
功し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、ＳＴＡ遺伝子のエク
ソン６によりコードされるポリペプチドのうち少なくと
も一部を免疫原とした抗体及び該抗体を用いた蛋白の測
定方法を提供するものである。
ソン６によりコードされるポリペプチドのうち少なくと
も一部を免疫原とした抗体及び該抗体を用いた蛋白の測
定方法を提供するものである。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】上述のように、本発明の抗体は、ＳＡＴ遺
伝子のエクソン６によりコードされるポリペプチドの少
なくとも一部を免疫原とした抗体である。後述の実施例
に示すように本発明の好ましい態様の抗体は、ＳＴＡ遺
伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の
うちアミノ酸番号１７３〜１８８から成るペプチドＥＤ
１またはアミノ酸番号２４５〜２５４から成るペプチド
ＥＤ２を免疫原とする。ＥＤ１はＳＲＳＳＬＤＬＳＹＹ
ＰＴＳＳＳＴの１６残基からなるペプチドであり、ＥＤ
２はＦＭＱＡＥＥＧＮＰＦの１０残基からなるペプチド
である。
伝子のエクソン６によりコードされるポリペプチドの少
なくとも一部を免疫原とした抗体である。後述の実施例
に示すように本発明の好ましい態様の抗体は、ＳＴＡ遺
伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の
うちアミノ酸番号１７３〜１８８から成るペプチドＥＤ
１またはアミノ酸番号２４５〜２５４から成るペプチド
ＥＤ２を免疫原とする。ＥＤ１はＳＲＳＳＬＤＬＳＹＹ
ＰＴＳＳＳＴの１６残基からなるペプチドであり、ＥＤ
２はＦＭＱＡＥＥＧＮＰＦの１０残基からなるペプチド
である。
【００１０】尚、本明細書中では、アミノ酸を表すのに
表１に示す１文字または３文字の略号を用いる。
表１に示す１文字または３文字の略号を用いる。
【００１１】
【表１】
【００１２】本発明の抗体を作成するにはＳＴＡ遺伝子
のエクソン６がコードするポリペプチド全体を免疫原と
するか、またはその一部をペプチド合成し、これを免疫
原として抗体を作成する。免疫原として用いる程大量に
蛋白質を精製したり合成したりするのは困難であるの
で、ＳＴＡ遺伝子のアミノ酸配列を基にして、抗原性が
得られる程度の長さのペプチドを合成し、免疫原として
用いるのが好ましい。免疫原とする合成ペプチドは、Ｂ
ＳＡやＫＬＨ等のキャリアー蛋白と結合させるために、
Ｎ末端側にＣｙｓ等を加えておくとよい。
のエクソン６がコードするポリペプチド全体を免疫原と
するか、またはその一部をペプチド合成し、これを免疫
原として抗体を作成する。免疫原として用いる程大量に
蛋白質を精製したり合成したりするのは困難であるの
で、ＳＴＡ遺伝子のアミノ酸配列を基にして、抗原性が
得られる程度の長さのペプチドを合成し、免疫原として
用いるのが好ましい。免疫原とする合成ペプチドは、Ｂ
ＳＡやＫＬＨ等のキャリアー蛋白と結合させるために、
Ｎ末端側にＣｙｓ等を加えておくとよい。
【００１３】本発明の抗体はポリクローナル抗体であっ
てもモノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナ
ル抗体の場合は、ウサギ、モルモット、マウス等の免疫
動物に抗原を免疫する。免疫は常法に従っておこなうこ
とができ、抗原は単独で、またはアジュバンドと共に免
疫動物に投与する。免疫後は、抗体価の上昇を確認して
血清を採取するが、必要に応じて追加免疫を行うとよ
い。
てもモノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナ
ル抗体の場合は、ウサギ、モルモット、マウス等の免疫
動物に抗原を免疫する。免疫は常法に従っておこなうこ
とができ、抗原は単独で、またはアジュバンドと共に免
疫動物に投与する。免疫後は、抗体価の上昇を確認して
血清を採取するが、必要に応じて追加免疫を行うとよ
い。
【００１４】またモノクローナル抗体の場合は、上述の
ようにして抗原を免疫した動物の脾臓細胞等のような抗
体産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、
ポリエチレングリコール等のような融合剤で融合してハ
イブリドーマを作製する。次いでハイブリドーマをＨＡ
Ｔ培地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等
の適当な方法でモノクローナル化して培養する。この培
養上清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分
析し、目的とする抗体を産生しているクローンを選択す
る。これらのモノクローナル抗体作製の手法は、公知の
方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Nature 256
495 1975 ）、シェーラー（Nature 285446 1980 ）等
の方法により行うことができる。また上述の手法により
作製したモノクローナル抗体は、培養上清から、塩折、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラ
フィー等の分析・精製手段により回収することができ
る。
ようにして抗原を免疫した動物の脾臓細胞等のような抗
体産生細胞と、ミエローマ細胞のような腫瘍細胞とを、
ポリエチレングリコール等のような融合剤で融合してハ
イブリドーマを作製する。次いでハイブリドーマをＨＡ
Ｔ培地のような選択培地を用いて選択し、限界希釈法等
の適当な方法でモノクローナル化して培養する。この培
養上清を酵素免疫測定法のような適当な免疫測定法で分
析し、目的とする抗体を産生しているクローンを選択す
る。これらのモノクローナル抗体作製の手法は、公知の
方法、例えば、ケーラーとミルシュタイン（Nature 256
495 1975 ）、シェーラー（Nature 285446 1980 ）等
の方法により行うことができる。また上述の手法により
作製したモノクローナル抗体は、培養上清から、塩折、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラ
フィー等の分析・精製手段により回収することができ
る。
【００１５】本発明の抗体を用いる蛋白質の測定方法と
しては、免疫組織染色法、ウエスタンブロッティング
法、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ
等の該抗体の反応性を応用する測定方法を意味する。
しては、免疫組織染色法、ウエスタンブロッティング
法、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ
等の該抗体の反応性を応用する測定方法を意味する。
【００１６】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。
細に説明する。
【００１７】実施例１ ＥＤ−１及びＥＤ−２の合成 免疫原とするにあたり担体蛋白と結合させるためＮ−末
端側にＣｙｓを加えた配列で、ペプチドＥＤ−１（ＣＳ
ＲＳＳＬＤＬＳＹＹＰＴＳＳＳＴ：Cys-Emerin１７３−
１８８）及びペプチドＥＤ−２（ＣＦＭＱＡＥＥＧＮＰ
Ｆ：Cys-Emerin２４５−２５４）を、合成した。
端側にＣｙｓを加えた配列で、ペプチドＥＤ−１（ＣＳ
ＲＳＳＬＤＬＳＹＹＰＴＳＳＳＴ：Cys-Emerin１７３−
１８８）及びペプチドＥＤ−２（ＣＦＭＱＡＥＥＧＮＰ
Ｆ：Cys-Emerin２４５−２５４）を、合成した。
【００１８】ペプチドはアプライドバイオシステムズ４
３１Ａペプチド合成機（パーキンエルマー社製、千葉県
浦安市）により合成した。アミノ酸はすべてＬ体を用い
た。各アミノ酸のα- アミノ基はＦｍｏｃ基（9-Fluore
nylmethoxycarbonyl）で保護し（Int. J. Peptide Prot
ein Res., 35, 1990, 161-214 ）、アミノ酸側鎖官能基
の保護には以下のような保護基を使用した。Ｃｙｓのβ
−スルフヒドリル基とＡｓｎのβ−カルボキサミド基は
Ｔｒｔ基（Triphenylmethyl ）、Ａｓｐのβ−カルボキ
シル基、Ｇｌｕのγ−カルボキシル基、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
のβ−水酸基及びＴｙｒのフェノール性水酸基は全てｔ
−Ｂｕ基（tert-Butyl）、Ａｒｇのグアニジノ基はＰＭ
Ｃ基（2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6- sulfonyl）と
した。
３１Ａペプチド合成機（パーキンエルマー社製、千葉県
浦安市）により合成した。アミノ酸はすべてＬ体を用い
た。各アミノ酸のα- アミノ基はＦｍｏｃ基（9-Fluore
nylmethoxycarbonyl）で保護し（Int. J. Peptide Prot
ein Res., 35, 1990, 161-214 ）、アミノ酸側鎖官能基
の保護には以下のような保護基を使用した。Ｃｙｓのβ
−スルフヒドリル基とＡｓｎのβ−カルボキサミド基は
Ｔｒｔ基（Triphenylmethyl ）、Ａｓｐのβ−カルボキ
シル基、Ｇｌｕのγ−カルボキシル基、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
のβ−水酸基及びＴｙｒのフェノール性水酸基は全てｔ
−Ｂｕ基（tert-Butyl）、Ａｒｇのグアニジノ基はＰＭ
Ｃ基（2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6- sulfonyl）と
した。
【００１９】ペプチド合成を開始するための固相担体
は、ＥＤ−１についてはあらかじめ上記保護基で保護さ
れたＴｈｒが導入された担体であるＨＭＰ−トレオニン
（パーキンエルマー社）を用い、ＥＤ−２についてはＨ
ＭＰ−レジン（パーキンエルマー社）を用いて、合成の
最初にＦｍｏｃ−Ｐｈｅを、４３１Ａ合成機に標準で添
付されている合成プログラムであるローディングサイク
ルにより導入した。
は、ＥＤ−１についてはあらかじめ上記保護基で保護さ
れたＴｈｒが導入された担体であるＨＭＰ−トレオニン
（パーキンエルマー社）を用い、ＥＤ−２についてはＨ
ＭＰ−レジン（パーキンエルマー社）を用いて、合成の
最初にＦｍｏｃ−Ｐｈｅを、４３１Ａ合成機に標準で添
付されている合成プログラムであるローディングサイク
ルにより導入した。
【００２０】ペプチド鎖の延長は４３１Ａ合成機の標準
的な方法であるＦｍｏｃ／ＨＯＢｔ／ＮＭＰ法で行っ
た。両ペプチドとも０．２５ｍｍｏｌのスケールで合成
を開始し、得られた保護基を含むペプチド担体は、ＥＤ
−１で９９７．７ｍｇ（収率９６％）、ＥＤ−２で５５
５．９ｍｇ（収率７７％）であった。
的な方法であるＦｍｏｃ／ＨＯＢｔ／ＮＭＰ法で行っ
た。両ペプチドとも０．２５ｍｍｏｌのスケールで合成
を開始し、得られた保護基を含むペプチド担体は、ＥＤ
−１で９９７．７ｍｇ（収率９６％）、ＥＤ−２で５５
５．９ｍｇ（収率７７％）であった。
【００２１】上記担体を添加剤を含むトリフルオロ酢酸
（トリフルオロ酢酸１０ｍｌ、水０．５ｍｌ、フェノー
ル０．４ｇ、チオアニソール０．５ｍｌ、エタンジチオ
ール０．２５ｍｌ）で室温で９０から１２０分処理し
て、遊離のペプチド鎖を取り出し、エーテルで沈殿さ
せ、濾取し、水に溶解して凍結乾燥し粗ペプチドを得
た。収量はＥＤ−１担体３０１ｍｇから粗ＥＤ−１が１
４４．５ｍｇ、ＥＤ−２担体２０４ｍｇから粗ＥＤ−２
が７０．８ｍｇであった。
（トリフルオロ酢酸１０ｍｌ、水０．５ｍｌ、フェノー
ル０．４ｇ、チオアニソール０．５ｍｌ、エタンジチオ
ール０．２５ｍｌ）で室温で９０から１２０分処理し
て、遊離のペプチド鎖を取り出し、エーテルで沈殿さ
せ、濾取し、水に溶解して凍結乾燥し粗ペプチドを得
た。収量はＥＤ−１担体３０１ｍｇから粗ＥＤ−１が１
４４．５ｍｇ、ＥＤ−２担体２０４ｍｇから粗ＥＤ−２
が７０．８ｍｇであった。
【００２２】粗ペプチドの精製は逆相高速液体クロマト
グラフで行った。カラムはShodex Asahipack ODP-90
（20 mmID x 250 mmL 、昭和電工 (株) ）を用い、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む水に対して、ＥＤ−１は
０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの混合
比を１５から２５％まで、ＥＤ−２は２０から３０％ま
で徐々に上昇させる直線濃度勾配により溶出し、２２０
ｎｍの紫外吸収により検出される主要部分を集めて凍結
乾燥した。収量は４９．７ｍｇの粗ＥＤ−１から１４．
３６ｍｇ、３２。３ｍｇの粗ＥＤ−２から１９．８２ｍ
ｇであった。
グラフで行った。カラムはShodex Asahipack ODP-90
（20 mmID x 250 mmL 、昭和電工 (株) ）を用い、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む水に対して、ＥＤ−１は
０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの混合
比を１５から２５％まで、ＥＤ−２は２０から３０％ま
で徐々に上昇させる直線濃度勾配により溶出し、２２０
ｎｍの紫外吸収により検出される主要部分を集めて凍結
乾燥した。収量は４９．７ｍｇの粗ＥＤ−１から１４．
３６ｍｇ、３２。３ｍｇの粗ＥＤ−２から１９．８２ｍ
ｇであった。
【００２３】実施例２ 合成ペプチドの分析 実施例１で合成したペプチドの純度を確認するために逆
相高速液体クロマトグラフで分析した。カラムはYMC-pa
ck ODS-AP AP-302（4.6 mmID x 150 mmL、（株）ワイエ
ムシイ）を用い、ＥＤ−１は０．１％トリフルオロ酢酸
を含む水に対して０．０８％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの混合比を１８から２３％、ＥＤ−２は１
０から６０％まで徐々に上昇させる直線濃度勾配により
溶出し、２２０ｎｍの紫外吸収により検出した。ＥＤ−
１はリテンションタイム８．６３、ＥＤ−２はリテンシ
ョンタイム１０．４８５の部分にワンピークを示す結果
であった。
相高速液体クロマトグラフで分析した。カラムはYMC-pa
ck ODS-AP AP-302（4.6 mmID x 150 mmL、（株）ワイエ
ムシイ）を用い、ＥＤ−１は０．１％トリフルオロ酢酸
を含む水に対して０．０８％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルの混合比を１８から２３％、ＥＤ−２は１
０から６０％まで徐々に上昇させる直線濃度勾配により
溶出し、２２０ｎｍの紫外吸収により検出した。ＥＤ−
１はリテンションタイム８．６３、ＥＤ−２はリテンシ
ョンタイム１０．４８５の部分にワンピークを示す結果
であった。
【００２４】また、ペプチドの構造の確認のためにペプ
チドを塩酸で加水分解しアミノ酸分析を行った。加水分
解はペプチド２００μｇを６Ｎ塩酸４００μｌに溶解
し、試験管に入れ、減圧下に脱気、封管し、１１０℃の
ヒートブロック中で２４時間行った。アミノ酸分析は日
本電子製ＪＬＣ−３００全自動アミノ酸分析計で、ニン
ヒドリン法により行った。結果を表２に示す。
チドを塩酸で加水分解しアミノ酸分析を行った。加水分
解はペプチド２００μｇを６Ｎ塩酸４００μｌに溶解
し、試験管に入れ、減圧下に脱気、封管し、１１０℃の
ヒートブロック中で２４時間行った。アミノ酸分析は日
本電子製ＪＬＣ−３００全自動アミノ酸分析計で、ニン
ヒドリン法により行った。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】実施例３ 免疫のための担体蛋白との結合 実施例１で精製したペプチドを二価性架橋剤で担体蛋白
と結合した。担体蛋白としてＫＬＨ（Keyhole Limpet H
emocyanin 、CALBIOCHEM、La Jolla、California、USA
）、二価性架橋剤としてＧＭＢＳ（N-Succinimidyl 4-
maleimidobutyrate、（株) 同人化学研究所）を用い
た。
と結合した。担体蛋白としてＫＬＨ（Keyhole Limpet H
emocyanin 、CALBIOCHEM、La Jolla、California、USA
）、二価性架橋剤としてＧＭＢＳ（N-Succinimidyl 4-
maleimidobutyrate、（株) 同人化学研究所）を用い
た。
【００２７】ＫＬＨ１５ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）１．５ｍｌに溶解し、ＤＭＦ（ジメチル
ホルムアミド）５００μｌに溶解したＧＭＢＳ５ｍｇを
加え、室温で１時間撹拌した。反応液を１ｍＭのＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
したＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオテク
(株)）２本に均等にかけ、同緩衝液で溶出した。カラム
からの溶出液の初めの２．５ｍｌは廃棄し、それに続く
２．０ｍｌを集めた。得られたマレイミド化ＫＬＨ溶液
に、同緩衝液１ｍｌに溶解したペプチド８ｍｇを加え、
室温で３時間撹拌した。反応液を透析チューブに移し、
ＰＢＳ（phosphate buffered saline 、ICN Biochemica
ls, Inc., Ohio, USA ）に対し４℃で一夜透析し、約７
ｍｌのペプチド／ＫＬＨ複合体溶液を得た。この溶液の
蛋白濃度はBCA Protein Assay Reagent（PIERCE、Illin
ois, USA ）により定量し、２．８ｍｇ／ｍｌであっ
た。
（ｐＨ７．５）１．５ｍｌに溶解し、ＤＭＦ（ジメチル
ホルムアミド）５００μｌに溶解したＧＭＢＳ５ｍｇを
加え、室温で１時間撹拌した。反応液を１ｍＭのＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
したＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオテク
(株)）２本に均等にかけ、同緩衝液で溶出した。カラム
からの溶出液の初めの２．５ｍｌは廃棄し、それに続く
２．０ｍｌを集めた。得られたマレイミド化ＫＬＨ溶液
に、同緩衝液１ｍｌに溶解したペプチド８ｍｇを加え、
室温で３時間撹拌した。反応液を透析チューブに移し、
ＰＢＳ（phosphate buffered saline 、ICN Biochemica
ls, Inc., Ohio, USA ）に対し４℃で一夜透析し、約７
ｍｌのペプチド／ＫＬＨ複合体溶液を得た。この溶液の
蛋白濃度はBCA Protein Assay Reagent（PIERCE、Illin
ois, USA ）により定量し、２．８ｍｇ／ｍｌであっ
た。
【００２８】実施例４ 抗ＥＤ−１及び抗ＥＤ−２抗血
清の作製 実施例３で調製したＥＤ−１−ＫＬＨ及びＥＤ−２−Ｋ
ＬＨをそれぞれ５００μｇづつ、フロイントの完全アジ
ュバントと共にオスのニュージーランドウサギ２匹の背
に投与した。１週間間隔で追加免疫をしながら抗体価を
調べ、６回追加免疫を行った後、全採血した。採血した
血液から遠心分離にて血清を分離し、抗血清１及び２を
得た。
清の作製 実施例３で調製したＥＤ−１−ＫＬＨ及びＥＤ−２−Ｋ
ＬＨをそれぞれ５００μｇづつ、フロイントの完全アジ
ュバントと共にオスのニュージーランドウサギ２匹の背
に投与した。１週間間隔で追加免疫をしながら抗体価を
調べ、６回追加免疫を行った後、全採血した。採血した
血液から遠心分離にて血清を分離し、抗血清１及び２を
得た。
【００２９】実施例５ 抗血清の反応性試験 ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で実施例１
で合成したＥＤ−１及びＥＤ−２を１μｇ／ｍｌになる
ように希釈し、９６穴マイクロプレートにそれぞれ５０
μｌづつ分注して４℃一晩放置して抗原固定化プレート
を調製した。非結合のＥＤ−１及びＥＤ−２を除去後、
０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＴ）で洗浄
し、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３７℃１時間放置してブロ
ッキングして、抗原固相化プレートとした。これに１×
１０2 〜１×１０5 に希釈した実施例４で作製した各抗
血清を５０μｌづつ加え、３７℃１時間反応させた。Ｐ
ＢＳで洗浄後、１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ウサギ免疫グロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０
μｌ加え、３７℃１時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄
後、ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）
を１００μｌ加え、３７℃３０分反応後、得られた吸光
度を測定した。結果を図１に示す。ＥＤ−１を免疫原と
した抗血清を抗ＥＤ−１抗血清、ＥＤ−２を免疫原とし
た抗血清を抗ＥＤ−２抗血清と名付けた。
で合成したＥＤ−１及びＥＤ−２を１μｇ／ｍｌになる
ように希釈し、９６穴マイクロプレートにそれぞれ５０
μｌづつ分注して４℃一晩放置して抗原固定化プレート
を調製した。非結合のＥＤ−１及びＥＤ−２を除去後、
０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＴ）で洗浄
し、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３７℃１時間放置してブロ
ッキングして、抗原固相化プレートとした。これに１×
１０2 〜１×１０5 に希釈した実施例４で作製した各抗
血清を５０μｌづつ加え、３７℃１時間反応させた。Ｐ
ＢＳで洗浄後、１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ウサギ免疫グロブリン抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０
μｌ加え、３７℃１時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄
後、ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ−過酸化水素系）
を１００μｌ加え、３７℃３０分反応後、得られた吸光
度を測定した。結果を図１に示す。ＥＤ−１を免疫原と
した抗血清を抗ＥＤ−１抗血清、ＥＤ−２を免疫原とし
た抗血清を抗ＥＤ−２抗血清と名付けた。
【００３０】実施例６ 組織染色 Nature 333, 861-863 (1988)とJ. Neurolo. Sci. 101,
148-156 (1991)に記載された方法により、実施例４で作
製した各抗血清を用いてゼラチンカバースライド上で、
各種疾患の６μｍの筋肉組織凍結切片を間接免疫蛍光法
で染色した。結果を表３に示す。
148-156 (1991)に記載された方法により、実施例４で作
製した各抗血清を用いてゼラチンカバースライド上で、
各種疾患の６μｍの筋肉組織凍結切片を間接免疫蛍光法
で染色した。結果を表３に示す。
【００３１】抗ＥＤ−１抗血清は、筋線維核膜との反応
において、他の全ての筋肉組織とは反応したが、ＥＤＭ
Ｄ患者組織とは反応しなかった。また、抗ＥＤ−１抗血
清は、筋線維膜表面との反応において、ＤＭＤを除いて
全ての筋肉組織の膜表面と反応した。正常筋肉、肢帯型
筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、
筋緊張性型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロ
フィー、多発性筋炎、運動ニューロン疾患及びパーキソ
ン病では筋線維核膜と筋線維膜表面との両方に抗ＥＤ−
１血清が反応した。抗ＥＤ−２抗血清は、筋線維核膜と
の反応において、他の全ての筋肉組織とは反応したが、
ＥＤＭＤ患者組織とは反応しなかった。また、筋線維膜
表面との反応を調べたが、抗ＥＤ−２抗血清はどのサン
プルとも反応しなかった。
において、他の全ての筋肉組織とは反応したが、ＥＤＭ
Ｄ患者組織とは反応しなかった。また、抗ＥＤ−１抗血
清は、筋線維膜表面との反応において、ＤＭＤを除いて
全ての筋肉組織の膜表面と反応した。正常筋肉、肢帯型
筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、
筋緊張性型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロ
フィー、多発性筋炎、運動ニューロン疾患及びパーキソ
ン病では筋線維核膜と筋線維膜表面との両方に抗ＥＤ−
１血清が反応した。抗ＥＤ−２抗血清は、筋線維核膜と
の反応において、他の全ての筋肉組織とは反応したが、
ＥＤＭＤ患者組織とは反応しなかった。また、筋線維膜
表面との反応を調べたが、抗ＥＤ−２抗血清はどのサン
プルとも反応しなかった。
【００３２】
【表３】
【００３３】実施例７ 細胞の分画 正常ヒト及びＥＤＭＤ患者の瞬間凍結筋肉サンプル０．
３ｇに、０．３２Ｍシュークロース、３ｍＭ塩化マグネ
シウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．６を
５倍量加えてホモゲナイズした。J. Cell Bilo. 91, 29
3s-299s (1981)に記載された方法に基づき、速度沈殿法
とシュークロースの密度勾配沈殿法にて核、ミトコンド
リア、マイクロゾーム、可溶性細胞質をそれぞれ分画し
た。用いた試薬には全て１０μｇ／ｍｌのロイペプチ
ン、１０μｇ／ｍｌのＥ−６４−ｃ、１００ｍＭのＥＤ
ＴＡ、２ｍＭのＰＭＳＦを加えた。
３ｇに、０．３２Ｍシュークロース、３ｍＭ塩化マグネ
シウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．６を
５倍量加えてホモゲナイズした。J. Cell Bilo. 91, 29
3s-299s (1981)に記載された方法に基づき、速度沈殿法
とシュークロースの密度勾配沈殿法にて核、ミトコンド
リア、マイクロゾーム、可溶性細胞質をそれぞれ分画し
た。用いた試薬には全て１０μｇ／ｍｌのロイペプチ
ン、１０μｇ／ｍｌのＥ−６４−ｃ、１００ｍＭのＥＤ
ＴＡ、２ｍＭのＰＭＳＦを加えた。
【００３４】実施例８ イムノブロッティング 実施例７で調製した分画前のホモゲナイズサンプルと分
画後の各細胞分画を、Biochem. Biophys. Res. Com. p2
02, 577-585 (1994)に記載された方法でイムノブロッテ
ィングした。分子量マーカーには、アルブミン（６７ｋ
ｄ）、オブアルブミン（４３ｋｄ）、カルボニックアン
ヒドラーゼ（３０ｋｄ）を用いた。各細胞分画、正常骨
格筋及びＥＤＭＤ患者骨格筋サンプルと各抗血清とのイ
ムノブロッティング結果を図２に示した。抗ＥＤ−１抗
血清では、核でエメリンの分子量に相当する３４ｋｄ部
分にバンドが見られた。また、核、ミトコンドリア、全
ホモゲナイズサンプルで５０ｋｄ部分に、マイクロゾー
ムで７８ｋｄ部分にバンドが見られた。尚、可溶性細胞
質と全ホモゲナイズサンプルで６７ｋｄ部分にバンドが
出ているが、サンプルを抗ヒトアルブミン血清で予備吸
収したところ、６７ｋｄ部分のバンドは吸収された。正
常骨格筋（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では抗ＥＤ−１抗血清及び
抗ＥＤ−２抗血清共に、３４ｋｄ部分でバンドが見られ
たが、ＥＤＭＤ患者骨格筋では反応は見られなかった。
画後の各細胞分画を、Biochem. Biophys. Res. Com. p2
02, 577-585 (1994)に記載された方法でイムノブロッテ
ィングした。分子量マーカーには、アルブミン（６７ｋ
ｄ）、オブアルブミン（４３ｋｄ）、カルボニックアン
ヒドラーゼ（３０ｋｄ）を用いた。各細胞分画、正常骨
格筋及びＥＤＭＤ患者骨格筋サンプルと各抗血清とのイ
ムノブロッティング結果を図２に示した。抗ＥＤ−１抗
血清では、核でエメリンの分子量に相当する３４ｋｄ部
分にバンドが見られた。また、核、ミトコンドリア、全
ホモゲナイズサンプルで５０ｋｄ部分に、マイクロゾー
ムで７８ｋｄ部分にバンドが見られた。尚、可溶性細胞
質と全ホモゲナイズサンプルで６７ｋｄ部分にバンドが
出ているが、サンプルを抗ヒトアルブミン血清で予備吸
収したところ、６７ｋｄ部分のバンドは吸収された。正
常骨格筋（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では抗ＥＤ−１抗血清及び
抗ＥＤ−２抗血清共に、３４ｋｄ部分でバンドが見られ
たが、ＥＤＭＤ患者骨格筋では反応は見られなかった。
【００３５】筋肉以外の組織ホモゲナイズサンプルと各
抗血清とのイムノブロッティング結果を図３に示した。
脾臓、腎臓、肺臓、副腎及びコントロールとして骨格筋
をサンプルとして用いた。抗ＥＤ−１抗血清及び抗ＥＤ
−２抗血清共に、全てのサンプルで３４ｋｄ部分にバン
ドが見られたが、５０ｋｄ部分は、抗ＥＤ−１抗血清だ
けがバンドを示した。
抗血清とのイムノブロッティング結果を図３に示した。
脾臓、腎臓、肺臓、副腎及びコントロールとして骨格筋
をサンプルとして用いた。抗ＥＤ−１抗血清及び抗ＥＤ
−２抗血清共に、全てのサンプルで３４ｋｄ部分にバン
ドが見られたが、５０ｋｄ部分は、抗ＥＤ−１抗血清だ
けがバンドを示した。
【００３６】
【発明の効果】本発明により、ＥＤＭＤ及びその他のＸ
染色体劣性遺伝に伴う各種疾患の発症機序解明及びこれ
ら疾患の鑑別診断に用いることのできる抗体及び該抗体
を用いた蛋白の測定方法を提供することができるように
なった。
染色体劣性遺伝に伴う各種疾患の発症機序解明及びこれ
ら疾患の鑑別診断に用いることのできる抗体及び該抗体
を用いた蛋白の測定方法を提供することができるように
なった。
【図１】抗ＥＤ−１、抗ＥＤ−２の反応性を示した図で
ある。
ある。
【図２】各種細胞分画、正常骨格筋、ＥＤＭＤ患者骨格
筋と抗ＥＤ−１抗血清及び抗ＥＤ−２抗血清との反応性
を調べたイムノブロッティング結果を示す図である。
筋と抗ＥＤ−１抗血清及び抗ＥＤ−２抗血清との反応性
を調べたイムノブロッティング結果を示す図である。
【図３】各種正常組織細胞と抗ＥＤ−１、抗血清及び抗
ＥＤ−２抗血清との反応性を調べたイムノブロッティン
グ結果を示す図である。
ＥＤ−２抗血清との反応性を調べたイムノブロッティン
グ結果を示す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 ＳＴＡ遺伝子のエクソン６によりコード
されるポリペプチドのうち少なくとも一部を免疫原とし
た抗体。 - 【請求項２】 アミノ酸配列ＳＲＳＳＬＤＬＳＹＹＰＴ
ＳＳＳＴからなるペプチドを免疫原とした抗体。 - 【請求項３】 アミノ酸配列ＦＭＱＡＥＥＧＮＰＦから
なるペプチドを免疫原とした抗体。 - 【請求項４】 エメリンと反応する請求項１ないし３に
記載の抗体。 - 【請求項５】 請求項１ないし４に記載の抗体を用いた
蛋白の免疫測定方法。 - 【請求項６】 請求項１ないし４に記載の抗体を用いた
エメリンの免疫測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4221096A JPH09210996A (ja) | 1996-02-06 | 1996-02-06 | ペプチドと反応する抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4221096A JPH09210996A (ja) | 1996-02-06 | 1996-02-06 | ペプチドと反応する抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09210996A true JPH09210996A (ja) | 1997-08-15 |
Family
ID=12629668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4221096A Pending JPH09210996A (ja) | 1996-02-06 | 1996-02-06 | ペプチドと反応する抗体及び該抗体を用いた蛋白の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09210996A (ja) |
-
1996
- 1996-02-06 JP JP4221096A patent/JPH09210996A/ja active Pending
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