JPH07309900A - 抗ヒトプロカテプシンｂモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いたヒトプロカテプシンｂ又はヒトカテプシンｂの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗ヒトプロカテプシンＢモノクローナル抗体
を提供し、それを用いてヒト（プロ）カテプシンＢを測
定する方法を提供すること。 【構成】 ヒトプロカテプシンＢ蛋白を特異的に認識す
るモノクロ−ナル抗体を提供した。また、上記本発明の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供し
た。さらに、上記本発明のモノクローナル抗体又はその
抗原結合性断片を用いて免疫測定によりヒトプロカテプ
シンＢ又はヒトカテプシンＢを検出又は定量する方法を
提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗ヒトプロカテプシン
Ｂモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ
及びそれを用いたヒトプロカテプシンＢ又はヒトカテプ
シンＢ（以下、「プロカテプシンＢ又はカテプシンＢ」
を「（プロ）カテプシンＢ」と表示することがある）の
測定方法に関する。本発明は、各種癌疾患やアルツハイ
マー型痴呆症等の診断に有用である。

【０００２】

【従来の技術】リソゾ−ムは、多種多様のプロテア−ゼ
を含有し、細胞内及び外来蛋白質の分解に関与してい
る。カテプシンＢは、リソゾ−ムのシステインプロテア
−ゼ群の１種である。結直腸癌組織中において、カテプ
シンＢｍＲＮＡ量が、正常組織と比較して増加している
(Cancer Res. 51, 4, 1137 (1991))ことや、カテプシン
Ｂ活性が増大していること(Int.J.Cancer 43, 478 (198
9)) が報告されている。また、ヒト肺腺癌組織で、正常
組織と比較してカテプシンＢが多く存在していること
が、免疫組織染色によって証明されている（日本癌学会
抄録 p1241 (1992) ）。さらに、アルツハイマ−型痴呆
症の原因物質と言われているβ−アミロイド蛋白質の前
駆体であるＡＰＰの正常な代謝に、カテプシンＢが関与
していることが報告されている。以上のような背景によ
り、ヒト検体中の（プロ）カテプシンＢを特異的に検出
する方法が望まれている。

【０００３】ヒトプロカテプシンＢC ＤＮＡ塩基配列が
Chan S.J. らにより報告（Proc. Natl. Acad. Sci. 83,
7721 (1986) ）されている。ヒトカテプシンＢに対する
ポリクロ−ナル抗体は既に取得されているが、ヒト（プ
ロ）カテプシンＢに対するモノクローナル抗体は得られ
ていない。また、ヒトプロカテプシンＢ様蛋白質に対す
るモノクロ−ナル抗体が既に取得されている（ＷＯ ９
１０１３７８）が、このモノクロ−ナル抗体はヒト（プ
ロ）カテプシンＢとは反応しない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、抗ヒトプロカテプシンＢモノクローナル抗体を提供
し、それを用いてヒト（プロ）カテプシンＢを測定する
方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトプロカテ
プシンＢ蛋白を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体を
提供する。また、本発明は、上記本発明のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。さらに、
本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体又はその抗
原結合性断片を用いて免疫測定によりヒトプロカテプシ
ンＢ又はヒトカテプシンＢを検出又は定量する方法を提
供する。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトプロ
カテプシンＢを特異的に認識する。後述の実施例におい
ては、遺伝子工学的に調製されたヒトプロカテプシンＢ
を免疫原として用いてモノクローナル抗体ＲＢ１及びＲ
Ｂ４が得られた。また、ヒトプロカテプシンＢのプロ部
の１６番から２９番の配列Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕのアミノ酸配列を
有するペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合
したものを免疫原として用いてモノクローナル抗体ＳＢ
Ｐ２−２が得られた。従って、モノクローナル抗体ＳＢ
Ｐ２−２は上記プロ部のアミノ酸配列を特異的に認識す
るものであり、プロ部を有さないヒトカテプシンＢは認
識しない。また、ヒトプロカテプシンＢマチュア部分の
アミノ酸配列のうち、８０番より９２番の配列Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎのアミ
ノ酸配列を有するペプチドをＢＳＡに結合したものを免
疫原として用いてモノクローナル抗体ＳＢＭ１−１が得
られた。従って、モノクローナル抗体ＳＢＭ１−１は上
記マチュア部のアミノ酸配列を特異的に認識するもので
あり、当然のことながらヒトカテプシンＢを特異的に認
識するものである。同様に、ヒトプロカテプシンＢのア
ミノ酸配列のうち、２９５番より３０９番目のアミノ酸
配列であるＬｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−
Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅのアミノ酸配列を有する
ペプチドをＢＳＡに結合したものを免疫原として用いて
モノクローナル抗体ＳＢＭ２−２が得られた。従って、
モノクローナル抗体ＳＢＭ２−２は上記マチュア部のア
ミノ酸配列を特異的に認識するものであり、当然のこと
ながらヒトカテプシンＢを特異的に認識するものであ
る。これらのモノクローナル抗体の免疫グロブリンサブ
クラスは決定されており、下記実施例に記載されてい
る。また、これらのモノクローナル抗体のうち、ＳＢＭ
１−１、ＳＭＢ２−２、ＲＢ１及びＲＢ４は生命工学工
業技術研究所に寄託されており、その受託番号は、それ
ぞれＦＥＲＭ Ｐ−１３６８３、ＦＥＲＭ Ｐ−１３６
８２、ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５及びＦＥＲＭ Ｐ−１
３６８４である。

【０００８】もっとも、本発明のモノクローナル抗体
は、実施例で得られたモノクローナル抗体に限定される
ものではなく、ヒト（プロ）カテプシンＢ内の他の領域
をエピトープとするものであってもよい。

【０００９】本発明のモノクローナル抗体を調製するた
めの免疫原として用いることができるヒトプロカテプシ
ンＢは、以下の方法で遺伝子工学的に調製することがで
きる。なお、以下の方法はあくまで一例であり、ヒトプ
ロカテプシンＢの遺伝子工学的調製方法は下記のものに
限定されるわけではない。

【００１０】(1) ヒトｃＤＮＡ まず、ヒト組織（腎臓，肝臓，心臓，胎盤，膵臓，大腸
等）またはヒト培養細胞からｍＲＮＡを抽出後、逆転写
酵素にてｃＤＮＡを合成する。或いは、市販のｃＤＮＡ
ライブラリー（例えばＣＬＯＮＴＥＣＨ社製，腎臓，肝
臓，心臓，胎盤，膵臓，大腸等または種々のヒト培養細
胞のλｇｔ１０ライブラリー）を入手する。

【００１１】（２）ヒトプロカテプシンＢ−ｃＤＮＡの
塩基配列 Ｃｈａｎらにより決定されている(Chan,S.J.ら, Proc.N
atl.Acad.Sci, 83巻,7721貢,1986 年) 。なお、配列表
の配列番号１として、ヒトプロカテプシンＢの全塩基配
列及び推定アミノ酸配列が記載されている。なお、配列
番号１で示される配列のうち、プロ部は１番のメチオニ
ンから７９番のリジンまでであり、マチュア部は８０番
のロイシンから３３９番のイソロイシンまでである。

【００１２】（３）遺伝子増幅反応 (ポリメラーゼチェ
インリアクション、ＰＣＲ） プライマー ｃＤＮＡ上の任意の２カ所を選び、遺伝子増幅用のプラ
イマーとして２０〜３０塩基のオリゴヌクレオチドを通
常のＤＮＡ合成装置（例えばアプライドバイオシステム
社製 391-02 機等）にて合成する。プライマーは、ｃＤ
ＮＡ発現用ベクターに連結しやすいように、制限酵素部
位を付加しておいても良い。

【００１３】ＰＣＲ条件 パーキンエルマーシータス社の遺伝子増幅試薬キットの
プロトコールに従うか、もしくは例えば以下の方法にて
行うことができる。 反応組成 １００μｌ ＤＮＡ ０．１〜１μｇ プライマー 各２５〜１００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ 各２００μＭ Tris-HCl(pH8.3) １０ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭ ゼラチン ０．０１％ Ｔａｑポリメラーゼ ２．５〜５単位 反応サイクル ９５℃、３０秒〜１分（変性）、３７℃〜５５℃、３０
秒〜２分（アニーリング）及び７０℃〜７４℃、１分〜
３分（伸長）のサイクルを２５〜４０サイクル繰り返
す。

【００１４】増幅したｃＤＮＡの調製 ＰＣＲで増幅したＤＮＡは、０．６〜２％アガロースゲ
ルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで検出したＤＮ
Ａのバンドを切り出し、通常の方法(Maniatis,T. et a
l, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab.NY
等) で調製する。

【００１５】（４）遺伝子発現ベクターへの連結，組換
えプラスミドの構築 発現ベクター 遺伝子工学一般に用いられているプラスミドに、遺伝子
発現のためのプロモーター，ＳＤ配列，遺伝子挿入用制
限酵素切断部位，ターミネーター等の配列を含む発現ベ
クター等を用いる。これらは、市販されており、例えば
ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア社）等を利用すること
ができる。

【００１６】ｃＤＮＡの連結，組換えプラスミドの構
築 （３）で調製したＤＮＡを、制限酵素で切断した発現ベ
クターに連結する。制限酵素は多く市販されており、連
結反応は市販の酵素もしくはキット（宝酒造製，ライゲ
ーションキット等）を用いて行うことができる。次い
で、連結した組換えプラスミドは、上記連結反応溶液を
用いてコンピテントな大腸菌を形質転換し、組換えプラ
スミドを保持する大腸菌を選択することにより取得する
ことができる。これらは、通常の遺伝子操作であり、Mo
lecular Cloning (Maniatis,T. etal, Cold Spring Har
bor Lab. NY) 等に記載されている。

【００１７】（５）組換え菌の培養 組換えプラスミドを保持する大腸菌を、ＬＢ培地にて対
数増殖中期程度まで増殖させた後、使用する宿主と発現
ベクターに応じ、遺伝子発現のための誘導処理（ｔｒｃ
プロモーターの場合は、１ｍＭ ＩＰＴＧ添加）を行
い、さらに２時間程度の培養を行う。

【００１８】（６）組換えプロカテプシンＢ蛋白の分離
・精製 組換え菌を遠心分離により集菌し、超音波処理等で菌体
を破砕した後、遺伝子産物が封入体を形成する場合は、
遠心分離の後尿素による可溶化を行い、イオン交換体
（ＤＥＡＥ等）による吸脱着法，ゲルろ過法，電気泳動
法，特異的吸着担体による吸脱着法などに従い行うこと
ができる。

【００１９】上記のようにして調製されるヒトプロカテ
プシンＢを免疫原として用い、公知のハイブリドーマ法
により本発明のモノクローナル抗体を得ることができ
る。また、配列番号１で示されるヒトプロカテプシンＢ
のアミノ酸配列のうち、特定の領域の一次アミノ酸配列
を有するオリゴペプチドをＢＳＡのようなキャリアタン
パクに結合したものを免疫原として用いて本発明のモノ
クローナル抗体を得ることができる。以下、この工程に
ついて好ましい例をより詳細に説明するが、これに限定
されるものではない。

【００２０】(1) 免疫 先ず、上記免疫原を哺乳動物に免疫する。免疫される動
物は、霊長類、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサ
ギなど）、牛、羊、山羊、犬などでもよい。下記実施例
においてはマウスを用いた。なお、免疫原組成物の調製
（フロイントのアジュバントの添加）並びに免疫方法及
び回数は、周知の方法に基づき適宜行うことができ、下
記実施例に一例が記載されている。

【００２１】（２）細胞融合 ミエロ−マ細胞株は、マウス由来の細胞（例えばＮＳ−
０，ＮＳ−１，Ｐ３Ｕ１など）を用いることができる。
下記実施例ではＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４株を使用してい
る。これらのミエローマは周知であり、市販のものを用
いることができる。また、細胞融合の操作もこの分野に
おいて周知であり、下記実施例に一例が詳述されてい
る。

【００２２】（３）スクリ−ニング 公知の酵素抗体法により、ヒトプロカテプシンＢと反応
するものを選択することができる。２次抗体としては、
アルカリホスファタ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等で標識した抗免疫グロブリン
ポリクローナル抗体を好ましく用いることができる。下
記実施例では、標識物質としてペルオキシダ−ゼを使用
している。標識酵素を検出するための基質としては、
３，３−ジアミノベンチジン、２，２−アジノビス、ｏ
−ジアニシジン、４−クロロナフト−ル、４−アミノア
ンチピリン等を用いることができる。下記実施例ではｏ
−フェニレンジアミンを使用している。

【００２３】（４）クロ−ニング 限界希釈法または軟寒天法で行うことができる。下記実
施例では限界希釈法により実施している。

【００２４】（５）モノクロ−ナル抗体の生産 血清培地または無血清培地を用いたハイブリド−マの大
量培養法、もしくはマウスの腹腔に、ハイブリド−マを
接種し、マウスの腹水として得ることができる。下記実
施例では、無血清培地による大量培養法を採用してい
る。

【００２５】（６）モノクロ−ナル抗体の精製 プロテインＡ−セファロ−スアフィニティカラム、高速
液体クロマトグラフィ等で行うことができる。下記実施
例では、プロテインＧ−セファロ−スアフィニティカラ
ムを使用している。

【００２６】上記の方法により、本発明のモノクローナ
ル抗体を得ることができる。

【００２７】上述のように、本発明はまた、上記本発明
のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて
免疫測定によりヒト（プロ）カテプシンＢを検出又は定
量する方法を提供する。

【００２８】ヒト（プロ）カテプシンＢの検出又は定量
は、上記本発明のモノクローナル抗体を用いて免疫測定
により行うことができるが、その抗原結合性断片、すな
わち、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）₂ フラグメン
トを用いることもできる。

【００２９】抗原抗体反応を利用して検体中の抗原を検
出又は定量する免疫測定方法自体はこの分野において周
知であり、周知のいかなる方法をも採用することができ
る。すなわち、測定様式としては、サンドイッチ法、競
合法、凝集法等を用いることができ、また、標識として
は、酵素標識、放射標識、蛍光標識等を用いることがで
きる。さらに、下記実施例に詳述するような、ウェスタ
ンブロット法を用いることもできる。

【００３０】上記方法のうち、簡便で広く用いられてい
るサンドイッチ法について、その好ましい態様をより詳
細に説明するが、あくまでも一例であってこれに限定さ
れるものではない。

【００３１】本発明のモノクローナル抗体（第１抗体）
を適当な不溶性担体（例えばプラスチック容器）に固定
化する（以下、これを固定抗体という）。

【００３２】次に、不溶性担体と測定しようとする試薬
又は検体との非特異的吸着を避けるために、適当な物質
（例えばＢＳＡ）で不溶化担体の表面を被覆する。この
ようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性担体
を、検体と共にインキュベートする。検体は希釈したも
のであってもよく、その場合、希釈は一般にリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）で行う。このインキュベーション
の間に固定化抗体と検体中のヒト（プロ）カテプシンＢ
が結合する（検体中にもし存在すれば）。次いで、適当
な洗浄液で洗浄後、適当な標識物質（例えば酵素）で標
識した、ヒト（プロ）カテプシンＢと抗原抗体反応する
第２抗体の溶液を不溶性担体における固相抗体に結合し
たヒト（プロ）カテプシンＢと一定時間及び温度で接触
させ、第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗
った後、不溶性担体上の固相抗体とヒト（プロ）カテプ
シンＢを介して結合して存在する第２抗体に標識された
標識物質の量を測定する。かくして、その値によって検
体中のヒト（プロ）カテプシンＢを検出又は定量するこ
とができる。

【００３３】ここで使用する不溶性担体としては、例え
ばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
エステル、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高
分子物質、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこ
れらの組合せ等がある。形状も、トレイ状、球状等種々
の形状であることができる。また、標識抗体の標識物質
としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等
を使用するのが有利である。

【００３４】酵素として、ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼが、蛍光
物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート等
が、発光物質としては、イソルシノール、ルシゲニン等
が、そして放射性物質としては¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、¹⁴Ｃ、
³Ｈ等を用いることができる。しかし、これらは例示し
たものに限らず、免疫測定法に使用し得るものであれ
ば、他のものでも使用できる。

【００３５】標識酵素としてペルオキシダーゼを用いる
場合は、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ
−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸等を、標
識酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基
質としてｏ−ニトロフェニルフォスフェイト等を、標識
酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、基質
として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド等を用いることができる。

【００３６】上記本発明の方法に供される検体として
は、特に限定されないが、ヒト血清、尿、腹水、リンパ
液、骨髄液等を挙げることができる。

【００３７】また、本発明のモノクローナル抗体及びそ
の抗原結合性断片は、下記実施例に詳述するように、通
常の方法（月刊 MEDICAL TECHNOLOGY 別冊，染色法のす
べて，医歯薬出版株式会社、及び、ベクタ−社製ベクタ
ステインＡＢＣエリ−トキット）に従って免疫染色に用
いることもできる。

【００３８】本発明の方法により、ヒト（プロ）カテプ
シンＢを検出することにより、肺癌、食道癌、膵臓癌、
膀胱癌、前立腺癌、結直腸癌、腎臓癌等の癌疾患や、ア
ルツハイマー型痴呆症等の、ヒト（プロ）カテプシンＢ
がマーカーとなる各種疾病の診断を行うことができる。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００４０】実施例１ プロカテプシンＢ−ｃＤＮＡ発現系の構築 （１）プロカテプシンＢ−ｃＤＮＡの調製 プロカテプシンＢ−ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号１）
に基づき、プロカテプシンＢ蛋白をコードする領域付近
の５’側の配列２１残基と３’側の配列２１残基（配列
表における存在位置は、それぞれ 232..252 と 1339..1
359 ）を、ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステム
社製・モデル391-02）を使用し、通常の方法により合成
した。但し、５’側オリゴヌクレオチドには制限酵素 B
smI 認識部位を導入しておいた（下図配列の第８番目の
塩基：本来はＣであるがＧに変更することにより BsmI
認識配列となる）。なお、３’側オリゴヌクレオチドに
はStyI 認識部位が含まれる。 ５’側 5'-TGTTGGCGAATGCCCGGAGCA-3' ３’側 5'-CCAGGACTTGGTCTCCTTGGA-3'

【００４１】上記オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレ
オチド精製カートリッジ（アプライド・バイオシステム
社製・ＯＰＣ^TM）で精製し、ＰＣＲ用のプライマーに供
した。

【００４２】ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１
０ライブラリー，クローンテック社）を、通常の方法("
Molecular Cloning", Maniatis,T., et al, Cold Spri
ng Harbor Lab. NY)で増幅後、ＤＮＡを調製した。これ
を１μｇ，各プライマーを１００ｐｍｏｌ使用し、ＤＮ
Ａ増幅試薬キット（パーキンエルマーシータス社・Ｇｅ
ｎｅＡｍｐ（登録商標）及びＤＮＡサーマルサイクラー
（パーキンエルマーシータス社）でＰＣＲを行った。熱
変性９５℃１分，アニーリング５５℃２分，相補鎖合成
７２℃３分の一連のステップを２５サイクル繰り返した
後、反応産物を０．６％アガロースゲル電気泳動したと
ころ、１ｋｂ付近に単一のバンドが検出されたため、通
常の方法にてゲルから切り出し調製した。これを制限酵
素 BsmI,StyI で切断し、０．６％アガロースゲル電気
泳動・ゲルからの切り出しにより、プロカテプシンＢ−
ｃＤＮＡを BsmI 〜 StyI 断片として取得した。

【００４３】（２）プロカテプシンＢ−ｃＤＮＡ発現プ
ラスミドの作製 上記ｃＤＮＡ断片の両末端をＤＮＡブランチングキット
（宝酒造製）で平滑化し、制限酵素 HincII で切断した
プラスミドｐＵＣ１１８に連結した（図１）。このプラ
スミドを制限酵素 BamHI で切断，平滑化、NcoI リン
カー（１２ｍｅｒ）連結後、プロカテプシン−ｃＤＮＡ
断片をNcoI 〜 PstI 片として調製し、NcoI, PstI で
切断したプラスミドｐＫＫ２３３−２と連結後、コンピ
テントな大腸菌 JM109 に形質転換し、プロカテプシン
Ｂを含む組換えプラスミド（図２）を保持する大腸菌を
選択した。こうして得られた組換え菌を、ＬＢ培地中３
７℃で対数増殖中期（ＯＤ₆₀₀ ＝０．３）まで培養の
後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド）を最終濃度１ｍＭ添加後さらに４時間培養し
粗蛋白をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した
ところ、プロカテプシンＢ蛋白と考えられる約３８ＫＤ
ａのバンドを検出した。

【００４４】実施例２ 組換えプロカテプシンＢの製造 （１）大腸菌によるプロカテプシンＢの産生 プロカテプシンＢ発現用プラスミドを保持する大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株をＬＢ培地中で対数増殖期中〜後期まで増殖
させた。その後培地中にＩＰＴＧを１ｍＭになるように
加え、さらに４時間培養しプロカテプシンＢを産生させ
た。

【００４５】（２）プロカテプシンＢの抽出 上記培養液を遠心分離し大腸菌菌体を得る。菌体を緩衝
液Ａ（20mM Tris-HCl,pH8.0 + 5mM EDTA) に懸濁した
後、超音波破砕器（ＢＲＡＮＳＯＮ製ＳＯＮＩＦＩＥＲ
２５０）にて菌体を破砕した。この懸濁液を１，０００
ｘｇで遠心分離し、プロカテプシンＢを沈澱画分として
得た。

【００４６】（３）プロカテプシンＢの可溶化 上記沈澱画分を緩衝液Ａに懸濁した後、最終濃度８Ｍに
なるように尿素の飽和溶液を加えた。さらに１％（V/V
）になるように２−メルカプトエタノールを加えた
後、６０℃にて１〜４時間放置して沈澱を可溶化した。

【００４７】（４）プロカテプシンＢの分離 上記可溶化溶液を緩衝液Ｂ（20mM Tris-HCl,pH8.0 + 6M
Urea ）で平衡化した陰イオン交換樹脂（ファルマシア
製 ＭｏｎｏＱ）に通し、吸着した成分を０〜０．３Ｍ
塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。溶出液のう
ち分子量３８ＫＤａのプロカテプシンＢを含む画分を集
め、限外ろ過（ＡＭＩＣＯＮ製 セントリプレップ−１
０）で濃縮した。次に濃縮液を緩衝液Ｃ（50mM Na-Pi,p
H6,4 + 6M Urea + 0.5M NaCl + 2% DMSO）で平衡化した
ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー製）にてゲルろ
過した。溶出液のうちプロカテプシンＢを含む画分を集
め、限外ろ過により溶媒を緩衝液Ａに交換し、精製プロ
カテプシンＢ（ＰｒｏＢ）とした。

【００４８】実施例３ ヒトプロカテプシンＢの合成ペプチド作製 ヒトプロカテプシンＢｃＤＮＡの塩基配列（Proc.Natl.
Acad.Sci. 83, 7721,1986）をもとに、ヒトプロカテプ
シンＢプロ部及びマチュア部のアミノ酸配列に相当する
合成ペプチド（１３ー１４残基）を化学合成した。さら
に、得られたペプチドの１部を、キャリア蛋白（ＢＳ
Ａ）とＭＢＡ法により結合し、免疫に使用した。合成し
たオリゴペプチドは、ヒトプロカテプシンＢプロ部分の
アミノ酸配列のうち、１６番より２９番の配列Ａｓｎ−
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕのアミノ酸配列を有するもの、ヒトプロカテプシンＢ
マチュア部分のアミノ酸配列のうち、８０番より９２番
の配列Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎのアミノ酸配列を有するもの、及びヒトプロカ
テプシンＢのアミノ酸配列のうち、２９５番より３０９
番目のアミノ酸配列であるＬｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｒ
ｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅのアミノ
酸配列を有するものである。

【００４９】実施例４ モノクローナル抗体の作製 （１）マウスの免疫 実施例１、２、３より得られたヒトプロカテプシンＢ蛋
白および３種類の合成ペプチドをフロイントコンプリー
トアジュバントと等量混合して乳化し、この乳化物をマ
ウス（BALB/C ♀８週令）の腹腔内に投与し、２週間後
にヒトプロカテプシンＢ蛋白および合成ペプチドをフロ
イントインコンプリートアジュバントと等量混合し乳化
したものを追加免疫した。 細胞融合に供する３ー４日
前に、マウスの尾静脈より各抗原のみを投与した。

【００５０】（２）細胞融合 最終免疫より３ー４日後に、（１）の方法で免疫したマ
ウスから脾臓を摘出した。 ホモジナイザーにより脾臓
を破砕し、脾臓細胞をＰＢＳに浮遊調製した。次いで、
脾臓細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２／０ーＡｇ１４）を
５：１の割合に調製し、５０％ポリエチレングリコール
存在下で３分間放置した。１２００ｒｐｍ，８分遠心分
離し上清を除いたのち、ＲＰＭＩ−１６４０培地２５ｍ
ｌを徐々に加え、さらに１２００ｒｐｍ，８分遠心分離
した。最終的に、１０％ ＦＣＳ加ＨＡＴ ＲＰＭＩ−
１６４０培地に、脾臓細胞が３．５ｘ１０⁶ 個／ｍｌ
になるように調製し、９６ウエルマイクロプレートに
０．１ｍｌ／ウエルになるように分注した。この９６ウ
エルマイクロプレートを、５％ＣＯ₂ ，３７℃で培養し
た。培養開始から２−３日後に、１０％ＦＣＳ加ＨＡＴ
ＲＰＭＩ−１６４０培地を０．１ｍｌ添加し、さらに
３−４日おきに培地を半量交換した。培養開始より７−
１０日後にコロニー形成が見られ、少なくとも１個のウ
エルに、免疫源に対する十分な抗体が産生された。この
抗体産生ウエルの培養上清について、抗体のスクリーニ
ングを行った。

【００５１】（３）スクリーニング 抗体のスクリーニングは、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法，
Immunochemistry,8,871-874,1971）によりおこなった。
ＰＢＳで懸濁し調製した免疫抗原液５０μｌを入れ、３
０℃，２時間反応後、さらにペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス抗体と３０℃，１時間反応させた。最後に、ｏ−フ
ェニレンジアミンを基質とし、発色により判定した。

【００５２】（４）クローニング スクリーニングの結果、陽性と判定したウエルから細胞
を取り出し、限界希釈法によるクローニングを行った。
すなわち、ハイブリドーマ（５個／ｍｌ）とフィーダー
用の胸腺細胞（１．０ｘ１０⁶ 個／ｍｌ）の細胞浮遊１
０％加ＨＴ−ＲＰＭＩ−１６４０培地を０．２ｍｌずつ
９６ウエルマイクロプレートに分注した。３７℃で約７
ー１０日間培養後、１ウエルで１つのコロニーのみ形成
し、さらに抗体陽性を示すウエルの細胞を、目的のモノ
クローナル抗体産生ハイブリド−マとした。同様の手順
を３回繰り返し、目的の抗体産生ハイブリド−マをヒト
プロカテプシンＢについて２株（ＲＢ１及びＲＢ４）、
プロ部合成ペプチドについて１株（ＳＢＰ２−２）及び
マチュア部について２株（ＳＢＭ１−１、ＳＢＭ２−
２）それぞれ選択し、計５株取得した。これらの株のう
ち、ＳＢＭ１−１、ＳＢＭ２−２、ＲＢ−１、ＲＢ−４
は、生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受
託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１３６８３、ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６８２、ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５及びＦＥＲＭ Ｐ
−１３６８４である。

【００５３】（５）モノクロ−ナル抗体の精製及びサブ
クラス決定 目的の抗体を産生するハイブリド−マの培養上清から、
プロテインＧ−セファロ−スアフィニティ−カラム（フ
ァルマシア製）によりモノクロ−ナル抗体を精製した。
モノクロ−ナル抗体の免疫グロブリンクラス・サブクラ
スは、モノクロ−ナル抗体サブタイピングキット（バイ
オラッド製）により同定した。その結果を表１に示し
た。

【００５４】

【表１】 表１ ───────────────────────────────── 免疫抗原 ハイブリド−マ株 サブクラス ───────────────────────────────── プロカテプシ ＲＢ１(FERM P-13685) ＩｇＧ2b ンＢ（ＰｒｏＢ） ＲＢ４(FERM P-13684) ＩｇＧ2b 合成ペプチド １）プロ部 ＳＢＰ２−２ ＩｇＧ3 ２）マチュア部 ＳＢＭ１−１(FERM P-13683) ＩｇＧ1 ＳＢＭ２−２(FERM P-13682) ＩｇＧ1 ─────────────────────────────────

【００５５】実施例５ モノクロ−ナル抗体の特異性 （１）ＥＬＩＳＡ法（酵素抗体法） 取得した５種類のモノクロ−ナルについて、ヒトプロカ
テプシンＢ蛋白及び合成ペプチドに対する反応性をＥＬ
ＩＳＡ法により調べた（表２）。抗原はＰｒｏＢ又はプ
ロ部若しくはマチュア部合成ペプチドであり、サンプル
としては各精製抗体を用いた。抗原を予め吸着させてお
いた９６ウエルマイクロプレ−トにサンプル５０μｌ入
れ、３０℃，２時間反応後、さらにペルオキシダ−ゼ標
識抗マウス抗体と３０℃，１時間反応させた。最後に、
ｏ−フェニレンジアミンを基質とし、１０分間反応させ
た。

【００５６】

【表２】 表２（ｓ−ＥＬＩＳＡによる評価） ─────────────────────────────── 合成ペプチド ＰｒｏＢ プロ部 マチュア部 ─────────────────────────────── ＲＢ１ ＋＋ ＲＢ４ ＋＋ ＳＢＰ２−２ ＋ ＋＋ ＳＢＭ１−１ ＋ ＋＋ ＳＢＭ２−２ ＋ ＋＋ ───────────────────────────────

【００５７】（２）ウエスタンブロッティング法 取得した５種類のモノクロ−ナルについて、ヒトプロカ
テプシンＢ蛋白質（ＰｒｏＢ）及びヒト肝由来カテプシ
ンＢ（マチュア型）に対する反応性をウエスタンブロッ
ティング法で調べた。ヒト肝カテプシンＢ、ヒト腎カテ
プシンＬ、ヒト好中球カテプシンＧ（nova biochem社
製）及びＰｒｏＢを、それぞれ電気泳動用サンプルバッ
ファ−で、１００℃，２分間処理したのち電気泳動を行
い、さらにウエスタンブロッティング用メンブランに転
写し、５種類のモノクロ−ナル抗体との反応性を見た。
結果を表３に示す。

【００５８】

【表３】 表３（ウエスタンブロッティング法による評価） ─────────────────────────────────── ヒト肝 ヒト腎 ヒト好中球 ＰｒｏＢ カテプシンＢ カテプシンＬ カテプシンＧ ─────────────────────────────────── ＲＢ１ ＋＋ ＋＋ − − ＲＢ４ ＋＋ ＋＋ − − ＳＢＰ２−２ ＋ − − − ＳＢＭ１−１ ＋ ＋＋ − − ＳＢＭ２−２ ＋ ＋＋ − − ───────────────────────────────────

【００５９】（１）、（２）の結果より、ＲＢ１，ＲＢ
４はヒトプロカテプシンＢのマチュア部に特異性がある
こと、ＲＢ１、ＲＢ４、ＳＢＭ１−１、ＳＢＭ２−２
は、ヒト肝由来のカテプシンＢと特異的に反応すること
が判明した。

【００６０】実施例６ ヒトの生化学的検体との反応性
検討（ウエスタンブロッティング法） （１）ヒト糞便中（プロ）カテプシンＢの検出 健常人、便潜血陽性、陰性患者の糞便を抽出バッファ−
（Ｓｕｃｒｏｓｅ １５％，尿素９Ｍ，ＳＤＳ １．５
％，２−メルカプトエタノ−ル １．５％）で懸濁した
のち、さらにソニケ−ションをおこなった。次に、１０
０℃で３分間煮沸した後、１０，０００ｘｇで２０分間
遠心分離し、その上清の電気泳動をおこなった。電気泳
動後、常法に従ってニトロセルロ−ス膜に転写し、抗カ
テプシンＢモノクローナル抗体（ＲＢ１：１０μｇ／ｍ
ｌ；ＳＢＰ２−２：１０μｇ／ｍｌ）と反応させ、疾病
との相関を検討した。

【００６１】便潜血陽性検体中に、プロカテプシンＢと
考えられる３９ＫＤａのバンドが検出されるものがあ
り、肝硬変・肝癌検体で８３％（５／６）、大腸癌で５
０％（５／１０）の検出率であった。また、健常人、便
潜血陰性検体には検出されなかった。これらの結果よ
り、ヒト糞便中の（プロ）カテプシンＢを検出する方法
は、肝硬変・肝癌、大腸癌の診断に応用可能である。

【００６２】実施例７ ヒトの生化学的検体との反応性
検討（ｓ−ＥＬＩＳＡ法） 取得した５種類のモノクロ−ナル抗体より、下記２種類
のサンドイッチエライザ系を構築した。 測定系１： 下部抗体ＳＢＰ２−２（３μｇ／ｍｌ） 上部抗体ＲＢ４ （２μｇ／ｍｌ） 測定系２： 下部抗体ＳＢＭ２−２（１μｇ／ｍｌ） 上部抗体ＲＢ４ （１μｇ／ｍｌ） 測定系１により健常人（１０名）及び頚部食道癌（２
名）、膵癌患者（１３名）の血清を用い、血清中（プ
ロ）カテプシンＢ量を測定した。健常人平均値＋２ｘ標
準偏差をカットオフ値とした場合、頚部食道癌で１００
％（２／２）、膵癌で５４％（７／１３）の陽性率が得
られた。これらの結果より、ヒト血清中（プロ）カテプ
シンＢを検出、測定する方法は、（プロ）カテプシンＢ
が関与する癌やその他の疾患の診断法として有用であ
る。

【００６３】実施例８ モノクローナル抗体による消化
器系組織及び肺組織の免疫染色 手術により摘出した大腸癌とその周辺部位及び肺癌の組
織標本（フォルマリン標本）から切片（パラフィン包埋
切片）を作製し、１次抗体として精製モノクローナル抗
体（ＲＢ１）を用い、通常の方法（月刊 MEDICAL TECHN
OLOGY 別冊，染色法のすべて，医歯薬出版株式会社、及
び、ベクタ−社製のベクタステインＡＢＣエリ−トキッ
ト）に従い免疫染色した。陰性対照は、１次抗体と同濃
度のマウスＩｇＧ（カッペル社製）を用いた。その結
果、１次抗体濃度０．２−０．５μｇ／ｍｌ，３０℃，
３０分の反応条件において、正常部腺細胞はほとんど染
色されなかったが、肺癌及び大腸癌部腺細胞において特
異的に染色が認められた。なお、陰性対照のマウスＩｇ
Ｇでは両細胞とも染色されなかった。

【００６４】

【発明の効果】本発明により、ヒトプロカテプシンＢを
特異的に認識するモノクローナル抗体、それを産生する
ハイブリドーマ及びそれを用いたヒト（プロ）カテプシ
ンＢの測定方法が提供された。本発明により、肺癌、食
道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、結直腸癌、腎臓癌等
の癌疾患や、アルツハイマー型痴呆症等の、ヒト（プ
ロ）カテプシンＢがマーカーとなる各種疾病の診断を効
率良く簡便に行うことができる。

【００６５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：2002 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ホモ サピエンス （ヒト） 組織の起源：肝癌 直接の起源 ライブラリー名：human hepatoma cDNA library 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍＲＮＡ 存在位置：1..2002 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：195..1211 配列 AATTCCGCGG CAACCGCTCC GGCAACGCCA ACCGCTCCGC TGCGCGCAGG CTGGGCTGCA 60 GGCTCTCGGC TGCAGCGCTG GGCTGGTGTG CAGTGGTGCG ACCACGGCTC ACGGCAGCCT 120 CAGCCACCCA GATGTAAGCG ATCTGGTTCC CACCTCAGCC TTCCGAGTAG TGGATCTAGG 180 ATCTGGCTTC CAAC ATG TGG CAG CTC TGG GCC TCC CTC TGC TGC CTG CTG 230 Met Trp Gln Leu Trp Ala Ser Leu Cys Cys Leu Leu 1 5 10 GTG TTG GCC AAT GCC CGG AGC AGG CCC TCT TTC CAT CCC GTG TCG GAT 278 Val Leu Ala Asn Ala Arg Ser Arg Pro Ser Phe His Pro Val Ser Asp 15 20 25 GAG CTG GTC AAC TAT GTC AAC AAA CGG AAT ACC ACG TGG CAG GCC GGG 326 Glu Leu Val Asn Tyr Val Asn Lys Arg Asn Thr Thr Trp Gln Ala Gly 30 35 40 CAC AAC TTC TAC AAC GTG GAC ATG AGC TAC TTG AAG AGG CTA TGT GGT 374 His Asn Phe Tyr Asn Val Asp Met Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Cys Gly 45 50 55 60 ACC TTC CTG GGT GGG CCC AAG CCA CCC CAG AGA GTT ATG TTT ACC GAG 422 Thr Phe Leu Gly Gly Pro Lys Pro Pro Gln Arg Val Met Phe Thr Glu 65 70 75 GAC CTG AAG CTG CCT GCA AGC TTC GAT GCA CGG GAA CAA TGG CCA CAG 470 Asp Leu Lys Leu Pro Ala Ser Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Pro Gln 80 85 90 TGT CCC ACC ATC AAA GAG ATC AGA GAC CAG GGC TCC TGT GGC TCC TGC 518 Cys Pro Thr Ile Lys Glu Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys 95 100 105 TGG GCC TTC GGG GCT GTG GAA GCC ATC TCT GAC CGC ATC TGC ATC CAC 566 Trp Ala Phe Gly Ala Val Glu Ala Ile Ser Asp Arg Ile Cys Ile His 110 115 120 ACC AAT GCG CAC GTC AGC GTG GAG GTG TCG GCG GAG GAC CTG CTC ACC 614 Thr Asn Ala His Val Ser Val Glu Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr 125 130 135 140 TGC TGT GGC AGC ATG TGT GGG GAC GGC TGT AAT GGT GGC TAT CCT GCT 662 Cys Cys Gly Ser Met Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ala 145 150 155 GAA GCT TGG AAC TTC TGG ACA AGA AAA GGC CTG GTT TCT GGT GGC CTC 710 Glu Ala Trp Asn Phe Trp Thr Arg Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu 160 165 170 TAT GAA TCC CAT GTA GGG TGC AGA CCG TAC TCC ATC CCT CCC TGT GAG 758 Tyr Glu Ser His Val Gly Cys Arg Pro Tyr Ser Ile Pro Pro Cys Glu 175 180 185 CAC CAC GTC AAC GGC TCC CGG CCC CCA TGC ACG GGG GAG GGA GAT ACC 806 His His Val Asn Gly Ser Arg Pro Pro Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr 190 195 200 CCC AAG TGT AGC AAG ATC TGT GAG CCT GGC TAC AGC CCG ACC TAC AAA 854 Pro Lys Cys Ser Lys Ile Cys Glu Pro Gly Tyr Ser Pro Thr Tyr Lys 205 210 215 220 CAG GAC AAG CAC TAC GGA TAC AAT TCC TAC AGC GTC TCC AAT AGC GAG 902 Gln Asp Lys His Tyr Gly Tyr Asn Ser Tyr Ser Val Ser Asn Ser Glu 225 230 235 AAG GAC ATC ATG GCC GAG ATC TAC AAA AAC GGC CCC GTG GAG GGA GCT 950 Lys Asp Ile Met Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala 240 245 250 TTC TCT GTG TAT TCG GAC TTC CTG CTC TAC AAG TCA GGA GTG TAC CAA 998 Phe Ser Val Tyr Ser Asp Phe Leu Leu Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Gln 255 260 265 CAC GTC ACC GGA GAG ATG ATG GGT GGC CAT GCC ATC CGC ATC CTG GGC 1046 His Val Thr Gly Glu Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly 270 275 280 TGG GGA GTG GAG AAT GGC ACA CCC TAC TGG CTG GTT GCC AAC TCC TGG 1094 Trp Gly Val Glu Asn Gly Thr Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp 285 290 295 300 AAC ACT GAC TGG GGT GAC AAT GGC TTC TTT AAA ATA CTC AGA GGA CAG 1142 Asn Thr Asp Trp Gly Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Arg Gly Gln 305 310 315 GAT CAC TGC GGA ATC GAA TCA GAA GTG GTG GCT GGA ATT CCA CGC ACC 1190 Asp His Cys Gly Ile Glu Ser Glu Val Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr 320 325 330 GAT CAG TAC TGG GAA AAG ATC TAATCTGCCG TGGGCCTGTC GTGCCAGTCC 1241 Asp Gln Tyr Trp Glu Lys Ile 335 TGGGGGCGAG ATCGGGGTAG AAAGTCATTT TATTCTTTAA GTTCACGTAA GATACAAGTT 1301 TCAGGCAGGG TCTGAAGGAC TGGATTGGCC AAAGTCCTCC AAGGAGACCA AGTCCTGGCT 1361 ACATCCCAGC CTGTGGTTAC AGTGCAGACA GGCCATGTGA GCCACCGCTG CCAGCACAGA 1421 GCGTCCTTCC CCCTGTAGAC TAGTGCCGTG GGAGTACCTG CTGCCCAGCT GCTGTGGCCC 1481 CCTCCGTGAT CCATCCATCT CCAGGGAGCA AGACAGAGAC GCAGGATGGA AAGCGGAGTT 1541 CCTAACAGGA TGAAAGTTCC CCCATCAGTT CCCCCAGTAC CTCCAAGCAA GTAGCTTTCC 1601 ACATTTGTCA CAGAAATCAG AGGAGAGATG GTGTTGGGAG CCCTTTGGAG AACGCCAGTC 1661 TCCAGGTCCC CCTGCATCTA TCGAGTTTGC AATGTCACAA CCTCTCTGAT CTTGTGCTCA 1721 GCATGATTCT TTAATAGAAG TTTTATTTTT CGTGCACTCT GCTAATCATG TGGGTGAGCC 1781 AGTGGAACAG CGGGAGCCTG TGCTGGTTTG CAGATTGCCT CCTAATGACG CGGCTCAAAA 1841 GGAAACCAAG TGGTCAGGAG TTGTTTCTGA CCCACTGATC TCTACTACCA CAAGGAAAAT 1901 AGTTTAGGAG AAACCAGCTT TTACTGTTTT TGAAAAATTA CAGCTTCACC CTGTCAAGTT 1961 AACAAGGAAT GCCTGTGCCA ATAAAAGGTT TCTCCAACTT G 2002

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のモノクローナル抗体を得るための免疫
原として用いたヒトプロカテプシンＢを遺伝子工学的に
調製する工程の一部を説明するための図である。

【図２】図１の工程の続きを説明するための図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 中山 光二 千葉県袖ケ浦市上泉1280番地 出光興産株 式会社中央研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトプロカテプシンＢ蛋白を特異的に認
   識するモノクロ−ナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトプロカテプシンＢプロ部分のアミノ
   酸配列のうち、１６番より２９番の配列Ａｓｎ−Ａｌａ
   −Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−
   Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕのア
   ミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する請求項
   １記載のモノクロ−ナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒトプロカテプシンＢマチュア部分のア
   ミノ酸配列のうち、８０番より９２番の配列Ｌｅｕ−Ｐ
   ｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒ
   ｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎのアミノ
   酸配列を有するペプチドを特異的に認識する請求項１記
   載のモノクロ−ナル抗体。
4. 【請求項４】 モノクローナル抗体ＳＢＭ１−１である
   請求項３記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 ヒトプロカテプシンＢのアミノ酸配列の
   うち、２９５番より３０９番目のアミノ酸配列であるＬ
   ｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓ
   ｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
   −Ｇｌｙ−Ｐｈｅのアミノ酸配列を有するペプチドを特
   異的に認識する請求項１記載のモノクロ−ナル抗体。
6. 【請求項６】 モノクローナル抗体ＳＢＭ２−２である
   請求項５記載のモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】 請求項１ないし６記載のいずれかに記載
   のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】 請求項１ないし６記載のいずれかに記載
   のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて
   免疫測定によりヒトプロカテプシンＢ又はヒトカテプシ
   ンＢを検出又は定量する方法。