JP3295358B2 - ヒトｎｍ２３タンパク質及びそれに対する抗体並びにガン診断剤 - Google Patents

ヒトｎｍ２３タンパク質及びそれに対する抗体並びにガン診断剤

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】本発明はヒトｎｍ２３タンパク質、ヒト
ｎｍ２３タンパク質をコードするＤＮＡ（又はこのよう
なＤＮＡの断片もしくはアナログ）、ヒトｎｍ２３タン
パク質を認識する抗体並びにこのような物質を産生及び
使用するためのプロセス及び産物に関する。
【０００２】Steeg et al.,Journal of the National C
ancer Institute,80:200-204,1988はマウス腫瘍転移潜
在能力に関与するマウスｎｍ２３遺伝子及び対応タンパ
ク質について開示する。
【０００３】
【発明の概要】本出願人はヒトｎｍ２３タンパク質をコ
ードするヒト遺伝子、並びに、ヒト腫瘍の侵攻を予想す
る上で役立つタンパク質及び抗体を提供する。本発明の
一面によれば、ヒトｎｍ２３タンパク質をコードするＤ
ＮＡ又はこのようなＤＮＡの断片、アナログもしくは誘
導体が提供される。
【０００４】本発明のもう１つの面によれば、ヒトｎｍ
２３タンパク質をコードするＤＮＡ又はこのようなＤＮ
Ａの断片、アナログもしくは誘導体を含むクローニング
又は発現ビヒクルが提供される。
【０００５】本発明の別の面によれば、宿主；特にヒト
ｎｍ２３タンパク質又はこのようなＤＮＡの断片、アナ
ログもしくは誘導体をコードするＤＮＡ又はこのような
ＤＮＡの断片、アナログもしくは誘導体を含むように遺
伝子工学処理された細胞；即ちヒトｎｍ２３ＤＮＡを含
むように修正されたこのような細胞が提供される。
【０００６】本発明の更にもう１つの面によれば、ヒト
ｎｍ２３タンパク質が提供される。本発明の更に別の面
によれば、ヒトｎｍ２３タンパク質を認識する抗体が提
供される。
【０００７】本発明の更に他の面によれば、前記ＤＮＡ
を用いるための操作及び腫瘍の転移潜在能力を予想する
ための抗体が提供される。
【０００８】
【発明の具体的説明】ここで用いられる“ヒトｎｍ２３
遺伝子又はＤＮＡ”という用語は、ヒトｎｍ２３タンパ
ク質をコードする遺伝子又はＤＮＡあるいはヒトｎｍ２
３タンパク質をコードするＤＮＡに特有のＤＮＡ配列を
包含する又は含むこのようなＤＮＡ又は遺伝子のアナロ
グ、誘導体又は断片を意味する。このため、ヒトｎｍ２
３遺伝子という用語は、図２の遺伝子又はＤＮＡ、図３
で示された遺伝子又はＤＮＡ、そのフラクションあるい
はこのような遺伝子の断片、誘導体又はアナログを包含
する。
【０００９】“ヒトｎｍ２３タンパク質”とは、ヒトｎ
ｍ２３タンパク質に独特なアミノ酸配列を包含するか又
は含みかつ好ましくはヒトｎｍ２３タンパク質で認識さ
れる抗体を誘導する、ヒトで見出されるｎｍ２３タンパ
ク質又はその断片、アナログもしくは誘導体を意味す
る。ヒトｎｍ２３タンパク質という用語は図２又は図３
の遺伝子でコードされるタンパク質を包含する。
【００１０】ここで用いられる“抗体”という用語はポ
リクローナル及びモノクローナル抗体を包含する。
【００１１】“ｎｍ２３抗体”という用語はヒトｎｍ２
３タンパク質に応答して誘導されるか又はヒトｎｍ２３
タンパク質を認識する抗体を意味する。ヒトｎｍ２３タ
ンパク質を認識する抗体はヒトｎｍ２３タンパク質に応
答して誘導されても又はされなくてもよい。
【００１２】本出願人はここで２種の異なるかつ別個の
ｎｍ２３タンパク質をコードする２種の異なるかつ別個
のヒト遺伝子（ＤＮＡ）を発見した。第一遺伝子は図２
で示され、ここではｎｍ２３‐Ｈ１と称される。第二遺
伝子はここではｎｍ２３‐Ｈ２と称され、このような遺
伝子配列の一部が図３で示されている。図３において、
塩基対番号１は図２における塩基対番号２１６に相当す
る。本出願人はここに２種の異なるｎｍ２３タンパク質
をコードする２種の別個のヒト遺伝子を確認したが、本
発明の範囲はこのような特定遺伝子に限定されない。
【００１３】ヒトｎｍ２３ＤＮＡ（ＲＮＡ）はＲＮＡ又
はＤＮＡを検出及び／又は測定するための診断手段とし
て用いることができる。例えば、このようなＤＮＡ又は
ＲＮＡは、癌細胞におけるｍＲＮＡ発現を検出し、それ
によりヒト腫瘍の悪性潜在能力を予測する上で役立てる
ために用いてよい。使用可能な方法としては以下があ
る： （１）ＲＮＡ（“ノーザン”）ブロッティング．ＲＮＡ
はいくつかの標準的操作のうちいずれかで腫瘍サンプル
から単離することができる。例えば、Lehrach（１）の
方法の改良法が使用可能である。ＲＮＡは変性ゲル電気
泳動に付され、ニトロセルロース又は他の支持マトリッ
クスに移される。ｎｍ２３ｍＲＮＡは放射線又は非放射
線標識ｎｍ２３‐Ｈ１又はｎｍ２３‐Ｈ２のハイブリッ
ド形成により検出できる。腫瘍中のｍＲＮＡはハイブリ
ッド形成の強度で反映される。比較のため、レベルが一
定のｍＲＮＡに関するコントロールプローブ（例えば、
β‐アクチン）とのハイブリッド形成で結果を標準化さ
せる。低レベルのｎｍ２３‐Ｈ１又はｎｍ２３‐Ｈ２の
検出は高悪性潜在能力の腫瘍を示す。
【００１４】（２）ヌクレアーゼ保護アッセイ．腫瘍サ
ンプルから単離されたＲＮＡは、標識された相補的ＤＮ
Ａ又はＲＮＡとの二本鎖形成能力により、ｎｍ２３‐Ｈ
１又はｎｍ２３‐Ｈ２の含有量に関して分析できる。ｎ
ｍ２３‐Ｈ１又はｎｍ２３‐Ｈ２ヌクレオチド配列の全
部又は一部を用いて、プラスミドが対応ｍＲＮＡと相補
的な核酸プローブの産生用に形成できる。このようなベ
クターの例としては、ＲＮＡプローブ用のＴ７もしくは
ＳＰ６プロモーターに基づくベクター、又は、オリゴヌ
クレオチドプライミングを用いたＤＮＡプローブ製造用
のｍ１３ファージがある。このようなベクターから製造
されたプローブは、過剰プローブの条件下で腫瘍サンプ
ルからのＲＮＡと完全にハイブリッド形成する。ＲＮア
ーゼはモル非ハイブリッド形成ＲＮＡプローブを除去す
るために使用でき、又はＳ１ヌクレアーゼもしくは他の
一本鎖特異性ＤＮアーゼは非ハイブリッド形成ＤＮＡプ
ローブを除去するために使用できる。次いでこれらは変
性ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーに付され
る。保護プローブに相当するバンドの強度が、サンプル
からのｎｍ２３‐Ｈ１又はｎｍ２３‐Ｈ２のいずれかの
量である。レベルが変化していないｍＲＮＡに関するヌ
クレアーゼ保護実験も含めれば、結果を標準化できる。
相対的に低レベルのｎｍ２３‐Ｈ１又はｎｍ２３‐Ｈ２
である腫瘍の検出は高悪性潜在能力の腫瘍を示す。
【００１５】（２）腫瘍切片中におけるｎｍ２３‐Ｈ１
又はｎｍ２３‐Ｈ２の現場ハイブリッド形成から、腫瘍
の個々の細胞におけるｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２ ｍＲＮ
Ａの量が分析される。ｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２配列に相
補的なプローブは前記のように製造でき、（パラフィン
の使用によるような標準的技術で包埋されたか又はそれ
以外で保存された）腫瘍サンプルの薄い切片内でｍＲＮ
Ａとハイブリッド形成できる。非ハイブリッド形成プロ
ーブはヌクレアーゼで除去できる。ハイブリッド形成は
オートラジオグラフィー又は他の方法で検出できる。ハ
イブリッド形成の強度は腫瘍細胞内におけるｎｍ２３‐
Ｈ１又はＨ２ ｍＲＮＡの量を反映する。腫瘍細胞が低
レベルのｎｍ２３を含有する場合、それらは高度に悪性
であると思われる。
【００１６】ヒトｎｍ２３ＤＮＡ（ＲＮＡ）はヒト癌細
胞におけるこのようなＤＮＡの異常を検出して、それに
より癌の侵攻を予測する上で役立てるために用いてもよ
い（異常はより侵攻性の細胞でみられる）。このような
方法としては以下がある： （１）腫瘍から単離されたＤＮＡは、ブロットハイブリ
ッド形成により、ｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２遺伝子の異常
に関して試験できる。正常組織及び腫瘍組織から単離さ
れたＤＮＡは制限酵素で断片化され、ゲル電気泳動に付
され、ニトロセルロース又は他の支持マトリックスに移
され、ｎｍ２３‐Ｈ１及びＨ２遺伝子断片は、前記ｃＤ
ＮＡの全部もしくは一部又はｎｍ２３‐Ｈ１もしくはＨ
２遺伝子の他の領域を含むプローブを用いてハイブリッ
ド形成により検出される（サザンブロット操作）。正常
又は腫瘍細胞からのＤＮＡ間におけるハイブリッド形成
パターンの差異はｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２遺伝子に関す
る異常を示す。
【００１７】（２）ｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２遺伝子に関
する対立遺伝子欠失の確認。各ｎｍ２３遺伝子に関する
制限鎖長多型（ＲＦＬＰ）はサザンブロット操作で確認
することができる。ＲＦＬＰは、ＲＦＬＰに関して異型
接合性である患者において、遺伝子に関する個々の対立
遺伝子を確認するために用いてもよい。一患者の正常及
び腫瘍細胞からのＤＮＡが、ｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２の
いずれかに関する腫瘍ＤＮＡで対立遺伝子欠失があるこ
とを示す場合、このような変化は高悪性潜在能力の腫瘍
を示す。
【００１８】（３）ｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２に関する遺
伝子配列内における遺伝子異常の確認。ヌクレオチド配
列分析は腫瘍サンプル中におけるｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ
２の遺伝子構造を調べるために用いることができる。ｎ
ｍ２３‐Ｈ１及びＨ２のヌクレオチド配列は正常配列を
規定する。患者のＤＮＡにおけるこれら配列の変化は高
転移潜在能力の腫瘍を示す。
【００１９】ヒトｎｍ２３ＤＮＡはヒトｎｍ２３タンパ
ク質を産生する上で適切な発現ビヒクル中に組み込んで
もよい。
【００２０】適切なＤＮＡ配列は広範囲のベクター又は
プラスミドのうちいずれに含有させてもよい。このよう
なベクターとしては染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配
列；例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファー
ジＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミド及びファージＤ
ＮＡ、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮
性狂犬病等のようなウイルスＤＮＡの組合せから誘導さ
れるベクターがある。適切なＤＮＡ配列は様々な操作で
ベクター中に挿入させてよい。一般に、ＤＮＡ配列は当
業界で公知の操作により適切な制限エンドヌクレアーゼ
部位に挿入される。このような操作及びその他はいわゆ
る当業者が知る範囲内に属すると思われる。
【００２１】ベクター中におけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮ
Ａ合成を指示するため適切な発現コントロール配列（プ
ロモーター）に作動的に結合される。このようなプロモ
ーターの代表例としては、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモー
ター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐ、ファージラムダＰＬプ
ロモーター及びその他の原核及び真核細胞又はそれらの
ウイルスにおいて遺伝子の発現をコントロールすること
が知られたプロモーターが挙げられる。発現ベクターは
翻訳開始及び転写終結に関するリボソーム結合部位も含
む。ベクターは発現を増幅させるために適した配列も含
んでよい。
【００２２】加えて、発現ベクターは真核細胞培養のた
めジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性
又は大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピシ
リン耐性のような形質転換宿主細胞の選択用に表現型の
形質を提供する遺伝子を含むことが好ましい。
【００２３】前記のように適切なＤＮＡ配列及び適切な
プロモーター又はコントロール配列を含むベクターは、
適切な宿主を形質転換させて宿主にタンパク質を発現さ
せるために用いてよい。適切な宿主の代表例としては、
大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typ
himurium）のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞；
ＣＨＯ又はボーウェス(Bowes) メラノーマのような動物
細胞；植物細胞等が挙げられる。適切な宿主の選択は本
開示から当業者の範囲内に属すると思われる。慣用的ペ
プチド化学により、例えばペプチドシンセサイザー及び
固相技術の使用によりヒトｎｍ２３タンパク質を産生す
ることも可能である。
【００２４】ヒトｎｍ２３タンパク質はｎｍ２３抗体を
産生するために用いることができる。
【００２５】ヒトｎｍ２３タンパク質に対する抗体は当
業界で通常知られる操作により産生してよい。例えば、
ポリクローナル抗体は、単独の又は適切なタンパク質に
カップリングされたタンパク質を非ヒト動物に注入する
ことで産生してもよい。適切な期間の後、動物から採血
され、血清が回収され、当業界で公知の技術により精製
される。モノクローナル抗体は、例えば免疫Ｂ‐リンパ
球とミエローマ細胞との融合からなるKohler-Millstein
（２）の技術で製造される。例えば、前記のような抗原
は、ポリクローナル抗体応答がマウス血清で検出される
まで前記のようにマウスに注入することができる。マウ
スは再度追加免疫してもよく、その脾臓が摘出され、ミ
エローマとの融合が様々な方法に従い行われる。個々の
生存ハイブリドーマ細胞は、まず免疫抗原と結合しうる
それらの能力により、次に細胞からのｎｍ２３‐Ｈ１及
びＨ２を免疫沈降させうるそれらの能力により、抗ｎｍ
２３抗体の分泌に関して試験される。このため、ヒトｎ
ｍ２３タンパク質に応答して誘導される抗体はポリクロ
ーナル又はモノクローナル抗体のいずれであってもよ
い。
【００２６】ｎｍ２３抗体は低レベルのｎｍ２３タンパ
ク質、ひいては転移性又は悪性である高い能力を有した
腫瘍を検出するために用いることができる。このような
抗体は精製されても又はされなくてもよい。このような
アッセイに関するフォーマットとしては以下がある： （１）免疫組織化学分析．腫瘍の切片は抗ｎｍ２３‐Ｈ
１又はＨ２抗体と反応させることができ、免疫複合体は
ペルオキシダーゼ標識第二抗体のような標準的かつ市販
品によって検出される。このような免疫染色の密度か
ら、細胞で産生されるｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２の量を評
価できる。
【００２７】（２）固相免疫アッセイ．このようなアッ
セイは、腫瘍組織の可溶性抽出物中におけるｎｍ２３‐
Ｈ１及びＨ２の量を定量測定するために用いることがで
きる。このようなアッセイにおいて、抗体又は抗原いず
れかの１成分が固体支持腫瘍に固定される。
【００２８】このため、本発明のもう１つの面によれ
ば、アッセイにおいて特異的結合剤として前記タイプの
ｎｍ２３抗体を用いるヒトｎｍ２３タンパク質の検出又
は測定用のアッセイが提供される。
【００２９】用いられるアッセイ技術は、ｎｍ２３抗体
がサンプル中に存在するヒトｎｍ２３タンパク質と結合
する結合剤として固体支持体に支持され、結合タンパク
質が適切なトレーサーの使用により測定されるアッセイ
であることが好ましい。
【００３０】トレーサーは、検出可能標識で標識された
リガンドから構成される。そのリガンドはヒトｎｍ２３
タンパク質で免疫学的に結合されたものであり、このよ
うなリガンドは当業界で公知の技術により標識してもよ
い。
【００３１】このため、例えば、固体支持体上のｎｍ２
３抗体に結合されたヒトｎｍ２３タンパク質は適切な検
出可能標識で標識されたｎｍ２３抗体の使用により測定
される。
【００３２】このようなサンドイッチアッセイ技術にお
いて、標識されたｎｍ２３抗体はモノクローナル抗体で
も又はポリクローナル抗体であってもよく；例えばポリ
クローナル抗体はヒトｎｍ２３タンパク質に特異的な抗
体であってもよく、その抗体は当業界で公知の操作、例
えば適切な動物をヒトｎｍ２３タンパク質で接種する操
作により産生してよい。
【００３３】検出可能標識は酵素、放射線標識、発色原
（ケイ光及び／又は吸着色素の双方を含む）等を含めた
様々な検出可能標識のうちいずれであってもよい。検出
可能標識の選択は、本開示から当業者の範囲内に属する
と思われる。
【００３４】ｎｍ２３抗体に関する固体支持体は様々な
固体支持体のうちいずれであってもよく、適切な支持体
の選択は本開示から当業者の範囲内に属すると思われ
る。例えば、固体支持体は微量滴定プレート、チュー
ブ、粒子等であるが、しかしながら本発明の範囲はいか
なる代表的支持体にも制限されない。ｎｍ２３抗体は当
業界で公知の技術、例えばコーティング、共有結合カッ
プリング等により支持体に支持される。適切な技術の選
択は本開示から当業者の範囲内に属すると思われる。
【００３５】サンドイッチアッセイは様々な技術、例え
ば“フォワード”(forward) 、“リバーズ”(reverse)
又は“同時”で実施できるが、しかしながらフォワード
技術が好ましい。
【００３６】典型的操作において、固体支持体に支持さ
れたｎｍ２３抗体は、サンプル中に存在するこのような
タンパク質のいずれかを支持体上のこのような抗体と特
異的に結合させるため、まずヒトｎｍ２３タンパク質を
含有するか又はその含有が疑われるサンプルと接触され
る。
【００３７】固体支持体の洗浄後、支持体はヒトｎｍ２
３タンパク質と結合するトレーサーと接触される。この
ようなタンパク質がサンプル中に存在すると、トレーサ
ーは固体支持体上の抗体と結合したこのようなタンパク
質と結合するようになり、固体支持体上におけるトレー
サーの存在はサンプル中におけるヒトｎｍ２３タンパク
質の存在を示す。トレーサーの存在は、当業界で公知の
操作により検出可能標識の存在を検定することで調べて
もよい。
【００３８】好ましい操作はサンドイッチアッセイであ
るが、ｎｍ２３抗体は他のアッセイ技術、例えばｎｍ２
３抗体がラテックス粒子のような固体粒子上で用いられ
る凝集アッセイで用いてもよいことが理解される。
【００３９】本発明のもう１つの面によれば、ｎｍ２３
抗体、好ましくはｎｍ２３タンパク質に応答して誘導さ
れるｎｍ２３抗体、を含有したヒトｎｍ２３タンパク質
測定用のアッセイキット又はパッケージが提供される。
ｎｍ２３抗体は検出可能マーカー又は標識で標識しても
又はしなくてもよい。キットが免疫組織化学アッセイに
用いられる場合、そのキットは未標識ｎｍ２３抗体及び
そのｎｍ２３抗体と免疫結合する標識抗体を含有してい
てもよい。キットが免疫アッセイに用いられる場合、そ
のキットは支持ｎｍ２３抗体及び非支持ｎｍ２３抗体の
双方を含有していてもよいが、これは検出可能標識又は
マーカーで標識されていることが好ましい。そのキット
は緩衝液等のような他の成分も含有してよい。
【００４０】
【実施例】本発明は下記の実施例で更に説明されるが、
しかしながら本発明の範囲はそれにより制限されない。
実施例中において、他に指摘がなければ、精製、切断及
び結合は"Molecular Cloning,a laboratory manual"(分
子クローニング，実験マニュアル) by Maniatis et a
l.,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)に記載された
ように実施される。
【００４１】実施例１ ２種の別個のｃＤＮＡを、正常ヒト繊維芽細胞ｍＲＮＡ
から作られたｃＤＮＡライブラリーから単離した。標準
的技術を全体にわたり用いた。プローブとして、我々は
ｐｎｍ２３‐Ｍ１の５０２塩基ＨｐａII制限断片を用い
た。Steeg ら（３）。このＤＮＡはＤＥ４５膜を用い
て、アガロースゲル電気泳動から単離した（Schlicher
and Scheuell）。そのＤＮＡはニックトランスレーショ
ン反応（Amersham kit）及びｐ３２ＰｄＣＴＰ（Amersh
am）を用いて放射化した。Hiroto Okayama（Okayama et
al.（４））から得たｃＤＮＡライブラリーの個々の細
菌をアガロースルリアブロスプレート上に分散させた。
増殖後にそれらをニトロセルロースに移し（Schlicher
and Scheuell）、０．５Ｍ ＮａＯＨ及び１．５ＭＮａ
Ｃｌを用いて溶離させ、１Ｍ ＮＨＡｃで中和した。Ｄ
ＮＡをベーキングでニトロセルロースに固定した。放射
線プローブとのハイブリッド形成を４０％ホルムアミ
ド、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸Ｎ
ａ、０．２％牛血清アルブミン、０．２％フィコール(F
icol) 、０．２％ポリビニルピロリドン及び２mg/ml Ｄ
ＮＡ中で行った。ハイブリッド形成は４２℃で１５時間
行った。ハイブリッド形成の後、フィルターを室温で２
０分間にわたり０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン
酸Ｎａで２回洗浄し、しかる後４２℃で各２０分間にわ
たり０．０１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．００１５Ｍクエン
酸Ｎａで２回洗浄した。陽性ハイブリッド形成をオート
ラジオグラフィーで５つの細菌について検出した。これ
らを単一細胞クローニングで精製した。
【００４２】ＤＮＡを５クローンの各々から抽出し、制
限酵素分析で分析した。別個のパターンを２クローンの
ｐｎｍ２３‐Ｈ１及びｐｎｍ２３‐Ｈ２に関して確認し
た。これらを次の分析に付した。
【００４３】ｐｎｍ２３‐Ｈ１及びｐｎｍ２３‐Ｈ２の
ＤＮＡ配列はジデオキシチェインターミネイション法
（５）（U.S.Biochemical kit ）を用いて決定した。こ
の目的のため、ｐｎｍ２３‐Ｈ１及びｐｎｍ２３‐Ｈ２
のＸｈｏＩ断片をプラスミドから除去し、標準的技術を
用いてＭ１３ｍｐ１８（ＢＲＬ）のＳａｌＩ部位に挿入
した。ＤＮＡ配列分析は、反応プライマーとして合成１
７塩基オリゴヌクレオチドを用いて行った。ｐｎｍ２３
‐Ｈ１及びｐｎｍ２３‐Ｈ２のＤＮＡ配列は図２及び図
３に示されている。図２は、ｐｎｍ２３‐Ｈ１が推定翻
訳開始コドン（ヌクレオチド８７）の上流にヌクレオチ
ド配列を含むことを示している。図３は、ｐｎｍ２３‐
Ｈ２がオープン読取り枠内で始まるｍＲＮＡの部分的コ
ピーを含むことを示す。ヌクレオチド配列の非同一性
（類似率９４％）は、ｐｎｍ２３‐Ｈ１及びｐｎｍ２３
‐Ｈ２が別の遺伝子の産物であることを示す。
【００４４】実施例２ ｎｍ２３‐Ｈ１及びｎｍ２３‐
Ｈ２タンパク質の産生 ｐｎｍ２３‐Ｈ１及びＨ２のヌクレオチド配列は、対応
タンパク質に関する予想タンパク質配列に翻訳すること
ができる。いくつかの方法がこのようなタンパク質を形
成するために使用できる。
【００４５】（１）標準的化学操作はｎｍ２３‐Ｈ１又
はＨ２アミノ酸配列の全部又は一部に相当するペプチド
を合成するために用いることができる。これらのペプチ
ドは抗体産生のためＫＬＨのようなキャリアタンパク質
にカップリングさせることができる。
【００４６】（２）ｎｍ２３‐Ｈ１の全部もしくは一部
又はｎｍ２３‐Ｈ２の一部に相当するタンパク質は、細
菌転写促進シグナルの指示下において細菌内で合成でき
る。ｎｍ２３‐Ｈ１タンパク質は、（６）に記載された
ものに類似したベクターにおいて、バクテリオファージ
ラムダＰＬプロモーターの指示下で発現されている。こ
のベクターは第１図に示されたように構築された。プラ
スミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＡｕａＩで切断
し、塩基断片をアガロースゲル電気泳動で単離した。こ
れはいくつかの酵素部位、細菌リボソーム結合部位及び
ＮｃｏＩ制限酵素部位含有翻訳開始コドンを含んだ合成
制限断片（第１図）と組合せた。これらをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼと反応させ、大腸菌に組込んで形質転換させ、正
しい構造のプラスミドを確認した。これらプラスミドか
らのＤＮＡをＢｓｔＸＩ及びＢａｍＨＩで切断し、バク
テリオファージＤＮＡの４．５kbＨｉｎｄIII 断片のＢ
ｓｔＸＩ‐ＢｇｌII切断と組合せた。このＢｓｔＸＩ‐
ＢｇｌII断片はＰＬプロモーターを含む。結合及び大腸
菌（ｃＩ８５７プロファージを含む）での形質転換後、
第１図に示された構造を含むプラスミドを確認した。こ
れらプラスミドからのＤＮＡをＢｓｔＸＩ及びＨｐａＩ
で切断し、各ＤＮＡの付着末端を大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ大断片で補充した。これを標準条件下で結合さ
せ、大腸菌に組込んで形質転換させた（７）。ｎｍ２‐
Ｈ１は、超コイル化分子から直鎖形への変換で確認され
るような部分的切断分子を産生するため、ＤＮＡ１μｇ
当たり酵素１単位の比率で２分間かけてＮｃｏＩで切断
することによりＭ１３ｍｐ１８から除去された。これを
フェノール／ＣＨＣｌ２抽出し、エタノール沈降させて
ＮｃｏＩ酵素を除去し、更にＥｃｏＲＩで切断した。
０．７kb断片をアガロースゲル電気泳動から単離した。
この断片をＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで切断されたプラス
ミドｐＰＬと混合し、結合させ、大腸菌に組込んで形質
転換させた。
【００４７】ヒトｎｍ２３‐Ｈ１タンパク質の合成を指
示できる細菌クローンが確認された。細菌を３２℃でＯ
Ｄ６６０＝１となるまで増殖させ、温度をシフトさせて
４２℃で１６時間増殖させた。全細菌タンパク質を、Ｓ
ＤＳ含有１５％ポリアクリルアミドゲルを含有した中で
電気泳動により試験した。ヒトｎｍ２３‐Ｈ１タンパク
質は、そのタンパク質のアミノ酸８６‐１０２に対する
抗ペプチド抗血清と反応できる１９kDa タンパク質とし
て確認された。
【００４８】ヒトｎｍ２３‐Ｈ１タンパク質は様々な方
法により細菌から精製できる。例えば、増殖及び温度シ
フト誘導後、細菌をｐＨ７．５の２０mMトリス、１５０
nMＮａＣｌ（ＴＢＳ）中における音波処理で溶離させ
た。不溶性物質を１００，０００×ｇで３０分間の遠心
により除去した。次いで硫酸アンモニウムを６０％飽和
溶液まで加え、タンパク質を４℃で１０分間かけて沈降
させた。これらのタンパク質を１００，０００×ｇで１
０分間の遠心により集め、沈降物をＴＢＳに溶解させ
た。７１６時間の透析後、細かな沈降物を１０，０００
×ｇで１０分間の遠心により集める。これはＴＢＳ及び
１mMＤＴＴに可溶化する。こうして得られたタンパク質
はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で判断したと
ころ純度８０％以上である。こうして得られたタンパク
質は抗体産生及び生物学的修飾実験における免疫抗原と
して使用上適している。
【００４９】ｎｍ２３‐Ｈ１及びＨ２のヌクレオチド配
列は、真核細胞でいずれかのタンパク質を発現する。酵
母〜ヒト組織培養細胞の範囲にわたる細胞においてタン
パク質の発現用に入手可能な様々な系が存在する。ｎｍ
２３‐Ｈ１又はＨ２タンパク質の発現用に必要な必須要
素は、ｎｍ２３の合成を指示できるヌクレオチド配列で
あった。
【００５０】実施例３ ｎｍ２３抗体の産生 実施例３セクションで記載された産物は抗原として使用
できる。これらはそのままで又はキーホール・リンピド
(Keyhole Limpid)ヘモシアニンのようなキャリアタンパ
ク質にカップリングして用いることができる。カップリ
ングは確立された技術を用いて及びＥＤＣのような架橋
剤を用いて行える。次いで抗原をアジュバント（例え
ば、フロイント）と混合し、（ウサギ、ラット又はヤギ
のような）動物に注射する。アジュバント（例えば、フ
ロイント不完全）と混合された抗原による追加免疫注射
後、動物から採血し、血清を調製する。抗体の存在は免
疫沈降、ウェスターンブロット又は固相結合アッセイ
（例えば、ＥＬＩＳＡ）でモニターすることができる。
ｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２に対するポリクローナル抗血清
は、アフィニティクロマトグラフィーにより精製された
形で得ることができる。免疫グロブリン分子はブドウ球
菌タンパク質Ａ結合により血清から得ることができ、抗
ｎｍ２３‐Ｈ１又はＨ２は適切なｎｍ２３抗原が化学的
に固定された固体マトリックスとの結合により得た。
【００５１】実施例４ モノクローナル抗体の製造 Ｂａｌｂ／ｃマウスを、免疫用にフロイント完全アジュ
バントと及び追加免疫用にフロイント不完全アジュバン
トと混合された精製ｎｍ２３‐Ｈ１タンパク質１００μ
ｇの１週間間隔で３回のＩＰ注射により免疫した。ハイ
ブリドーマはLane et al.,Methods in Enz.,121,p.183
(1986) の方法により得た。融合の相手はミエローマＰ
３ｘ６３‐ＡＴＣＣから得られるＡｇ８．６５３であっ
た。融合細胞にLane et al.,Hybridoma,Vol.7,p.289 (1
988)の方法で得られた腹腔内細胞をいれた。ハイブリド
ーマをＮＣＴＣ‐１０９（Gibco ）、７．５％牛胎児血
清（Sigma ）、７．５％ＣＳＰＲ‐３（Sigma ）、１mM
ピルビン酸Ｎａ、１００単位ペニシリン、１００μｇス
トレプトマイシン、１０μg/mlインシュリン及び２５μ
M β‐メルカプトエタノールで補充され０．１mMヒポキ
サンチン、０．４μMアンホプテリン及び０．０１６mM
チミジンを含有したＤＭＥＭ中で増殖させた。ハイブリ
ドーマクローンを９６穴皿で２週間にわたり増殖させ
た。抗ｎｍ２３産生ハイブリドーマはＥＬＩＳＡで確認
した。精製されたｎｍ２３‐Ｈ１タンパク質をイムロン
(Immulon) １皿に結合させ、ハイブリドーマ培地を室温
で２時間反応させた。
【００５２】抗体反応はＢＲＬ ＨｙＢＲＬキットでそ
の条件下ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体及びステプタビ
クジン(steptavicdin)西洋ワサビペルオキシダーゼを用
いて検出した。陽性ハイブリドーマは５％ハイブリドー
マ増殖助剤（Fisher）含有の前記培地において限界希釈
によりクローニングした。これらをＥＬＩＳＡで反応性
に関して試験した。ヒトｎｍ２３タンパク質との反応は
ウェスターンブロッティングアッセイで確認した。
【００５３】実施例５ 転移腫瘍の検出 ヒトｎｍ２３‐Ｈ１及びＨ２タンパク質に特異的な抗体
は前記のようにして得ることができる。ｎｍ２３‐Ｈ１
配列のアミノ酸４５‐６１に対する１つのこのような抗
体は、腫瘍切片でｎｍ２３タンパク質を検出するために
用いられた。標準的技術が免疫組織化学用の切片の製造
に用いることができる。これらの方法としてはサンプル
の凍結切片化又はホルマリン固定しかる後パラフィン包
埋がある。この例において、腫瘍切片を１０％中和緩衝
化ホルマリン中で一夜かけて固定し、自動組織プロセッ
サー（Fisher）を用いてパラフィン中に包埋させた。５
ミクロン切片を切出し、キシレン及びアルコールを要す
る標準的操作を用いて脱パラフィン化した。次いで切片
をアフィニティ精製抗ペプチド抗体により１／２００希
釈で免疫染色した：免疫染色はビオチニル化ヤギ抗ウサ
ギ抗体しかる後アビジンビオチニル化西洋ワサビペルオ
キシダーゼを用いて製造業者（Vector）から示されたよ
うな標準的技術により行った。室温で５分間にわたる
０．５mg/ml での発色反応（ジアミノベンジジンテトラ
ヒドロクロリド）後、反応を停止させるため水洗した。
次いで切片をマイヤーズ(Mayers)ヘマトキシリンを用い
て対比染色し、脱水し、カバーガラスを標準的方法で適
用した。次いで切片を明確な細胞質染色のため光学顕微
鏡で調べた。腫瘍が腋窩リンパ節に広がった乳癌患者か
らの２サンプルはほとんど染色を示さない；癌が胸部に
限定された患者からの２サンプルは異なる染色を示す。
これは低ｎｍ２３タンパク質発現の検出が初期部位以外
に広がる傾向がある悪性腫瘍を確認していることを示
す。本発明の様々な修正及び変更が上記開示からみて可
能であり；したがって添付された請求の範囲内において
本発明は具体的に記載された以外で実施してもよい。
【００５４】参考文献 １．Lehrach,H., Biochemistry,16,p.4743(1975). ２．Kohler-Millstein,Galfre,G.and Milstein,C.,Meth
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換),Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning,Cold Sprin
g Harbor Laboratory(1982).
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＰＬ−ｎｍ２３−Ｈ１の構築を示
した図である。Ａ＝ＡｖａＩ；Ｒ＝ＥｃｏＲＩ；Ｂ＝Ｂ
ａｍＨＩ；Ｂｘ＝ＢｓｔＸＩ；Ｈ＝ＨｐａＩ；Ｎ＝Ｎｃ
ｏＩ。バクテリオファージラムダＰＬプロモーター位置
は矢印及び“ＰＬ”で示される。ラムダバクテリオファ
ージラムダＮ遺伝子はボックス及び“Ｎ遺伝子”で示さ
れる。リボソーム結合配列の位置はＳ／Ｏで示される。
タンパク質イニシエーターａｔｇの位置は“ａｔｇ”で
示される。２つの矢印が集まる箇所では結合反応が行わ
れる。
【図２】ｎｍ２３−Ｈ１のヌクレオチド配列およびその
アミノ酸配列を示した図である。マウスｎｍ２３−Ｈ２
タンパク質との差異が示されている。
【図３】ｎｍ２３−Ｈ２のヌクレオチド配列およびその
アミノ酸配列を示した図である。マウスｎｍ２３−Ｈ１
タンパク質との差異が示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｇ０１Ｎ 33/574 1:91） 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） ＺＮＡＣ 1:91） 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 スティーグ、パトリシア、エス アメリカ合衆国メリーランド州、エリコ ット、シティー、マクカビン、バレー、 トレイル、3513 (72)発明者 ライオッタ、ランス、エイ アメリカ合衆国メリーランド州、ポトマ ック、ミストウッド、ドライブ、9027 (56)参考文献 特開 平１−137994（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−156999（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ ｔｉｏｎａｌ ＣＡｎｃｅ Ｉｎｓｔｉ ｔｕｔｅ，Ｖｏｌ．80，Ｎｏ．３ （1988），Ｐ．200−204 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 16/46 C12N 1/00 - 5/28 C12P 21/00 - 21/08 G01N 33/50 - 33/98 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の８
    ６−１０２番のアミノ酸残基からなるペプチドを認識す
    るヒトｎｍ２３−Ｈ１抗体：Thr Gly Arg Val Met Leu
    GlyGlu Thr Asn Pro Ala Asp Ser Lys Pro Gly 。
  2. 【請求項２】下記のヒトｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の４
    ５−６１番のアミノ酸残基からなるペプチドを認識する
    ヒトｎｍ２３−Ｈ１抗体：Glu Asp Leu Leu Lys Glu Hi
    s Tyr Val Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe 。
  3. 【請求項３】請求項１または２に記載の抗体を含む、ガ
    ン診断剤。
  4. 【請求項４】請求項１または２に記載の抗体を含む、腫
    瘍の悪性潜在能力および／またはガン細胞の攻撃性の予
    測用薬剤。
  5. 【請求項５】請求項１または２に記載の抗体と単離され
    た試料とを接触させることを含む、ｎｍ２３−Ｈ１タン
    パク質の検出法。
  6. 【請求項６】腫瘍の悪性潜在能力および／またはガン細
    胞の攻撃性の予測に用いられる請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】抗体がモノクローナル抗体である、請求項
    ５に記載の方法。
  8. 【請求項８】請求項１または２に記載の抗体を含む、ガ
    ン細胞におけるｎｍ２３−Ｈ１タンパク質の検出キッ
    ト。
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