JPH11140099A - ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの検出方法及び免疫学的材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、従来のジヒドロピリミジンデヒド
ロゲナーゼ（ＤＰＤ）アッセイの欠点を解消して、病院
等における日常的使用も可能な単純かつ迅速なアッセイ
を提供するＤＰＤ濃度測定のための材料及び方法を提供
する。 【解決手段】 本発明は、ジヒドロピリミジンデヒドロ
ゲナーゼ、特にはヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナ
ーゼを特異的に認識するモノクローナル抗体、該抗体の
生成に有用なハイブリドーマ細胞系及び該抗体を用いる
アッセイ系を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的材料、及
び生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナー
ゼ（ＤＰＤ）の測定に有用な方法に関するものである。

【０００２】ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（Ｄ
ＰＤ）は、ピリミジン類の５，６−ジヒドロピリミジン
類への変換について触媒作用する酵素であり、得られる
異化物であるジヒドロウラシル及びジヒドロチミンは、
それぞれ更にβ−アラニンまたはβ−アミノイソ酪酸に
異化される。

【０００３】ＤＰＤは、２’−デオキシ−５−フルオロ
ウリジン（２’−ｄＦＵｒｄ）、５’−デオキシ−５−
フルオロウリジン（５’−ｄＦＵｒｄ、ドキシフルリジ
ン）等の抗腫瘍薬として広く使用されている５−フルオ
ロウラシル（５−ＦＵ）並びにピリミジン類似体及び誘
導体に由来する種々の異化物の還元反応について触媒作
用することも知られている。腫瘍を患っている個体の生
物学的試料中のＤＰＤ濃度は、５−フルオロウラシル誘
導体の系統の抗腫瘍薬の治療的効果の興味深いマーカー
であることが報告されている（例えば、Iigo et al., 1
969, Biochem.Pharmacol., 38, 1885-1889 参照）。

【０００４】ＤＰＤの欠損は、ピリミジン抗腫瘍薬の代
謝産物の毒性のためであることが知られており、これは
化学療法において生命を脅かす症状をもたらす（Milan
o, G.and Etienne, 1988, M.C., Pharmacogenetics, 4,
301-306）。最近になって、ＤＰＤ欠損の障害は初期に
考えられていたよりも頻繁に起こることが見出された
（Diasio and Lu, 1994, J. Clin. Oncol., 12, 2239-2
242 ）。したがって、ＤＰＤ欠損を伴う患者を同定する
ことは重要である。従って、生物学的試料中のＤＰＤ濃
度検出のための高感度かつ信頼性あるアッセイが必要と
される。

【０００５】

【従来の技術】このようなアッセイのためのいくつかの
方法論が記述されている。フェルナンデス−サルグエロ
等は、ヒト末梢血リンパ細胞におけるＤＰＤ活性測定の
ための薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）手法を報告し
ている（Fernandez-Salguero et al., 1995, Biochem.
Pharm. 50, 1015-1020）。該アッセイは、基質として放
射標識ウラシルを使用する。しかしながら、放射標識を
使用する方法は、明らかに病院における日常的診断には
適用できない。更に、このようなＴＬＣ法は、時間を消
費するものである。

【０００６】ＨＰＬＣを使用する別の方法も、例えばva
n Gennip et al., 1982, Adv. Exp.Med. Biol., 253A:
111-118、及び Sommadossi et al., 1982, J. Biol. Ch
em., 257: 8171-8176によって記述されている。これら
の方法は、逆相ＨＰＬＣを使用して５−ＦＵの種々の異
化物の合計を測定することにより酵素活性を測定するこ
とに基礎を置くものである。このような方法は、煩雑で
あり、かつ時間を消費するものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明によって向けら
れる課題は、上述した既知の方法の欠点を有さず、かつ
病院における日常的使用のための単純かつ迅速なアッセ
イを提供するＤＰＤ濃度測定のための材料及び方法を見
出すことである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の課題は、添付され
る特許請求の範囲に定義される発明により解決される。
本発明は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰ
Ｄ）、特にはヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ
を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。

【０００９】上記のモノクローナル抗体は、好適にはヒ
ト腫瘍細胞系HT-3 (ATCC HTB-32)由来のホモジネートに
対して強い反応性を示すが、ヒト腫瘍細胞系MCF-7 (ATC
C HTB-22) 由来のホモジネートに対して低い反応性また
はまったく反応性を示さないモノクローナル抗体であ
る。

【００１０】上記のモノクローナル抗体は、ＤＰＤに高
い特異性を示すモノクローナル抗体である。

【００１１】好ましくは、ヒト腫瘍細胞系HT-3 (ATCC H
TB-32)からのホモジネートを用いて選られた免疫沈澱
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される場合に単一バン
ドを示す。

【００１２】該モノクローナル抗体は、好適にはハイブ
リドーマ細胞系2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-
1 (FERM BP-6015), 6H5-42-1, 4B9-12-1 (FERM BP-601
6), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014) 及び 3B12-B1-56-1-2
からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞系によ
り産生されうる。好ましくは、該モノクローナル抗体
は、3A5-6-1 (FERM BP-6015), 4B9-12-1 (FERM BP-601
6), 2E2-B3-1-3 (FERM BP-6014)から選択されるハイブ
リドーマ細胞系により産生され得る。

【００１３】該モノクローナル抗体は、上記細胞系の一
つにより産生されるモノクローナル抗体と同等な態様で
ＤＰＤに結合するモノクローナル抗体、即ち、上記細胞
系の一つにより産生されるモノクローナル抗体と同じエ
ピトープに結合するか、あるいは上記細胞系の一つによ
り産生されるモノクローナル抗体と強く交差反応するモ
ノクローナル抗体でありうる。

【００１４】本発明は、上記に定義されたモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系にも関するもの
である。

【００１５】そのハイブリドーマ細胞系は、好適には上
記第１の特定のハイブリドーマ細胞系群から選択され、
また好ましくは上記第２の特定のハイブリドーマ細胞系
群のうちから選択される。

【００１６】本発明は、ＤＰＤの定量及び／または定性
的検出に有用なモノクローナル抗体の対にも関連し、こ
の対は、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼを特異的
に認識する第１のモノクローナル抗体及びジヒドロピリ
ミジンデヒドロゲナーゼを特異的に認識する第２のモノ
クローナル抗体を含み、該第１のモノクローナル抗体及
び第２のモノクローナル抗体は、互いに異なるエピトー
プを認識する。

【００１７】このようなモノクローナル抗体の対は、第
１のモノクローナル抗体としてMab-3A5-6-1, Mab-6H5-4
2-1 及び Mab-3B12-B1-56-1-2 からなる群から選択され
るモノクローナル抗体を、また第２のモノクローナル抗
体としてMab-4B9-12-1, Mab-2E2-B3-1-3, Mab-9C7, Mab
-2B6 及び Mab-5E6-19-1 からなる群から選択されるモ
ノクローナル抗体を含みうる。

【００１８】好ましくは、第１のモノクローナル抗体は
Mab-3A5-6-1 であり、第２のモノクローナル抗体はMab-
4B9-12-1または Mab-2E2-B3-1-3 である。

【００１９】更に本発明は、生物学的試料中のジヒドロ
ピリミジンデヒドロゲナーゼの検出または定量測定のた
めのキットに関し、（ａ）上記に定義される少なくとも
１種のモノクローナル抗体、及び（ｂ）該モノクローナ
ル抗体とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼとの免疫
接合体を定性的及び／または定量的に検出するための標
識、を有してなる。

【００２０】好ましくは、このキットは上記に定義され
るモノクローナル抗体の対及び標識を含む。

【００２１】他の側面において、本発明は生物学的試料
中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの検出及び／
または定量のための免疫アッセイ方法に関し、該方法は
（ａ）試料を上記に定義される少なくとも１種のモノク
ローナル抗体により処理して、抗体とジヒドロピリミジ
ンデヒドロゲナーゼとの間の免疫接合体を産生させ、及
び（ｂ）前記免疫接合体を標識手段により定性的または
定量的に検出することを含む。

【００２２】免疫アッセイは、免疫アッセイ技術におい
て既知の任意の免疫アッセイ様式であり得る（例えば、
M. Ferencik, 1993, in "Handbook of Immunochemistr
y", Chapman & Hall, London, UK 発刊参照）。特に
は、それは例えば免疫沈降法等の１点結合アッセイ、Ｅ
ＬＩＳＡ等の２点結合アッセイ（サンドイッチアッセ
イ）であり得る。２点結合アッセイは、好ましくは上記
に定義されるモノクローナル抗体対が使用されるであろ
う。

【００２３】

【発明の実施の形態】モノクローナル抗体の調製 特定の抗原に対するモノクローナル抗体の産生の方法論
は、この技術で周知であり、例えば、Harlow et al., 1
988, Section 6 of "Antibodies: a Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Press, New York, USA により
記述されている。

【００２４】ＤＰＤを特異的に認識するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が最初に樹立され
る。この目的のために、実験動物がＤＰＤ蛋白質または
その断片を抗原として免疫される。該実験動物は、ハイ
ブリドーマ細胞系の樹立に使用するために適合するリン
パ細胞及び脾臓細胞等の免疫能をもった細胞を有する任
意の種であり得る。適当な種は、例えば、マウス、ラッ
ト、ウサギ及びヤギである。マウスまたはラットが特に
都合がよい。抗原は、ＤＰＤ蛋白質自体またはその断片
の混合物を含む断片であり得る。抗原として使用される
ＤＰＤ蛋白質またはその断片は、天然供給源から蛋白質
を単離するか、または組換え技術により製造することに
より得られうる。ＤＰＤ蛋白質は、好ましくはヒト由来
の肝臓組織等から、例えば、Lu等のJ. Biol. Chem. 26
7, 17102-17105, 1992 等に既に報告されている単離方
法により得られうる。

【００２５】遺伝子組換え技術は、組換え抗原の調製の
ための都合よい手段を提供する。ヒトＤＰＤのヌクレオ
チド配列は、GenBank ^TM/ EMBLから、アクセス番号Ｕ０
９１７９によって入手可能である（Yokota, H. et al.,
1994, J. Biol. Chem. 269, pp. 23192-23196 ）。ヒ
トＤＰＤのヌクレオチド配列及びそれから導かれるアミ
ノ酸配列は、下記の配列表に配列番号：１及び配列番号
２としてそれぞれ示される。配列情報に基づいて、組換
えＤＰＤ蛋白質またはその断片が、合成ＤＮＡまたはク
ローン化ＤＰＤ遺伝子の何れかを使用して、組換え遺伝
子のための慣用の発現系を使用して産生されうる。クロ
ーニングを要する場合には、クローニング方法は例えば
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応
（ＬＣＲ）、転写増幅または自己維持的配列複製等の任
意の核酸増幅方法に基づきうる。ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）は特に信頼性が高く都合がよい。ＰＣＲクロ
ーニング方法は、ＤＰＤ遺伝子の全ヌクレオチド配列ま
たはその遺伝子の部分ヌクレオチド配列を与えうる。例
においては、ＧＳＴ蛋白質との融合蛋白質の形態でのＤ
ＰＤの断片が、動物の免疫について有効な抗原であるこ
とが示される。

【００２６】配列番号：２に示されるように、アミノ酸
配列はＤＰＤ断片の化学合成のための有用な情報を提供
する。このような合成ペプチドも、本発明に対して抗原
として有用である。上記の何れかの方法により調製され
た抗原は、ウエスタンブロッティングによりそれらの抗
原性が評価されうる。

【００２７】前記抗原のマウス、ラット、ヒツジ、ウサ
ギ等への注射により、本発明のモノクローナル抗体が、
このような免疫動物から抗体の産生細胞を回収し、前記
細胞を不死化することによって調製されうる。上記抗原
による動物の免疫は、例えばHarlow等の上記文献に記述
される様にこの技術で既知の手法によって行われうる。
不死化は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞系を与え、また該抗体産生細胞のミエローマ細胞
との融合のように慣用の様式で行われうる。

【００２８】このようなハイブリドーマ培養物の上澄み
が、ウエスタンブロッティング等のドット−免疫結合ア
ッセイ、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ等の慣用
の手法によりモノクローナル抗体についてスクリーニン
グされる。

【００２９】モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ上
澄みから例えば、イオン交換クロマトグラフィー、蛋白
質Ｇまたは蛋白質Ａでの親和性クロマトグラフィー、Ｈ
ＰＬＣ等の慣用のクロマトグラフィー手法により精製さ
れうる。

【００３０】この分野で既知の手法によるモノクローナ
ル抗体の大量産生のためには、所望の抗体を分泌するハ
イブリドーマが、注射に先立ってプリスタンにて前処理
されたマウスに、腹腔内的に注射される。１匹のマウス
におけるこのような腹水腫瘍によって、約１００ｍｇま
でのモノクローナル抗体が産生されうる。モノクローナ
ル抗体は、例えば例２に記述されるようにこのような腫
瘍により産生される腹水から精製されうる。

【００３１】モノクローナル抗体は、オクタロニー免疫
拡散法等の既知の方法、またはマウス・モノ Ab-ID EIA
キット (Zymed, San Francisco, CA, USA)等の商業的
に入手可能な試験キットを使用して、それらのサブクラ
スに従って、性質決定されうる。本発明においては、例
２において調製されるハイブリドーマ細胞系からの特定
のサブクラスは、それぞれMab-2B6-11-1 (IgG1, κ), M
ab-9C7-30-1 (IgG1,κ), Mab-5E6-19-1 (IgG3,κ), Mab
-3A5-6-1 (IgM,κ) 及びMab-6H5-42-1 (IgM,κ) として
決定された。

【００３２】4B9-12-1, 3A5-6-1 及び2E2-B3-1-3として
命名される本発明によるハイブリドーマ細胞系は、特に
複数部位結合アッセイのための本発明のモノクローナル
抗体の産生に有用である。これらの細胞系は、下記の受
託番号のもとに１９９７年７月８日にブダペスト条約に
基づいて日本の生命工学研究所（ＮＩＢＨＴ）に寄託さ
れている：2E2-B3-1-3についてFERM BP- 6014, 3A5-6-1
についてFERM BP- 6015 及び4B9-12-1についてFERM BP-
6016 。

【００３３】本発明のモノクローナル抗体は、ＤＰＤの
免疫親和性精製法に使用され得る。このような抗体は、
最終的にこの技術で周知の方法、例えばセファロース等
のＣＮＢｒ活性化アガロースに共有結合により結合する
ことにより、固体担体に連結される。

【００３４】更に、本発明のモノクローナル抗体は、ヒ
ト患者の腫瘍組織であり得る生物学的試料中のＤＰＤ濃
度を決定するための診断用の道具としても使用され得
る。このような用途のために、モノクローナル抗体は、
蛍光色素、酵素等の色生成物質（酵素結合免疫吸着アッ
セイ；ＥＬＩＳＡ）またはビオチン等のこの技術で慣用
的に使用される標識に結合されてよい。

【００３５】本発明のモノクローナル抗体の使用により
構築されうるアッセイ様式の性能の評価のために、放射
標識を使用する下記の慣用のアッセイ法が使用され得
る。

【００３６】ＤＰＤ酵素活性のアッセイ方法 ＤＰＤの酵素活性は、５−ＦＵ異化物の合計、即ち［６
−¹⁴Ｃ］５−ＦＵから形成されるジヒドロフルオロウラ
シル、α−フルオロ−β−ウレイドプロピオネート、及
びα−フルオロ−β−アラニンを測定することにより決
定されうる。特に次の手法が上記アッセイに適用され
る。

【００３７】標準反応混合物は、全体積５０μｌ中に、
１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍ
Ｍジチオスレイトール、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２５
０μＭ ＮＡＤＰＨ、２５μＭ ［６−¹⁴Ｃ］５−ＦＵ
（５６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、及び２５μｌ粗製酵素（最終
蛋白質濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を含む。全反応は３７℃に
て３０分間で行われ、次いで反応チューブ（０．５ｍｌ
エッペンドルフチューブ）を沸騰水中に３０分間浸ける
ことにより停止させた。該反応チューブを、更に操作を
行う前に、少なくとも２０分間、−２０℃にて冷凍し
た。蛋白質を遠心分離により除去し、次いで１０μｌの
上澄み液をシリカゲルＴＬＣシート（ＭＥＲＣＫ５７３
５）にスポットし、これには１０ｍＭ ５−ＦＵ、５０
ｍＭ ジヒドロウラシル、２０ｍＭβ−ウレイドプロピ
オネート、１０ｍＭα−フルオロ−β−アラニン及び５
０ｍＭ尿素を含む５μｌの真正マーカー混合物を予めス
ポットしておいた。スポットを、酢酸エチル／イソプロ
パノール／Ｈ₂ Ｏ（６５：２３：１２、ｖ／ｖ／ｖ）の
混合物の溶媒系にて展開した。これらの展開されるマー
カーは、Naguib等、1985, Cancer Res. 45, 5405の方法
により同定した。５−ＦＵ異化物として同定されるスポ
ットの放射能は、ＢＡＳ１０００システム（富士フィル
ム）により検出されうる。ＤＰＤ活性は５−ＦＵの変換
されたｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分として表される。

【００３８】酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ） 本発明のモノクローナル抗体の免疫学的定量アッセイに
おける典型的な応用として、１点結合法及び２点結合法
（いわゆるサンドイッチアッセイ）が考慮される。一般
的には２点結合法が高精度及び高感度の達成において有
利といえる。上記に定義したモノクローナル抗体対を使
用するＥＬＩＳＡは、感度がよくかつ迅速なアッセイ様
式であることが示された（例３参照）。

【００３９】ＥＬＩＳＡは、抗体のうちの一方を固体担
体に固定化し、斯くして固定化された抗体を、ＤＰＤを
含むと考えられる試料と接触させてＤＰＤ−抗体接合体
を形成させ、該接合体を他方のモノクローナル抗体と反
応させてＤＰＤサンドイッチ接合体、即ち抗体−ＤＰＤ
−抗体を形成し、後者の接合体を例えばＨＲＰ標識ラッ
ト抗−マウスイムノグロブリン抗体により標識して該接
合体を検出することにより行われうる。ＨＲＰ標識が使
用される場合には、検出は例えば、ＨＲＰにより触媒さ
れる酵素反応において発色する基質であるＴＭＢ及びＨ
₂ Ｏ₂ を含むＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼキ
ット系（ＫＰＬ）を使用する着色反応により行われう
る。検出のための標識として、ラット抗−マウスイムノ
グロブリン抗体は、ビオチン、酵素、放射性同位体等の
任意の慣用の標識を有してもよい。別法として、可動相
のモノクローナル抗体がＨＲＰ、ビオチン、放射性同位
体、ラテックス粒子等により標識されてもよい。

【００４０】例３に示されるように、ＥＬＩＳＡの高い
感度は、上記に定義されるモノクローナル抗体の対を使
用して達成されうる。この高い感度は、このアッセイ法
を上記のＤＰＤ欠損症状のようにＤＰＤ濃度が低い場合
においても、人体からの生物学的試料におけるＤＰＤ濃
度の測定について有用なものとする。

【００４１】免疫沈降 本発明によるモノクローナル抗体は、免疫沈降法による
ＤＰＤ蛋白質の単離及び測定にも有用である。免疫沈降
の方法論自体は、この技術で周知である。上記に定義さ
れるモノクローナル抗体を使用して、そのモノクローナ
ル抗体の高い結合特異性により複雑な試料からの標的抗
原（ＤＰＤ）の特異的分離が提供される。

【００４２】使用され得る典型的沈降試薬の一つは、マ
ウスイムノグロブリンのＦｃ領域に結合可能な蛋白質Ｇ
が、セファロース４Ｂビーズの表面に固定化された蛋白
質Ｇ−セファロース４Ｂである。この試薬は、ＤＰＤが
存在すると、ＤＰＤ−抗体−蛋白質Ｇ−セファロース４
Ｂの複合体を形成し、該複合体は遠心分離により分離さ
れうる。集められた複合体の沈殿物から、抗原及び抗体
は酸性条件下、例えばグリシン−ＨＣｌ−緩衝溶液、ｐ
Ｈ３．０等により解離されうる。而して分離されたＤＰ
Ｄは、ゲル濾過の方法により容易にイムノグロブリンか
ら単離されうる。ＤＰＤが結合するこのような複合体
は、酵素の単離のみならず、酵素の定量にも有用であ
る。而して本発明のモノクローナル抗体は、下記例６に
示されるように複雑な生物学的試料からのＤＰＤの単離
及び測定のための有力な道具である。

【００４３】抗体捕捉アッセイ 本発明のモノクローナル抗体は、抗体捕捉アッセイにお
いても有用である。このアッセイ様式において、モノク
ローナル抗体はマイクロタイタープレートのウエル等適
当な容器の表面に固定化される。固定化は、この技術で
既知の慣用方法により行われる。ＤＰＤを含む試料がこ
のようなウエルに入れられると、ＤＰＤペプチドは固定
化された本発明のモノクローナル抗体により捕捉され
る。ウエルの洗浄後に、ＤＰＤの基質を含む溶液が添加
される。こうして酵素生成物の検出系は、ＤＰＤ活性の
検出手段を与えるであろう。ＤＰＤ遺伝子に遺伝的損傷
を有する患者の場合に酵素活性を失った変異ＤＰＤ蛋白
質を有し得るために、このアッセイ様式は、捕捉された
ＤＰＤが、本来の酵素的作用を有するか否かを決定する
為に有用であろう。

【００４４】別法として、ＤＰＤが固定化モノクローナ
ル抗体に捕捉された後に、このような免疫複合体が洗浄
され、次いでＤＰＤポリペプチドが、例えば酸性条件等
の適当な緩衝溶液にて溶離される。この操作も、精製Ｄ
ＰＤ調製物を提供する。

【００４５】本発明のモノクローナル抗体を使用する臨
床的方法 更なる側面において、本発明は患者におけるＤＰＤ欠損
状態の測定方法に関し、この方法は；(a) 患者由来の生
物学的試料を上記に定義されるモノクローナル抗体によ
り処理し、及び（ｂ）該モノクローナル抗体とジヒドロ
ピリミジンデヒドロゲナーゼとの免疫接合体を定量的に
測定することを含んでなる。

【００４６】他の側面において、本発明は癌を患う患者
の、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍
薬による治療に対する感受性の評価方法に関し、（ａ）
患者由来の生物学的試料を上記に定義されるモノクロー
ナル抗体により処理し、（ｂ）該モノクローナル抗体及
びヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの免疫学的
接合体を定量的に測定し、患者由来の生物学的試料中の
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度を決定して感
受性の尺度を得ることを含んでなる。

【００４７】上記の方法は、患者についての測定濃度
を、患者の参考濃度と比較することにより上記医薬の有
効性を臨床家が予想することを可能とする。

【００４８】 更なる側面において、本発明は癌を患う
患者の、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗
腫瘍薬による治療に対する感受性の評価方法に関し、
（ａ）患者由来の生物学的試料を上記に定義されるモノ
クローナル抗体により処理し、（ｂ）該モノクローナル
抗体及びヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの免
疫学的接合体を定量的に測定し、患者由来の生物学的試
料中のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度を決定
し（ｃ）前記患者由来の前記生物学的試料のピリミジン
ヌクレオシドホスホリラーゼ濃度を測定し、並びに
（ｄ）該ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ濃度と
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度の比を計算し
て感受性の尺度を得ることを含んでなる。

【００４９】上記方法は、患者についての計算された該
ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ濃度とジヒドロ
ピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度の比を測定濃度を、患
者の参考濃度と比較することにより、上記医薬の有効性
を臨床家が予想することを可能とする。

【００５０】略号 以下において、次の略号がしばしば使用されるであろ
う。 ＤＰＤ ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ ＰｙＮＰａｓｅ ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ ＧＳＴ グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ ＩＰＴＧ イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド ＫＬＨ キーホールリンペットヘモシアニン ５−ＦＵ ５−フルオロウラシル ＣＦＡ 完全フロイントアジュバント ＩＦＡ 不完全フロイントアジュバント ＥＩＡ 酵素免疫アッセイ ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水 ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ＴＭＢ テトラメチルベンジジン （ＴＭＢキットは3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン及びＨ₂ Ｏ₂ を含む） ＴＢＳ トリス緩衝食塩水（２０mM トリス／５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７. ４ ） ＴＴＢＳ ０．０５％ＴＷＥＥＮ（商標）−２０を含むＴＢＳ

【００５１】

【実施例】本発明は、以下の実施例により更に例示され
るであろう。以下の記述は、次の図１，２，３，４，
５，６−１及び６−２を参照することにより、よりよく
理解されるであろう。

【００５２】図１は、例１により産生される組換えＧＳ
Ｔ−ＤＰＤ融合蛋白質の抗−ＤＰＤペプチド２抗体を使
用するウエスタンブロッティングによる抗原性の確認を
示す。図１において、レーン１は分子量マーカー、レー
ン２はＧＳＴ蛋白質自体、及びレーン３はＧＳＴ−ＤＰ
Ｄ融合蛋白質である。

【００５３】図２は、ＤＰＤを含むヒト組織ホモジネー
トに対する本発明のモノクローナル抗体のウエスタンブ
ロットパターンを示す。この図において、レーン１は、
分子量マーカー。レーン２は組換えＤＰＤ（ｒＤＰ
Ｄ）、レーン３はヒト腫瘍細胞系ＨＴ−３の異種移植片
ホモジネート、レーン４，５及び６は、それぞれ異なる
ヒト肺ガンホモジネートである。

【００５４】図３は、例３に記述される本発明によるＥ
ＬＩＳＡによって得られた標準曲線を例示する。この図
において、横軸はＨＴ−３活性の対数であり、縦軸は波
長４５０ｎｍにおいて測定される光学密度の対数であ
る。図３は、本発明のＥＬＩＳＡが、約２．５〜約１７
０ピコモル／分／ｍｌの範囲のＤＰＤ活性を測定し得る
ことを示している。

【００５５】図４は、共に正常組織及び乳癌組織におい
て、ＤＰＤ活性アッセイ及び本発明のＥＬＩＳＡにより
測定されたＤＰＤ濃度の間の相関を例示する。ＤＰＤ活
性アッセイは、¹⁴Ｃ- 放射標識を使用して慣用のＴＬＣ
法により行われた。ここに使用されるＥＬＩＳＡは例３
に記述されるものである。

【００５６】図５は、例５に記述されるようにPyNPase/
DPD 比の測定によるフルツロン（FURTULON）等の５−フ
ルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬に対する
感受性試験の結果を示す。PyNPase 濃度は、Nishida M.
et al., 1996, Biol. Pharm. Bull. 19(11), 1407-141
1 により記述される方法を使用してアッセイされた。ま
たここに使用されるＥＬＩＳＡは、例３に記述されるも
のである。

【００５７】図６および７は、実施例６に記述される本
発明によるモノクローナル抗体を使用する免疫沈殿アッ
セイの結果を例示する。図６（ａ）及び（ｂ）は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示すもので、（ａ）は上澄みにつ
いて、また（ｂ）は免疫沈殿のビーズ溶離物についてで
ある。図７（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、ウエスタンブ
ロットの結果を示すもので（ａ）は抗−ＤＰＤ−１ポリ
ペプチド抗体を使用して検出した上澄みからの結果、
（ｂ）は抗−ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検
出した免疫沈降からの溶出の結果、及び（ｃ）は（ｂ）
と同じ溶離液について本発明のモノクローナル抗体3A5-
6-1が検出に使用された結果を示す。それぞれのレーン
は、下記の試料を使用した免疫沈降アッセイの結果に対
応する：レーン 1: マウス IgG 1; レーン 2: 2B6-11-
1; レーン 3: 2E2-B3-1-3; レーン４：4B9-12-1; 及び
レーン5: 9C7-30-1 。図７（ｂ）のレーンＣは、陽性対
照としてのHT-3のホモジネートの操作である。

【００５８】例１ 抗原の調製 先に記述したように、ヒトＤＰＤのヌクレオチド配列及
びそれから導かれるアミノ酸配列は、Yokota, H. et a
l., 1994, J. Biol. Chem., 269, (37) 23192-23196に
より報告されている（配列番号：１及び配列番号：２参
照）。抗原としての融合蛋白質は、配列番号：１の１１
７０位から３１６４位までの遺伝情報に基づいて調製さ
れ、この融合蛋白質は、下記のように遺伝子情報を保有
するベクターpGEX 4 T-3により形質転換された宿主生物
E. coli JM 109を用いてＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質とし
て発現された。

【００５９】１）ＤＰＤ発現ベクターの構築 配列番号：１の１１７０−３１６４位の遺伝情報に基づ
いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＰＤ遺
伝子分節をクローニングするために、３個のＤＮＡプラ
イマーが調製された。プライマー１（ＥｃｏＲＩリンカ
ー＋センス）は、ＥｃｏＲＩリンカー(CGCGAATTC) を
５’末端部分に含み、及び配列番号：１の１７７０−１
７８５位のヌクレオチドに対応する正の鎖を配列を有す
る２５量体として調製された。 プライマー１：5'-CGCGAATTCTTTTGAAGCTGGATGG-3' ( 配列番号：３) (1770 Eco RI リンカー + センス)

【００６０】プライマー２(Eco RI リンカー + アンチ
センス) は、５’末端部分のEco RIリンカー及び配列番
号：１の３１４８−３１６４位のヌクレオチドの相補的
な負の鎖を含む配列を有する２６量体として調製され
た。 プライマー２： 5'-CGCGAATTCTCACCTTAACACACCGG-3' （配列番号４） (3164 Eco RI リンカー + アンチセンス)

【００６１】プライマー３（アンチセンス）は、配列番
号：１の３４９５−３５１０位のヌクレオチドに対応す
る配列の相補的な配列を有する１６量体として調製され
た。 プライマー３： 5'-AATCAAATATGGAGCA-3' （配列番号：５） (3510 アンチセンス)

【００６２】全ＲＮＡは、ヒト肺二倍体細胞系ＷＩ３８
細胞（ＡＴＣＣ ＣＬＬ−７５）から、ＲＮＡ単離キッ
ト(Stratagene, La Jolla, CA, USA) を使用して、酸グ
アニジニウム・チオシアネート・フェノール・クロロホ
ルム抽出（ＡＧＰＣ）方法（例えば、 Chomczynski, P.
and Sacci, N., 1987, Anal. Biochem. 162, 156-159
参照）に基づき、慣用方法により調製され、プライマー
３を使用して逆転写酵素ＲＡＶ−２による逆転写反応に
付してｃＤＮＡ調製物を得た。反応において、１ｍｇの
全ＲＮＡが、２０ｍｌの反応溶液中で、４２℃において
６０分間、逆転写反応に付され、次いで逆転写酵素が９
５℃にて５分間加熱することにより変性された。こうし
て得たｃＤＮＡ調製物を、ＰＣＲ増幅において使用する
まで、４℃に維持した。ｃＤＮＡの第１鎖の合成に使用
された緩衝溶液は、5 mMのMgCl₂、各１ mM のdGTP、dAT
P、dTTP及びdCTP、Rnase 阻害剤、20 単位の逆転写酵
素RAV-2 並びに 0.75 μM のプライマーを含んでいた。

【００６３】次いでこのｃＤＮＡ調製物は、プライマー
１及び２、並びに商業的ＰＣＲキット、即ちＲＴ−ＰＣ
Ｒキット（タカラ酒造、滋賀、日本）を使用して、ＤＮ
Ａポリメラーゼ（３．５単位のｐｆｕ）をＴａｑポリメ
ラーゼに代えて使用したことを除いてキットの使用書に
従って、サーマルサイクラー装置（ZYMOREACTOR II,ATT
O、東京、日本）上でＰＣＲ増幅に付した。全体積１０
０μｌを有するＰＣＲ増幅緩衝溶液は、2 mMのMgCl₂ 、
各0.2 mM の dGTP 、dATP、dTTP及びdCTP並びに各0.4
μM のプライマーを含んでいた。ＰＣＲプログラムは、
９４℃において３０秒間、５５℃において１分間、及び
７５度において４分間を３２サイクルであった。こうし
て増幅されたＤＰＤ ｃＤＮＡ断片は、アガロースゲル
電気泳動により１．４ｋｂｐに対応するバンドとして単
離され、ＱＩＡＥＸ１１ゲル抽出キット（QIAGEN, Hild
en, Germany ）を用いて精製された。精製されたｃＤＮ
Ａ断片は、ＥｃｏＲＩにより消化され、該ＥｃｏＲＩ断
片は、ＤＮＡリゲーションキット（宝酒造、滋賀、日
本）を用いて１６℃にて一夜でベクターpGEX4T-3 (Phar
macia, Uppsala, Sweden) に、ＥｃｏＲＩ部位にて挿入
された。こうして得られたベクター（以下、pGEX4T-3-D
PDと称する）は、ＧＴＳ−ＤＰＤ融合蛋白質を発現でき
た。上記挿入断片の部分ヌクレオチド配列を決定し、期
待されるＤＰＤ遺伝子の部分配列を有することが確認さ
れた。

【００６４】２）ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質の発現 E. coli JM109 ( 東洋紡、大阪、日本) を、pGEX4T-3-D
PDにより形質転換し、形質転換体を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＳＯＢ（20 g/lのバクト−トリプト
ン、5 g/l のバクト−イースト抽出物、0.5 g/l の塩化
ナトリウム、0.186 g/l の塩化カリウム及び0.95 g/lの
塩化マグネシウム； pH 7.0 ）培地中にて２２℃にて培
養して融合蛋白質を発現させた。前記Ｅ．ｃｏｌｉ形質
転換体の細胞を、0.5 mMのIPTG (イソプロピルβ−Ｄ−
チオガラクトピラノシド) の添加により処理し、２２℃
にて１６時間インキュベートし、次いで１％のTRITON
（登録商標）-X100 、１％のサルコシル、１０ｍＭのＤ
ＴＴ及び２ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳを含む緩衝溶液中で
超音波処理に付した。細胞溶解物を遠心分離し、可溶性
分画をグルタチオン−セファロース４Ｂカラム(Pharmac
ia, Uppsala, Sweden)に負荷した。吸着したＧＳＴ−Ｄ
ＰＤ融合蛋白質を、１０ｍＭの還元グルタチオンにより
溶出した。ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにて約７５ｋＤａ蛋白質として同定した。

【００６５】この目的融合蛋白質は、抗−ＤＰＤペプチ
ド抗体との反応により確認された。この目的で、ＤＰＤ
の２種類のペプチド、即ちペプチド１（配列番号：６）
及びペプチド２（配列番号：７）を、配列番号：２とし
て記述される配列に基づいて化学合成し、例えばHarlow
et al., 1988, in "Antibodies: a Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Press, New York, USA, pp 78
- 79に記述される様にしてグルタールアルデヒド法に
よりＫＬＨと結合し、抗原を得た。２００μｇの各抗原
を、ＣＦＡと共にウサギに皮下的に注射して該動物を免
疫し、続いてＩＦＡを伴う同じ量の抗原による追加免疫
を行った。こうして生成される抗血清をＫＨＬカラム
（ＫＨＬが担体、即ちアフィゲル−１０に固定化された
カラムであり、BioRad, Hercules, CA, USA から入手可
能である）に通して抗−ＫＨＬ抗体を除去し、次いで使
用前に、蛋白質Ｇカラム(MAB Trap GII, Pharmacia, Up
psala,Sweden)またはペプチドカラムに負荷し、０．１
Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０の緩衝溶液にて溶出
し、引き続き１ＭトリスＨＣｌにて中和することにより
精製した。ペプチドカラムは、上記ペプチド１またはペ
プチド２を、アフィゲル−１５(BioRad, Hercules, CA,
USA) に結合することによって調製される。抗−ＤＰＤ
ペプチド１及び抗−ＤＰＤペプチド２ポリクローナル抗
体の両者は、ヒト及びマウス由来のＤＰＤと、ウエスタ
ンブロッティングにおいて反応性であり、従って、ＧＳ
Ｔ−ＤＰＤ融合蛋白質の産生の確認に使用された。上述
のように、該形質転換体は抗−ＤＰＤペプチド２を用い
るウエスタンブロッティングによりＧＳＴ−ＤＰＤ融合
蛋白質を産生することが確認された（図１参照）。図１
において、レーン１は分子量マーカー、レーン２はＧＳ
Ｔ蛋白質自体、レーン３はＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質で
ある。レーン３に見られるように、該融合蛋白質は約７
５ｋＤａの蛋白質として確認された。

【００６６】例２ 抗−ＤＰＤモノクローナル抗体の調製 １）細胞融合 例１において調製されたＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質（動
物当たりに５０μｇ）をＣＦＡと共にＢａｌｂ／ｃマウ
スに１００μｌ／マウスの体積で腹腔内的に注射し、引
き続いて２週間の間隔で２回、ＩＦＡと共に動物当たり
に１０μｇのＧＳＴ−ＤＰＤ蛋白質を用いて腹腔内的に
追加免疫した。最後の免疫から３日後に、感作マウスを
切開して脾臓を取り出し、脾臓細胞を調製した。こうし
て得られた脾臓細胞を、予め約３７℃に加温した血清非
含有ＲＰＭＩ１６４０（ニッケン・セイブツ・イガク・
ケンキュウショ、京都、日本）を用いて注意深く洗浄し
た。引き続く融合処理は、緩衝溶液を含み約３７℃に予
め加温した試薬を使用して行った。

【００６７】マウスミエローマ細胞系P3x63 Ag8-U1 (Fl
ow Laboratories Ltd, Irvine, UKから購入) も、血清
非含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて注意深く洗浄した。該
脾臓細胞（約4 x 10⁸ ）を、マウスミエローマ細胞系P3
x63 Ag8-U1 (8 x 10⁷)と、５：１の比率にて混合し、細
胞融合を下記のように行った。細胞の混合物を遠心によ
りペレット化し、培地を吸引し、次いで該細胞混合物の
ペレットに２５０μｌの５０％ポリエチレングリコール
溶液（PEG1500, Boehringer Mannheim）を、マイクロピ
ペットのチップにてペレットを攪拌しながら１分間でゆ
っくり加え、次いで更に２５０μｌの５０％ポリエチレ
ングリコール溶液を、マイクロピペットのチップにてペ
レットを攪拌しながら１分間でゆっくり加え；次いで該
チューブの穏やかな回転により攪拌を２分間続けた。該
細胞融合混合物に、５０ｍｌの血清非含有ＲＰＭＩ１６
４０培地（ニッケン・セイブツ・イガク・ケンキュウシ
ョ、京都、日本）をゆっくりと５分間で滴下添加し、細
胞を遠心分離により洗浄してＰＥＧを除去した。

【００６８】細胞融合後にペレット化された細胞混合物
を、１０％の子牛血清（ＦＳＣ）、ペニシリン／ストレ
プトマイシン及び２ＭＥを含むＲＰＭＩ１６４０（ニッ
ケン・セイブツ・イガク・ケンキュウショ、京都、日
本）培地中に再懸濁し、９６ウエルプレートのウエルに
ピペットでとり、これを次いで５％ＣＯ₂ 下、３７℃に
てインキュベートした。インキュベーションの間の２
日、４日及び７日目に、各ウエルの培地の半量を、ＨＡ
Ｔ培地（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地にＨＡＴ溶液(F
low Laboratories Ltd, Irvine, UK) を添加することに
より調製）により置き換え、インキュベーションを続け
た。インキュベーションの約１０日目から、いくつかの
ウェルではブドウ状コロニーが形成され、最終的に1056
ウェルにおいてハイブリドーマの増殖が認められた。

【００６９】２）モノクローナル抗体のスクリーニング （２−１）1 次スクリーニング ハイブリドーマの増殖が認められた全ウェルについてＥ
ＬＩＳＡ（固相−抗体結合法）により、次の通り陽性ウ
ェルを調べた。９６ウエル免疫プレート(Maxisorp, Nun
c, Roskilde, Denmark) のウエルを、何れかの蛋白質１
μg/mlを含む溶液の50μl/ウエルの量にてGST-DPD 融合
蛋白質またはＧＳＴにて被覆した。ＴＴＢＳにて未吸着
のタンパクを洗浄除去し、３％のスキムミルク含有ＴＢ
Ｓにてブロッキングを室温で１時間行った。ウエルを再
びＴＴＢＳにて洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を
５０μl/ウエルを以て添加し、３７℃で１時間静置し
た。各ウエルをＴＴＢＳにて３回洗浄した後、２次抗体
として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ) 標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリンIgG+A+M(KPL 社）を加え、該プ
レートを３７℃で約１時間静置した。各ウエルをＴＴＢ
Ｓにて４回洗浄し、次いで基質（ＴＭＢ、マイクロウェ
ル キットシステム, ＫＰＬ社）を加えた。１Ｍリン酸
の添加にて反応を停止した後、マイクロプレートリーダ
ーを用いて４５０nmの吸光度を測定した。ＧＳＴを被覆
したものより、ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質を被覆したも
のに強く反応した陽性ウェルを１次貯留として集めた。

【００７０】（２−２）二次スクリーニング スクリーニングの効率を確認するために、二次スクリー
ニングをウエスタンブロッティングにおいて、ＤＰＤ全
配列を有する組換え蛋白質を使用することにより行っ
た。

【００７１】（Ａ）ＤＰＤ全配列を有する組換え蛋白質の調製 全配列ＤＰＤの組換え蛋白質を、ＲＴ−ＰＣＲクローニ
ングに基づいてＤＰＤの全長ｃＤＮＡをクローニング
し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターpTrcHisA (Invitrogen,
San Diego, USA) に挿入された遺伝子の発現により調製
し、この方法は、ＧＳＴ−ＤＰＤ融合蛋白質のクローニ
ング及び発現における場合と本質的に同じであった。

【００７２】最初に、ｃＤＮＡの第１鎖を、合成プライ
マー２及びＲＡＶ−２逆転写酵素を使用して、ヒト胎盤
及び肝臓ｍＲＮＡ調製物(Clontech, Palo Alto, CA, US
A)の逆転写反応により調製した。次いで、標的ｃＤＮＡ
のＰＣＲ増幅を、合成プライマー４（EcoRI リンカー +
センス、62位； 5'- CGCGAATTCTCGAGACTGTAGGCACT-3'
、配列番号：８) 及びプライマー２並びにｐｆｕＤＮ
Ａポリメラーゼ(Stratagene, Lajolla, CA, USA)を使用
して行った。ＰＣＲは、タカラＲＴ−ＰＣＲキットを使
用して、使用書に従ってサーマルサイクラーZYMOREACTO
R 11 (ATTO, Tokyo, Japan) により、９４℃にて３０秒
間、５５℃にて１分間及び７５℃にて８分間の３５サイ
クルを以て行った。こうして増幅されたｃＤＮＡ断片
を、１％アガロースゲルでの電気泳動にて分離し、所望
のバンドのＤＮＡを、ＤＮＡ精製キットQIAEX11 (QIAGE
N, Hilden, Germany) を用いて精製した。精製されたｃ
ＤＮＡをＥｃｏＲＩにて消化し、次いで発現ベクター、
即ちpTrcHisA (Invitrogen, San Diego, USA) のＥｃｏ
ＲＩ部位にサブクローン化した。こうしてクローン化さ
れたＤＰＤ ｃＤＮＡは、全ＤＰＤ及びヒスチジン標識
蛋白質の融合蛋白質として約１２０ｋＤａの蛋白質を発
現し、これを更にスクリーニングに使用した。

【００７３】（Ｂ）スクリーニング 上記のように得た組換えＤＰＤを、ラエムリの方法論に
従って、NPG-D520L ゲル(Pagel, ATTO, Tokyo, Japan)
上で電気泳動にかけ、該蛋白質を半乾燥ブロッター(ATT
O, Tokyo, Japan)を使用してＰＶＤＦ膜(Immobilon, Mi
llipore, Bedford, MA, USA)上にブロッティングした。
該ＤＰＤ蛋白質がブロッティングされたＰＶＤＦ膜を、
３％スキムミルクを含むＴＢＳを用いてブロックし、Ｔ
ＴＢＳにて洗浄し、次いでスクリーナー・ブロッター・
ミニ２８(Sanplatec Corp., Japan)上で、室温にて１時
間、例１に記述したハイブリドーマの培養上澄みとの反
応に付した。次いで、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳにて洗浄
後、それらを室温にて１時間、ＨＲＰ−標識ヤギ抗−マ
ウスIgG+A+M 抗体（ＫＬＰ）と反応させた。膜をＴＴＢ
Ｓにて再度洗浄し、コニカイムノステイニング（Konica
Immunostaining ）HRP-1000 (Konica, Tokyo, Japan)
を使用して着色反応に付した。約１２０ｋＤａの組換え
ＤＰＤと強く反応した、例えば2B6, 9C7, 5E6, 3A5及び
6H5 と命名されたコロニーを、候補として集めた。ここ
において使用されるように、特定のハイブリドーマ、例
えばハイブリドーマ2B6 により産生されるモノクローナ
ル抗体は、ハイブリドーマの名称の頭に"Mab-"を付すこ
とにより、例えばMab-2B6 として命名される。

【００７４】上記の候補は、制限希釈法を２回以上繰り
返してクローニングし、ハイブリドーマ細胞系（例え
ば、2B6-11-1, 9C7-30-1, 5E6-19-1, 3A5-6-1 及び6H5-
42-1を含む）を樹立した。最初の制限希釈法の後に、上
記のモノクローナル抗体、即ちMab-2B6-11, Mab-9C7-3
0, Mab-5E6-19, Mab-3A5-6 及びMab-6H5-42の特異性
を、ＤＰＤを含む試料を使用してウエスタンブロッティ
ングにより評価した。

【００７５】図２は、ハイブリドーマ細胞系2B6-11, 9C
7-30, 3A5-6-1, 5E6-19 及び6H5-42により産生されるモ
ノクローナル抗体についてのウエスタンブロッティング
の結果を示す。この図に示されるように、抗体及びＤＰ
Ｄにより生じた免疫接合体が、分子量約１１０−１２０
ｋＤａの位置付近に観察された。

【００７６】上記ハイブリドーマ細胞系により産生され
るモノクローナル抗体のサブクラスを、マウス・モノ
（Mouse Mono）Ab-ID EIA Kit (Zymed, San Francisco,
CA, USA) を使用して検査し、それぞれMab-2B6-11-1
(IgG1, κ), Mab-9C7-30-1 (IgG1,κ), Mab-5E6-19-1
(IgG3,κ), Mab-3A5-6-1 (IgM,κ), Mab-6H5-42-1 (Ig
M,κ) として決定された。上記のモノクローナル抗体
は、ＤＰＤ検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡに適用
可能であることが確認された。しかしながら、腫瘍組織
中のＤＰＤ濃度は肝臓よりも低いものと予想され、ＤＰ
Ｄ−欠損水準と正常水準との間の区別を可能とするため
には高感度が必要とされるであろうことから、より高感
度のＥＬＩＳＡ系を構築するために、更なるスクリーニ
ングが好ましいと考えた。

【００７７】（２−３）三次スクリーニング 代表としてハイブリドーマ3A5-6-1 のモノクローナル抗
体をとり、Mab-3A5-6-1 の抗体により認識されるものと
は異なるエピトープを認識し、かつ上記抗体以上に組織
中の天然ＤＰＤの検出においてより高感度を達成するで
あろう更なるモノクローナル抗体をスクリーニングし
た。

【００７８】モノクローナル抗体Mab-3A5-6-1 を、１０
μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウエルを用いて、プレー
トのウエルを被覆するために使用し、未結合抗体を除去
後、各ウエルを室温にて１時間、３％のスキムミルクを
含むＴＢＳにてブロックした。ＴＴＢＳにて洗浄後、ウ
エルを約２μｇ／ｍｌの濃度のマウス肝臓ホモジネート
の５０μｌ／ウエルと、室温にて１時間反応させた。Ｔ
ＴＢＳにて洗浄後、ウエルをハイブリドーマ培養物上澄
の一次貯留の５０μｌ／ウエルと、３７℃にて１時間反
応させた。再度、ＴＴＢＳにより洗浄後、ウエルをＨＲ
Ｐ標識ラット抗−マウスＩｇＧ１特異的モノクローナル
抗体(Zymed, San Francisco, CA, USA)と、３７℃にて
１時間反応させた。ＴＴＢＳによる洗浄に続いて、ウエ
ルをＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼキットシス
テム（ＫＰＬ）を用いて発色に付し、次いで反応を１Ｍ
リン酸の添加により停止させ、マイクロタイタープレー
ト読み取り装置により４５０ｎｍにおける吸光度を測定
した。

【００７９】強い反応を伴う２２個のウエルが決定さ
れ、これらのウエルのハイブリドーマを、上述したと同
様な様式で上記マウス肝臓ホモジネートをヒト腫瘍細胞
系、ＨＴ−３及びＭＣＦ−７のホモジネートに置き換
え、更にスクリーニングに付した。前記ＨＴ−３は、１
６０ｐｍｏｌ／分／ｍｇ蛋白質のＤＰＤ活性を有し、ウ
サギ抗−ＤＰＤ−ペプチド１または抗−ペプチド２ポリ
クローナル抗体を使用するウエスタンブロッティングに
より１１０ｋＤａ付近の単一バンドとして検出される。
他方において、細胞系ＭＣＦ−７は１．６ｐｍｏｌ／分
／ｍｇのＤＰＤ活性を有するが、同様なウエスタンブロ
ッティングにおいては検出されなかった。従って、発明
者等は、細胞系ＨＴ−３と強く反応するが、細胞系ＭＣ
Ｆ−７とは反応しないハイブリドーマ（４Ｂ９及び２Ｅ
２と称する）を選択した。これらのハイブリドーマ４Ｂ
９及び２Ｅ２を、更に２回以上の制限希釈法に付して、
ハイブリドーマクローン4B9-12-1及び2E2-B3-1-3（これ
らの抗体はＩｇＧ１，κとして決定された）を樹立し
た。

【００８０】モノクローナル抗体Mab-4B9-12-1及びMab-
2E2-B3-1-3は、免疫沈降によって可溶化状態のＤＰＤに
対する特異性が確認された。

【００８１】（２−４）モノクローナル抗体の精製 一般的に、本発明のモノクローナル抗体を産生しうるハ
イブリドーマが一旦樹立されると、モノクローナル抗体
の産生及び精製はこの技術で知られているモノクローナ
ル抗体の産生及び精製のための任意の手段によっても行
われうる。例えば、モノクローナル抗体の産生は、ハイ
ブリドーマ細胞を適切な培養培地中で培養し、該培養物
からの抗体の回収及び精製によって実施されうる。別法
として、ハイブリドーマ細胞の増殖は、該細胞をマウス
の腹腔内腹水に植えることによって行われうる。モノク
ローナル抗体の産生及び精製は、下記の特定のモノクロ
ーナル抗体について例示されるように慣用の方法により
行われうる。

【００８２】１）Ｍａｂ−４Ｂ９−１２−１ ハイブリドーマ細胞系4B9-12-1を、血清非含有培地(PM
1000 Kit, Eiken, Tokyo, Japan)中で、細胞濃度約５ｘ
１０⁵ ／mlにおいて培養した。培養の上澄みを集め、該
上澄みをHiTrap 蛋白質G カラム (Pharmacia, Uppsal
a, Sweden) を通すことにより、抗体（ＩｇＧ）を以下
のように精製した。

【００８３】HiTrap蛋白質Ｇカラムを２０ｍＭのリン酸
緩衝溶液（ＰＨ７．０）により平衡化し、次いで上澄み
調製物をカラムにかけた。カラムを２０ｍＭリン酸緩衝
食塩水により洗浄後、ＩｇＧ分画を０．１Ｍグリシン−
ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ３．０）により溶出した。こうし
て集めた分画を、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に
より中和し、次いでＰＢＳに対して透析した。BIO-RAD
Dc 蛋白質アッセイキット(Biorad, Hercules, CA, US
A; 対照はBSA であった) を使用する精製抗体分画の蛋
白質測定は、３００ｍｌの培養上澄みから４ｍｇの抗体
を示した。このモノクローナル抗体のサブクラスはIgG
1, κとして決定された。

【００８４】２）Ｍａｂ−３Ａ５−６−１ マウスに対する０．５ｍｌのプリスタン(Sigma, St. Lo
uis, MO, USA) の腹腔内的注射から１週間後、５ｘ１０
⁵ 細胞のハイブリドーマ3A5-6-1 細胞を、動物の腹腔部
内に注射により接種した。２週間後、動物から腹水を採
取し、遠心分離し、０．８μｍフィルターを通してろ過
した。抗体（ＩｇＭ）の精製は、イムノピュア（Immuno
Pure） IgM 精製キット(Pierce, Rockford, Illinois,
USA) を使用することにより行った。０．５ｍｌの腹水
に０．５ｍｌのイムノピュアＩｇＭ結合緩衝溶液を添加
し、該混合物をイムノピュア固定化ＭＢＰカラムに付加
した。該カラムをイムノピュアＩｇＭ結合緩衝溶液にて
洗浄後、抗体をイムノピュアＩｇＭ溶出緩衝溶液にて溶
出させ、抗体の分画をＰＢＳに対して透析した。ＢＳＡ
を対照とする蛋白質測定は、約０．５ｍｌの腹水から約
２ｍｇの抗体（ＩｇＭ）が得られたことを示した。

【００８５】例３ 本発明のモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡ 免疫学的定量アッセイとして、１点結合法及び２点結合
法（いわゆるサンドイッチアッセイ）が、この技術で周
知である。一般的に、２点結合法は、より高い精度及び
感度を達成するために有利であるといわれている。上記
例２において得られたモノクローナル抗体を、下記のよ
うにサンドイッチＥＬＩＳＡの構築に使用した。

【００８６】（ａ）第１の抗体の被覆 Mab-4B9-12-1の溶液を、１０μｇ／ｍｌの濃度をもっ
て、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて調製し、５０μｌの
この溶液を９６ウエルイムノプレート(Maxsorp,Nunc, R
oskilde, Denmark)の各ウエルに加え、これらのウエル
を膜状封止材で封止し、４℃にて一夜インキュベートし
て抗体を固定化した（この例において、プレートはイン
キュベートの間封止されていた）。

【００８７】未結合抗体の回収後、ウエルをＴＴＢＳに
て洗浄し、次いで３％のスキムミルクを含むＴＢＳを用
い、室温にて３時間インキュベートすることによりブロ
ックした。

【００８８】（ｂ）試料の負荷 ＤＰＤを含有する標準試料として、ＨＴ−３異種移植片
ホモジネートを、２ｍｇ／ｍｌの濃度にて調製した。該
ホモジネートの連続希釈物を１％のスキムミルクを含む
ＴＢＳ中に調製し、５０μｌの試料をそれぞれのウエル
に加え、次いで該イムノプレートを３７℃にて２時間イ
ンキュベートした。

【００８９】（ｃ）第２の抗体との反応 ウエルをＴＴＢＳにて洗浄後、２μｇ／ｍｌのMab-3A5-
6-1 を３％スキムミルクを含むＴＢＳ中に含む抗体溶液
を、５０μｌの体積をもって各ウエルに加え、該イムノ
プレートを３７℃にて１時間インキュベートした。この
処理によって、ＤＰＤが上記試料中に存在する場合に、
ＤＰＤが２個のモノクローナル抗体の間にサンドイッチ
された[Mab-4B9-12-1]-[DPD]-[Mab-3A5-6-1]の免疫接合
体が生成される。

【００９０】（ｄ）標識 該接合体を検出する目的で、ＨＲＰ標識ラット抗−マウ
スＩｇＭ抗体(Zymed,San Francisco, CA, USA) を接合
体の標識に使用した。この商業的に入手可能なＨＲＰ標
識抗体は、３％スキムミルクを含むＴＢＳにて１０００
倍に希釈して使用した。該イムノプレートのウエルを、
ＴＴＢＳにより洗浄し、５０μｌの上記ＨＲＰ標識抗体
を添加し、プレートを３７℃にて１時間インキュベート
した。

【００９１】（ｅ）検出 ウエルの洗浄後、着色反応を、基質としてＨＲＰにより
触媒される酵素反応において発色するTMB 及び H₂O₂ を
含むＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼキットシス
テム（ＫＰＬ）を使用することにより行った。基質溶液
をそれぞれのウエルに加え、１Ｍリン酸の添加により反
応を停止した後に、ウエルの吸光度をマイクロプレート
読み取り装置(BioRad, Hercules, CA, USA) により４５
０ｎｍにて測定した。

【００９２】代表的結果は、下記の表１に要約され、Ma
b-4B9-12-1及びMab-3A5-6-1 を含む上記ＥＬＩＳＡシス
テムにより得られた標準曲線は図３に例示されている。
この図において、横軸はＨＴ−３活性の対数、及び縦軸
は波長４５０ｎｍにて測定した光学密度（ＯＤ）の対数
である。図３に示されるように、本発明のＥＬＩＳＡシ
ステムは、約２．５〜１７０ｐｍｏｌ／分／ｍｌの範囲
にわたりＤＰＤ活性の測定を可能とする。ＤＰＤ ＥＬ
ＩＳＡアッセイのこの高い感度は、人体由来の生物学的
試料のＤＰＤ濃度の決定に有用であろう。更に上記のＤ
ＰＤ ＥＬＩＳＡは、かなり低いＤＰＤ濃度を示すこと
が知られている欠損症由来の試料のＤＰＤ濃度の決定を
可能とするであろう。

【００９３】

【表１】 表１ HT-3 activity^* (pmol/分/ml) OD450^** 167.5 1.313 83.75 0.894 41.88 0.548 20.94 0.320 10.47 0.175 5.23 0.105 2.61 0.060^* 活性、167.5 pmol/mg/分を有する HT-3 標準を使用した^** ブランク水準から差し引いたＯＤ

【００９４】例４ ＥＬＩＳＡ及びＤＰＤ活性の結果間の比較 例３に記述される本ＥＬＩＳＡにより測定された濃度
と、ＤＰＤの酵素活性水準との間の相関を調べた。試料
は、乳癌組織及び外科的摘出である隣接する正常組織で
あった。試料は、組織ホモジネートの形態で調製され
た。略述すれば、腫瘍及び正常組織は、最初に15 mM の
NaCl 、 1.5 mM のMgCl₂ 及び 50 mMのリン酸カリウム
を含む１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．
４）にホモジネート化し、次いで105000 x gにて９０分
間遠心分離した。上澄みを、２０ｍＭのリン酸カリウム
緩衝溶液（ｐＨ７．４）及び１ｍＭの２−メルカプトエ
タノールに対して一夜透析した。

【００９５】ＤＰＤ活性は、上述したように[6-¹⁴C]5-F
U から形成される５−ＦＵ異化物、即ちジヒドロフルオ
ロウラシル、α―フルオロ―β−ウレイドプロピオネー
ト及びα−フルオロ−β−アラニンの合計が測定され
る、Fernandez-Salguero et al., 1995, Biochem. Phar
m. 50, 1015-1020に記述される方法に近い、ＴＬＣ法に
よって測定された。ＥＬＩＳＡは、Ｓｃａｂｅｒ異種移
植片ホモジネート（１０ ⁵ ｐｍｏｌ／分／ｍｇ）を標準
として使用し、例３に記述されるのと同様な様式で行わ
れた。

【００９６】各試料は、上記ＴＬＣプレート法及びＥＬ
ＩＳＡの両者によりアッセイされ、各試料のデータは、
図４に示されるようにＥＬＩＳＡにより測定されたｐｍ
ｏｌ／分／ｍｇにおけるＤＰＤ量をグラフの縦軸に、ま
たＴＬＣ法により測定されたＤＰＤ活性を横軸にプロッ
トした。活性アッセイと、本発明のＥＬＩＳＡの結果間
の高い相関性が、腫瘍組織及び正常組織の両者について
確認された。

【００９７】例５ フルツロン等の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導
体系の抗腫瘍薬の有効性測定に対する本発明のＥＬＩＳ
Ａの適用 ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系の抗腫瘍薬
の一代表例、即ちフルツロン（５‘−デオキシ−５−フ
ルオロウリジン(5'-dFUrd)）は、ヒト細胞においてピリ
ミジンヌクレオシドホスホリラーゼ(PyNPase) 、即ちチ
ミジンホスホリラーゼの作用により５−ＦＵに変換され
るプロドラッグである。

【００９８】腫瘍細胞内のPyNPase/DPD 比を評価するた
めの便利なアッセイシステムを考案した。該システム
は、Nishida M. et al., 1996, Biol. Pharm. Bull. 19
(11),1407-1411 により記述されるPyNPase のアッセイ
のためのＥＬＩＳＡ、及び上記例３に記述される本発明
のＥＬＩＳＡの組み合わせ含む。

【００９９】PyNPase/DPD 比が、フルツロンの有効性の
指標であることを調べるために、この比を、フルツロン
に対して感受性であることが既に知られている多くの腫
瘍組織、及びフルツロンに対して拒絶性であることが知
られている多くの腫瘍組織について測定した。フルツロ
ン−感受性組織の代表としての細胞系は、以下の９種の
ヒト腫瘍異種移植片細胞系である：Scaber (鱗状癌, AT
CC HTB-3), ZR-75 (乳癌), MCF-7 (乳腺癌, ATCC HTB-2
2), LoVo (直腸癌, ATCC CCL-229), KN45 ( 胃癌), SIH
A ( 鱗状癌), ME-180 ( 表皮癌), HCT116 ( 直腸癌) 及
び COLO205 (直腸癌, ATCC CCL 222) 。フルツロン拒絶
性組織の代表として使用した細胞系は以下の７種のヒト
腫瘍異種移植片細胞系である：SK-OV-3 ( 卵巣腫瘍, AT
CC HTB-77), MAD-MB-231 (乳癌), HT-29 (直腸癌, ATCC
HTB-38), T-24 (膀胱癌, ATCC HTB-4), PC-3 ( 前立腺
癌), WiDr-1 ( 直腸癌, ATCC CCL-218) 及び MKN28 (胃
癌) 。

【０１００】本発明のＥＬＩＳＡに基づいて測定された
比を、図５のグラフにプロットした。図に示されるよう
に、フルツロン−感受性細胞系は、拒絶性細胞系よりも
実質的に高いPyNPase/DPD 比を示した。この結果は、腫
瘍組織におけるPyNPase/DPD比が、腫瘍を患う患者の治
療におけるフルツロンの有効性の尺度を与えるために有
用であることを示す。

【０１０１】例６ 本発明によるモノクローナル抗体を使用する免疫沈降ア
ッセイ 腫瘍細胞系ＨＴ−３の異種移植片ホモジネートを、ＤＰ
Ｄを含有する生物学的試料として使用した。該異種移植
片ホモジネート(8.6 mg/ml) を、蛋白質Ｇセファロース
４Ｂカラムに２回通して処理し、宿主に由来する抗体を
吸着させ、下記の免疫沈降アッセイに付した。

【０１０２】１５０μｌのＨＴ−３異種移植片ホモジネ
ートを入れた試験管に、５μｌの試験されるべき本発明
のモノクローナル抗体を加え、試験管を４℃にて２時間
インキュベートした。次いで各２０μｌの５０％蛋白質
Ｇ−セファロース４Ｂ(Sigma, ST. Louis, MO, USA) を
試験管に加え、混合物を更に４℃にて２時間インキュベ
ートした。反応後、混合物を遠心分離してビーズ分画と
上澄みとに分離した。集めたビーズ分画を２０ｍＭのリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて７回洗浄し、
６０μｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ
３．０）中に溶出し；溶出液を３μｌの１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）にて中和して免疫沈降調製物を得
た。

【０１０３】上澄み試料、及び以下ビーズ溶出物と称す
るビーズ分画からの溶出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウ
エスタンブロッティングにより分析した。図６は、本発
明のモノクローナル抗体Mab-2B6-11-1、Mab-2E2-B3-1-
3、Mab-4B9-12-1及びMab-9C7-30-1を使用した免疫沈降
の結果を例示する。

【０１０４】図６の（ａ）及び（ｂ）は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの泳動パターンを示し、ここにおいて（ａ）は上澄
みについて示し、（ｂ）は免疫沈降のビーズ溶出物を示
し、またバンドは銀染色(2D-銀染色第一、第一化学、東
京、日本) により可視化した。

【０１０５】図７の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、ウエ
スタンブロッティングの結果を示し、ここにおいて
（ａ）は抗ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検出
される上澄みからの結果であり、（ｂ）は抗ＤＰＤ−１
ポリペプチド抗体を使用することにより免疫沈降からの
ビーズ溶出物の結果であり、また（ｃ）は検出に本発明
のモノクローナル抗体3A5-6-1 が使用される（ｂ）と同
様のビーズ溶出物からの結果である。それぞれのレーン
は、以下の試料を使用した免疫沈降アッセイの結果に対
応する：レーン１：マウスIgG 1 ；レーン２： 2B6-11-
1 ；レーン３： 2E2-B3-1-3 ；レーン４： 4B9-12-1 ；
及びレーン５： 9C7-30-1 。図７の（ｂ）のレーンｃ
は、陽性対照としてのＨＴ−３ホモジネートの操作であ
る。

【０１０６】図６の（ｂ）に示されるように、免疫沈降
は本発明のモノクローナル抗体、Mab-2E2-B3-1-3 (レー
ン3)及びMab-4B9-12-1 (レーン 4) の場合に約１２０ｋ
Ｄａに対応するバンドとして観察される。ＰＡＧＥゲル
上で、50 kDa 及び 25 kDa辺りに見られるバンドは、
使用された抗体の重鎖及び軽鎖に対応する。

【０１０７】同時に、ウエスタンブロッティングを上澄
み及びビーズ溶出物を使用して行った。ウサギ抗−ＤＰ
Ｄペプチド−１抗体またはMab-3A5-6-1 の何れかが、Ｄ
ＰＤ検出のために使用された。図６の（ａ）に示される
ように、ＤＰＤに対応するバンドは上澄みの試料には観
察されず（レーン３及び４参照）、一方で図７の（ｂ）
及び（ｃ）に示されるように、１２０ｋＤａ辺りの単一
バンドが、Mab-4B9-12-1 及び Mab-2E2-B3-1-3 を用い
た免疫沈殿からの結果であるビーズから溶出される試料
において、抗−ＤＰＤペプチド−１抗体またはMab-3A5-
6-1 を使用して観察され、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥにて
１２０ｋＤａ近傍に観察される単一バンドがＤＰＤに対
応することを裏付けている。更に、Mab-4B9-12-1を用い
た免疫沈降からのビーズ溶出物試料中、及び対応する上
澄みのＤＰＤ活性をアッセイし、ＤＰＤ活性は下記表２
に示されるようにビーズ溶出物中にのみＤＰＤ活性が観
察された。

【０１０８】

【表２】 表２ [DPD 活性: pmol/ 分/ml] HT-3 ホモジネート / Mab + ビーズ 添加抗体 上澄み ビーズ溶出物 マウス IgG1 118.2 <1.41 4B9-12-1 <1.41 85.3

【０１０９】これらの結果は、本発明のモノクローナル
抗体、即ちMab-4B9-12-1及び Mab-2E2-B3-1-3 が、天然
の配位を持った活性なＤＰＤ分子を認識し、かつこれら
の抗体のＤＰＤに対する特異性が、免疫沈降が単一バン
ドとして観察されるように極めて高いことを示してい
る。

【０１１０】更に、Mab-3A5-6-1 が、Mab-4B9-12-1によ
っても特異的に認識されるＤＰＤ分子を特異的に認識す
ることが確認され、このことは本発明のこれらの抗体を
使用するサンドイッチＥＬＩＳＡシステムの信頼性を保
証する。

【０１１１】当業者が容易に理解するように、本発明の
モノクローナル抗体は、ＤＰＤの精製のためのアフィニ
ティカラムの調製にも有用である。

【０１１２】配列表 一般情報 出願人：エフ．ホフマンーラ ロッシュ アーゲー 発明の名称：ジヒドロピリミジン デヒドロゲナーゼを
検出するための免疫学的材料および方法 配列の数 ７ 配列番号：１ 配列の長さ：３９５１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） 起 源 生物名：ホモサピエンス（Homosapiens ） 特性キー：ＣＤＳ 位置：１．．３９５１ 配列決定方法：Ｅ 配列 GCTGTCACTT GGCTCTCTGG CTGGAGCTTG AGGACGCAAG GAGGGTTTGT CACTGGCAGA 060 CTCGAGACTG TAGGCACTGC CATGGCCCCT GTGCTCAGTA AGGACTCGGC GGACATCGAG 120 AGTATCCTGG CTTTAAATCC TCGAACACAA ACTCATGCAA CTCTGTGTTC CACTTCGGCC 180 AAGAAATTAG ACAAGAAACA TTGGAAAAGA AATCCTGATA AGAACTGCTT TAATTGTGAG 240 AAGCTGGAGA ATAATTTTGA TGACATCAAG CACACGACTC TTGGTGAGCG AGGAGCTCTC 300 CGAGAAGCAA TGAGATGCCT GAAATGTGCA GATGCCCCGT GTCAGAAGAG CTGTCCAACT 360 AATCTTGATA TTAAATCATT CATCACAAGT ATTGCAAACA AGAACTATTA TGGAGCTGCT 420 AAGATGATAT TTTCTGACAA CCCACTTGGT CTGACTTGTG GAATGGTATG TCCAACCTCT 480 GATCTATGTG TAGGTGGATG CAATTTATAT GCCACTGAAG AGGGACCCAT TAATATTGGT 540 GGATTGCAGC AATTTGCTAC TGAGGTATTC AAAGCAATGA GTATCCCACA GATCAGAAAT 600 CCTTCGCTGC CTCCCCCAGA AAAAATGTCT GAAGCCTATT CTGCAAAGAT TGCTCTTTTT 660 GGTGCTGGGC CTGCAAGTAT AAGTTGTGCT TCCTTTTTGG CTCGATTGGG GTACTCTGAC 720 ATCACTATAT TTGAAAAACA AGAATATGTT GGTGGTTTAA GTACTTCTGA AATTCCTCAG 780 TTCCGGCTGC CGTATGATGT AGTGAATTTT GAGATTGAGC TAATGAAGGA CCTTGGTGTA 840 AAGATAATTT GCGGTAAAAG CCTTTCAGTG AATGAAATGA CTCTTAGCAC TTTGAAAGAA 900 AAAGGCTACA AAGCTGCTTT CATTGGAATA GGTTTGCCAG AACCCAATAA AGATGCCATC 960 TTCCAAGGCC TGACGCAGGA CCAGGGGTTT TATACATCCA AAGACTTTTT GCCACTTGTA 1020 GCCAAAGGCA GTAAAGCAGG AATGTGCGCC TGTCACTCTC CATTGCCATC GATACGGGGA 1080 GTCGTGATTG TACTTGGAGC TGGAGACACT GCCTTCGACT GTGCAACATC TGCTCTACGT 1140 TGTGGAGCTC GCCGAGTGTT CATCGTCTTC AGAAAAGGCT TTGTTAATAT AAGAGCTGTC 1200 CCTGAGGAGA TGGAGCTTGC TAAGGAAGAA AAGTGTGAAT TTCTGCCATT CCTGTCCCCA 1260 CGGAAGGTTA TAGTAAAAGG TGGGAGAATT GTTGCTATGC AGTTTGTTCG GACAGAGCAA 1320 GATGAAACTG GAAAATGGAA TGAAGATGAA GATCAGATGG TCCATCTGAA AGCCGATGTG 1380 GTCATCAGTG CCTTTGGTTC AGTTCTGAGT GATCCTAAAG TAAAAGAAGC CTTGAGCCCT 1440 ATAAAATTTA ACAGATGGGG TCTCCCAGAA GTAGATCCAG AAACTATGCA AACTAGTGAA 1500 GCATGGGTAT TTGCAGGTGG TGATGTCGTT GGTTTGGCTA ACACTACAGT GGAATCGGTG 1560 AATGATGGAA AGCAAGCTTC TTGGTACATT CACAAATACG TACAGTCACA ATATGGAGCT 1620 TCCGTTTCTG CCAAGCCTGA ACTACCCCTC TTTTACACTC CTATTGATCT GGTGGACATT 1680 AGTGTAGAAA TGGCCGGATT GAAGTTTATA AATCCTTTTG GTCTTGCTAG CGCAACTCCA 1740 GCCACCAGCA CATCAATGAT TCGAAGAGCT TTTGAAGCTG GATGGGGTTT TGCCCTCACC 1800 AAAACTTTCT CTCTTGATAA GGACATTGTG ACAAATGTTT CCCCCAGAAT CATCCGGGGA 1860 ACCACCTCTG GCCCCATGTA TGGCCCTGGA CAAAGCTCCT TTCTGAATAT TGAGCTCATC 1920 AGTGAGAAAA CGGCTGCATA TTGGTGTCAA AGTGTCACTG AACTAAAGGC TGACTTCCCA 1980 GACAACATTG TGATTGCTAG CATTATGTGC AGTTACAATA AAAATGACTG GACGGAACTT 2040 GCCAAGAAGT CTGAGGATTC TGGAGCAGAT GCCCTGGAGT TAAATTTATC ATGTCCACAT 2100 GGCATGGGAG AAAGAGGAAT GGGCCTGGCC TGTGGGCAGG ATCCAGAGCT GGTGCGGAAC 2160 ATCTGCCGCT GGGTTAGGCA AGCTGTTCAG ATTCCTTTTT TTGCCAAGCT GACCCCAAAT 2220 GTCACTGATA TTGTGAGCAT CGCAAGAGCT GCAAAGGAAG GTGGTGCCAA TGGCGTTACA 2280 GCCACCAACA CTGTCTCAGG TCTGATGGGA TTAAAATCTG ATGGCACACC TTGGCCAGCA 2340 GTGGGGATTG CAAAGCGAAC TACATATGGA GGAGTGTCTG GGACAGCAAT CAGACCTATT 2400 GCTTTGAGAG CTGTGACCTC CATTGCTCGT GCTCTGCCTG GATTTCCCAT TTTGGCTACT 2460 GGTGGAATTG ACTCTGCTGA AAGTGGTCTT CAGTTTCTCC ATAGTGGTGC TTCCGTCCTC 2520 CAGGTATGCA GTGCCATTCA GAATCAGGAT TTCACTGTGA TCGAAGACTA CTGCACTGGC 2580 CTCAAAGCCC TGCTTTATCT GAAAAGCATT GAAGAACTAC AAGACTGGGA TGGACAGAGT 2640 CCAGCTACTG TGAGTCACCA GAAAGGGAAA CCAGTTCCAC GTATAGCTGA ACTCATGGAC 2700 AAGAAACTGC CAAGTTTTGG ACCTTATCTG GAACAGCGCA AGAAAATCAT AGCAGAAAAC 2760 AAGATTAGAC TGAAAGAACA AAATGTAGCT TTTTCACCAC TTAAGAGAAG CTGTTTTATC 2820 CCCAAAAGGC CTATTCCTAC CATCAAGGAT GTAATAGGAA AAGCACTGCA GTACCTTGGA 2880 ACATTTGGTG AATTGAGCAA CGTAGAGCAA GTTGTGGCTA TGATTGATGA AGAAATGTGT 2940 ATCAACTGTG GTAAATGCTA CATGACCTGT AATGATTCTG GCTACCAGGC TATACAGTTT 3000 GATCCAGAAA CCCACCTGCC CACCATAACC GACACTTGTA CAGGCTGTAC TCTGTGTCTC 3060 AGTGTTTGCC CTATTGTCGA CTGCATCAAA ATGGTTTCCA GGACAACACC TTATGAACCA 3120 AAGAGAGGCG TACCCTTATC TGTGAATCCG GTGTGTTAAG GTGATTTGTG AAACAGTTGC 3180 TGTGAACTTT CATGTCACCT ACATATGCTG ATCTCTTAAA ATCATGATCC TTGTGTTCAG 3240 CTCTTTCCAA ATTAAAACAA ATATACATTT TCTAAATAAA AATATGTAAT TTCAAAATAC 3300 ATTTGTAAGT GTAAAAAATG TCTCATGTCA ATGACCATTC AATTAGTGGC ATAAAATAGA 3360 ATAATTCTTT TCTGAGGATA GTAGTTAAAT AACTGTGTGG CAGTTAATTG GATGTTCACT 3420 GCCAGTTGTC TTATGTGAAA AATTAACTTT TTGTGTGGCA ATTAGTGTGA CAGTTTCCAA 3480 ATTGCCCTAT GCTGTGCTCC ATATTTGATT TCTAATTGTA AGTGAAATTA AGCATTTTGA 3540 AACAAAGTAC TCTTTAACAT ACAAGAAAAT GTATCCAAGG AAACATTTTA TCAATAAAAA 3600 TTACCTTTAA TTTTAATGCT GTTTCTAAGA AAATGTAGTT AGCTCCATAA AGTACAAATG 3660 AAGAAAGTCA AAAATTATTT GCTATGGCAG GATAAGAAAG CCTAAAATTG AGTTTGTGGA 3720 CTTTATTAAG TAAAATCCCC TTCGCTGAAA TTGCTTATTT TTGGTGTTGG ATAGAGGATA 3780 GGGAGAATAT TTACTAACTA AATACCATTC ACTACTCATG CGTGAGATGG GTGTACAAAC 3840 TCATCCTCTT TTAATGGCAT TTCTCTTTAA ACTATGTTCC TAACCAAATG AGATGATAGG 3900 ATAGATCCTG GTTACCACTC TTTTACTGTG CACATATGGG CCCCGGAATT C 3951 配列番号：２ 配列の長さ：１０２５残基 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：蛋白質 起 源 生物名：ホモサピエンス（Homosapiens ） 位置：１．．１０２５ 配列決定方法：Ｅ 配列 Met Ala Pro Val Leu Ser Lys Asp Ser Ala Asp Ile Glu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Ala Leu Asn Pro Arg Thr Gln Thr His Ala Thr Leu Cys Ser Thr Ser 20 25 30 Ala Lys Lys Leu Asp Lys Lys His Trp Lys Arg Asn Pro Asp Lys Asn 35 40 45 Cys Phe Asn Cys Glu Lys Leu Glu Asn Asn Phe Asp Asp Ile Lys His 50 55 60 Thr Thr Leu Gly Glu Arg Gly Ala Leu Arg Glu Ala Met Arg Cys Leu 65 70 75 80 Lys Cys Ala Asp Ala Pro Cys Gln Lys Ser Cys Pro Thr Asn Leu Asp 85 90 95 Ile Lys Ser Phe Ile Thr Ser Ile Ala Asn Lys Asn Tyr Tyr Gly Ala 100 105 110 Ala Lys Met Ile Phe Ser Asp Asn Pro Leu Gly Leu Thr Cys Gly Met 115 120 125 Val Cys Pro Thr Ser Asp Leu Cys Val Gly Gly Cys Asn Leu Tyr Ala 130 135 140 Thr Glu Glu Gly Pro Ile Asn Ile Gly Gly Leu Gln Gln Phe Ala Thr 145 150 155 160 Glu Val Phe Lys Ala Met Ser Ile Pro Gln Ile Arg Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Pro Pro Pro Glu Lys Met Ser Glu Ala Tyr Ser Ala Lys Ile Ala Leu 180 185 190 Phe Gly Ala Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Phe Leu Ala Arg 195 200 205 Leu Gly Tyr Ser Asp Ile Thr Ile Phe Glu Lys Gln Glu Tyr Val Gly 210 215 220 Gly Leu Ser Thr Ser Glu Ile Pro Gln Phe Arg Leu Pro Tyr Asp Val 225 230 235 240 Val Asn Phe Glu Ile Glu Leu Met Lys Asp Leu Gly Val Lys Ile Ile 245 250 255 Cys Gly Lys Ser Leu Ser Val Asn Glu Met Thr Leu Ser Thr Leu Lys 260 265 270 Glu Lys Gly Tyr Lys Ala Ala Phe Ile Gly Ile Gly Leu Pro Glu Pro 275 280 285 Asn Lys Asp Ala Ile Phe Gln Gly Leu Thr Gln Asp Gln Gly Phe Tyr 290 295 300 Thr Ser Lys Asp Phe Leu Pro Leu Val Ala Lys Gly Ser Lys Ala Gly 305 310 315 320 Met Cys Ala Cys His Ser Pro Leu Pro Ser Ile Arg Gly Val Val Ile 325 330 335 Val Leu Gly Ala Gly Asp Thr Ala Phe Asp Cys Ala Thr Ser Ala Leu 340 345 350 Arg Cys Gly Ala Arg Arg Val Phe Ile Val Phe Arg Lys Gly Phe Val 355 360 365 Asn Ile Arg Ala Val Pro Glu Glu Met Glu Leu Ala Lys Glu Glu Lys 370 375 380 Cys Glu Phe Leu Pro Phe Leu Ser Pro Arg Lys Val Ile Val Lys Gly 385 390 395 400 Gly Arg Ile Val Ala Met Gln Phe Val Arg Thr Glu Gln Asp Glu Thr 405 410 415 Gly Lys Trp Asn Glu Asp Glu Asp Gln Met Val His Leu Lys Ala Asp 420 425 430 Val Val Ile Ser Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser Asp Pro Lys Val Lys 435 440 445 Glu Ala Leu Ser Pro Ile Lys Phe Asn Arg Trp Gly Leu Pro Glu Val 450 455 460 Asp Pro Glu Thr Met Gln Thr Ser Glu Ala Trp Val Phe Ala Gly Gly 465 470 475 480 Asp Val Val Gly Leu Ala Asn Thr Thr Val Glu Ser Val Asn Asp Gly 485 490 495 Lys Gln Ala Ser Trp Tyr Ile His Lys Tyr Val Gln Ser Gln Tyr Gly 500 505 510 Ala Ser Val Ser Ala Lys Pro Glu Leu Pro Leu Phe Tyr Thr Pro Ile 515 520 525 Asp Leu Val Asp Ile Ser Val Glu Met Ala Gly Leu Lys Phe Ile Asn 530 535 540 Pro Phe Gly Leu Ala Ser Ala Thr Pro Ala Thr Ser Thr Ser Met Ile 545 550 555 560 Arg Arg Ala Phe Glu Ala Gly Trp Gly Phe Ala Leu Thr Lys Thr Phe 565 570 575 Ser Leu Asp Lys Asp Ile Val Thr Asn Val Ser Pro Arg Ile Ile Arg 580 585 590 Gly Thr Thr Ser Gly Pro Met Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ser Phe Leu 595 600 605 Asn Ile Glu Leu Ile Ser Glu Lys Thr Ala Ala Tyr Trp Cys Gln Ser 610 615 620 Val Thr Glu Leu Lys Ala Asp Phe Pro Asp Asn Ile Val Ile Ala Ser 625 630 635 640 Ile Met Cys Ser Tyr Asn Lys Asn Asp Trp Thr Glu Leu Ala Lys Lys 645 650 655 Ser Glu Asp Ser Gly Ala Asp Ala Leu Glu Leu Asn Leu Ser Cys Pro 660 665 670 His Gly Met Gly Glu Arg Gly Met Gly Leu Ala Cys Gly Gln Asp Pro 675 680 685 Glu Leu Val Arg Asn Ile Cys Arg Trp Val Arg Gln Ala Val Gln Ile 690 695 700 Pro Phe Phe Ala Lys Leu Thr Pro Asn Val Thr Asp Ile Val Ser Ile 705 710 715 720 Ala Arg Ala Ala Lys Glu Gly Gly Ala Asn Gly Val Thr Ala Thr Asn 725 730 735 Thr Val Ser Gly Leu Met Gly Leu Lys Ser Asp Gly Thr Pro Trp Pro 740 745 750 Ala Val Gly Ile Ala Lys Arg Thr Thr Tyr Gly Gly Val Ser Gly Thr 755 760 765 Ala Ile Arg Pro Ile Ala Leu Arg Ala Val Thr Ser Ile Ala Arg Ala 770 775 780 Leu Pro Gly Phe Pro Ile Leu Ala Thr Gly Gly Ile Asp Ser Ala Glu 785 790 795 800 Ser Gly Leu Gln Phe Leu His Ser Gly Ala Ser Val Leu Gln Val Cys 805 810 815 Ser Ala Ile Gln Asn Gln Asp Phe Thr Val Ile Glu Asp Tyr Cys Thr 820 825 830 Gly Leu Lys Ala Leu Leu Tyr Leu Lys Ser Ile Glu Glu Leu Gln Asp 835 840 845 Trp Asp Gly Gln Ser Pro Ala Thr Val Ser His Gln Lys Gly Lys Pro 850 855 860 Val Pro Arg Ile Ala Glu Leu Met Asp Lys Lys Leu Pro Ser Phe Gly 865 870 875 880 Pro Tyr Leu Glu Gln Arg Lys Lys Ile Ile Ala Glu Asn Lys Ile Arg 885 890 895 Leu Lys Glu Gln Asn Val Ala Phe Ser Pro Leu Lys Arg Ser Cys Phe 900 905 910 Ile Pro Lys Arg Pro Ile Pro Thr Ile Lys Asp Val Ile Gly Lys Ala 915 920 925 Leu Gln Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Glu Leu Ser Asn Val Glu Gln Val 930 935 940 Val Ala Met Ile Asp Glu Glu Met Cys Ile Asn Cys Gly Lys Cys Tyr 945 950 955 960 Met Thr Cys Asn Asp Ser Gly Tyr Gln Ala Ile Gln Phe Asp Pro Glu 965 970 975 Thr His Leu Pro Thr Ile Thr Asp Thr Cys Thr Gly Cys Thr Leu Cys 980 985 990 Leu Ser Val Cys Pro Ile Val Asp Cys Ile Lys Met Val Ser Arg Thr 995 1000 1005 Thr Pro Tyr Glu Pro Lys Arg Gly Val Pro Leu Ser Val Asn Pro Val 1010 1015 1020 Cys 配列番号：３ 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の型：ＤＮＡ 特性キー：ＣＤＳ 配列 CGCGAATTCT TTTGAAGCTG GATGG 25 配列番号：４ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の型：ＤＮＡ 特性キー：ＣＤＳ 配列 CGCGAATTCT CACCTTAACA CACCGG 26 配列番号：５ 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の型：ＤＮＡ 特性キー：ＣＤＳ 配列 AATCAAATAT GGAGCA 16 配列番号：６ 配列の長さ：１８残基 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：ペプチド 位置：５２．．６９ 配列決定方法：Ｅ 配列 Cys Glu Lys Leu Glu Asn Asn Phe Gly Asp Ile Lys His Thr Thr Leu 52 55 60 65 Gly Glu 69 配列番号：７ 配列の長さ：２０残基 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 分子の型：ペプチド 位置：６６０．．６７９ 配列決定方法：Ｅ 配列 Ser Gly Ala Asp Ala Leu Glu Leu Asn Leu Ser Cys Pro His Gly Met 660 665 670 675 Gly Glu Arg Gly 679 配列番号：８ 配列の長さ：２７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の型：ＤＮＡ 特性キー：ＣＤＳ 配列 CGCGAATTCT CGAGACTGTAGGCACT 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、例１により産生される組換えＧＳＴ−
ＤＰＤ融合蛋白質の抗−ＤＰＤペプチド２抗体を使用す
るウエスタンブロッティングによる抗原性の確認を示す
ゲルの写真図であって、レーン１は分子量マーカー、レ
ーン２はＧＳＴ蛋白質自体、及びレーン３はＧＳＴ−Ｄ
ＰＤ融合蛋白質である。

【図２】図２は、ＤＰＤを含むヒト組織ホモジネートに
対する本発明のモノクローナル抗体のウエスタンブロッ
トパターンを示すゲルの写真図であって、レーン１は、
分子量マーカー。レーン２は組換えＤＰＤ（ｒＤＰ
Ｄ）、レーン３はヒト腫瘍細胞系ＨＴ−３の異種移植片
ホモジネート、レーン４，５及び６は、それぞれ異なる
ヒト肺ガンホモジネートである。

【図３】図３は、例３に記述される本発明によるＥＬＩ
ＳＡによって得られた標準曲線を例示するグラフであ
る。この図において、横軸はＨＴ−３活性の対数であ
り、縦軸は波長４５０ｎｍにおいて測定される光学密度
の対数である。

【図４】図４は、共に正常組織及び乳癌組織において、
ＤＰＤ活性アッセイ及び本発明のＥＬＩＳＡにより測定
されたＤＰＤ濃度の間の相関を例示するグラフである。
ＤＰＤ活性アッセイは、14C-放射標識を使用して慣用の
ＴＬＣ法により行われ、ここに使用されるＥＬＩＳＡは
例３に記述されるものである。

【図５】図５は、例５に記述されるようにPyNPase/DPD
比の測定によるフルツロン（FURTULON）等の５−フルオ
ロウラシル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬に対する感受
性試験の結果を示すグラフである。PyNPase 濃度は、Ni
shida M. et al., 1996,Biol. Pharm. Bull. 19(11), 1
407-1411 により記述される方法を使用してアッセイさ
れ、また、ここに使用されるＥＬＩＳＡは、例３に記述
されるものである。

【図６】図６は、実施例６に記述される本発明によるモ
ノクローナル抗体を使用する免疫沈殿アッセイの結果を
例示する写真図である。図６（ａ）及び（ｂ）は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示すもので、（ａ）は上澄みにつ
いて、また（ｂ）は免疫沈殿のビーズ溶離物についてで
ある。

【図７】図７は、実施例６に記述される本発明によるモ
ノクローナル抗体を使用する免疫沈殿アッセイの結果を
例示する写真図である。図７（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）
は、ウエスタンブロットの結果を示すもので（ａ）は抗
−ＤＰＤ−１ポリペプチド抗体を使用して検出した上澄
みからの結果、（ｂ）は抗−ＤＰＤ−１ポリペプチド抗
体を使用して検出した免疫沈降からの溶出の結果、及び
（ｃ）は（ｂ）と同じ溶離液について本発明のモノクロ
ーナル抗体3A5-6-1 が検出に使用された結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ 33/573 33/577 Ｂ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 ＺＮＡＣ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ
   （ＤＰＤ）を特異的に認識するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナー
   ゼを特異的に認識する請求項１に記載のモノクローナル
   抗体。
3. 【請求項３】 ヒト腫瘍細胞系HT-3 (ATCC HTB-32)由来
   のホモジネートに対して強い反応性を示すが、ヒト腫瘍
   細胞系MCF-7 (ATCC HTB-22) 由来のホモジネートに対し
   て低い反応性を示すかまったく反応性を示さない請求項
   １または２に記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 ヒト腫瘍細胞系HT-3 (ATCC HTB-32)由来
   のホモジネートを用いて得た免疫沈澱が、ＳＤＳ−ＰＡ
   ＧＥにより分析された場合に単一バンドを示す請求項３
   に記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 ハイブリドーマ細胞系2B6-11-1、 9C7-3
   0-1 、 5E6-19-1 、3A5-6-1 (FERM BP-6015) 、 6H5-42
   -1 、 4B9-12-1 (FERM BP-6016)、 2E2-B3-1-3 (FERM B
   P-6014) 及び 3B12-B1-56-1-2.からなる群から選択さ
   れるハイブリドーマ細胞系により産生されうる請求項１
   ないし４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のモノクローナル抗体と
   同等な様式でＤＰＤに結合する請求項１ないし４のいず
   れか１項に記載のモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれか１項に記載
   のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
   系。
8. 【請求項８】 ハイブリドーマ細胞系2B6-11-1、 9C7-3
   0-1 、 5E6-19-1 、3A5-6-1、 6H5-42-1 、 4B9-12-1
   、 2E2-B3-1-3 及び 3B12-B1-56-1-2 からなる群から
   選択される請求項７に記載のハイブリドーマ細胞系。
9. 【請求項９】 請求項１ないし６のいずれかに記載の第
   １のモノクローナル抗体及び請求項１ないし６のいずれ
   かに記載の第２のモノクローナル抗体を含んでなり、該
   第１のモノクローナル抗体と該第２のモノクローナル抗
   体とが異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体
   の対。
10. 【請求項１０】 該第１のモノクローナル抗体が、Mab-
    3A5-6-1 、 Mab-6H5-42-1 及び Mab-3B12-B1-56-1-2 か
    らなる群から選択され、該第２のモノクローナル抗体
    が、Mab-4B9-12-1、 Mab-2E2-B3-1-3 、 Mab-9C7-30-1
    、 Mab-2B6-11-1 及び Mab-5E6-19-1 からなる群から
    選択される請求項９に記載の対。
11. 【請求項１１】 該第１のモノクローナル抗体がMab-3A
    5-6-1 であり、及び該第２のモノクローナル抗体がMab-
    4B9-12-1である請求項１０に記載の対。
12. 【請求項１２】 該第１のモノクローナル抗体がMab-3A
    5-6-1 であり、及び該第２のモノクローナル抗体がMab-
    2E2-B3-1-3である請求項１０に記載の対。
13. 【請求項１３】 生物学的試料中のジヒドロピリミジン
    デヒドロゲナーゼの検出または定量のためのキットであ
    って、 （ａ）請求項１−６項のいずれか一つに記載の少なくと
    も１種のモノクローナル抗体、及び （ｂ）該モノクローナル抗体及びジヒドロピリミジンデ
    ヒドロゲナーゼの免疫接合体を定性的または定量的に検
    出するための標識、 を有してなるキット。
14. 【請求項１４】 請求項９ないし１１のいずれかに記載
    のモノクローナル抗体の対、ならびに該モノクローナル
    抗体とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼとの間の免
    疫接合体を定性的及び／または定量的に検出するための
    標識を含んでなる請求項１３に記載のキット。
15. 【請求項１５】 生物学的試料中のジヒドロピリミジン
    デヒドロゲナーゼの検出及び／または定量のための請求
    項１３または１４項に記載のキットの使用。
16. 【請求項１６】 生物学的試料中のジヒドロピリミジン
    デヒドロゲナーゼの検出及び／または定量のための免疫
    アッセイであって、 （ａ）試料を、請求項１ないし６項のいずれかに記載の
    少なくとも１種のモノクローナル抗体を用いて処理し、
    その抗体とジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼとの間
    の免疫接合体を生成させ、及び （ｂ）前記免疫接合体を標識の手段により定性的または
    定量的に検出することを含んでなる、免疫アッセイ。
17. 【請求項１７】 免疫沈澱アッセイである請求項１６に
    記載のアッセイ。
18. 【請求項１８】 酵素連結免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩ
    ＳＡ）である請求項１６に記載のアッセイ。
19. 【請求項１９】 患者におけるＤＰＤ欠損状態の測定方
    法であって； （ａ）患者由来の生物学的試料を請求項２ないし６項の
    いずれかに記載のモノクローナル抗体により処理し、及
    び （ｂ）該モノクローナル抗体とジヒドロピリミジンデヒ
    ドロゲナーゼとの免疫接合体を定量的に測定すること、 を含んでなるＤＰＤ欠損状態の測定方法。
20. 【請求項２０】 癌を患う患者の、５−フルオロウラシ
    ル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬による治療に対する感
    受性の評価方法であって； （ａ）患者由来の生物学的試料を請求項２ないし６項の
    いずれかに記載のモノクローナル抗体により処理し、 （ｂ）該モノクローナル抗体及びジヒドロピリミジンデ
    ヒドロゲナーゼの免疫学的接合体を定量的に測定し、患
    者由来の生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロ
    ゲナーゼ濃度を決定して感受性の尺度を得ること、 を含んでなる５−ＦＵ誘導体系抗腫瘍薬による治療に対
    する感受性の評価方法。
21. 【請求項２１】 癌を患う患者の、５−フルオロウラシ
    ル（５−ＦＵ）誘導体系抗腫瘍薬による治療に対する感
    受性の評価方法に関し、 （ａ）患者由来の生物学的試料を請求項２ないし６項の
    いずれかに記載のモノクローナル抗体により処理し、 （ｂ）該モノクローナル抗体及びジヒドロピリミジンデ
    ヒドロゲナーゼの免疫学的接合体を定量的に測定し、患
    者由来の生物学的試料中のジヒドロピリミジンデヒドロ
    ゲナーゼ濃度を決定し （ｃ）前記患者由来の前記生物学的試料のピリミジンヌ
    クレオシドホスホリラーゼ濃度を測定し、並びに （ｄ）該ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ濃度と
    ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ濃度の比を計算し
    て感受性の尺度を得ること、 を含んでなる５−ＦＵ誘導体系抗腫瘍薬による治療に対
    する感受性の評価方法。