JPH05317087A - 抗ヒトオルニチン脱炭酸酵素抗体及びそれを用いたヒトオルニチン脱炭酸酵素の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトオルニチン脱炭酸酵素を対応抗原とす
る抗体を提供すること及び該抗原を用いたヒトオルニチ
ン脱炭酸酵素の測定方法を提供すること。 【構成】 ヒトオルニチン脱炭酸酵素に特異的結合性
を有するポリクローナル抗体を提供した。また、ヒトオ
ルニチン脱炭酸酵素に特異的結合性を有するモノクロー
ナル抗体を提供した。さらに、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを提供した。さらに、上記本発
明の抗体と、ヒトオルニチン脱炭酸酵素との特異的結合
性を利用した免疫測定法によりヒトオルニチン脱炭酸酵
素を測定する、ヒトオルニチン脱炭酸酵素の測定方法を
提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗ヒトオルニチン脱炭
酸酵素抗体及びそれを用いたヒトオルニチン脱炭酸酵素
の測定方法に関する。本発明の抗体は癌の診断に用いる
ことができる。

【０００２】

【従来の技術】オルニチン脱炭酸酵素（以下、ＯＤＣと
言うことがある）は、ポリアミン生合成系の初発酵素で
あり（Ｐｅｇｇ，Ａ．Ｅ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２
３４巻、２４９頁、１９８６年）、薬物等の刺激により
速やかに活性の変化を示し、これが細胞の増殖や発ガン
に関係していることが知られている（Ｆｅｉｎｓｔｅｉ
ｎ，Ｓ．Ｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８２巻、５７６１頁、１９８５年；Ｋａｔ
ｚ，Ａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７巻、２６
４１頁、１９８７年；Ｌａｕ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４巻、１１８２
頁、１９８７年等々）。また、ＯＤＣは、細胞増殖に際
して上昇するため、腫瘍の生物学的悪性度を表現する指
標となることが示されている（村上信三ら、日消誌、８
６巻、１２６０頁、１９８９年；中西一夫ら、医学の歩
み、１５３巻、７０９頁、１９９０年；山本修美、日外
会誌、９０巻、１０４９頁、１９８９年；Ｎａｒｉｓａ
ｗａ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ，６３巻、１５７２頁、１
９８９年等々）。

【０００３】ＯＤＣ活性測定は、一般に¹⁴Ｃ標識オルニ
チンから脱炭酸された¹⁴ＣＯ₂ をプロトゾル等の二酸化
炭素吸着剤に吸収させ、吸収された¹⁴ＣＯ₂ を測定する
もの（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻、１４２０頁、１９
６８年）であり、気体状の放射性物質を扱うため、操作
が煩雑であり誤差が大きい。一方、ＯＤＣ量をラジオイ
ムノアッセイで測定する方法として、 ³Ｈ−ＤＦＭＯ−
標識ＯＤＣを用いる方法（Ｓｅｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．ら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８巻、２４９６頁、１
９８３年）や ¹²⁵Ｉ−標識ＯＤＣを用いる競合法（Ｉｓ
ｏｍｍａ，Ｖ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
５８巻、６７３５頁、１９８３年）があるが、前者は感
度に問題があり、後者では ¹²⁵Ｉ−標識ＯＤＣを調製す
る必要がある。

【０００４】近年、これらの問題を解決すべく、ＯＤＣ
に対する酵素免疫測定法（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｍら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻、１９頁、１９８
９年）やモノクローナル抗体を利用した測定法（ＣＡ１
２１５０１０、特開平２−１７６５６４号）が考案され
ている。しかしながら、ヒトＯＤＣを動物の免疫に必要
な量確保することは困難であるため、上記従来の測定系
開発に使用されたＯＤＣは、マウスやラット等、ヒト以
外の動物から調製したものである。このため、ヒトＯＤ
Ｃとの抗原性の違いが予想され、高い測定精度の要求さ
れるヒトの臨床診断への適用には問題がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ヒトＯＤＣを対応抗原とする抗体を提供すること及
び該抗原を用いたヒトＯＤＣの測定方法を提供すること
である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ヒトＯＤＣを遺伝子工学的手法により大量に
調製することに成功し、このように調製されたヒトＯＤ
Ｃを免疫原として用いることにより抗ヒトＯＤＣポリク
ローナル抗体及び抗ヒトＯＤＣモノクローナル抗体を得
ることに成功し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、ヒトオルニチン脱炭
酸酵素に特異的結合性を有するポリクローナル抗体を提
供する。また、本発明は、ヒトオルニチン脱炭酸酵素に
特異的結合性を有するモノクローナル抗体を提供する。
さらに、本発明は、該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを提供する。さらに、本発明は、上記本発
明の抗体と、ヒトオルニチン脱炭酸酵素との特異的結合
性を利用した免疫測定法によりヒトオルニチン脱炭酸酵
素を測定する、ヒトオルニチン脱炭酸酵素の測定方法を
提供する。

【０００８】以下、本発明のポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体の調製方法を順を追って説明する。

【０００９】(1) 免疫抗原の調製 ヒトｃＤＮＡ ヒトＯＤＣを遺伝子工学的に製造するために、先ず、ヒ
トｃＤＮＡを得る。これは、常法に基づき、ヒト組織
（例えば腎臓、肝臓、心臓、胎盤、膵臓及び大腸等）又
はヒト培養細胞からｍＲＮＡを抽出後、逆転写酵素にて
合成することができる。あるいは、ヒトｃＤＮＡライブ
ラリーが市販されている（例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社
製、腎臓、肝臓、心臓、胎盤、膵臓、大腸等又は種々の
ヒト培養細胞のλｇｔ１０ライブラリー）ので、このよ
うな市販のヒトｃＤＮＡライブラリーを用いることもで
きる。

【００１０】遺伝子増幅反応（ＰＣＲ法） ｉ）プライマー ヒトＯＤＣのｃＤＮＡの塩基配列はＨｉｃｋｏｋらによ
り決定されている（Ｈｉｃｋｏｋ，Ｎ．Ｊ．ら、ＤＮ
Ａ、６巻、１７９頁、１９８７年）ので、ｃＤＮＡ上の
任意の２カ所を選び、プライマーをその塩基配列に基づ
いて通常のＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム
ズ社製３９１−０２機等）により合成する。もっとも、
増幅されたＤＮＡがコードするポリペプチドが抗原性を
有する程度の長さを持っていることが必要である。ま
た、プライマーの長さは２０〜３０オリゴヌクレオチド
程度が好ましく、また、プライマーの５’末端はｃＤＮ
Ａ発現用ベクターに連結し易いように、制限酵素部位を
付加しておいてもよい。なお、Ｈｉｃｋｏｋらによって
決定されたヒトＯＤＣのｃＤＮＡの塩基配列は下記配列
表に示されている。

【００１１】ｉｉ）ＰＣＲ条件 ＰＣＲの試薬キットはパーキンエルマー−シータス社か
ら市販されており、その指示書に従って、ＰＣＲを行な
うことができる。あるいは、次の条件によってもＰＣＲ
を行なうことができる。 反応組成 １００μｌ ＤＮＡ ０．１〜１μｇ プライマー 各２５〜１００ｐｍｏｌ ｄＮＴＰ 各２００μＭ Tris-HCl(pH8.3) １０ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭ ゼラチン ０．０１％ Taq ポリメラーゼ ２．５〜５単位 ９５℃、３０秒〜１分（第１工程） ↓ ３７℃〜５５℃、３０秒〜２分（第２工程） ↓ ７０℃〜７４℃、１分〜３分（第３工程） ↓ 第１工程に戻り、第１〜３工程のサイクルを２５〜４０
回繰り返す。

【００１２】ｉｉｉ）増幅したｃＤＮＡの調製 ＰＣＲで増幅したＤＮＡは、０．６〜２％アガロースゲ
ルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで検出したＤＮ
Ａのバンドを切り出し、通常の方法（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．ら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂ．ＮＹ等）で調製することができる。

【００１３】遺伝子発現ベクターへの連結、組換えプ
ラスミドの構築 ｉ）発現ベクター 発現ベクターとしては、遺伝子発現のためのプロモータ
ー、ＳＤ配列、遺伝子挿入用制限酵素切断部位、ターミ
ネーター等の配列を含むプラスミドから成る、遺伝子工
学一般に用いられている発現ベクターを利用することが
できる。特に、プロテインＡ等のアフィニティ精製が可
能なタンパク質をコードする遺伝子と融合して発現され
る遺伝子融合型発現ベクターを用いると遺伝子産物の精
製が容易になるので好ましい。これらの発現ベクターは
市販されており、例えば、ファルマシア社から市販され
ているｐＫＫ２３３−３、ｐＲＩＴ２Ｔ及びｐＧＥＸ−
３Ｘ等を挙げることができる。

【００１４】ｉｉ）ｃＤＮＡの連結、組換えプラスミド
の構築 (1) で調製したＤＮＡを、制限酵素で切断した発現ベ
クターに連結する。制限酵素は多く市販されており、連
結反応は市販の酵素又はキットを用いて行なうことがで
きる（例えば、宝酒造社製、ライゲーションキット
等）。連結した組換えプラスミドは、上記連結反応溶液
を用いてコンピテントな大腸菌を形質転換し、組換えプ
ラスミドを保持する大腸菌を選択することにより取得す
ることができる。これらは、通常の遺伝子操作であり、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（上掲）等に記載
されている。

【００１５】組換え菌の培養 組換えプラスミドを保持する大腸菌を、ＬＢ培地にて対
数増殖中期程度まで増殖させた後、使用する宿主と発現
ベクターに応じ、遺伝子発現のための誘導処理（例え
ば、発現がｔａｃプロモーターの制御下で行われる場合
には、１ｍＭ ＩＰＴＧ添加、λＰ_R プロモーターの場
合は、培養温度の４２℃へのシフト等）を行ない、さら
に２〜４時間程度の培養を行なう。

【００１６】ヒトＯＤＣの分離、精製 組換え菌を遠心分離により集菌し、超音波処理等で菌体
を破砕した後、遺伝子産物が封入体を形成する場合は、
遠心分離の後尿素による可溶化を行ない、イオン交換体
（ＤＥＡＥ等）による吸脱着法、ゲルろ過法、電気泳動
法、特異的吸着担体による吸脱着法等によりヒトＯＤＣ
の分離、精製を行なうことができる。ヒトＯＤＣが融合
タンパク質として発現される場合には、融合タンパク質
からの切断はタンパク質分解酵素ファクターＸａ（ベー
リンガー・マンハイム社製）により該製品の処方に従い
行なうことができる。切断処理後、イオン交換体（ＤＥ
ＡＥ等）による吸脱着法、ゲルろ過法、電気泳動法、特
異的吸着担体による吸脱着法等によりヒトＯＤＣの分
離、精製を行なうことができる。なお、ヒトＯＤＣの分
離、精製の具体的条件の一例は下記実施例に記載されて
いる。

【００１７】(2) 動物への免疫、ポリクローナル抗体取
得 上記のようにして得られた精製ヒトＯＤＣは、常法に基
づき動物に免疫することができる。すなわち、例えばサ
ル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツ
ジ、ヤギ、ニワトリ等の温血動物に対し、それ自体又は
担体若しくは希釈剤と共に皮下注射等により精製ヒトＯ
ＤＣを投与することができる。投与に際して抗体産生能
を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フ
ロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常、
２〜６週毎に１回ずつ、計３〜６回程度行なう。ポリク
ローナル抗体は、上記の方法で免疫された血液から採取
することができる。

【００１８】(3) モノクローナル抗体取得 免疫 上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に、温血動
物、例えばマウスを免疫する。

【００１９】細胞融合 抗体価の認められた固体を選択し、最終免疫の２〜５日
後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞をミエローマ細胞（例えばＮＳ−０、ＮＳ−
１、Ｐ３Ｕ１等）と融合させる。融合操作は既知の方
法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２５６巻、４９５頁、１９７５年）に従って行なう
ことができる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）と
ミエローマ細胞との好ましい比率は１：１〜２０：１程
度であり、ＰＥＧ（好ましくは分子量１０００〜６００
０）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、３０〜３７
℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率良
く細胞融合を実施することができる。

【００２０】スクリーニング ハイブリドーマを常法により、ＨＡＴ培地等により選択
した後、ヒトＯＤＣを吸着させた固相（例えばマイクロ
プレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、酵素
（例えばアルカリフォスファターゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−カラクトシダーゼ又は西洋ワサビペル
オキシダーゼ等）で標識した抗免疫グロブリン抗体（細
胞融合に用いられる細胞がマウスであれば抗マウス免疫
グロブリン抗体が用いられる）を加え、固相に結合した
抗ヒトＯＤＣモノクローナル抗体を検出する酵素抗体法
等によりヒトＯＤＣ産生ハイブリドーマのスクリーニン
グを行なうことができる。

【００２１】クローニング ヒトＯＤＣ産生ハイブリドーマのクローニングは、常法
である限界希釈法又は軟寒天法により行なうことができ
る。

【００２２】モノクローナル抗体の生産 モノクローナル抗体は、血清培地又は無血清培地を用い
たハイブリドーマの大量培養により取得するか又はマウ
スの腹水にハイブリドーマを接種し、マウスの腹水から
取得することができる。

【００２３】(4) 抗体の精製 抗体は、常法により、プロテインＡやプロテインＧ−セ
ファロース（登録商標）アフィニティカラム又は高速液
体クロマトグラフィー等により精製することができる。

【００２４】本発明のポリクローナル抗体及びモノクロ
ーナル抗体は、ヒトＯＤＣとの特異的結合性を利用し
て、免疫測定法によりヒトＯＤＣを測定するために用い
ることができる。免疫測定法の態様は特に限定されるも
のではなく、従来から知られているいずれの免疫測定
法、例えば酵素抗体法やサンドイッチ酵素抗体法等、に
も用いることができる。好ましい態様としては、例え
ば、本発明の第１の抗体を例えばマイクロプレートのウ
ェルやマイクロビーズ等の固相担体上に不溶化し、これ
を被検液と接触させ、次いで、酵素等の適当な標識剤で
標識化した、第１の抗体とはエピトープが異なる第２の
本発明の抗体を反応させた後、固相に結合された標識剤
を測定することから成る、サンドイッチ法による免疫測
定法が挙げられる。また、本発明の抗体を用いて、ヒト
の組織を常法に基づき免疫化学的に染色することもで
き、それによって癌細胞を検出することができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明により、ヒトＯＤＣに対するポリ
クローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにそれらを
用いたヒトＯＤＣの測定方法が提供された。本発明の抗
体は、従来の抗ＯＤＣ抗体とは異なり、ヒトＯＤＣを抗
原としているので、癌の臨床診断等において高感度にヒ
トＯＤＣを測定することができる。

【００２６】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２７】（１）ＯＤＣ−ｃＤＮＡ発現系の構築 ｉ）ＯＤＣ−ｃＤＮＡの調製 ＯＤＣ−ｃＤＮＡの塩基配列（別表）に基づき、ＯＤＣ
蛋白をコードする領域の５’側と３’側の配列２３残基
に、それぞれ５’側に制限酵素BamHI、 EcoRI切断部位を
付加したオリゴヌクレオチド（３０残基）を、ＤＮＡ合
成機（アプライド・バイオシステムズ社製・モデル 391
-02 ）を使用し、通常の方法により合成した。 ５’側 5'-GGGATCCCCATGAACAACTTTGGTAATGAA-3' ３’側 5'-GGGAATTCTACACTTAAATACTAGCCGAAG-3' 上記オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド精製カ
ートリッジ（アプライド・バイオシステムズ社製・ＯＰ
Ｃ（登録商標）で精製し、ＰＣＲ用のプライマーに供し
た。

【００２８】ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１
０ライブラリー、クローンテック社）を、通常の方法
（Molecular Cloning, Maniatis,T., et al, Cold Spri
ng Harbor Lab. NY ）で増幅後、ＤＮＡを調製した。こ
れを１μｇ、各プライマーを１００ｐｍｏｌ使用し、Ｄ
ＮＡ増幅試薬キット（パーキンエルマーシータス社・Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ（登録商標）及びＤＮＡサーマルサイクラ
ー（パーキンエルマーシータス社）でＰＣＲを行った。
変熱性９５℃１分、アニーリング５５℃２分、相補鎖合
成７２℃３分の一連のステップを２５サイクル繰り返し
た後、反応産物を０．６％アガロースゲル電気泳動した
ところ、１．４ｋｂ付近に単一のバンドが検出されたた
め、通常の方法にてゲルから切り出し調製した。これを
制限酵素 BamHI、 EcoRI で切断し、０．６％アガロース
ゲル電気泳動・ゲルからの切り出しにより、ＯＤＣ−ｃ
ＤＮＡを BamHI〜EcoRI 断片として取得した。

【００２９】２）ＯＤＣ−ｃＤＮＡ発現プラスミドの作
製 プロテインＡ遺伝子融合ベクター（ｐＲＩＴ２Ｔ・ファ
ルマシア製）における融合蛋白からのプロテインＡ蛋白
部分の確実な切除のため、プロテインＡのＣ末部分を、
プロテアーゼ・ファクターＸで切除可能なグルタチオン
Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合ベクター
（ｐＧＥＸ−３Ｘ・ファルマシア製）のＧＳＴのＣ末部
分に交換した改変プロテインＡ遺伝子融合遺伝子ベクタ
−を作製（図１）し、ＯＤＣ−ｃＤＮＡ発現用ベクター
に使用した。

【００３０】この発現ベクターを制限酵素 BamHI、 EcoR
I で切断し、ｉ）で調製したＯＤＣ−ｃＤＮＡ断片と連
結後、コンピテントな大腸菌（遺伝子誘導のかからな
い） N99cI⁺ （ファルマシア社より市販）に形質転換
し、ＯＤＣ−ｃＤＮＡを含む組換えプラスミド（図２）
を保持する大腸菌を選択した。本菌よりプラスミドを抽
出し、遺伝子発現誘導のかかる大腸菌 N4830-1（ファル
マシア社より市販）を形質転換した。こうして得られた
組換え菌を、ＬＢ培地中３０℃で対数増殖中期（ＯＤ
₆₀₀ ＝０．３）まで培養の後、４２℃にて２．５時間培
養し粗蛋白をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
したところ、プロテインＡとＯＤＣの融合蛋白と考えら
れる約９０Ｋｄのバンドを検出した。

【００３１】同様に、ｐＧＥＸ−３Ｘにもｉ）で調製し
たＤＮＡ断片を連結し大腸菌 JM109を形質転換すること
によりグルタチオンＳトランスフェラ−ゼとＯＤＣの融
合体を産生する組換え菌を作製した（図３）。

【００３２】（２）ＯＤＣの製造 ｉ）大腸菌によるＯＤＣ融合体の産生 プロテインＡ−ＯＤＣ融合体発現用プラスミドを保持す
る大腸菌Ｎ４８３０−１株をＬＢ培地中３０℃で対数増
殖期中〜後期まで増殖させた。その後培地温度を４２℃
に上昇し、さらに４時間培養しプロテインＡ−ＯＤＣ融
合体を産生させた。

【００３３】ＧＳＴ−ＯＤＣ融合体発現用プラスミドを
保持する大腸菌Ｙ１０９１株（クローンテック社より市
販）を用いるときはＬＢ培地中３７℃で対数増殖期中〜
後期まで増殖させた後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭ加えさ
らに４時間培養しＧＳＴ−ＯＤＣ融合体を産生させた。

【００３４】ii）融合蛋白の抽出 ｉ）の培養液を遠心分離し大腸菌菌体を集め、菌体を緩
衝液Ａ（20mM Tris-HCl, pH8.0 + 5mM EDTA ）に懸濁し
た後、超音波破砕器（ブランソン製ＳＯＮＩＦＩＥＲ２
５０）にて菌体を破砕した。この懸濁液を１，０００×
Ｇで遠心分離し、融合体を沈殿画分として得た。

【００３５】iii)融合蛋白の可溶化 ii）で得られた沈殿画分を緩衝液Ａに懸濁した後、最終
濃度８Ｍになるように尿素の飽和溶液を加え、さらに１
％ (V/V)になるように２−メルカプトエタノールを加え
た後、６０℃にて１〜４時間放置して沈殿を可溶化し
た。

【００３６】iv）融合蛋白の分離 iii)で得られた可溶化溶液を緩衝液Ｂ（20mM Tris-HCl,
pH8.0 + 6M 尿素）で平衡化した陰イオン交換樹脂（東
ソー製・トヨパール６５０Ｓ）に通し、吸着した成分を
０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムのグラジエントで溶出し
た。溶出液のうち融合体を含む画分を集め、限外ろ過
（アミコン製・セントリプレップ−３０）で濃縮した。
濃縮液に変性液（最終濃度 1% SDS, 6M 尿素, 1% 2- メ
ルカプトエタノール）を加え１００℃で２分間煮沸し、
この溶液を緩衝液Ｃ（20mM Tris-HCl,pH8.0 + 0.1% SDS
）で平衡化したゲルろ過カラム（ファルマシア製・Ｓ
ｕｐｅｒｄｅｘ２００）にてゲルろ過した。溶出液のう
ち融合体を含む画分を集め、限外ろ過により溶媒を緩衝
液Ａに交換した。本溶液中に残留するＳＤＳはファクタ
ーＸａの反応を阻害するので、これを界面活性剤除去剤
（ピアース製 Ｅｘｔｒａｃｔｉ−ＧｅｌＤ）で除去し
た。

【００３７】ｖ）融合蛋白からＯＤＣの切断 iv）で得られた融合蛋白を最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、融合
蛋白：ファクターＸａ＝１００：１（重量比）になるよ
うに反応液（50mM Tris-HCl, pH8.0 + 100mM NaCl + 5m
M CaCl₂ ）で希釈した。ファクターＸａはベーリンガー
マンハイム製を用いた。反応は４℃、一晩または２５
℃、２〜６時間行った。

【００３８】vi）ＯＤＣの分離 ｖ）で得られた反応済溶液に最終濃度８Ｍになるように
尿素の飽和溶液を加え、さらに１％ (V/V)になるように
２−メルカプトエタノールを加えた後、６０℃にて１〜
４時間放置して抗原蛋白を変性させた。本溶液を緩衝液
Ｄ（緩衝液Ｂ +0.1% 2-メルカプトエタノール）で平衡
化した陰イオン交換樹脂（ファルマシア製・Ｍｏｎｏ
Ｑ）に通し、吸着した成分を０〜０．３Ｍ塩化ナトリウ
ムのグラジエントで溶出させた。溶出液のうちＯＤＣを
含む画分を集め限外ろ過により濃縮した後、緩衝液Ｅ
（50mM Na-Pi, pH6.2 + 6M尿素 + 0.5M NaCl + 2% DMS
O) で平衡化したゲルろ過カラム（東ソー製・Ｇ３００
０ＳＷ）にてゲルろ過し、溶出液のうちＯＤＣを含む画
分を集め限外ろ過により溶媒を緩衝液Ａに交換し、精製
ＯＤＣとした。

【００３９】免疫にはプロテインＡ−ＯＤＣ融合体由来
ＯＤＣを用い、スクリーニング等抗体の評価検討におい
てはＧＳＴ−ＯＤＣ融合体由来ＯＤＣを用いることでＯ
ＤＣ以外の夾雑蛋白質による干渉を防いだ。

【００４０】vii)精製ＯＤＣの確認 精製したＯＤＣの確認のため自動気相プロテインシーク
エンサー（アプライドバイオシステムズ社製；４７０
Ａ）によりアミノ末端側のアミノ酸配列を部分的に決定
した。試料は５００ｐｍｏｌｅを用い、通常の方法で行
った。結果を下記表１に示す。

【表１】 表１ ──────────────────────────────────── 実験値 Gly Ile Pro Met Asn Asn Phe Gly Asn Glu Glu Phe Asp Xaa His Phe 文献値 Met Asn Asn Phe Gly Asn Glu Glu Phe Asp Cys His Phe 1 5 10 Leu Asp Glu Gly Leu Asp Glu Gly 15 ──────────────────────────────────── Xaa:不明

【００４１】（３）免疫 上記（２）で得たＯＤＣ １００μｇを含む５ｍＭリン
酸バッファ−（ｐＨ７．０）１ｍｌに１ｍｌの完全フロ
イントアジュバントを加えよく混和し、ウサギの皮下約
２０ヶ所に接種した。２週間後に、不完全フロイントア
ジュバンドを用い、同様の操作でウサギの皮下に接種し
た。さらに２週間後、抗原量を２００μｇに増やし、不
完全フロイントアジュバンドを用い、同様の操作でウサ
ギの皮下に接種することを４回繰り返した。最終免疫の
７日後、全採血を行い常法に従い抗血清を得た。

【００４２】同様に８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスにＯ
ＤＣ ５０μｇ／匹をアジュバントとともに腹腟内投与
した。２週間後追加免疫し、細胞融合に供する３〜４日
前にマウスの尾静脈より抗原のみを投与した。

【００４３】（４）細胞融合 最終免疫より３〜４日後、上記（３）で免疫したマウス
から脾臓を摘出、ホモジナイザーにより脾臓を破砕し脾
臓細胞をＰＢＳに浮遊調製した。次いで脾臓細胞とミエ
ローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４）（大日本製薬より
入手）を５：１の割合に混合し、５０％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ４０００）存在下で３分間放置した。
１，２００回転８分間遠心して上清を除いた後、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地２５ｍｌを徐々に加えさらに１，２０
０回転８分間遠心分離した。最終的に１０％牛胎児血清
（ＦＣＳ）および１０％ハイブリドーマクローニングフ
ァクター（ＨＣＦ）を含有するＨＡＴ ＲＰＭＩ−１６
４０培地に脾臓細胞が１．７５×１０⁶ 個／ｍｌになる
ように調製し、９６ウェルマイクロタイタープレート７
枚に１ウェル当たり０．２ｍｌずつ分注した。分注後、
細胞を３７℃で５％炭酸ガス培養器中で培養した。培養
開始から７日後に１０％ＦＣＳ、１０％ＨＣＦ含有のＨ
ＡＴ ＲＰＭＩ−１６４０培地を０．１ｍｌ交換した。
培養開始から７〜１０日後に、ハイブリドーマの増殖に
よるコロニーの形成が認められ、数１０個のウェルで免
疫原に対する十分な抗体の産生を以下に述べるＥＬＩＳ
Ａ法により確認した。

【００４４】（５）スクリーニング ハイブリドーマのスクリーニングは、酵素抗体法（ＥＬ
ＩＳＡ法： Immunochemistry, 8巻， 871頁，1971年）
による抗体価測定により行った。即ち、ＯＤＣを５μｇ
／ｍｌ含むＰＢＳ溶液５０μｌ、または大腸癌細胞破砕
物（蛋白濃度０．８ｍｇ／ｍｌ、実施例（８）に従い調
製）５０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートに
分注し、４℃で２４時間もしくは３０℃２時間放置し吸
着させ、プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有の
ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した後、ブロック
エース（大日本製薬製、４倍希釈液）３００μｌを分注
し、４℃２４時間もしくは３０℃２時間処理した。この
プレートに１ウェル当たり５０μｌのハイブリドーマの
培養上清を加え、３０℃２時間反応させた。反応後ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗
マウス抗体（カッペル社製、０．１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで１，０００倍に希釈）１００μｌを加え３０℃１時
間反応させた。反応後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した
後、０．０４％ｏ−フェニレンジアミン、０．０２％過
酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ
５．０を１００μｌ分注し、３０℃３〜１０分間反応さ
せた。３．６規定硫酸２０〜５０μｌを加え反応を停止
させた後、４９２および６３０ｎｍの吸収をプレートリ
ーダー（ＭＴＰ−１２０，コロナ社製）で測定し、抗体
の活性を判定した。

【００４５】抗体活性が陽性を示したウェルのうち２７
種のハイブリドーマを選択し、２４ウェルタイタープレ
ートで培養後抗体の活性を判定、最終的に１７種のハイ
ブリドーマを選択した。うち４種のハイブリドーマ３Ｂ
−８、３Ｂ−１０、４Ｂ−６、５Ｃ−１０はそれぞれ微
工研菌寄第１２４３５号、１２４３６号、１２４３７
号、１２４３８号として寄託してある。

【００４６】（６）クローニング、クラス・サブクラス
決定 上記１７種の各ハイブリドーマを限界希釈法によるクロ
ーニングに付した。即ちハイブリドーマが５個／ｍｌお
よび１０個／ｍｌになるように１０％ＦＣＳ、１０％Ｈ
ＣＦ含有のＨＴ−ＲＰＭＩ１６４０に浮遊させ、１ウェ
ル当たり０．２ｍｌずつ９６ウェルマイクロタイタープ
レートに分注した。３７℃で約７〜１０日間培養後、１
ウェルで１つのコロニーのみ形成し、さらに抗体陽性を
示すウェルの細胞を目的のモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマとした。その結果、１４クローンのハイブリ
ドーマが得られ、モノクローナル抗体サブタイピングキ
ット（バイオラッド社製）により免疫グロブリンクラス
・サブクラスを同定したところ、ＩｇＧ２ａの他、Ｉｇ
Ｇ２ｂ（３Ｂ−１０、４Ｂ−６）、及びＩｇＭ（５Ｃ−
１０）であった。これらのハイブリドーマは、クローニ
ングの操作をもう一度繰り返しモノクローナル抗体の生
産に供した。

【００４７】（７）抗体の精製、標識化 ｉ）抗体の分離・精製 （３）で取得した抗血清に等量の結合緩衝液（20mM Na-
Pi, pH7.0)を加え、結合緩衝液で平衡化したプロテイン
Ｇ−セファロース４カラム（ファルマシア製）に通し、
ＩｇＧを吸着させた。結合緩衝液でカラムを洗浄した
後、溶出緩衝液（100mM グリシン−HCl, pH2.7）でＩｇ
Ｇを溶出させた。溶出液を限外ろ過（アミコン製・セン
トリプレップ−３０）で濃縮した後、結合緩衝液に対し
透析し、精製ポリクローナル抗体とした。同様な手法に
よりハイブリドーマの培養上清からモノクローナル抗体
を精製した。

【００４８】ii) ポリクローナル抗体の標識化 ｉ）で得られたポリクローナル抗体を蛋白質ビオチン標
識溶キット（アマシャム製）を用い、該キットの処方に
従いビオチン化した。

【００４９】（８）ポリクローナル抗体・モノクローナ
ル抗体のウェスタンブロッティングによる反応性検討 ｉ）培養ヒト癌細胞との反応 培養細胞におけるＯＤＣ活性は、培地の交換により約１
０倍に活性化される（D'Agostinoら、Gastroenterolog
y, 97巻， 888頁，1989年）ため、ヒト由来細胞（ＣＯ
ＬＯ ２０５、結腸線癌由来、原ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ
−２２２）を、１０％ＦＣＳ含有のＲＰＭＩ１６４０中
２．７×１０⁵ 個／ｍｌで培養開始後３日目に培地を交
換しさらに６時間培養を続けることにより高いＯＤＣ活
性を有すると予想される細胞を調製した。同時に培地の
交換をしない細胞もコントロールとして用意した。両細
胞が生育したフラスコ内の培地を除き、ＰＢＳで洗浄後
０．２５％トリプシン含有ＰＢＳで処理し遠心分離によ
り集め、再度ＰＢＳで洗浄、遠心分離後、Ｌａｅｍｍｌ
ｉ法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い（ファルマシア社製−ファストシステム使用、１レ
−ン当たり泳動した蛋白量は１５μｇ）、ＰＶＤＦ膜
（クリアブロッド・Ｐ膜、アト−株式会社製）に転写し
た（ファストシステム使用）。転写した膜は、イミュン
ブロットアッセイキット（バイオ・ラッド社製）に従い
各抗体に結合するバンドを検出した。その結果、一次抗
体にポリクローナル抗体（精製ＩｇＧ）を使用した場
合、培地を交換した細胞において組換えＯＤＣと同位置
に濃い特異的なバンドを検出したが培地を交換しない細
胞では薄いバンドであった（図４）。同様に一次抗体に
モノクローナル抗体を使用した場合も培地を交換した細
胞においてポリクローナル抗体使用時よりは弱いものの
特異的なバンドを検出した。

【００５０】ii）テストステロン誘導マウス腎臓抽出物
との反応 マウス腎臓からのＯＤＣ分離精製においてテストステロ
ンの処理によりＯＤＣ含量を増加させている（Nishiyam
a ら、J. Immunoassaay, 10 巻， 19 頁，1989年 およ
び Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371巻， 363頁，1990
年）ため、同様にテストステロンで処理した後１週間目
の雄マウス（ＤＤＹ）から腎臓を抽出、テフロンホモゲ
ナイザ−で破砕し遠心分離（１００，０００ｇ，１時
間）した上清を調製し、上記ｉ）と同様にウェスタンブ
ロッティングを行った。また、テストステロン無処理の
マウスからもコントロールとして調製した。その結果、
一次抗体にポリクローナル抗体（精製ＩｇＧ）を使用し
た場合、テストステロン処理マウス腎臓抽出物において
組換えＯＤＣと同位置に無処理マウスよりも濃いバンド
を検出した（図５）。一次抗体にモノクローナル抗体を
使用した場合もＯＤＣのバンドを検出した。

【００５１】（９）モノクローナル抗体による消化器系
組織の免疫染色 手術により摘出した大腸癌、胃癌とその周辺部位の組織
標本（フォルマリン標本及び凍結標本）から切片（パラ
フィン包埋切片、凍結切片）を作製し、１次抗体として
精製モノクローナル抗体（３Ｂ−１０、４Ｂ−６）を用
い、通常の方法（月刊 MEDICAL TECHNOLOGY 別冊、染色
法のすべて、医歯薬出版株式会社、及びベクター社製の
ベクタステインＡＢＣエリートキット）に従い免疫染色
した。陰性対照は、１次抗体と同濃度のマウスＩｇＧ
（カッペル社製）を用いた。その結果、１次抗体濃度３
０〜４０ｎｇ／ｍｌ、３０℃３０分の反応条件におい
て、正常部腺細胞は染色されなかったが癌部腺細胞にお
いて特異的に染色が認められた。なお、陰性対照のマウ
スＩｇＧでは両細胞とも染色されなかった。

【００５２】（１０）標識化ポリクローナル抗体による
ＯＤＣ量の測定 ｉ）ＯＤＣ検量線の作製 （２）で製造したＯＤＣ、（７）で製造したポリクロー
ナル抗体及び標識化ポリクローナル抗体を用い、サンド
イッチＥＬＩＳＡ法により検量線を作成した。即ち、ポ
リクローナル抗体を５μｇ／ｍｌ含むＰＢＳ溶液５０μ
ｌを９６マイクロウェルプレートに分注し、４℃で１８
時間もしくは３０℃２時間放置し吸着させ、プレートを
Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５ｍｌ／ｌ含有のＰＢＳ（ＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した後、ブロックエース（大日本
製薬製、４倍に希釈）３２０μｌを分注し４℃１８時間
もしくは３０℃２時間処理した。このプレートに１ウェ
ル当たりＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で段階希釈したＯＤＣ
溶液５０μｌを加え、３０℃２時間反応させた。反応後
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、ビオチン標識化ポリ
クローナル抗体を１μｇ／ｍｌ含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
溶液５０μｌを加え３０℃１時間反応させた。反応後Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、アビジン結合ペルオキ
シダーゼ（ベクター社製）を５μｇ／ｍｌ含むＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎ溶液を１００μｌ加え３０℃３０分反応させ
た。反応後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、０．０４
％ｏ−フェニレンジアミン、０．０２％過酸化水素を含
む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液 ｐＨ５．０を１０
０μｌ分注し、３０℃１０分間反応させた。３．６規定
硫酸２０μｌを加え反応を停止させた後、４９２および
６３０ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＭＴＰ−１２
０，コロナ社製）で測定した。下記表２にその結果を、
図６に検量線を示す。

【表２】 表２ ──────────────────────────────────── ＯＤＣ濃度 （ｎｇ／ｍｌ） 0 0.5 1 2 4 6 8 10 吸光度 0.088 0.134 0.158 0.221 0.408 0.481 0.625 0.707 ────────────────────────────────────

【００５３】ii) 培養ヒト癌細胞とテストステロン誘導
マウス腎臓中のＯＤＣ量の測定 培養ヒト癌細胞（ＭＫＮ−２８，ＣＯＬＯ ２０５）及
びテストステロン誘導マウス腎臓抽出液を用い、i ）の
方法に従いＯＤＣ量を測定した。培養ヒト癌細胞におい
ては超音波破砕器で細胞を破砕した後、測定に供した。
下記表３に結果を示す。

【表３】 表３ ─────────────────────────────────── ＭＫＮ−２８ ＣＯＬＯ ２０５ マウス腎臓抽出液 ──────────────────────────── 培地交換 無 培地交換 無 誘導有 無 ─────────────────────────────────── ＯＤＣ濃度 5.5 4.8 37 8.7 145 40 （ｎｇ／ｍｇ蛋白） ───────────────────────────────────

【配列表】

配列番号：ｌ 配列の長さ：1815 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：ホモ サピエンス （ヒト） 組織の起源：肝臓 直接の起源 ライブラリ−名：λｇｔｌｌ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍＲＮＡ 存在位置：1..1815 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：88..1473 配列 GAATTCCTGG AGAGTTGCCT TTGTGAGAAG CTGGAAATAT TTCTTTCAAT TCCATCTCTT 60 AGTTTTCCAT AGGAACATCA AGAAATC ATG AAC AAC TTT GGT AAT GAA GAG TTT 114 Met Asn Asn Phe Gly Asn Glu Glu Phe 90 95 GAC TGC CAC TTC CTC GAT GAA GGT TTT ACT GCC AAG GAC ATT CTG GAC 162 Asp Cys His Phe Leu Asp Glu Gly Phe Thr Ala Lys Asp Ile Leu Asp 100 105 110 CAG AAA ATT AAT GAA GTT TCT TCT TCT GAT GAT AAG GAT GCC TTC TAT 210 Gln Lys Ile Asn Glu Val Ser Ser Ser Asp Asp Lys Asp Ala Phe Tyr 115 120 125 GTG GCA GAC CTG GGA GAC ATT CTA AAG AAA CAT CTG AGG TGG TTA AAA 258 Val Ala Asp Leu Gly Asp Ile Leu Lys Lys His Leu Arg Trp Leu Lys 130 135 140 GCT CTC CCT CGT GTC ACC CCC TTT TAT GCA GTC AAA TGT AAT GAT AGC 306 Ala Leu Pro Arg Val Thr Pro Phe Tyr Ala Val Lys Cys Asn Asp Ser 145 150 155 160 AAA GCC ATC GTG AAG ACC CTT GCT GCT ACC GGG ACA GGA TTT GAC TGT 354 Lys Ala Ile Val Lys Thr Leu Ala Ala Thr Gly Thr Gly Phe Asp Cys 165 170 175 GCT AGC AAG ACT GAA ATA CAG TTG GTG CAG AGT CTG GGG GTG CCT CCA 402 Ala Ser Lys Thr Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Leu Gly Val Pro Pro 180 185 190 GAG AGG ATT ATC TAT GCA AAT CCT TGT AAA CAA GTA TCT CAA ATT AAG 450 Glu Arg Ile Ile Tyr Ala Asn Pro Cys Lys Gln Val Ser Gln Ile Lys 195 200 205 TAT GCT GCT AAT AAT GGA GTC CAG ATG ATG ACT TTT GAT AGT GAA GTT 498 Tyr Ala Ala Asn Asn Gly Val Gln Met Met Thr Phe Asp Ser Glu Val 210 215 220 GAG TTG ATG AAA GTT GCC AGA GCA CAT CCC AAA GCA AAG TTG GTT TTG 546 Glu Leu Met Lys Val Ala Arg Ala His Pro Lys Ala Lys Leu Val Leu 225 230 235 240 CGG ATT GCC ACT GAT GAT TCC AAA GCA GTC TGT CGT CTC AGT GTG AAA 594 Arg Ile Ala Thr Asp Asp Ser Lys Ala Val Cys Arg Leu Ser Val Lys 245 250 255 TTC GGT GCC ACG CTC AGA ACC AGC AGG CTC CTT TTG GAA CGG GCG AAA 642 Phe Gly Ala Thr Leu Arg Thr Ser Arg Leu Leu Leu Glu Arg Ala Lys 260 265 270 GAG CTA AAT ATC GAT GTT GTT GGT GTC AGC TTC CAT GTA GGA AGC GGC 690 Glu Leu Asn Ile Asp Val Val Gly Val Ser Phe His Val Gly Ser Gly 275 280 285 TGT ACC GAT CCT GAG ACC TTC GTG CAG GCA ATC TCT GAT GCC CGC TGT 738 Cys Thr Asp Pro Glu Thr Phe Val Gln Ala Ile Ser Asp Ala Arg Cys 290 295 300 GTT TTT GAC ATG GGG GCT GAG GTT GGT TTC AGC ATG TAT CTG CTT GAT 786 Val Phe Asp Met Gly Ala Glu Val Gly Phe Ser Met Tyr Leu Leu Asp 305 310 315 320 ATT GGC GGT GGC TTT CCT GGA TCT GAG GAT GTG AAA CTT AAA TTT GAA 834 Ile Gly Gly Gly Phe Pro Gly Ser Glu Asp Val Lys Leu Lys Phe Glu 325 330 335 GAG ATC ACC GGC GTA ATC AAC CCA GCG TTG GAC AAA TAC TTT CCG TCA 882 Glu Ile Thr Gly Val Ile Asn Pro Ala Leu Asp Lys Tyr Phe Pro Ser 340 345 350 GAC TCT GGA GTG AGA ATC ATA GCT GAG CCC GGC AGA TAC TAT GTT GCA 930 Asp Ser Gly Val Arg Ile Ile Ala Glu Pro Gly Arg Tyr Tyr Val Ala 355 360 365 TCA GCT TTC ACG CTT GCA GTT AAT ATC ATT GCC AAG AAA ATT GTA TTA 978 Ser Ala Phe Thr Leu Ala Val Asn Ile Ile Ala Lys Lys Ile Val Leu 370 375 380 AAG GAA CAG ACG GGC TCT GAT GAC GAA GAT GAG TCG AGT GAG CAG ACC 1026 Lys Glu Gln Thr Gly Ser Asp Asp Glu Asp Glu Ser Ser Glu Gln Thr 385 390 395 400 TTT ATG TAT TAT GTG AAT GAT GGC GTC TAT GGA TCA TTT AAT TGC ATA 1074 Phe Met Tyr Tyr Val Asn Asp Gly Val Tyr Gly Ser Phe Asn Cys Ile 405 410 415 CTC TAT GAC CAC GCA CAT GTA AAG CCC CTT CTG CAA AAG AGA CCT AAA 1122 Leu Tyr Asp His Ala His Val Lys Pro Leu Leu Gln Lys Arg Pro Lys 420 425 430 CCA GAT GAG AAG TAT TAT TCA TCC AGC ATA TGG GGA CCA ACA TGT GAT 1170 Pro Asp Glu Lys Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Trp Gly Pro Thr Cys Asp 435 440 445 GGC CTC GAT CGG ATT GTT GAG CGC TGT GAC CTG CCT GAA ATG CAT GTG 1218 Gly Leu Asp Arg Ile Val Glu Arg Cys Asp Leu Pro Glu Met His Val 450 455 460 GGT GAT TGG ATG CTC TTT GAA AAC ATG GGC GCT TAC ACT GTT GCT GCT 1266 Gly Asp Trp Met Leu Phe Glu Asn Met Gly Ala Tyr Thr Val Ala Ala 465 470 475 480 GCC TCT ACG TTC AAT GGC TTC CAG AGG CCG ACG ATC TAC TAT GTG ATG 1314 Ala Ser Thr Phe Asn Gly Phe Gln Arg Pro Thr Ile Tyr Tyr Val Met 485 490 495 TCA GGG CCT GCG TGG GAA CTC ATG CAG CAA TTC CAG AAC CCC GAC TTC 1362 Ser Gly Pro Ala Trp Glu Leu Met Gln Gln Phe Gln Asn Pro Asp Phe 500 505 510 CCA CCC GAA GTA GAG GAA CAG GAT GCC AGC ACC CTG CCT GTG TCT TGT 1410 Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Ala Ser Thr Leu Pro Val Ser Cys 515 520 525 GCC TGG GAG AGT GGG ATG AAA CGC CAC AGA GCA GCC TGT GCT TCG GCT 1458 Ala Trp Glu Ser Gly Met Lys Arg His Arg Ala Ala Cys Ala Ser Ala 530 535 540 AGT ATT AAT GTG TAG ATAGCAC TCTGGTAGCT GTTAACTGCA AGTTTAGCTT 1510 Ser Ile Asn Val Stop 545 GAATTAAGGG ATTTGGGGGG ACCATGTAAC TTAATTACTG CTAGTTTTGA AATGTCTTTG 1570 TAAGAGTAGG GTCGCCATGA TGCAGCCATA TGGAAGACTA GCATATGGGT CACACTTATC 1630 TGTGTTCCTA TGGAAACTAT TTGAATATTT GTTTTATATG GATTTTTATT CACTCTTCAG 1690 ACACGCTACT CAAGAGTGCC CCTCAGCTGC TGAACAAGCA TTTGTAGCTT GTACAATGGC 1750 AGAATGGGCC AAAAGCTTAG TGTTGTGACC TGTTTTTAAA ATAAAGTATC TTGAAATAAT 1810 TAGGC 1815

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＯＤＣの調製工程において用いた、改変プ
ロテインＡ発現用ベクターの構築方法を示す図。

【図２】ヒトＯＤＣの調製工程において用いた、ヒトＯ
ＤＣのｃＤＮＡを含む組換えプラスミドの構築方法を示
す図。

【図３】ヒトＯＤＣの調製工程において用いた、グルタ
チオンＳトランスフェラーゼとヒトＯＤＣの融合体をコ
ードする組換えプラスミドの構築方法を示す図。

【図４】本発明の抗体を用いて行なったウェスタンブロ
ッティングの結果を示す図。

【図５】本発明の抗体とテストステロン誘導マウス腎臓
抽出物との反応を示すウェスタンブロッティングの結果
を示す図。

【図６】本発明の抗体を用いて標準試料中のヒトＯＤＣ
を免疫測定して得られた検量線。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトオルニチン脱炭酸酵素に特異的結
   合性を有するポリクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトオルニチン脱炭酸酵素に特異的結
   合性を有するモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 請求項２記載のモノクローナル抗体を
   産生するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】 請求項１及び／又は２記載の抗体と、
   ヒトオルニチン脱炭酸酵素との特異的結合性を利用した
   免疫測定法によりヒトオルニチン脱炭酸酵素を測定す
   る、ヒトオルニチン脱炭酸酵素の測定方法。
5. 【請求項５】 担体上に不溶化した、ヒトオルニチン
   脱炭酸酵素に特異的結合性を有する第１の抗体に被検液
   を接触させた後、標識剤で標識化されたヒトオルニチン
   脱炭酸酵素に対する第２の抗体を接触させ、不溶化担体
   上の標識剤の活性を測定する、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項２記載の抗体でヒトオルニチン脱
   炭酸酵素を免疫染色することにより、ヒトオルニチン脱
   炭酸酵素を産生しているガン細胞を検出する方法。