JP3336775B2 - 抗フコシルトランスフェラーゼ抗体、抗フコシルトランスフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方法 - Google Patents
抗フコシルトランスフェラーゼ抗体、抗フコシルトランスフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方法Info
- Publication number
- JP3336775B2 JP3336775B2 JP28146694A JP28146694A JP3336775B2 JP 3336775 B2 JP3336775 B2 JP 3336775B2 JP 28146694 A JP28146694 A JP 28146694A JP 28146694 A JP28146694 A JP 28146694A JP 3336775 B2 JP3336775 B2 JP 3336775B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fucosyltransferase
- antibody
- fta1
- human
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗フコシルトランスフ
ェラーゼモノクローナル抗体、抗フコシルトランスフェ
ラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及
び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方
法に関する。
ェラーゼモノクローナル抗体、抗フコシルトランスフェ
ラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及
び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】医療の分野では、癌との関連性を調べる
ためにさまざまな腫瘍マーカーが研究されている。中で
もいくつかの糖鎖抗原は癌と強く関連することが見出さ
れ、糖鎖抗原と反応する抗体は癌の診断補助やその研究
に広く利用されている。例えば、シアリルルイスＡは膵
臓癌のマーカーとなり得ることが、シアリルルイスＸは
肺癌のマーカーとなり得ることが報告され、抗シアリル
ルイスＡ抗体や抗シアリルルイスＸ抗体を用いた測定系
は、膵臓癌や肺癌等の指標として広く臨床現場で用いら
れている（J. B. C., 257, 14365 (1982) 、Cancer Re
s., 44, 5279(1984)) 。
ためにさまざまな腫瘍マーカーが研究されている。中で
もいくつかの糖鎖抗原は癌と強く関連することが見出さ
れ、糖鎖抗原と反応する抗体は癌の診断補助やその研究
に広く利用されている。例えば、シアリルルイスＡは膵
臓癌のマーカーとなり得ることが、シアリルルイスＸは
肺癌のマーカーとなり得ることが報告され、抗シアリル
ルイスＡ抗体や抗シアリルルイスＸ抗体を用いた測定系
は、膵臓癌や肺癌等の指標として広く臨床現場で用いら
れている（J. B. C., 257, 14365 (1982) 、Cancer Re
s., 44, 5279(1984)) 。
【０００３】更に、少しでも早期の癌変化を検出しよう
とする研究が進み、近年では腫瘍マーカーである糖鎖抗
原自体を産生する糖転移酵素が注目されている(Microbi
ol,Immunol., 38(7), 489-504, 1994) 。特にフコシル
トランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼIII 、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼＶ等は癌との関連性が高いと
言われている。糖転移酵素は細胞中のゴルジ体に存在
し、カテプシン様プロテアーゼの作用（Sadler, J. E.
et.al. J. Biol.Chem., 263, 17735-17743 (1987))に
よってゴルジ体から離脱し、血中に遊離することが知ら
れている。すでに、糖転移酵素のひとつであるフコシル
トランスフェラーゼの酵素活性測定方法が開発され（Ca
ncer Res., 62, 516-520, 1988、臨床病理, 40, 182-18
8, 1992 ）、癌化によって血中のフコシルトランスフェ
ラーゼ活性が上昇することが報告されている。
とする研究が進み、近年では腫瘍マーカーである糖鎖抗
原自体を産生する糖転移酵素が注目されている(Microbi
ol,Immunol., 38(7), 489-504, 1994) 。特にフコシル
トランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼIII 、Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼＶ等は癌との関連性が高いと
言われている。糖転移酵素は細胞中のゴルジ体に存在
し、カテプシン様プロテアーゼの作用（Sadler, J. E.
et.al. J. Biol.Chem., 263, 17735-17743 (1987))に
よってゴルジ体から離脱し、血中に遊離することが知ら
れている。すでに、糖転移酵素のひとつであるフコシル
トランスフェラーゼの酵素活性測定方法が開発され（Ca
ncer Res., 62, 516-520, 1988、臨床病理, 40, 182-18
8, 1992 ）、癌化によって血中のフコシルトランスフェ
ラーゼ活性が上昇することが報告されている。
【０００４】しかしながら、糖転移酵素活性は、糖鎖抗
原量よりも早期の癌変化を反映しはするものの、必ずし
も酵素の絶対量を反映するとは限らず、糖転移酵素量に
ついて把握しにくいという問題点があった。また、フコ
シルトランスフェラーゼには、糖を付加する位置によっ
て１，２−フコシルトランスフェラーゼ、１，３−フコ
シルトランスフェラーゼ、１，４−フコシルトランスフ
ェラーゼ、１，６−フコシルトランスフェラーゼ等のア
イソザイムが存在することが知られているが、最近にな
って１，３−フコシルトランスフェラーゼの中に酵素活
性測定だけでは分別しにくいさらに多くのアイソザイム
が存在することが報告された（Cancer Res.,50, 6787-6
792 1990, Cancer Res., 53, 5559-5565 1993 ）。
原量よりも早期の癌変化を反映しはするものの、必ずし
も酵素の絶対量を反映するとは限らず、糖転移酵素量に
ついて把握しにくいという問題点があった。また、フコ
シルトランスフェラーゼには、糖を付加する位置によっ
て１，２−フコシルトランスフェラーゼ、１，３−フコ
シルトランスフェラーゼ、１，４−フコシルトランスフ
ェラーゼ、１，６−フコシルトランスフェラーゼ等のア
イソザイムが存在することが知られているが、最近にな
って１，３−フコシルトランスフェラーゼの中に酵素活
性測定だけでは分別しにくいさらに多くのアイソザイム
が存在することが報告された（Cancer Res.,50, 6787-6
792 1990, Cancer Res., 53, 5559-5565 1993 ）。
【０００５】上述の理由によりフコシルトランスフェラ
ーゼ、特にそのアイソザイムを直接検出することのでき
る抗体が切望されていたが、フコシルトランスフェラー
ゼは種間の相同性が高いため、これまでα（１，３／
１，４）フコシルトランスフェラーゼアイソザイムと反
応する抗体は存在しなかった。
ーゼ、特にそのアイソザイムを直接検出することのでき
る抗体が切望されていたが、フコシルトランスフェラー
ゼは種間の相同性が高いため、これまでα（１，３／
１，４）フコシルトランスフェラーゼアイソザイムと反
応する抗体は存在しなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、抗α（１，３／１，４）フコシルトランスフェラー
ゼ抗体を提供し、従来検出できなかったα（１，３／
１，４）フコシルトランスフェラーゼ量の測定を可能に
することである。
は、抗α（１，３／１，４）フコシルトランスフェラー
ゼ抗体を提供し、従来検出できなかったα（１，３／
１，４）フコシルトランスフェラーゼ量の測定を可能に
することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、従来の課題
を解決すべく鋭意研究した結果、遺伝子組み替え技術を
駆使して得られたヒトα（１，３／１，４）フコシルト
ランスフェラーゼを免疫源として、フコシルトランスフ
ェラーゼと反応する抗体を得ることに成功した。またこ
の抗体を用いた免疫測定法を開発し、フコシルトランス
フェラーゼ量を検出可能として、本発明を完成するに至
ったものである。
を解決すべく鋭意研究した結果、遺伝子組み替え技術を
駆使して得られたヒトα（１，３／１，４）フコシルト
ランスフェラーゼを免疫源として、フコシルトランスフ
ェラーゼと反応する抗体を得ることに成功した。またこ
の抗体を用いた免疫測定法を開発し、フコシルトランス
フェラーゼ量を検出可能として、本発明を完成するに至
ったものである。
【０００８】すなわち、本発明は、フコシルトランスフ
ェラーゼと反応する抗体及びフコシルトランスフェラー
ゼと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供し、該抗体を用いたフコシルトランスフェラ
ーゼの測定方法を開発することによって、従来酵素活性
でしか検出し得なかったフコシルトランスフェラーゼ量
を測定する方法を初めて提供するものである。
ェラーゼと反応する抗体及びフコシルトランスフェラー
ゼと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを提供し、該抗体を用いたフコシルトランスフェラ
ーゼの測定方法を開発することによって、従来酵素活性
でしか検出し得なかったフコシルトランスフェラーゼ量
を測定する方法を初めて提供するものである。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】本発明の抗体が認識するフコシルトランス
フェラーゼは、フコースを付加する糖転移酵素の一種で
ある。
フェラーゼは、フコースを付加する糖転移酵素の一種で
ある。
【００１１】本発明者等は、フコシルトランスフェラー
ゼと反応する抗体を得るための免疫源として、Gene & D
ev., 4, 1288-1303 に表わされたヒトα（１，３／１，
４）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列をも
とに、図１に表わすオリゴヌクレオチドを常法により合
成し、ＰＣＲ法のプライマーとして用いた。
ゼと反応する抗体を得るための免疫源として、Gene & D
ev., 4, 1288-1303 に表わされたヒトα（１，３／１，
４）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列をも
とに、図１に表わすオリゴヌクレオチドを常法により合
成し、ＰＣＲ法のプライマーとして用いた。
【００１２】オリゴヌクレオチドは、例えば市販のＤＮ
Ａ合成装置（ｍｏｄｅｌ ３８１ＡＡＢＩ社製）を用い
ることにより容易に合成することができる。
Ａ合成装置（ｍｏｄｅｌ ３８１ＡＡＢＩ社製）を用い
ることにより容易に合成することができる。
【００１３】ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅後、遺
伝子組み換えにより発現ベクターに導入し、該ベクター
を用いて宿主を形質転換させた。
伝子組み換えにより発現ベクターに導入し、該ベクター
を用いて宿主を形質転換させた。
【００１４】ＰＣＲ法は市販のＰＣＲ増幅キット（ＰＣ
Ｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ タカラ社製）
を、遺伝子組み換えにはベクターとして市販品、例えば
ＰＧＥＭＥＸ−１、ＰＥＴ３ａ、ＰＹＥＵｒａ３等を、
宿主として、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等を用い、公
知の方法により容易に行うことができる。
Ｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ タカラ社製）
を、遺伝子組み換えにはベクターとして市販品、例えば
ＰＧＥＭＥＸ−１、ＰＥＴ３ａ、ＰＹＥＵｒａ３等を、
宿主として、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等を用い、公
知の方法により容易に行うことができる。
【００１５】宿主が産生したポリペプチドは、塩処理や
超音波処理等により菌体を破砕後、公知の分離精製手
段、例えばゲルクロマトグラフィーやイオンクロマトグ
ラフィー等にて精製することができる。
超音波処理等により菌体を破砕後、公知の分離精製手
段、例えばゲルクロマトグラフィーやイオンクロマトグ
ラフィー等にて精製することができる。
【００１６】このようにして得られたヒトα（１，３／
１，４）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子によりコー
ドされるポリペプチドを免疫源として、抗フコシルトラ
ンスフェラーゼ抗体を作成した。
１，４）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子によりコー
ドされるポリペプチドを免疫源として、抗フコシルトラ
ンスフェラーゼ抗体を作成した。
【００１７】
【００１８】本発明のモノクローナル抗体及び該抗体を
産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにして得
ることができる。
産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにして得
ることができる。
【００１９】すなわち、上述のようにして得られたヒト
α（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ遺伝
子がコードするポリペプチドを動物、例えばマウス、ラ
ット等に免疫する。ポリペプチドは単独またはアジュバ
ンドと共に動物に免疫するが、必要に応じて、適当な担
体、例えばＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin ）、Ｂ
ＳＡ（Bovin Serum Albumin ）等に結合した後、免疫に
用いてもよい。
α（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ遺伝
子がコードするポリペプチドを動物、例えばマウス、ラ
ット等に免疫する。ポリペプチドは単独またはアジュバ
ンドと共に動物に免疫するが、必要に応じて、適当な担
体、例えばＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin ）、Ｂ
ＳＡ（Bovin Serum Albumin ）等に結合した後、免疫に
用いてもよい。
【００２０】次いで、免疫された動物の抗体産生細胞、
例えば脾細胞、リンパ節細胞等と、腫瘍細胞、例えばミ
エローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを作成する。
この際、融合剤、例えばセンダイウイルス、ポリエチレ
ングリコール等を用いると効率よくハイブリドーマを得
ることができる。次いで、ハイブリドーマを選択培地、
例えばＨＡＴ培地を用いて非融合細胞から選択し、さら
にクローニングすることによって単クローン化する。ク
ローニングには限界希釈法、軟寒天法等の適当な手法を
用いることができる。この培養上清を分析して目的とす
る抗ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラ
ーゼモノクローナル抗体を産生するクローンを選択す
る。培養上清の分析には、適当な免疫測定法、例えば酵
素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ法等を用いること
ができる。これらの各工程は、公知の方法、例えばケー
ラーとミルシュタインのNature 256, 495 (1975)、シェ
ーラーのNature 285, 446 (1980)に記載された方法によ
り行うことができる。
例えば脾細胞、リンパ節細胞等と、腫瘍細胞、例えばミ
エローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを作成する。
この際、融合剤、例えばセンダイウイルス、ポリエチレ
ングリコール等を用いると効率よくハイブリドーマを得
ることができる。次いで、ハイブリドーマを選択培地、
例えばＨＡＴ培地を用いて非融合細胞から選択し、さら
にクローニングすることによって単クローン化する。ク
ローニングには限界希釈法、軟寒天法等の適当な手法を
用いることができる。この培養上清を分析して目的とす
る抗ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラ
ーゼモノクローナル抗体を産生するクローンを選択す
る。培養上清の分析には、適当な免疫測定法、例えば酵
素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ法等を用いること
ができる。これらの各工程は、公知の方法、例えばケー
ラーとミルシュタインのNature 256, 495 (1975)、シェ
ーラーのNature 285, 446 (1980)に記載された方法によ
り行うことができる。
【００２１】このようにして得られたフコシルトランス
フェラーゼと反応する抗体を産生するハイブリドーマの
うち、好ましいものがＦＴＡ１−５、ＦＴＡ１−９、Ｆ
ＴＡ１−１６及びＦＴＡ３−１０である。またこれらの
ハイブリドーマは、それぞれモノクローナル抗体ＦＴＡ
１−５、ＦＴＡ１−９、ＦＴＡ１−１６及びＦＴＡ３−
１０を産生する。
フェラーゼと反応する抗体を産生するハイブリドーマの
うち、好ましいものがＦＴＡ１−５、ＦＴＡ１−９、Ｆ
ＴＡ１−１６及びＦＴＡ３−１０である。またこれらの
ハイブリドーマは、それぞれモノクローナル抗体ＦＴＡ
１−５、ＦＴＡ１−９、ＦＴＡ１−１６及びＦＴＡ３−
１０を産生する。
【００２２】本発明のモノクローナル抗体は、その培養
上清から、各種分離精製手段により回収することができ
る。モノクローナル抗体の分離精製手段としては、例え
ば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等の方法を用いることができる。モノクローナル抗体を
大量に取得する場合には、前記ハイブリドーマを組織適
合性動物、胸腺欠損ヌードマウス等の腹腔内に移植して
増殖させ、産生された腹水中に含まれる該モノクローナ
ル抗体を分離精製して回収すればよい。
上清から、各種分離精製手段により回収することができ
る。モノクローナル抗体の分離精製手段としては、例え
ば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等の方法を用いることができる。モノクローナル抗体を
大量に取得する場合には、前記ハイブリドーマを組織適
合性動物、胸腺欠損ヌードマウス等の腹腔内に移植して
増殖させ、産生された腹水中に含まれる該モノクローナ
ル抗体を分離精製して回収すればよい。
【００２３】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを検出
するために、免疫学的測定法に広く利用することができ
る。例えば、ラジオイムノアッセイ法、酵素免疫測定
法、凝集免疫測定法、ウエスタンブロッティング法等で
ある。従来、α（１，３／１，４）フコシルトランスフ
ェラーゼは酵素活性によってのみ検出可能であったが、
本発明のモノクローナル抗体を用いたこれらの免疫学的
測定方法は、初めてα（１，３／１，４）フコシルトラ
ンスフェラーゼ量を直接検出しうる手段を提供し、癌診
断の補助検査、癌発生機序の研究等に広く用いることが
できるものである。
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを検出
するために、免疫学的測定法に広く利用することができ
る。例えば、ラジオイムノアッセイ法、酵素免疫測定
法、凝集免疫測定法、ウエスタンブロッティング法等で
ある。従来、α（１，３／１，４）フコシルトランスフ
ェラーゼは酵素活性によってのみ検出可能であったが、
本発明のモノクローナル抗体を用いたこれらの免疫学的
測定方法は、初めてα（１，３／１，４）フコシルトラ
ンスフェラーゼ量を直接検出しうる手段を提供し、癌診
断の補助検査、癌発生機序の研究等に広く用いることが
できるものである。
【００２４】
【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳
細に説明する。
細に説明する。
【００２５】実施例１ Lowe等によって報告された、ヒトα-(1,3/1,4)-Fucosyl
transferase ( 以下FTase と略称する) 遺伝子（Gene &
Dev., 4, 1288-1303)の塩基配列を参考にして図１に示
す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを ABI社の DNA
合成装置により化学合成した。次いで、鋳型にヒト培養
細胞より抽出したゲノム DNAを、プライマーに上記オリ
ゴヌクレオチドを用い、タカラ社の PCR増幅キットにて
目的とする 0.8kbヒト FTase遺伝子 DNA断片を増幅し
た。さらに1%アガロールゲル電気泳動により0.8kb DNA
断片を分離した後、制限酵素Eco RI処理をした。このDN
A断片をプラスミドPUC 19のEco RI部位に導入した後、
これを用いて大腸菌 DH5αを形質転換した。
transferase ( 以下FTase と略称する) 遺伝子（Gene &
Dev., 4, 1288-1303)の塩基配列を参考にして図１に示
す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを ABI社の DNA
合成装置により化学合成した。次いで、鋳型にヒト培養
細胞より抽出したゲノム DNAを、プライマーに上記オリ
ゴヌクレオチドを用い、タカラ社の PCR増幅キットにて
目的とする 0.8kbヒト FTase遺伝子 DNA断片を増幅し
た。さらに1%アガロールゲル電気泳動により0.8kb DNA
断片を分離した後、制限酵素Eco RI処理をした。このDN
A断片をプラスミドPUC 19のEco RI部位に導入した後、
これを用いて大腸菌 DH5αを形質転換した。
【００２６】実施例２ 0.8kb DNA 断片が導入されたプラスミド（pFTase A) に
より形質転換された大腸菌クローンよりプラスミドを抽
出し、USB 社のシーケナーゼキットを用いて、0.8kb DN
A 断片の一次構造を決定した。結果を図２に示す。この
塩基配列はLowe等が報告したヒトFTase の塩基配列序列
第293 番から第1083番とまったく同一であり、pFTaseに
導入されたDNA 断片はヒトFTase の一部であることが判
明した。 実施例３ プラスミドpFTase Aを制限酵素Eco RIで水解し、1%アガ
ロースゲル電気泳動によりヒトFTase 遺伝子を含む0.8k
b DNA 断片を分離した。このDNA 断片を T7promoterを
保持する発現用ベクターPW6A（図３）のEco RI部位に導
入し、これを用いて大腸菌BL 21(DE3)を形質転換させ、
アンピシリン耐性の形質転換体(Escherichia coli BL 2
1 (DE3)/PW6A θ) を得た。
より形質転換された大腸菌クローンよりプラスミドを抽
出し、USB 社のシーケナーゼキットを用いて、0.8kb DN
A 断片の一次構造を決定した。結果を図２に示す。この
塩基配列はLowe等が報告したヒトFTase の塩基配列序列
第293 番から第1083番とまったく同一であり、pFTaseに
導入されたDNA 断片はヒトFTase の一部であることが判
明した。 実施例３ プラスミドpFTase Aを制限酵素Eco RIで水解し、1%アガ
ロースゲル電気泳動によりヒトFTase 遺伝子を含む0.8k
b DNA 断片を分離した。このDNA 断片を T7promoterを
保持する発現用ベクターPW6A（図３）のEco RI部位に導
入し、これを用いて大腸菌BL 21(DE3)を形質転換させ、
アンピシリン耐性の形質転換体(Escherichia coli BL 2
1 (DE3)/PW6A θ) を得た。
【００２７】実施例４ 実施例３で得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシリ
ンを含む LB 培地(1.5ml) 中37℃で培養し、O.D.ユニッ
ト[600nmの光学濃度] が0.6 〜0.8 の時、IPTGを240 μ
g/mlの濃度で加え、培養をさらに２時間続けた。1.5ml
量の菌体培養液を5000rpm で２分間遠心分離して菌体を
集め、100 μl の緩衝液(10mM トリス塩酸, pH 8.0, 0.
1M NaCl, 1mM EDTA)に懸濁し、リゾチーム( 最終濃度 1
mg/ml)およびPMSF( 最終濃度 10 μg/ml) を添加してよ
く攪拌した後、氷中で30分静置した。これを菌体試料と
した。
ンを含む LB 培地(1.5ml) 中37℃で培養し、O.D.ユニッ
ト[600nmの光学濃度] が0.6 〜0.8 の時、IPTGを240 μ
g/mlの濃度で加え、培養をさらに２時間続けた。1.5ml
量の菌体培養液を5000rpm で２分間遠心分離して菌体を
集め、100 μl の緩衝液(10mM トリス塩酸, pH 8.0, 0.
1M NaCl, 1mM EDTA)に懸濁し、リゾチーム( 最終濃度 1
mg/ml)およびPMSF( 最終濃度 10 μg/ml) を添加してよ
く攪拌した後、氷中で30分静置した。これを菌体試料と
した。
【００２８】菌体試料 8μl に３倍濃度のSDS ポリアク
リルアミド緩衝液(0.15M トリス塩酸, pH 6.8, 6% SD
S, 24% グリセロール, 6mM EDTA, 3% 2-メルカプトエ
タノール, 0.003% ブロモフェノールブルー) 4 μl を
加え、十分攪拌した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った。泳動後、ポリアクリルアミドゲルをタ
ンパク染色液(0.25% クマシーブリリアンドブルー, 50
% メタノール, 10% 酢酸) に20分間、次いで脱色液(40%
メタノール, 10% 酢酸) に３時間浸し、菌体試料に含
まれるタンパクの展開像を観察した。形質転換体（Esch
erichia coli BL21 (DE3)/PW6A θ) 試料中には、非形
質転換体（Escherichia coli BL 21 (DE3)) は認められ
ず、また分子量約 30000ダルトンのタンパクが存在し
た。これは、プラスミドPW6Aθに導入されたヒトFTase
遺伝子にコードされるポリペプチドと考えられる。
リルアミド緩衝液(0.15M トリス塩酸, pH 6.8, 6% SD
S, 24% グリセロール, 6mM EDTA, 3% 2-メルカプトエ
タノール, 0.003% ブロモフェノールブルー) 4 μl を
加え、十分攪拌した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った。泳動後、ポリアクリルアミドゲルをタ
ンパク染色液(0.25% クマシーブリリアンドブルー, 50
% メタノール, 10% 酢酸) に20分間、次いで脱色液(40%
メタノール, 10% 酢酸) に３時間浸し、菌体試料に含
まれるタンパクの展開像を観察した。形質転換体（Esch
erichia coli BL21 (DE3)/PW6A θ) 試料中には、非形
質転換体（Escherichia coli BL 21 (DE3)) は認められ
ず、また分子量約 30000ダルトンのタンパクが存在し
た。これは、プラスミドPW6Aθに導入されたヒトFTase
遺伝子にコードされるポリペプチドと考えられる。
【００２９】実施例５ 形質転換体(Escherichia coli BL 21 (DE3)/PW6Aθ) に
よって産生される 30000ダルトンタンパクの大量精製品を得るため、実施
例４に記載した方法に従って、形質転換体(Escherichia
coli BL 21 (DE3)/PW6Aθ)1リットルの培養を行い、菌
体試料を調製した。次いで、常法（DNA cloning volume
III, IPL press 59-87 ( 1987)) に従い、宿主大腸菌由
来の夾雑物を除去した。この操作により 30000ダルトン
蛋白を不溶物として回収し、緩衝液(4M グアニジン塩
酸, 10mM トリス塩酸, pH 7.5, 1mM EDTA, 0.1M NaCl)
に透析した。透析した試料 8μl を、SDS ポリアクリル
アミドゲルで電気泳動し、タンパク染色を行った。結果
を図４に示す。この結果から、宿主大腸菌由来の夾雑物
をほとんど含まない30000 ダルトンタンパクが回収され
ていることが明らかとなった。
よって産生される 30000ダルトンタンパクの大量精製品を得るため、実施
例４に記載した方法に従って、形質転換体(Escherichia
coli BL 21 (DE3)/PW6Aθ)1リットルの培養を行い、菌
体試料を調製した。次いで、常法（DNA cloning volume
III, IPL press 59-87 ( 1987)) に従い、宿主大腸菌由
来の夾雑物を除去した。この操作により 30000ダルトン
蛋白を不溶物として回収し、緩衝液(4M グアニジン塩
酸, 10mM トリス塩酸, pH 7.5, 1mM EDTA, 0.1M NaCl)
に透析した。透析した試料 8μl を、SDS ポリアクリル
アミドゲルで電気泳動し、タンパク染色を行った。結果
を図４に示す。この結果から、宿主大腸菌由来の夾雑物
をほとんど含まない30000 ダルトンタンパクが回収され
ていることが明らかとなった。
【００３０】実施例６ 実施例５で得られたヒトα（１，３／１，４）フコシル
トランスフェラーゼの100μg をフロイントの完全アジ
ュバンドと共にBALB/cマウスに腹腔内投与した。２週間
間隔でこれを３回繰り返し、この３週間後、最終免疫と
してヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラ
ーゼ 100μg を静脈内投与した。３日後摘出した脾臓を
ケーラーとミルシュタインの常法(Nature 256, 495 (19
75))に従って細胞融合に供した。他方の親細胞に、マウ
ス骨髄腫細胞株であるP3-X63-Ag8-U1(P3U1) を用い、融
合剤としてはポリエチレングリコールを用いた。
トランスフェラーゼの100μg をフロイントの完全アジ
ュバンドと共にBALB/cマウスに腹腔内投与した。２週間
間隔でこれを３回繰り返し、この３週間後、最終免疫と
してヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラ
ーゼ 100μg を静脈内投与した。３日後摘出した脾臓を
ケーラーとミルシュタインの常法(Nature 256, 495 (19
75))に従って細胞融合に供した。他方の親細胞に、マウ
ス骨髄腫細胞株であるP3-X63-Ag8-U1(P3U1) を用い、融
合剤としてはポリエチレングリコールを用いた。
【００３１】このようにして融合した細胞は HAT培地に
懸濁し96穴のマイクロカルチャープレートに分注して培
養した。約２週間後、ハイブリドーマが増殖したウェル
の培養上清について以下のような方法によってヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼに特異
的なモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ
を選択した。すなわち、リン酸緩衝液(PBS) にヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを 500
ng/mlの濃度で溶解し、96穴マイクロアッセイプレート
に 100μl ／ウェルとなるように分注し、４℃で一晩放
置して抗原固定化プレートを作製した。次に非結合のヒ
トα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ溶
液を除去し、0.05% Tween 20を含む PBSで洗浄した後、
1.0%の BSAを含む PBSを分注し、37℃２時間に放置して
ブロッキングした。同様に洗浄後、ハイブリドーマ培養
上清を 100μl ／ウェルとなるように分注し、37℃１時
間に放置した。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ
標識抗マウス免疫グロブリン抗体( DAKO社製) を1000倍
に希釈したものを 100μl ／ウェルとなるように分注
し、１時間37℃に放置した。最後に同様に洗浄した後、
ペルオキシダーゼ基質(ABTS-過酸化水素系) 100 μl ／
ウェルとなるように加え、吸光度を測定した。
懸濁し96穴のマイクロカルチャープレートに分注して培
養した。約２週間後、ハイブリドーマが増殖したウェル
の培養上清について以下のような方法によってヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼに特異
的なモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ
を選択した。すなわち、リン酸緩衝液(PBS) にヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを 500
ng/mlの濃度で溶解し、96穴マイクロアッセイプレート
に 100μl ／ウェルとなるように分注し、４℃で一晩放
置して抗原固定化プレートを作製した。次に非結合のヒ
トα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ溶
液を除去し、0.05% Tween 20を含む PBSで洗浄した後、
1.0%の BSAを含む PBSを分注し、37℃２時間に放置して
ブロッキングした。同様に洗浄後、ハイブリドーマ培養
上清を 100μl ／ウェルとなるように分注し、37℃１時
間に放置した。続いて同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ
標識抗マウス免疫グロブリン抗体( DAKO社製) を1000倍
に希釈したものを 100μl ／ウェルとなるように分注
し、１時間37℃に放置した。最後に同様に洗浄した後、
ペルオキシダーゼ基質(ABTS-過酸化水素系) 100 μl ／
ウェルとなるように加え、吸光度を測定した。
【００３２】以上のようにして選択されたハイブリドー
マのうちクローンFTA1-5, FTA1-9,FTA1-16, FTA3-10が
ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ
と特異的に反応した。なお、このハイブリドーマFTA1-
5, FTA1-9, FTA1-16, FTA3-10細胞は生命工学工業技術
研究所に寄託され、その受託番号はそれぞれＦＥＲＭＰ
−１４５８６、ＦＥＲＭ Ｐ−１４５８７、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５８８、ＦＥＲＭ Ｐ−１４５８９である。
マのうちクローンFTA1-5, FTA1-9,FTA1-16, FTA3-10が
ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ
と特異的に反応した。なお、このハイブリドーマFTA1-
5, FTA1-9, FTA1-16, FTA3-10細胞は生命工学工業技術
研究所に寄託され、その受託番号はそれぞれＦＥＲＭＰ
−１４５８６、ＦＥＲＭ Ｐ−１４５８７、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４５８８、ＦＥＲＭ Ｐ−１４５８９である。
【００３３】実施例７ 抗ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラー
ゼ抗体の調製 実施例６で得られたそれぞれのハイブリドーマ１×１０
7 個を、プリスタン0.5ml 投与後２週間のBALB/cにそれ
ぞれ腹腔内投与した。約10日後、マウス腹腔中に腹水が
貯溜し、この腹水中に抗ヒトα（１，３／１，４）フコ
シルトランスフェラーゼ抗体が高濃度に含まれていた。
採取した腹水は ABxカラム (ベーカーボンド社製) によ
るイオン交換クロマトグラフィー、あるいはプロテイン
Ａによるアフィニティークロマトグラフィーで精製し
た。
ゼ抗体の調製 実施例６で得られたそれぞれのハイブリドーマ１×１０
7 個を、プリスタン0.5ml 投与後２週間のBALB/cにそれ
ぞれ腹腔内投与した。約10日後、マウス腹腔中に腹水が
貯溜し、この腹水中に抗ヒトα（１，３／１，４）フコ
シルトランスフェラーゼ抗体が高濃度に含まれていた。
採取した腹水は ABxカラム (ベーカーボンド社製) によ
るイオン交換クロマトグラフィー、あるいはプロテイン
Ａによるアフィニティークロマトグラフィーで精製し
た。
【００３４】抗ヒトα（１，３／１，４）フコシルトラ
ンスフェラーゼモノクローナル抗体はいずれも以下の特
徴を有していた。
ンスフェラーゼモノクローナル抗体はいずれも以下の特
徴を有していた。
【００３５】i)免疫グロブリンのタイプ：IgG ii)分子量：約15万ダルトン iii)分子吸光係数：E280nm = 14.0 実施例８ 抗ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラー
ゼモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティン
グ ヒト株化細胞（C-1,MKN-45) のライセイトを10% SDS, 5
% 2-メルカプトエタノール及び 5% グリセリン溶液で溶
解した後、10% ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
し、これをさらにニトロセルロース膜に転写して転写膜
を作製した。このように調製した転写膜を、１% BSA を
含む PBS中に室温で２時間放置し、ブロッキングした。
この転写膜と、実施例７で得られたそれぞれの抗ヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼモノク
ローナル抗体を２時間反応させた。0.05% Tween 20を含
む PBSで転写膜を洗浄後、ビオチン化抗マウス免疫グロ
ブリン抗体 (ベクタステイン ABCキット、ベクター社
製) と30分間反応させた。同様に洗浄後、アビジンDH及
びビオチン化ペルオキシダーゼの複合物と30分間反応さ
せた。同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ不溶性基質(4-
クロロナフトール -過酸化水素系) を加えて発色させ
た。
ゼモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティン
グ ヒト株化細胞（C-1,MKN-45) のライセイトを10% SDS, 5
% 2-メルカプトエタノール及び 5% グリセリン溶液で溶
解した後、10% ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
し、これをさらにニトロセルロース膜に転写して転写膜
を作製した。このように調製した転写膜を、１% BSA を
含む PBS中に室温で２時間放置し、ブロッキングした。
この転写膜と、実施例７で得られたそれぞれの抗ヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼモノク
ローナル抗体を２時間反応させた。0.05% Tween 20を含
む PBSで転写膜を洗浄後、ビオチン化抗マウス免疫グロ
ブリン抗体 (ベクタステイン ABCキット、ベクター社
製) と30分間反応させた。同様に洗浄後、アビジンDH及
びビオチン化ペルオキシダーゼの複合物と30分間反応さ
せた。同様に洗浄後、ペルオキシダーゼ不溶性基質(4-
クロロナフトール -過酸化水素系) を加えて発色させ
た。
【００３６】結果を図５に示す。この結果、ヒト株化細
胞ライセイトの転写膜には FTA1-16, FTA3-10 に対して
約30〜50キロダルトンのバンドが得られた。実施例５で
得られたヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフ
ェラーゼに対しても同様のウェスタンブロッティングを
行ったが、この場合は FTA1-5, FTA1-9, FTA1-16, FTA3
-10 に対して明瞭なバンドが得られた。
胞ライセイトの転写膜には FTA1-16, FTA3-10 に対して
約30〜50キロダルトンのバンドが得られた。実施例５で
得られたヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフ
ェラーゼに対しても同様のウェスタンブロッティングを
行ったが、この場合は FTA1-5, FTA1-9, FTA1-16, FTA3
-10 に対して明瞭なバンドが得られた。
【００３７】実施例９ 抗ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラー
ゼモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ測定法 実施例７で得られたFTA1-5及びFTA1-9抗体を PBSで10μ
g/mlの濃度に調製し、96ウェルアッセイプレート (ヌン
ク社製) に 100μl/ウェルとなるように分注し、４℃一
晩放置して、抗体固定化プレートを作製した。次に、非
結合のFTA1-5及びFTA1-9抗体溶液を除去し、0.05% Twee
n 20を含む PBSで洗浄した後、1.0%のBSAを含む PBSを
100μl/ウェルに分注し、37℃２時間放置してブロッキ
ングした。ここでヒトα（１，３／１，４）フコシルト
ランスフェラーゼを 0, 0.03,0.3, 3, 30ng/mlとなるよ
うに1% BSAを含む PBSにて調製し、抗体固定化プレート
に 100μl/ウェルとなるように分注した。37℃２時間放
置の後、同様に洗浄し、常法によりアルカリフォスファ
ターゼを結合させた酵素標識FTA1-16 抗体を適当な濃度
に希釈して、 100μl/ウェルとなるように分注した。37
℃１時間放置後、同様に洗浄し、アルカリフォスファタ
ーゼ基質PNPP(4-Nitrophenyl phosphate) を 100μl/ウ
ェルとなるように加え、吸光度を測定した。結果を表１
に示す。このサンドイッチ測定法は、数ng/ml のヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを十分
検出することができた。
ゼモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ測定法 実施例７で得られたFTA1-5及びFTA1-9抗体を PBSで10μ
g/mlの濃度に調製し、96ウェルアッセイプレート (ヌン
ク社製) に 100μl/ウェルとなるように分注し、４℃一
晩放置して、抗体固定化プレートを作製した。次に、非
結合のFTA1-5及びFTA1-9抗体溶液を除去し、0.05% Twee
n 20を含む PBSで洗浄した後、1.0%のBSAを含む PBSを
100μl/ウェルに分注し、37℃２時間放置してブロッキ
ングした。ここでヒトα（１，３／１，４）フコシルト
ランスフェラーゼを 0, 0.03,0.3, 3, 30ng/mlとなるよ
うに1% BSAを含む PBSにて調製し、抗体固定化プレート
に 100μl/ウェルとなるように分注した。37℃２時間放
置の後、同様に洗浄し、常法によりアルカリフォスファ
ターゼを結合させた酵素標識FTA1-16 抗体を適当な濃度
に希釈して、 100μl/ウェルとなるように分注した。37
℃１時間放置後、同様に洗浄し、アルカリフォスファタ
ーゼ基質PNPP(4-Nitrophenyl phosphate) を 100μl/ウ
ェルとなるように加え、吸光度を測定した。結果を表１
に示す。このサンドイッチ測定法は、数ng/ml のヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを十分
検出することができた。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例１０ 抗ヒトα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラー
ゼモノクローナル抗体を用いたコンペティション測定法 実施例５で得られたヒトα（１，３／１，４）フコシル
トランスフェラーゼをPBSにて500ng/mlに希釈し、96ウ
ェルアッセイプレートに 100μl/ウェルになるように分
注し、４℃一晩放置して抗原固定化プレートを作製し
た。次に、非結合のヒトα（１，３／１，４）フコシル
トランスフェラーゼを除去し、 0.05%Tween 20を含む
PBSで洗浄後、1%の BSAを含む PBSを 100μl/ウェルに
なるように分注し、37℃２時間放置してブロッキングし
た。ここでヒトα（１，３／１，４）フコシルトランス
フェラーゼを0, 24, 240, 2400, 24000ng/mlとなるよう
に1% BASを含む PBSにて調製し、それぞれのヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ溶液50
μl と、一方で常法によりアルカリフォスファターゼを
結合させたFTA1-16 抗体の適当な濃度に希釈した溶液50
μl とを混合し、これを抗原固定化プレートの各ウェル
に分注した。37℃２時間放置の後、同様に洗浄し、アル
カリフォスファターゼ基質であるPNPPを 100μl/ウェル
になるように加え、その吸光度を測定した。結果を表２
に示す。このコンペティション測定法は、24ng/ml のヒ
トα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを
十分検出することができた。
ゼモノクローナル抗体を用いたコンペティション測定法 実施例５で得られたヒトα（１，３／１，４）フコシル
トランスフェラーゼをPBSにて500ng/mlに希釈し、96ウ
ェルアッセイプレートに 100μl/ウェルになるように分
注し、４℃一晩放置して抗原固定化プレートを作製し
た。次に、非結合のヒトα（１，３／１，４）フコシル
トランスフェラーゼを除去し、 0.05%Tween 20を含む
PBSで洗浄後、1%の BSAを含む PBSを 100μl/ウェルに
なるように分注し、37℃２時間放置してブロッキングし
た。ここでヒトα（１，３／１，４）フコシルトランス
フェラーゼを0, 24, 240, 2400, 24000ng/mlとなるよう
に1% BASを含む PBSにて調製し、それぞれのヒトα
（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ溶液50
μl と、一方で常法によりアルカリフォスファターゼを
結合させたFTA1-16 抗体の適当な濃度に希釈した溶液50
μl とを混合し、これを抗原固定化プレートの各ウェル
に分注した。37℃２時間放置の後、同様に洗浄し、アル
カリフォスファターゼ基質であるPNPPを 100μl/ウェル
になるように加え、その吸光度を測定した。結果を表２
に示す。このコンペティション測定法は、24ng/ml のヒ
トα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼを
十分検出することができた。
【００４０】
【表２】
【００４１】
【発明の効果】本発明により、α（１，３／１，４）フ
コシルトランスフェラーゼと反応する抗体が初めて提供
され、該抗体を免疫反応に用いることにより、従来測定
できなかったα（１，３／１，４）フコシルトランスフ
ェラーゼ量を検出することができるようになった。
コシルトランスフェラーゼと反応する抗体が初めて提供
され、該抗体を免疫反応に用いることにより、従来測定
できなかったα（１，３／１，４）フコシルトランスフ
ェラーゼ量を検出することができるようになった。
【図１】FTase 遺伝子増幅プライマーの塩基配列を示し
たものである。
たものである。
【図２】0.8kb DNA 断片の塩基配列を示したものであ
る。
る。
【図３】PW6Aの制限酵素地図である。
【図４】形質転換体（Escherichia coli BL 21(DE3)/PW
6Aθ）から産生されたポリペプチドのタンパク染色結果
である。
6Aθ）から産生されたポリペプチドのタンパク染色結果
である。
【図５】フコシルトランスフェラーゼのウェスタンブロ
ッティング法の結果を示したものである。
ッティング法の結果を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 伊藤 哲 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富 士レビオ株式会社内 (56)参考文献 特開 平５−49495（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−504480（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔ，1990，Ｖｏｌ．４，ｐ．1288−1303 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】α（１，３／１，４）フコシルトランスフ
ェラーゼアイソザイムに特異的に反応するFTA1-5、FTA1
-9、FTA1-16及びFTA3-10抗α（１，３／１，４）フコシ
ルトランスフェラーゼモノクローナル抗体。 - 【請求項２】ハイブリドーマがFTA1-5、FTA1-9、FTA1-1
6及びFTA3-10であるである請求項1に記載のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項３】請求項1に記載のモノクローナル抗体を用
いたフコシルトランスフェラーゼの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28146694A JP3336775B2 (ja) | 1994-10-21 | 1994-10-21 | 抗フコシルトランスフェラーゼ抗体、抗フコシルトランスフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28146694A JP3336775B2 (ja) | 1994-10-21 | 1994-10-21 | 抗フコシルトランスフェラーゼ抗体、抗フコシルトランスフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08119999A JPH08119999A (ja) | 1996-05-14 |
| JP3336775B2 true JP3336775B2 (ja) | 2002-10-21 |
Family
ID=17639580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28146694A Expired - Fee Related JP3336775B2 (ja) | 1994-10-21 | 1994-10-21 | 抗フコシルトランスフェラーゼ抗体、抗フコシルトランスフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3336775B2 (ja) |
-
1994
- 1994-10-21 JP JP28146694A patent/JP3336775B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９０，Ｖｏｌ．４，ｐ．１２８８−１３０３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08119999A (ja) | 1996-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0822484B1 (pt) | Anticorpo imunorreativo com um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3- fosfoshiquímico sintase) mutante, linhagem de células de hibridomas e método para detectar a presença de um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante em uma composição | |
| JPS61500469A (ja) | 化学反応を触媒する方法 | |
| JPS63309198A (ja) | Ｐ−糖タンパク質細胞表面抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ及び抗原のＣ−末端領域のタンパク質をコードしているｃＤＮＡクローンの選択に関する方法 | |
| CN101821623A (zh) | 用于精子性别选择的材料和方法 | |
| WO2006132272A1 (ja) | 抗体の作製方法 | |
| Hiller et al. | Cloning and expression of ragweed allergen Amb a 6 | |
| JP3295358B2 (ja) | ヒトｎｍ２３タンパク質及びそれに対する抗体並びにガン診断剤 | |
| JPWO2006073133A1 (ja) | 新規タンナーゼ遺伝子およびそのタンパク質 | |
| CN116410322A (zh) | 抗人pcdh7蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| JP3336775B2 (ja) | 抗フコシルトランスフェラーゼ抗体、抗フコシルトランスフェラーゼモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及び該抗体を用いたフコシルトランスフェラーゼの測定方法 | |
| Zhang et al. | Construction of a single chain variable fragment antibody (scFv) against carbaryl and its interaction with carbaryl | |
| JP2002533084A (ja) | Ａ群のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの防御的な抗原（ＳＰＡ） | |
| JP2888587B2 (ja) | 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法 | |
| JPH07309900A (ja) | 抗ヒトプロカテプシンｂモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いたヒトプロカテプシンｂ又はヒトカテプシンｂの測定方法 | |
| JP3888695B2 (ja) | ヒトｌｅｃｔ２に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット | |
| JPH09235300A (ja) | ヒトｔｉｍｐ−３及び抗ヒトｔｉｍｐ−３モノクローナル抗体並びにその用途 | |
| RU2817391C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pQE30-Ig-TIM1, обеспечивающая экспрессию иммуноглобулинового домена гена TIM-1/HAVCR-1 человека в клетках E. coli для диагностических и научных исследований | |
| JP3488767B2 (ja) | モノクローナル抗体、これを産生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キット | |
| US20070072269A1 (en) | Ubiquitin-specific protease occurring in the brain and DNA encoding the same | |
| JP3202029B2 (ja) | インターロイキン５の微量定量 | |
| JP2003125766A (ja) | 抗５−メチル−２’−デオキシシチジン抗体および５−メチル−２’−デオキシシチジンの測定法 | |
| JPH09507755A (ja) | 哺乳類細胞におけるメチルチオアデノシンホスホリラーゼ欠乏の検出方法 | |
| JP3521841B2 (ja) | ファイトプラズマの検出方法 | |
| JPH11341980A (ja) | 改変された抗体Ｆａｂ断片 | |
| JP2673619B2 (ja) | 抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラスミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080809 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080809 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090809 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090809 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100809 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |