JPS63309198A - Ｐ−糖タンパク質細胞表面抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ及び抗原のＣ−末端領域のタンパク質をコードしているｃＤＮＡクローンの選択に関する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、いかなる作用も受けていない正常な細胞にお
いては、検出されない、細胞表面抗原、特に多剤抵抗性
に関与するＰ−ｔＩタンパク表面抗原〔ジュリアーノ・
アール・エル（Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｒ，Ｌ、）及びリング
・ブイ（Ｌｉｎｇ、Ｖ、）バイオケム・バイオフィズ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）
　、第４５５巻、第１５２頁−第１６２頁（１９７６）
）に対する特異的抗体を産生ずるハイブリドーマ（つま
り永久に増殖を続けるクローン細胞）を選別する方法に
関するものである。

更に本発明はその様なハイブリドーマ及びそれらによっ
て産生されるモノクローナル抗体にも関するものである
。

臨床面において併用される化学療法というものに対する
耐性は癌の様な腫瘍疾患に関して好結果をもたらす治療
には、大きな障害となる。この臨床的耐性についての基
本的なメカニズムはほとんどまだわかっていない。そし
て、患者がもっているその耐性の種類や程度を判定した
り、容易に合理的な治療法を選定したり、正確な予測の
基準としうる診断薬は現在まだできていない。多くの研
究者は化学療法併用に際して見られるこの臨床的耐性の
メカニズム解明を期待しつつ、種々の薬剤に対して耐性
となる腫瘍の実験系を哺乳動物組織培養及びイン・ビボ
（ｔｎ　ｖｉｖｏ）において開発した。

そしてこれらの実験系が今日多剤耐性フェノタイプと称
され定義されている幾つかの共通な特徴をもっている事
は意味深い事である〔カートナー・エヌ（にａｒ　ｊｎ
１３Ｌ　Ｎ）　、リオルダン・ジエー・アール（Ｒｉｏ
ｒｄａｎ、Ｊ、Ｒ，）及びリング・ブイ　（Ｌｉｎｇ、
Ｖ、）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２１巻、第
１２８５頁−第１２８８頁（１９８３）、及びリング・
ブイ（Ｌｉｎｇ、　Ｖ、）、ゲールラ７ハ、ジエイ　（
Ｇｅｔｌａｃｈ、　Ｊ、）及びカートナー・エヌ（Ｋａ
ｒｔｎｅｒ＋Ｎ、）０、プレスト・キャンサー・レス・
トリート（Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

Ｔｒｅａｔ、）　、第４巻、第８９頁−第９４頁（１９
８４）　）。

その特徴とは（ｉ）関連性のない薬剤に対する多剤交差
耐性、（ｉｉ　）取り込まれた薬剤の総蓄積量の減少、
及び（ｉｉｉ）　１７０，０００ダルトンの細胞表面コ
ンポーネント、ｐ−ｔｌタンパク質の不規則な発現、な
どである。異なった細胞系においてもその他の注目すべ
き点も認められたが、研究に際して最初の薬剤の選択や
哺乳動物とは無関係に定性的には上記特徴としての多剤
耐性のみが一致していた。Ｐ−糖タンパク質の発現と多
剤耐性フェノタイプの出現における著しい関連性により
癌患者の多剤耐性悪性細胞検出のための診断用マーカー
としてＰ−糖タンパク質が使用されるという可能性が出
てきた。また、異なった哺乳動物種においてもＰ−糖タ
ンパク質は確認されているので、哺乳動物細胞表面にお
いて重要な機能的役割を果たしているであろう。しかし
、多剤耐性細胞あるいは正常組織における役割について
はまだわかっていない。

本発明の目的は用途の広い分析用試薬の様に使用しうる
モノクローナル抗体の獲得に関するもので異なる動物種
のＰ−糖タンパク質の相同領域を認識しているものが好
ましい。この理由により、Ｐ−１タンパク質に対する特
異的モノクローナル抗体選別の戦略策定には、幾つかの
理論的な考慮がなされた。

第１に、Ｐ−糖タンパク質はその分子サイズの２０〜３
０％に相当する炭水化物としての部分を持つ〔リング・
ブイ、カートナー・エヌ、スト−・ティー（Ｓｕｄｏ、
Ｔ、）、シミノビフチ・エル（Ｓｉｍｉｎｏ−ｖｉｔｃ
ｈｌ、）及びリオルダン・ジエイ・アール、キャンサー
・トリート・レッゾ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅｓｔ、Ｒｅ
ｐ、）　。

第６７巻、第８６９頁〜第８７４頁（１９８３）　）。

ポリペプチド部分の細胞外領域は比較的大きな炭水化物
部分により限定あるいは隔離されている様である。それ
故、ポリペプチド領域と結合するであろう、Ｐ−糖タン
パク質としての保存抗原部位は細胞表面においては、な
んら影響をうけるものではない。

第２に、他のシステムにおいて細胞表面上での結合に基
づく選別により糖結合物質の炭水化物抗原決定基に直接
反応する抗体をしばしば作成した。

その様な抗原決定基は細胞の分化段階や腫瘍原性なトラ
ンスホーメーシジンにより変化を引きおこす。この変化
は種々の糖タンパク質や糖脂質においても同様にみられ
るであろう。更にＩｌｌ瘍細胞のような不安定な情況に
おいて、いたる所でみられるこの変化はいまだに説明が
ついていない。よって、Ｐ−糖タンパク質の炭水化物抗
原決定基あるいは他の糖タンパク質抗原に直接反応する
抗体は抗原決定基が付着している遺伝子産物をｉｔ’！
認するという限定された用途をもつ。

第３に、薬剤感受性細胞においてもＰ−糖タンパク質の
発現にある基礎的なレベルがあった。よってＰ−糖タン
パク質は哺乳動物細胞中における正常成分の一つであろ
う。

また、もし、それが自己抗原を認識するのであれば、Ｐ
−糖タンパク質の細胞外領域への免疫応答に対する制御
があるはずである。

第４に、天然タンパク質に対するモノクローナル抗体は
、免疫沈降法や免疫プロッティング法による分析には不
十分であることが観察されている。

このことは膜成分が分析操作の過程でしばしば変性する
ことを考えた場合、特に重要な問題である。

免疫沈降法や免疫プロッティング法による分析上の利点
なしに抗体が特異性をもっている抗原の適確な同定をす
ることは困難であろう。最後に、細胞表面に対する結合
というものをその選別の基準にしてＰ−１タンパク質特
異的モノクロ一ナル抗体を調製するという試みは、これ
までの所Ｐ−糖タンパク質を直接的に検出しうる、一般
的に使われるであろう、抗体の産生はまだできていない
〔オーハラ・シ・ジェイ　（０’Ｈａｒａ、Ｃ，Ｊ、）
及びプライス・ジー・ビー（Ｐｒｉｃｅ、Ｇ、Ｂ、）　
、イムコノル・レット（Ｉｖｗｕｎｏｌ、Ｌｅｔｔ、）
、第５巻、第１５頁〜第１８頁、（１９８２）；及びス
ギモト・ブイ（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ＋　Ｙ、）、スズキ・
エッチ（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｈ，）及びタナ力・エヌ（Ｔ
ａｎａｋａ、Ｎ、　）　、バイオケム・バイオフィズ・
レス・コム（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅ
ｓ。

Ｃｏｌｌ１１．）、第１１４巻、第９６９頁〜第９７５
頁（１９８３））。

これら理論的考慮に基づき、永久に増殖を続けるクロー
ン（以下、ハイブリドーマとも表現する）をスクリーニ
ングする方法が確立された。細胞表面結合アッセイ法で
はなくして免疫プロッティング法に有効利用されるモノ
クローナル抗体の選別を約束するスクリーニング法であ
る。

それにより、本発明は、正常細胞の表面ではなんら影響
を受けない、細胞表面抗原のドメインを特異的に認識し
ている抗体を産生じ、永久に増殖を続けるクローンの選
別方法を提供するものであり、以下のステップより成る
；実験系に適した哺乳動物に抗体として獲得したい哺乳
動物細胞系の原形質膜を含む細胞や組織分画物で免疫；
前記免疫哺乳動物より永続的に抗体を産生ずる細胞を取
り永久に増殖を続ける抗体産生クローンを多数作製；及
び前記抗原を同厚基質に固定しそれに対する特異的抗体
を産生じている前記クローンのスクリーニングより成る
。

また、本発明前述方法により作られるハイブリドーマや
モノクローナル抗体において本発明はその様なモノクロ
ーナル抗体はもち論、ある一定の細胞表面抗原、特にＰ
−糖タンパク質に特異的な抗体、すなわちモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマを提供することにある
。

Ｐ−１ｇタンパク質は哺乳動物種間において、かなり高
度に保存されている様である。本発明においてチャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のＰ−１タンパク
質に結合するモノクローナル抗体は他の奮歯動物やヒト
多剤耐性細胞系におけるＰ−［タンパク質との間に交差
反応性をもっていた。この保存性についてＤＮＡレベル
での解析にまで広げた。

ＣＨＯＰ−糖タンパク質のＣ−末端領域をコードしてい
る６４０ｂｐのｃＤＮＡクローン（ｐｃＨＰｌ）は、マ
ウス及びヒトのＤＮＡと強くハイブリダイズする。そし
てこれをＣＨＯ細胞よりさらに長鎖のＰ−糖タンパク質
ｃＤＮＡクローン（例えばｐＬ２Ｂ）約２．　ＯＯＯｂ
　ｐを選択するときのプローブとする。

さらにこのプローブはヒトＰ−糖タンパク質の遺伝子が
クロモシーム７ｇ３６上にある事をつきとめるのにも使
用された。ヒト、ハムスター、及びマウス細胞系より得
たＤＮＡの制限酵素により様々に混ざりあっている断片
をｐＣＨＰ　１をプローブとした、ＤＮＡのサザーン・
プロット法による解析結果より、Ｐ−１ｉタンパク質は
多重遺伝子族によりコードされている事が示唆された。

Ｐ−糖タンパク質遺伝子の複製はＰ−糖タンパク質の発
現を増大させる事が多剤耐性細胞系においてしばしば見
うけられる。ある種の多剤耐性細胞系において、Ｐ−糖
タンパク質遺伝子の異なった複製が観察されている事よ
り、この種々のＰ−糖タンパク質発現が多剤耐性フェノ
タイプ全体に対して作用を及ぼしているという可能性が
出てきた。

多剤耐性におけるｐ−Ｆタンパク質の機能についてはま
だ解明されていないというのが現状である。この耐性の
基礎になっているのは、細胞内における薬剤の蓄積量の
減少にあるとされている。

すなわち、Ｐ−１タンパク質は薬剤の原形質膜における
内側、外側あるいはその両者の通過移動に対して、間接
的あるいは直接的に介在しているものと推測されている
。

本発明はその様なＰ−糖タンパク質の機能解明のために
重要なＰ−１ｉタンパク質のアミノ酸配列を提供するも
のである。Ｐ−ＩＩタンパク質と同様に多剤耐性でしか
もアルファー溶血素を輸送する大腸菌における溶血素β
（ｈｌｙ　Ｂ）タンパク質とＰ−糖タンパク質との間に
みられる著しい相同性により、Ｐ−糖タンパク質の介在
多剤耐性の直接的な機能解明のためのモデルとされるも
のである。

本発明の好ましい方法により多剤耐性チャイニーズ・ハ
ムスター卵巣細胞及びヒトの細胞系における原形質膜を
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化して、マウ
スを使って免疫した。ハイブリドーマはその免疫された
マウスから取り出した肺細胞とそのパートナとして適し
ている細胞とを融合させて作成した（以下記載の実施例
１参照）。

ニトロセルロース膜上べ固定された界面活性剤可溶化原
形質膜成分に対する交差種パネルを用いて選別したモノ
クローナル抗体がよく保存されている薬剤耐性を示す特
異的な抗原決定基とその変性している抗原中において結
合しろる事が実証された。これは５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のタンパク
質免疫プロット（ウェスタンプロッティング）法により
示されている。

ニトロセルロース脱法使用によるハイブリドーマ・スク
リーニングの結果を第１図に示す。予期した通り哺乳動
物、ＣＨＯあるいはヒトの抗原に対して共通性を示すも
のも含めた種々の特異性が幾つか認められた（第１図；
ｆ、ｅ、ｃ）。

更に重要な事とてしてＣＨＯあるいはヒト、またはその
両者の細胞系における耐性膜に対する特異性も検出され
た（第１図ｉ　ｂｓ　ｄｚ　ａ）。しかし、膜使用法の
大部分についてはその結果が陰性であったり、弱い染色
力を持っていたにすぎない。

第１図に示した以外の特異性についてはほとんどまれに
しか検出されず、しかも−船釣にその真偽の程は疑かわ
しい。ハイブリドーマの増殖が陽性であった１、　００
７個のウェルにおけるハイブリドーマ培養上清液の第１
次スクリーニングの結果より、薬剤耐性細胞膜に対して
７１個のウェルにおいて陽性反応が確認された（ヒトの
みに対して１９個、ＣＨＯのみに対して３７個、その両
者に対して１５個）。

これらのウェルをそれぞれ拡大培養して、更に第２次ス
クリーニングを行ない、２１個のウェル中においてなお
強い陽性反応を検出した（ヒト；２、ＣＨＯ；　５、両
者：１４）。

上記記載の特異的抗体産生クローン選択のスクリーニン
グ法に基づき、薬剤耐性膜特異的ハイブリドーマを限界
希釈法を２回繰り返すことによりクローン化した。

そして最終的に８個の安定なりローンを分離した（ＣＨ
Ｏ；３、ＣＨＯ及びヒト；５）。

特異抗体分泌ハイブリドーマの数が減っていくのはおそ
らく、それらの遺伝子的な不安定性によるものであろう
。

第１次スクリーニングの結果は、ハイブリドーマの大部
分が偽陽性であったというよりも、不安定な特異的抗体
産生ハイブリドーマがかなり含まれていた事を示すもの
である。それらのより詳細な性状は２回クローニング選
別ハイブリドーマの最終産物により検討した。

モノクローナル　　の　′ ハイブリドーマの最初のスクリーニングの結果は、種々
の抗体により認識される結合部位に幾つかの差異が期待
される事を明らかに示している。

例えば８個の最終クローンの内、３個は薬剤耐性ヒト細
胞膜に対して親和性を示さなかった。これらの相異をよ
り正確に特徴付けるために、クローン化したハイブリド
ーマの培養上清液をより大きなパネルでその薬剤感受性
及び耐性原形質膜に対してのスクリーニングを行なった
。感受性及び耐性ＣＨＯ細胞の原形質膜を５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって免疫プロッティング用の試験フィルター膜
を作製した。

第２図（Ａ及びＢ）はこれらの操作による結果を示した
ものである。第２　（Ａ）図に示されているより大きな
細胞系パネルのドツトプロッティングにより得られた染
色パターンの違いから、８個のモノクローナル抗体をさ
らに３つの異なったグループ（１，ｆｆ、ｍ）に分類し
た。８個のモノクローナル抗体のどれを使おうともいか
なる細胞系において薬剤感受性細胞膜との顕著な染色反
応は見られなかった。

グループ■のモノクローナル抗体は試験したすべての薬
剤耐性膜との間に染色反応を示した。グループＨの中に
は薬剤耐性ＣＨＯ及びマウス膜に対して染色反応をもつ
ものや、ヒトの膜に対しては非常に弱い染色しか示され
ないものがある。グループ■に属するものは薬剤耐性Ｃ
ＨＯ及びヒト膜に対して染色反応をもち、マウスに関し
ては染色反応をもたない、他の小さな相異もまた同様に
その３つのグループにおいてｖａ認された。

モノクローナル抗体により染色される抗原の分子のサイ
ズを決定するために、薬剤感受性及び薬剤耐性原形質膜
をウェスタンブロッティングしたフィルターに対して、
ハイブリドーマ培養上清を作用させ放射能標識された第
２次抗体を更に反応させる操作を行なった。第２　（Ｂ
）図に見られるようにすべての抗体は約１７０，０００
ダルトンにおける薬剤耐性特異的バンドと反応していた
。低分子量の薄いバンドもまた、染色されていた事は興
味深い所である。

これらのバンドは一つの細胞から得られる種々の原形質
膜調製物の中において変化しうる、主要染色バンドから
分離してきたタンパク分解を受けた断片であろう。これ
ら微小バンドはいずれも薬剤感受性細胞膜中には存在し
ていなかった。

多剤耐性原形質膜のｐ−１，１タンパク質に対する特異
的なポリクローナル・ウサギ抗血清使用の際にも、同様
の推定上の分解産物が出現してくるという詳ねしい報告
がある〔カートナー・エヌ、リオルドン・ジエイ・アー
ル、及びリング・ブイ、サンエンス（Ｓｃｉｅｎｓｅ）
第２２１巻、第１２８５頁−第１２８８頁（１９８３）
）。一般的な現象として、界面活性剤による可溶化反応
中にもたらされる膜付随プロテアーゼの活性化、または
、ＳＤＳ存在下での加熱処理によるタンパク質の化学的
開裂などがある。

例えばニーマン（Ｎｉｍａａ＋）及びエルグ−（Ｅｌｄ
ｅｒ）はネズミレトロウィルスのエンベロープ糖タンパ
ク質、ｇｐ７０についての生体系本来の分解断片につい
て詳しく述べている。また、それら断片をｇｐ７０の抗
原部位マフピングのための一般的概略図作成のために使
用している〔ニーマン・エッチ・エル（Ｎｉｍａｎ、Ｈ
，Ｌ、）　、及びエルダー・ジェイ・エッチ（Ｅｌｄｅ
ｒ、Ｊ、Ｈ，）　、モノクローナル・アンタイボディー
ズ・アンド・ティー・セル・プロダクツ（Ｍｏｎｏｃｌ
ｏ’ｎａｌ　Ａｎ糖ｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ　Ｃｅ１
ｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（カフツ・ディー・エッチ（Ｋ
ａｔｚ、　Ｄ、Ｈ，）Ｉ集）第２３頁〜第５１頁（シー
・アール・シー（ＣＲＣ）プレス（Ｐｒｅｓｓ）、ポカ
・シートン（Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ）、フロツグ（Ｆ　
ｆｏｒ　１ｄａ）、（１９８２））、これに関連して、
興味深いことは、単一の原形質膜ｌｌ製物を異なるモノ
クローナル抗体に対するプローブとして使用すると、低
分子量バンド中に２本の異なるバンドパターンが検出さ
れた事である。第２（Ｂ）図はグループ１１■、■にお
ける代表的な抗体により得られたパターンを示すもので
ある。

グループ■における抗体は１つのパターンのみを示し、
グループ■及び■はそれぞれ異なるパターンを示した。

これは生体系本来のタンパク分解開裂部位は、グループ
Ｉの抗原決定基をグループ■及び■における抗原決定基
から区別しうろことを示唆している。付は加えるべきそ
の他の情報なしにより正確に抗原決定基をマフピングし
ようとするあらゆる試みは、抗原決定基がＰ−糖タンパ
ク質ポリペプチド内で反復配列をもち、またはＰ−糖タ
ンパク質が類似している、あるいは同じでない族におけ
る異なったメンバーの中に存在し得る可能性のために複
雑なものになるであろう。

種々の原形質膜のパネルに対する染色反応パターンやペ
プチドマツプの差異は３つの異なった抗原部位の存在を
示唆している。８個のモノクローナル抗体間の差異のよ
り直接的な証拠を与え、それらの結合部位の立体的な関
連性を決定するために、種々のハイプリドーマを腹水に
接種し、それを精製、放射性標識した、３つの抗体グル
ープの代表的抗体により拮抗結合反応試験を行なった。

典型的な拮抗アッセイの結果を第３図に示した。

これらの結果は立体的に異なる３つの抗原決定基に対す
る結合性を基に、抗体が明らかに３つのグループ（Ｉ、
■及び■）に分類される事を示している。第３図に示し
た、精製、放射性標識ヨード結合抗体と８個のモノクロ
ーナル抗体との直接的拮抗結合アッセイにおいて、９６
大のプレート中でニトロセルロースに固定されたＣＨＲ
Ｂ３０由来の原形質膜小胞をそのターゲット抗原とした
。

第３図において、横座標は非標識拮抗抗体の放射性標識
抗体の濃度比を対数値のスケールで表わす。

縦座標は、拮抗抗体の非存在下でのｃｐｍ範囲を平均化
し、そのｃｐｍ範囲のパーセントスケールで表わす。単
一の同時実験の結果が明確に示されている。

パネル■は８個の異なるハイブリドーマにより作製され
た抗体を含む腹水を希釈したものに対する標識されたグ
ループＩの抗体（Ｃ２１９）の拮抗を示すものである。

グループ■及びグループ■の抗体はＣ２１９とは拮抗し
ない。Ｃ２１９の自己拮抗曲線に関して、その他のグル
ープＩの抗体の拮抗曲線における大きな変化はそれらの
結合親和力の差によるものである。異なるアイソタイプ
の抗体の定量化における誤差もまた見かけの変化に寄与
している。

パネル■はその他の腹水とグループ■の抗体（Ｃ３２）
との拮抗を示すものであり、グループ■と■の抗体はＣ
３２と拮抗しない。グループ■において、３つの抗体に
ついての結合力イネティクスにはかなりの類催性が認め
られた。

パネル■はグループ■における単一の代表的な抗体（Ｃ
４９４）に対する拮抗データーを示すものである。

グループＩ及び■の抗体はＣ４９４と拮抗しない。試験
抗体はＣ１１，○；Ｃ２６，・；Ｃ３２゜△；Ｃ３６，
ム；ＣｌＯ３，；Ｃ２１９，マーＣ４９４，口；及びＣ
６９９，−である。

Ｐ−ンバク　の 上に示された証拠は、調整中のモノクローナル抗体が多
剤耐性細胞のｐ−糖タンパク質と結合することを強く示
唆している。しかしこの結果には、ｐ−１タンパク質を
定義するために以前使用した細胞系での抗体チェックに
よる確認が必要である。

ドツトプロット法ｉ薬剤耐性細胞膜に対して特異的染色
を示したが、それぞれのケースにおいて、同一抗原が結
合しているのか明らかではない。これまでの研究におい
て、−貫した分子量の同−Ｐ−糖タンパク賞が、すべて
の多剤耐性細胞系において発現している事が示された〔
カートナー（Ｋａｒｔｎｅｒ）等、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）　、上述、；ジアバジー・アール（Ｇｉａｖ
ａｚｚｉ＋Ｒ，）、カートナー・エヌ（Ｋａｒｔｎｅｒ
、Ｎ、）及びハート・アイ・アール（Ｈａｒｔ、１．Ｒ
，）　、キャンサー・ケモテル・ファルマコル（Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｃｈｅｓｏｔｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、）　
、第１３巻、第１４５頁−第１４７頁（１９８４）；カ
ートナー・エヌ（Ｋａｒｔｎｅｒ、Ｎ、）　、シャール
ス・エム（Ｓｈａｌｅｓ、Ｍ、）　、リオルダン・ジェ
イ・アール（Ｒｉｏｒｄａｎ、　Ｊ、　Ｒ，）及びリン
グ・ブイ（Ｌｉｎｇ、Ｖ、）　、キャンサー・レス（Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５）、第４３巻、第４４１３頁−第４
４１９頁、（１９８３））。これにより、一連の原形膜
質のウェスタンプロットは、放射性標識ヨード結合モノ
クローナル抗体を使用して染色した。

第４　（Ａ）図は、コルヒチン耐性が増大したＣＨＯ細
胞由来の一連の原形質膜を染色した結果を示すものであ
り、薬剤感受性リバータントについても示した（レーン
Ｈａ−ｄ、及びｆ）、ダウノルビシン耐性ＣＨＯ細胞系
についてもテストした（レーン；ｅ）。更にコルヒチン
耐性マウス（レーン；ｈ）、及びビンブラスチン耐性ヒ
ト細胞（レーン；ｊ）のプロットに対しても検査した（
薬剤感受性である親細胞を対照にした。それぞれレーン
ｇ及びｉ）、プロットをより長時間感光するとくレーン
に−ｎ）、感受性親細胞の膜においてかすかなバンドが
検出されてきた。レーンａ１ｆ、ｇ及び■それぞれのリ
バータント細胞でも同様である。薬剤感受性細胞におけ
るＰ−糖タンパク質の低い発現率はすでに報告されてい
る〔カートナー（Ｋａｒｔｎｅｒ）等、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）　、上述）。リン酸あるいは共通な炭水
化物エピトープの検出という様な異なった種における見
かけ上回−である１７０にバンドに対するありふれた説
明はレーン０及びＰのコントロール群により除外された
。多数の哺乳動物種においての薬剤の選択如何にかかわ
らず、Ｐ−糖タンパク質の発現の増大と多剤耐性の増大
との相関や、抗原分子サイズの保存性というものは、モ
ノクローナル抗体が結合する抗原はＰ−１ｉタンパク質
であるという、これまでに証明されている〔カートナー
（Ｋａｒｔｎｅｒ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
　、上述〕事をさらに確かなものとする。

これまでの結果は、この実験に際して、ニトロセルロー
スフィルター上に固定された、界面活性剤により可溶化
され変性したＰ−糖タンパク質はモノクローナル抗体に
より検出されることを示している。

診断及び研究のための多くの応用目的において重要なこ
とは、いかなる作用も受けていない正常の細胞及び組織
の中に存在している状態の抗原部位を抗体が認識できる
ことである。この点に関して、放射性標識抗体及び間接
的免疫螢光染色の両方法により、なんら作用を受けてい
ない正常な多剤耐性細胞では細胞表面において結合する
モノクローナル抗体はないことが確認された。それにも
かかわらず、第４（Ｂ）図に見られるように固定し透過
可能にした細胞を用いて、モノクローナル抗体が耐性Ｃ
ＨＯ及びヒト細胞の表面膜をラベルする能力を持つこと
が判明した。

本実験により、モノクローナル抗体により同定されたエ
ピトープは原形質膜の細胞質面に隠れているか、露出し
ているかである。自然の状態における原形質膜小胞がニ
トロセルロース上にスポットした場合、ＳＤＳ可溶化膜
に対するのと同様に８個すべての抗体はそれらのスポッ
トと結合する、これはタンパク質かつつみこまれた状態
になっていないということは、とりたててエピトープ認
識にとって必須ではないことを示している。それにより
、抗体は、破壊されまたは内部の現われている膜小胞に
おいて、割合自然な形のＰ−糖タンパク賞の露出してい
る細胞質ドメインに結合すると推定される。第４（Ｃ）
図は、フローサイトメトリーを使用して、これらのモノ
クローナル抗体による細胞の染色度合を半定量的に測定
し、また細胞の薬剤耐性の度合との相関を示す図である
。その様な相関が、薬剤耐性の度合と、薬剤耐性細胞中
において発現されてくるＰ−糖タンパク質の度合との間
に存在していた〔カートナー（Ｋａｒｔｎｅｒ）等、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、上述；カートナー（Ｋ
ａｒｔｎｅｒ）等、キャンサー・レス（Ｃａｎｃｅｒ、
Ｒｅｓ、）、上述；ジアバジー（Ｇｉａｖａｚｚｉ）等
、キャンサー・ケモテル、ファーマコル（Ｃａｎｃｅｒ
　ＣｈｅｍｏＬｈｅｒＰｈａｒ＋５ａｃａｌ　）　、上
述；リオルダン・ジェー・アール（Ｒｉｏｒｄａｎ、Ｊ
、Ｒ，）及びリング・ブイ（Ｌｉｎｇ、　Ｖ、）、ジェ
イ・パイオル・ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、
第２５４＠、第１２７０１頁−第１２７０５頁（１９７
９））。

第４（Ｃ）図に示した耐性細胞における螢光強度と薬剤
耐性の程度との間で得られる、この同様な相関というも
のはＰ−糖タンパク質が特異的に染色されていることを
強く確実に証明するものである。更に第４　（Ｂ及びＣ
）図は、細胞及び組織を染色する試薬として有用である
ことを示している０間接的免疫螢光法における使用の外
にも、常法、免疫ペルオキシダーゼ染色法にもこのモノ
ク　。

ローナル抗体は使用される。

Ｐ−［タンパク質の保存ドメインにおける３つのエピト
ープの局在グループ■のモノクローナル抗体、Ｃ２１９
、は薬剤耐性ＣＨＯ細胞、ＣＨ”Ｂ２Ｏ、のλｇｔｌ１
発現ライブラリーから６４０ｂｐのｃＤＮＡプローブ、
ｐｃＨＰｌ、を得るために使用した。

ｐｃＨＰｌのｌａｃ　Ｚ融合産物はＣ２１９と結合する
エピトープを含んでいるであろう。ｐＣＨＰｌをプロー
ブとしたゲノムＤＮＡのサザンプロットから、耐性は遺
伝子の増幅に付随しているということも含む、個々の証
拠より、ｃＤＮＡはそのＣ−末端側のＰ−糖タンパク質
の断片をコードしているであろうという考えを強く支持
する。幾つかの理由により、異なるエピトープを認識し
ている抗体がｌａｃ　Ｚ融合産物と結合するかどうかを
知ることは興味があるところである。第１に、ｐｃＨＰ
ｌによりコードされているポリペプチドにおいて、一つ
以上のエピトープが存在しているということはｃＤＮＡ
がＰ−［タンパク質の断片を真にコードしているという
強く確実な証拠を提供するであろう。

単一のＰ−糖タンパク質特異的モノクローナル抗体は非
−Ｐ−糖タンパク質抗原と結合をするかもしれないが、
独立したエピトープを結合している抗体が同様の非−Ｐ
−糖タンパク賞抗原と結合するという゛ことはありそう
もない。第２に、ｐｃＨｌによりコードされている様な
ペプチド断片は、ｌａｃ　Ｚ融合産物と結合するモノク
ローナル抗体のグループの中の付加的サブグループを決
定するための試薬として役立つ、最後として、結合デー
ターは異なるエピトープの大ざっばな位置ぎめを可能に
し、Ｐ−塘タンパク質の構造にいくつかの洞察を与える
可能性もある。

第５（Ａ）図においてコントロールとしてのλｇｔｌｌ
−怒染細菌及びｐｃＨｌ−感染細菌の溶解物を５ＤＳ−
ＰＡＧＥで解析した結果を示す。

コントロール溶解物（レーンａ）において、強いβ−ガ
ラクトシダーゼのバンドを検出。ｐＣＨＰ　１溶解物で
は、このバンドは消失し、約１４，５００ダルトンの部
分に主要なＩａｃ　Ｚ融合バンドが検出された。

このバンドはｐｃＨＰ１挿入物の大部分、あるいはすべ
ての部分がオープンリーディングフレームをコードして
いるかもしれないと思われる、おおよそのサイズに等し
い。

主要１ａｃ　Ｚ融合のバンドよりも幾分小さい分子量を
もった多くの新しいバンドも検出された。これらは、Ｉ
ａｃ　Ｚ融合タンパク質のタンパク分解作用により出現
した断片と推定される。

第５（Ｂ）図はｐｃＨＰｌのｌａｃ　Ｚ融合産物とそれ
ぞれ３つのモノクローナル抗体との厳密なウェスタンプ
ロットの結果を示すものである。３つのエピトープはす
べて、同様のペプチド断片として検出された。

グループＩ及び■の抗体は主要１ａｃ　Ｚ融合産物のみ
を染色する様だが、グループ■の抗体は、同様に幾分小
さい分子量をもつ断片をも染色する。

低分子量バンドではあるが、β−ガラクトシダーゼより
はすべて大きく、また挿入物によりコードされているペ
プチドはβ−ガラクトシダーゼのＣ−末端側に付着され
ている事より、エピトープの大まかなマフピングが可能
である。タンパク分解によると思われる断片の染色は、
グループ■のエピトープがｐｃＨＰｌによりコードされ
ているペプチドのＣ−末端領域の末端にあることを示唆
している。

主要なあるいは、より大きなバンドのみが、グループ■
及び■の抗体により染色されているように見えるので、
それらはペプチドのＣ−末端の近傍でクラスターを形成
していると思われる。ｐＣ）ＩＰＩ溶解物とコントロー
ルλｇｔｌｌ溶解物のドツトプロットにより、８個のモ
ノクローナル抗体すべてがｌａｃ　Ｚ融合産物と結合す
ることが確認された。

ｐｃＨＰｌは、おそら＜ｐ−糖タンパク質ポリペプチド
部分の２０％以下をコードしているにすぎない事から、
この結果は驚（べきものである。

ｌａｃ　Ｚ融合産物中における３つの独立したエピトー
プの存在によりｐｃＨＰｌはＰ−糖タンパク質をコード
していることがよりはっきりと確認された。更に、この
実験結果は、Ｐ−１ｇタンパク賞のＣ−末端領域に免疫
原性、保存ドメインが存在していることを示唆するもの
である。

要約として、ＳＯ３変性、ニトロセルロース上固定操作
後に保存された、多剤耐性付随抗原と結合するモノクロ
ーナル抗体選定の為の、戦略が画策され、実行された。

本発明において使用されたハイブリドーマのスクリーニ
ング方法は、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体
作製の一般的な有効操作法による。

これは、有力なウェスタンブロッティング法における抗
原検出用の有効試薬になると確信されている。

更に、これは細胞表面上での結合アッセイに付随してく
る、おこりうる幾つかの問題点を回避し、またそうなる
べき、ハイプリドーマスクリーニングに対して、補足的
な代替法を提供するものである。この方法は膜抗原のド
メインに対する抗体作製の手段をも提供する。これらの
ドメインは細胞の細胞質に付随する機能をもつことから
非常に興味ある物で、しかし、それらの詳細な特性とい
うものは、はとんど、知られていない。

多剤耐性細胞の原形質膜に異なった結合をもつモノクロ
ーナル抗体の作製により、８個の異なった抗体が得られ
た。

Ｐ−糖タンパク賞の発現は多剤耐性細胞表面の主要な変
化に基づくという考え方を支持し、８個の抗体が同一抗
原、Ｐ−糖タンパク質に対して特異性を示すということ
は重要なことである。

更に、８個の抗体はそれぞれが、アミノ酸配列において
２４０個以内の領域をもつと限定されている３つの異な
るエピトープの一つと結合する。

このドメインは原形質膜の細胞質表面においてのみ影響
を受けやす（、ｐ−１タンパク質ポリペプチドのＣ−末
端領域にあるとされている。

３つの独立的抗原原性部位がこの領域においてクラスタ
ーになっているのは興味あることである。

これはドメインが、タンパク質の全体部におけるよりも
比較的強い免疫原性をもつことを示唆している。おそら
く、この領域が親水性ドメインでありその他は割り合い
疎水性タンパク質なのであろう。代わりに最近、より変
化をうけやすいコンホメーションをもつ、このポリペプ
チドの領域は、より抗原原性となりやすいであろうこと
が示唆されてきている。

よって、ポリペプチドの末端部は、たまに、抗原原性領
域に関連するものである。また、Ｐ−１タンパク質の細
胞質外ドメインに対して結合する抗体が一つも得られな
かったことも、興味あるところである。

特に炭水化物領域は界面活性剤可溶化に際して、影響を
うけることもなく、他の糖タンパク質に対して、この領
域はしばしば高い割合をもつ抗原原性部位とみなされる
。

本実験結果に対する一つの説明はＰ−糖タンパク質の炭
水化物抗原決定基は、薬剤感受性及び薬剤耐性細胞に存
在している他の糖配合体と共通であり、特異なスクリー
ニング法では検出できないということである０代わりに
、哺乳動物種の間でもし保存されているのならば、自己
−抗原として、Ｐ−糖タンパク質細胞外ドメインを認識
することがこの実験結果を説明することになる。

細胞質ドメインに限定されているエピトープは、種々の
哺乳動物種において等しく表わされているようには見え
ない。

エピトープの一つ（グループ■）は陥歯類及びヒトのＰ
−［タンパク質において、等しく良好に検出され、それ
故に高度に保存されていると思われる。グループ■のエ
ピトープはハムスターにおいて検出され、マウスでは少
量、及びヒトのＰ−糖タンパク質に関してはごくわずか
しか検出されなかった。この結果は、タンパク質のこの
領域における種関連構造的分岐を反映するものであろう
。

一方、グループ■のエピトープはハムスターにおいて検
出され、ヒトＰ−糖タンパク質においてはより少量検出
されたが、マウスにおいては極めて、微量の検出があっ
たにすぎない。このエピトープはＰ−糖タンパク質構造
のより変異性のある領域を示すものである。Ｐ−糖タン
パク質の多重遺伝子族の異なるメンバーは種々の細胞系
において発現されるという別の説明も可能である。

この可能性というものは、共通の親細胞系から選択され
た多剤耐性細胞における交差耐性パターンにみられる変
化について可能な機能としてすでに報告されている。

独特の薬剤の選択や、親細胞系の特徴などにより特異的
遺伝子の増幅や過剰発現、あるいは遺伝子の特異的な組
み合わせに影響を与えるであろう。

最近、Ｐ−糖タンパク賞特異的ｃＤＮＡプローブ（ｐｃ
ＨＰｌ）によるゲノムＤＮＡのサザンプロット解析によ
りＰ−糖タンパク質は多重遺伝子族であることを支持す
る、強い証拠が提出された。

本発明に記載された抗体はヒトの癌におけるＰ−糖タン
パク賞の役割の評価、及び多剤耐性フェノタイプの分子
生物学的解明のための利用可能な、最初の分子プローブ
である。

治療に対して耐性になる疾患に用いる診断的モノクロー
ナル抗体の臨床上の適用は、本発明の明白な利用である
。

癌におけるＰ−糖タンパク質量の上昇を早期に検出する
ことは通常の化学療法から離れて、多剤耐性フィノタイ
プを出し抜く新規治療の適用を指示することができる。

化学療法に失敗したある卵巣腫瘍患者におけるＰ−糖タ
ンパク質量の上昇を予備的に検出するということは、本
目的にそった、本発明によるモノクローナル抗体の有効
利用を示すものである。

更に、これらの試薬は、実験系及び正常哺乳動物組織中
のＰ−糖タンパク賞の高感度及び特異的検出に有効利用
されるであろう、これは、薬剤耐性細胞におけるＰ−糖
タンパク質の生合成及び機能的役割についての研究を可
能にするであろう。

そのような研究は哺乳動物細胞表面における構造及び機
能に関する洞察を与え、また現在、対応のない、腫瘍性
疾患の化学療法の改良につながる理論的基礎を確立させ
るであろう。

実施例１ リオルダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）及びリング（Ｌｉ’ｎｇ
）　　（リオルダン・ジェイ・アール（Ｒｉｏｒｄａｎ
、　Ｊ、　Ｒ，）及びリング・ブイ（Ｌｉｎｇ、Ｖ、）
　、ジェイ・パイオル・ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、）第２５４巻、第１２７０１頁−第１２７０５頁（１
９７９））の方法によりＣＨ”Ｂ２Ｏ及びＣＨＭ／ＶＬ
Ｂｓ。。細胞系より分離、精製した原形質膜を１２週令
の（Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／ｃＸＣ３Ｈ）Ｆ＋　マウスに注射
により免疫した。

膜タンパクのアッセイは、ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）等の
方法〔ローリ−・オー・エッチ（Ｌｏｗｒｙ、０．Ｈ，
）、ローズプロー・エヌ・ジエイ（Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇ
ｈ、Ｎ、Ｊ、）、ファール・エイ・エル（Ｆａｒｒ、Ａ
、Ｌ、）及びランダル・アール・ジエイ（Ｒａｎｄａｌ
ｌ、Ｒ，Ｊ、）　、ジェイ・パイオル・ケム（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第１９３巻、第２６５頁−第２７
５頁（１９５１））を改良〔ピーターラン・ジー・エル
（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｇ、Ｌ、）、アナル・バイオケム
（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、第８３巻、第３４
６頁−第３５６頁（１９７７））した方法により行なっ
た。膜は５ＤＳ−ＰＡＧＥ用の２％ＳＤＳを含む緩衝液
でタンパク質ｒ　ＳＤＳ比が１：１．４になるようにし
て、可溶化し、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ）のイ
ンコンプリートアジュバントと共に１：１でエマルジョ
ンを作製した。第１回目としてＣＨ”８３０由来の膜を
２００μｇｌｉ！腔内接種し１４日後に同一サンプルを
第２回目として接種した。１４ケ月後にＣＨ”３０及び
ＣＥＭ／ＶＬＢＳ。。の原形質膜を各々１００μｇ含む
混合物としてマウスに更に接種した。本免疫実験系にお
いて同一サンプルの接種を第１回目接種後、１４日目と
２１日目に行なった。更に追加として２１日目には各々
１００μｇの超音波処理をしたＣＨ’Ｂ３０及びＣＥＭ
／ＶＬＢｓｏｏ　（７）原形質膜小胞を含む混合物を静
脈注射した。２６日目に無菌的に肺臓を摘出し、肺細胞
をＳＰ２１０−Ａｇ１４融合パートナ−と３：１の割合
で融合した〔シュルマン・エム（Ｓｈｕｌｍａｎ、Ｍ、
）　、ウィルデ・シー・ディー（Ｗｉｌｄｓ、　Ｃ，Ｄ
、）及びコーラ−・ジー（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、）、ネイ
チ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ　）　、第２７６巻、第２６
９頁−第２７０頁（１９７Ｂ））。細胞は１００μＭヒ
ポキサンチン、０．５μＭアミノプテリン、３０μＭチ
ミジン、２ｍＭ　　Ｌ−グルタミン、５０μＭ２−メル
カプトエタノール及び１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地により９６大のプレートに、−穴あた
り１０’ミエローマ細胞数となるように分注して培養し
た。

各ウェルにおいて細胞の飽和密度が約Ａに達した時（１
０日−１４日培養において、ｌウェルあたり５０−８０
％の飽和密度となるのが一般的である）、特異的抗体産
生ハイプリドーマ検出のスクリーニングを行なう。

試験用フィルターは番号のついた５　ｗａ　Ｘ　２５　
ｍニトロセルロースに１μβの５ＤＳ−可１１　化原形
質膜（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に調製）を１■／ｌｌｌ１の
濃度でスポットして作製した（第１図、パネルＡ参照）
。

ドツトプロットしたニトロセルロースフィルターを乾燥
し３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／食塩水中３７℃
で一時間ブロックし、ＢＳＡ／食塩水で１；１０に希釈
したハイブリドーマ培養上清液を含む試験管に入れた。

４℃で一晩保持した後このフィルターをＰＢＳを数回取
りかえながら洗浄し、″５■−標識１ｇＧヤギ抗マウス
免疫グロブリン（カッペル（ｃａｐｐｅｌ）　　；　３
％ＢＳＡ／食塩水中１０’　ｃｐｓ　／　ａｅＪ）と共
に、２５℃で６時、間展開した。洗浄乾燥後、試験フィ
ルターを、堅いプラスチック板上に固定し、増感紙を使
用して、コダック（Ｋｏｄａｋ　）　Ｘ　−Ａ　Ｒ５フ
イルム上で、−７０℃で一晩感光した。特色として一度
に約１０００枚分の反応フィルター紙が処理できる。

有望なウィルについては更に拡大培養を行ない、２回の
限界希釈法によりクローン化した。

上述スクリーニング法を陽性り、ローンを産出するため
に繰り返し行なった。

Ｐ−ンバク　のｃＤＮＡクローン ｐｃＨＰ１は薬剤感受性チャイニーズハムスター卵巣細
胞系より調製されたオカヤマーバルグ（Ｏｋａｙａｍａ
　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ）法によるｐｃＤベクターライブラ
リーからｃＤＮＡクローン（ｐ　Ｌ　２８）を取り出す
ためのプローブとして使用される（ライブラリー作製及
びスクリーニング法に関してはエリオツド・イー・エム
（Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｅ、Ｍ、）等、ジー・モル・セル・
パイオル（Ｇ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、第
５巻、第２３６頁（１９８５）中に記載されている。）
。ＤＮＡ塩基配列決定のために、挿入されているクロー
ンをＢａｍＨｌで切断して、Ｍｌ：３ｗｐ９においてク
ローン化した。それぞれのＤＮＡ鎖を合成ヌクレオチド
ブライマーとザンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等〔ブロク・ナ
トル・アカド・サイ・ニー・ニス・エイ　（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、八、）、第７４
巻、第５４６３頁（１９７７））のグイデオキシ法によ
りその塩基配列を決定した。塩基配列の完全決定がなさ
れ、その中にｐｃＨＰ１配列をも含んでいるｃＤＮＡク
ローン（ｐＬ２８）を第６図に図示しておく。

完全な塩基配列を第７図に示したが、配列中四角く囲ん
である領域はｐｃＨＰｌの配列に相当するものである。

ｐＬ２８クローンは１３２３ｂｐのオープンリーディン
グフレーム、その中には２つの終止コドンがあり、３６
６ｂｐの非翻訳領域及びポリ（Ａ）付加の領域よりでき
ている。オーブンリーディングフレームにおける塩基配
列はその他のｃ　ＤＮＡクローンの配列と類似している
が、非翻訳領域にみられる相異により、薬剤感受性細胞
においてＰ−糖タンパク質遺伝子ファミリーの異なった
メンバーが発現されている事を示唆する。

ｐｃＨＰ１プローブは約４．７　ｋ　ｂのｍＲＮＡを検
出するのでｐＬ２８によりコードされている４４１個の
アミノ酸はＰ−糖タンパク質分子の約１／３に該当する
。しかしながら重複しているクローンによる塩基配列の
結果はＰ−糖タンパク質遺伝子が２つの繰り返し配列を
もっている事を示している。

アイゼンバーブ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）等の方法〔ジェ
イ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、第１
７９巻、第１２５頁（１９８４年）〕による、ｐＬ２８
及びその他のｃＤＮＡクローンについてのアミノ酸配列
の解析はｐｃＨＰｌと相同性をもつ５′−末端領域にお
いて６個の膜移行性能力をもつ断片があることを示して
いる（この領域は第６図におけるｐＬ２８のオープンホ
ックとして表わされている。）。

Ｐ−糖タンパク質のＣ−末端側２３９個のアミン酸（第
６図において、縞線で囲んである）は螢光色素標識され
たモノクローナル抗体と結合のため・原形質膜の細胞質
側に局在している。

Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ　ＤＮＡシークエンスデーターベース
（ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデ
ーション（Ｎａ糖ｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎ−ｄａ糖ｏｎ（ＮＢＲＦ）プ
ロティン・アイデンティフィケーション・リソース（Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎ糖ｆｉｃａ糖ｏｎＲｅｓｏｕｒ
ｃｅ）のＦＡＳＴＮプログラム使用）の検索により、大
腸菌の溶血素輸送に必要な遺伝子、 ｈｌｙＢ遺伝子、とｐＬ２８との間には広範囲にわたる
ＤＮＡ配列の相同性が確認された。

アルファー溶血素産生及び輸送に関するシストロンは４
つある；溶血素分子（１０７ｋｂ）をコードしているｈ
ｌ）＋Ａ、溶血素のプロセッシング中に含まれてくる小
さな（２０ｋ　ｂ）細胞質タンパクをコードしているｈ
ｔｙＣ，溶血素を菌体外へ放出するのに必要な膜タンパ
クをコードしているｈｌｙＢ及びｈｌｙＤ（以前はｈｌ
ｙＢａ　、　　ｈｌｙＢｂと記されていた）である。菌
体クロモシーム中にまたはプラスミド中に存在している
これらの遺伝子に対する完全な塩基配列も決定されてい
る〔フェルムリー・ティ（Ｆｅｌ＋５ｌｅｅ、Ｔ、）等
、ジエイ・バクチリアル（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、）
　％第１６３巻、第９４頁（１９８５）１゜ 溶血現象は腸外大腸菌感染によってもたびたび起こり、
毒性因子であると考えられている。

赤血球の溶血によって遊離されてくる鉄分子は非溶血性
細菌との間における溶血性細菌の選択的培養に対する利
点を与える。溶血素は選択的に免疫系細胞に対して傷害
効果をもたらすであろう。

ｈｔｙｓ遺伝子及びｐＬ２８遺伝子より得られた推定上
のアミノ酸配列を検討すると、Ｐ−糖タンパク質とｈｌ
ｙＢタンパク質とのＣ−末端領域において広範囲な相同
性が確認された（第８Ａ図）。

説得力にはかけるが、アミノ酸配列のＮ−末端側にはほ
とんど相同性が見られなかった。しかしながら、ｈｌｙ
Ｂタンパク質におけるその領域と対応するような膜移行
セグメントをＮ−末端領域中にｐＬ２８は含んでいる（
第６図）。それ故、疎水アミノ酸置換の可能性が十分に
あるので、ＤＯＴＭＡＴＲＩＸプロットにおいて、はと
んど相同性がみられない、この領域が機能的な相同性を
もつものと思われる。

Ｐ−糖タンパク質のＣ−末端側２３９個のアミノ酸と、
ｂｔｙｓタンパク質のＣ−末端側２３６個のアミノ酸が
うまくマツチする様に配列させるのには３ケ所のアミノ
酸部位に対して、ギャップを入れればいいだけであった
（第９図）。

この配列による２３３個の可能なアミノ酸マツチングに
より、１０８個（４６，４％）のアミノ酸が同一であり
、６３個（２７，０％）のアミノ酸が置換体を保存して
いた（第９図）。

この様な広範囲にわたる相同性というものは、両者タン
パク質における共通の機能ばかりでなく共通のヒストリ
ーをも持っている事を示唆している。

１　　　びｒ　、の　゛に　　る　゛ もし、Ｐ−糖タンパク質が、溶血素輸送に関するｈｌｙ
Ｂタンパク質と同様の機能をその多剤耐性において持つ
のならば、共通な状態になる様にそれぞれ進行するであ
ろうと、期待される。両進行過程は、エネルギー産生の
阻害剤及び局所的麻酔剤の作用などにより影響をうける
ものである。エネルギー産生阻害剤（例えば、シアン化
カリウム、２．４−ジニトロフェノール、アジ化ナトリ
ウム）をグルコースの様なエネルギー源の含まれていな
い多剤耐性あるいは薬剤感受性哺乳動物細胞の培養培地
中に添加すると、薬剤の細胞内における総蓄積量が増大
する。この効果は多剤耐性細胞においてより顕著に見ら
れ、もしグルコースを加えるならば、細胞内における薬
剤蓄積レベルは薬剤感受性細胞よりもずっと迅速に減少
していく。つまり、薬剤に対する、エネルギー依存、外
部輸送ポンプが多剤耐性となる機能を担っているという
仮定が導びかれる。またプロカインの様な局所麻酔剤は
多剤耐性細胞における耐性能力のレベルを減少させる。

大腸菌からアルファー溶血素を輸送するには大腸菌の内
膜、外膜の両方を通過させうるある種の分子の存在が必
要である。溶血素の内膜通過（細胞質から細胞質表層へ
の通過）は、シアン化カリウム、２．４−ジニトロフェ
ノール、及びアジ化ナトリウムにより阻害され、更にプ
ロカインによっても阻害される。それとは対照的に、外
膜通過（細胞質表層から細胞表面への通過）はこれらの
物質では、なんら阻害を受けるものではない。つまり、
溶血素輸送に対する阻害剤の効果、薬剤の総蓄積に対す
る効果、多剤耐性における効果などにおける類似性はｈ
ｌｙＢタンパク質が内膜に局在している事を支持するも
のである。またこの局在性というものは、ｈｌｙＢタン
パク質におけるＮ−末端領域のシグナル配列を欠損した
もの、あるいは大腸菌ミニ細胞におけるｈｔｙ　Ｂシス
トロンの発現実験などにより、支持されている。

Ｐ−［タンパク質及びｈｌｙＢタンパク質のアミノ酸配
列における広範囲にわたる相同性や、多剤耐性哺乳動物
細胞中における薬剤蓄積量の減少や大腸菌における溶血
素の内膜通過に際しての類似性などを考え合わせると、
それら両分子の機能というものが推察されてくる。

上記記載のすべての効果は、エネルギー依存の原形質膜
通過が見られる薬剤の輸送によるＰ−糖タンパク質の多
剤耐性の調節、及びエネルギー依存の大腸菌内膜通過に
おけるｈｌｙＢタンパク質の溶血素輸送などと一致して
いる。これらの提案された役割機能を更に裏付けるため
にその他のクラスに属する゛エネルギー依存、細菌性輸
送タンパク質のＣ−末端領域との相同性についても調べ
てみた。

ンパク　　ム　　　　　の　゛　システムとの丑這並 ＮＢＲＦ７”ロチインシーフェンスデーターベース（Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ）
（ＮＢＲＦプロテインアデエンティフィケーションリソ
ース（ＰｒｏｔｅｉｎＩｄｅｎ糖ｆｉｃａ糖ｏｎ　Ｒｅ
５ｏｕｒｃｅ）のＦＡＳＴＰプログラム使用）の検索に
より、Ｐ−糖タンパク質のＣ−末端側２４０個のアミノ
酸と広範囲におよぶ相同性をもっている２つの細菌性輸
送タンパク質を確認した、一つはネズミチフス菌におけ
るヒスチジン透過酵素システムのｈｉｓＰタンパク質で
あり、もう一つは大腸菌のマルトース及びマルトデキス
トリン輸送システムのｗａｌｋタンパク質である。これ
ら２つのタンパク質はそれぞれが同様に大腸菌における
リン酸特異的輸送システムのｐｓｔＢタンパク質と、あ
るいはネズミチフス菌におけるオリゴペプチド透過酵素
のｏｐｐ　Ｄと相同性をもっていた（　ｐｓｔＢ、　　
ｏｐｐＤ及びｈｌｙＢのタンパク質に関するデータはＮ
ＢＲＦプロテエインシークエンスデーターベースには含
まれていなかった。）。

これらのタンパク質は、強い親和性を持ち、基質結合依
存、輸送システム活性化膜結合コンポーネントである。

Ｐ−糖タンパク賞のＣ−末端側４４１個のアミノ酸に対
するｈｉｓ　Ｐ　／ｗａｌｋ／ｐｓｔＢ　１０ｐｐＤタ
ンパク質を含むＤＯＴＭ＾ＴＲＩＸ　　（データー記載
なし）により高度相同性をもつ２つの共通領域を検出し
た（第９図にＡ−Ａ及びＢ−Ｂで示した）、この領域は
ヌクレオチド結合体（おもにＡＴＰ）として巻きこまれ
ると考えられている配列を含み輸送を直接的に活性化す
る。これらの領域のアミノ酸配列を、比較するために５
つの他のタンパク質におけるヌクレオチド結合領域と、
−緒に第１０図に示した。

箱型に囲われているアミノ酸は６種類のタンパク質にお
いて１）Ｐ−糖タンパク質のアミノ酸と一致すると確認
された部分、あるいはｉｉ　）疎水性アミノ酸置換体と
なって高度に保存されている部分を示している。

コンセンサス配列におけるアミノ酸とは、１）Ｐ−糖タ
ンパク質と５つの細菌性タンパク質結合輸送タンパク賞
のうちから少なくとも４種類のタンパク質について、そ
のアミノ酸が同一であるもの、あるいは１ｉ）Ｐ−糖タ
ンパク質に対して細菌性輸送タンパク質のうち３種類以
上の物についてそのアミノ酸が違っていたとしても、６
種類すべてのアミノ酸に関して疎水性アミノ酸置換体と
して保存されているもの（“ｈ″で表わす）を示してい
る。

更に第１０図には、比較するために以下のタンパク質の
ヌクレオチド結合領域を示した；アデニレート・キナー
ゼ（ウサギ）　、Ｈ−ｒａｓ　−１ｐ　２１腫瘍形成タ
ンパク賞（ヒト）、ビオチン・カルボキシル・キャリア
ータンパク質（プロピオニンバクテリウム・シエルマニ
ー）及び、大腸菌Ｆｔ−ＡＴＰａｓｅのアルファー及び
ベーター鎖。

それらのタンパク質は、それぞれが細菌性輸送タンパク
質中に存在するヌクレオチド結合領域をもっているだけ
ではなく、機能的な広がりをも、持っていることから、
ヌクレオチド結合タンパクとして選ばれた。

これらタンパク質のアミノ酸配列は、ナショナル・バイ
オメディカル・リサーチ・ファンデーシラン・プロティ
ン・シーフェンス・データーベースより得たものである
。尚、Ｐ−１１タンパク質と同一であるアミノ酸、ある
いは疎水性アミノ酸置換体として保存されているアミノ
酸だけが表示されている。

その他のアミノ酸についての表示はないが、最大の相同
性が確認される為にそれぞれの配列中にギャップ（Ｐ２
１タンパク質のＮ−末端部に見られる）を入れ、ダッシ
ュ（−）により表示した。

領域Ａ−ＡはｈｈＧ−−Ｇ−ＧＫなる配列として記述さ
れる。グリシンを多く含む領域は柔軟なループ構造を取
りやすく、しかも基質と結合した時あるいは他のタンパ
ク質ドメインによる相互作用を受けた時などはコンホー
メーション変化を起こしやすい。’ｐ−１１タンパク質
と５つの細菌性輸送タンパク質はさらに多くのアミノ酸
をその配列中において共有している；　ｈｈＧ　−５Ｇ
（Ｃ／Ｓ）　−ＧＫＳＴ。

またその他のヌクレオチド結合タンパク質においては、
保存性がかなり弱いもののｈＮＬ−ｈ−−Ｇなる保存配
列が確認された事を、付は加えておく。

領域Ｂ−Ｈにおいて、その他のヌクレオチド結合タンパ
ク質に対する相同性は減少しているが、Ｐ−糖タンパク
質と５つの細菌性輸送タンパク質との相同性は増大して
いる（第１Ｏ図）。

この領域における共通した特徴は、平行β−波型構造を
持つ疎水性セグメントでありその後に・１個あるいは２
個の酸性アミノ酸をもっている（Ｐ−糖タンパク質及び
５つの細菌性輸送タンパク質においてｈｈｈｈＤＥとな
っている）。

この構造は、加水分解の作用を減少するために結合ヌク
レオチドより水を排除するであろう。

また、この疎水性セグメント部と異なった所では、Ｐ−
糖タンパク質とその他のヌクレオチド結合タンパク質と
の間における同一性はほとんど見られなかった。しかし
ながら、Ｐ−１タンパク質と５つの細菌性輸送タンパク
質との間に、３２個以上のアミノ酸に対する相同性が確
認された。つまり、これらタンパク質のこの領域が、ヌ
クレオチドに対する結合も含めた、何か重要な機能的役
割を果たしていると示唆できる。

４つのタンパク質結合依存性輸送タンパク質において、
最もよく保存されているアミノ酸であるのでエネルギー
産生体と結合して、直接的に輸送するであろう。

Ｐ−糖タンパク質、ｈｌｙＢタンパク質、ｈｉｓＰ／Ｉ
ＩＩａｌｋ／ｐｓｔＢ　１０ｐｐＤタンパク質及びその
他のヌクレオチド結合タンパク質との間に見られる相同
性の範囲を測定して、クラスター分析を行ない、それら
の物質量の相互関連性を図に示した（第１１図）。

ＲＥＬＡＴＥプログラム（ナショナル・バイオメディカ
ル・リサーチ・ファンデーション・プロティン・アイデ
エンティフィケーシッン・リソース（Ｎａ糖ｏｎａｌ　
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｕｎｄａ
糖ｏｎＰｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎ糖ｆｉｃａ糖ｏｎ　Ｒ
ｅ５ｏｕｒｃｅ　）　）を用いて第１０図に示されてい
るヌクレオチド結合領域の１１個のタンパク質問に見ら
れる類似性を測定した。

た。

それらのタンパク質のペアーに対して、つまり一つのタ
ンパク質における可能な２５個のアミノ酸セグメントと
その他のタンパク質における可能な２５個のアミノ酸セ
グメント間の相同性を示すスコアーを置換するアミノ酸
に対する変異出現性確率データーマトリックスとして決
定した。

このスコアーの分布による絶対値が、２つのタンパク質
問における真の配列として、またそれらタンパク質問の
ランダムな配列検索を５００回操日の結果として決定さ
れた。

真の配列に対する数値とランダム操作による平均値との
間にある数値差を、ランダム操作における標準偏差値で
割り算をし、標準偏差値単位をもつセグメント比較スコ
アーとして作製した。

偶然的にその様なスコアーを得る確率は標準化された累
積正規分布表により評価する（スコアー＞ｌ０３Ｄ以上
を得る確率は＜　ｌ　Ｑ−１２以下であるが、スコアー
＞６３Ｄを得る確率は＜１０−”である）。

クラスターは、セグメント比較スコアーのもっとも高い
スコアーをもつ合流タンパク質として形成される。クラ
スター形成後、分岐合流（■ｅｒｇｉｎｇ）用のスコア
ーはクラスター構成物質のスコアーの加重平均である。

高度相同性はＰ−糖タンパク質と、ｈｌｙＢタンパク質
との間にみられた。更にＰ−Ｆタンパク質とｈａｙＢタ
ンパク質がクラスターを形成した後、そのクラスターは
、ｏｐｐ　Ｄタンパク質よりも、ｈｉｓ　Ｐ　／　ｗａ
ｌｋ／　ｐｓｔＢクラスタータンパク賞とにおいて大き
な類似性をもっていた。

この構造的類偵性は、Ｐ−糖タンパク賞とｈｌｙＢタン
パク質がタンパク賞結合依存細菌性輸送タンパク質と同
様方法で、エネルギー産生体と結合（ｃｏａｐｌｉｎｇ
　）することにより輸送するという機能を果たす事を示
唆している。このＰ−１ｇタンパク質とｈｌｙＢタンパ
ク質間の著しい相同性は、ｈｌｙＢタンパク質による溶
血素の輸送というものが、多剤耐性におけるＰ−糖タン
パク質の介在的機能の解析実験系の最も優好なモデルと
なりうる事もあわせて示唆している。

このＰ−９９タンパク質及びｈｌｙＢタンパク質のＣ−
末端領域において、これ程までの相同性があるとは思っ
てもいなかったが、この発見は癌に対する化学療法にお
ける薬剤耐性という問題解明の直接的な意味あいを我々
に与えた。

本明細書中に報告されている相同性は、チャイニーズ・
ハムスター由来のＰ−糖タンパク質によるものであるが
、モノクローナル抗体及びＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン法による実験より、この自然界に保存されているＰ−
［タンパク質が・その相同性における範囲をその他の哺
乳動物（ヒトも含めて）のＰ−糖タンパク質分子にまで
拡大しうる事は確実である。

もしＰ−糖タンパク質が多剤耐性に介在していると証明
されるならば、ｐ−１タンパク質の機能阻害により耐性
を回避出来るであろう。

Ｐ−１ｉタンパク質と細菌性タンパク質結合依存性輸送
タンパク質における相同性は、Ｐ−糖タンパク質がヌク
レオチド結合領域を持っている事を示している（第１０
図）。多剤耐性を克服するための一つの方法は、Ｐ−糖
タンパク質のヌクレオチド結合を阻害する類似体の使用
である。溶血素の輸送を阻害する能力をもっているとい
う事を基にして、その様な類似体のスクリーニングの為
にＰ−糖タンパク質とｈｌｙＢタンパク質間の相同性が
活用されるであろう、また同様に、溶血性あるいは非溶
血性細菌を殺傷する種々の活性をもつ抗癌因子の存在や
能力をスクリーニングする上でも活用されるであろう。

その様な方法により、溶血性細菌が、ある種の抗癌剤に
対して耐性になるであろう事も想定される。この点に関
して、大腸菌のナリジキシン酸耐性株が溶血性をもつよ
うになってくるという報告（ウオルトン・ジエイ・アー
ル（Ｗｏｌｔｏｎ、Ｊ、Ｒ，）等、ジェイ・バタテリオ
ル（Ｊ。

３ａｃｔｅｒｉｏ１．）　、第９８巻、第３０４頁（１
９６９）　）は、興味深い事である。

現在の臨床的試験において、カルシウム拮抗剤、あるい
はカルシウムチャンネル阻害剤使用による腫瘍細胞の薬
剤耐性能の減少も一つの方法である。

これらの化合物は、カルシウムの分子レベルで作用する
のではなく、その化合物のもつ両親媒性により、原形質
膜に影響を及ぼすものと示唆される。

よって、プロ力インが溶血素の細菌内膜通過輸送を阻害
するのと同様の方法により、それら化合物はＰ−糖タン
パク質のもつ機能を阻害するのであろう。これは、多剤
耐性細胞の耐性能の減少における局所麻酔剤の役割に対
する説明にもなる。

薬剤感受性細胞におけるＰ−糖タンパク質の機能は知ら
れていないが、Ｐ−糖タンパク質は脂肪親和性毒性化合
物の低レベルにおける細胞防御としての役割をもち、多
剤耐性においてはその様な化合物の増大したレベルに対
処する為にただ単にこの機能を拡大したにすぎない。

Ｐ−糖タンパク質は多剤耐性とは関係なく、その輸送機
能をもつのか、あるいはこの機能の著しい激化（例えば
、遺伝子の増大）があった時のみ、その耐性が出現する
のであろう。もし後者の場合が本当だとしたら、薬剤感
受性細胞におけるＰ−糖タンパク質による輸送に対する
もっとも考えられる物質は、溶血素輸送と同様に、大き
なタンパク物質である。溶血素様タンパク質の可能性を
もつ一つのグループは好酸球、細胞傷害性Ｔリンパ球、
およびＮＫ一様細胞の様な細胞傷害性細胞は遊離されて
くるポアー形成分子である。

これらの分子は、Ｐ−糖タンパク質を保存し続けている
自然界の物質中において、検出され、またよく保存もさ
れている。真核細胞中においてはっきりとは知られてい
ないタンパク賞移動メカニズムの可能的な存在について
は、おそらく、Ｐ−糖タンパク質とｈｔｙ　Ｂタンパク
質問における相同性を最重要視することである。

種々の哺乳動物において高度に保存されているＰ−糖タ
ンパク質は、哺乳動物細胞中で主要な役割を果たしてい
ることを示唆している。Ｐ−［タンパク質は多重遺伝子
族によりコードされているので幾つかの同様システムが
ありそれぞれ異なったタンパク質を移行させるであろう
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に従って作製したハイブリドーマのス
クリーニングに使用したドツトイムノプロットの実施例
を示す写真である。 第２図は、パネルＡにおいて薬剤感受性及び耐性細胞よ
り得た原形質膜に対して作製した８個のクローン化ハイ
ブリドーマによる抗体のドツトイムノプロットを、パネ
ルＢにおいて薬剤耐性及び感受性細胞より得た原形質膜
に対するモノクローナル抗体の染色をそれぞれ示す写真
である。 第３図は、情調した、放射性ヨード標識抗体に対する８
個のモノクローナル抗体による直接拮抗結合アッセイの
結果をグラフとして示す図である。 第４図は、パネルＡにおいて、モノクローナル。 抗体を用いた薬剤感受性及び耐性細胞より得た原形質膜
のウェスタンプロットを、パネルＢにおいて、モノクロ
ーナル抗体を用いた薬剤耐性細胞の間接免疫螢光染色を
示す写真であり、及びパネルＣにおいて、異なった薬剤
耐性細胞系に対する間接免疫螢光染色のフローサイトメ
トリーをそれぞれ示す図である。 第５図は、種々のモノクローナル抗体に対するＰ−糖タ
ンパク質のペプチド断片を含むｐｃｌｌｐＨａｃＺ融合
産物のプローブ性を示す写真である。 第６図は、Ｐ−糖タンパク質のｐＬ２Ｂ及びｐｃＨＰｌ
　ｃＤＮＡクローンの間の関係を示す図である。ｐＬ２
８中四角で囲こんである領域は１３２３ｂｐのオープン
リーディングフレームに相当する。その領域中縞線のな
い部分は膜移行領域と推定されており、縞線領域は溶血
素Ｂ（ｈｌｙＢ）タンパク質のＣ−末端部分と相同性を
示す領域である。 第７図は、１３２３ｂｐのオープンリーディングフレー
ムを含むｐＬ２Ｂクローンの塩基配列と、それに対応す
るアミノ酸配列、及びｐｃＨＰ１クローンの領域を箱型
に囲こんで示した図である。 第８図は、Ｐ−糖タンパク質のＣ−末端側４４１個のア
ミノ酸と、溶血素Ｂ　（ｈｌｙＢ）タンパク質の７０７
個のアミノ酸との比較を示す図である。 プロットは、アミノ酸置換体に対する変異出現性確率デ
ーター・マトックスのスコーテとして、ナショナル・バ
イオメディカル・リサーチ・ファンデーシラン・プロテ
ィン・アイデンティフィケーション・リソース（Ｎａ糖
ｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦ
ｏｕｎｄａ糖ｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎ糖ｆｉｃ
ａ糖ｏｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ）のＤＯＴＭＡＴＲＩＸプ
ログラムにより作製。ウィンドーサイズは３０個のアミ
ノ酸であり、高精度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）プロント
（Ａ）における、一点作製のための最小スコアーは４０
であり、低精度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）プロット（Ｂ
）においては１５である。微細部分は１０アミノ酸に相
当する。 第９図は、Ｐ−ｌタンパク質のＣ−末端部分２３９個の
アミノ酸配列（上段の配列）と、溶血素Ｂ（ｈｌｙＢ）
タンパク質のＣ−末端部分２３６個のアミノ酸配列（下
段）をそれぞれ示す図である。 アミノ酸置換体として保存されている領域（アミノ酸置
換体に対する変異出現性確率データー・マトリックスに
おいて０以上のスコアーによって限定されている）を箱
型に囲み、両配列中同−アミノ酸部位には、星印しく☆
☆☆）を付けた。比較しやすい配列にするために、３つ
のアミノ酸部位にギャップを入れ（ｐＬ２Ｂの配列中、
２１５番目、及びｈｔｙＢ配列中、５６６番目、及び５
７７番目）、ダッシュ（−−−）により表示した。下線
部領域（Ａ−Ａ及びＢ−Ｂ）は高度に保存された、ヌク
レオチド結合部位を含むものであり、第１０図において
、他のヌクレオチド結合タンパク質と一緒にその配列を
示す。 第１０図は、Ｐ−糖タンパク質、溶血素Ｂ　（ｈｌｙＢ
）タンパク質、及びｈｉｓ　Ｐ　／ｗａｌｋ／ｐｓｔＢ
　１０ｐｐＤタンパク質におけるヌクレオチド結合配列
を示す図である。２種の配列群（上段と下段）は第９図
における下線部領域（それぞれ、Ａ−Ａ、及びＢ−Ｂ）
に相当する。アミノ酸はそれぞれ一文字標記である。 第１１図は、幾つかのヌクレオチド結合タンパク質にお
けるタンパク質配列における相同性のクラスター（ｃｌ
ｕｓｔｅｒ）解析を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体産生ハイブリドーマは、少なくとも一つの興味
   ある多剤耐性哺乳動物細胞系由来の細胞あるいは組織分
   画物より得た、変性原形質膜により免疫された適当な哺
   乳動物より得た、永遠に抗体を産生しつづける細胞から
   誘導されたもので、ハイブリドーマは多剤耐性細胞の原
   形質膜に結合するが、生の正常細胞には結合しない抗体
   を産生するためにスクリーニングされ、Ｃ−末端領域は
   約２３９個のアミノ酸を持つ、Ｐ−糖タンパク質のＣ−
   末端領域付随の明確なエピトープと結合する抗体よりな
   る、哺乳動物種における、多剤耐性に関連するＰ−糖タ
   ンパク質細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体。 ２、適切な動物を免疫するに際してＳＤＳ変性原形質膜
   を使用した特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル
   抗体。 ３、抗体は、固形基質に固定されたＰ−糖タンパク質抗
   原に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマをス
   クリーニングすることによって選別された、特許請求の
   範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ４、抗体は、ヒトＰ−糖タンパク質のＣ−末端領域の明
   確なエピトープと結合する特許請求の範囲第１項記載の
   モノクローナル抗体。 ５、少なくともＰ−糖タンパク質細胞表面抗原部である
   ポリペプチドをコードしている配列で、少なくとも１６
   ８９個のヌクレオチドからなる分離された核酸。 ６、核酸がＤＮＡである特許請求の範囲第５項記載の核
   酸。 ７、核酸がＲＮＡである特許請求の範囲第５項記載の核
   酸。 ８、ｐＬ２８の塩基配列を持つ特許請求の範囲第６項記
   載の核酸。 ９、特許請求の範囲第８項記載の核酸と約７０％以上の
   ホモロジーをもつ、実質上純粋なＤＮＡ配列、あるいは
   、それのハイブリダイズする部分。 １０、特許請求の範囲第８項記載の核酸と約８０％以上
   のホモロジーをもつ、実質上純粋なＤＮＡ配列、あるい
   は、ハイブリダイズ部分。 １１、特許請求の範囲第５項記載の核酸を含むクローニ
   ングビークル。 １２、特許請求の範囲第１１項記載のクローニングビー
   クルを含む微生物。 １３、特許請求の範囲第５項記載の塩基配列によりコー
   ドされている分離されたポリペプチド。 １４、特許請求の範囲第８項記載の塩基配列によりコー
   ドされている分離されたポリペプチド。 １５、少なくともＰ−糖タンパク質のＣ−末端領域の末
   端部で、約２３９個のアミノ酸よりなる分離されたポリ
   ペプチド。 １６、ｐＬ２８のＣ−末端領域の末端部からなる、２３
   ９個のアミノ酸の推定配列を持つ、特許請求の範囲第１
   ５項記載のポリペプチド。 １７、特許請求の範囲第１６項記載のポリペプチドと約
   ５０％以上のホモロジーをもつ、分離されたポリペプチ
   ド。 １８、分離されたｃＤＮＡクローンｐＣＨＰ１。 １９、特許請求の範囲第１８項記載のクローンによりコ
   ードされている分離されたポリペプチド。