JPS61111694A - 哺乳類細胞系の複合薬剤耐性及び決定因子糖蛋白質ｄｎａの単離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 灸脹Ω斑！ 本発明は、通常はそれらに有毒である薬剤に対する耐性
を発現させる生体真核生物細胞に関し、ざらに具体的に
は、生体細胞の薬剤耐゛ｉの決定因子及び上記蛋白質決
定因子を指令する核酸配列に関する。

λ更度亘量 唾乳頚細胞か、癌細胞が化学療法に使用される薬剤に対
して耐゛ｉｌ：を発現するという癌研究の分野で発見さ
れたような、薬剤に対する耐性を発現するということが
知られでいる。この耐性は、癌細胞の増殖を遅らせ又は
停止させるために化学療法に使用される薬剤の効能を停
止する。最近報告されたサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
　、２２１巻、１２８５〜１２８８ページ、（１９８３
年９月）に、複合の薬剤耐性を示すハムスター、マウス
及び人の腫瘍細胞系についての言及がなされている。細
胞膜に見られるような複合薬剤耐′ｉに関連して１７０
，０００ドルトンの表面抗原の増加した発現があるとい
うことが発見された。抗原は単離され、Ｐ−糖蛋白質ぞ
あると理解されている。

複合薬剤耐’ａ（ＭＯＲ）は、ある種の抗癌剤に対する
耐性について特に選択される婦乳類細胞の突然変異体に
よって示される表現型であるが、また異なる化学構造及
び作用標的を有する他の広スペクトル抗癌剤に対しても
耐性を示す。この表現型を有する細胞は耐゛ｉの明確な
機構として薬剤の細胞内レベルを減少したままにする。

この変更された薬剤輸送機能に関連して、これらの細胞
の原形質膜はＰ−糖蛋白質と特定して言われるポリペプ
チドを高含有量で含む。

異なる程度の薬剤耐性を有する種々の突然変異細胞系を
選択することが可能になった。これらの異なる細胞系の
原形質膜中のＰ−糖蛋白質の量は薬剤耐性の程度に定量
的に関連している。

Ｐ−糖蛋白質の過剰の発現は、複合薬剤耐性の表現型の
、一致したかつ特有の特徴であるということが明白であ
る。

このＰ−糖蛋白質か複合薬剤耐性表現型に直接的又は間
接的に介在することを実証するために広範な研究がなさ
れた。リング・ブイ（Ｌｉｎｑ　、Ｖ、）、カートナー
・エフ（Ｋａｒｔｎｅｒ、　Ｎ、）　、スト−・ティー
（Ｓｕｄｏ　、　Ｔ、）　、シミノビッチ・エル（Ｓｉ
ｍｉｎｏｖｉｔｃｈ、　Ｌ、）及びリオルダン・ジエー
・アール（Ｒｉｏｒｄａｎ、　Ｊ、Ｒ，）のカンサー・
トリートメント・レポート（Ｃａｎｃｅｒ　丁ｒｅａｔ
、　Ｒｅｐ、）、６７巻、８６９〜８７４ページ（１９
８３年）において開示されたように、広範な遺伝学的研
究が中国産ハムスターの卵巣細胞系に行なわれた。これ
らの研究において、次のことが立証されている。

（ａ）突然変異を誘発することなく単一工程で単離され
た独立した薬剤耐性クローンは複合薬剤耐性表現型及び
Ｐ−糖蛋白質の過剰な発現を示す：（ｂ）増大した薬剤
耐性、例えば、コルヒチンに対する選択は他の薬剤に対
する交差耐性及びＰ−糖蛋白質の発現の増大をきたした
： （ｃ）複合薬剤耐性表現型に含まれる一化合物に対する
薬剤感受性を試験するために単一工程で単離された復帰
変異体は減少したＰ−糖蛋白質の発現を含む他の性格の
表現型への復帰を示す：（ｄ）交差耐性、副行の感受性
及びＰ−糖蛋白質の過剰な発現は細胞中に一致して現れ
る（細胞雑種）。

Ｐ−糖蛋白質の単離及び複合薬剤耐性を引き起こすその
決定因子に関する未知の面はこの大きざの蛋白質か単−
遺伝子又は遺伝子族によって暗号を特定されるか、遺伝
子又は遺伝子族の選択的発現における独立した事柄の結
果なのかということである。

発１Σ４Ｌ 本発明の態様に従えば、本質的に純粋なＤＮＡ分子は約
１７０，０００　ドルトンの分子量を有するＰ−糖蛋白
質のポリペプチド単位（ｍｏｉｅｔｙ）を指令する。

本発明の他の態様に従えば、ＤＮＡ分子の本質的に純粋
なヌクレオチド配列はＰ−糖蛋白質の対応するポリペプ
チド配列を指令する。このヌクレオチド配列はｃＯＮＡ
、　ｍＲＮＡ又はポリペプチド配列の対応する部分を指
令するＤＮＡの断片（ｆｒａ９ｍｅｎｔ）から構成する
ことができる。ヌクレオチド配列はバクテリオファージ
又はプラスミドとの組換え体で組入れることかできる。

ファージ又はプラスミドはクローン化することができ、
かつ適当な宿主中に転換された場合、その宿主はＰ−糖
蛋白質の対応するポリペプチド配列を形成するために培
養することができる。

本発明の他の態様に従えば、バクテリオファージ及び／
又はプラスミドの形態のヌクレオチド配列はそのファー
ジ又はプラスミドに与えられた適当な標識をもってＤＮ
Ａプローブとして使用することができる。

本発明の他の態様に従えば、ｃＯＮＡ％プラスミド中に
単離する方法は公知のファージ発現ベクター及びＰ−糖
蛋白質を過剰に発現する高薬剤耐性の細胞系から得られ
るｍＲＮＡ５　％使用してｃＤＮＡライブラリー（ｌｉ
ｂｒａｒｙ）を構成することから成る。モノクローン抗
体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）　
＠使用するような適当な技術によって、Ｐ−糖蛋白質に
特定である抗体に対する融合蛋白質抗原を発現するファ
ージベクターが同定される。組換えプラスミドは同定さ
れたファージから形成される。このプラスミドは適合さ
れた生体細胞中で発現されで、対応するポリペプチド配
列を形成する。抗体は、そのポリペプチド配列がＰ−糖
蛋白質の部分であることを確認するために使用される。

ましい−熊、　詳細な１日 Ｐ−糖蛋白質の精製のための出発物質として作用する原
形質膜小胞の単離及び確認のために多くの方法か開発さ
れてきた。この蛋白質は１４０キロドルトンの分子量の
ポリペプチド単位を有する本来の糖蛋白質として及び１
７０キロドルトンの分子量及び約７．１の等電点を有す
る対応するＰ−糖蛋白質として精製、確認された。この
蛋白質に対するポリクローン及びモノクローン抗体が産
生された。

別個の種から得られた糖蛋白質に特定な発生モノクロー
ン抗体及び別個の種から得られた糖蛋白質と強力に交差
反応する発生モノクローン抗体はその膜の一部として糖
蛋白質を含む生体細胞を選別するために使用される。相
補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーは糖蛋白質を過剰に
発現する高薬剤耐性の細胞系から得た伝令ＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）で構成することができる。このライブラリーは発
現ベクターλｇｔｌｌを使用することによって構成する
ことができる。

Ｐ−糖蛋白質に特定のモノクローン抗体に対する抗原β
−ガラクトシダーセ融合蛋白質を発現するファージプラ
クがＰ−糖蛋白質のポリペプチド配列に暗号を特定する
ｃＤＮＡを発見するために同定、精選及び分析される。

別個の複合薬剤耐性系から得た膜蛋白質は上記したサイ
エンス２２１巻中に開示されているようにＰ−糖蛋白質
に特定なポリクローン抗体で免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｂ
ｌｏｔ）された、Ｐ−糖蛋白質発現の程度は細胞系の相
対的薬剤耐性に相関があるということがわかった。従ｐ
で、Ｐ−糖蛋白質の過剰な発現は生体細胞の複合薬剤耐
性表現型に関連した最も適した分子標識であると思われ
る。化学療法に応答しない進行した卵巣腫瘍を有する患
者の腫瘍細胞から直接得た生検試料中にＰ−糖蛋白質の
過剰な発現があるということがわかった。

モノクローン抗体を使用することによっで単離されるポ
リペプチド断片を指令する核酸配列を単離するために、
相補ＤＮＡライブラリーが構成される。Ｐ−糖蛋白質に
対する培養されたモノクローン抗体の一種（Ｃ２＋９）
がβ−ガラクトシダーセーＰ−糖蛋白質融合生成物を合
成するクローン用のこのうイブラリ−を選別するために
使用された。数種類のファージが同定され、プラクが精
製された。

今は入ＣＨＰ−１の形態である発生予定の糖蛋白質ｃＤ
ＮＡクローンの一つが単離され、プラスミドｐＵＣ−９
中でサブクローン化されてプラスミドｐＣＨＰ−１を得
た。このクローン化されたプラスミドは、薬剤耐性及び
薬剤感受性細胞から得た核酸配列の分子交雑分析のプロ
ーブとして使用することかできる約６００塩基対の挿入
配列を有している。

約６００塩基対のプラスミドｐ（ＨＰ−１の挿入配列は
、単離された薬剤耐性細胞中に過剰に発現されるＰ−糖
蛋白質の少なくとも一部の蛋白質のカルボキシル末端か
ら暗号を特定する。細胞が薬剤耐性を発現しているかど
うかを調べるためのプローブとしてこの核酸配列を使用
する場合に、核酸配列は検出できる標識で標識すること
ができる。標識は放射性、けい光性又はバイオチニレー
ション化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）された標識の形
態でよい。

一本発明に従えば、プラスミドｐＣＨＰ−Ｉｔクローン
化するために、プラスミドを、プラスミドの多数の複製
を作るために宿主微生物に転換することができる。微生
物はクローニングベヒクルの宿主細胞として作用する大
腸菌株でよい、細胞の薬剤耐性の決定因子としてのＰ−
糖蛋白質の一部であるポリペプチドが、クローニングベ
ヒクルが転換される宿主微生物又は他の有機体を培養す
ることによって主成できる。

本発明の実施態様に従えば、クローニングベヒクルの宿
主細胞は大腸菌に−１２の株ＪＭ８３　［メシング、ジ
エ−（ＭｅＳＳｉｎ９、Ｊ、）、リコンどナンドＤＮＡ
テクニカル　プレタン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮ
ＡＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）　ＮＩＨ発
行番号７７〜９９．２巻、２号（１９７９年）４３．〜
４８ベージ］である。新規のプラスミドを有する宿主細
胞は１９８４年９月７日に寄託されたＡＴＣＣ登録番号
第３９８３９号から得ることができる。この宿主細胞は
組換えプラスミドｐＣＨＰ−１！含む。このプラスミド
は、プラスミドクローニングベクターｐ（ＪＣ９Ｃバイ
ーラ、ジエー（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、）及びメシング、
ジｘ−（Ｍｅｓｓｉｎ９、Ｊ、）ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１９巻、（１９８２）　　２５９〜２６８ぺ一ジコの新
規のＥｃｏＲＩクローニング部位中にＰ−糖蛋白質の暗
号特定配列の一部に対応するｃＤＮＡ配列を挿入するこ
とによって構成された。

ｃＤＮＡクローンｐＣＨＰ−１は約２００のアミノ酸残
基から成るＰ−糖蛋白質のＣ−末端切片を指令する。こ
のクローンのＤＮＡ挿入配列は約６５０塩基対の長さで
あると見積られる。この配列の少なくとも一部にβ−ガ
ラクトシダーゼを加えることによっで暗号を特定された
ポリペプチドから成る融合生成物は約１４０，０００　
ドルトンの大きざを有している。１１６゜６００　ドル
トンのβ−ガラクトシダーゼ分子量を引くと挿入配列に
よって指令されたペプチドの分子量として２３，４００
ドルトンを得る。これは約１９０アミノ酸残基又は５７
０塩基対を表す。したがって、挿入配列の約８０塩基対
を除く全てがペプチドに暗号を特定するために必要とさ
れる。これらの８０１冨基対は３′未翻訳配列の部分を
表すはずである。

ｐＣＨＰりは同類のラムグライブラリ−を再選別するた
めに使用され、５個の追加のｃＤＮＡクローンが得られ
た。これらは１．２　；　１．６５　、２．０及び２．
５キロ塩基対の大きざを有していた。完全Ｐ−糖蛋白質
のポリペプチドの約半分を指令する最も長いものがｐＣ
ＨＰ−２と称され、１９８５年７月３日にＡＴＣＣに寄
託され、登録番号−−−一−を与えられた。

しかしながら、非電に努力を要する方法で、Ｐ−糖蛋白
質のポリペプチド部分の核酸配列が、アドリアマイシン
、アドリアマイシン０、コルヒチン、ダウノルとトン、
エメチン、ポドフィロトキシン、ビューロマイシン、タ
キソール、ビンブラスチン又はビンクリスチンのような
薬剤に対する耐性を示す補乳類細胞系を選択することに
よって単離されることが確認されている。これらの全て
の薬剤は複合薬剤耐性の多面作用の表現型を常に示す、
これらの複合の表現型は構造的及び作用的に反応しない
化合物に対する交差耐性も含む。この細胞の原形質膜が
この細胞による薬剤耐性のこの複合表現型に関係するが
、複雑な実際の機構は充分に理解されているわけではな
い。本発明の実施態様に従えば、Ｐ−糖蛋白質遺伝子の
核酸配列を単離するための広範な方法としては複合薬剤
耐性突然変異細胞の選択：それらの遺伝学的確認（ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）　：薬剤輸送の研究：
抗体が形成されるＰ−糖蛋白質の単離を含む原形質膜の
確認がある。次いで、この抗体は高複合薬剤耐性突然変
異体から単離されたｍＲＮＡから形成されたバクテリオ
ファージｃＤＮＡ発現ベクターライブラリーを選別する
ために使用され、次０で同定された正の組換えバクテリ
オファージクローンがＰ−糖蛋白質の特定ＤＮＡ配列を
プラスミドベクターにサブクローン化するために使用で
きる。この方法で、全Ｐ−糖蛋白質遺伝子が単離、確認
できる。

単離され、かつプラスミドｐＣＨＰ−１中でクローン化
された切片はＰ−糖蛋白質のポリペプチド切片を指令す
る際に作用を及ぼさない指令領域を含むことが確認され
ている。核酸挿入配列の作用を及ぼす部分は組換えプラ
スミドｐＣＨＰ−１中にある約６５０塩基対のうち約６
００塩基対を有する。確認され、第１図に示されている
ように、Ｐ−糖蛋白質の蛋白質単位は約１４０，０００
ドルトンであり、約４キＯ塩基対の暗号特定領ｔｈ′１
２を有する伝令ＲＮＡ　！必要とする場合もある。Ｐ−
糖蛋白質の過剰な発現のある細胞において、単一の主ｍ
ＲＮＡ成分は約５キロ塩基対のものである。量の差は約
５キロ塩基対にＰ−糖蛋白質ｍＲＮＡの大きざを増大さ
せるであろう５′及び３−未翻訳領域による。

薬剤に対する細胞の耐゛ｉのためのボ１ノペブチド決定
因子は１７０，０００ドルトンの範囲内の分子量を有す
るＰ−糖蛋白質として同定される。細胞表面のＰ−糖蛋
白質の濃度は種々の条件下でのＣＨＯ細胞系中の複合薬
剤耐性表現型に定量的に関連する。高耐性細胞系は細胞
膜中にＰ−糖蛋白質の発現を増大した。この膜の゛成分
は動物及び人の細胞中で単離された他の複合薬剤耐゛ｉ
系に過剰に発現されるように思われる。少なくとも一部
のＰ−糖蛋白質分子は大いに保護される：ＫＪぢ、別個
の種のＰ−糖蛋白質の中で一定である。培養されたモノ
クローン抗体は別個の動物及び人の細胞から得たＰ−糖
蛋白質と強力に交差反応する。

Ｐ−糖蛋白質配列を含むんｇｔ１１クローンを同定する
ために使用されたモノクローン抗体（Ｃ：２１９．）は
、リオーダン、ジェーΦアール（Ｒｉｏｒｄａｎ、　Ｊ
、　Ｒ，）及びリング、ヴイ（Ｌｉｎｇ、Ｖ、）の「減
少したコルヒチン透過性を有する中国産ハムスターの卵
巣細胞突然変異体の原形質膜から得たＰ−糖蛋白質の精
製」、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、２５４巻、（１９７９
年）１２７０１〜１２７０５ページに記載されたように
、免疫原として高度にコルヒチン耐性のＣＨＯ細胞系Ｃ
Ｂ５０）から生成した、単離された原形質膜小胞を使用
して培養されカッウスはこれらの小胞で免疫を得た。何
回かのブースター注射の後、マウスの牌臓から取った細
胞が骨髄腫細胞と融合されて雑種細胞の系を形成した。

これらは１合薬剤耐性細胞であるが薬剤感受性細胞では
ないＰ−糖蛋白質小胞に対する抗体を製造するために選
別された。

増大した薬剤耐性の細胞系はＰ−糖蛋白質の発現を増大
した。第２Ｂ図は増大する薬剤耐性を有する一連の同類
のＣＨＲクローン ＡｕｘＢｌ　４Ｃ：ＨＲＡ３　→ＣＨＲＢ３　→ＣＨＲ
Ｃ５−−→ＣＨＲＢ３０並びにＣＨＲＣ５から選択され
た復帰変異体クローン１１０から生成されたｍＲＮＡの
スロットブロー／　ト（Ｓｌｏ、ｔ　ｂｌｏｔ）を示す
、　ｐｃＨｐ−を配列がＰ−糖蛋白質の一部を暗号化し
た場合、これらの細胞系のＰＣＩ（Ｐ−１プローブによ
って示されたｍＮＲＡの量は予期したレベルに一致する
。

第２Ｂ図の薬剤感受性及び一連の同類の複合薬剤耐性Ｃ
ＨＣＨＯ細胞系から得たゲノムＤＮＡのサザンプロット
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析が第３Ａ図に示さ
れている。　ｐＣ）ＩＰ−１に相同の配列が薬剤感受性
又は復帰変異体細胞に比べて耐性細胞系中に！ｊａｆｇ
されている。さらに、増幅の量は増大した薬剤耐性に関
連する。これはこれらの系におけるＰ−糖蛋白質の過剰
な発現が遺伝子増幅の結果生じたことを示す。

薬剤感受性細胞系のゲノム中のｐｃＨｐ−ｔに相同の１
〜１５キロ塩基対の大きさの範囲である１０個のＥｃｏ
Ｒ１断片があるのが解る。他の制限酵素が使用された場
合（データは第３ＡＩＮに示されていない）、複数のバ
ンドがあるのがわかる。仮にｐｃＨＰ−１プロープが二
以上のエクソンにわたる場合、複数のバンドが得られる
かもしれないが、ｐＣＨＰ−１は内部ＥｃｏＲ１部位を
有せず、かつ挿入配列の大きさが約６００〜７００塩基
対でしかないので、第３Ａ図及び第３Ｂ図で見られる複
数のバンドはほぼ同じ分子量の対応する全てのＰ−糖蛋
白質に指令する遺伝子族が存在する結果だろうと思われ
る。Ｐ−糖蛋白質遺伝子族は一つの増幅可能な単位（ア
ンプリコン）内に群生しているように見える。これは、
単一の別個の工程、例えば第２Ｂ図のＣＨＲＡ３でコル
ヒチンに対する耐性を選択したクローン系において、　
　１０個の制限断片の増幅が同時に生じたことを観察す
ることによって立証される。さらに、薬剤感受性系の同
等の断片と比較した場合、各断片は約１０〜２０倍にほ
ぼ均一に増幅されている。他の系において、アンプリコ
ンは約１００−１，０００キロ塩基対の大きさであると
判断され、従って、Ｐ−糖蛋白質遺伝子族はそのような
領域内で縦列に構成されていると考えられる。Ｐ−糖蛋
白質遺伝子の増幅において同類の協調因子の増大は第二
工程のクローン（ＣＨＲＢ３）第三工程のクローン（Ｃ
ＨＲＣ５）又は多工程系（ＣＨＲＢ３０）に見られない
、制限パターンがより複雑になり、別の制限断片の増幅
の程度がより大きな範囲に変化しているように見える。

例えばＯＨ”Ｂ２Ｏにおいて、制限断片４．６及び８は
１０〜２０倍に増幅されたが、断片７．１０．１１及び
１２は第３Ａ図に示したように５０倍以上に増幅された
。これらの倍率は別々の実験で適当に露光されたフィル
ムの定量デンシトメトリーによって判断された。母ＤＮ
Ａ中に示されないより耐性の細胞系に増幅した断片が見
られるということは興味のあることであった。

これらの例は第３Ａ図の断片２及び５である。これらは
、スターク、エフ・アール（Ｓｔａｒｋ、　Ｆ、Ｒ，）
及びワール、ジー・エム（Ｗａｈ　１　、　Ｇ、Ｍ、）
の７ニユアル・レビュー令バイオケミストリー（Ａｎｎ
、　Ｒｅマ。

Ｂｉａｃｈｅｍ、）、５３巻、４４？　〜４９１ページ
（１８８４）に記載されたように縦に増幅された配列中
に見られる「新規の結合」を示し得る。

上記の所見は、Ｃ）１０細胞ゲノムが結合される１０個
ものＰ−糖蛋白質遺伝子の族を含み、この遺伝子族がコ
ルヒチン耐性、複合薬剤耐性の細胞系中で増幅されるこ
とを示す、ｐｃｏｐ−ｔを使用する複合薬剤耐性のマウ
ス及び人細胞のサザンプロット分析は、これらの種のＰ
−糖蛋白質配列が遺伝子族によって暗号化され、かつこ
の族のあるものが第３Ｂ図に示したように耐性細胞系中
で増幅されるということを立証した。この族の別個のＰ
−糖蛋白質遺伝子配列を含む８個のＥｃｏＲ１断片はマ
ウスのゲノム中で見られる。これらの断片のうち５個は
耐性細胞系中で明らかに増幅されているが、８．６及び
４．３キロ塩基対標識のすぐ下並びに２．３キロ塩基対
標識のすぐ上にある３個の断片は明らかに増幅されてい
ない。同様に、人のゲノムにおいて、８個の断片が見ら
れるが、８個の断片のうちわずか４個だけが耐性細胞系
中で明らかに増幅されている。　ＥｃｏＲ１断片のある
ものがマウス及び人の耐性細胞系中では明らかに増幅さ
れていないということから、ＣＨＤ細胞中に見られるも
のとは反対に、これらの系中のＰ−糖蛋白質遺伝子は単
一のアンプリコン中に含まれないで、分散された可能性
があるということを示唆している。耐性マウス細胞中に
おいて、感受性細胞中には存在しない約３キロ塩基対の
新規の断片が第３Ｂ図に示したように観察される。これ
は上記した縦に増幅された配列中の「新規の結合」領域
に一致する。そのような断片は耐性の大細胞中には見ら
れない、　ｐｃＨＰ−１が厳格な条件下で発生予定の人
のＰ−糖蛋白質配列に強く交雑することができるという
事実が、Ｐ−糖蛋白質が蛋白質及びＤＮＡレベルの両方
で保持されるということのより確かな立証となる。

多くの系中に見られる遺伝子増幅の抜型的特徴は染色体
の均一に緊張している部位（ＨＳＲｓ）又は分裂中期細
胞中に見られる二重微小染色体（ＤＭｓ）である、その
ような特徴は複合薬剤耐性細胞系で知られている。　Ｄ
ＮＡ仲介感染細胞において、ＤＭｇの数はコルヒチン及
び複合薬剤耐性並びにＰ−糖蛋白質の発現の程度に関連
する。　ＣＨＯ細胞系において、長いＨＳＲが第４図に
示したようにＣＨＲＢ３０細胞中に観察される。これは
薬剤感受性の母細胞系には見られない、この部位は長さ
が変化し、しばしばそれが存在しているＺ４染色体とほ
とんど同じ大きさになる。　ＣＨＲ８３０細胞中の増幅
されたＰ−糖蛋白質配列がこのＨＳＲ内に含まれていた
かを調べるために、３Ｈ標識されたｐＧＨＰ−１プロー
ブを使用して正常部位雑種を行なった。試験された２５
体の細胞のうち２０体が、第４Ｂ図及び第４Ｃ図に示し
たように染色体Ｚ４のＨＳＲに局在化された１以上のオ
ートラジオグラフィー粒子を得た。染色体の全粒子を調
べると、全粒子の４５％（ｌ（０／１３３）がＨＳＲに
局在化されている０反対に、薬剤感受性母細胞系Ａｕｘ
Ｂ１を使用して試験された２５体の細胞にはほとんど粒
子の局在化が見られなかった。そのデータは第４図には
示していない。

Ｐ−糖蛋白質のポリペプチドに暗号を特定する遺伝子族
の１個以上の遺伝子の確認がｃＤＮＡの単離された部分
を使用して上記で論じた方法に従って成し遂げられる。

Ｐ−糖蛋白質のポリペプチド単位を指令するためのＤＮ
Ａ配列は約５キロ塩基対舛のものである。このＤＮＡ又
はそのいかなる切片も細胞の複合薬剤体制を調べるため
に種々の方法で使用できる。さらに、遺伝子族の１個以
上の遺伝子又はその族のいかなる遺伝子の切片も生体細
胞内の複合薬剤耐性の存在を調べるためのプローブとし
て使用できる。遺伝子又はその切片は上記したように適
切なベヒクル中に組入れられ、かつ適切な宿主中に転換
され、Ｐ−糖蛋白質又はその一部を生成することができ
る。

本発明に至る方法論の好ましい実施態様を次ぎの実施例
に従って実証する。これは特許請求の範囲をどのように
も限定するものではない。

実」１例」２ 全細胞ＲＮＡをキールウィン（Ｃｈｉｒｇ賛ｉｎ）等の
バイオケミストリー、工８巻、５２９４〜５２９９ペー
ジ（１９７９）に従って高コルヒチン耐性ＣＨＯ細胞か
ら単離した。ポリ　Ａ”　ＲＮＡをアビブ、エイチ（Ａ
ｖ　ｉマＨ，）及びレター、ピー（Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、
）のプロシーディンゲス・ナショナル番アカデミーＯサ
イエンスｅ　ニー　ｓ　ｚス＊　ｘ−（Ｐｒａｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）　、　８９巻、１４０８〜１４１２ペー
ジ（１９７２）に従ってオリゴｄ？−セルロース［タイ
プ３、コラポラティブ番すサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）製］にクロマトグラフ
ィーすることによってこれから選択した。この工程の選
択物をプライマーとしてオリゴ−ｄＴを使用するｃＤＮ
Ａの合成のための鋳型として使用した。ｉ　ｇｇのＡ”
　ＲＮＡを５分間７０℃に加熱し、氷の上で冷却し、次
いで５０！ＩＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、４０
　ｍＨのＫＣｌ　、　８　ｍＭのＭｇＣｌ２０．４　ｄ
のＤＴＴ　、　０．５１Ｌｇのオリゴ−ｄＴ（１２〜１
８　　；：１ラポラテイブ・リサーチ社製）、２ＩＩＩ
Ｍの各デオキシメクレオチド、１μのα（Ｐ］ｄＧＴＰ
［アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、８００　Ｃ１／
ａモル］及び５単位のＡＭＶ逆転写酵素［セフｙクリー
ル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ−２００によるクロマト
グラ２イーによって精製したもの】中、４２℃で１時間
培養した。第二鎖合成を、１００　ｍＷのＨＥＰＥＳ（
ｐ！４６．８）　、　２０（ｌ　ｍＷの　ＫＣＩ、０．
２　ｍＷの各デオ午ジヌクレオチド及び２７７−ｇの均
質ＤＮＡポリメラーゼ１の存在下に１４℃で５時間行な
った。１ｍ１Ｌトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、ｌＯ
舊ＸのＥＤＴＡ中のセファデックス（Ｓｅｐｈａｄａｘ
）　Ｇ−１００によるクロマトグラフィーに引き続き、
チェレンコフ放射によって検出された二重鎖ｃＤＮＡ含
有分画をプール、凍結乾燥した。このヘアピン状のルー
プを３０分間３４℃で１０００単位のＳ１ヌクレアーゼ
［ポアリンガーーマンハイム社製（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］で加水分解した。フェノール
／りｌ：ｒロホルムによる抽出に引き続き、セファデッ
クスＧ−１ｏｏによるグロマトグラフィ一工程を繰返し
た。　４０　ｍにのトリス−ＨＣＩ（ｐ）［７，５）、
１　ｍＨのＥＤＴＡ　、　５ｍＭ　ＤＴＴ　、　　１０
ルにＳ−アデノシルメチオニン中にプール、凍結乾燥し
た分画を溶解した後、ＥｃｏＲｆ部位でのメチル化を行
った。　ＥｃｏＲｌ　メチラーゼ（０，ｌｕ−ｇ）での
培養は３７℃で１５分間であった。二重鎖末端を、Ｍｇ
Ｃ：　ｌ　２を１０　ｄまで及び全デオキシヌクレオチ
ドを２０トｘまで添加することによって形成した。０．
２５ｐｇの均質ＤＮＡポリメラーゼｌを添加した後、培
養を室温で１０分間行った。セファデックスＧ−１００
による脱塩工程を繰返し、リンク付加する前にピーク分
画をプール、凍結乾燥した。ＥｃｏＲ１リンカ−（１２
量体、コラポラティブ・リサーチ社製）をリン酸化した
後、その３　ＪＪ−ｇを１０　＋＊Ｍのトリス−ＭＣＩ
　（ｐＨ７，５）、１０　ｒｍＭのＭｇｃ１２．１０ｍ
ＭのＡＴＰ及び６単位の４ポリヌクレオチドキナーゼ（
ポアリンガーーマンハイム社製）中で１時間３７℃で培
養に使用した。リン酸化したリンカ−の反応性をトレイ
ルリゲーション（ｔｒａｉｌ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）で試
験できるようにγ−［３２ＰＩＡＴＰを含有させた。そ
の生成物を１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
によって観測した０次いで、二重鎖末端化されたｃＤＮ
Ａを０．３μｇの均質Ｔ４リガーゼによって１２℃で一
晩すゲーションするために５μのリン酸化されたリンカ
−（０，５ｈ　ｇ）中に再懸濁したａ　ＥＣ０ＲＩの加
水分解を１単位の均質ＥｃｏＲ１を含む２５ｗＭのトリ
ス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、
５　ｒａＨのＭｇＣＩ　２中で３７℃において１時間行
った。そのｃＤＮＡをセファクリールＳ−１００カラム
（１ｍＭ　ト！ｊ　ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０
ｐＭのＥＤＴＡ中２ｍｍ　！　１５ｃｍ）上に分画した
。　ｃＤＮＡピークの先端を構成する分画をプール、凍
結乾燥した。

この物質（約３０　ｎｇ）を、その調節充填力（ｃｏｎ
ｔｒｏｌｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃ７）
がｔ　ｇｇ当たり１０’から１０５フアージに減少され
るまでＥｃｏＲｌで加水分解され、次いで子牛の腸のア
ルカル性ホスファターゼ（ポアリンガーーマンハイム社
製）で処理された１μｇのλｇｔｌｌ　ＤＮＡで７ニー
ルした０次いでリゲーションが０．Ｉ　ＩＬｇの均質Ｔ
しノガーゼによって１０℃で一晩続行された。試験管内
充填を、マニアティス、テ４−　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　
、　Ｔ、）　、　７リツチ、イー、　ｊ−７（Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、）及びサムブルーフ、ジｘ　−（Ｓ
ａｍｂｒｏｏ　ｋ　、　Ｊ、）　（７）報告書ＩＩ、モ
Ｌ／キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）　、　コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−、ニューヨーク、（１１１１Ｂ２）に従
って、そこに記載されたように調製した抽出物を使用し
て行った。細菌株Ｙ１０９０の平板培養は１．３に１Ｇ
’組換え体を示した。その６５％はβ−ガラクトシダー
ゼの不活化によって確定されるｃＤＮＡ挿入配列を含ん
でいた。

選別するために、ｅｏｏ、ｏｏｏ部分の増幅されたライ
ブラリーを１５ｃ層のベトリ皿当たり１００，０００の
密度で株Ｙ１０８９に沈着させ、３〜４時間４２℃で成
長させた。予め１０厘にのＩＰＴＧ　（インプロピルチ
オガラクトピラノシド）に浸漬、乾燥させたニトロセル
ロースフィルター［ＢＡ８５　、シュライシャー−アン
ド・シュニル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃ
ｈｕｅｌｌ）製］を上記ペトリ皿に重ね、培養を３７℃
で２時間続け、誘導β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を
合成させた。フィルターを取り出し、ＰＢＳで１０分間
づつ三回洗浄し、３７℃で１時間乾燥させた。乾燥させ
たフィルターを３７℃に４〜６時間３ＺＢＳＡ中に保持
した。フィルターを放射性ヨウ素化（約１０ｕＣｉ／Ｉ
Ｌｇ）モノクローン抗体０２１９を含有する同じ組成の
新鮮な溶液に移し、２３℃で１０時間培養した。各１０
分間の洗浄を次ぎのように連続して行った；　ＰＢＳで
二回、０．１＄ｌ７）ＮＰ　４０を含ムＰＢＳテ二回及
びｐａｓテ三回、乾燥後、フィルターをオートラジオグ
ラフィーした。最初のスクリーンに検知された正の像は
正のファージの均質な集団を得るためにプラク精製の数
工程中維持された。

支ム遣」 Ｐ−糖蛋白質ｃＤＮＡ配列を入ｇｔｌ＋のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子に挿入した結果として合成された融合蛋
白質の大きさを可視化及び測定するために。

組換え体ファージを株Ｙ１０８８で溶菌的に成長させた
。これらの細′胞を入ｇｔｌ１組換え体ファージで感染
させ、３２℃で低密度（ペトリ皿当たり約１００）に培
養した。温度感受性を試験するために、単一コロニーか
ら得た細胞を二枚のベトリ皿に置き、一方を４２℃、他
方を３２℃で培養した０次いで４２℃ではなく３２℃で
成長させたクローンを１００　ｍにのＬＢを接種するた
めに使用した。０Ｄ６ｏｏＩＩＯ９５まで３２℃で成長
させた後、温度を４３℃に急激に上昇させ、培養を２０
分間続行した。　ＩＰＴＧを１０ｍＭまで添加し。

３７℃で１時間培養を続け、誘導融合蛋白質を蓄積させ
た。細胞を２５℃で遠心分離することによって回収し、
最初の容積の１１５０のＰＢＳに再懸濁させ、液体窒素
で凍結した。氷解後、試料を短時間榛超音波処理し、６
．５ｚポリアクリルアミドゲルで電気泳動処理し、次い
でそのゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色又は
モノクローン抗体を使用して免疫染色した。

第１図を参照して、パネルＡは入ｇｔ１１（レーンａ）
又は八〇ＨＰ　　（Ｌ／−ンｂ）で感染させたＹ１０８
９細菌の溶菌液から得た７５４ｇの蛋白質を含有するア
リコートである。一番左にある分子量標識は上記した通
りであった。矢印は入ＣＨＰ−１の１ａｃＺ融合物（上
の矢印）及び連続したβ−ガラクトシダーゼ（下の矢印
）を示す、パネルＢはパネルＡに示したレーンのウェス
タンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ）である、
モノクローン抗体を単離し、ｐ−＠蛋白質分子上の三種
類のエピトープを識別する能力に基づいて三つのグルー
プに分類した。プロットの三つの同一な組をグループＩ
（左のレーン、Ｃ２１８プローブ）、グループＩＩ（中
のレーン、Ｃ３２プローブ）及びグループＩＩＩ（右の
レーン、Ｃ４８４プローブ）の代表的なモノクローン抗
体で調べた。レーンａは対照溶菌液（八ｇｔ１１）であ
り、レーンｂは１ａｃＺ融合物含有溶菌液である。矢印
は１ａｃＺ融合物の予想される位置を示す、抗体で１ａ
ｃＺ融合物を染色することによって三つの別個のエピト
ープを同定する。

プラスミド（ｐＣＨＰ−１）又はその約６００塩基対の
挿入配列は、例えば、通常ノーザン及びサザンブロッ゛
ト試験と言われているＤＮＡ検索技術に従って薬剤耐性
及び薬剤感受性細胞から得たＲＮＡ及びＤＮＡの分子交
雑分析用のＤＮＡプローブとして使用できる。

文」ｕｌ】 ｍＲＮＡ相同体のλＣＩＰ−１ファージに対する比較を
薬剤感受性Ａｕｇ８１　ｍ胞及び高薬剤耐性Ｂ３０細胞
を使用して試みた。結果を第２Ａ図に示す。

ＲＮＡを、チオシアン酸グアニジニウム中で分断し、そ
の後ＣｓＣｌ勾配遠心分離に付すことによって細胞の単
層培養液から単離した。アガロース（１＄）ゲル電気泳
動、ニトロセルロース［ＢＡ８５　、シュライシャー・
アンド・シュニル社（Ｓｃｈｌａｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳ
ｃｈｕｅｌｌ）製］への移動及び交雑をトーマス、ピー
、ニス、（Ｔｈｏ厘ａｓ、　Ｐ、Ｓ、）のメソッド・エ
ンチモル（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ）、［編集者つ
、アール（Ｗｕ、Ｒ，）、グロスマン、エル（Ｇｒｏｓ
ｓｍａｎ　、Ｌ、）モルドフ、ジー（Ｍｏｌｄｏｖｅ、
　Ｋ、）アカデミツクプレス、ニューヨーク、１００巻
、２５５〜２６６ページ（１９８３）に従って行なった
。１５％ｇの全ＲＮＡ試料をＩＭの脱イオン化したグリ
オキザール、５０％口ＭＳＯ１ｆｌｌ　ｍＷのリン酸ナ
トリウム（ｐＨ８４）中に溶解し、１時間５０℃で変性
した。冷却後、試料緩衝液（５ｏｚグリセロール、１０
ｍＭのリン酸ナトリウム及びブロモフェノールブルー）
を加え、それから電気泳動を緩衝液を循環させながら９
０Ｖで約６時間行った。移動のために、上記ゲルを２０
倍のＳＣＣ中に浸漬したワットマン３ＭＭろ紙上に置い
た。ニトロセルロースを水で濡らし、ゲル上に置き３Ｍ
Ｍろ紙でカバーした。約１０時間吸収させた後、ニトロ
セルロースをランプで乾燥し、真空オーブン中８０℃で
２時間焼成した。

モノクローン抗体Ｃ２１９によってんｇｔｌ＋ライブラ
リーから同定されたＰ−糖蛋白質の部分に対応する挿入
配列を、プラスミドｐＵＣ９のＥｃｏＲ１部位にサブク
ローニングすることによって交雑プローブとして使用す
るために調製した。このようにして得た組換え体プラス
ミドをｐＣ）ＩＰ−１と命名し、直接交雑プローブとし
て、又はプローブとして使用するための挿入配列の供給
源として使用した。

ノーザンプロット試験の予備交雑を５０％ホルムアルデ
ヒド、５倍のＳＣ０、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ８，５）、２５０ルｇ／ｍｌの超音波処理した鮭の精
子ＤＮＡ％０．０２　％の　ＢＳＡ、　０．０２　＄の
Ｆｉｃｏｌｌ及び０．０２％のポリビニルピロリドン中
で１８時間の間４２℃で行った。交雑を行うために１０
％の硫酸デキストランを加えた。４２℃１８時間の交雑
に使用する前に、切れ目移動によって標識されたｐＣＨ
Ｐ−１から得た挿入配列を１００℃で５時間変性した。

洗浄を次（７）通’１行ツタ：２３℃で２倍（７）ＳＣ
Ｇ　、　０．１＄ＳＤＳ中において５分間ずつ四回及び
５０℃で０．１倍の５ＳＣ１０，１ＸＳＤＳ中において
二回、洗浄したシートをオートラジオグラフィーして、
第２Ａ図に示すパターンを得た。２８Ｓ及び１８ｓはリ
ポゾーマルＲＮＡ５（リポ≠核酸）の位置を示す。

このノーザンプロット分析から、単一の主要な伝令ＲＮ
Ａ成分が５キロ塩基対よりほんのわずか小さい分子量を
有して非常に増大した量で８３０細胞に見られることが
第２Ａ図でわかる。　ｐｃＨＰ−１プローブによって検
知された厘ＲＮＡの増大した発現及び分子量はＰ−糖蛋
白質遺伝子に相補の配列を含むｐＣＨＰ−１に完全に一
致する。Ｐ−糖蛋白質の蛋白質単位は約１４０　、００
０　ドルトンであり、これは最小成約３．５〜４．０キ
ロ塩基対の暗号特定領域を有するｍＲＮＡを必要とする
。５゛及び３゛の未翻訳配列が約５．０キロ塩基対であ
る第２Ａ図のバンドのＰ−糖蛋白質ｍＲＮＡまでＰ−糖
蛋白質ｍＲＮＡの大きさを増大するということがわかる
。

支墓遣」 上記したように、増大したコルヒチン耐性の細胞系はＰ
−糖蛋白質の発現を増大した。そのような関係がこれら
の系のＰ−糖蛋白質腫ＲＮＡ５の量にも存在するかどう
かを調べるために、ｐｃｉｐ−１を交雑プローブとして
使用した。第２Ｂ図は増大する薬剤耐性（７）ＡｕｘＢ
ｌ　−”０ＨＲＡ３　＋ＣＨＲ８３−ＣＨＲ０５からＢ
２Ｏまでの一連のＣＨクローン及びＣＨＲＣ５から選択
された復帰変異体クローン１１０から調製された履ＲＮ
Ａ５のスロットプロットを示す、スロットプロット分析
装置（シュライシャー・アンド・シュエル社製の装置と
同様な）をまず２００ルｇ／＋ｓｌの変性した鮭の精子
ＤＮＡを含むＩＭの酢酸アンモニウム中に２時間浸漬し
、それからＩＭの酢酸アンモニウムで洗浄した。　ＲＮ
Ａが吸収されるニトロセルロースを、下敷のワットマン
３ＭＭろ紙と同様にＨ２Ｏ、次いで２０倍のＳＳＣ中に
浸漬した。２００ｅｌの２０倍のＳＳＣを各スロットに
充填し、下敷まで吸収させた。グリオキサール中で変性
後、第２Ａ図におけると同様に調製したＲＮＡ試料（１
５ルｇ）を２０倍のＳＳＣで２００１Ｌｌに希釈し、充
填し、それからさらに２００１Ｌ＋の２０倍ＳＳＧで洗
浄した。この装置を分解し、ニトロセルロースを乾燥、
焼成し、それから第２Ａ図におけると同様にＰＣＨＰ−
１で交雑した。

クローン系ＧＨＲＡ３　、　ＧＨＲＢ３及びＣＨＲＣ５
をコルヒチン耐性のための連続的選択に誘導した。　Ｃ
ＨＲＢ３０を、はじめ５　ＪＪ−ｇ／ｍｌから数段階で
３０　Ｊｊ−ｇ／ｍｌにコルヒチンの濃度を増加してＣ
ＨＲＣ５を成長させることによって得た。復帰変異体１
１０を単一工程のＣＨＲＣ５から選択した。コルヒチン
に対する相対的な耐性を母細胞系に必要な薬剤量と比較
して相対的なコロニー形成力を１０％に減少するために
必要な薬剤の量によって決定した。

これらの系におけるｐＣＨＰ−１プローブによって検知
されたｍＲＮＡの量がＰ−糖蛋白質遺伝子の部分を指令
化するｐｃＨＰ−１配列と完全に一致することがわかる
。総合すれば、上記した全データが、ｃＤＮＡの断片が
Ｐ−糖蛋白質にクローン化されるという根拠を提供する
。

支蔦ｌ」 薬剤感受性及び高複合薬剤耐性ＣＨＯ細胞系から得た遺
伝子ＤＮＡのサザンプロット分析を第３Ａ図に示す、各
細胞から得た１５ＪＬｇのＤＮＡをＥｃｏＲｌで完全に
ダイジェストし、０．６ｚアガロースゲル中で電気泳動
させた。ニトロセルロースへの移動を、ジャーナルφモ
レキュラー〇バイオロジー、８８巻、５０３〜５１７ペ
ージ（１Ｂ７５）にサザン、イー、エム、（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、）　ニよッテ開示さレタト同様に行
った。フィルターを５０％ホルムアミド、５倍のＳＣＣ
、２０＋＋＋Ｈのリン酸ナトリウム（ｐＨ８，５）　、
　２００ｐＬｇ／ｍｌノ超音波処理シタ鮭の精巣ＤＮＡ
　、　Ｏ，ｌＸノＢＳＡ　、　０．１％のＦｉｃｏｌｌ
及び０．１ｚのポリビニルピロリドン中４０℃で９時間
予備交雑した。フィルターの交雑を１０％まで硫酸デキ
ストランを添加して上記と同様な溶液中で行った。プロ
ーブｐＣＨＰ−１を３ｘ１０８ｄｐｍ／ＪＬｇの比活性
にａ　［”Ｐ］　ｄｃＴＰで切れ目移動することによっ
て調製し、５分後に１００℃で１０’　ｃｐｓ／ｍｌま
で交雑混合液に加えた。３５時間４０℃で交雑した後、
フィルターを室温において２倍のＳＣＣ、０，１！（７
）Ｓｎ２中で５分間二回及び５０℃ニオイて２倍ノＳＣ
Ｃ、０，１＄ノＳＯＳ及び０．１＄＋７）　＋）　ン［
す）リウム中で３０分間二回洗浄し、空気乾燥しそれか
ら増感スクリーンを使用して一７０℃において１５時ら
測定した。　ＡｕｘＢｌ　（ｘ１２）は１２倍も長く露
光したＡｕｘＢｌを示す、　ＡｕｘＢｌのバンド１はこ
の実験では表示が不十分である。他の実験において、そ
の強度はＡｕｘＢｌのバンド３に似ている。

上記のことから、薬剤感受性細胞中に１から約１３キロ
塩基対の範囲にあるＥｃｏＲ１断片の１２のバンドがあ
るのがわかる。他の制限酵素を使用する場合、複数のバ
ンドが同様に観察される。　ｐｃＨＰ−１プローブが内
部ＥｃｏＲ１部位を有せず、かつ挿入配列ノ大きさが約
６００ベース対でしかないので、観察された複数バンド
はＣＨＯ細胞中のＰ−糖蛋白質を指令する核酸配列の放
を表わす、これらの配列は薬剤耐性細胞系Ｂ２Ｏ中で増
幅される。これは蛋白質及びｍＲＮＡレベルにおいてこ
の系のＰ−糖蛋白質の過剰な発現が遺伝子の増幅から生
じることを示すものである。バンドが明らかに異なって
増幅されたということはＰ−糖蛋白質が遺伝子の族によ
って指令されていることを示す、　ＡｕｘＢＩ　ＤＮＡ
　Ｃ！１２）によって示されないＢ２Ｏ１１ＮＡ中にさ
らに増幅したバンドが見られるということは興味のある
ことである。

実」Ｕ殊ｊ 他の複合薬剤耐性系から得たＤＮＡのサザンプロット分
析を第３Ｂ図に示す、　ＤＮＡを薬剤感受性（Ｓ）又は
複合薬剤耐性（Ｒ）の細胞系から調製し、サザンプロッ
ト分析を第３Ａ図におけると同様な条件で行った。オー
トラジオグラフィーを、同様に示してある１５時間露光
した耐性マウス細胞系（！０．１）を除いて７日間行っ
た。耐性マウス細胞系をＬ細胞から誘導し、コルヒチン
で選択した。耐性人細胞系を人山血球細胞系ＣＣＲＦ−
ＣＥＭから誘導し、ビンブラスチンに対する高耐性を選
択した。

マウス細胞において、ＣＨＯ細胞中で見られたものとは
異なる一連のバンドが観察される。薬剤感受性系におい
ては、バンドのいくつかは他のものより非常に弱い１人
細胞系において、６個のバンドが見られる。薬剤耐性系
において、薬剤感受性細胞に見られるバンドが増大した
複製数で示され、かつ人及びマウス系の両方で、特異的
な増幅が見られる。大細胞系において、いくつかのバン
ドが感受性細胞系に比べて高耐性細胞系において非常に
高められているが他のものはそうではない。

これらの観測からＰ−糖蛋白質が遺伝子族によって指令
され、かつこの族の部位の増幅がＰ−糖蛋白質の過剰な
発現に関連することを立証する。

支嵐迩１ Ｃ）Ｉ”８３０細胞の２４染色体における均質な染色領
域にＰ−糖蛋白質配列が局在化するという細胞学的根拠
を第４Ａ図、第４８図及び第４Ｃ図に示す０図において
、第４Ａ図は染色体Ｚ４　（矢印）のＨＲ９を立証する
代表的なＧバンド分集されたＣＨＲＢ３Ｇ細胞を示す。

そのような）ＩＳＲは薬剤感受性ＡｕｘＢＩ系では見ら
れない、第４Ｂ図はＺ４−ｆｌｓＲ領域（矢印）にオー
トラジオグラフィー粒子の局在化、引き続いて３Ｈ−標
識されたｐｃＨＰ−１での正常部位雑種の結果を示す、
第４Ｃ図は粒子局在化の例であり、２４−ＨＳＲ（矢印
）は第４Ｂ図におけると同様に５個の別個のＣＨＲ８３
０細胞からなる。

第４図の結果はプロシーディング・ナショナル・アカデ
ミ−・サイエンス・ニー・ニス・ニー、７９巻、７８０
９−７８１３ページ（１９８２）においてトレンド、ジ
ュー。エム、（Ｔｒｅｎｔ　、　Ｊ、Ｍ、）　、　オル
ソン、ニス（Ｏｌｓｏｎ、　Ｓ、）及びローン、アーａ
；、ｘム、（Ｌａｖｎ、　Ｒ，Ｍ、）並びにネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）。

３０５巻、２４５〜２４８ページ（１９８３）において
シュニブ、エム、（Ｓｃｈｗａｂ、　Ｍ、）　、アリタ
ロ、ジェー。

（Ａｌｉｔａｌ　ｏ、Ｊ、）、クレンプナウアー、ジー
ーエイチ、　（Ｋｌｅｍｐｎａｕｅ　ｒ　、　Ｋ−Ｈ，
）　、パルマス、エイチ、イー、（Ｖａｒｍｕｓ、　Ｈ
，Ｅ、）　、　ビショップ、エム。

ジｘ　−、（Ｂｉｓｈｏｐ、　Ｍ、Ｊ、）　、　　ギル
バート、エフ。

（Ｇｉｌｂｅｒ　ｔ　、　Ｆ、）　、プロデユア−、ジ
ー。

（Ｂｒｏｄｅｕ　ｒ　、　Ｇ、）　、ゴールドスティン
、エム６（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　Ｍ、）及びトレンド
、ジュー。エム。

（Ｔｒｅｎｔ、　Ｊ、Ｍ、）によって開示された通りに
実施したＧバンド分集及び正常部位雑種によって得られ
る。母細胞系ＡｕｘＢ１及び高コルヒチン耐性ＣＨＲＢ
３０系の間の最も一貫し、かつ特徴的な染色体の変化は
第４Ａ図に示したように２４染色体の長い腕上のＨＳＲ
の存在である。正常部位雑種工程において、細胞系を０
．８５．ｇｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度で１５．５時間交
雑し、引き続き第４Ｂ図及び第４Ｃ図におけるようなオ
ートラジオグラフィーの現像に先立ち、７日間露光した
。オートラジオグラフィー分析を分集していない染色体
で行ったが、しかしＺ４−Ｈ３Ｈの大きさ及び腕の長さ
の比はＣＨＲＢ３０細胞系中で明確に同定されるように
した。

本発明に従えば、複合薬剤耐性細胞系におけるＰ−糖蛋
白質の過剰な発現は遺伝子増幅が伴う、Ｐ−糖蛋白質の
過剰な発現が進行した卵巣腫瘍細胞系に必ず起こるとい
う最近の観察が、この機構が人の悪性腫瘍にも働くこと
を示唆している。遺伝子の増幅を特徴づけるＨ５Ｒｓは
悪性の疾患に通常見られるので、複合耐性突然変異が比
較的よく生じ、そのような突然変異がうまくいっている
組合せ化学療法を制限するのが事実らしい。

Ｐ−糖蛋白質のポリペプチド部分を指令する核酸配列の
単離を招来するそれらの膜中にＰ−糖蛋白質を有する細
胞を選択することが種々の用途を提供する。　ｃＤＮＡ
との交雑によって同定されたｍＲＮＡは約５．０キロ塩
基対の大きさのものであり、その量が細胞中の蛋白質の
量及び複合薬剤耐性の程度に直接関係する。　ｃＤＮＡ
は人及び動物の細胞系中のＰ−糖蛋白質配列を確認する
ＤＮＡとして使用でき、かつ複合薬剤耐性におけるこれ
らの遺伝子の増幅を測定できる。Ｐ−糖蛋白質遺伝子は
多数の遺伝子族を構成し、その部位は特異的に増幅する
ことができる。

耐性が耐性細胞系からのゲノムＤＮＡで感染されること
によって転移される場合、Ｐ−糖蛋白質としてのいくつ
かの遺伝子配列が薬剤感受性細胞系に転移できる。

相補ΩＨＡはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方の機能性
遺伝子配列を同定し、かつ単離するために使用できる。

ａ脆性は、クローン化された配列で感染させた後、薬剤
耐性を定量することによって観測できる。最初の薬剤耐
性機能の展開に加えて、これらの感染実験は原形質膜の
浸透性の調節及び大小の分子の輸送の研究に使用するこ
とができる。　ｃＤＮＡプローブは癌患者の複合薬剤耐
性の進行の診断に使用することができる。この検知能力
は化学療法の方式を改善するための基礎を提供する。さ
らに、このシステムは増幅されたＰ−糖蛋白質遺伝子を
有する腫瘍細胞の検知に使用でき、これらの腫瘍細胞に
直接化学治療剤を適用することが可能となる。

本発明の好ましい実施態様を詳細に説明してきたが、種
々の変更が、本発明の精神又は特許請求の範囲から逸脱
することなく、これらになされるということが当業者に
は理解できるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は三種類のモノクローン抗体を使用するＰ−糖蛋
白質の部分に対応するｃＤＮＡ配列の同定及び単離を説
明する。パネルＡは１４０，０００　ドルトンの分子量
を有する染色された融合蛋白質を示す、パネルＢはこの
融合蛋白質とＰ−糖蛋白質に特定なりローン及び他の二
種類のクローンを同定するために使用したモノクローン
Ａｂ（Ｃ２１９）との反応性を示す。 第２Ａ図は薬剤感受性ＡｕｘＢｌ細胞及び高薬剤耐性Ｂ
３０細胞から得た全細胞ＲＮＡの７−ザンプロツト分析
を示し、第三のレーンは対照としての正常な牛の脳から
得たＲＮＡを含んでいる。 第２Ｂ図は第１図におけるものと同様の種々の薬剤耐性
のレベルを有する一連の細胞から得たＲＮＡのスロット
プロット分析を示し、耐性の相対的な程度は相対する各
スロットで示されている。 第３Ａ図は第２Ａ図で示したのと同じ一連のしだいに増
大する複合薬剤耐性ＣＨＯ細胞から得たＥｃｏＲ１ダイ
ジェストゲノムＤＮＡのサザンプロット分析を示す。 第３Ｂ図は薬剤感受性の大白血球細胞形（ＯＥＭ）及び
複合薬剤耐性変異型（ＣＥＭ／Ｖ１ｂｌＯＯＯ）から得
たＥｃｏＲ１ダイジエストＤＮＡのサザンプロット分析
を示す、他の組は薬剤感受性マウスＬ細胞（ＬＭＴＫ−
）及びＮＯＲ変異型（ＥＣＨ”）から得たものである。 方法は第２Ｂ図におけると同様であった。 第４Ａ図、第４Ｂ図及び第４Ｃ図はＣＨＯ細胞系ト３０
のＺ４染色体上の均質な染色領域にＰ−糖蛋白質配列が
局在化するという細胞学的根拠を示す。 ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３Ｂ 手続補正書（方式） ％式％ １、凄件の表示 昭和６０年特許願１９８７０７号 決定因子糖蛋白質ＤＮＡの単離 ３、補正をする者 事件との関係　　　　出願人 工イチ　ニス　シー　リサーチ ディベロップメント　コーポレーション５、補正命令の
日付　　　昭和８０年１１月２６８６、補正の対象　　
　　　図面（企図）−７〆−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）生体細胞の複合薬剤耐性における主要な決定因子で
   ある約１７０，０００ドルトンの分子量を有するＰ−糖
   蛋白質のポリペプチド単位を指令する本質的に純粋なＤ
   ＮＡ分子。 ２）前記ＤＮＡ分子が前記対応するＰ−糖蛋白質のポリ
   ペプチド単位を指令する遺伝子族の一遺伝子から成る特
   許請求の範囲第１項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ３）前記遺伝子族が複数の遺伝子から成る特許請求の範
   囲第２項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ４）前記複数の遺伝子がアンプリコン中に縦列に配置さ
   れている特許請求の範囲第３項記載の本質的に純粋なＤ
   ＮＡ分子。 ５）前記複数の遺伝子がげっ歯類の１０個までの遺伝子
   から成る特許請求の範囲第３項又は第４項記載の本質的
   に純粋なＤＮＡ分子。 ６）前記複数の遺伝子が人の８個までの遺伝子から成る
   特許請求の範囲第３項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子
   。 ７）前記Ｐ−糖蛋白質の対応するポリペプチド配列を指
   令する本質的に純粋なヌクレオチド配列から成る特許請
   求の範囲第１項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ８）前記本質的に純粋なヌクレオチド配列がｃＤＮＡか
   ら成る特許請求の範囲第７項記載の本質的に純粋なＤＮ
   Ａ分子。 ９）前記本質的に純粋なヌクレオチド配列がｍＲＮＡか
   ら成る特許請求の範囲第７項記載の本質的に純粋なＤＮ
   Ａ分子。 １０）前記本質的に純粋なヌクレオチド配列が前記Ｐ−
   糖蛋白質のポリペプチド配列の対応する部分を指令する
   前記配列のＤＮＡ断片から成る特許請求の範囲第７項記
   載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 １１）前記本質的に純粋なヌクレオチド配列がバクテリ
   オファージとの組換え体である特許請求の範囲第１０項
   記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 １２）前記本質的に純粋なヌクレオチド配列がプラスミ
   ドとの組換え体である特許請求の範囲第１０項記載の本
   質的に純粋なＤＮＡ分子。 １３）前記ＤＮＡ断片が約６００塩基対である本質的に
   純粋なヌクレオチド配列から成る特許請求の範囲第１０
   項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 １４）前記ＤＮＡ断片が約２，５００塩基対である本質
   的に純粋なヌクレオチド配列から成る特許請求の範囲第
   １０項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 １５）前記ＤＮＡ断片がｃＤＮＡである本質的に純粋な
   ヌクレオチド配列から成る特許請求の範囲第１３項記載
   の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 １６）前記Ｐ−糖蛋白質に対する三種類の別個の培養抗
   体によって指示される前記Ｐ−糖蛋白質に特異的な三種
   類の別個のエピトープを有するポリペプチド配列を指令
   する本質的に純粋なヌクレオチド配列から成る特許請求
   の範囲第１５項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 １７）前記ｍＲＮＡが約５キロ塩基対のものであり、か
   つ前記Ｐ−糖蛋白質の約１４０，０００ドルトンの蛋白
   質単位を指令する約４キロ塩基対の前記Ｐ−糖蛋白質用
   の暗号化領域を有する、本質的に純粋なヌクレオチド配
   列から成る特許請求の範囲第９項記載の本質的に純粋な
   ＤＮＡ分子。 １８）前記バクテリオファージがＤＮＡプローブとして
   使用するために適応されている本質的に純粋なヌクレオ
   チド配列から成る特許請求の範囲第１１項記載の本質的
   に純粋なＤＮＡ分子。 １９）前記プラスミドがＤＮＡプローブとして使用する
   ために適応されている本質的に純粋なヌクレオチド配列
   から成る特許請求の範囲第１２項記載の本質的に純粋な
   ＤＮＡ分子。 ２０）前記分子が中国産ハムスターの卵巣細胞から得ら
   れる特許請求の範囲第１項記載の本質的に純粋なＤＮＡ
   分子。 ２１）前記分子がマウス細胞から得られる特許請求の範
   囲第１項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ２２）前記分子が人細胞から得られる特許請求の範囲第
   １項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ２３）前記ＤＮＡプローブが検出できる標識で標識化さ
   れている本質的に純粋なヌクレオチド配列から成る特許
   請求の範囲第１９項記載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ２４）前記標識が放射性である本質的に純粋なヌクレオ
   チド配列から成る特許請求の範囲第２３項記載の本質的
   に純粋なＤＮＡ分子。 ２５）前記標識がけい光性である本質的に純粋なヌクレ
   オチド配列から成る特許請求の範囲第２３項記載の本質
   的に純粋なＤＮＡ分子。 ２６）前記標識がバイオチニレーション化 （ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）されている本質的に純粋
   なヌクレオチド配列から成る特許請求の範囲第２３項記
   載の本質的に純粋なＤＮＡ分子。 ２７）特許請求の範囲第１１項記載のバクテリオファー
   ジから成るクローニングベヒクル。 ２８）特許請求の範囲第１２項記載のプラスミドから成
   るクローニングベヒクル。 ２９）特許請求の範囲第２８項記載のクローニングベヒ
   クルから成る宿主細胞。 ３０）特許請求の範囲第２８項記載のクローニングベヒ
   クルから成る微生物。 ３１）ＡＴＣＣ登録番号第３９８３９号である、前記特
   許請求の範囲第２８項記載のクローニングベヒクルから
   成る大腸菌。 ３２）水性栄養培地中で特許請求の範囲第２９項記載の
   微生物を培養し、かつポリペプチドを単離することから
   成る約１７０，０００ドルトンの分子量を有するＰ−糖
   蛋白質の断片であるポリペプチド配列を形成する方法。 ３３）水性栄養培地中で特許請求の範囲第３１項記載の
   微生物を培養し、かつポリペプチドを単離することから
   成る約１４０，０００ドルトンの分子量を有するＰ−糖
   蛋白質の断片であるポリペプチド配列を形成する方法。 ３４）公知のファージ発現ベクター及び前記Ｐ−糖蛋白
   質を過剰に発現する高薬剤耐性の細胞系から得られるｍ
   ＲＮＡｓを使用してｃＤＮＡライブラリー（ｌｉｂｒａ
   ｒｙ）を構成し、前記Ｐ−糖蛋白質に特定である抗体に
   対する融合蛋白質抗原を発現する組換えファージベクタ
   ーを同定し、同定したファージから組換えプラスミドを
   形成し、対応するポリペプチド配列を構成するために適
   合する生体細胞に前記プラスミドを発現し、かつ前記抗
   体を使用することによって前記ポリペプチドが前記Ｐ−
   糖蛋白質であると確認することから成る特許請求の範囲
   第８項記載のｃＤＮＡをプラスミド中に単離する方法。 ３５）前記ファージがバクテリオファージである特許請
   求の範囲第３４項記載の方法。 ３６）前記ファージがλｇｔｌｌである特許請求の範囲
   第３５項記載の方法。 ３７）前記プラスミドがｐＵＣ９である特許請求の範囲
   第３６項記載の方法。