JPS61500646A

JPS61500646A - ファクタ−８および関連生産物の製造

Info

Publication number: JPS61500646A
Application number: JP59504050A
Authority: JP
Inventors: トウール，ジヨン　ジエイ，ジユニア
Original assignee: ジェネティックス、インスティチュ−ト
Priority date: 1983-10-28
Filing date: 1984-10-12
Publication date: 1986-04-10
Anticipated expiration: 2010-11-15
Also published as: EP0162067A4; IE57884B1; JPH0690763A; JPH02182188A; EP0162067B1; ES8700868A1; ES537146A0; FI86436C; JPH02227078A; DK292385D0; EP0162067A1; ES8800987A1; DK292385A; FI852547L; ES8704546A1; DK174927B1; JPH07106156B2; IT1177066B; WO1985001961A1; JP2549049B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ファクター■および関連生産物の製造本衾皿企！見本発明は、ヒトファクター■：Ｃの細胞生産をコードする組換えデオキシリボ核＠　（ＤＮＡ）およびブタファクター■：ＣをコードするＤＮＡの製造、ファクター■：ＣをコードするＤＮＡ分子を得る方法、そのようなりＮＡを使用するヒトおよびブタファクター■：Ｃの発現、それにそのようなりローンを得るために、そしてヒトファクター■：Ｃの発現を達成するために使用されるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む新規化合物に関する。本発明はまた、組換えＤＮＡ技術によるヒ）ＡＨＦおよびその製造に関する。ファクター■：Ｃは血友病Ａに欠乏または存在しない血漿タンパクである。この病気は、男性約２０，０００人中１人がかかる遺伝性出血病である。ファクター ■：Ｃはまた、ファクター■、抗血友病因子（ＡＨＦ）、抗血友病グロブリン（ＡＨＣ；）、血友病ファクターＡ、血小板助因子、トロンポプラスチノジエン、トロンボサイトリシンとしても知られ、そしてそのように呼ばれている。それが凝血活性に影響する化合物であることを指示するために、“ファクター■：Ｃ″ と呼ばれる。ここで使用するように、“ファクター■：Ｃ”と”ＡＨＦ″とは同義語である。血漿からのＡＨＦの単離は文献に記載されているけれども、ＡＨＦの詳細な構造は、一部は純粋な材料の十分な量の入手不能性と、そして多数の夾雑物および精製剤のタンパク分解性のため、これまで同定されていない。不純なＡＨＦのいくらかの量は新しい冷凍ヒト血漿から処理した濃縮製剤として提供されているが、ヒト血漿中のＡＨＦの極めて低い濃度と、そしてヒト血漿の入手および処理の高いコストが、血友病の広範な治療に対してこの物質のコストを禁止的にしている。本発明は、組換えＤ　Ｎ　Ａ技術の使用によりヒトＡＨＦの製造を可能にする。ＡＨＦは、他のタンパクと同様に、特定の配列に並んだ２０種あまりの異なるアミノ酸からなっている。遺伝子操作技術を使用し、ヒトＡｍ（Ｆタンパクをコードする遺伝子を同定し、そしてクローニングし、該遺伝子を組換えＤＮＡベクター中へ挿入し、適当な宿主を該遺伝子を含む該ベクターで形質転換し、そのような宿主中にヒ）ＡＨＦ遺伝子を発現させ、そしてそれによって生産されたヒトＡＨＦを採取することにより、ＡＨＦの生産を可能とする方法が開発された。同様に、本発明は、組換えＤＮＡ技術によってブタＡＨＦの製造、そしてそのようなブタＡ）ＩＦ生産に関連した製品および方法を提供することを可能にする。最近開発された技術は、それらの起源は天然であるにもかかわらず、商業的に有用なタンパクおよびペプチドの合成のため、急速にそして豊富に成長し得る微生物を採用することを可能にした。これら技術は、適当な微生物へ通禽他の生物によってつくられるタンパクまたはペプチドを合成する能力を遺伝的に賦与することを可能にする。この技術は、遺伝子物質、通常ＤＮＡと、生物によって合成されるタンパクとの間に、すべての生きている生物に存在する基本的関係を使用する。この関係とは、タンパクのアミノ酸配列の生産はＤＮＡの３個のヌクレオチド配列のシリーズによってコードされることである。タンパク中に最も普通に存在する２０種のアミノ酸のめいめいの生産に対して特異的にコードする１組またはそれ以上のトリヌクレオチド配列群（コードンと呼ばれる）が存在する。めいめいの与えられたトリヌクレオチド配列と、それをコードする対応するアミノ酸との間の特異的関係が遺伝暗号を構成する。その結果、すべてのタンパクまたはペプチドのアミノ酸配列は、良く理解された関係に従って、対応するヌクレオチド配列によって表現される。さらに、このヌクレオチド配列は、原則として、どんな生きた生物によってもほん訳されることができる。遺伝暗号の議論については、その記載を参照としてここに取りいれたＪ、Ｄ、　Ｗａｔｓｏｎ。Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　（Ｗ、Ａ、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｉｎｃ、、１９７７）　ｌ　特に３４７−７７頁；　Ｃ，Ｆ、Ｎｏｒｔｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　（Ａｄｄｉｓｏ、ｎ、　Ｗｅｓｌｅｙ　１９８１）　＊および米国特許第４，３６３，８７７号参照。それからクンバクがつくられる２０種類のアミノ酸は、フェニルアラニン（以後時に“Ｐｈｅ　”または“Ｆ″と略す）、ロイシン（６Ｌｅｕ　”、”Ｌ　”）　、イソロイシン（”Ｉｃｅ　、′Ｉ　″）ｌメチオニン（’Ｍｅｔ″、”Ｍ” ）、バリン（Ｖａｌ　”、　”Ｖ″）、セリン（”Ｓｅｒ　”＋　”Ｓ　”）ｌプロリン（’Ｐｒｏ　”、”Ｐ　”）　、スレオニン（”　Ｔｈｒ　”、“Ｔ” ）、アラニン（”Ａｌａ　”、”Ａ　”）　、チロシン（“Ｔｙｒ　”、“Ｙ” ）、ヒスチジン（“旧Ｓ”、“Ｈ”）、グルタ・　ミン（”Ｇｌｎ　”　ｇｇ　 ″）、アスパラギン（”Ａｓｐ　ｓ、ＩＩＮ”）　。グルタミン酸（Ｇｌｕ　”、”Ｅ　″）、システィン（”Ｃｙｓ　”、”（：　 ″）、トリプトファン（“Ｔｒｐ　、′縁　”）、アルギニン（“Ａｒｇ　”。 “Ｒ”）およびグリシン（”Ｇｌｙ　”、“Ｇ”）である。与えられたコードン中に含まれることができるトリヌクレオチドの種々の組合せによってコードされるアミノ酸は表１に見られる。表１　遺伝暗号Ｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＴＰｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＣＬｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ　＊　５ｔｏｐ　＊　ＡＬｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ＊　Ｔｒｐ　ＧＣＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　ＴＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　ＣＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　ＡＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ＧＡ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｌ１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＣＴｉｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＡＭｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＧＧ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＴＶａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＣＶａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＡＶａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ＊　５ｔｏｐはタンパクの発現を停止する。特定のタンパクをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列のデオキシヌクレオチド配列を知ることは、該タンパクのアミノ酸配列の正確な記述を許容する。しかしながら逆は必ずしも真ならず、メチオニンはたった１種のコードンでコードされるが、他のアミノ酸は、第１表から明らかなように、６種までのコードン（例えばセリン）によってコードされることができる。このように、アミノ酸配列からヌクレオチド配列を予測するにはかなりの不確実性が存在する。要約すると、本発明以前にはＡＨＦの構造については非常に少ししか知られておらず、そして多年にわたる多大の労作にもかかわらず、当業者はＡＨＦまたはその遺伝子の構造を決定し、またはＡＨＦを実質上純粋な形で実質的な量において生産できる操作を提供することが不可能であった。ヒトＡＨＦのための遺伝子がクローン化され、発現されるこ＼に記載する方法は、以下のステップを含む。（１１ブタＡＨＦの精製；（２）　ブタＡＨＦのアミノ酸配列の決定；（３）オリゴヌクレオチドプローブの調製およびブタＡＨＦをコードする遺伝子の少なくとも断片を同定および／または単離するためにそれらプローブの使用；（４）　ヒ）ＡＨＦをコードするヒト遺伝物質を同定および単離するためにブタＡＨＦ遺伝子断片の使用；（５）種々の哺乳類組織からＡＨＦの合成部位の決定のため前記ＡＦＦ　ＤＮＡ断片の使用；（６）ステップ５における組織同定から得られたメツセンジャーＲＮＡを使用して、ヒトおよびブタＡＨＦをコードするｃＤＮＡセグメントの製造；（７）　ステップ６において製造されたｃＤＮＡセグメントから、例えば同じ制限酵素によって切断されたＣＤＮＡセグメントをリゲーションすることによって全長さのヒトおよびブタｃＤＮＡクローンの構成；ｆ８１ＡＨＦ合成を命令し得るＤＮＡ発現ベクターのＧ生成；（９）　ヒトまたはブタＡＨＦのための全長さのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを持つ発現ベクターによる適当な宿主の形質転換；００）宿主中のヒトまたはブタＡＨＦの発現；０１１　発現されたＡＨＦの採取；この作業の途中において、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための新技術がＡＨＦ分子中に含まれているアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドプローブを使用して開発された。本発明は上記方法と、それに関連して作られる種々のヌクレオチド、ベクターおよび他の製品を含む。Ｕ皿■皿里左関亙第１図は、実施例１に記載した６９，０００ダルトントロンビン開裂産物のアミノ末端配列について決定されたアミノ酸配列（Ａ）の図である。１番目の残基は同定できなかった。この配列は、実施例３に記載されたブタＡＨＦエクソンのヌクレオチド配列から推論された配列（Ｂ）、および実施例４に記載されたヒトＡ　ＨＦエクソンと比較されている。第２図は、（Ａ）アミノ末端のウシトロンビン消化断片と、（Ｂ）後出Ａａｓｓらにより単離された１６６ＫｄブタＡＨＦ断片の４０Ｋｄトロンビン開裂産物の単一文字で表したアミノ酸配列を図示する。第３図は、ＡＨＦをコードするブタ遺伝子の少なくとも一部の同定および単離のためのオリゴヌクレオチドの設計を図示する。第４図は、実施例３に記載したバタテリオファージＰＢ３４がら得られた、ブタＡＨＦエクソンを含むＳｍａｌＤＮＡ断片（３４−５ｌ　）のためのＤＮＡ配列を図示する。第５図は、実施例３に記載した、ブタＡＨＦのためのエクソンを持つＨａｅ　ＩＩＩ挿入３４−旧のＤＮＡ配列の図である。この配列は第４図に示した長い配列内に含まれ、そして第４図の配列のヌクレオチド２５０−６１５に相当する。第６図は、実施例４に記載したヒトＡＨＦのためのエクソンの一部を示す、クローン２５−３ＬのＳａｕ　３Ａ１インサートのためのヌクレオチド３４−８４のためのＤＮＡ配列および推論したアミノ酸配列の図である。第７図は、ヒ１−ＡＨＦをコードする全体の配列を含むＤ　Ｎ　Ａヌクレオチド配列（１本のみを示す）、およびヒトＡＨＦの推論したアミノ酸配列を図示する。本文肌企寵組友森ユ本出願の理解を容易にするため、以下の定義が供給される。この分野において通用している意義と異なる場合には、以下の定義が支配する。増幅とは、細胞がそれらの染色体ＤＮＡ内で遺伝子反復を生産する過程を意味する。同時形質転換とは、そのうちの一つが細胞に選択し得る表現型を与える、ｔｆｆｉ［ｌ胞にとって異質の二つ以上の外来遺伝子をもって細胞を形質転換する過程を意味する。下流とは、ヌクレオチド配列の３゛末端へ向かって進行する方向を意味する。エンハンサ−とは、遺伝子の本体、遺伝子に関して配列の位置、または配列の配向に関係なく、遺伝子の転写を可能とし得るヌクレオチド配列である。遺伝子とは、与えられた成熟タンパクをコードするデオキシリボヌクレオチド配列である。ここでの目的に対しては、遺伝子は、ＲＮＡ転写開始信号、ポリアデニル化付加部位、プロモーターまたはエンハンサ−のようなほん訳されない両端域は含まない。選択遺伝子とは、検出し得るタンパクとして該遺伝子を発現する表現型を細胞へ与える遺伝子である。選択剤とは、選択遺伝子の発現の検出を可能とする条件または物質である。遺伝子型とは、表現型として観察される、その発現に対向して細胞内に含まれる遺伝情報である。リゲーションとは、２本のＤＮＡ鎖の５°および３′末端間にフォスフオシエステル結合を形成する過程である。これはＴ４リガーゼによる鈍い末端連結を含む、いくつかの良く知られた酵素性技術によって達成することができる。配向とは、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序を意味する。ＤＮＡ配列の反転配位とは、他の配位に関して該配位の一゛がら３”への順序が、咳配位を得たＤＮＡ中の基準点と比較した時反対になっている順序である。そのような基準点は、起′ｔＡＤ　Ｎ　Ａまたは該配列を含んでいる複製し得るベクターの複製源中の他の特定ＤＮＡ配列の転写の方向を含むことができる。転写とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を意味する。形質転換とは、外来ＤＮＡの細胞による摂取によって細胞の遺伝子型を変えることを意味する。形質転換は、ある場合には細胞の表現型の変化によって検出することができる。形質転換した細胞はトランスフォーマントと呼ばれる。形質転換前細胞は、親細胞と呼ばれる。はん訳とは、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）からポリペプチドの合成を意味する。本発明は、組換えＤＮＡ技術によって、ブタファクター■：Ｃ遺伝子の同定およびｆｆｉ離を始めて可能にする０本発明はまた、ＡＨＦのためのヒト遺伝子を発見および単離するため、ブタＡＨＦ　ＤＮＡとヒトＡＨＦ　ＤＮＡとの間の相同の利点を利用することにより、組換えＤＮＡ技術により、ヒトファクター■：Ｃを暗号化する遺伝子の単離および同定を始めて可能にする。ブタＡＨＦ遺伝子との相同を経由するＡＨＦ製造のためのｃＤＮＡクローンへのこのルートは、非席に高価でありかつ実質上入手できないヒ）ＡＨＦを精製するための退屈な時間のかかるそして費用のかかる必要性を回避する。ブタＡＨＦは、最も好ましくは、Ｄａｖｉｄ　Ｆａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、″Ｍｏｎｏｃｌｏ−ｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ａ）ＩＦ　Ｃｏａｇｕｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅＩｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｃｏａｇｕｌｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　”　、　Ｂｌｏｏｄ　５９　：　５９４−６００（１９８２）　、およびＫｎｕｔｓｅｎ　ｅｔ　ａｌｌ”　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｆａｃｔｏｒ　■：　Ｃｐｒｅ−ｐａｒｅｄ　ｂｙ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ）１ｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　”　Ｂｌｏｏｄ＋　５９　：　６１５−２４　（１９８２）に記載されているモノクロナール抗体精製技術によって最初高度に精製される。上記論文の記載を参照としてここに取り入れる。ブタファクター■：Ｃポリペプチドは、適当なアフィニティークロマトグラフィーカラム上に固定化された抗 ■：Ｃモノクロナール抗体へ結合される。約１６６および１３０Ｋｄの分子サイズを有する２種の大きい分子量ポリペプチドがエチレンジアミンテトラ酢酸で溶離される。次に約７６Ｋｄの分子量を持つ他のタンパクセグメントが約５０％のエチレングリコールを用いてカラムから溶離される。これらポリペプチド、および／またはウシトロンビンまたはタンパクを切断する他の適当な試薬を使用する、該タンパクの酵素消化のような、既知の方法で得られたこれらポリペプチドの断片の部分的アミノ酸配列が、次に既知の分析方法によって決定される。これら物質のアミノ酸配列を基にして、オリゴヌクレオチドプローブが合成され、その少なくともいくつかはＡＨＦの対応するセグメントをコードするＤＮＡとハイプリント化されるであろう。これらオリゴヌクレオチドは次に、ブタＡＨＦをコードする遺伝子のセグメントをスクリーニングするために使用される。ＡＨＦのためのブタ遺伝子一部分が得られれば、該組換え物質はヒトＡＨＦをコードする遺伝子を探索し、そして単離するため、ヒトゲノムＤＮＡをスクリーンするために使用される。この操作において、ヒｌ−Ａ　ＨＦとブタＡＨＦとの間に、かなりの類似性が存在することが確立され、そしてこれら類似性の利益がヒトファクター■：Ｃ遺伝子または遺伝子セグメントを単離し、そして同定するために用いられる。ブタおよびヒトタンパクのＩＱａｌ性は、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の対応する類似性に帰せられる。ヒトおよびブタのＡＨＦタンパクをコードする遺伝物質は、高いパーセントの部分において同一であり、そのため、例えばＢｅｎｔｏｎおよびＤａνｉｓの“５ｃｒｅｅｎ−ｉｎｇ　ｇｔ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｃ１ｏｎｅｓ　ｂｙ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｎ　ｔｏ　Ｓｉｎｇｌｅ　ＰｌａｑｕｅｓＩｎ　５ｉｔｕ　”、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０　（１９７７）の操作へかける時、ハイブリッド化を示す。該論文の記載を参照としてここに取り入れる。ヒトＡＨＦのための遺伝子のクローン化したセグメントは、次に種々のヒト組織の中からＡＨＦ　ｍＲＮＡの源を同定するために使用される。同様に、ブタＡＨＦのためのクローン化したセグメントの一つまたはそれ以上がブタＡＨＦのための可能性ある組織源をスクリーニングするために使用される。このステップは、例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２　）に記載されているように、ＲＮＡ抽出、ゲル電気泳動、ニトロセルロースシートへの移換、および放射標識したクローン化ＤＮＡへのハイブリッド化を含む。この組織源が同定されれば、ｃＤＮＡライブラリーがつくられ（プラスミドまたは好ましくはバクテリオファージラムダベクター中に、両方とも一般に入手可能）、そして以下に記載するようにＡＨＦｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンについてスクリーニングされる＊　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリースクリーニングのプロセスは、ＤＮＡ配列決定により、ＡＨＦをコードする全体ＤＮＡ遺伝子配列を含むことを示す一組のｃＤＮＡクローンが得られるまで繰り返される。全長さのヒトまたはブタＡＨＦ　ｃＤＮＡが得られたならば、ＡＨＦ活性を発現するため、既知の適当な手段、例えば適当なベクターへの挿入、適当な宿主中へのトランスフェクション、形質転換された細胞（トランスフォーマント）の選択、およびこれらトランスフォーマントの培養がＡＨＦタンパクを発現するために使用される。ＡＨＦの発現のための宿主ベクター系は原核細胞でもよいが、しかしＡＨＦの複雑性は好ましい発現系を真核細胞、特に（少なくとも凝血活性を有する生物学的に活性なＡＨＦに対しては）哺乳動物系のものとする。これは真核細［２（通常哺乳類またはを椎動物細胞）の過当なＡＨＦベクターによる形質転換によって容易に達成される。真核細胞形質転換は、一般によく知られたプロセスであり、そして種々の標準的方法によって達成することができる。これらは、プロトプラスト融合、ＤＮＡミクロ注入、染色体トランスフェクション、溶菌性または非熔菌性ビールスベクター（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋−Ｎａｔｕｒｅ”　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２７７　：　１０８−１１４　（１９’、９）　）　、細胞対細胞融合（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、’Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、”７４：３１９−３２３　（１９７７）　）　、リビフド構造（米国特許第４，３９４，４４８号）、およびＤＮＡ沈澱の摂取（Ｂａｃｈｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、どＰｒｏｃ、　Ｈａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７４　：１５９０−１５９４　（１９７７）　）の使用を含む。イーストまたはこん生細胞のような他の真核性細胞も有利に使用し得る。溶菌性ビールスベクターによって仲介される形質転換が効率的であるが、しかし多数の理由により不利である。トランスフェクトされたＤＮＡの最大サイズがビールスのカブシッドパフキンレ゛の形状によって制限される、外来遺伝子がビールス複製中しばしば消失する、ヘルパービールスまたは特異化された宿主の必要性が存在する、宿主細胞はパーミソシブでなければならない、そして宿主がビールス感染の途中で殺されることである。非溶菌性形質転換は、安定なエピソームとしである細胞ライン中に導入されたビールスベクターの転写およびほん訳を基にする。これら系は独特な細胞ラインを必要とし、そして多数の不利益を蒙る。 ”　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　”　＋　１９８３年３月号、　ｐｐ、２０９−２１２参照。他方、染色体外ＤＮＡが宿主細胞の染色体中に摂取される他の形質転換方法は、低い形質転換頻度および低い発現レベルによって特徴づけされていた。これら当初の難点は、実際に形質転換された細胞（選択遺伝子）の小集団を遺伝的に選択し得る表現型を与える遺伝子で形質転換することによって緩和された。形質転換された細胞の全集団は、獲得した表現型を有する細胞に有利な条件で育成されることができ、そのため形質転換された細胞を好都合に探索することを可能とする。その後、トランスフォーマントは該表現型をもつと強く表現する能力についてスクリーニングされることができる。これらは、より高い発現を検出するような方法で、選択剤を変更することによって達成される。選択遺伝子は三つのカテゴリー、すなわち検出し得るように増幅された選択遺伝子、優性選択遺伝子、および検出し得るように増幅された優性選択遺伝子に分けられる。検出し得るように増幅された選択された遺伝子は、増幅が宿主細胞を選択剤の変更へ１１８露することによって検出することができる遺伝子である。ｔｉＥ性に活動しない検出し得るように増幅された遺伝子は、一般に選択遺伝子を遺伝子型的に欠く親細胞ラインを必要とする。その例は、ヒドロキシメトールグルタニルＣｏＡレダクターゼ（（１９４３）　）　、アスパルテートトランスカルバミラーゼ（Ｋｅｍｐ　ｅｔ　ａｔ。 “Ｃｅ１１９：５４１（１゛９７６）、アデニレートデアミナーゼ（ＤｅＢａｔｉｓｓｅｅｔ　ａｌ、　”Ｍｏｌ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ＋、　”２　（１１）　：　１３４６−１３５３　（１９８２）　）　。マウスジヒドロフオレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、および欠陥プロモーターと共にマウスチミジンキナーゼ（ＴＫ）に対する遺伝子を含む。優性選択遺伝子は、親細胞の遺伝子型に関係なくトランスフォーマント中に発現される遺伝子である。大部分の優性選択遺伝子は、その表現型が選択剤による処理において高度に効果的なため、遺伝子を増幅した、または増幅しなかった細胞ラインを識別することが困難であるために、検出し得るように増幅されない。このタイプの優性選択遺伝子は、キサンチンーグアニンフォスフォリポシルトランスフェラーゼ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、”７８（４）　：　２０？２−２０７６　（１９８１）　）　、およびアミノグルコシド３゛　−フォスフオドランスフェラーゼ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　”　Ｊ、　Ｍｏｌ。Ｂｉｏ＋、”　、　１５０　：　１−１４　（１９８１）　）のような、原核生物酵素に対する遺伝子を含む。いくらかの優性選択遺伝子は検出できるように増幅される。適当な実例は、Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、”Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、”　４　：　４９９−５０８（１９８２）に記載された変異ＤＨＦＲ遺伝子、ＨＬＡ抗原のような細胞表面マーカー、およびこの分野でよく知られているように螢光源または色素源物質から螢光物質または着色物質を生産する特異性エステラーゼのような酵素をコードする遺伝子を含む。検出し得るように増幅された優性選択遺伝子がここで使用するために好ましい。ある場合は、優性選択遺伝子は遺伝子の適当な変異によって検出し得るように増幅された遺伝子へ変えることができることを理解すべきである。選択遺伝子は最初墾られた商業的有用性しかなかった。それらは摂取したＤＮＡを増幅する性質を有するトランスフォーマントを選択することを可能としたが、大部分の選択遺伝子は商業的価値のない生産物を生産した。他方、商業的に価値ある生産物のための遺伝子は、一般にそれらのトランスフォーマントへ容易に検出し得る（または単に検出し得る）表現型を与えなかった。これは、例えば独特の栄養代謝または無毒化能力で形質転換された細胞を与えない酵素またはホルモンについて真理であろう。商業的に興味ある大部分のタンパクはこのグループ、例えばホルモン、血液凝固に関与するタンパク、およびフィブリン熔解酵素に属する。後に、形質転換される性質を有し、そして選択遺伝子を増幅する真核細胞は、生産物遺伝子の場合と同じことをするであろうということが発見された。選択遺伝子を追従することにより、選択遺伝子と同時に、生産物遺伝子を同時発現し、同時増幅するトランスフォーマント細胞の小集団を同定することができた。トランスフォーマントを選択剤の存在下に培養し、そして選択遺伝子の増加した発現を有するトランスフォーマントは生産物遺伝子の増加した発現をも示すであろうと結論するのが実際であった。これは後でもっと詳細に論するように、常に正しいとは限らない。Ａｘｅｌら（米国特許第４゜３９９．２１６号）は、ある細胞を、共有結合した、または結合しない遺伝子を含むベクター系によろうと、そして後者の場合、遺伝子が宿主ｍ胞中へ後から、または同時に導入されようと、二辺上の異なった遺伝子で形質転換する過程を記載するために、同時形質転換なる術語を使用している。同時形質転換は、“実質上任意の遺伝子の培養細胞中への導入および統合を許容しくＷｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、“Ｃｅ１ｌ　”　＋耳し７７７−７８５．　（１９７５）　）、および“同時形質転換過程の使用により、所望のタンパク性および他の物質を合成する真核細胞を生産することが可能”　（米国特許第４，３９９，２１６号、カラム３．３７−４２行）でなければならない。長ｉｋ迫丘玄叉二ＡＦＨ同時形質転換に使用されるベクターは、選択遺伝子およびＡＨＦ遺伝子を含むであろう。加えて、形質転換または同時異質転換ベクター中に、後で記載するようなエンハンサ−、プロモーター、イントロン、アクセサリ−ＤＮＡ、ポリアデニル化部位、および３“非コーテイング域のような他の要素が通常存在するであろう。適当な選択遺伝子は上に記載した。選択剤は選択遺伝子の不存在下で細胞生育を阻止するものであることが好ましい。そのため、選択遺伝子を失った大規模培養中の復帰突然変異細胞は、醗酵物を過度に生育させないであろう。しかしながら、ＡＨＦＯ萌業生産業生産ては、細胞毒素の使用を避け、それにより製品精製工程を単純化することが望ましいであろう。このため、望ましい選択遺伝子は、トランスフォーマントがさもなければ使用できない生育にとって重要な栄養を使用することを可能にするものであろう。前述したＴＫ遺伝子は一例である。二つのクラスのベクターが同時形質転換に用いられた。第一のクラスの未結合ベクターである。ここでは選択遺伝子およびＡＨＦ遺伝子は共有結合されない。二つの遺伝子のリゲーションまたは他の結合ステップが必要ないので、このクラスのベクターが好ましい。このことは、選択遺伝子および生産物遺伝子スられ、そしてそれらの野生タイプ環境においてリゲートされないから、形質転換過程を単純化する。加えて、同時形質転換特使用されるＡＨＦおよび選択遺伝子のモル比は、同時形質転換効率を増すように調節することができる。同時形質転換ベクターの第二のクラスは、結合したベクターである。これらベクターは、選択およびＡＨＦベクターが好ましくはリゲーシッンによって共有結合されている点において未結合ベクターから区別される。こ−ではベクターはエンハンサ−を含むことができる。エンハンサ−は機能的にプロモーターから区別されるが、しかしプロモーターと協力して作用するように見える。それらの細胞レベル上の機能は良くわかっていないが、それらの独特な特徴は、位置もしくは配位に依存することなく転写を活性化または可能化する能力である。プロセロターは遺伝子の上流でなければならないが、エンハンサ−はイントロンのように、遺伝子内でプロモーターから上流または５゜に、または遺伝子とポリアデニル化部位との間で遺伝子から下流に、またはポリアデニル化部位から３° に存在することができる。反転したプロモーターは機能しないが、しかし反転したエンハンサ−は機能する。エンハンサ−はシス活性、すなわちプロモーターに対しそれらが同じＤＮＡＮ玉鎖上在する場合のみ効果がある。エンハンサ−の一般的議論については、Ｋｈｏｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ″３３　：　３１３−３１４（１９８３）参照。好ましいエンハンサ−は、サルビールス４０、ボリオマビールス、ウシパピロマビールス、レトロビールスまたはアデノビールスのような動物ビールスから得られる。ビールスエンハンサ−は、大衆が入手し得るビールスから容易に得ることができる。いくつかのビールス、例えばラウスザルコーマビールスおよびサルビールス４０のた：　７０５−７１６　（１９８３）参照。問題のビールスの公表された制限マツプを基にしてこれら域を切除し、そしてもし必要ならばエンハンサ−を所望のベクターに接合することを可能とするように部位を修飾することは８富的な化学的事項である。例えば、Ｋａｕｌｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、“Ｊ。Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　”　、　１５９　：　６０１−６２１　（１９８２）およびＭｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、”２　（１１）　：　］３０４−１３１９　（ｘ９ｓ２）参照。これら両者の記載を参照とじてこ＼に取り入れる。代わりに、エンハンサ−°は配列データから合成することができる。ビールスエンハンサ−のサイズは、これを実際の達成できるほど十分に小さい（一般に約１５０ｂｐ以下）。ベクターアセンブリ中に存在しなければならない他の要素は、ポリアデニル化接合（付加）部位である。これはほん訳された遺伝子区域から下流に位置するＤＮＡ配列であり、そこから少し下流に転写ストップおよびアデニンリボヌクレオチドが付加され、メツセンジャーＲＮＡの３°末端にポリアデニンヌクレオチド尾部を形成する。ポリアデニル化は、メツセンジャーＲＮＡのレベル、従って生産物タンパクのレベルを減らす事象である、細胞中の分解に対してメツセンジャーＲＮＡを安定化するのに重要である。真核性ポリアデニル化部位は良く知られている。真核性遺伝子の中にコンセンサスな配列が存在する。ヘキサヌクレオチド５’　−ＡＡυＡＡＡ−３゛　ば、ポリアデニル化がスタートする点から１１−３０ヌクレオチドに発見される。ポリアデニル化部位を含むＤＮＡ配列は発表された報告に従ってビールスから得ることができる。例示的なポリアデニル化配列はマウスベータグロブリン、およびサルビールス４０後期または早期域遺伝子から得ることができるが、しかしビールスのポリアデニル化部位が好ましい。これら配列は既知であるから、それらは生体外で合成することができ、そしてベクターへ慣用の手法でリゲートすることができる。ポリアデニル化域は、ＡＨＦおよび／または選択遺伝子のどちらからも下流に配置されなければならないが、どちらの遺伝子ヘリゲートすることもできる。それは生産物遺伝子ではな（、選択遺伝子のみヘリゲートすることができ、そしてベクターが結合していても結合していなくてもそうである。はん訳ストフプコードンからポリアデニル化部位を分離する配列は、好ましくはプロモートされない真核性遺伝子のようなほん訳されないオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドおよび遺伝子はプロモーターを付与されないので、それらは発現されないであろう、該オリゴヌクレオチドはストップコードンからポリアデニル化部位まで約１，０００塩基までのオーダーでかなりの距離延長しなければならない。この３”非はん訳オリゴヌクレオチドは、一般に生産物収率の増加をもたらす。該ベクターはコンセンサス配列から下流約１０ないし約３０ｂｐで終わることができるが、しかしその野性タイプ環境においてポリアデニル化部位から下流に見出される３”配列を保持することが好ましい。これら配列は、典型的にはポリアデニル化部位から下流へ約２００ないし６００塩基対延長する。こ＼に記載したベクターは当業者によ（知られた技術によって合成することができる。選択遺伝子、エンハンサ−、プロモーター等のようなベクターの成分は天然源から得ることもできるし、または前記のように合成することもできる。基本的には、もし成分がビールス機能のような成分のように、大量に入手し得るＤＮＡ中に見出に起源生物を培養し、そのＤＮＡを適当なエンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡ断片を分離し、興味ある要素を含んでいるＤＮＡを同定し、そしてそれを回収することによって得ることができる。通常、形質転換ベクターは小量組立てられ、そして次に真核性プラスミドまたはファージのような適当な自律的に複製する合成ベクターヘリゲートされるであろう。大部分の場合、ｐＢＲ３２２プラスミドを使用することができる。前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ参照。合成ベクターは、例えばバーミンシブな真核生物のトランスフェクション、高コピー数への合成ベクターの複製、細胞熔解による合成ベクターの回収、および細胞片から合成ベクターの分離によって、慣用手法によりリゲートした形質転換ベクターをクローン化するために使用される。合成ベクターの得られる収穫物は真核性細胞へ直接トランスフェクトすることができ、または形質転換ベクターは、適当なエンドヌクレアーゼ消化、分子量による分離、および形質転換ベクターの回収によって、合成ベクターから救出することができる。形質転換ベクター救出は、合成ベクターの残部が真核性遺伝子増幅、転写またはほん訳に悪影響しない限り必要でない。例えば、こ−で好ましい合成ベクターは、真核細胞に対して有害な配列を除去したＥ、　Ｃｏ１１変異株プラスミドｐＢＲ３２２である。前出Ｋａｕｆｏ＋ａｎ　ｅｔ　ａｌ参照。この変異株の使用は、同時形質転換前に、プラスミド残部を除去する必要性を全くなくす。Ｅ　５　−１’　、よび土−の形質転換すべき細胞はイースプロトプラストを含む任意の真核細胞でよいが、しかじ通當は非カビ細胞である。−次体外移植体（幹細胞のような比較的未分化細胞を含む）、および死滅しないおよび／または形質転換された細胞ラインが適当である。候補細胞は、選択遺伝子が優性である限り選択遺伝子を遺伝子型的に欠けていなくてもよい。細胞は、好ましくは前に論じたように安定な哺乳類細胞ラインであろう。それらの染色体ＤＮＡ中へ選択遺伝子を安定に統合することが知られた細胞ライン、例えばチャイニーズハムスター卵（ＣＨＯ）細胞ラインが最良である。ＣＯＳサル細胞、Ｂｏｗｅｓ細胞ラインのようなメラノーマ細胞ライン、マウスＬ細胞、マウス線維芽細胞、およびマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞も使用し得る。未結合ベクターによる同時転換は、順次または同時に達成することができる（米国特許第４，３９９，２１６号を見よ）。細胞のＤＮＡ摂取を容易にする方法は前に記載されている。細胞核中へのベクターのマイクロ注入は最高形質転換効率を得るであろうが、しかしリン酸カルシウム沈澱の形のＤＮＡへ親細胞を露出するのが最も便利である。かなり良い同時形質転換効率は、１００：１のオーダーの選択遺伝子に対する生成物のモル過剰による同時形質転換から得られる。形質転換条件へ曝露された細胞の個体群は次にトランスフォーマントを同定するために処理される。同時形質転換のために処理された培養物の小個体群だけが選択遺伝子の表現型を示すであろう。培養物中の細胞は表現型についてスクリーニングされる。これら細胞を個々に細胞選別装置でアッセイすることによって達成することができ、その場合、表現型は選択遺伝子によって生産された酵素による螢光源物質の開裂時の螢光のような信号を発生する表現型である。しかしながら、好ましくは該表現型は、前に詳しく論じたような特別の発育培地中でトランスフォーマントのみが発育または生存することを可能とする。選択トランスフォーマントは、次に生産物遺伝子のそれらの染色体へのリゲーシッンについて、または生産物自体の発現についてスクリーニングされる。前者はサウザンプロット分析によって達成することができ、後者は標準的な免疫学的または酵素的アッセイによって達成することができる。トランスフォーマントが同定されたならば、ＭＴＸのような選択剤の存在下さらにクローニングすることによって生産物遺伝子の表現を増幅するためのステップが実施される。米国特許第４，３９９，２１６号を見よ。こ５に記載したプロセスに従って調製し得るトランスフォーマントは、公知技術による高等生物の生体内トランスフェクションに通している。可能性ある宿主動物の一次体外移植物または安定な細胞ラインが同時形質転換され、そして該宿主、生産物タンパクが遺伝子型的に欠けている実質上ばかに同質遺伝子的な宿主に接種される。本発明は、以下の例証具体例を参照してさらに理解されるであろう。該具体例は純粋に例示であり、そして請求の範囲に記載された本発明の真の範囲を限定するものと解すべきではない。特記しない限り、制限エンドヌクレアーゼはそれらの商業的供給者が推奨する条件および態様で使用される。リゲーション反応は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　？１ａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）　、　２４５−６頁（その記載を参照とじこ＼に取り入れる）に記載されているように、その第２４６頁に記載されている緩衝液を使用し、そしてＤＮＡ：ｓ度１〜１００μｇ／■を使用し、鈍いＤＮＡ末端に対しては２３℃の温度において、そしてくっつき易いＤＮＡ末端に対しては１６℃において実施される。こ〜に記載した“フォスフォターゼ処理”とはＤＮＡの脱フォスフォリル化を意味し、そして前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、の１３３頁等に記載されている態様で実施される。“キナーゼ処理”とはＤＮＡのフォスフォリル化を意味する。電気泳動は、９０ｍＭ　トリス−ホウ酸塩、１０　ｍＦＩ　ＥＤＴＡを含有する０、５〜１．５％アガロースゲル中で実施される。“ニック−トランスレーティングとは、Ｒｊｇｂｙｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１１３：２３７　（１９７７）に記載されているように、Ｄ　Ｎ　Ａを３２ｐで標識する方法を意味する。すべての放射標識したＤ　Ｎ　Ａは、どのような標識技術が使用されようが、３２ｐで標識される。 “ラビッド　プレソフ１とは、例えば前出Ｍａｎｉ、ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　３６５−３７３頁に記載されているバクテリオファージまたはプラスミドＤＮＡの急速小規模生産を意味する。本発明の他の局面によれば、ＡＨＦの医薬製剤が提供される。本発明に従って生産されたヒ）ＡＨＦの医薬製剤は、この技術分野においてよく知られた操作に従って非経口投与のために製造される。ヒトに使用される医薬製剤は、形質転換した細胞から採取した滅菌したＡＨＦを含む。ＡＨＦポリペプチドまたはＡＨＦ活性を産生ずるその十分な部分に加え、一種またはそれ以上の許容し得るその担体と、そして場合により他の治療成分を含むことができる。担体は、製剤の他の成分と共存し得るとの意味において許容し得るものでなければならず、そしてその受容者にとって有害であってはならない。該製剤は、単位投与形態で便利に提供されることができ、そして薬剤学の分野において良く知られた任意の方法によって製造することができる。非経口投与に通した本発明の医薬製剤は、有利には、好ましくは受容者の血液と等張である溶液をつくるため滅菌した溶液の添加によって復元し得るＡＨＦポリペプチドの無菌凍結乾燥製剤を含むことができる。該製剤は、単位または多数投与容器、例えばシールしたアンプルまたはバイアル中に提供することができる。無菌ＡＨＦまたはその溶液に加え、本発明の医薬製剤は希釈剤、緩衝剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）その他のような一種またはそれ以上の追加の成分を含んでもよい。ゼラチン、乳を唐、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、微粉シリカゲル、ココアバター、タルク、植物性および動物性油脂、植物性ゴム、およびポリアルキレングリコール、および医薬用の他の既知の担体はすべて本発明の医薬製剤の製造に適している。非経口用途のための製剤は、担体である水または薬剤学的に許容し得る液体の無菌溶液または懸濁液のアンプル、または薬剤学的に許容し得る液体で希釈するための無菌固体ＡＨＦを含む。本発明の医薬製剤は、血友病Ａの治療に有用である。これら製剤はまた、血液凝固が関与するプロセスの生体内および生体外研究において、およびＡ　ＨＦ分子の免疫学的および生物学的特徴の研究において、重要な道具を提供する。実施例１　久ｌバ１皿死圀捉ブタファクター■；Ｃを前出のＫｎｕｔｓｅｎおよびＰａ５ｓ　（１９８２）　；Ｆａｓｓｅｔ　ａｌ、　（１９８２）に発表された操作に従って、０ａｖｉｄ　ＦａＳｓによって精製された。アミノ酸配列分析は、以下に記載する７６．０００ダルトンタンパクのウシトロンビン消化生成物について実施される。抗■：Ｃモノクロナール抗体カラムへ結合したブタＡＨＦポリペプチドは、２ステツプにおいて次々に溶離されることができる（Ｆａｓｓｅｔ　ａｌ、　１９８２　）　、二種の巨大分子量スペシス、１６６．０００および１３０，０００ダルトンはＥＤＴＡで溶離し得る。約７６．０００ダルトンの分子量を有する残りのポリペプチドは、次に５０％エチレングリコールで溶離することができる。７６、ＯＯＱダルトンのタンパクは、５１ａ？！トリス−ＨＣＩＬ　（ｐＨ７，５）　、０．１５Ｍ　ＮａＣ１！中における広汎な透析の後、トロンビンで消化する。ウシトロンビン消化は、ウシトロンビン１単位／戴を用いて室温で６０分間実施し、さらにトロンビン１単位／献を加え、そしてさらに６０分間インキュベートする。トロンビン消化は０．０１％ＳＤＳ中９０℃で１０分間加熱することによって打ち切る。７６゜０００ダルトンタンパクの主なトロンビン消化生成物は、６９．０００ダルトン（６９Ｘｄ）のポリペプチドである。前記の６９Ｋｄポリペプチドスペシスの１Ｍｇ以下を、Ｉｌ、　Ｋ。Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２７７　：　６８０　（１９７０）　（その記載をこ−に参照として取り入れる）の操作によりＳＤＳゲル電気泳動後、放射性マーカーとして役立つようにヨード化する。ＴＡＳｉ街液（５０ｍＭ）リス− 酢酸塩（ｐＨ７，８）　、　０．１％５ＤＳ）中に溶解したポリペプチドを、担体を含まないヨウ素−１２５の５　ｍｃｉを含む同じ緩衝液１００μｌへ加える。ＴＡＳ緩衝液中２．５■／ｄのクロラミンＴ（ベーカー）５０μｌを加え、溶液を１分間かきまぜる。反応をＴＡＳ緩（１液中メタ重亜硫酸ナトリウム２．５ ■／献溶液５０μＰを加え、１分間かきまぜることによって停止する。標識したタンパクは小容積のセファデックスＧ−２５Ｍカラム（ＰＤ−１０，ファルマシア）を使用するクロマトグラフィーにより、取り込まれなかった■ツから分離する。ｖｉカラムは、ヨウ化ナトリウム２．５■／成を含むＴＡＳ緩ｆｉ液の数倍カラム容積をもってあらかじめ平衡化される。室容積を集め、そしてタンパク完全性を前出Ｌａｅｍｍｌｉ　（１９７０）の操作に従ってＳＤＳゲル電気泳動によって分析する。放射標識した６９Ｋｄタンパクを後のモニタリングのためその未標識対応タンパクへ加える。該タンパクは次に個々に電気泳動的に！ｉＩ縮される。タンパク溶液は０．１％ＳＤＳ、１０ｍｒＩジチオスレイトールへ調節され、そしてＣｏｏＩＩｌａｓｓｉｅブリリアントブルー（Ｓｅｒｖａ　）を加え、溶液を非常に薄くブルーに着色する。溶液は次にスペクトラボア透析チューブ（約１４，０００の分子量カットを有するＳｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　！１りを使用してＴ　Ａ　Ｓ　緩衝液中で大体透析する。透析したタンパクサンプルは、次に１ｌｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、旦卦工壓壮、工Ｅｎｚｙｍｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ。Ｐａｒｔ　Ｉ　、　９１　：　２２７　（１９８３）によって示された設計の電気泳動濃縮装置に入れられ、Ｔ　Ａ　Ｓ　緩衝液中で２４時間５０ボルトで濃縮される。上の操作で濃縮された６９ＫｄＡＨＦポリペプチドは、前出Ｌａｅｍｍｌｉに従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動される。放射標識されたトレーサーポリペプチドのオートラジオグラフィーによって同定される、精製されたタンパクがゲルから切り出され、電気溶離され、そして前出）１ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、によって記載されたように濃縮される。′ａ縮されたタンパクは、）Ｉｅｗｉｃｋ　ｅｔａｔ、、　Ｊ、　Ｒ４ａｌ、　Ｃｈｅｍ、２５６：７９９０　（１９８１）に記載された気相シーケネーターを使用する直接アミノ酸配列分析に適している。６９．０００ダルトントロンビン開裂生成物の２−４２残基を延びるアミノ末端配列は、第１図に図示するとおりである。１番目の残基″Ｘ９は同定できなかった。前出Ｆａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、によって記載された１６６ＫｄＡＨＦ断片の（Ａ）アミノ末端および（Ｂ）それからの４０Ｋｄウシトロンビン消化生成物のアミノ酸配列は第２図に示されている。７６Ｋｄポリペプチドのアミノ末端は、Ｘ −１１ｅ　５ｅｒＬｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＡｓｐＴｌｅ　Ｐｈｅである。（ａｌペンタペプチドプローブ給源決定されたブタＡＨＦ断片の部分的アミノ酸配列は、ブタＡＨＦオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そして合成することを許容する。遺伝暗号（表１）から、このアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を予測することが可能である。遺伝暗号は変性であるので、アミノ酸配列毎に二つ以上の可能性あるＤＮＡコード配列が存在する。従って、正確なりＮＡ配列を確かめるため、合理的な数のオリゴヌクレオチドのみを必要とするＡＨＦ分子の区域に対して複数の相補性オリゴヌクレオチドプローブ配列が容易される。そのような区域は、最低の変性度を有する５個ないし８個の連続するアミノ酸配列をサーチすることによって選択される。該区域が選択された後、オリゴヌクレオチドの給源が合成され、それは選択された区域の５個ないし８個のアミノ酸をコードできるすべての可能性あるＤＮＡ配列を含むであろう。ブタＡＨＦの６９，０００ダルトントロンビン開裂断片においては、アミン末端から１８番目ないし２２番目のアミノ酸までを含むペンタペプチド配列があり、これは、１５１［１ｉ１のヌクレオチド長さに対し、めいめい５個のコードンを有する１６個までの異なるＤＮＡ配列によってコードされることができる。Ｔｒｐ　−Ａｓｐ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−Ｍｅｔ可能性あるａ＋ＲＮＡ配列　ＵＧＧ　ＧＡＵ　ＵＡＵ　ＧＧｔｌ　Ａｔ１Ｇまたは　または　またはＧＡＣ（ＩＡＣＧＧＣまたはＧＡまたはＧＧＣプローブは、混合物あたり２ないし８またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドの限られた数の混合物を合成することによってつくられる。すべての可能性あるコード配列を包囲するのに十分な給源がつくられる。これらオリゴヌクレオチドは、例えば、その記載を参照とじこ＼に取り入れるＲ、　Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ＋＊、　Ｓｏｃ、　９８　：　３６５５　（１９６７）に開示されているフォスフオトリエステル法により、人手によって合成することができる。他の方法はこの分野で良（知られている。こ−にその記載を参照として取り入れたＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０３　：　３１８５　（１９８１）参照。しかしながら、好ましくは所望のポリペプチド配列のための合成オリゴヌクレオチドプローブは、上に示した完全自動アプライド、バイオシステムズ、ＤＮＡシンセサイザーの助けにより、同じ化学によって合成される。このように製造されたオリゴヌクレオチドは、次にその記載を参照としてこへに取り入れたＨ、　Ｆｒ１ｔｚ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ、−１７：１２５７　（１９７８）に記載されているような逆ＨＰＬＣカラム上で精製することができる。８０％ＨＯＡｃによる脱トリチル化の後、得られるオリゴヌクレオチドは通常純粋であり、そしてプローブとして直接使用することができる。もし夾雑物があれば、合成りＮＡは好ましくは少し異なる勾配システムを使用して、同じＨＰＬＣカラム上でさらに精製することができる。オリゴヌクレオチドは（−３２ｐ）　ＡＴＰおよび丁４ポリペプチドキナーゼを使用することによって標識され、そしてそれらの配列は、その記載を参照として取り入れるＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　Ｔ。：　１２０９　（１９７３）に記載された二次元クロマトグラフィーにより、またはＭｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　６５　：　４９９　（１９７７）記載のＭａｘａｎ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法によって検定される。（ｂｌ　４５個ヌクレオチドプローブ本発明の独特な面は、ＡＨＦ遺伝子またはその断片についてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため、オリゴヌクレオチドプローブを使用することである。オリゴヌクレオチドはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用されているが（ここにその記載を参照として取り入れる門、　Ｊａｙｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ、　１１　：　２３２５　（１９８２）参照）、ゲノムライブラリーは以前ＣＤＮＡプローブのみにより、すなわち記載されたタンパクのための組織源が同定され、そしてゲノムサーチによって発見された遺伝子のＤＮＡ配列に正確にマツチしたｃＤＮＡを生産するのに用いられた後で生産されたプローブにより成功してスクリーニングされていた。本件の場合、興味あるタンパクのアミノ酸配列をコードするゲノムライブラリー中の遺伝子セグメントを同定するためにオリゴヌクレオチドを使用することが可能であることが示され、そしてそのような遺伝子セグメントの同定はｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはその後のゲノムスクリーニング技術に使用するための性格なプローブを提供する。好ましくは、こ＼でそうであるように、興味あるタンパクのアミノ酸配列の少な（とも２個のセグメントに対応するオリゴヌクレオチドが使用される。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１個が、選択されたアミノ酸配列をコードし得るすべての可能性あるＤＮＡ配列を総合して含むオリゴヌクレオチドの一つまたはそれ以上の給源の形で使用される。好ましくは、比較的短いプローブ、例えば１１ないし２５ヌクレオチド、好ましくは１５ないし２０ヌクレオチドが比較的長いプローブ、例えば３０ないし２００ヌクレオチド、好ましくは４０ないし５０ヌクレオチドと組合せて使用される。２番目のプローブは確認のために使用することができ、そしてＤＮＡセグメントの同定のためには常に必要ではない。好ましくは、プローブの一方、そしてもっと好ましくは長い方のプローブは以下に記載する規則工ないし４に従って設計される。規則１．ユニ上ヱ慢人血他の配旧なしに、類（以の補乳類遺伝子中の支配的または類似の配列にマツチしたヌクレオチドが選ばれた＊　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ａ　ｅｉｎ厘ム、　ｉｓ：　（１９８２）参照。規則２．宜肌左旦工対金ヌクレオチドＧは、その相補体Ｃへの結合に加えて、ヌクレオチドＴと弱い結合を生成し得る。Ａｇａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ。２５６　：　１０２３　（１９８１）参照。このため、不確実なコードンの第３の部分のためＧまたはＡの選択に直面して、Ｇを選ぶことが好ましい。それはもし生ずるハイブリッド化が該位置の実際のヌクレオチドがＣでな（、Ｔであってもおこるならば、該ハイブリッド化はなお安定であるからである。もし誤ってＡが選ばれたならば、対応するＡを破壊するのに十分であり得る。規則３．Ｌ皿ｎ皿少皿！可能性ある不確実性から選択する時、コードン内にせよ、コードン間にせよ、５ °ＣｐＧ配列を含まないヌクレオチドを選択せよ。規則４．１スヱヱ土拉１使用のためコードン配列を選ぶにあたり、分子の末端近くのミスマツチは、分子の中心近くのミスマツチはどハイブリッド化に悪影響しないとの仮説が考慮された。このため、例えば特定のコードンの配列に関して実質的な疑問が発生し、そしてそのコードンがプローブの中心に近い場合、傾向は該コードンについて可能性あるヌクレオチド配列の給源をテストすることであったが、プローブの末端近くのコードン位置はコードン優先性に基づく決定の対象らしかった。４５−マープローブのため選ばれた配列およびアミノ酸配列、可能性あるＤＮＡ配列、および実際のプローブ配列、すなわちＡＨＦエクソンのために決定された実際にコードするストランドの相補体は第３図に示すとおりである。このようにして、選択を含むヌクレオチド位置の中で、３種が両方の可能性あるヌクレオチド選択群を含む給源を使用することによってカバーされ、５種が正しく予測され、１種が正しくないが幾分中立性を維持することが予測され、そして他の４種は誤りであった。約１１％のミスマツチ（５／４５）にもか−わらず、４５−マーオリゴヌクレオチドの給源は、以下記載するようにブタＡＨＦ遺伝ブタゲノムライブラリーがバクテリオファージベクターラムダＪｌを使用して構成される。ラムダＪ１はＬ　４７．１　（Ｌｏｅｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ。２Ｑ：２４９　（１９８０）　）から、１．３７ｋｂおよび２．８３　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｂａｌ１１旧断片を９５　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ −Ｘｂａ　Ｉ−ｂｇｌ　ＩＩ−Ｂａｍ　ＩＩポリリンカーによって置換することによって得られる。６．６　ｋｂ　Ｂａｍ旧断片はその時Ｌ　４７．１に関して逆の配向の直接の反復体として存在する。ＢａｍＨ１断片についてクローニング能力は８．６〜２３．８ｋｂである。Ｂａａ旧開裂ブタＤＮＡ　（Ｐｉｃｃｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ旦、　３０：２０５　（１９８２）に記載のように調製した）をフェノール抽出し、エタノール沈澱し、そしてマイクロフユージ中の遠心によって濃縮する。Ｂａｍ　）ＩＩブブタＮＡ０．６７ｐｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（前出１’１ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　４７４頁）１０単位を含む１０μ！リゲーシヨン緩衝液中において、前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　２７５−２７９頁に記載するように調製したラムダＪＩＲａｍ旧アームの２μｇヘリゲートする。リゲートしてＤ　Ｎ　Ａはパンケージされ、そして前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　２９１頁に記載されているようにプレートされる。約４Ｘ１０’ｐｆｕが、８．　０００　ｐｆｕ／プレートの割合でＮＺＣＹＭアガロースを収容した１５ｃｍプラスチックプトリ皿上のＥ、　ｃｏｌｉ株ｃ６００上にプレートされる。これら組換えファージは前述の４５−マープローブを使用してＷｏｏの方法（１９７９）によってスクリーニングされ、プローブとして、前述のように３２ｐで放射標識される。フィルターが次に５　Ｘ５ＳＣ，５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ、　０．１％ＳＤＳ、および５　Ｘ　１０６ｃｐｓ／ａｅプローブ中で、４５℃において１６時間ハイブリッド化され、５　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中５０℃中塊０され、そして高輝度スクリーン（デュポン　ライトニンクープラス）を使用するオートラジオグラフィーへかけられる。オートラジオグラフィーは、種々の程度で４５−マーとハイブリッド化したファージを明らかにする。フィルターは次に０．５　Ｍ　ＮａＯＨ中で変性され、１．０１’ｌ）リスｐｎ７．５．　１．５ＭＮａＣ１！中で中和され、そしてハイブリッド化および洗浄温度が３７℃であるほかは４５− マーについて記載したとおりに１５−マーヘハイブリッド化する。両方のプローブへハイブリッド化された一つのファージを元のプレートから取り、そして１００ｐｆｕをプレートし、熔菌斑を前記のように１５−マーをプローブとして用いてスクリーニングする。ＰＢ　３４と命名された陽性ファージをプラグとして取り、そして前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　６Ｆ）−６６頁に記載されているようにプレート熔解質をつくるために使用した。小規模のＰＢ３４ＤＮＡの単離が前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　３７１−３７２頁記載の操作を使用して達成される。こＤＮＡの１０μｌを制限酵素Ｈａｅｍで切断し、次に子ウシアルカリ性フォスファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を使用してラオスファターゼ処理された。フェノール抽出した後、Ｓｍａ　Ｉ切断Ｍ１３ｍｐ８　ＤＮＡを添加し、溶液を０．２ＭＮａαとし、そして２容積のエタノールの添加によって核酸を沈澱する。沈澱したＤＮＡは遠心によってペレット化され、そしてリゲーション混合物２μβ中に再熔解され、そしてＤＮＡは２３℃で３０分間リす−トされ、リガーゼｆｆｔ　ｆｔｉ液で５０μ！へ希釈され、さらに３時間リゲートされる。この反応物５μβがＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０１／ＴＧ　１株を形質転換するために使用される。細胞は、Ｓ０８Ｍ培地５０−中（ＳＯＢＭは、トリプトン２％、イースト抽出物０．５％、　ＮａＣｆ１！０．１Ｍ、　ＫＯＨｏ、１１　ｇ／１２．　２０　ｍｌｌ　ＭｇＳＯ４である）３７℃で０．Ｄ、（２）　０．５まで発育させることによって形質転換に対して適応させる。細胞は２５００ｒｐｍにおいて１０分間４℃において遠心することによってペレット化される。、細胞は、１００ｍＭＲｂα、４５　ｍＭＭｎＣｌｚ、５０　ｍＭＣａαｚ、１０ｍＭＭＥｓカリウムｐＨ６，４（ＭＥＳ＝メチルエタンスルホンＭ）３．５ｄ中に再懸濁される。適切な細Ｆａ　２００μＰがリゲーシジン反応物５戚中に含まれるＤＮ　Ａ　Ｔ：　０　’ｃにおいて３０分間形質転換される。細胞は次に４２℃で９０秒ヒートショックされ、その後静止ＪＭ　１０１／ＴＧ　１細胞１００μｌを含有する０、８％アガロース／ＳＯＢＭ　４　ａｅが添加され、１０　ｃｍ　ＳＯＢＭ７ガロースペトリ皿上にプレートされる。１５−マーヘハイブリフド化する、ＰＢ　３４からのＨａｅ　ｍ断片を含んでいるサブクローンが、前出のＢｅｎ　ｔｏｎおよびＤａｖｉｓの操作を使用してスクリーニングすることによって同定される。このクローンが単離され、鋳型として使用するために調製される。３４−）ＩＩと命名された、このクローン中に存在するＨａｅ　ｍ断片のＤ　Ｎ　Ａ配列が第５図に示されている。Ｍ　１３鋳型ＤＮＡは感染させた細胞を３７℃で５時間生育することによって調製される。細胞はベフクマンマイクロフユージ中で１０分間遠心することによってペレット化される。上清１−０戴（ビールスを含んでいる）を除去し、２０％ポリエチレングリコール、　２．５Ｍ　ＮａＣｌ２００μｉを加える。このサンプルを次に室温で１５分間インキュベートし、ベソクマンマイクロフユージ中で５分間遠心する。ペレットをＴＥ１００ｄ中に熔解し、４　Ｍ　ＮａＣＨａＣＯＯｐＨ４，５の７．５μＥを加え、そしてサンプルをフェノール−クロロホルムｔｉｔ混合物で２回、そしてクロロホルムで１回抽出する。単一ストランドのファージＤＮＡを次にエタノール２容積の添加によって沈澱させる。沈澱したＤＮＡはベックマンマイクロフユージ中の遠心によってペレット化し、１１１１ＭトリスｐＨ８，０、０，１ａｌＭ　ＥＤＴＡ３０μｌ中に溶解する。ＤＮＡ配列決定は、１５− マーをプライマーとして使用し、ジデオキシ鎖成端技術によって実施する。Ｓａｎｇｅｒｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　［１，Ｓ、Ａ、７４　：５４６３　（１９７７）参照。第４図および第５図に示した配列中に含まれる、観察された配列は、第１に表した６９　Ｋｄ断片のアミノ末端配列中のフェニルアラニン２からグルタミン１５までの区域によって囲まれた同じ１４個のアミノ酸を含むので、該サブクローンがブタＡＨＦエクソンを含んでいることを確認した。それ以上の確認は、３４−Ｈｌベクター中のポリリンカーの隣接点にユニバーサルプライ７　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）をプライミングすることにより、３４−Ｈｌベクター中のＨａｅ　ｍインサートの５°端から配列決定することによって得られた。また、３４〜Ｈ１と命名されたこのクローンからのインサートは、ＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ１および旧ｎｄｎｌで制限し、子ウシアルカリ性フォスフプクーゼでフォスファターゼ処理し、そしてＥｃｏ　Ｒ１，）ｆｉｎｄ　ｌｌ！開裂Ｍ１３ｍｐ９　ＤＮＡヘリゲートすることにより、Ｍ１３＋ａｐＱ中へ再クローンされた。ユニバーサルプライマーに関してＨａｅ　ｍセグメントの反転を含有するこのクローンも前述のように配列決定された。インサー）３４−Ｈｌのすべてについての得られた配列データは第５図に示されている。この配列は、このサブクローンは、ヌクレオチド１６９から２６７までにおいて、６９Ｋｄ断片（第１図）のフェニルアラニン２からアルギニン３１までの少なくとも３０個のアミノ酸をコードできるブタＡ　ＨＦ遺伝子のエクソンを含有していることを確認する。成端コードンはすべての三つの読み取りフレームにおいてヌクレオチド２６７　（第５図）から下流に発見することができ、そして一致した５”継木部位配列もヌクレオチド２６６−２６７間の該区域に発見されるので、アルギニン３１はイントロンを境界するように見える。さらに、下流ＤＮＡによってコードされるであろうアミノ酸配列は、ブタＡＨＦの６９Ｋｄ断片に観察されるそれと完全に異なっている。ＰＢ３４ＤＮＡはＢａ−旧で切断され、そしてアガロースゲルを通して電気泳動され、そしてゲルを５μｇ　／　ｐＪ！臭化エチジウム中で染色した後紫外線によって可視化された。約６．６ｋｂ、６．Ｏｋｂ、１．８ｋｂの三つのインサートが観察された。ゲル中のＤＮＡは前出Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、　３８３ −３８６頁に記載のようにニトロセルロースへ移された。口過物の１５−マーへのハイブリッド化およびオートラジオグラフィーが前述のように実施れさた。オートラジオグラフィーは、６．０ｋｂバンドが１５−マープローブへハイブリッド化されたＡＨＦ遺伝子断片を含んでいることを示した。このように、ブタＡＨＦをコードする遺伝子の部分がはじめて単離され、同定された。バクテリオファージラムダ組換えクロンＰＢ３４は、ＡＴＣＣ４００８７としてアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。実施例４　ヒトＡＩ（Ｆ゛　−の亡　。Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１５　：　６７８　（１９７８）によって記載されたヒトゲノムライブラリーが、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＬＥ　３９２株（一般に入手可能）を６Ｘ１０５ｐｆｕで感染させ、そして１５　ｃｍ　ＮＺＣＹＭ寒天プレート上に２０，０００　ｐｆｕ／プレートの密度でプレートすることにより、ヒトＡＨＦ遺伝子についてスクリーニングされる。これらファージは前出のＢｅｎ　ｔｏｎおよびＤａｖｉｓの操作を用い、実施例３に記載した６、０ｋｂブタブタＦ断片でスクリーニングし、プローブとして二フクトランスレーションによって３２ｐで標識される。強いハイブリッド化信号を示すファージを採取し、約１００　ｐｆｕ／　１０ｃｍプレートでプレートし、一方のプローブとして放射標識した４５−マーを、そして他方のプローブとして６．０　ｋｂ　Ｂａａ旧断片を使用し、前述のように二重にスクリーニングする。両方のプローブへハイブリッド化する）ＩＨ−２５と命名されたファージが同定され、プレートストックがつくられ、そして前述のようにラピッドプレツブＤＮＡが調製される。ファージＤＮＡがＳａｕ　３Ａ　１で切断され、子ウシアルカリ性フォスファターゼでフォスファターゼ処理され、フェノール抽出され、そしてＢａｇ　Ｈ１切断Ｍ１３ｍｐ８　ＤＮＡの２０ｎｇと共沈される。沈澱したＤＮＡは遠心によってペレット化され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含有するりガーゼ緩衝液２μ Ｅ中に再溶解される。リゲーションは１６℃において２分間実施され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液５０μ！へ希釈され、１６℃でさらに３時間インキュベートされる。この反応混合物５μｌが実施例に記載したようにＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０１／ＴＧ　１株を形質転換するために使用される。溶菌斑がＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ操作を使用し、そして放射標識した１５ −マーでプローブすることによってスクリーニングされる。ハイブリッド化を示す２５−３ｌと命名されたファージ熔菌斑が単離され、そして単一ストランドファージＤＮＡが前記のようにＤＮＡ配列化鋳型として使用するために調製される。配列化は、プライマーとして１５−マーを使用し、前出Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、にょって記載されたジデオキシ鎖成端技術を使用して実施され、そして第６図に示す情報ストランドＤＮＡ配列を与える。このｇＢで配列化された８４ヌクレオチドは、ブタＡＨＦの相同区域と８５％の相同を示した。第１図に示したブタＡＨＦ６９Ｋｄ区域２−１６と、第６図のヒトヌクレオチド配列から推論した対応する区域との間には、たった１個のアミノ酸の違いがある。この高い程度の相同は、組換えファージＨ）ｌ−２５のＤＮＡはＡＨＦ遺伝子から発散することを示す。このように、ヒトＡＨＦ遺伝子のためのエクソンがはじめて単離され、同定された。バクチリオファシラムダ組換えＨＨ−２５は、寄託番号ＡＴＣＣ４００８６としてアメリカン、タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。実施例５　ＡＨＦ　：　に−　る　の■上に記載したブタおよびヒトＡＨＦエクソンは種々の機能のために有用であり、その一つは生体内においてＡＨＦ合成部位である組織の同定を許容するスクリーニング剤としてである。ＡＨＦの天然の発現の途中に生成されるｍＲＮＡに対する正確な相補体としてエクソンを使用することを基礎とする多数の方法が利用可能である。このスクリーニング操作において、生体の各種の部分からの組織がその内に含まれるｍ　ＲＮ　Ａを放出するように処理され、そしてＡＨＦに対するエクソンを含んでいるＤＮＡ断片へハイブリッド化され、そしてもしｍＲＮＡの分子がそのエクソンへハイブリッド化すれば、該ｍＲＮＡの源である組織がＡＨＦの源である。１、スフ１−ニング品腎臓、肝臓、すい臓、ひ臓、骨髄、リンパ節等を含む、種々の４管からのブタおよびヒト組織が、その記載を参照とじこ〜に取り入れるＣｏｘ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ−＋　１２Ｂ　：　１２０　（１９６８）によって記載されたグアニジン塩酸塩抽出により、いくつかの修飾を加えて調製される。要約すれば、組織は、８Ｍグアニジン塩酸塩（またはその記載をこ＼に参照として取り入れたＣｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８　：　５２９４　（１９７９）によって提案された４門グアニジンイソチオシアネート、また前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　１８９頁その他を参照）、５０ＩＩＩＭトリス（ＰＨ７，５）　、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ中へ体外移植し、最高スピードで１分間オムニミキサー（Ｓｏｒｖａｌｌ　）中でホモジナイズする。ホモジネートを５ｏｒｖａｌｌ　ＨＢ−４０−ター中で５分間５０００ｒｐｍで清澄化し、ＲＮＡを０．５容積のエタノールの添加によって沈澱する。該ＲＮＡは溶解し、水に熔解する前に６Ｍグアニジン塩酸塩からさらに３回沈澱する。この給源からのメツセンジャーＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ　）セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）上のクロマトグラフィーによってエンリッチされる。このｍＲＮＡは次に、前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　２０２−３頁に記載されているように、ホルムアルデヒドを含有するアガロースゲルを通る電気泳動へかけられる。ゲル中のｍＲＮＡは次にニトロセルロースフィルターへ移される（前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　２０３−４頁）。このようにして得られたｍＲＮＡは、上で得られた放射標識したブタまたはヒトエクソンＤＮＡでハイブリッド化され、ハイブリッドの存在がオートラジオグラフィーによって検出される。放射性信号は、ｍＲＮＡの組織源は体内におけるＡＨＦ合成の源であることを指示する。代わりに、ｍＲＮＡはＳ１保護スクリーニング法によってスクリーニングされることができる。Ｓ１ヌクレアーゼは、単一ストランドＤＮＡを加水分解するが、しかしハイブリッド化したｍ　ＲＮ　Ａ　／　Ｄ　Ｎ　Ａのような塩基対合したヌクレオチドは加水分解しない酵素である。このため、アクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィー後の放射性バンドの存在は、ＡＨＦエクソンに対応する単一ストランドＤＮＡが相補性ｍＲＮＡ、すなわちＡＨＦに対するｍＲＮＡによって保護されていることを示す。このため、このｍ　ＲＮ　Ａ　（７）源であった組織は生体内におけるＡＨＦの合成部位である。このスクリーニング方法は上に記載したスクリーニング方法よりもいくらかはもっと感受性である。該ｍＲＮＡに対し相補性である、単一ストランドの放射標識されたＤＮＡよりなるプローブが、ブタゲノムサブクローン３４−８１のＤＮＡ合成を開始するためＭ１３のユニバーサルブライマーを使用して合成される。この反応は、５０ｍＭトリスｐＨ７，４，５ｍＭ　ＭｇＣｔ！ｚ。１１２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｎａ０ｉ！、ユニバーサルプライマー１０門ｇ、　３４−５３鋳型ＤＮＡ２００　４００門ｇ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）のＨｅｎｏ−断片の溶液１００．ｊ！中で実施される。反応液は２３℃で６０分間、７０℃で１０分間インキュベートされ、Ｐｓｔ１５０単位が添加され、追加の６０分間インキュベートされる。反応はフェノール／クロロホルム抽出によって停止され、ＮａＣ７！が０．２門へ添加され、そして次に１００％エタノール２容積で沈澱される。沈澱したＤＮＡは遠心によりベレット化され、２０％シュークロース、５０　ｍＭ　ＮａＯＨ，０，１％クレゾールグリーン中に再熔解され、そして次に５　Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＯＨ，１０ｍＭＥＤＴＡ中の２％アガロースを通して電気泳動される。得られる単一ストランド断片はオートラジオグラフィーによって探索され、バンドが切除され、そしてＤＮＡが透析チューブ中の電気溶離によって単離される。サンプルｍＲＮＡは、上述のグアニジン塩酸塩法によって肝臓、ひ臓等の組織から調製される。次にプローブは、５０％ホルムアミド、０．４　Ｍ　ＮａＣ＋！、４０　ｎ＋Ｍ　ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホンｆｌｆｔ）　）　ｐＨ６，５，１ｍＭＥＤＴＡ、５−５０ｐｇ　ｍＲＮＡ、１５．ｃ＋ｊ！中２ｐｇの標し％ＤＮＡ中で、サンプルｍＲＮＡ　（オリゴ（ｄＴ）クロマトブラフィーエンリンチステップ、から得られた）へハイブリッド化される。ハイブリッド化は、冷たいＳ１ヌクレアーゼ緩衝液２００μＮ（０，２５？ＩＮａＣｊ！、０．３Ｍ　ＮａＣＨａＣｏｏ、　ｐＨ４，５）　、１ｍＭ　ＺｎＳＯ４，５％グリセロール。Ｓ１ヌクレア一ゼ１０００単位の添加によって停止される。サンプルをフェノール抽出し、イーストｔＲＮＡｌＯμｇと共にエタノール沈澱し、そしてＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ、　ＰＮＡＳ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４　：　５６０　（１９７７）に記載した５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルを通す電気泳動にによる分析へかける。実施例６　＝’１”ＡＦＨｍＲＮＡ　え　ξｔ：　ｈ　Ａ　ＨＦ　ｘり７７旦凡人■使朋ｍＲＮＡの源である組織が同定されれば、該組織からのＡＨＦｍＲＮＡが抽出され、ｃＤ、ＮＡライブラリーを構成するために使用れる。このｃＤＮＡライブラリーは、以下に記載するようにゲノムクローン中に含まれたイントロンなしに、ＡＨＦのアミノ配列をコードする全長さのｃＤＮＡクローンを同定し、構成するために用いられる。その後で、ＡＨＦタンパクをコードするｃＤＮＡが、ＡＨＦ発現のため適当な宿主中の適当な発現ベクター中に挿入される。ヒ）ＡＨＦは血友病治療または他の用途のため大きい需要があるノテ、ｔニドＡＨＦ　ｃＤＮＡの調製を記載する。１、　ヒトＡＨＦのだめのｍＲＮＡの　′。ＡＨＦ合成に責任あるヒト組織からのｍＲＮＡは、前に記載したようにＣｏｘにより記載され、Ｃｈｉｒｇｗｉｎによって修飾されたグアニジン塩酸塩法によって調製された。オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーカラムから得られたｍ　ＲＮ　Ａ（７１＋し以上（７）分画ハ、１０ｍＭ）　’Ｊ　ス−ＨＣｅ　（ｐ）１７．４）　、１門ＭＥＤＴＡおよび０．２％ＳＤＳを含む５−２０％シュークロース勾配上にベックマン５Ｗ２８中において２４時間２２．ｏｏｏｒｐＩｌｌで遠心することによる沈澱によって得られる。分画（１，０ｄ）が集められ、酢酸ナトリウムが０．２Ｍまで添加され、そして分画は水に熔解する前に２回エタノール沈澱された。分画したＲＮＡ０サイズ分布は、２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１、４％アガロースゲルを通す電気泳動によって決定された。２８より大きいＳ　（Ｓｖｅｄｂｅｒｇ）価を有するｍＲＮＡ沈降物を二重ストランドｃＤＮＡの合成のためにプールする。このＲＮＡの１０ｐｇを１０ｍＭメチル水銀ハイドロオキサイド１ｏμｌ中において室温で変性する。１４０＋ｎＭの２−メルカプトエタノールをメチル水銀ハイドロオキサイドを不活性化するために添加する。次にＲＮＡは、１４０ｍＭ　ＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣＥ　（ｐＨ８，３、４２℃）、各デオキシヌクレオチドトリフオスフェート１ｍＭ、２００μｇ／ｖｄｌオリゴ（ｄＴ）　１２−１８．１０ｍＭ　ＭｇＣＪ！ｚ　、および０．１　、ｃｌｃｉ　３２ｐ−ｄＣＴＰ　／ｍｊ！を含んでいる５０μ ｌへ希釈される。これら反応は、ＡＭＶ逆トランスクリプターゼ（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　）　１７単位／μβの３ｐｌを添加した後、４２℃で１時間実施サレル。反応ハ０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐ　Ｈ８゜０）を２０ｍＭまで添加することによって停止される。得られる混合物はフェノール／クロロホルム（１：　１）の等容積で１回、そしてクロロホルムで１回抽出される。次にサンプルは１０ｍＭ）リス−〇（ｊ！（ｐＨ８，０）　、１００ｍＭ　Ｎａ０ｉ！、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア）５献上でクロマトグラフィーされる。空容積が集められ、そして核酸（ＲＮＡ／ＣＤＮＡハイブリッドを含んでいる）がエタノール２．５容積の添加によって沈澱される。好ましくは、上の操作と組合せて、Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、ｔ　Ｎａｔｕｒｅ＋　３０３：　８２１　（１９８３）に記載されているように、ＡＨＦエクソンオリゴヌクレオチドセグメントも逆転写を開始するためオリゴｄＴｒの代わりに使用される。ＲＮＡ−ｃＤＮＡは脱イオン水３５ｐｌ！中に溶解され、１００ａ＋Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ６，８）　、１００μＭ　ｄＣＴＰ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１−Ｍ塩化コバルトを添加し、そしてデオキシチジルターミナルトランスフエラーゼ（ｐ）ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ１ｃａｌｓ　）　１０単位を加え、反応物を３７℃で３０秒間インキュベートすることによって酵素的に尾部処理される０反応は０．２５？ＩＥＤＴＡを１０１まで添加することによって停止される。トリス−Ｈ（ｊ！　ＣｐＨ８，０）を３００ｍ？Ｉまで添加し、そしてサンプルはフェノール／グロロホルム（１：１）の等容積で１回、そしてクロロホルムの等容積で抽出される。核酸はエタノール２．５容積の添加によってこの生成物から沈澱される。６０尾部処理されたハイプリント分子は、１０ｎＭＭＣ！！中１７０μｇ／ｄオリゴ（ｄＧ）　１４−１８セルロースで４３℃にて１０分間、そして２３℃にて１０分間アンニールされる。この反応生成物は次に１１００１１Ｉ硫酸アンモニウム、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００ａＭｎ１００ａ　、１００μｇ／戴ウシ血清アルブミン（シグマ、コーンファクター■）、およびｌＯＯμｈニコチナマイドアデニンジヌクレオチドを含む１００μ！へ希釈される。２番目のストランドのｃＤＮＤＮＡは、ＲＮアーゼＨ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　１単位、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ１単位、およびＤＮＡポリメラーゼ１１０単位を添加することによって開始され、そして１６℃で１２時間インキュベートされる。次にサンプルは前に記載したようにセファローズＣＬ−４Ｂ上でクロマトグラフィーされる。二重ストランドＤＮＡはエタノール沈澱され、そしてＲＮＡ−ｃＤＮＡハイプリント尾部処理について記載したようにｄＣＫ部処理される。２、ヒトＡＨＦ　ＤＮＡについてスフ１−ニング上に記載したようにして得られたｄＣ尾分処理された二重ストランドｃＤＮＡは、１０ＩＩＩＭ）リス−Ｈα（ｐＨ８，０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。１００ｍＭ　ＮａＣ７！中３７℃で２時間等モル量のｄＧ尾公娼理ｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）で７ン二−ルされる。７ン二− ルされたキメラ様分子はバクテリア形質転換に使用するまで一２０℃で冷凍される。バクテリア形質転換は、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１株（ソース）を使用して実施される。細胞（５０ｄ）は６００ｎ＋ａにおける光学密度０．２５まで生育される。細胞は２５００ｒｐ＋ａにおいて１２分間遠心することによって濃縮され、無菌１００ｍＭ　ＣａＣｌ２中で洗浄され、そして前に記載したように遠心によってペレット化される。細胞は無菌１００ｍＭ　ＣａＣ１ｚ中に再懸濁され、そして４℃に１２時間保たれる。アンニールしたキメラ様分子は、適切な細胞２００μ！当たり５ａｇの二重ストランドｃＤＮＡの比で４℃において３０分間インキュベートされる。次にバクテリアは４２℃２分のヒートショックへかけられる。Ｌ−ブロス１．０淑が加えられ、細胞は３７℃で１時間インキュベートされる。細胞は次に５μｇ／ｍｌテトラサイタリンを含有するＬＢ−寒天プレート上にプレートされる。ヒトＡＨＦクローンは、その記載を参照とし、てこ〜に取り入れたＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ　ＰＮＡＳ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２　：　３９６１　（１９７５）のコロニーハイブリディゼイション法を使用で同定される。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｌ−ブロス１５μｇ／戴テトラサイクリン寒天プレートの上に重ねたニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ　）上にプレートされる。コロニーは３７℃で一夜生育され、次にフィルターは無菌−ｈａｔｍａｎ　３Ｍペーパー上に置かれる。次にあらかじめ湿したニトロセルロースフィルターをマスターフィルターに対して押し付け、これらフィルターを１８ゲージ針を使用して止める。レプリカフィルターを次に３７℃においてＬＢ−テトラサイクリンプレート上でコロニーが１〜２０の直径に達するまで発育させる。次にフィルターは１５０μｇ／ｄクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートへ移され、３７℃で１６〜２４時間インキュベートされる。次にフィルターが除去され、０．５　Ｍ　ＮａＯＨで室温で５分間飽和させたＷｈａｔｍａｎ　３Ｍペーパー上に置かれる。次にフィルターはＩＭ　ｌ−リス− ＨＣ７！　（ｐｌ＋７．５）　、１．５ＭＮａ（ｊ！で飽和させたＷｈａｔｍａｎ　３Ｍ上に、そして次に２ｘ積標準塩クエン酸塩（ＳＳＣ）で飽和させた讐ｈａｔｍａｎ　３ＦＩＩ上に置くことによって中和される。ＳＳＣ（ｌｘ）は０．１５　Ｍ　ＮａＣ１，０゜０１５４クエン酸ナトリウムである。フィルターを風乾し、減圧下８０℃で２時間焼付ける。フィルターのプレハイブリディゼイションは、１０ＩＩＩＭトリスーＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）　。１ｍ！Ｉ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で３０分間、そして７ｘ　ＳＳＣ。５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　（ｌｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは０．０２％ポリビニルピロリジン、０．０２％フィコル、　、０．０２％ウシ血清アルブミンである）、１００μｇ／ｄ変性サケ精子ＤＮＡ、および０．１％ＳＤＳ中３０分間で実施される。上で記載したように調製した３２ｐ標識ヒトエクソンＤＮＡが１１０６ｃｐ／ｍ１２まで添加され、ハイブリディゼイションが３７℃で１２〜１６時間実施される。次にフィルターは７　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳの数回の交換で３７℃において１〜２時間洗浄される。次にフィルターは風乾され、コダックＸＡＲフィルムおよびＤｕｐｏｎｔ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ高輝度スクリーンを使用してオートラジオグラフィーへかけられる。バンクグランド上にハイブリディゼイション信号を示すコロニーが、プラスミドＤＮＡのラビットプレフプ精製のため、テトラサイクリン５μｇ／ｍＲを含むし一プロス中で生育される。プラスミドＤＮＡは、その記載を参照とじてこ＼に取り入れたＨｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１１４　：　１９３　（１９８１）の方法によって精製される。このＤＮＡの部品標品を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで開裂し、そして断片を１％アガロース／ＴＢＥゲルを通して電気透析し、そしてその記載をこ＼に参照として取り入れたＥ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。 …ｏ１．９８　：　５０３　（１９７５）の操作に従ってじみをつける。ニトロセルロースフィルターは、コロニーハイブリディゼイションについて記載したように、放射標識したヒトＡＨＦエクソンＤＮＡでハイブリッド化される。ＡＨＦエクソンＤＮＡへハイブリッド化するＰｓｔｌインサートを含んだプラスミドがＤＮＡ配列分析に使用される。配列決定のため、プラスミドＤＮＡ　（培養物０．７５ｄから前出Ｈｏ１ＩＩｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、の操作により精製）が制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３ａｌで完結まで消化される。３４−５ｌであると同定された生成したＤＮＡ断片は、第４図に図示したＤＮＡ配列を持っている。このＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出後エタノール沈澱され、１０μｊ２ＴＥ（１０ｍＭ）リス−Ｈα（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ’ｚ　、１０ｄジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰおよび過剰の７４ＤＮＡリガーゼ１００μ！中において、Ｂａｍ　１１開裂Ｍ１３　ｌｌ１ｐ　９の複製形ＤＮＡとリゲートする。リゲーションは１５℃ において２〜４時間実施される。このリゲーション反応物５μｌは、前記したＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ／ＴＧＩ株２００／７ｘを形質転換するために使用される。組換えは、Ｄａνｉｓ　ｅｔａ＋、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　３６　：　４１３　（１９６８）によって記載されているベーターガラクトシダーゼ活性のための指示としてＸ−ｇａｌを含んでいるＬＢ寒天プレート上で生育する時白い熔菌斑として同定される。ヒトエクソンへハイブリッド化する組換えファージ包囲配列は、その記載をこ− に参照として取り入れたＢｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ１９６　：　１８０　（１９７７）の操作により、放射標識したヒトＡＨＦエクソンをプローブとして使用して同定される。ハイブリデイゼイション信号を示す熔菌斑を取り、Ｌ−ブロス１，５ｄ培地中で生育させる。これら培養物から調製した単一ストランドファージＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプライムＤＮＡ合成反応に鋳型として使用される。配列化はジデオキシ鎮成端方法を使用して実施される。例えば、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　ＩＪ、Ｓ、Ａ、　７４　：　５４６３　（１９７７）参照。ヒトＡ）（Ｆ組換え型はそれらのヌクレオチド配列をヒトＡＨＦのヒトエクソン配列から既知のそれと比較することにより同定される。３、ブ　ＡＨＦ　ｍＲＮＡヒトＡ　ＨＦ組換え型は、全くヒト組織ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーについて記載したように構成したブタ組織ライブラリーをスクリーニングするために使用される。見込みあるブタＡＨＦ組換えＤＮＡクローンは、先に記載したようにブタ３２　ｐ　標Ｆｉｋエクソン断片を使用し、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法によって同定される。プローブは、その記載をこ−に参照として取り入れたＲ４ｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１３３：　２３７　（１９７７）によって記載されたニック−トランスレーションによって３２ｐで標識したブタＡＨＦエクソンセグメントである。ハイブリディゼイションを示すコロニーは前記したラピフドプレフブブラスミドｌｉ製目的のために生育される。プラスミドＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで開裂され、１％アガロース／ＴＢＥを通して電気泳動され、Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　（１９７５）の操作によってじみをつけられる。しみは３２ｐで標識したニックトランスレートされたブタＡＨＦ組換えＤＮＡとハイブリッド化される。全長さのクローンは、この分野でよく知られているように（“遺伝子ウオ−キング）、例えば両方のクローンに共通な制限酵素部位において重複するクローンからのＤＮＡ断片をリゲートすることにより、慣用の態様で構成される。４、スーープ２　たは３１′の　のクローンのｉ既存のクローンの５°端とｍＲＮＡの５°端との間の距離は、その配列が既存のＡＨＦクローンの５°　（アミノ末８）区域から由来するオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、Ａｇａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌ、、“Ｊ、Ｂ、Ｃ，”韮（２）　：　１０２３−１０２８　（１９８１）に記載されたプライマー延長技術によって分析することができる。もしこの操作を用いて発達したゲルが二辺上の転写を示せば、最も強いバンドが全体のｍＲＮＡ転写を表しているものと考えなければならない。しかしながら、５°未はん訳配列の長い区域を含んでいる多数のｍＲＮＡが存在する。このように、ヒトＡＨＦ　ＤＮＡの発現は完全なｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの獲得次第であってはならない。例えば、配列分析によって、メチオニンコードンと、続いて既知の真核タンパク分泌信号と類似または同一であり、そして残りのコードンを持つフレーム中にある配列の存在を示すクローンが得られる。形質転換および発現は、予期されたサイズでありそしてポリ　（Ｔ）３°末端を含をするメチオニン分泌信号配列を含有するクローンについて実施しなければならない。 −を使用して同定されることが好ましい。ＡＨＦ合成に責任あるヒト胎児肝臓組織からのｍＲＮＡが、実施例５のセクションｌにおいて述べたＣｏｘにより記載され、Ｃｈｉｒｇｗｉｎｅｔ　ａｌ、によって修飾された、グアニジン塩酸塩法によって調製された。一番目のストランドのｃＤＮＡは、前出実施例６、セクション１に記載した操作によってポＩＪ　Ａ＋胎児肝臓ＲＮＡｌ０μｇから合成された。詳しくは、このＲＮＡｌ０Ｉｇは１０ｍＭメチル水銀ハイドロオキサイド１０μβ中で室温で変性された。２−メルカプトエタノール１４０１がメチル水銀ハイドロオキサイドを不活性化するために添加された。次にこのＲＮＡは、１４０ｍＭ　ＫＣｆ！、１００ｍＭ　）リス −１（Ｃｉ！　（ｐＨ８，３、４２℃）、各デオキシヌクレオチドトリリン酸Ｉｎ＋Ｍ、２００Ｉｇ１ｍＲオリゴ（ｄＴ）　１２−１８．１０　ｍＭ　Ｍｇα２Ｉおよび０．１μＣ４３２ｐ−ｄＣＴＰ／ｍを含んでいる５０μ！へ希釈された。これら反応はＡＭＶ逆トランスクリブタブタ（Ｌｉｆｅ　５ｃｅｉｅｎｃｅｓ）　１７単位／μｅの３μβを添加した後、４２℃で１時間実施された。プライマー延長したライブラリーの１番目のストランド合成のため、独特な相補性３８マーの２００ピコグラムがＣＨ３ＨｇＯＨ変性ステップに含められ、そして反応物は１４０ｍＭベーターメルカプトエタノール、０．７Ｍ　ＭＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ）リス−ＨＣ！！　（ｐＨ８゜３．４２℃）　、　Ｉ？Ｎアーゼ（Ｂｉｏｔｅｃ）　１単位／μβとなし、５０℃で２分間および４２℃ で２分間インキュベートされた。次にこれは１４０ｍＭ　ＫＣＩ、１００ｍＭｌ −リス−ＨＣ１！（ｐＨ８，３、４２℃）、各デオキシヌクレオチドトリリン酸１ａＭ、１０ｍＭ　Ｍｇα２．および０．１μＣｉ　３２　ｐ−ｄＣＴＰ／μｌを含む５０μｌへ希釈された。反応物は１７単位／μＩ！ＡＭＶ逆）ランスクリプターゼ３μβの添加後、４２℃で１時間インキニーベートされた。１番目のストランド合成後、反応物は１０ｍＭ　ＭｇＯ！ｚ　、５０ｍＭトリスｐＨ７，４、５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、７．５　ｍＭ　ＮＨ４ＳＯ３＋各デオキシヌクレオチドトリリン酸２５０μＮを含む１５０ｐｊ！へ希釈され、そして２番目のストランドの合成がＲＮアーゼ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）１単位およびＤＮＡポリメラーゼ１４５単位の添加によって開始された。反応物は１６℃ で８時間インキュベートされ、そしてＥＤＴＡを２０ｍＭへ添加することによって停止され、水で最終容積２００μｅとされた。次にＥｃｏＲ１メチル化がＳ− アデノシルメチオニンを５０μｉへ、そしてＥｃｏＲ１メチラーゼ４０単位を添加することによって実施された。これら反応物は３７℃で１時間インキュベートされ、フェノール／クロロホルム抽出によって停止され、１０ｍＦｌ）リス−ＨＣ１（ｐＨ８，０）　、１　ｍ門ＥＤＴＡで平衡化されたアファデ・ノクスＧ５０を用いてクロマトグラフィーされた。空容積をプールし、エタノール添加によって沈殿させた。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子は、５０ｍＭ）リスｐｏｓ、ｓ、１いａＹＩ　ＭｇＣ１ｚ　、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ　ＮａＣ１，各デオキシヌクレオチドトリリン酸５０μｌ’！、　１００Ｉｇ／ｍＪ２卵アルブミンおよびＴ４ポリメラーゼ５単位を含有する２００μβ中において鈍末端化された。反応は３７℃で３０分間インキュベートされ、次にフェノール／クロロホルム抽出によって停止された。次に核酸はエタノール添加によって沈澱された。ＥｃｏＲｌ　″リンカー”　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）が次に、合計容積４５ｔｔｌ中において前出のＭａｎｉｔｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　２４３頁の標準条件で、鈍化ｃＤＮＡヘリゲートされた０反応はＥＤＴＡを１５＋＋＋Ｍへ添加することにより停止され、フェノール／クロロホルムで抽出された。核酸はエタノールによって沈澱され、遠心によってペレット化された。リンカ−処理されたｃＤＮＡは１００μｈ　トリス−Ｈα（ｐＨ７，２）　、５ｍＭ　７１ｇα２　、　５０ｍＭ　ＮａＣ＋　２００μＮ中に再熔解され、そしてＥｃｏＲｌ　３００単位で３７℃で２時間消化された。反応物は次にフェノール／クロロホルムで抽出され、１０１１Ｍトリス（ｐＨ８，０）１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．ＩＭＮａＯＨで平衡化されたセファロースＣＬ−４Ｂ上でクロマトグラフィーにかけられた。空容積中のｃ　ＤＮＡは集め、エタノールで沈澱し、遠心によってペレット化された。ＣＤＮＡは、１０１トリス−ＨＣ１！　（ｐＨ，０）　、１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ中に再溶解され、そしてＥｃｏＲ１開裂フォスファターゼ処理ラムダＣｈａｒｏｎ２１ａＤＮＡへ、ｃＤＮＡ対ベクターＤＮＡの種々の比率において標準リゲーション条件でリゲートされた。リゲートされたＤＮＡはパッケージされ、そして前出Ｍａｎｉｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　６Ｃ２５６頁に確立された操作を用いてタイターされた。該ライブラリーはプレートされ、そして前出ＢｅｎＬｏｎおよびＤａνｉｓに記載された条件のもとで３２９−標識ヒトエクソンＤＮＡを使用してスクリーニングされた。約１０゜０００塩基対にまたがる重複するクローンが得られ、そしてその実質的部分がヒトＡＨＦをコードする１本の長い開いた読取りフレームを解明するために配列化された。それから得られたヒトＡＨＦをコードする組換えＤＮＡヌクレオチド配列、および推論されたヒトＡＨＦのためのアミノ酸配列が第７図に示されている０重複するクローンが当分野で良く知られた慣用技術を用い、すなわち重複するクローンからのＤＮＡ断片を両方のクローンに共通な制躍酵素部位においてリゲートすることにより、ベクターｐＳＰ６４　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）中にアセンブルされた。ｐＳＰ６４−■と命名された、第７図に示したヌクレオチド配列を含んでいるｐＳＰ６４組換えクローンは、アメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。実施例７　ヒト　たはブ　ＡＨＦのこの実施例は、実施例６の方法によって得られた全長さのクローンを同時形質転換系に用いる、ＡＨＦの発現を意図する。１、ＡＨＦ形質転換ベクターを得るための直接法を以下に記載する。ｐＣＶＳＶＬプラスミドをＰｓｔｌで部分的に消化し、消化物をゲル電気泳動上で分離する。可視化後、全長さのプラスミドに相当する線状ＤＮＡ１ｆｒ片をｐＣＶＳＶＬ−Ｂｌとして単離する。ＡＨＦのためのｃＤＮＡ実施例５のクローニングベクターからＰｓｔＩによる部分消化によって救出する。部分的消化物をゲル電気泳動上に分離し、そして全長さのｃＤＮＡの分子量に相当するバンドを単離する。ｐＣＶＳＶＬ−ＢｌをこのＤＮＡ断片でアンニールし、１５℃においてＴ４　リガーゼでリゲートし、Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｈａ　１０１株中へトランスフェクトし、トランスフォーマントをテトラサイタリン耐性について選択する０選択したＥ、ｃｏｌｔ　）ランスフォーマントをテトラサイクリン存在下に育成する。プラスミドｐＣＶＳＶＬ−Ｂｌａが慣用方法で回収される。該プラスミド中のｃＤＮＡの適切な配向は、適当なエンドヌクレアーゼによる不斉消化により慣用態様で決定することができる。２、　ロ　５−　：゛　お　び上ブラスミｔ’ｐｃＶｓＶＬ−ＡｌａもしくはｐＣＶＳＶＬ−Ｂｌａと、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ　＃　３　（前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）とを混合しく５０βｇ）ＩＰおよび０．５ＭｇｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ＃３　）　、そしてＮａ０Ａｃ　ｐＨ４，５を０．３Ｍへそしてエタノール２．５容積の添加によって再沈澱する。沈澱したＤＮＡを風乾し、２Ｘ　ＨＥＢＳＳ　（０，５ａｅ）中に再懸濁し、そして記載（前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔａｌ、）のように０．２５　Ｍ　ＣａＣ１ｚ　（０，５ｍ）と激しく混合する。カルシウム−フォスフニー）− ＤＮＡ沈澱を室温で３０分間落着かせ、そしてＣＨＯＤυ■−Ｂ１細胞（Ｃｈａｓｉｎ　およびＵｒｌａｕｂ　１９８（Ｌ　コロンビア大学から入手可能）へ適用する。これらの細胞の発育および維持は記載されている（前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、およびＣｈａｓｉｎおよびＵｒｌａｕｂ、　１９８０）。このＤｌｌＫＫ−Ｂｌ細胞をトランスフェクシタン前に５ｘｌＯ’／１０１皿で２４時間副次培養する。室温で３０分間インキュベートした後、１０％ウシ胎児血清を含む培地を適用し、細胞を３７℃で４゜５時間インキュベートする。該培地は次に、１０％ウシ胎児血清、チミジン、アデノシンおよびデオキシアデノシン１０μｇ　／ａｅ、それにペニシリンおよびストレプトマイシンを含むａ−培地２戴の単層から除去される。２日後該細胞は１：１５の割合で１０％透析ウシつ児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含み、ヌクレオチドを欠くａ −培地中へ副次培養される。細胞は次に４〜５日後同じ培地を再び供給される。選択培地中への副次培養１０〜１２日後、コロニーが出現する。ＡＨＦｉ！！伝子のメトトレキセート（ＭＴＸ）選択および検出、選択遺伝子増幅はＡｘｅｌ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許第４，３９９，２１６号、または前出のＫａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、に従って実施される。ＡＨＦ収率は、ＤＵＫＥ−８１Ｂｌ胞の代わりに、永久細胞ラインＥＡ、　ｈｙ９２６　（Ｅｄｇｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ−＋　”Ｐｒｏｃ　Ｎａ工し」二重　Ｓｃｉ、　”　８０　：　３７３４−３７３７（１９８３）　）を同時形質転換することによって改良し得る。この場合同時形質転換する選択遺伝子は、Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、”　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌＧｅｎｅｔｉｃｓ　”　４　：　４９９−５０８　（１９８２）に記載された優性ＤＨＰＲ遺伝子でなければならない。さもなければ、同時形質転換および培養は実質上本明ｍ書のどこかに述べているとおりである。３、人且旦旦生産セクション２において選択されたＡＨＦ生産ＣＨＯトランスフォーマントは、標準技術を使って種カルチャー中に維持される。該カルチャーは慣用培地中で細胞を培養することにより１０βまでスケールアップされる。この培地はＭＴＸを含有する必要はな（、選択遺伝子復帰突然変異株を除去するように、ヌクレオチドを含有しないであろう。培養上清は、血景サンプルについて使用するための標準アッセイ法（ファクター ■欠乏血景の針面時間の短縮）に従って凝血活性についてモニターされる。上清は、ファクター■アフセイの感度を増すために、ポリエチレングリコールおよびグリシン沈澱（血概からＡＨＦの精製に使用するため既知であるように）のような慣用技術によって精製し得る。ファクター■活性がピークに達した時、細胞が遠心によって培地から分離される。次にファクター〜ｉが回収され、ポリエチレングリコールおよびグリシン沈澱によって精製される。凝血活性がファクター■欠乏血漿において示される。４、ＡＨＦの　゛のための°　− 全体のＡＨＦコーディング区域を含んでいる全長さのｃＤＮＡが前記した）ＩＨ −２５中のエクソン、該エクソンの５”および３゛区域が重複している２種のｃＤＮＡクローン、そして３’　ｃＤＮＡクローンが重複しそして成端コードンを過ぎて続いている３番目のクローンから形成された。これは、合成Ｓａｌ　１部位がイニシエーターメチオニンに対してちょうど５°に、そしてＡＨＦをコードする配列の末端のほん訳停止信号に対して３′に配置されるように形成された。これはｐＳＰ６４のポリリンカ−５ａ１１部位中へ配置し、そしてそれから切り取ることを許容した。このクローン（ｓＳＰ６４−■）からのＳａｌ■断片が精製され、そしてｐＣＶＳＶＬ２ヘリゲートされた。ｐＣＶＳＶＬ２は、慣用の操作によって達成されるＳＶ４０ポリアデニル化配列の３°に位置するＰｓｔｌＮ３位を欠いていること、およびアデノビールス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から上流にＳＶ４０　Ａｖａ　ＩＩ　（Ｄ）断片の重複を含んでいることを除き、Ｑ現ベクターｐＣＶＳＶＬ　（Ｘａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。ル旦ユ」≧上ＩＢム壮、　２　：　１３０４　（１９８２）　、その記載を参照とじてこ−に取り入れる）と同一であるプラスミドである。ｐＣＶＳＶＬ２はｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（１）（前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、参照）から、二つのＳν４０ＡｖａｌＩ”Ｄ”断片の各末端においてＸｈｏ　Ｔリンカ−を加え、そしてそれらをｐＡｄＤ２６ｓＶｐｎ（１）のＸｈｏ　１部位へ挿入することによって誘導された。Ａｖａ■“Ｄ”断片は、ＳＶ４０後期プロモーターがＡｄ２主要後期プロモーターと同じ配向になるように両方共挿入される。ｐＣＶＳＶＬおよびｐＡｄＤ２６ＶｐＡ　（３）については、前出Ｋａｕｆａ＋ａｎ　ａｔ　ａｌ、参照。ｐＳＰ６４−■の５ａｌＩ断片をｐＣＶＳＶＬ２中へ挿入するため、ｐｃＶｓＶＬ２中の独特のＰｓｔ１部位はＲｏＬｈｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍ、６９　：　９Ｂ　（１９８０）に記載の操作によってＳａ目部位へ変えられ、そしてｐｓｌ’６４−■から切り取った５ａｌＩ断片がｐＣＶＳＶＬ２−■が得られるように挿入された。ｐｃＶｓＶＬ２−■は、ベクターのアデノビールスＭｌ−ＰからＡＨＦをコードする配列の転写を許容する正確な５゛から３゛への配向を含んでいる。ｐＣＶＳＶＬ２−■はアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションへ寄託されている。ｐＣＶＳＶＬ２−■は、サルＣＯ５−７細胞（Ｍｅｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃｅ１ｌ　２７　：　２７９（１９８１）　）中へ、ＳａｍｐａｙｒａｃおよびＤａｎｎａ、　ＰＮＡＳ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８　：　７５７５（１９８１）に記載されたＤＥＡＥデキストラントランスフェクションプロトコールを使用して導入された。細胞は血清を含まない培地中で培養され、トランスフェクション３日後、ＡＨＦ活性についてアッセイされた。７７クター■二〇活性は、Ｄｉｄｉｓｈｅｉｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　１２９：３８９　（１９５９）に記載された染色体基質アッセイによって測定され、ヒトファクター■：Ｃ発現が約０．０５単位／−のレベルで達成されたことを確実にした。ＦＩＧ、２Ａ、１６６Ｋｄポリペプチドのアミノ酵末端Ｘ工ＲＲＹＹＬＧＡＶＥＬＳＷＤＹＲＱＳＥＬＬＲＥＬＨＶＤＴＲＦＰＡＢ、１６６Ｋｄポリペプチドの断片ＸＶＡＫＫＨＰＫＴＷＶＨＹＩＳＡＥＥＥＤＷＤＹＡＰＡＶＰＳＰＳＤＲ６／’ 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Claims

【特許請求の範囲】１．実質上他のヒト遺伝子を含まない、ヒトファクターＶＩＩ：ＣをコートするＤＮＡ配列。２．クローン化したヒトファクターＶＩＩ：Ｃ遺伝子。３．宿主がバクテリア、イーストおよび哺乳類細胞から選ばれた、ヒトファクターＶＩＩ：Ｃのための遺伝子を含んでいる形質転換された宿主。４．配列：【配列があります】を有するポリデオキシヌクレオチドを含む、ヒトファクターＶＩＩ：Ｃをコードする単離されたＤＮＡ。５．ヒトゲノムＤＮＡから切り取られた第４項のＤＮＡ。６．非ヒト源からのＤＮＡへ直接または間接に結合した第４項のＤＮＡ。７．第４項のＤＮＡセグメントを含むクローニングベクター。８．第４項のＤＮＡセグメントを含む、ヒトファクターＶＩＩ：Ｃのための発現ベクター。９．第７項の発現ベクターを含んでいる形質転換された微生物。１０．第７項の発現ベクターを含んでいる形質転換された細胞ライン。１１．配列：【配列があります】またその反転相補体の少なくとも１０個のヌクレオチドを有するデオキシリボヌクレオチドを含む、ヒト遺伝子ファクターＶＩＩ：Ｃの少なくとも一部をコードするデオキシヌクレオチド配列およびリボヌクレオチド配列を同定するためのスクリーニング剤。１２．ブタゲノムＤＮＡから切り取られた第１１項のＤＮＡ。１３．非ブタ源からのＤＮＡへ結合された第１１項のＤＮＡ。１４．第１１項のＤＮＡセグメントを含むクローニングベクター。１５．実質上他のブタ遺伝子を含まない、ブタファクターＶＩＩ：ＣをコードするＤＮＡ配列。１６．クローン化したブタファクターＶＩＩ：Ｃ遺伝子。１７．宿主がバクテリア、イーストおよび哺乳類細胞から選ばれた、ブタファクターＶＩＩ：Ｃのための遺伝子を含んでいる形質転換された宿主。１８．配列：【配列があります】を有するポリデオキシリボヌクレオチドを含む、ブタファクターＶＩＩ：Ｃをコードする単離したＤＮＡ。１９．第１８項のＤＮＡセグメントを含む、ブタファクターＶＩＩ：Ｃのための発現ベクター。２０．第１９項の発現ベクターを含んでいる形質転換されたベクター。２１．あるタンパクを生産する生物のゲノムＤＮＡライブラリーを形成し、その配列が該タンパク中に含まれるアミノ酸配列のみに基づいて選択された少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブ形成し、前記ゲノムライブラリーを前記オリゴヌクレオチドとＤＮＡ／ＤＮＡハイブリディゼイションを有利にする条件下で接触させ、前記オリゴヌクレオチドへハイブリッド化するゲノムＤＮＡを同定し、そして前記オリゴヌクレオチドへハイブリッド化するＤＮＡを含有するゲノムＤＮＡを単離することを含む、あるタンパクの少なくとも一部をコードする遺伝子断片の単離方法。２２．少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブは、めいめいがＤＮＡ配列において前記アミノ酸配列に対応する異なるＤＮＡ配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む、第２１項の方法。２３．少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブは、その一つが前記タンパク中の選択されたアミノ酸配列に対応するめいめいの可能性あるＤＮＡ前列を含む、複数のオリゴヌクレオチドを含む、第２２項の方法。２４．前記オリゴヌクレオチドプローブは、約１０ないし２００ヌクレオチドの長さを揺する第２２項の方法。２５．前記オリゴヌクレオチドは、１０ないし２０ヌクレオチドの長さを有する第２２項の方法。２６．前記オリゴヌクレオチドは、約３０ないし２００ヌクレオチドの鎖長を有する第２２項の方法。２７．前記オリゴヌクレオチドは、約４０ないし５０ヌクレオチドの鎖長を有する第２２項の方法。２８．ＤＮＡ配列において前記タンパク中のアミノ酸配列に対応する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプローブが形成され、各オリゴヌクレオチドプローブが前記ゲノムＤＮＡとハイブリッド化条件下接触させられる第２２項の方法。２９．一つのオリゴヌクレオチドプローブが１１ないし２０ヌクレオチドの長さを有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、他のオリゴヌクレオチドプローブが４０ないし２００ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む第２８項の方法。３０．一つのヌクレオチドプローブが４０ないし９０ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む第２８項の方法。３１．以下の配列：【配列があります】またはその反転相補体の少なくとも１０ヌクレオチド配列に対応するプローブを持ってｃＲＮＡライブラリーをスクリーニングし、該プローブとハイブリッド化するｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを成形し、そして該ｃＤＮＡライブラリーからのＡＨＦｃＤＮＡをリゲートすることによってヒトファクターＶＩＩ：Ｃをコードする遺伝子を形成することを含む、ヒトファクターＶＩＩ：Ｃをコードする遺伝子の単離方法。３２（８）ＡＨＦをコードするヒトＤＮＡとハイブリッド化する、またはそのようなＤＮＡの相補体とハイブリッド化する１種または２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを調製し、（ｂ）そのようなプローブの少なくとも１種を用いてＡＨＦに対応するヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ転写物を含んでいる細胞を同定し、（ｃ）ステップ（ｂ）のｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、（ｄ）ステップ（ｃ）のｃＲＮＡを成熟ヒトＡＨＦの少なくともアミノ酸配列をコードする複製し得るｃＤＮＡ中ヘアセンブルし、（ｅ）ステップ（ｄ）の配列をクローニングし、（ｆ）ＡＨＦを発現しない親細胞をステップ（ｅ）配列で形質転換し、（ｇ）ステプ（ｆ）の形質転換された細胞を培養し、そして（ｈ）培養物からＡＨＦを採取する、ステップを含むＡＨＦの生産方法。３３．前記細胞は哺乳類細胞である第３２項の方法。３４．前記細胞は選択遺伝子で同時形質転換される第３３項の方法。３５．第３２項の方法によって生産された、実質上純粋なヒトファクターＶＩＩ：Ｃ。３６．前記配列は、第７図に示したＤＮＡヌクレオチド配列、または第７図に示したＤＮＡヌクレオチド配列へハイブリッド化する１種または２種以上のＤＮＡ配列から選ばれた１積または２種以上のＤＮＡ配列を含み、かつ発現においてファクターＶＩＩ：Ｃ活性を示すタンパクをコードする第１項のＤＮＡ配列。３７．前記配列は第７図に示したＤＮＡ配列を含む第１項のＤＮＡ配列。３８．前記配列は第７図に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第１項のＤＮＡ配列。３９．ファクターＶＩＩ活性を生産するポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列。４０．前記ポリペプチドは第７図のアミノ酸配列の少なくとも主要部分を含む第３９項のＤＮＡ配列。４１．第７図に示したアミノ酸配列、または第７図に示したＤＮＡヌクレオチド配列へハイブリッド化するＤＮＡ配列によって発現されたアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を含む、ヒトファクターＶＩＩ：Ｃ活性を示す、ＤＮＡによって発現されたポリペプチド。４２．前記ポリペプチドは、ファクターＶＩＩ：Ｃ活性を提供するのに十分な第７図のアミノ酸配列のセグメントに対応するアミノ酸を含み、ヒトフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンを実質上含有しない第４１項のポリペプチド。４３．前記ポリペプチドは他のヒトポリペプチドを実質上含有しない第４１項のポリペプチド。４４．前記他のヒトポリペプチドは、ヒトファクターＶＩＩ：ｖＷＦ．フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンである第４３項のポリペプチド。４５．フエクターＶＩＩ：Ｃ活性を生産するのに十分な、第７図に示した配列に多数のアミノ酸基をコードするＤＮＡ配列を含むベクター。４６．ファクターＶＩＩ：Ｃ活性を生産するのに十分な、第７図に示した配列に多数のアミノ酸基をコードする外来ＤＮＡを含んでいる形質転換された宿主。４７．前記宿主は、バクテリア、イースト、こん虫もしくは哺乳類細胞から選ばれる第４６項の宿主。４８．宿主を、ファクターＶＩＩ：Ｃ活性を生産するのに十分な、第７図に示した多数のアミノ酸基を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換し、そて該配列からポリペプチドを発現させることを含む、ヒトファクターＶＩＩ：Ｃの製造方法。４９．該ポリペプチドは第７図に示したアミノ酸配列を有する第４８項の方法。５０．前記ＤＮＡセグメントは第７図に示した前列を有する第４８項の方法。５１．前記トランスフォーマントからヒトファクターＶＩＩ：Ｃを回収することをさらに含む第４８項の方法。５２．ファクターＶＩＩ：Ｃ活性を提供するのに十分な、第７図に示した配列に多数のアミノ酸より本質的に構成されるグリコシル化ポリペプチド。５３．第４１項のポリペプチドの無菌製剤を含む、血友病Ａの治療に有用な医療製剤。５４．第４１項のポリペプチドの有効投与量を投与することよりなる血友病Ａの治療方法。