JP2549049B2 - ファクターｖｉｉｉおよび関連生産物の製造 - Google Patents
ファクターｖｉｉｉおよび関連生産物の製造Info
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- JP2549049B2 JP2549049B2 JP5024748A JP2474893A JP2549049B2 JP 2549049 B2 JP2549049 B2 JP 2549049B2 JP 5024748 A JP5024748 A JP 5024748A JP 2474893 A JP2474893 A JP 2474893A JP 2549049 B2 JP2549049 B2 JP 2549049B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】本発明の背景 本発明は、ヒトファクターVIII：Ｃの細胞生産をコード
する組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡの製造、
ファクターVIII：ＣをコードするＤＮＡ分子を得る方
法、に関する。
する組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ＤＮＡの製造、
ファクターVIII：ＣをコードするＤＮＡ分子を得る方
法、に関する。
【０００２】ファクターVIII：Ｃは血友病Ａに欠乏また
は存在しない血漿タンパクである。この病気は、男性約
２０，０００人中１人がかかる遺伝性出血病である。フ
ァクターVIII：Ｃはまた、ファクターVIII，抗 血友病
因子（ＡＨＦ），抗血友病グロブリン（ＡＨＧ），血友
病ファクターＡ，血小板助因子、トロンボプラスチノジ
ェン、トロンボサイトリシンとしても知られ、そしてそ
のように呼ばれている。それが凝血活性に影響する化合
物であることを指示するために、“ファクターVIII：
Ｃ”と呼ばれる。ここで使用するように、“ファクター
VIII：Ｃ”と“ＡＨＦ”とは同義語である。
は存在しない血漿タンパクである。この病気は、男性約
２０，０００人中１人がかかる遺伝性出血病である。フ
ァクターVIII：Ｃはまた、ファクターVIII，抗 血友病
因子（ＡＨＦ），抗血友病グロブリン（ＡＨＧ），血友
病ファクターＡ，血小板助因子、トロンボプラスチノジ
ェン、トロンボサイトリシンとしても知られ、そしてそ
のように呼ばれている。それが凝血活性に影響する化合
物であることを指示するために、“ファクターVIII：
Ｃ”と呼ばれる。ここで使用するように、“ファクター
VIII：Ｃ”と“ＡＨＦ”とは同義語である。
【０００３】血漿からのＡＨＦの単離は文献に記載され
ているけれども、ＡＨＦの詳細な構造は、一部は純粋な
材料の十分な量の入手不能性と、そして多数の夾雑物お
よび精製剤のタンパク分解性のため、これまで同定され
ていない。不純なＡＨＦのいくらかの量は新しい冷凍ヒ
ト血漿から処理した濃縮製剤として提供されているが、
ヒト血漿中のＡＨＦの極めて低い濃度と、そしてヒト血
漿の入手および処理の高いコストが、血友病の広範な治
療に対してこの物質のコストを禁止的にしている。
ているけれども、ＡＨＦの詳細な構造は、一部は純粋な
材料の十分な量の入手不能性と、そして多数の夾雑物お
よび精製剤のタンパク分解性のため、これまで同定され
ていない。不純なＡＨＦのいくらかの量は新しい冷凍ヒ
ト血漿から処理した濃縮製剤として提供されているが、
ヒト血漿中のＡＨＦの極めて低い濃度と、そしてヒト血
漿の入手および処理の高いコストが、血友病の広範な治
療に対してこの物質のコストを禁止的にしている。
【０００４】本発明は、組換えＤＮＡ技術の使用により
ヒトＡＨＦの製造を可能にする。
ヒトＡＨＦの製造を可能にする。
【０００５】ＡＨＦは、他のタンパクと同様に、特定の
配列に並んだ２０種あまりの異なるアミノ酸からなって
いる。遺伝子操作技術を使用し、ヒトＡＨＦタンパクを
コードする遺伝子を同定し、そしてクローニングし、該
遺伝子を組換えＤＮＡベクター中へ挿入し、適当な宿主
を該遺伝子を含む該ベクターで形質転換し、そのような
宿主中にヒトＡＨＦ遺伝子を発現させ、そしてそれによ
って生産されたヒトＡＨＦを採取することにより、ＡＨ
Ｆの生産を可能とする方法が開発された。
配列に並んだ２０種あまりの異なるアミノ酸からなって
いる。遺伝子操作技術を使用し、ヒトＡＨＦタンパクを
コードする遺伝子を同定し、そしてクローニングし、該
遺伝子を組換えＤＮＡベクター中へ挿入し、適当な宿主
を該遺伝子を含む該ベクターで形質転換し、そのような
宿主中にヒトＡＨＦ遺伝子を発現させ、そしてそれによ
って生産されたヒトＡＨＦを採取することにより、ＡＨ
Ｆの生産を可能とする方法が開発された。
【０００６】最近開発された技術は、それらの起源は天
然であるにもかかわらず、商業的に有用なタンパクおよ
びペプチドの合成のため、急速にそして豊富に成長し得
る微生物を採用することを可能にした。これら技術は、
適当な微生物へ通常他の生物によってつくられるタンパ
クまたはペプチドを合成する能力を遺伝的に賦与するこ
とを可能にする。この技術は、遺伝子物質、通常ＤＮＡ
と、生物によって合成されるタンパクとの間に、すべて
の生きている生物に存在する基本的関係を使用する。こ
の関係とは、タンパクのアミノ酸配列の生産はＤＮＡの
３個のヌクレオチド配列のシリーズによってコードされ
ることである。タンパク中に最も普通に存在する２０種
のアミノ酸のめいめいの生産に対して特異的にコードす
る１組またはそれ以上のトリヌクレオチド配列群（コー
ドンと呼ばれる）が存在する。めいめいの与えられたト
リヌクレオチド配列と、それをコードする対応するアミ
ノ酸との間の特異的関係が遺伝暗号を構成する。その結
果、すべてのタンパクまたはペプチドのアミノ酸配列
は、良く理解された関係に従って、対応するヌクレオチ
ド配列によって表現される。さらに、このヌクレオチド
配列は、原則として、どんな生きた生物によってもほん
訳されることができる。遺伝暗号の議論については、そ
の記載を参照としてここに取りいれた J.D. Watson, Me
lecular Biology of Gene （W.A. Benjamin, Inc.,197
7），特に347-77頁； C.F. Norton, Microbiology（Add
ison, Wesley 1981），および米国特許第4,363,877 号
参照。
然であるにもかかわらず、商業的に有用なタンパクおよ
びペプチドの合成のため、急速にそして豊富に成長し得
る微生物を採用することを可能にした。これら技術は、
適当な微生物へ通常他の生物によってつくられるタンパ
クまたはペプチドを合成する能力を遺伝的に賦与するこ
とを可能にする。この技術は、遺伝子物質、通常ＤＮＡ
と、生物によって合成されるタンパクとの間に、すべて
の生きている生物に存在する基本的関係を使用する。こ
の関係とは、タンパクのアミノ酸配列の生産はＤＮＡの
３個のヌクレオチド配列のシリーズによってコードされ
ることである。タンパク中に最も普通に存在する２０種
のアミノ酸のめいめいの生産に対して特異的にコードす
る１組またはそれ以上のトリヌクレオチド配列群（コー
ドンと呼ばれる）が存在する。めいめいの与えられたト
リヌクレオチド配列と、それをコードする対応するアミ
ノ酸との間の特異的関係が遺伝暗号を構成する。その結
果、すべてのタンパクまたはペプチドのアミノ酸配列
は、良く理解された関係に従って、対応するヌクレオチ
ド配列によって表現される。さらに、このヌクレオチド
配列は、原則として、どんな生きた生物によってもほん
訳されることができる。遺伝暗号の議論については、そ
の記載を参照としてここに取りいれた J.D. Watson, Me
lecular Biology of Gene （W.A. Benjamin, Inc.,197
7），特に347-77頁； C.F. Norton, Microbiology（Add
ison, Wesley 1981），および米国特許第4,363,877 号
参照。
【０００７】それからタンパクがつくられる２０種類の
アミノ酸は、フェニルアラニン（以後時に“Phe ”また
は“F ”と略す）, ロイシン（“Leu ”, “L ”）, イ
ソロイシン（“Ile ”, “I ”）, メチオニン（“Met
”, “M ”）, バリン（“Val ”, “V ”）, セリン
（ “Ser ”, “S ”）, プロリン（“Pro ”, “P
”）, スレオニン（“Thr ”, “T ”）, アラニン
（“Ala ”, “A ”）, チロシン（“Tyr ”, “Y
”）, ヒスチジン（“His ”, “H ”）, グルタミン
（“Gln ”, “Q ”）, アスパラギン（“Asp ”, “N
”）, グルタミン酸（“Glu ”, “E ”）, システイ
ン（“Cys ”, “C ”）, トリプトファン（“Trp ”,
“W ”）, アルギニン（“Arg ”, “R ”）およびグリ
シン（“Gly ”，“G ”）である。与えられたコードン
中に含まれることができるトリヌクレオチドの種々の組
合せによってコードされるアミノ酸は表１に見られる。
アミノ酸は、フェニルアラニン（以後時に“Phe ”また
は“F ”と略す）, ロイシン（“Leu ”, “L ”）, イ
ソロイシン（“Ile ”, “I ”）, メチオニン（“Met
”, “M ”）, バリン（“Val ”, “V ”）, セリン
（ “Ser ”, “S ”）, プロリン（“Pro ”, “P
”）, スレオニン（“Thr ”, “T ”）, アラニン
（“Ala ”, “A ”）, チロシン（“Tyr ”, “Y
”）, ヒスチジン（“His ”, “H ”）, グルタミン
（“Gln ”, “Q ”）, アスパラギン（“Asp ”, “N
”）, グルタミン酸（“Glu ”, “E ”）, システイ
ン（“Cys ”, “C ”）, トリプトファン（“Trp ”,
“W ”）, アルギニン（“Arg ”, “R ”）およびグリ
シン（“Gly ”，“G ”）である。与えられたコードン
中に含まれることができるトリヌクレオチドの種々の組
合せによってコードされるアミノ酸は表１に見られる。
【０００８】
【０００９】特定のタンパクをコードする遺伝子または
ＤＮＡ配列のデオキシヌクレオチド配列を知ることは、
該タンパクのアミノ酸配列の正確な記述を許容する。し
かしながら逆は必ずしも真ならず、メチオニンはたった
１種のコードンでコードされるが、他のアミノ酸は、第
１表から明らかなように、６種までのコードン（例えば
セリン）によってコードされることができる。このよう
に、アミノ酸配列からヌクレオチド配列を予測するには
かなりの不確実性が存在する。
ＤＮＡ配列のデオキシヌクレオチド配列を知ることは、
該タンパクのアミノ酸配列の正確な記述を許容する。し
かしながら逆は必ずしも真ならず、メチオニンはたった
１種のコードンでコードされるが、他のアミノ酸は、第
１表から明らかなように、６種までのコードン（例えば
セリン）によってコードされることができる。このよう
に、アミノ酸配列からヌクレオチド配列を予測するには
かなりの不確実性が存在する。
【００１０】要約すると、本発明以前にはＡＨＦの構造
については非常に少ししか知られておらず、そして多年
にわたる多大の労作にもかかわらず、当業者はＡＨＦま
たはその遺伝子の構造を決定し、またはＡＨＦを実質上
純粋な形で実質的な量において生産できる操作を提供す
ることが不可能であった。
については非常に少ししか知られておらず、そして多年
にわたる多大の労作にもかかわらず、当業者はＡＨＦま
たはその遺伝子の構造を決定し、またはＡＨＦを実質上
純粋な形で実質的な量において生産できる操作を提供す
ることが不可能であった。
【００１１】ヒトＡＨＦのための遺伝子がクローン化さ
れ、発現されるこゝに記載する方法は、以下のステップ
を含む。
れ、発現されるこゝに記載する方法は、以下のステップ
を含む。
【００１２】（１）ブタＡＨＦの精製； （２）ブタＡＨＦのアミノ酸配列の決定； （３）オリゴヌクレオチドプローブの調製およびブタＡ
ＨＦをコードする遺伝子の少なくとも断片を同定および
／または単離するためにそれらプローブの使用； （４）ヒトＡＨＦをコードするヒト遺伝物質を同定およ
び単離するためにブタＡＨＦ遣伝子断片の使用； （５）種々の哺乳類組織からＡＨＦの合成部位の決定の
ため前記ＡＨＦＤＮＡ断片の使用； （６）ステップ５における組織同定から得られたメッセ
ンジャーＲＮＡを使用して、ヒトおよびブタＡＨＦをコ
ードするｃＤＮＡセグメントの製造； （７）ステップ６において製造されたｃＤＮＡセグメン
トから、例えば同じ制限酵素によって切断されたｃＤＮ
Ａセグメントをリゲーションすることによって全長さの
ヒトおよびブタｃＤＮＡクローンの構成； （８）ＡＨＦ合成を命令し得るＤＮＡ発現ベクターの生
成； （９）ヒトまたはブタＡＨＦのための全長さのｃＤＮＡ
を持つ発現ベクターによる適当な宿主の形質転換； （１０）宿主中のヒトまたはブタＡＨＦの発現； （１１）発現されたＡＨＦの採取； この作業の途中において、ゲノムＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするための新技術がＡＨＦ分子中に含ま
れているアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用して開発された。
ＨＦをコードする遺伝子の少なくとも断片を同定および
／または単離するためにそれらプローブの使用； （４）ヒトＡＨＦをコードするヒト遺伝物質を同定およ
び単離するためにブタＡＨＦ遣伝子断片の使用； （５）種々の哺乳類組織からＡＨＦの合成部位の決定の
ため前記ＡＨＦＤＮＡ断片の使用； （６）ステップ５における組織同定から得られたメッセ
ンジャーＲＮＡを使用して、ヒトおよびブタＡＨＦをコ
ードするｃＤＮＡセグメントの製造； （７）ステップ６において製造されたｃＤＮＡセグメン
トから、例えば同じ制限酵素によって切断されたｃＤＮ
Ａセグメントをリゲーションすることによって全長さの
ヒトおよびブタｃＤＮＡクローンの構成； （８）ＡＨＦ合成を命令し得るＤＮＡ発現ベクターの生
成； （９）ヒトまたはブタＡＨＦのための全長さのｃＤＮＡ
を持つ発現ベクターによる適当な宿主の形質転換； （１０）宿主中のヒトまたはブタＡＨＦの発現； （１１）発現されたＡＨＦの採取； この作業の途中において、ゲノムＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするための新技術がＡＨＦ分子中に含ま
れているアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用して開発された。
【００１３】本発明は上記方法と、それに関連して作ら
れる種々のヌクレオチド、ベクターおよび他の製品を含
む。
れる種々のヌクレオチド、ベクターおよび他の製品を含
む。
【００１４】本発明の詳細な説明 本出願の理解を容易にするため、以下の定義が供給され
る。この分野において通用している意義と異なる場合に
は、以下の定義が支配する。
る。この分野において通用している意義と異なる場合に
は、以下の定義が支配する。
【００１５】増幅とは、細胞がそれらの染色体ＤＮＡ内
で遺伝子反復を生産する過程を意味する。
で遺伝子反復を生産する過程を意味する。
【００１６】同時形質転換とは、そのうちの一つが細胞
に選択し得る表現型を与える、該細胞にとって異質の二
つ以上の外来遺伝子をもって細胞を形質転換する過程を
意味する。
に選択し得る表現型を与える、該細胞にとって異質の二
つ以上の外来遺伝子をもって細胞を形質転換する過程を
意味する。
【００１７】下流とは、ヌクレオチド配列の３’末端へ
向かって進行する方向を意味する。
向かって進行する方向を意味する。
【００１８】エンハンサーとは、遺伝子の本体、遺伝子
に関して配列の位置、または配列の配向に関係なく、遺
伝子の転写を可能とし得るヌクレオチド配列である。
に関して配列の位置、または配列の配向に関係なく、遺
伝子の転写を可能とし得るヌクレオチド配列である。
【００１９】遺伝子とは、与えられた成熟タンパクをコ
ードするデオキシリボヌクレオチド配列である。ここで
の目的に対しては、遺伝子は、ＲＮＡ転写開始信号、ポ
リアデニル化付加部位、プロモーターまたはエンハンサ
ーのようなほん訳されない両端域は含まない。
ードするデオキシリボヌクレオチド配列である。ここで
の目的に対しては、遺伝子は、ＲＮＡ転写開始信号、ポ
リアデニル化付加部位、プロモーターまたはエンハンサ
ーのようなほん訳されない両端域は含まない。
【００２０】選択遺伝子とは、検出し得るタンパクとし
て該遺伝子を発現する表現型を細胞へ与える遺伝子であ
る。
て該遺伝子を発現する表現型を細胞へ与える遺伝子であ
る。
【００２１】選択剤とは、選択遺伝子の発現の検出を可
能とする条件または物質である。
能とする条件または物質である。
【００２２】遺伝子型とは、表現型として観察される、
その発現に対向して細胞内に含まれる遺伝情報である。
その発現に対向して細胞内に含まれる遺伝情報である。
【００２３】リゲーションとは、２本のＤＮＡ鎖の５’
および３’末端間にフォスフォジエステル結合を形成す
る過程である。これはＴ４リガーゼによる鈍い末端連結
を含む、いくつかの良く知られた酵素法技術によって達
成することができる。
および３’末端間にフォスフォジエステル結合を形成す
る過程である。これはＴ４リガーゼによる鈍い末端連結
を含む、いくつかの良く知られた酵素法技術によって達
成することができる。
【００２４】配向とは、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの
順序を意味する。ＤＮＡ配列の反転配位とは、他の配位
に関して該配位の５’から３’への順序が、該配位を得
たＤＮＡ中の基準点と比較した時反対になっている順序
である。そのような基準点は、起源ＤＮＡまたは該配列
を含んでいる複製し得るベクターの複製源中の他の特定
ＤＮＡ配列の転写の方向を含むことができる。
順序を意味する。ＤＮＡ配列の反転配位とは、他の配位
に関して該配位の５’から３’への順序が、該配位を得
たＤＮＡ中の基準点と比較した時反対になっている順序
である。そのような基準点は、起源ＤＮＡまたは該配列
を含んでいる複製し得るベクターの複製源中の他の特定
ＤＮＡ配列の転写の方向を含むことができる。
【００２５】転写とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を
意味する。
意味する。
【００２６】形質転換とは、外来ＤＮＡの細胞による摂
取によって細胞の遺伝子型を変えることを意味する。形
質転換は、ある場合には細胞の表現型の変化によって検
出することができる。形質転換した細胞はトランスフォ
ーマントと呼ばれる。形質転換前細胞は、親細胞と呼ば
れる。
取によって細胞の遺伝子型を変えることを意味する。形
質転換は、ある場合には細胞の表現型の変化によって検
出することができる。形質転換した細胞はトランスフォ
ーマントと呼ばれる。形質転換前細胞は、親細胞と呼ば
れる。
【００２７】ほん訳とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）からポリペプチドの合成を意味する。
ＮＡ）からポリペプチドの合成を意味する。
【００２８】本発明は、組換えＤＮＡ技術によって、ブ
タファクターVIII：Ｃ遺伝子の同定および単離を始めて
可能にする。本発明はまた、ＡＨＦのためのヒト遺伝子
を発見および単離するため、ブタＡＨＦ ＤＮＡとヒト
ＡＨＦ ＤＮＡとの間の相同の利点を利用することによ
り、組換えＤＮＡ技術により、ヒトファクターVIII：Ｃ
を暗号化する遺伝子の単離および同定を始めて可能にす
る。ブタＡＨＦ遺伝子との相同を経由するＡＨＦ製造の
ためのｃＤＮＡクローンへのこのルートは、非常に高価
でありかつ実質上入手できないヒトＡＨＦを精製するた
めの退屈な時間のかかるそして費用のかかる必要性を回
避する。
タファクターVIII：Ｃ遺伝子の同定および単離を始めて
可能にする。本発明はまた、ＡＨＦのためのヒト遺伝子
を発見および単離するため、ブタＡＨＦ ＤＮＡとヒト
ＡＨＦ ＤＮＡとの間の相同の利点を利用することによ
り、組換えＤＮＡ技術により、ヒトファクターVIII：Ｃ
を暗号化する遺伝子の単離および同定を始めて可能にす
る。ブタＡＨＦ遺伝子との相同を経由するＡＨＦ製造の
ためのｃＤＮＡクローンへのこのルートは、非常に高価
でありかつ実質上入手できないヒトＡＨＦを精製するた
めの退屈な時間のかかるそして費用のかかる必要性を回
避する。
【００２９】ブタＡＨＦは、最も好ましくは、David Fa
ss et al, “Monoclonal Antibodies to Porcine AHF C
oagulant and Their Use in theIsolation of Active C
oagulent Protein”, Blood 59：594-600 （1982）, お
よび Knutsen et al.,“Porcine FactorVIII：C pre-pa
red by affinity Interaction with Von WillebrandFac
tor andHeterologous Antibodies,” Blood, 59：615-2
4（1982）に記載されているモノクロナール抗体精製技
術によって最初高度に精製される。上記論文の記載を参
照としてここに取り入れる。ブタファクターVIII：Ｃポ
リペプチドは、適当なアフィニティークロマトグラフィ
ーカラム上に固定化された抗VIII：Ｃモノクロナール抗
体へ結合される。約１６６および１３０Kdの分子サイズ
を有する２種の大きい分子量ポリペプチドがエチレンジ
アミンテトラ酢酸で溶離される。次に約７６Kdの分子量
を持つ他のタンパクセグメントが約５０％のエチレング
リコールを用いてカラムから溶離される。これらポリペ
プチド、および／またはウシトロンビンまたはタンパク
を切断する他の適当な試薬を使用する、該タンパクの酵
素消化のような、既知の方法で得られたこれらポリペプ
チドの断片の部分的アミノ酸配列が、次に既知の分析方
法によって決定される。これら物質のアミノ酸配列を基
にして、オリゴヌクレオチドプローブが合成され、その
少なくともいくつかはＡＨＦの対応するセグメントをコ
ードするＤＮＡとハイブリッド化されるであろう。これ
らオリゴヌクレオチドは次に、ブタＡＨＦをコードする
遺伝子のセグメントをスクリーニングするために使用さ
れる。
ss et al, “Monoclonal Antibodies to Porcine AHF C
oagulant and Their Use in theIsolation of Active C
oagulent Protein”, Blood 59：594-600 （1982）, お
よび Knutsen et al.,“Porcine FactorVIII：C pre-pa
red by affinity Interaction with Von WillebrandFac
tor andHeterologous Antibodies,” Blood, 59：615-2
4（1982）に記載されているモノクロナール抗体精製技
術によって最初高度に精製される。上記論文の記載を参
照としてここに取り入れる。ブタファクターVIII：Ｃポ
リペプチドは、適当なアフィニティークロマトグラフィ
ーカラム上に固定化された抗VIII：Ｃモノクロナール抗
体へ結合される。約１６６および１３０Kdの分子サイズ
を有する２種の大きい分子量ポリペプチドがエチレンジ
アミンテトラ酢酸で溶離される。次に約７６Kdの分子量
を持つ他のタンパクセグメントが約５０％のエチレング
リコールを用いてカラムから溶離される。これらポリペ
プチド、および／またはウシトロンビンまたはタンパク
を切断する他の適当な試薬を使用する、該タンパクの酵
素消化のような、既知の方法で得られたこれらポリペプ
チドの断片の部分的アミノ酸配列が、次に既知の分析方
法によって決定される。これら物質のアミノ酸配列を基
にして、オリゴヌクレオチドプローブが合成され、その
少なくともいくつかはＡＨＦの対応するセグメントをコ
ードするＤＮＡとハイブリッド化されるであろう。これ
らオリゴヌクレオチドは次に、ブタＡＨＦをコードする
遺伝子のセグメントをスクリーニングするために使用さ
れる。
【００３０】ＡＨＦのためのブタ遺伝子一部分が得られ
れば、該組換え物質はヒトＡＨＦをコードする遺伝子を
探索し、そして単離するため、ヒトゲノムＤＮＡをスク
リーンするために使用される。この操作において、ヒト
ＡＨＦとブタＡＨＦとの間に、かなりの類似性が存在す
ることが確立され、そしてこれら類似性の利益がヒトフ
ァクターVIII：Ｃ遺伝子または遺伝子セグメントを単離
し、そして同定するために用いられる。
れば、該組換え物質はヒトＡＨＦをコードする遺伝子を
探索し、そして単離するため、ヒトゲノムＤＮＡをスク
リーンするために使用される。この操作において、ヒト
ＡＨＦとブタＡＨＦとの間に、かなりの類似性が存在す
ることが確立され、そしてこれら類似性の利益がヒトフ
ァクターVIII：Ｃ遺伝子または遺伝子セグメントを単離
し、そして同定するために用いられる。
【００３１】ブタおよびヒトタンパクの類似性は、アミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の対応する類似性に帰
せられる。ヒトおよびブタのＡＨＦタンパクをコードす
る遺伝物質は、高いパーセントの部分において同一であ
り、そのため、例えば Benton および Davisの“Screen
ing gt Recombinant Clones by Hybridizatin to Singl
e Plaques In Situ ”, Science, 196：180 （1977）の
操作へかける時、ハイブリッド化を示す。該論文の記載
を参照としてここに取り入れる。
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の対応する類似性に帰
せられる。ヒトおよびブタのＡＨＦタンパクをコードす
る遺伝物質は、高いパーセントの部分において同一であ
り、そのため、例えば Benton および Davisの“Screen
ing gt Recombinant Clones by Hybridizatin to Singl
e Plaques In Situ ”, Science, 196：180 （1977）の
操作へかける時、ハイブリッド化を示す。該論文の記載
を参照としてここに取り入れる。
【００３２】ヒトＡＨＦのための遺伝子のクローン化し
たセグメントは、次に種々のヒト組織の中からＡＨＦ
ｍＲＮＡの源を同定するために使用される。同様に、ブ
タＡＨＦのためのクローン化したセグメントの一つまた
はそれ以上がブタＡＨＦのための可能性ある組織源をス
クリーニングするために使用される。このステップは、
例えばManiatis et al., Molecular Cloning, A Labora
tory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)
に記載されているように、ＲＮＡ抽出、ゲル電気泳動、
ニトロセルロースシートへの移換、および放射標識した
クローン化ＤＮＡへのハイブリッド化を含む。この組織
源が同定されれば、ｃＤＮＡライブラリーがつくられ
（プラスミドまたは好ましくはバクテリオファージラム
ダベクター中に、両方とも一般に入手可能）、そして以
下に記載するようにＡＨＦ ｃＤＮＡクローンについて
スクリーニングされる。ｃＤＮＡライブラリースクリー
ニングのプロセスは、ＤＮＡ配列決定により、ＡＨＦを
コードする全体ＤＮＡ遺伝子配列を含むことを示す一組
のｃＤＮＡクローンが得られるまで繰り返される。
たセグメントは、次に種々のヒト組織の中からＡＨＦ
ｍＲＮＡの源を同定するために使用される。同様に、ブ
タＡＨＦのためのクローン化したセグメントの一つまた
はそれ以上がブタＡＨＦのための可能性ある組織源をス
クリーニングするために使用される。このステップは、
例えばManiatis et al., Molecular Cloning, A Labora
tory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)
に記載されているように、ＲＮＡ抽出、ゲル電気泳動、
ニトロセルロースシートへの移換、および放射標識した
クローン化ＤＮＡへのハイブリッド化を含む。この組織
源が同定されれば、ｃＤＮＡライブラリーがつくられ
（プラスミドまたは好ましくはバクテリオファージラム
ダベクター中に、両方とも一般に入手可能）、そして以
下に記載するようにＡＨＦ ｃＤＮＡクローンについて
スクリーニングされる。ｃＤＮＡライブラリースクリー
ニングのプロセスは、ＤＮＡ配列決定により、ＡＨＦを
コードする全体ＤＮＡ遺伝子配列を含むことを示す一組
のｃＤＮＡクローンが得られるまで繰り返される。
【００３３】全長さのヒトまたはブタＡＨＦ ｃＤＮＡ
が得られたならば、ＡＨＦ活性を発現するため、既知の
適当な手段、例えば適当なベクターへの挿入、適当な宿
主中へのトランスフェクション、形質転換された細胞
（トランスフォーマント）の選択、およびこれらトラン
スフォーマントの培養がＡＨＦタンパクを発現するため
に使用される。
が得られたならば、ＡＨＦ活性を発現するため、既知の
適当な手段、例えば適当なベクターへの挿入、適当な宿
主中へのトランスフェクション、形質転換された細胞
（トランスフォーマント）の選択、およびこれらトラン
スフォーマントの培養がＡＨＦタンパクを発現するため
に使用される。
【００３４】ＡＨＦの発現のための宿主ベクター系は原
核細胞でもよいが、しかしＡＨＦの複雑性は好ましい発
現系を真核細胞、特に（少なくとも凝血活性を有する生
物学的に活性なＡＨＦに対しては）哺乳動物系のものと
する。これは真核細胞（通常哺乳類または脊椎動物細
胞）の適当なＡＨＦベクターによる形質転換によって容
易に達成される。真核細胞形質転換は、一般によく知ら
れたプロセスであり、そして種々の標準的方法によって
達成することができる。これらは、プロトプラスト融
合、ＤＮＡミクロ注入、染色体トランスフェクション、
溶菌性または非溶菌性ビールスベクター（例えば、Mull
igan et al.,“Nature”（London）277 ：108 -114（19
79））, 細胞対細胞融合（Fournier et al.,“Proc. Na
t. Acad. Sci. ”74：319-323 （1977））, リピッド構
造（米国特許第 4,394,448号）、およびＤＮＡ沈澱の摂
取（Bachetti et al.,“Proc. Nat. Acad.Sci. 74 ：15
90-1594 （1977））の使用を含む。イーストまたはこん
虫細胞のような他の真核性細胞も有利に使用し得る。
核細胞でもよいが、しかしＡＨＦの複雑性は好ましい発
現系を真核細胞、特に（少なくとも凝血活性を有する生
物学的に活性なＡＨＦに対しては）哺乳動物系のものと
する。これは真核細胞（通常哺乳類または脊椎動物細
胞）の適当なＡＨＦベクターによる形質転換によって容
易に達成される。真核細胞形質転換は、一般によく知ら
れたプロセスであり、そして種々の標準的方法によって
達成することができる。これらは、プロトプラスト融
合、ＤＮＡミクロ注入、染色体トランスフェクション、
溶菌性または非溶菌性ビールスベクター（例えば、Mull
igan et al.,“Nature”（London）277 ：108 -114（19
79））, 細胞対細胞融合（Fournier et al.,“Proc. Na
t. Acad. Sci. ”74：319-323 （1977））, リピッド構
造（米国特許第 4,394,448号）、およびＤＮＡ沈澱の摂
取（Bachetti et al.,“Proc. Nat. Acad.Sci. 74 ：15
90-1594 （1977））の使用を含む。イーストまたはこん
虫細胞のような他の真核性細胞も有利に使用し得る。
【００３５】溶菌性ビールスベクターによって仲介され
る形質転換が効率的であるが、しかし多数の理由により
不利である。トランスフェクトされたＤＮＡの最大サイ
ズがビールスのカプシッドパッキングの形状によって制
限される、外来遺伝子がビールス複製中しばしば消失す
る、ヘルパービールスまたは特異化された宿主の必要性
が存在する、宿主細胞はパーミッシブでなければならな
い、そして宿主がビールス感染の途中で殺されることで
ある。
る形質転換が効率的であるが、しかし多数の理由により
不利である。トランスフェクトされたＤＮＡの最大サイ
ズがビールスのカプシッドパッキングの形状によって制
限される、外来遺伝子がビールス複製中しばしば消失す
る、ヘルパービールスまたは特異化された宿主の必要性
が存在する、宿主細胞はパーミッシブでなければならな
い、そして宿主がビールス感染の途中で殺されることで
ある。
【００３６】非溶菌性形質転換は、安定なエピソームと
してある細胞ライン中に導入されたビールスベクターの
転写およびほん訳を基にする。これら系は独特な細胞ラ
インを必要とし、そして多数の不利益を蒙る。“Trends
in Biochemical Sciences”, 1983年 3月号, pp.209-2
12参照。
してある細胞ライン中に導入されたビールスベクターの
転写およびほん訳を基にする。これら系は独特な細胞ラ
インを必要とし、そして多数の不利益を蒙る。“Trends
in Biochemical Sciences”, 1983年 3月号, pp.209-2
12参照。
【００３７】他方、染色体外ＤＮＡが宿主細胞の染色体
中に摂取される他の形質転換方法は、低い形質転換頻度
および低い発現レベルによって特徴づけされていた。こ
れら当初の難点は、実際に形質転換された細胞（選択遺
伝子）の小集団を遺伝的に選択し得る表現型を与える遺
伝子で形質転換することによって緩和された。形質転換
された細胞の全集団は、獲得した表現型を有する細胞に
有利な条件で育成されることができ、そのため形質転換
された細胞を好都合に探索することを可能とする。その
後、トランスフォーマントは該表現型をもっと強く表現
する能力についてスクリーニングされることができる。
これらは、より高い発現を検出するような方法で、選択
剤を変更することによって達成される。
中に摂取される他の形質転換方法は、低い形質転換頻度
および低い発現レベルによって特徴づけされていた。こ
れら当初の難点は、実際に形質転換された細胞（選択遺
伝子）の小集団を遺伝的に選択し得る表現型を与える遺
伝子で形質転換することによって緩和された。形質転換
された細胞の全集団は、獲得した表現型を有する細胞に
有利な条件で育成されることができ、そのため形質転換
された細胞を好都合に探索することを可能とする。その
後、トランスフォーマントは該表現型をもっと強く表現
する能力についてスクリーニングされることができる。
これらは、より高い発現を検出するような方法で、選択
剤を変更することによって達成される。
【００３８】選択遺伝子は三つのカテゴリー、すなわち
検出し得るように増幅された選択遺伝子、優性選択遺
伝子、および検出し得るように増幅された優性選択遺伝
子に分けられる。
検出し得るように増幅された選択遺伝子、優性選択遺
伝子、および検出し得るように増幅された優性選択遺伝
子に分けられる。
【００３９】検出し得るように増幅された選択された遺
伝子は、増幅が宿主細胞を選択剤の変更へ曝露すること
によって検出することができる遺伝子である。優性に活
動しない検出し得るように増幅された遺伝子は、一般に
選択遺伝子を遺伝子型的に欠く親細胞ラインを必要とす
る。その例は、ヒドロキシメトールグルタニル CoAレダ
クターゼ（Sinensky, “Biochem. Biophys. Res. Commu
n.”78：863 （1977）），リボヌクレオチドレダクター
ゼ（Meuth et al.“Cell：3 ：367 （1943））, アスパ
ルテートトランスカルバミラーゼ（Kemp et al. “Cel
l” 9：541 （1976）, アデニレートデアミナーゼ（DeB
atisse et al.“Mol and Cell Biol.”2（11）：1346-1
353 （1982））, マウスジヒドロフォレートレダクター
ゼ（ＤＨＦＲ），および欠陥プロモーターと共にマウス
チミジンキナーゼ（ＴＫ）に対する遺伝子を含む。
伝子は、増幅が宿主細胞を選択剤の変更へ曝露すること
によって検出することができる遺伝子である。優性に活
動しない検出し得るように増幅された遺伝子は、一般に
選択遺伝子を遺伝子型的に欠く親細胞ラインを必要とす
る。その例は、ヒドロキシメトールグルタニル CoAレダ
クターゼ（Sinensky, “Biochem. Biophys. Res. Commu
n.”78：863 （1977）），リボヌクレオチドレダクター
ゼ（Meuth et al.“Cell：3 ：367 （1943））, アスパ
ルテートトランスカルバミラーゼ（Kemp et al. “Cel
l” 9：541 （1976）, アデニレートデアミナーゼ（DeB
atisse et al.“Mol and Cell Biol.”2（11）：1346-1
353 （1982））, マウスジヒドロフォレートレダクター
ゼ（ＤＨＦＲ），および欠陥プロモーターと共にマウス
チミジンキナーゼ（ＴＫ）に対する遺伝子を含む。
【００４０】優性選択遺伝子は、親細胞の遺伝子型に関
係なくトランスフォーマント中に発現される遺伝子であ
る。大部分の優性選択遺伝子は、その表現型が選択剤に
よる処理において高度に効果的なため、遺伝子を増幅し
た、または増幅しなかった細胞ラインを識別することが
困難であるために、検出し得るように増幅されない。こ
のタイプの優性選択遺伝子は、キサンチン−グアニンフ
ォスフォリボシルトランスフェラーゼ（Mulligan et a
l. “Proc. Nat. Acad. Sci. ”78〔4 〕： 2072-2076
（1981））, およびアミノグルコシド３’−フォスフォ
トランスフェラーゼ（Colbere-Garapin et al.“J. Mo
l. Biol. ”, 150 ：1-14（1981））のような、原核生
物酵素に対する遺伝子を含む。
係なくトランスフォーマント中に発現される遺伝子であ
る。大部分の優性選択遺伝子は、その表現型が選択剤に
よる処理において高度に効果的なため、遺伝子を増幅し
た、または増幅しなかった細胞ラインを識別することが
困難であるために、検出し得るように増幅されない。こ
のタイプの優性選択遺伝子は、キサンチン−グアニンフ
ォスフォリボシルトランスフェラーゼ（Mulligan et a
l. “Proc. Nat. Acad. Sci. ”78〔4 〕： 2072-2076
（1981））, およびアミノグルコシド３’−フォスフォ
トランスフェラーゼ（Colbere-Garapin et al.“J. Mo
l. Biol. ”, 150 ：1-14（1981））のような、原核生
物酵素に対する遺伝子を含む。
【００４１】いくらかの優性選択遺伝子は検出できるよ
うに増幅される。適当な実例は、 Haber et al.“Somat
ic Cell Genet. ” 4：499-508 （1982）に記載された
変異ＤＨＦＲ遺伝子、ＨＬＡ抗原のような細胞表面マー
カー、およびこの分野でよく知られているように螢光源
または色素源物質から螢光物質または着色物質を生産す
る特異性エステラーゼのような酵素をコードする遺伝子
を含む。
うに増幅される。適当な実例は、 Haber et al.“Somat
ic Cell Genet. ” 4：499-508 （1982）に記載された
変異ＤＨＦＲ遺伝子、ＨＬＡ抗原のような細胞表面マー
カー、およびこの分野でよく知られているように螢光源
または色素源物質から螢光物質または着色物質を生産す
る特異性エステラーゼのような酵素をコードする遺伝子
を含む。
【００４２】検出し得るように増幅された優性選択遺伝
子がここで使用するために好ましい。ある場合は、優性
選択遺伝子は遺伝子の適当な変異によって検出し得るよ
うに増幅された遺伝子へ変えることができることを理解
すべきである。
子がここで使用するために好ましい。ある場合は、優性
選択遺伝子は遺伝子の適当な変異によって検出し得るよ
うに増幅された遺伝子へ変えることができることを理解
すべきである。
【００４３】選択遺伝子は最初限られた商業的有用性し
かなかった。それらは摂取したＤＮＡを増幅する性質を
有するトランスフォーマントを選択することを可能とし
たが、大部分の選択遺伝子は商業的価値のない生産物を
生産した。他方、商業的に価値ある生産物のための遺伝
子は、一般にそれらのトランスフォーマントへ容易に検
出し得る（または単に検出し得る）表現型を与えなかっ
た。これは、例えば独特の栄養代謝または無毒化能力で
形質転換された細胞を与えない酵素またはホルモンにつ
いて真理であろう。商業的に興味ある大部分のタンパク
はこのグループ、例えばホルモン、血液凝固に関与する
タンパク、およびフィブリン溶解酵素に属する。後に、
形質転換される性質を有し、そして選択遺伝子を増幅す
る真核細胞は、生産物遺伝子の場合と同じことをするで
あろうということが発見された。選択遺伝子を追従する
ことにより、選択遺伝子と同時に、生産物遺伝子を同時
発現し、同時増幅するトランスフォーマント細胞の小集
団を同定することができた。トランスフォーマントを選
択剤の存在下に培養し、そして選択遺伝子の増加した発
現を有するトランスフォーマントは生産物遺伝子の増加
した発現をも示すであろうと結論するのが実際であっ
た。これは後でもっと詳細に論ずるように、常に正しい
とは限らない。Axelら（米国特許第4,399,216 号）は、
ある細胞を、共有結合した、または結合しない遺伝子を
含むベクター系によろうと、そして後者の場合、遺伝子
が宿主細胞中へ後から、または同時に導入されようと、
二以上の異なった遺伝子で形質転換する過程を記載する
ために、同時形質転換なる術語を使用している。同時形
質転換は、“実質上任意の遺伝子の培養細胞中への導入
および統合を許容し（Wigler et al.“Cell”, 16：77
7-785,（1975））, および“同時形質転換過程の使用に
より、所望のタンパク性および他の物質を合成する真核
細胞を生産することが可能”（米国特許第 4,399,216
号、カラム 3, 37-42行）でなければならない。
かなかった。それらは摂取したＤＮＡを増幅する性質を
有するトランスフォーマントを選択することを可能とし
たが、大部分の選択遺伝子は商業的価値のない生産物を
生産した。他方、商業的に価値ある生産物のための遺伝
子は、一般にそれらのトランスフォーマントへ容易に検
出し得る（または単に検出し得る）表現型を与えなかっ
た。これは、例えば独特の栄養代謝または無毒化能力で
形質転換された細胞を与えない酵素またはホルモンにつ
いて真理であろう。商業的に興味ある大部分のタンパク
はこのグループ、例えばホルモン、血液凝固に関与する
タンパク、およびフィブリン溶解酵素に属する。後に、
形質転換される性質を有し、そして選択遺伝子を増幅す
る真核細胞は、生産物遺伝子の場合と同じことをするで
あろうということが発見された。選択遺伝子を追従する
ことにより、選択遺伝子と同時に、生産物遺伝子を同時
発現し、同時増幅するトランスフォーマント細胞の小集
団を同定することができた。トランスフォーマントを選
択剤の存在下に培養し、そして選択遺伝子の増加した発
現を有するトランスフォーマントは生産物遺伝子の増加
した発現をも示すであろうと結論するのが実際であっ
た。これは後でもっと詳細に論ずるように、常に正しい
とは限らない。Axelら（米国特許第4,399,216 号）は、
ある細胞を、共有結合した、または結合しない遺伝子を
含むベクター系によろうと、そして後者の場合、遺伝子
が宿主細胞中へ後から、または同時に導入されようと、
二以上の異なった遺伝子で形質転換する過程を記載する
ために、同時形質転換なる術語を使用している。同時形
質転換は、“実質上任意の遺伝子の培養細胞中への導入
および統合を許容し（Wigler et al.“Cell”, 16：77
7-785,（1975））, および“同時形質転換過程の使用に
より、所望のタンパク性および他の物質を合成する真核
細胞を生産することが可能”（米国特許第 4,399,216
号、カラム 3, 37-42行）でなければならない。
【００４４】形質転換ベクター ＡＦＨ同時形質転換に使用されるベクターは、選択遺伝
子およびＡＨＦ遺伝子を含むであろう。加えて、形質転
換または同時異質転換ベクター中に、後で記載するよう
なエンハンサー、プロモーター、イントロン、アクセサ
リーＤＮＡ，ポリアデニル化部位、および３' 非コーテ
ィング域のような他の要素が通常存在するであろう。
子およびＡＨＦ遺伝子を含むであろう。加えて、形質転
換または同時異質転換ベクター中に、後で記載するよう
なエンハンサー、プロモーター、イントロン、アクセサ
リーＤＮＡ，ポリアデニル化部位、および３' 非コーテ
ィング域のような他の要素が通常存在するであろう。
【００４５】適当な選択遺伝子は上に記載した。選択剤
は選択遺伝子の不存在下で細胞生育を阻止するものであ
ることが好ましい。そのため、選択遺伝子を失った大規
模培養中の復帰突然変異細胞は、醗酵物を過度に生育さ
せないであろう。しかしながら、ＡＨＦの商業生産にお
いては、細胞毒素の使用を避け、それにより製品精製工
程を単純化すること が望ましいであろう。このため、
望ましい選択遺伝子は、トランスフォーマントがさもな
ければ使用できない生育にとって重要な栄養を使用する
ことを可能にするものであろう。前述したＴＫ遺伝子は
一例である。
は選択遺伝子の不存在下で細胞生育を阻止するものであ
ることが好ましい。そのため、選択遺伝子を失った大規
模培養中の復帰突然変異細胞は、醗酵物を過度に生育さ
せないであろう。しかしながら、ＡＨＦの商業生産にお
いては、細胞毒素の使用を避け、それにより製品精製工
程を単純化すること が望ましいであろう。このため、
望ましい選択遺伝子は、トランスフォーマントがさもな
ければ使用できない生育にとって重要な栄養を使用する
ことを可能にするものであろう。前述したＴＫ遺伝子は
一例である。
【００４６】二つのクラスのベクターが同時形質転換に
用いられた。第一のクラスの未結合ベクターである。こ
こでは選択遺伝子およびＡＨＦ遺伝子は共有結合されな
い。二つの遺伝子のリゲーションまたは他の結合ステッ
プが必要ないので、このクラスのベクターが好ましい。
このことは、選択遺伝子および生産物遺伝子は通常別々
の源から得られ、そしてそれらの野生タイプ環境におい
てリゲートされないから、形質転換過程を単純化する。
加えて、同時形質転換時使用されるＡＨＦおよび選択遺
伝子のモル比は、同時形質転換効率を増すように調節す
ることができる。
用いられた。第一のクラスの未結合ベクターである。こ
こでは選択遺伝子およびＡＨＦ遺伝子は共有結合されな
い。二つの遺伝子のリゲーションまたは他の結合ステッ
プが必要ないので、このクラスのベクターが好ましい。
このことは、選択遺伝子および生産物遺伝子は通常別々
の源から得られ、そしてそれらの野生タイプ環境におい
てリゲートされないから、形質転換過程を単純化する。
加えて、同時形質転換時使用されるＡＨＦおよび選択遺
伝子のモル比は、同時形質転換効率を増すように調節す
ることができる。
【００４７】同時形質転換ベクターの第二のクラスは、
結合したベクターである。これらベクターは、選択およ
びＡＨＦベクターが好ましくはリゲーションに よって
共有結合されている点において未結合ベクターから区別
される。
結合したベクターである。これらベクターは、選択およ
びＡＨＦベクターが好ましくはリゲーションに よって
共有結合されている点において未結合ベクターから区別
される。
【００４８】こゝではベクターはエンハンサーを含むこ
とができる。エンハンサーは機能的にプロモーターから
区別されるが、しかしプロモーターと協力して作用する
ように見える。それらの細胞レベル上の機能は良くわか
っていないが、それらの独特な特徴は、位置もしくは配
位に依存することなく転写を活性化または可能化する能
力である。プロモーターは遺伝子の上流でなければなら
ないが、エンハンサーはイントロンのように、遺伝子内
でプロモーターから上流または５’に、または遺伝子と
ポリアデニル化部位との間で遺伝子から下流に、または
ポリアデニル化部位から３’に存在することができる。
反転したプロモーターは機能しないが、しかし反転した
エンハンサーは機能する。エンハンサーはシス活性、す
なわちプロモーターに対しそれらが同じＤＮＡ鎖上に存
在する場合のみ効果がある。エンハンサーの一般的議論
については、Ｋｈｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌ
ｌ”３３：３１３−３１４（１９８３）参照。
とができる。エンハンサーは機能的にプロモーターから
区別されるが、しかしプロモーターと協力して作用する
ように見える。それらの細胞レベル上の機能は良くわか
っていないが、それらの独特な特徴は、位置もしくは配
位に依存することなく転写を活性化または可能化する能
力である。プロモーターは遺伝子の上流でなければなら
ないが、エンハンサーはイントロンのように、遺伝子内
でプロモーターから上流または５’に、または遺伝子と
ポリアデニル化部位との間で遺伝子から下流に、または
ポリアデニル化部位から３’に存在することができる。
反転したプロモーターは機能しないが、しかし反転した
エンハンサーは機能する。エンハンサーはシス活性、す
なわちプロモーターに対しそれらが同じＤＮＡ鎖上に存
在する場合のみ効果がある。エンハンサーの一般的議論
については、Ｋｈｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌ
ｌ”３３：３１３−３１４（１９８３）参照。
【００４９】好ましいエンハンサーは、サルビールス4
0、ポリオマビールス、ウシパピロマビールス、レトロ
ビールスまたはアデノビールスのような動物ビールスか
ら得られる。ビールスエンハンサーは、大衆が入手し得
るビールスから容易に得ることができる。いくつかのビ
ールス，例えばラウスザルコーマビールスおよびサルビ
ールス40のためのエンハンサー域は良く知られている。
Luciw et al.“Cell”33： 705-716（1983）参照。問題
のビールスの公表された制限マップを基にしてこれら域
を切除し、そしてもし必要ならばエンハンサーを所望の
ベクターに接合することを可能とするように部位を修飾
することは日常的な化学的事項である。例えば、Kaufma
n et al.“J.Mol. Biol.”, 159 ： 601-621（1982）お
よび“Mol.Cell Biol. ”2 （11）： 1304-1319（198
2）参照。これら両者の記載を参照としてこゝに取り入
れる。代わりに、エンハンサーは配列データから合成す
ることができる。ビールスエンハンサーのサイズは、こ
れを 実際の達成できるほど十分に小さい（一般に約１
５０bp以下）。
0、ポリオマビールス、ウシパピロマビールス、レトロ
ビールスまたはアデノビールスのような動物ビールスか
ら得られる。ビールスエンハンサーは、大衆が入手し得
るビールスから容易に得ることができる。いくつかのビ
ールス，例えばラウスザルコーマビールスおよびサルビ
ールス40のためのエンハンサー域は良く知られている。
Luciw et al.“Cell”33： 705-716（1983）参照。問題
のビールスの公表された制限マップを基にしてこれら域
を切除し、そしてもし必要ならばエンハンサーを所望の
ベクターに接合することを可能とするように部位を修飾
することは日常的な化学的事項である。例えば、Kaufma
n et al.“J.Mol. Biol.”, 159 ： 601-621（1982）お
よび“Mol.Cell Biol. ”2 （11）： 1304-1319（198
2）参照。これら両者の記載を参照としてこゝに取り入
れる。代わりに、エンハンサーは配列データから合成す
ることができる。ビールスエンハンサーのサイズは、こ
れを 実際の達成できるほど十分に小さい（一般に約１
５０bp以下）。
【００５０】ベクターアセンブリ中に存在しなければな
らない他の要素は、ポリアデニル化接合（付加）部位で
ある。これはほん訳された遺伝子区域から下流に位置す
るＤＮＡ配列であり、そこから少し下流に転写ストップ
およびアデニンリボヌクレオチドが付加され、メッセン
ジャーＲＮＡの３’末端にポリアデニンヌクレオチド尾
部を形成する。ポリアデニル化は、メッセンジャーＲＮ
Ａのレベル、従って生産物タンパクのレベルを減らす事
象である、細胞中の分解に対してメッセンジャーＲＮＡ
を安定化するのに重要である。
らない他の要素は、ポリアデニル化接合（付加）部位で
ある。これはほん訳された遺伝子区域から下流に位置す
るＤＮＡ配列であり、そこから少し下流に転写ストップ
およびアデニンリボヌクレオチドが付加され、メッセン
ジャーＲＮＡの３’末端にポリアデニンヌクレオチド尾
部を形成する。ポリアデニル化は、メッセンジャーＲＮ
Ａのレベル、従って生産物タンパクのレベルを減らす事
象である、細胞中の分解に対してメッセンジャーＲＮＡ
を安定化するのに重要である。
【００５１】真核性ポリアデニル化部位は良く知られて
いる。真核性遺伝子の中にコンセンサスな配列が存在す
る。ヘキサヌクレオチド5'-AAUAAA -3' は、ポリアデニ
ル化がスタートする点から 11-30ヌクレオチドに発見さ
れる。ポリアデニル化部位を含むＤＮＡ配列は発表され
た報告に従ってビールスから得ることができる。例示的
なポリアデニル化配列 はマウスベータグロブリン、お
よびサルビールス40後期または早期域遺伝子から得るこ
とができるが、しかしビールスのポリアデニル化部位が
好ましい。これら配列は既知であるから、それらは生体
外で合成することができ、そしてベクターへ慣用の手法
でリゲートすることができる。
いる。真核性遺伝子の中にコンセンサスな配列が存在す
る。ヘキサヌクレオチド5'-AAUAAA -3' は、ポリアデニ
ル化がスタートする点から 11-30ヌクレオチドに発見さ
れる。ポリアデニル化部位を含むＤＮＡ配列は発表され
た報告に従ってビールスから得ることができる。例示的
なポリアデニル化配列 はマウスベータグロブリン、お
よびサルビールス40後期または早期域遺伝子から得るこ
とができるが、しかしビールスのポリアデニル化部位が
好ましい。これら配列は既知であるから、それらは生体
外で合成することができ、そしてベクターへ慣用の手法
でリゲートすることができる。
【００５２】ポリアデニル化域は、ＡＨＦおよび／また
は選択遺伝子のどちらからも下流に配置されなければな
らないが、どちらの遺伝子へリゲートすることもでき
る。それは生産物遺伝子ではなく、選択遺伝子のみへリ
ゲートすることができ、そしてベクターが結合していて
も結合していなくてもそうである。ほん訳ストップコー
ドンからポリアデニル化部位を分離する配列は、好まし
くはプロモートされない真核性遺伝子のようなほん訳さ
れないオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌ
クレオチドおよび遺伝子はプロモーターを付与されない
ので、それらは発現されないであろう。該オリゴヌクレ
オチドはストップコードンからポリアデニル化部位まで
約１，０００塩基までのオーダ ーでかなりの距離延長
しなければならない。この３’非ほん訳オリゴヌクレオ
チドは、一般に生産物収率の増加をもたらす。該ベクタ
ーはコンセンサス配列から下流約１０ないし約３０bpで
終わることができるが、しかしその野性タイプ環境にお
いてポリアデニル化部位から下流に見出される３' 配列
を保持することが好ましい。これら配列は、典型的には
ポリアデニル化部位から下流へ約２００ないし６００塩
基対延長する。
は選択遺伝子のどちらからも下流に配置されなければな
らないが、どちらの遺伝子へリゲートすることもでき
る。それは生産物遺伝子ではなく、選択遺伝子のみへリ
ゲートすることができ、そしてベクターが結合していて
も結合していなくてもそうである。ほん訳ストップコー
ドンからポリアデニル化部位を分離する配列は、好まし
くはプロモートされない真核性遺伝子のようなほん訳さ
れないオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌ
クレオチドおよび遺伝子はプロモーターを付与されない
ので、それらは発現されないであろう。該オリゴヌクレ
オチドはストップコードンからポリアデニル化部位まで
約１，０００塩基までのオーダ ーでかなりの距離延長
しなければならない。この３’非ほん訳オリゴヌクレオ
チドは、一般に生産物収率の増加をもたらす。該ベクタ
ーはコンセンサス配列から下流約１０ないし約３０bpで
終わることができるが、しかしその野性タイプ環境にお
いてポリアデニル化部位から下流に見出される３' 配列
を保持することが好ましい。これら配列は、典型的には
ポリアデニル化部位から下流へ約２００ないし６００塩
基対延長する。
【００５３】こゝに記載したベクターは当業者によく知
られた技術によって合成することができる。選択遺伝
子、エンハンサー、プロモーター等のようなベクターの
成分は天然源から得ることもできるし、または前記のよ
うに合成することもできる。基本的には、もし成分がビ
ールス機能のような成分のように、大量に入手し得るＤ
ＮＡ中に見出されるならば、またはポリアデニル化部位
のようにそれらを合成し得るならば、適当な制限酵素の
使用により、大量のベクターは、単に起源生物を培養
し、そのＤＮＡを適当なエンドヌクレアーゼで消化し、
ＤＮＡ断片を分離し、興味ある要素を含んでいるＤＮＡ
を同定し、そしてそれを回収することによって得ること
ができる。通常、形質転換ベクターは小量組立てられ、
そして次に真核性プラスミドまたはファージのような適
当な自律的に複製する合成ベクターへリゲートされるで
あろう。大部分の場合、pBR322ブラスミドを使用するこ
とができる。前出 Kaufman et al参照。
られた技術によって合成することができる。選択遺伝
子、エンハンサー、プロモーター等のようなベクターの
成分は天然源から得ることもできるし、または前記のよ
うに合成することもできる。基本的には、もし成分がビ
ールス機能のような成分のように、大量に入手し得るＤ
ＮＡ中に見出されるならば、またはポリアデニル化部位
のようにそれらを合成し得るならば、適当な制限酵素の
使用により、大量のベクターは、単に起源生物を培養
し、そのＤＮＡを適当なエンドヌクレアーゼで消化し、
ＤＮＡ断片を分離し、興味ある要素を含んでいるＤＮＡ
を同定し、そしてそれを回収することによって得ること
ができる。通常、形質転換ベクターは小量組立てられ、
そして次に真核性プラスミドまたはファージのような適
当な自律的に複製する合成ベクターへリゲートされるで
あろう。大部分の場合、pBR322ブラスミドを使用するこ
とができる。前出 Kaufman et al参照。
【００５４】合成ベクターは、例えばパーミッシブな真
核生物のトランスフェクション、高コピー数への合成ベ
クターの複製、細胞溶解による合成ベクターの回収、お
よび細胞片から合成ベクターの分離によって、慣用手法
によりリゲートした形質転換ベクターをクローン化する
ために使用される。
核生物のトランスフェクション、高コピー数への合成ベ
クターの複製、細胞溶解による合成ベクターの回収、お
よび細胞片から合成ベクターの分離によって、慣用手法
によりリゲートした形質転換ベクターをクローン化する
ために使用される。
【００５５】合成ベクターの得られる収穫物は真核性細
胞へ直接トランスフェクトすることができ、または形質
転換ベクターは、適当なエンドヌクレアーゼ消化、分子
量による分離、および形質転換ベクターの回収によっ
て、合成ベクターから救出することができる。形質転換
ベクター救出は、合成ベクタ ーの残部が真核性遺伝子
増幅、転写またはほん訳に悪影響しない限り必要でな
い。例えば、こゝで好ましい合成ベクターは、真核細胞
に対して有害な配列を除去した E. Coli変異株プラスミ
ド pBR322 である。前出 Kaufman et al参照。この変異
株の使用は、同時形質転換前に、プラスミド残部を除去
する必要性を全くなくす。
胞へ直接トランスフェクトすることができ、または形質
転換ベクターは、適当なエンドヌクレアーゼ消化、分子
量による分離、および形質転換ベクターの回収によっ
て、合成ベクターから救出することができる。形質転換
ベクター救出は、合成ベクタ ーの残部が真核性遺伝子
増幅、転写またはほん訳に悪影響しない限り必要でな
い。例えば、こゝで好ましい合成ベクターは、真核細胞
に対して有害な配列を除去した E. Coli変異株プラスミ
ド pBR322 である。前出 Kaufman et al参照。この変異
株の使用は、同時形質転換前に、プラスミド残部を除去
する必要性を全くなくす。
【００５６】同時形質転換、選択および増幅の検出 形質転換すべき細胞はイースプロトプラストを含む任意
の真核細胞でよいが、しかし通常は非カビ細胞である。
一次体外移植体（幹細胞のような比較的未分化細胞を含
む）、および死滅しないおよび／または形質転換された
細胞ラインが適当である。候補細胞は、選択遺伝子が優
性である限り選択遺伝子を遺伝子型的に欠けていなくて
もよい。
の真核細胞でよいが、しかし通常は非カビ細胞である。
一次体外移植体（幹細胞のような比較的未分化細胞を含
む）、および死滅しないおよび／または形質転換された
細胞ラインが適当である。候補細胞は、選択遺伝子が優
性である限り選択遺伝子を遺伝子型的に欠けていなくて
もよい。
【００５７】細胞は、好ましくは前に論じたように安定
な哺乳類細胞ラインであろう。それらの染色体ＤＮＡ中
へ選択遺伝子を安定に統合することが知られた細胞ライ
ン、例えばチャイニーズハムスター卵（CHO ）細胞ライ
ンが最良である。 COSサル細胞、Bowes 細胞ラインのよ
うなメラノーマ細胞ライン、マウスＬ細胞、マウス線維
芽細胞、およびマウス NIH 3T3細胞も使用し得る。
な哺乳類細胞ラインであろう。それらの染色体ＤＮＡ中
へ選択遺伝子を安定に統合することが知られた細胞ライ
ン、例えばチャイニーズハムスター卵（CHO ）細胞ライ
ンが最良である。 COSサル細胞、Bowes 細胞ラインのよ
うなメラノーマ細胞ライン、マウスＬ細胞、マウス線維
芽細胞、およびマウス NIH 3T3細胞も使用し得る。
【００５８】未結合ベクターによる同時転換は、順次ま
たは同時に達成することができる（米国特許第 4,399,2
16号を見よ）。細胞のＤＮＡ摂取を容易にする方法は前
に記載されている。細胞核中へのベクターのマイクロ注
入は最高形質転換効率を得るであろうが、しかしリン酸
カルシウム沈澱の形のＤＮＡへ親細胞を露出するのが最
も便利である。かなり良い同時形質転換効率は、１０
０：１のオーダーの選択遺伝子に対する生成物のモル過
剰による同時形質転換から得られる。
たは同時に達成することができる（米国特許第 4,399,2
16号を見よ）。細胞のＤＮＡ摂取を容易にする方法は前
に記載されている。細胞核中へのベクターのマイクロ注
入は最高形質転換効率を得るであろうが、しかしリン酸
カルシウム沈澱の形のＤＮＡへ親細胞を露出するのが最
も便利である。かなり良い同時形質転換効率は、１０
０：１のオーダーの選択遺伝子に対する生成物のモル過
剰による同時形質転換から得られる。
【００５９】形質転換条件へ曝露された細胞の個体群は
次にトランスフォーマントを同定するために処理され
る。同時形質転換のために処理された培養物の小個体群
だけが選択遺伝子の表現型を示すであろう。培養物中の
細胞は表現型についてスクリーニングされる。これら細
胞を個々に細胞選別装置でアッセイすることによって達
成することができ、その場合、表現型は選択遺伝子によ
って生産された酵素による螢光源物質の開裂時の螢光の
ような信号を発生する表現型である。しかしながら、好
ましくは該表現型は、前に詳しく論じたような特別の発
育培地中でトランスフォーマントのみが発育または生存
することを可能とする。
次にトランスフォーマントを同定するために処理され
る。同時形質転換のために処理された培養物の小個体群
だけが選択遺伝子の表現型を示すであろう。培養物中の
細胞は表現型についてスクリーニングされる。これら細
胞を個々に細胞選別装置でアッセイすることによって達
成することができ、その場合、表現型は選択遺伝子によ
って生産された酵素による螢光源物質の開裂時の螢光の
ような信号を発生する表現型である。しかしながら、好
ましくは該表現型は、前に詳しく論じたような特別の発
育培地中でトランスフォーマントのみが発育または生存
することを可能とする。
【００６０】選択トランスフォーマントは、次に生産物
遺伝子のそれらの染色体へのリゲーションについて、ま
たは生産物自体の発現についてスクリーニングされる。
前者はサウザンブロット分析によって達成することがで
き、後者は標準的な免疫学的または酵素的アッセイによ
って達成することができる。
遺伝子のそれらの染色体へのリゲーションについて、ま
たは生産物自体の発現についてスクリーニングされる。
前者はサウザンブロット分析によって達成することがで
き、後者は標準的な免疫学的または酵素的アッセイによ
って達成することができる。
【００６１】トランスフォーマントが同定されたなら
ば、ＭＴＸのような選択剤の存在下さらにクローニング
することによって生産物遺伝子の表現を増幅するための
ステップが実施される。米国特許第 4,399，216 号を見
よ。
ば、ＭＴＸのような選択剤の存在下さらにクローニング
することによって生産物遺伝子の表現を増幅するための
ステップが実施される。米国特許第 4,399，216 号を見
よ。
【００６２】こゝに記載したプロセスに従って調製し得
るトランスフォーマントは、公知技術による高等生物の
生体内トランスフェクションに適している。可能性ある
宿主動物の一次体外移植物または安定な細胞ラインが同
時形質転換され、そして該宿主、生産物タンパクが遺伝
子型的に欠けている実質上ほかに同質遺伝子的な宿主に
接種される。
るトランスフォーマントは、公知技術による高等生物の
生体内トランスフェクションに適している。可能性ある
宿主動物の一次体外移植物または安定な細胞ラインが同
時形質転換され、そして該宿主、生産物タンパクが遺伝
子型的に欠けている実質上ほかに同質遺伝子的な宿主に
接種される。
【００６３】本発明は、以下の例証具体例を参照してさ
らに理解されるであろう。該具体例は純粋に例示であ
り、そして請求の範囲に記載された本発明の真の範囲を
限定するものと解すべきではない。
らに理解されるであろう。該具体例は純粋に例示であ
り、そして請求の範囲に記載された本発明の真の範囲を
限定するものと解すべきではない。
【００６４】特記しない限り、制限エンドヌクレアーゼ
はそれらの商業的供給者が推奨する条件および態様で使
用される。リゲーション反応は、Maniatis et al., Mo
lecular Cloning, A Laboratory Manual，（Cold Sprin
g Harbor Laboratory 1982）, 245-6 頁（その記載を参
照としこゝに取り入れる）に記載されているように、そ
の第２４６頁に記載されている緩衝液を使用し、そして
ＤＮＡ濃度１〜１００μｇ／mgを使用し、鈍いＤＮＡ末
端に対しては２３℃の温度において、そしてくっつき易
いＤＮＡ末端に対しては１６℃において実施される。こ
ゝに記載した“フォスフォターゼ処理”とはＤＮＡの脱
フォスフォリル化を意味し、そして前出Maniatis et a
l.の１３３頁等に記載されている態様で実施される。
“キナーゼ処理”とはＤＮＡのフォスフォリル化を意味
する。電気泳動は、９０ mM トリス−ホウ酸塩，１０ m
M EDTAを含有する０．５〜１．５％アガロースゲル中で
実施される。“ニック−トランスレーティング”とは、
Rigby et al., J. Mol. Biol., 113：237 （1977）に記
載されているように、ＤＮＡを３２ｐで標識する方法を
意味する。すべての放射標識したＤＮＡは、どのような
標識技術が使用されようが、３２ｐで標識される。
はそれらの商業的供給者が推奨する条件および態様で使
用される。リゲーション反応は、Maniatis et al., Mo
lecular Cloning, A Laboratory Manual，（Cold Sprin
g Harbor Laboratory 1982）, 245-6 頁（その記載を参
照としこゝに取り入れる）に記載されているように、そ
の第２４６頁に記載されている緩衝液を使用し、そして
ＤＮＡ濃度１〜１００μｇ／mgを使用し、鈍いＤＮＡ末
端に対しては２３℃の温度において、そしてくっつき易
いＤＮＡ末端に対しては１６℃において実施される。こ
ゝに記載した“フォスフォターゼ処理”とはＤＮＡの脱
フォスフォリル化を意味し、そして前出Maniatis et a
l.の１３３頁等に記載されている態様で実施される。
“キナーゼ処理”とはＤＮＡのフォスフォリル化を意味
する。電気泳動は、９０ mM トリス−ホウ酸塩，１０ m
M EDTAを含有する０．５〜１．５％アガロースゲル中で
実施される。“ニック−トランスレーティング”とは、
Rigby et al., J. Mol. Biol., 113：237 （1977）に記
載されているように、ＤＮＡを３２ｐで標識する方法を
意味する。すべての放射標識したＤＮＡは、どのような
標識技術が使用されようが、３２ｐで標識される。
【００６５】“ラピッド プレップ”とは、例えば前出
Maniatis et al. 365-373 頁に記載されているバク
テリオファージまたはプラスミドＤＮＡの急速 小規模
生産を意味する。
Maniatis et al. 365-373 頁に記載されているバク
テリオファージまたはプラスミドＤＮＡの急速 小規模
生産を意味する。
【００６６】本発明の他の局面によれば、ＡＨＦの医薬
製剤が提供される。本発明に従って生産されたヒトＡＨ
Ｆの医薬製剤は、この技術分野においてよく知られた操
作に従って非経口投与のために製造される。
製剤が提供される。本発明に従って生産されたヒトＡＨ
Ｆの医薬製剤は、この技術分野においてよく知られた操
作に従って非経口投与のために製造される。
【００６７】ヒトに使用される医薬製剤は、形質転換し
た細胞から採取した滅菌したＡＨＦを含む。ＡＨＦポリ
ペプチドまたはＡＨＦ活性を産生するその十分な部分に
加え、一種またはそれ以上の許容し得るその担体と、そ
して場合により他の治療成分を含むことができる。担体
は、製剤の他の成分と共存し得るとの意味において許容
し得るものでなければならず、そしてその受容者にとっ
て有害であってはならない。該製剤は、単位投与形態で
便利に提供されることができ、そして薬剤学の分野にお
いて良く知られた任意の方法によって製造することがで
きる。
た細胞から採取した滅菌したＡＨＦを含む。ＡＨＦポリ
ペプチドまたはＡＨＦ活性を産生するその十分な部分に
加え、一種またはそれ以上の許容し得るその担体と、そ
して場合により他の治療成分を含むことができる。担体
は、製剤の他の成分と共存し得るとの意味において許容
し得るものでなければならず、そしてその受容者にとっ
て有害であってはならない。該製剤は、単位投与形態で
便利に提供されることができ、そして薬剤学の分野にお
いて良く知られた任意の方法によって製造することがで
きる。
【００６８】非経口投与に適した本発明の医薬製剤は、
有利には、好ましくは受容者の血液と等張である溶液を
つくるため滅菌した溶液の添加によって復元し得るＡＨ
Ｆポリペプチドの無菌凍結乾燥製剤を含むことができ
る。該製剤は、単位または多数投与容器、例えばシール
したアンプルまたはバイアル中に提供することができ
る。
有利には、好ましくは受容者の血液と等張である溶液を
つくるため滅菌した溶液の添加によって復元し得るＡＨ
Ｆポリペプチドの無菌凍結乾燥製剤を含むことができ
る。該製剤は、単位または多数投与容器、例えばシール
したアンプルまたはバイアル中に提供することができ
る。
【００６９】無菌ＡＨＦまたはその溶液に加え、本発明
の医薬製剤は希釈剤、緩衝剤、結合剤、界面活性剤、増
粘剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）その他のよう
な一種またはそれ以上の追加の成分を含んでもよい。ゼ
ラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、
微粉シリカゲル、ココアバター、タルク、植物性および
動物性油脂、植物性ゴム、およびポリアルキレングリコ
ール、および医薬用の他の既知の担体はすべて本発明の
医薬製剤の製造に適している。非経口用途のための製剤
は、担体である水または薬剤学的に許容し得る液体の無
菌溶液または懸濁液のアンプル、または薬剤学的に許容
し得る液体で希釈するための無菌固体ＡＨＦを含む。
の医薬製剤は希釈剤、緩衝剤、結合剤、界面活性剤、増
粘剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）その他のよう
な一種またはそれ以上の追加の成分を含んでもよい。ゼ
ラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、
微粉シリカゲル、ココアバター、タルク、植物性および
動物性油脂、植物性ゴム、およびポリアルキレングリコ
ール、および医薬用の他の既知の担体はすべて本発明の
医薬製剤の製造に適している。非経口用途のための製剤
は、担体である水または薬剤学的に許容し得る液体の無
菌溶液または懸濁液のアンプル、または薬剤学的に許容
し得る液体で希釈するための無菌固体ＡＨＦを含む。
【００７０】本発明の医薬製剤は、血友病Ａの治療に有
用である。これら製剤はまた、血液凝固が関与するプロ
セスの生体内および生体外研究において、およびＡＨＦ
分子の免疫学的および生物学的特徴の研究において、重
要な道具を提供する。
用である。これら製剤はまた、血液凝固が関与するプロ
セスの生体内および生体外研究において、およびＡＨＦ
分子の免疫学的および生物学的特徴の研究において、重
要な道具を提供する。
【００７１】実施例１ タンパク配列分析 ブタファクターVIII：Ｃを前出の KnutsenおよびFass
（1982）；Fasset al.（1982）に発表された操作に従っ
て、David Fassによって精製された。アミノ酸配列分析
は、以下に記載する７６，０００ダルトンタンパクのウ
シトロンビン消化生成物について実施される。
（1982）；Fasset al.（1982）に発表された操作に従っ
て、David Fassによって精製された。アミノ酸配列分析
は、以下に記載する７６，０００ダルトンタンパクのウ
シトロンビン消化生成物について実施される。
【００７２】抗VIII：Ｃモノクロナール抗体カラムへ結
合したブタＡＨＦポリペプチドは、２ステップにおいて
次々に溶離されることができる（Fasset al. 1982 ）。
二種の巨大分子量スペシス，１６６，０００および１３
０，０００ダルトンは EDTAで溶離し得る。約７６，０
００ダルトンの分子量を有する残りのポリペプチドは、
次に５０％エチレングリコールで溶離することができ
る。
合したブタＡＨＦポリペプチドは、２ステップにおいて
次々に溶離されることができる（Fasset al. 1982 ）。
二種の巨大分子量スペシス，１６６，０００および１３
０，０００ダルトンは EDTAで溶離し得る。約７６，０
００ダルトンの分子量を有する残りのポリペプチドは、
次に５０％エチレングリコールで溶離することができ
る。
【００７３】７６，０００ダルトンのタンパクは、５ m
M トリス− HCl（ pH ７．５），０．１５M NaCl中にお
ける広汎な透析の後、トロンビンで消化する。ウシトロ
ンビン消化は、ウシトロンビン１単位／mlを用いて室温
で６０分間実施し、さらにトロンビン１単位／mlを加
え、そしてさらに６０分間インキュベートする。トロン
ビン消化は０．０１％ＳＤＳ中９０℃で１０分間加熱す
ることによって打ち切る。７６，０００ダルトンタンパ
クの主なトロンビン消化生成物は、６９，０００ダルト
ン（６９Kd）のポリペプチドである。
M トリス− HCl（ pH ７．５），０．１５M NaCl中にお
ける広汎な透析の後、トロンビンで消化する。ウシトロ
ンビン消化は、ウシトロンビン１単位／mlを用いて室温
で６０分間実施し、さらにトロンビン１単位／mlを加
え、そしてさらに６０分間インキュベートする。トロン
ビン消化は０．０１％ＳＤＳ中９０℃で１０分間加熱す
ることによって打ち切る。７６，０００ダルトンタンパ
クの主なトロンビン消化生成物は、６９，０００ダルト
ン（６９Kd）のポリペプチドである。
【００７４】前記の６９ Kd ポリペプチドスペシスの１
μｇ以下を、U. K. Laemmli, Nature, 277：680 （197
0）（その記載をこゝに参照として取り入れる）の操作
によりＳＤＳゲル電気泳動後、放射性マーカーとして役
立つようにヨード化する。ＴＡＳ緩衝液（５０ mM トリ
ス−酢酸塩（ pH ７．８），０．１％ＳＤＳ）中に溶解
したポリペプチドを、担体を含まないヨウ素−１２５の
５ mCiを含む同じ緩衝液１００μＬへ加える。ＴＡＳ緩
衝液中２．５mg／mlのクロラミンＴ（ベーカー）５０μ
Ｌを加え、溶液を１分間かきまぜる。反応をＴＡＳ緩衝
液中メタ重亜硫酸ナトリウム２．５mg／ml溶液５０μＬ
を加え、１分間かきまぜることによって停止する。標識
したタンパクは小容積のセファデックスG-25 Mカラム
（PD-10,ファルマシア）を使用するクロマトグラフィー
により、取り込まれなかったＩ125 ら分離する。該カラ
ムは、ヨウ化ナトリウム２．５mg／mlを含むＴＡＳ緩衝
液の数倍カラム容積をもってあらかじめ平衡化される。
空容積を集め、そしてタンパク完全性を前出 Laemmli
（1970）の操作に従ってＳＤＳゲル電気泳動によって分
析する。
μｇ以下を、U. K. Laemmli, Nature, 277：680 （197
0）（その記載をこゝに参照として取り入れる）の操作
によりＳＤＳゲル電気泳動後、放射性マーカーとして役
立つようにヨード化する。ＴＡＳ緩衝液（５０ mM トリ
ス−酢酸塩（ pH ７．８），０．１％ＳＤＳ）中に溶解
したポリペプチドを、担体を含まないヨウ素−１２５の
５ mCiを含む同じ緩衝液１００μＬへ加える。ＴＡＳ緩
衝液中２．５mg／mlのクロラミンＴ（ベーカー）５０μ
Ｌを加え、溶液を１分間かきまぜる。反応をＴＡＳ緩衝
液中メタ重亜硫酸ナトリウム２．５mg／ml溶液５０μＬ
を加え、１分間かきまぜることによって停止する。標識
したタンパクは小容積のセファデックスG-25 Mカラム
（PD-10,ファルマシア）を使用するクロマトグラフィー
により、取り込まれなかったＩ125 ら分離する。該カラ
ムは、ヨウ化ナトリウム２．５mg／mlを含むＴＡＳ緩衝
液の数倍カラム容積をもってあらかじめ平衡化される。
空容積を集め、そしてタンパク完全性を前出 Laemmli
（1970）の操作に従ってＳＤＳゲル電気泳動によって分
析する。
【００７５】放射標識した６９ Kd タンパクを後のモニ
タリングのためその未標識対応タンパクへ加える。該タ
ンパクは次に個々に電気泳動的に濃縮される。タンパク
溶液は０．１％ＳＤＳ，１０ mM ジチオスレイトールへ
調節され、そしてCoomassieブリリアントブルー（Serva
）を加え、溶液を非常に薄くブルーに着色する。
タリングのためその未標識対応タンパクへ加える。該タ
ンパクは次に個々に電気泳動的に濃縮される。タンパク
溶液は０．１％ＳＤＳ，１０ mM ジチオスレイトールへ
調節され、そしてCoomassieブリリアントブルー（Serva
）を加え、溶液を非常に薄くブルーに着色する。
【００７６】溶液は次にスペクトラポア透析チューブ
（約１４，０００の分子量カットを有するSpectrum Med
ical Industries, Inc. 製）を使用してＴＡＳ緩衝液中
で大体透析する。透析したタンパクサンプルは、次に H
unkapiller et al., Meth. Enzymol.,Enzyme Structure
s, Part Ｉ, 91：227 （1983）によって示された設計の
電気泳動濃縮装置に入れられ、ＴＡＳ緩衝液中で２４時
間５０ボルトで濃縮される。
（約１４，０００の分子量カットを有するSpectrum Med
ical Industries, Inc. 製）を使用してＴＡＳ緩衝液中
で大体透析する。透析したタンパクサンプルは、次に H
unkapiller et al., Meth. Enzymol.,Enzyme Structure
s, Part Ｉ, 91：227 （1983）によって示された設計の
電気泳動濃縮装置に入れられ、ＴＡＳ緩衝液中で２４時
間５０ボルトで濃縮される。
【００７７】上の操作で濃縮された６９ Kd ＡＨＦポリ
ペプチドは、前出Laemmli に従ってＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルを通して電気泳動される。放射標識された
トレーサーポリペプチドのオートラジオグラフィーによ
って同定される、精製されたタンパクがゲルから切り出
され、電気溶離され、そして前出 Hunkapiller et al.
によって記載されたように濃縮される。濃縮されたタン
パクは、Hewicket al., J. Biol. Chem. 256 ：7990
（1981）に記載された気相シーケネーターを使用する直
接アミノ酸配列分析に適している。
ペプチドは、前出Laemmli に従ってＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルを通して電気泳動される。放射標識された
トレーサーポリペプチドのオートラジオグラフィーによ
って同定される、精製されたタンパクがゲルから切り出
され、電気溶離され、そして前出 Hunkapiller et al.
によって記載されたように濃縮される。濃縮されたタン
パクは、Hewicket al., J. Biol. Chem. 256 ：7990
（1981）に記載された気相シーケネーターを使用する直
接アミノ酸配列分析に適している。
【００７８】６９，０００ダルトントロンビン開裂生成
物の ２−４２残基を延びるアミノ末端配列は、図１に
図示するとおりである。１番目の残基“Ｘ”は同定でき
なかった。前出 Fass et al.によって記載された１６６
Kd ＡＨＦ断片の（Ａ）アミノ末端および（Ｂ）それか
らの４０ Kd ウシトロンビン消化生成物のアミノ酸配列
は図２に示されている。７６ Kd ポリペプチドのアミノ
末端は、X-Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu
Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile Phe である。
物の ２−４２残基を延びるアミノ末端配列は、図１に
図示するとおりである。１番目の残基“Ｘ”は同定でき
なかった。前出 Fass et al.によって記載された１６６
Kd ＡＨＦ断片の（Ａ）アミノ末端および（Ｂ）それか
らの４０ Kd ウシトロンビン消化生成物のアミノ酸配列
は図２に示されている。７６ Kd ポリペプチドのアミノ
末端は、X-Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gln Pro Glu Glu
Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile Phe である。
【００７９】実施例２ ブタＡＨＦ遺伝子のためのオリ
ゴヌクレオチドプローブの化学的合成 （ａ）ペンタペプチドプローブ給源 決定されたブタＡＨＦ断片の部分的アミノ酸配列は、ブ
タＡＨＦオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そして
合成することを許容する。遺伝暗号（表１）から、この
アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を予測することが
可能である。遺伝暗号は変性であるので、アミノ酸配列
毎に二つ以上の可能性あるＤＮＡコード配列が存在す
る。従って、正確なＤＮＡ配列を確かめるため、合理的
な 数のオリゴヌクレオチドのみを必要とするＡＨＦ分
子の区域に対して複数の相補性オリゴヌクレオチドプロ
ーブ配列が容易される。そのような区域は、最低の変性
度を有する５個ないし８個の連続するアミノ酸配列をサ
ーチすることによって選択される。該区域が選択された
後、オリゴヌクレオチドの給源が合成され、それは選択
された区域の５個ないし８個のアミノ酸をコードできる
すべての可能性あるＤＮＡ配列を含むであろう。
ゴヌクレオチドプローブの化学的合成 （ａ）ペンタペプチドプローブ給源 決定されたブタＡＨＦ断片の部分的アミノ酸配列は、ブ
タＡＨＦオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そして
合成することを許容する。遺伝暗号（表１）から、この
アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を予測することが
可能である。遺伝暗号は変性であるので、アミノ酸配列
毎に二つ以上の可能性あるＤＮＡコード配列が存在す
る。従って、正確なＤＮＡ配列を確かめるため、合理的
な 数のオリゴヌクレオチドのみを必要とするＡＨＦ分
子の区域に対して複数の相補性オリゴヌクレオチドプロ
ーブ配列が容易される。そのような区域は、最低の変性
度を有する５個ないし８個の連続するアミノ酸配列をサ
ーチすることによって選択される。該区域が選択された
後、オリゴヌクレオチドの給源が合成され、それは選択
された区域の５個ないし８個のアミノ酸をコードできる
すべての可能性あるＤＮＡ配列を含むであろう。
【００８０】ブタＡＨＦの６９，０００ダルトントロン
ビン開裂断片においては、アミノ末端から１８番目ない
し２２番目のアミノ酸までを含むペンタペプチド配列が
あり、これは、１５個のヌクレオチド長さに対し、めい
めい５個のコードンを有する１６個までの異なるＤＮＡ
配列によってコードされることができる。
ビン開裂断片においては、アミノ末端から１８番目ない
し２２番目のアミノ酸までを含むペンタペプチド配列が
あり、これは、１５個のヌクレオチド長さに対し、めい
めい５個のコードンを有する１６個までの異なるＤＮＡ
配列によってコードされることができる。
【００８１】 プローブは、混合物あたり２ないし８またはそれ以上の
オリゴヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドの限られ
た数の混合物を合成することによってつくられる。すべ
ての可能性あるコード配列を包囲するのに十分な給源が
つくられる。
オリゴヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドの限られ
た数の混合物を合成することによってつくられる。すべ
ての可能性あるコード配列を包囲するのに十分な給源が
つくられる。
【００８２】これらオリゴヌクレオチドは、例えば、そ
の記載を参照としこゝに取り入れるR. L. Letsinger et
al., J. Am. Chem. Soc. 98：3655（1967）に開示され
ているフォスフォトリエステル法により、人手によって
合成することができる。他の方法はこの分野で良く知ら
れている。こゝにその記載を参照として取り入れた Mat
teucciおよびCaruthers,J. Am. Chem. Soc. 103 ：3185
（1981）参照。
の記載を参照としこゝに取り入れるR. L. Letsinger et
al., J. Am. Chem. Soc. 98：3655（1967）に開示され
ているフォスフォトリエステル法により、人手によって
合成することができる。他の方法はこの分野で良く知ら
れている。こゝにその記載を参照として取り入れた Mat
teucciおよびCaruthers,J. Am. Chem. Soc. 103 ：3185
（1981）参照。
【００８３】しかしながら、好ましくは所望のポリペプ
チド配列のための合成オリゴヌクレオチドプローブは、
上に示した完全自動アプライド、バイオシステムズ、Ｄ
ＮＡシンセサイザーの助けにより、同じ化学によって合
成される。
チド配列のための合成オリゴヌクレオチドプローブは、
上に示した完全自動アプライド、バイオシステムズ、Ｄ
ＮＡシンセサイザーの助けにより、同じ化学によって合
成される。
【００８４】このように製造されたオリゴヌクレオチド
は、次にその記載を参照としてこゝに取り入れた H. Fr
itz et al., Biochemistry, 17：1257（1978）に記載さ
れているような逆 HPLC カラム上で精製することができ
る。８０％ HOAc による脱トリチル化の後、得られるオ
リゴヌクレオチドは通常純粋であり、そしてプローブと
して直接使用することができる。もし夾雑物があれば、
合成ＤＮＡは好ましくは少し異なる勾配システムを使用
して、同じ HPLC カラム上でさらに精製することができ
る。
は、次にその記載を参照としてこゝに取り入れた H. Fr
itz et al., Biochemistry, 17：1257（1978）に記載さ
れているような逆 HPLC カラム上で精製することができ
る。８０％ HOAc による脱トリチル化の後、得られるオ
リゴヌクレオチドは通常純粋であり、そしてプローブと
して直接使用することができる。もし夾雑物があれば、
合成ＤＮＡは好ましくは少し異なる勾配システムを使用
して、同じ HPLC カラム上でさらに精製することができ
る。
【００８５】オリゴヌクレオチドは〔−３２ｐ〕ATP お
よびT4ポリペプチドキナーゼを使用することによって標
識され、そしてそれらの配列は、その記載を参照として
取り入れる Sanger et al., PNAS U.S.A．70：1209（19
73）に記載された二次元クロマトグラフィーにより、ま
たはMeth. Enzymology 65：499 （1977）記載の Maxan
-Gilbert法によって検定される。
よびT4ポリペプチドキナーゼを使用することによって標
識され、そしてそれらの配列は、その記載を参照として
取り入れる Sanger et al., PNAS U.S.A．70：1209（19
73）に記載された二次元クロマトグラフィーにより、ま
たはMeth. Enzymology 65：499 （1977）記載の Maxan
-Gilbert法によって検定される。
【００８６】（ｂ）４５個ヌクレオチドプローブ 本発明の独特な面は、ＡＨＦ遺伝子またはその断片につ
いてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
め、オリゴヌクレオチドプローブを使用することであ
る。オリゴヌクレオチドはｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングするために使用されているが（ここにその記
載を参照として取り入れるM. Jaye et al., Nuclei Aci
d Research, 11：2325（1982）参照）、ゲノムライブラ
リーは以前ｃＤＮＡプローブのみにより、すなわち記載
されたタンパクのための組織源が同定され、そしてゲノ
ムサーチによって発見された遺伝子のＤＮＡ配列に正確
にマッチしたｃＤＮＡを生産するのに用いられた後で生
産されたプローブにより成功してスクリーニングされて
いた。
いてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
め、オリゴヌクレオチドプローブを使用することであ
る。オリゴヌクレオチドはｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングするために使用されているが（ここにその記
載を参照として取り入れるM. Jaye et al., Nuclei Aci
d Research, 11：2325（1982）参照）、ゲノムライブラ
リーは以前ｃＤＮＡプローブのみにより、すなわち記載
されたタンパクのための組織源が同定され、そしてゲノ
ムサーチによって発見された遺伝子のＤＮＡ配列に正確
にマッチしたｃＤＮＡを生産するのに用いられた後で生
産されたプローブにより成功してスクリーニングされて
いた。
【００８７】本件の場合、興味あるタンパクのアミノ酸
配列をコードするゲノムライブラリー中の遺伝子セグメ
ントを同定するためにオリゴヌクレオチドを使用するこ
とが可能であることが示され、そしてそのような遺伝子
セグメントの同定はｍＲＮＡ，ｃＤＮＡまたはその後の
ゲノムスクリーニング技術に使用するための性格なプロ
ーブを提供する。
配列をコードするゲノムライブラリー中の遺伝子セグメ
ントを同定するためにオリゴヌクレオチドを使用するこ
とが可能であることが示され、そしてそのような遺伝子
セグメントの同定はｍＲＮＡ，ｃＤＮＡまたはその後の
ゲノムスクリーニング技術に使用するための性格なプロ
ーブを提供する。
【００８８】好ましくは、こゝでそうであるように、興
味あるタンパクのアミノ酸配列の少なくとも２個のセグ
メントに対応するオリゴヌクレオチドが使用される。好
ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１
個が、選択されたアミノ酸配列をコードし得るすべての
可能性あるＤＮＡ配列を総合して含むオリゴヌクレオチ
ドの一つまたはそれ以上の給源の形で使用される。好ま
しくは、比較的短いプローブ、例えば１１ないし２５ヌ
クレオチド、好ましくは１５ないし２０ヌクレオチドが
比較的長いプローブ、例えば３０ないし２００ヌクレオ
チド、好ましくは４０ないし５０ヌクレオチドと組合せ
て使用される。２番目のプローブは確認のために使用す
ることができ、そしてＤＮＡセグメントの同定のために
は常に必要ではない。好ましくは、プローブの一方、そ
してもっと好ましくは長い方のプローブは以下に記載す
る規則１ないし４に従って設計される。
味あるタンパクのアミノ酸配列の少なくとも２個のセグ
メントに対応するオリゴヌクレオチドが使用される。好
ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１
個が、選択されたアミノ酸配列をコードし得るすべての
可能性あるＤＮＡ配列を総合して含むオリゴヌクレオチ
ドの一つまたはそれ以上の給源の形で使用される。好ま
しくは、比較的短いプローブ、例えば１１ないし２５ヌ
クレオチド、好ましくは１５ないし２０ヌクレオチドが
比較的長いプローブ、例えば３０ないし２００ヌクレオ
チド、好ましくは４０ないし５０ヌクレオチドと組合せ
て使用される。２番目のプローブは確認のために使用す
ることができ、そしてＤＮＡセグメントの同定のために
は常に必要ではない。好ましくは、プローブの一方、そ
してもっと好ましくは長い方のプローブは以下に記載す
る規則１ないし４に従って設計される。
【００８９】規則１．コードン優先性 他の配慮なしに、類似の哺乳類遺伝子中の支配的または
類似の配列にマッチしたヌクレオチドが選ばれた。Mech
anism of Ageing Dev., 18：（1982）参照。
類似の配列にマッチしたヌクレオチドが選ばれた。Mech
anism of Ageing Dev., 18：（1982）参照。
【００９０】規則２．有利なＧＴ対合 ヌクレオチドＧは、その相補体Ｃへの結合に加えて、ヌ
クレオチドＴと弱い結合を生成し得る。Agarwal et a
l., J. Biol. Chem.256 ：1023（1981）参照。このた
め、不確実なコードンの第３の部分のためＧまたはＡの
選択に直面して、Ｇを選ぶことが好ましい。それはもし
生ずるハイブリッド化が該位置の実際のヌクレオチドが
Ｃでなく、Ｔであってもおこるならば、該ハイブリッド
化はなお安定であるからである。もし誤ってＡが選ばれ
たならば、対応するＡ：Ｃ不和合性はプローブがゲノム
ＤＮＡとハイブリッド化する能力を破壊するのに十分で
あり得る。
クレオチドＴと弱い結合を生成し得る。Agarwal et a
l., J. Biol. Chem.256 ：1023（1981）参照。このた
め、不確実なコードンの第３の部分のためＧまたはＡの
選択に直面して、Ｇを選ぶことが好ましい。それはもし
生ずるハイブリッド化が該位置の実際のヌクレオチドが
Ｃでなく、Ｔであってもおこるならば、該ハイブリッド
化はなお安定であるからである。もし誤ってＡが選ばれ
たならば、対応するＡ：Ｃ不和合性はプローブがゲノム
ＤＮＡとハイブリッド化する能力を破壊するのに十分で
あり得る。
【００９１】規則３．5'CG配列の回避 可能性ある不確実性から選択する時、コードン内にせ
よ、コードン間にせよ、5'CpG 配列を含まないヌクレオ
チドを選択せよ。
よ、コードン間にせよ、5'CpG 配列を含まないヌクレオ
チドを選択せよ。
【００９２】規則４．ミスマッチ位置 使用のためコードン配列を選ぶにあたり、分子の末端近
くのミスマッチは、分子の中心近くのミスマッチほどハ
イブリッド化に悪影響しないとの仮説が考慮された。こ
のため、例えば特定のコードンの配列に関して実質的な
疑問が発生し、そしてそのコードンがプローブの中心に
近い場合、傾向は該コードンについて可能性あるヌクレ
オチド配列の給源をテストすることであったが、プロー
ブの末端近くのコードン位置はコードン優先性に基づく
決定の対象らしかった。
くのミスマッチは、分子の中心近くのミスマッチほどハ
イブリッド化に悪影響しないとの仮説が考慮された。こ
のため、例えば特定のコードンの配列に関して実質的な
疑問が発生し、そしてそのコードンがプローブの中心に
近い場合、傾向は該コードンについて可能性あるヌクレ
オチド配列の給源をテストすることであったが、プロー
ブの末端近くのコードン位置はコードン優先性に基づく
決定の対象らしかった。
【００９３】４５−マ−プローブのため選ばれた配列お
よびアミノ酸配列、可能性あるＤＮＡ配列、および実際
のプローブ配列、すなわちＡＨＦエクソンのために決定
された実際にコードするストランドの相補体は図３に示
すとおりである。
よびアミノ酸配列、可能性あるＤＮＡ配列、および実際
のプローブ配列、すなわちＡＨＦエクソンのために決定
された実際にコードするストランドの相補体は図３に示
すとおりである。
【００９４】このようにして、選択を含むヌクレオチド
位置の中で、３種が両方の可能性あるヌクレオチド選択
群を含む給源を使用することによってカバーされ、５種
が正しく予測され、１種が正しくないが幾分中立性を維
持することが予測され、そして他の４種は誤りであっ
た。約１１％のミスマッチ（５／４５）にもかゝわら
ず、４５−マ−オリゴヌクレオチドの給源は、以下記載
するようにブタＡＨＦ遺伝子断片を強く同定するために
適切である。
位置の中で、３種が両方の可能性あるヌクレオチド選択
群を含む給源を使用することによってカバーされ、５種
が正しく予測され、１種が正しくないが幾分中立性を維
持することが予測され、そして他の４種は誤りであっ
た。約１１％のミスマッチ（５／４５）にもかゝわら
ず、４５−マ−オリゴヌクレオチドの給源は、以下記載
するようにブタＡＨＦ遺伝子断片を強く同定するために
適切である。
【００９５】 実施例３ ブタゲノムライブラリーのスクリーニング ブタゲノムライブラリーがバクテリオファージベクター
ラムダJ1を使用して構成される。ラムダJ1はＬ４７．１
（Loenen et al.,Gene, 20：249 （1980））から、１．
３７ kb および２．８３ kb Eco RI-BamHI断片を 95 kb
Eco R1-HindIII-Xba I-bg1 II-Bam HIポリリンカーに
よって置換することによって得られる。６．６ kb Bam
HI断片はその時Ｌ４７．１に関して逆の配向の直接の反
復体として存在する。Bam HI断片についてクローニング
能力は８．６〜２３．８ kb である。Bam HI開裂ブタＤ
ＮＡ（Piccini et al., Cell, 30：205 （1982）に記載
のように調製した）をフェノール抽出し、エタノール沈
澱し、そしてマイクロフュージ中の遠心によって濃縮す
る。Bam HIブタＤＮＡ０．６７μｇを、 T4 ＤＮＡリガ
ーゼ（前出Maniatis et al., 474頁）１０単位を含む１
０μＬリゲーション緩衝液中において、前出Maniatis e
t al., 275-279頁に記載するように調製したラムダJ1Ba
m HIアームの２μｇへリゲートする。リゲートしてＤＮ
Ａはパッケージされ、そして前出Maniatis et al., 291
頁に記載されているようにプレートされる。
ラムダJ1を使用して構成される。ラムダJ1はＬ４７．１
（Loenen et al.,Gene, 20：249 （1980））から、１．
３７ kb および２．８３ kb Eco RI-BamHI断片を 95 kb
Eco R1-HindIII-Xba I-bg1 II-Bam HIポリリンカーに
よって置換することによって得られる。６．６ kb Bam
HI断片はその時Ｌ４７．１に関して逆の配向の直接の反
復体として存在する。Bam HI断片についてクローニング
能力は８．６〜２３．８ kb である。Bam HI開裂ブタＤ
ＮＡ（Piccini et al., Cell, 30：205 （1982）に記載
のように調製した）をフェノール抽出し、エタノール沈
澱し、そしてマイクロフュージ中の遠心によって濃縮す
る。Bam HIブタＤＮＡ０．６７μｇを、 T4 ＤＮＡリガ
ーゼ（前出Maniatis et al., 474頁）１０単位を含む１
０μＬリゲーション緩衝液中において、前出Maniatis e
t al., 275-279頁に記載するように調製したラムダJ1Ba
m HIアームの２μｇへリゲートする。リゲートしてＤＮ
Ａはパッケージされ、そして前出Maniatis et al., 291
頁に記載されているようにプレートされる。
【００９６】約４×１０5 pfu が、８，０００ pfu／プ
レートの割合で NZCYMアガロースを収容した１５cmプラ
スチックプトリ皿上のE. coli 株ｃ６００上にプレート
される。これら組換えファージは前述の４５−マ−プロ
ーブを使用して Wooの方法（1979）によってスクリーニ
ングされ、プローブとして、前述のように３２ｐで放射
標識される。フィルターが次に５×SSC,５×Denhardt,
０．１％ＳＤＳ，および５×１０6 cpm／mlプローブ中
で、４５℃において１６時間ハイブリッド化され、５×
SSC,０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄され、そして高輝度
スクリーン（デュポンライトニンク−プラス）を使用す
るオートラジオグラフィーへかけられる。オートラジオ
グラフィーは、種々の程度で４５−マ−とハイブリッド
化したファージを明らかにする。フィルターは次に０．
５M NaOH中で変性され、１．０MトリスpH７．５，１．
５M NaCl中で中和され、そしてハイブリッド化および洗
浄温度が３７℃であるほかは４５−マ−について記載し
たとおりに１５−マ−へハイブリッド化する。両方のプ
ローブへハイブリッド化された一つのファージを元のプ
レートから取り、そして１００pfu をプレートし、溶菌
斑を前記のように１５−マ−をプローブとして用いてス
クリーニングする。
レートの割合で NZCYMアガロースを収容した１５cmプラ
スチックプトリ皿上のE. coli 株ｃ６００上にプレート
される。これら組換えファージは前述の４５−マ−プロ
ーブを使用して Wooの方法（1979）によってスクリーニ
ングされ、プローブとして、前述のように３２ｐで放射
標識される。フィルターが次に５×SSC,５×Denhardt,
０．１％ＳＤＳ，および５×１０6 cpm／mlプローブ中
で、４５℃において１６時間ハイブリッド化され、５×
SSC,０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄され、そして高輝度
スクリーン（デュポンライトニンク−プラス）を使用す
るオートラジオグラフィーへかけられる。オートラジオ
グラフィーは、種々の程度で４５−マ−とハイブリッド
化したファージを明らかにする。フィルターは次に０．
５M NaOH中で変性され、１．０MトリスpH７．５，１．
５M NaCl中で中和され、そしてハイブリッド化および洗
浄温度が３７℃であるほかは４５−マ−について記載し
たとおりに１５−マ−へハイブリッド化する。両方のプ
ローブへハイブリッド化された一つのファージを元のプ
レートから取り、そして１００pfu をプレートし、溶菌
斑を前記のように１５−マ−をプローブとして用いてス
クリーニングする。
【００９７】PB 34 と命名された陽性ファージをプラグ
として取り、そして前出Maniatis et al., 65-66頁に記
載されているようにプレート溶解質をつくるために使用
した。小規模のPB 34 ＤＮＡの単離が前出Maniatis et
al., 371-372頁記載の操作を使用して達成される。こＤ
ＮＡの１０μＬを制限酵素Hae III で切断し、次に子ウ
シアルカリ性フォスファターゼ（ベーリンガーマンハイ
ム）を使用してラオスファターゼ処理された。フェノー
ル抽出した後、Sma I 切断 M13mp8 ＤＮＡを添加し、溶
液を０．２M NaClとし、そして２容積のエタノールの添
加によって核酸を沈澱する。沈澱したＤＮＡは遠心によ
ってペレット化され、そしてリゲーション混合物２μＬ
中に再溶解され、そしてＤＮＡは２３℃で３０分間リゲ
ートされ、リガーゼ緩衝液で５０μＬへ希釈され、さら
に３時間リゲートされる。この反応物５μＬがE. coli
JM 101／TG 1株を形質転換するために使用される。
として取り、そして前出Maniatis et al., 65-66頁に記
載されているようにプレート溶解質をつくるために使用
した。小規模のPB 34 ＤＮＡの単離が前出Maniatis et
al., 371-372頁記載の操作を使用して達成される。こＤ
ＮＡの１０μＬを制限酵素Hae III で切断し、次に子ウ
シアルカリ性フォスファターゼ（ベーリンガーマンハイ
ム）を使用してラオスファターゼ処理された。フェノー
ル抽出した後、Sma I 切断 M13mp8 ＤＮＡを添加し、溶
液を０．２M NaClとし、そして２容積のエタノールの添
加によって核酸を沈澱する。沈澱したＤＮＡは遠心によ
ってペレット化され、そしてリゲーション混合物２μＬ
中に再溶解され、そしてＤＮＡは２３℃で３０分間リゲ
ートされ、リガーゼ緩衝液で５０μＬへ希釈され、さら
に３時間リゲートされる。この反応物５μＬがE. coli
JM 101／TG 1株を形質転換するために使用される。
【００９８】細胞は、SOBM培地５０ml中（SOBMは、トリ
プトン２％，イースト抽出物０．５％，NaCl０．１M, K
OH０．１１ｇ／Ｌ，２０ mM MgSO4 である）３７℃でO.
D.500 ０．５まで発育させることによって形質転換に
対して適応させる。細胞は２５００rpm において１０分
間４℃において遠心することによってペレット化され
る。細胞は、１００mMRbCl，４５ mM MnCl2 ，５０ mM
CaCl2 ，１０ mM MES カリウムpH６．４（ MES＝メチル
エタンスルホン酸）３．５ml中に再懸濁される。
プトン２％，イースト抽出物０．５％，NaCl０．１M, K
OH０．１１ｇ／Ｌ，２０ mM MgSO4 である）３７℃でO.
D.500 ０．５まで発育させることによって形質転換に
対して適応させる。細胞は２５００rpm において１０分
間４℃において遠心することによってペレット化され
る。細胞は、１００mMRbCl，４５ mM MnCl2 ，５０ mM
CaCl2 ，１０ mM MES カリウムpH６．４（ MES＝メチル
エタンスルホン酸）３．５ml中に再懸濁される。
【００９９】適切な細胞２００μＬがリゲーション反応
物５ml中に含まれるＤＮＡで０℃において３０分間形質
転換される。細胞は次に４２℃で９０秒ヒートショック
され、その後静止JM 101／TG 1細胞１００μＬを含有す
る０．８％アガロース／SOBM４mlが添加され、１０cm S
OBM アガロースペトリ皿上にプレートされる。
物５ml中に含まれるＤＮＡで０℃において３０分間形質
転換される。細胞は次に４２℃で９０秒ヒートショック
され、その後静止JM 101／TG 1細胞１００μＬを含有す
る０．８％アガロース／SOBM４mlが添加され、１０cm S
OBM アガロースペトリ皿上にプレートされる。
【０１００】１５−マ−へハイブリッド化する、 PB 34
からのHae III 断片を含んでいるサブクローンが、前出
のBentonおよびDavis の操作を使用してスクリーニング
することによって同定される。このクローンが単離さ
れ、鋳型として使用するために調製される。34-H1 と命
名された、このクローン中に存在するHae III 断片のＤ
ＮＡ配列が図５に示されている。M 13鋳型ＤＮＡは感染
させた細胞を３７℃で５時間生育することによって調製
される。細胞はベックマンマイクロフュージ中で１０分
間遠心することによってペレット化される。上清１．０
ml（ビールスを含んでいる）を除去し、２０％ポリエチ
レングリコール，２．５M NaCl２００μＬを加える。こ
のサンプルを次に室温で１５分間インキュベートし、ベ
ックマンマイクロフュージ中で５分間遠心する。ペレッ
トを TE １００ml中に溶解し、４MNaCH3COOpH４．５の
７．５μＬを加え、そしてサンプルをフェノール−クロ
ロホルム１：１混合物で２回、そしてクロロホルムで１
回抽出する。単一ストランドのファージＤＮＡを次にエ
タノール２容積の添加によって沈澱させる。沈澱したＤ
ＮＡはベックマンマイクロフュージ中の遠心によってペ
レット化し、１ mM トリス pH ８．０，０．１ mM EDTA
３０μＬ中に溶解する。ＤＮＡ配列決定は、１５−マ−
をプライマーとして使用し、ジデオキシ鎖成端技術によ
って実施する。Sangeret al., PNAS U.S.A., 74 ：5463
（1977）参照。図４および図５に示した配列中に含まれ
る、観察された配列は、第１に表した６９ Kd 断片のア
ミノ末端配列中のフェニルアラニン2 からグルタミン15
までの区域によって囲まれた同じ１４個のアミノ酸を含
むので、該サブクローンがブタＡＨＦエクソンを含んで
いることを確認した。それ以上の確認は、34-H1 ベクタ
ー中のポリリンカーの隣接点にユニバーサルプライマー
（Bethesda Research Labs ）をプライミングすること
により、34-H1 ベクター中のHae III インサートの5'端
から配列決定することによって得られた。また、34-H1
と命名されたこのクローンからのインサートは、ＤＮＡ
をEco RIおよびHind IIIで制限し、子ウシアルカリ性フ
ォスファターゼでフォスファターゼ処理し、そして Eco
RI, Hind III 開裂 M13mp9 ＤＮＡヘリゲートすること
により、 M13mp9 中へ再クローンされた。ユニバーサル
プライマーに関してHae III セグメントの反転を含有す
るこのクローンも前述のように配列決定された。インサ
ート34-H1 のすべてについての得られた配列データは図
５に示されている。この配列は、このサブクローンは、
ヌクレオチド１６９から２６７までにおいて、６９Kd断
片（図１）のフェニルアラニン2 からアルギニン31まで
の少なくとも３０個のアミノ酸をコードできるブタＡＨ
Ｆ遺伝子のエクソンを含有していることを確認する。
からのHae III 断片を含んでいるサブクローンが、前出
のBentonおよびDavis の操作を使用してスクリーニング
することによって同定される。このクローンが単離さ
れ、鋳型として使用するために調製される。34-H1 と命
名された、このクローン中に存在するHae III 断片のＤ
ＮＡ配列が図５に示されている。M 13鋳型ＤＮＡは感染
させた細胞を３７℃で５時間生育することによって調製
される。細胞はベックマンマイクロフュージ中で１０分
間遠心することによってペレット化される。上清１．０
ml（ビールスを含んでいる）を除去し、２０％ポリエチ
レングリコール，２．５M NaCl２００μＬを加える。こ
のサンプルを次に室温で１５分間インキュベートし、ベ
ックマンマイクロフュージ中で５分間遠心する。ペレッ
トを TE １００ml中に溶解し、４MNaCH3COOpH４．５の
７．５μＬを加え、そしてサンプルをフェノール−クロ
ロホルム１：１混合物で２回、そしてクロロホルムで１
回抽出する。単一ストランドのファージＤＮＡを次にエ
タノール２容積の添加によって沈澱させる。沈澱したＤ
ＮＡはベックマンマイクロフュージ中の遠心によってペ
レット化し、１ mM トリス pH ８．０，０．１ mM EDTA
３０μＬ中に溶解する。ＤＮＡ配列決定は、１５−マ−
をプライマーとして使用し、ジデオキシ鎖成端技術によ
って実施する。Sangeret al., PNAS U.S.A., 74 ：5463
（1977）参照。図４および図５に示した配列中に含まれ
る、観察された配列は、第１に表した６９ Kd 断片のア
ミノ末端配列中のフェニルアラニン2 からグルタミン15
までの区域によって囲まれた同じ１４個のアミノ酸を含
むので、該サブクローンがブタＡＨＦエクソンを含んで
いることを確認した。それ以上の確認は、34-H1 ベクタ
ー中のポリリンカーの隣接点にユニバーサルプライマー
（Bethesda Research Labs ）をプライミングすること
により、34-H1 ベクター中のHae III インサートの5'端
から配列決定することによって得られた。また、34-H1
と命名されたこのクローンからのインサートは、ＤＮＡ
をEco RIおよびHind IIIで制限し、子ウシアルカリ性フ
ォスファターゼでフォスファターゼ処理し、そして Eco
RI, Hind III 開裂 M13mp9 ＤＮＡヘリゲートすること
により、 M13mp9 中へ再クローンされた。ユニバーサル
プライマーに関してHae III セグメントの反転を含有す
るこのクローンも前述のように配列決定された。インサ
ート34-H1 のすべてについての得られた配列データは図
５に示されている。この配列は、このサブクローンは、
ヌクレオチド１６９から２６７までにおいて、６９Kd断
片（図１）のフェニルアラニン2 からアルギニン31まで
の少なくとも３０個のアミノ酸をコードできるブタＡＨ
Ｆ遺伝子のエクソンを含有していることを確認する。
【０１０１】成端コードンはすべての三つの読み取りフ
レームにおいてヌクレオチド２６７（図５）から下流に
発見することができ、そして一致した5'継木部位配列も
ヌクレオチド２６６−２６７間の該区域に発見されるの
で、アルギニン31はイントロンを境界するように見え
る。さらに、下流ＤＮＡによってコードされるであろう
アミノ酸配列は、ブタＡＨＦの６９ Kd 断片に観察され
るそれと完全に異なっている。
レームにおいてヌクレオチド２６７（図５）から下流に
発見することができ、そして一致した5'継木部位配列も
ヌクレオチド２６６−２６７間の該区域に発見されるの
で、アルギニン31はイントロンを境界するように見え
る。さらに、下流ＤＮＡによってコードされるであろう
アミノ酸配列は、ブタＡＨＦの６９ Kd 断片に観察され
るそれと完全に異なっている。
【０１０２】PB 34 ＤＮＡは Bam HI で切断され、そし
てアガロースゲルを通して電気泳動され、そしてゲルを
５μｇ／ml臭化エチジウム中で染色した後紫外線によっ
て可視化された。約６．６kb, ６．０kb, １．８kbの三
つのインサートが観察された。ゲル中のＤＮＡは前出 M
aniatis et al. 383-386頁に記載のようにニトロセルロ
ースへ移された。ロ過物の１５−マ−へのハイブリッド
化およびオートラジオグラフィーが前述のように実施れ
さた。オートラジオグラフィーは、６．０kbバンドが１
５−マ−プローブへハイブリッド化されたＡＨＦ遺伝子
断片を含んでいることを示した。
てアガロースゲルを通して電気泳動され、そしてゲルを
５μｇ／ml臭化エチジウム中で染色した後紫外線によっ
て可視化された。約６．６kb, ６．０kb, １．８kbの三
つのインサートが観察された。ゲル中のＤＮＡは前出 M
aniatis et al. 383-386頁に記載のようにニトロセルロ
ースへ移された。ロ過物の１５−マ−へのハイブリッド
化およびオートラジオグラフィーが前述のように実施れ
さた。オートラジオグラフィーは、６．０kbバンドが１
５−マ−プローブへハイブリッド化されたＡＨＦ遺伝子
断片を含んでいることを示した。
【０１０３】このように、ブタＡＨＦをコードする遺伝
子の部分がはじめて単離され、同定された。バクテリオ
ファージラムダ組換えクロンPB34は、 ATCC 40087 とし
てアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄
託されている。
子の部分がはじめて単離され、同定された。バクテリオ
ファージラムダ組換えクロンPB34は、 ATCC 40087 とし
てアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄
託されている。
【０１０４】実施例４ ヒトＡＨＦ遺伝子の位置決定 Maniatis et al., Cell, 15：678 （1978）によって記
載されたヒトゲノムライブラリーが、E. coli LE 392株
（一般に入手可能）を６×１０5 pfu で感染させ、そし
て１５cm NZCYM寒天プレート上に２０，０００ pfu／プ
レートの密度でプレートすることにより、ヒトＡＨＦ遺
伝子についてスクリーニングされる。これらファージは
前出の Benton およびDavis の操作を用い、実施例３に
記載した６．０ kb ブタＡＨＦ断片でスクリーニング
し、プローブとしてニックトランスレーションによって
３２ｐで標識される。強いハイブリッド化信号を示すフ
ァージを採取し、約１００ pfu／１０cmプレートでプレ
ートし、一方のプローブとして放射標識した４５−マ−
を、そして他方のプローブとして６．０ kb Bam HI断片
を使用し、前述のように二重にスクリーニングする。両
方のプローブへハイブリッド化する HH-25と命名された
ファージが同定され、プレートストックがつくられ、そ
して前述のようにラピッドプレップＤＮＡが調製され
る。ファージＤＮＡが Sau 3A I で切断され、子ウシア
ルカリ性フォスファターゼでフォスファターゼ処理さ
れ、フェノール抽出され、そして Bam HI 切断 M13mp8
ＤＮＡの２０ngと共沈される。沈澱したＤＮＡは遠心に
よってペレット化され、 T4 ＤＮＡリガーゼを含有する
リガーゼ緩衝液２μＬ中に再溶解される。リゲーション
は１６℃において２分間実施され、 T4 ＤＮＡリガーゼ
を含有するリガーゼ緩衝液５０μＬへ希釈され、１６℃
でさらに３時間インキュベートされる。この反応混合物
５μＬが実施例に記載したようにE. coli JM 101／TG 1
株を形質転換するために使用される。
載されたヒトゲノムライブラリーが、E. coli LE 392株
（一般に入手可能）を６×１０5 pfu で感染させ、そし
て１５cm NZCYM寒天プレート上に２０，０００ pfu／プ
レートの密度でプレートすることにより、ヒトＡＨＦ遺
伝子についてスクリーニングされる。これらファージは
前出の Benton およびDavis の操作を用い、実施例３に
記載した６．０ kb ブタＡＨＦ断片でスクリーニング
し、プローブとしてニックトランスレーションによって
３２ｐで標識される。強いハイブリッド化信号を示すフ
ァージを採取し、約１００ pfu／１０cmプレートでプレ
ートし、一方のプローブとして放射標識した４５−マ−
を、そして他方のプローブとして６．０ kb Bam HI断片
を使用し、前述のように二重にスクリーニングする。両
方のプローブへハイブリッド化する HH-25と命名された
ファージが同定され、プレートストックがつくられ、そ
して前述のようにラピッドプレップＤＮＡが調製され
る。ファージＤＮＡが Sau 3A I で切断され、子ウシア
ルカリ性フォスファターゼでフォスファターゼ処理さ
れ、フェノール抽出され、そして Bam HI 切断 M13mp8
ＤＮＡの２０ngと共沈される。沈澱したＤＮＡは遠心に
よってペレット化され、 T4 ＤＮＡリガーゼを含有する
リガーゼ緩衝液２μＬ中に再溶解される。リゲーション
は１６℃において２分間実施され、 T4 ＤＮＡリガーゼ
を含有するリガーゼ緩衝液５０μＬへ希釈され、１６℃
でさらに３時間インキュベートされる。この反応混合物
５μＬが実施例に記載したようにE. coli JM 101／TG 1
株を形質転換するために使用される。
【０１０５】溶菌斑がBentonおよびDavis 操作を使用
し、そして放射標識した１５−マ−でプローブすること
によってスクリーニングされる。ハイブリッド化を示す
25-S1と命名されたファージ溶菌斑が単離され、そして
単一ストランドファージＤＮＡが前記のようにＤＮＡ配
列化鋳型として使用するために調製される。配列化は、
プライマーとして１５−マ−を使用し、前出Sanger et
al. によって記載されたジデオキシ鎖成端技術を使用し
て実施され、そして図６に示す情報ストランドＤＮＡ配
列を与える。この態様で配列化された８４ヌクレオチド
は、ブタＡＨＦの相同区域と８５％の相同を示した。図
１に示したブタＡＨＦ６９ Kd 区域２−１６と、図６の
ヒトヌクレオチド配列から推論した対応する区域との間
には、たった１個のアミノ酸の違いがある。この高い程
度の相同は、組換えファージHH-25のＤＮＡはＡＨＦ遺
伝子から発散することを示す。
し、そして放射標識した１５−マ−でプローブすること
によってスクリーニングされる。ハイブリッド化を示す
25-S1と命名されたファージ溶菌斑が単離され、そして
単一ストランドファージＤＮＡが前記のようにＤＮＡ配
列化鋳型として使用するために調製される。配列化は、
プライマーとして１５−マ−を使用し、前出Sanger et
al. によって記載されたジデオキシ鎖成端技術を使用し
て実施され、そして図６に示す情報ストランドＤＮＡ配
列を与える。この態様で配列化された８４ヌクレオチド
は、ブタＡＨＦの相同区域と８５％の相同を示した。図
１に示したブタＡＨＦ６９ Kd 区域２−１６と、図６の
ヒトヌクレオチド配列から推論した対応する区域との間
には、たった１個のアミノ酸の違いがある。この高い程
度の相同は、組換えファージHH-25のＤＮＡはＡＨＦ遺
伝子から発散することを示す。
【０１０６】このように、ヒトＡＨＦ遺伝子のためのエ
クソンがはじめて単離され、同定された。バクテリオフ
ァジラムダ組換えHH-25 は、寄託番号 ATCC 40086 とし
てアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄
託されている。
クソンがはじめて単離され、同定された。バクテリオフ
ァジラムダ組換えHH-25 は、寄託番号 ATCC 40086 とし
てアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄
託されている。
【０１０７】 実施例５ ＡＨＦを活発に転写する細胞の同定 上に記載したブタおよびヒトＡＨＦエクソンは種々の機
能のために有用であり、その一つは生体内においてＡＨ
Ｆ合成部位である組織の同定を許容するスクリーニング
剤としてである。ＡＨＦの天然の発現の途中に生成され
るｍＲＮＡに対する正確な相補体としてエクソンを使用
することを基礎とする多数の方法が利用可能である。こ
のスクリーニング操作において、生体の各種の部分から
の組織がその内に含まれるｍＲＮＡを放出するように処
理され、そしてＡＨＦに対するエクソンを含んでいるＤ
ＮＡ断片へハイブリッド化され、そしてもしｍＲＮＡの
分子がそのエクソンへハイブリッド化すれば、該ｍＲＮ
Ａの源である組織がＡＨＦの源である。
能のために有用であり、その一つは生体内においてＡＨ
Ｆ合成部位である組織の同定を許容するスクリーニング
剤としてである。ＡＨＦの天然の発現の途中に生成され
るｍＲＮＡに対する正確な相補体としてエクソンを使用
することを基礎とする多数の方法が利用可能である。こ
のスクリーニング操作において、生体の各種の部分から
の組織がその内に含まれるｍＲＮＡを放出するように処
理され、そしてＡＨＦに対するエクソンを含んでいるＤ
ＮＡ断片へハイブリッド化され、そしてもしｍＲＮＡの
分子がそのエクソンへハイブリッド化すれば、該ｍＲＮ
Ａの源である組織がＡＨＦの源である。
【０１０８】１．スクリーニング操作 腎臓、肝臓、すい臓、ひ臓、骨髄、リンパ節等を含む、
種々の器管からのブタおよびヒト組織が、その記載を参
照としこゝに取り入れる Cox, Methods Enzymol., 12B
：120 （1968）によって記載されたグアニジン塩酸塩
抽出により、いくつかの修飾を加えて調製される。要約
すれば、組織は、８ Mグアニジン塩酸塩（またはその記
載をこゝに参照として取り入れたChirgwin et al., Bio
chemistry18：5294（1979）によって提案された４M グ
アニジンイソチオシアネート，また前出Maniatis et a
l., 189頁その他を参照）、５０mMトリス（ PH ７．
５），１０ mM ＥＤＴＡ中へ体外移植し、最高スピード
で１分間オムニミキサー（Sorvall ）中でホモジナイズ
する。ホモジネートをSorvall HB-4ローター中で５分間
５０００rpm で清澄化し、ＲＮＡを０．５容積のエタノ
ールの添加によって沈澱する。該ＲＮＡは溶解し、水に
溶解する前に６M グアニジン塩酸塩からさらに３回沈澱
する。
種々の器管からのブタおよびヒト組織が、その記載を参
照としこゝに取り入れる Cox, Methods Enzymol., 12B
：120 （1968）によって記載されたグアニジン塩酸塩
抽出により、いくつかの修飾を加えて調製される。要約
すれば、組織は、８ Mグアニジン塩酸塩（またはその記
載をこゝに参照として取り入れたChirgwin et al., Bio
chemistry18：5294（1979）によって提案された４M グ
アニジンイソチオシアネート，また前出Maniatis et a
l., 189頁その他を参照）、５０mMトリス（ PH ７．
５），１０ mM ＥＤＴＡ中へ体外移植し、最高スピード
で１分間オムニミキサー（Sorvall ）中でホモジナイズ
する。ホモジネートをSorvall HB-4ローター中で５分間
５０００rpm で清澄化し、ＲＮＡを０．５容積のエタノ
ールの添加によって沈澱する。該ＲＮＡは溶解し、水に
溶解する前に６M グアニジン塩酸塩からさらに３回沈澱
する。
【０１０９】この給源からのメッセンジャーＲＮＡは、
オリゴ（ dT ）セルロース（Collaborative Research）
上のクロマトグラフィーによってエンリッチされる。
オリゴ（ dT ）セルロース（Collaborative Research）
上のクロマトグラフィーによってエンリッチされる。
【０１１０】このｍＲＮＡは次に、前出Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔ ａｌ．，２０２−３頁に記載されているよう
に、ホルムアルデヒドを含有するアガロースゲルを通る
電気泳動にかけられる。ゲル中のｍＲＮＡは次にニトロ
セルロースフィルターへ移される（前出 Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０３−４頁）。
ｓ ｅｔ ａｌ．，２０２−３頁に記載されているよう
に、ホルムアルデヒドを含有するアガロースゲルを通る
電気泳動にかけられる。ゲル中のｍＲＮＡは次にニトロ
セルロースフィルターへ移される（前出 Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０３−４頁）。
【０１１１】このようにして得られたｍＲＮＡは、上で
得られた放射標識したブタまたはヒトエクソンＤＮＡで
ハイブリッド化され、ハイブリッドの存在がオートラジ
オグラフィーによって検出される。放射性信号は、ｍＲ
ＮＡの組織源は体内におけるＡＨＦ合成の源であること
を指示する。
得られた放射標識したブタまたはヒトエクソンＤＮＡで
ハイブリッド化され、ハイブリッドの存在がオートラジ
オグラフィーによって検出される。放射性信号は、ｍＲ
ＮＡの組織源は体内におけるＡＨＦ合成の源であること
を指示する。
【０１１２】代わりに、ｍＲＮＡはＳ１保護スクリーニ
ング法によってスクリーニングされることができる。
ング法によってスクリーニングされることができる。
【０１１３】Ｓ１ヌクレアーゼは、単一ストランドＤＮ
Ａを加水分解するが、しかしハイブリッド化したｍＲＮ
Ａ／ＤＮＡのような塩基対合したヌクレオチドは加水分
解しない酵素である。このため、アクリルアミドゲル電
気泳動およびオートラジオグラフィー後の放射性バンド
の存在は、ＡＨＦエクソンに対応する単一ストランドＤ
ＮＡが相補性ｍＲＮＡ，すなわちＡＨＦに対するｍＲＮ
Ａによって保護されていることを示す。このため、この
ｍＲＮＡの源であった組織は生体内におけるＡＨＦの合
成部位である。このスクリーニング方法は上に記載した
スクリーニング方法よりもいくらかはもっと感受性であ
る。
Ａを加水分解するが、しかしハイブリッド化したｍＲＮ
Ａ／ＤＮＡのような塩基対合したヌクレオチドは加水分
解しない酵素である。このため、アクリルアミドゲル電
気泳動およびオートラジオグラフィー後の放射性バンド
の存在は、ＡＨＦエクソンに対応する単一ストランドＤ
ＮＡが相補性ｍＲＮＡ，すなわちＡＨＦに対するｍＲＮ
Ａによって保護されていることを示す。このため、この
ｍＲＮＡの源であった組織は生体内におけるＡＨＦの合
成部位である。このスクリーニング方法は上に記載した
スクリーニング方法よりもいくらかはもっと感受性であ
る。
【０１１４】該ｍＲＮＡに対し相補性である、単一スト
ランドの放射標識されたＤＮＡよりなるプローブが、ブ
タゲノムサブクローン 34-H1のＤＮＡ合成を開始するた
め M13のユニバーサルプライマーを使用して合成され
る。この反応は、５０mMトリスｐＨ７．４，５mM MgCl
2 , １mM 2−メルカプトエタノール，５０mM NaCl, ユ
ニバーサルプライマー１０ng, 34-53 鋳型ＤＮＡ２００
−４００ ng,およびＤＮＡポリメラーゼＩ（E. coli ）
の Klenow 断片の溶液１００μＬ中で実施される。反応
液は２３℃で６０分間、７０℃で１０分間インキュベー
トされ、Pst Ｉ５０単位が添加され、追加の６０分間イ
ンキュベートされる。
ランドの放射標識されたＤＮＡよりなるプローブが、ブ
タゲノムサブクローン 34-H1のＤＮＡ合成を開始するた
め M13のユニバーサルプライマーを使用して合成され
る。この反応は、５０mMトリスｐＨ７．４，５mM MgCl
2 , １mM 2−メルカプトエタノール，５０mM NaCl, ユ
ニバーサルプライマー１０ng, 34-53 鋳型ＤＮＡ２００
−４００ ng,およびＤＮＡポリメラーゼＩ（E. coli ）
の Klenow 断片の溶液１００μＬ中で実施される。反応
液は２３℃で６０分間、７０℃で１０分間インキュベー
トされ、Pst Ｉ５０単位が添加され、追加の６０分間イ
ンキュベートされる。
【０１１５】反応はフェノール／クロロホルム抽出によ
って停止され、NaClが０．２M へ添加され、そして次に
１００％エタノール２容積で沈澱される。沈澱したＤＮ
Ａは遠心によりペレット化され、２０％シュークロー
ス、５０mM NaOH,０．１％クレゾールグリーン中に再溶
解され、そして次に５０mM NaOH,１０mMＥＤＴＡ中の２
％アガロースを通して電気泳動される。得られる単一ス
トランド断片はオートラジオグラフィーによって探索さ
れ、バンドが切除され、そしてＤＮＡが透析チューブ中
の電気溶離によって単離される。
って停止され、NaClが０．２M へ添加され、そして次に
１００％エタノール２容積で沈澱される。沈澱したＤＮ
Ａは遠心によりペレット化され、２０％シュークロー
ス、５０mM NaOH,０．１％クレゾールグリーン中に再溶
解され、そして次に５０mM NaOH,１０mMＥＤＴＡ中の２
％アガロースを通して電気泳動される。得られる単一ス
トランド断片はオートラジオグラフィーによって探索さ
れ、バンドが切除され、そしてＤＮＡが透析チューブ中
の電気溶離によって単離される。
【０１１６】サンプルｍＲＮＡは、上述のグアニジン塩
酸塩法によって肝臓、ひ臓等の組織から調製される。
酸塩法によって肝臓、ひ臓等の組織から調製される。
【０１１７】次にプローブは、５０％ホルムアミド、
０．４M NaCl, ４０mM PIPES（ピペラジン-N,N'-ビス
（2-エタンスルホン酸））pH６．５，１mMＥＤＴＡ，５
−５０μｇ ｍＲＮＡ，１５μＬ中２μｇの標識ＤＮＡ
中で、サンプルｍＲＮＡ（オリゴ（dT）クロマトブラフ
ィーエンリッチステップから得られた）へハイブリッド
化される。ハイブリッド化は、冷たいＳ１ヌクレアーゼ
緩衝液２００μＬ（０．２５M NaCl, ０．３M NaCH3CO
O, pH４．５），１mM ZnSO4, ５％グリセロール，Ｓ１
ヌクレアーゼ１０００単位の添加によって停止される。
サンプルをフェノール抽出し、イーストｔＲＮＡ１０μ
ｇと共にエタノール沈澱し、そしてMaxam-Gilbert, PNA
S U.S.A. 74 ： 560（1977）に記載した５％ポリアクリ
ルアミド配列決定ゲルを通す電気泳動にによる分析へか
ける。
０．４M NaCl, ４０mM PIPES（ピペラジン-N,N'-ビス
（2-エタンスルホン酸））pH６．５，１mMＥＤＴＡ，５
−５０μｇ ｍＲＮＡ，１５μＬ中２μｇの標識ＤＮＡ
中で、サンプルｍＲＮＡ（オリゴ（dT）クロマトブラフ
ィーエンリッチステップから得られた）へハイブリッド
化される。ハイブリッド化は、冷たいＳ１ヌクレアーゼ
緩衝液２００μＬ（０．２５M NaCl, ０．３M NaCH3CO
O, pH４．５），１mM ZnSO4, ５％グリセロール，Ｓ１
ヌクレアーゼ１０００単位の添加によって停止される。
サンプルをフェノール抽出し、イーストｔＲＮＡ１０μ
ｇと共にエタノール沈澱し、そしてMaxam-Gilbert, PNA
S U.S.A. 74 ： 560（1977）に記載した５％ポリアクリ
ルアミド配列決定ゲルを通す電気泳動にによる分析へか
ける。
【０１１８】実施例６ 組織からＡＨＦ ｍＲＮＡを得
るためＡＨＦエクソンＤＮＡの使用 ｍＲＮＡの源である組織が同定されれば、該組織からの
ＡＨＦｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡライブラリーを構
成するために使用れる。このｃＤＮＡライブラリーは、
以下に記載するようにゲノムクローン中に含まれたイン
トロンなしに、ＡＨＦのアミノ配列をコードする全長さ
のｃＤＮＡクローンを同定し、構成するために用いられ
る。その後で、ＡＨＦタンパクをコードするｃＤＮＡ
が、ＡＨＦ発現のため適当な宿主中の適当な発現ベクタ
ー中に挿入される。
るためＡＨＦエクソンＤＮＡの使用 ｍＲＮＡの源である組織が同定されれば、該組織からの
ＡＨＦｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡライブラリーを構
成するために使用れる。このｃＤＮＡライブラリーは、
以下に記載するようにゲノムクローン中に含まれたイン
トロンなしに、ＡＨＦのアミノ配列をコードする全長さ
のｃＤＮＡクローンを同定し、構成するために用いられ
る。その後で、ＡＨＦタンパクをコードするｃＤＮＡ
が、ＡＨＦ発現のため適当な宿主中の適当な発現ベクタ
ー中に挿入される。
【０１１９】ヒトＡＨＦは血友病治療または他の用途の
ため大きい需要があるので、ヒトＡＨＦｃＤＮＡの調製
を記載する。
ため大きい需要があるので、ヒトＡＨＦｃＤＮＡの調製
を記載する。
【０１２０】１．ヒトＡＨＦのためのｍＲＮＡの取得 ＡＨＦ合成に責任あるヒト組織からのｍＲＮＡは、前に
記載したようにCox により記載され、Chirgwinによって
修飾されたグアニジン塩酸塩法によって調製された。
記載したようにCox により記載され、Chirgwinによって
修飾されたグアニジン塩酸塩法によって調製された。
【０１２１】オリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィ
ーカラムから得られたｍＲＮＡのそれ以上の分画は、１
０mMトリス-HCl（pH７．４），１mMＥＤＴＡおよび０．
２％ＳＤＳを含む５−２０％シュークロース勾配上にベ
ックマン SW28 中において２４時間２２，０００rpm で
遠心することによる沈澱によって得られる。分画（１．
０ml）が集められ、酢酸ナトリウムが０．２M まで添加
され、そして分画は水に溶解する前に２回エタノール沈
澱された。分画したＲＮＡのサイズ分布は、２．２M ホ
ルムアルデヒドを含有する１．４％アガロースゲルを通
す電気泳動によって決定された。
ーカラムから得られたｍＲＮＡのそれ以上の分画は、１
０mMトリス-HCl（pH７．４），１mMＥＤＴＡおよび０．
２％ＳＤＳを含む５−２０％シュークロース勾配上にベ
ックマン SW28 中において２４時間２２，０００rpm で
遠心することによる沈澱によって得られる。分画（１．
０ml）が集められ、酢酸ナトリウムが０．２M まで添加
され、そして分画は水に溶解する前に２回エタノール沈
澱された。分画したＲＮＡのサイズ分布は、２．２M ホ
ルムアルデヒドを含有する１．４％アガロースゲルを通
す電気泳動によって決定された。
【０１２２】２８より大きいＳ（Svedberg）価を有する
ｍＲＮＡ沈降物を二重ストランドｃＤＮＡの合成のため
にプールする。このＲＮＡの１０μｇを１０mMメチル水
銀ハイドロオキサイド１０μＬ中において室温で変性す
る。１４０mMの 2−メルカプトエタノールをメチル水銀
ハイドロオキサイドを不活性化するために添加する。次
にＲＮＡは、１４０mM KCl, １００mMトリス-HCl（pH
８．３，４２℃），各デオキシヌクレオチドトリフォス
フェート１mM，２００μｇ／mlオリゴ（dT）12-18,１０
mM MgCl2 , および０．１μCi 32p-dCTP ／mlを含んで
いる５０μＬへ希釈される。これら反応は、ＡＭＶ逆ト
ランスクリプターゼ（Life Sciences ）１７単位／μＬ
の３μＬを添加した後、４２℃で１時間実施される。反
応は０．２５M ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を２０mMまで添
加することによって停止される。得られる混合物はフェ
ノール／クロロホルム（１：１）の等容積で１回、そし
てクロロホルムで１回抽出される。次にサンプルは１０
mMトリス-HCl（pH８．０），１００mM NaCl, １mM Ｅ
ＤＴＡ中に平衡化したセファロース CL-4Bカラム（ファ
ルマシア）５ml上でクロマトグラフィーされる。空容積
が集められ、そして核酸（ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッ
ドを含んでいる）がエタノール２．５容積の添加によっ
て沈澱される。
ｍＲＮＡ沈降物を二重ストランドｃＤＮＡの合成のため
にプールする。このＲＮＡの１０μｇを１０mMメチル水
銀ハイドロオキサイド１０μＬ中において室温で変性す
る。１４０mMの 2−メルカプトエタノールをメチル水銀
ハイドロオキサイドを不活性化するために添加する。次
にＲＮＡは、１４０mM KCl, １００mMトリス-HCl（pH
８．３，４２℃），各デオキシヌクレオチドトリフォス
フェート１mM，２００μｇ／mlオリゴ（dT）12-18,１０
mM MgCl2 , および０．１μCi 32p-dCTP ／mlを含んで
いる５０μＬへ希釈される。これら反応は、ＡＭＶ逆ト
ランスクリプターゼ（Life Sciences ）１７単位／μＬ
の３μＬを添加した後、４２℃で１時間実施される。反
応は０．２５M ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を２０mMまで添
加することによって停止される。得られる混合物はフェ
ノール／クロロホルム（１：１）の等容積で１回、そし
てクロロホルムで１回抽出される。次にサンプルは１０
mMトリス-HCl（pH８．０），１００mM NaCl, １mM Ｅ
ＤＴＡ中に平衡化したセファロース CL-4Bカラム（ファ
ルマシア）５ml上でクロマトグラフィーされる。空容積
が集められ、そして核酸（ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッ
ドを含んでいる）がエタノール２．５容積の添加によっ
て沈澱される。
【０１２３】好ましくは、上の操作と組合せて、Ullric
h etal., Nature, 303： 821（1983）に記載されている
ように、ＡＨＦエクソンオリゴヌクレオチドセグメント
も逆転写を開始するためオリゴｄＴｒの代わりに使用さ
れる。
h etal., Nature, 303： 821（1983）に記載されている
ように、ＡＨＦエクソンオリゴヌクレオチドセグメント
も逆転写を開始するためオリゴｄＴｒの代わりに使用さ
れる。
【０１２４】ＲＮＡ−ｃＤＮＡは脱イオン水３５μＬ中
に溶解され、１００mMカコジル酸カリウム（pH６．
８），１００μM ｄＣＴＰ，１mM 2−メルカプトエタノ
ール，１mM塩化コバルトを添加し、そしてデオキシチジ
ルターミナルトランスフェラーゼ（pH Biochemicals ）
１０単位を加え、反応物を３７℃で３０秒間インキュベ
ートすることによって酵素的に尾部処理される。反応は
０．２５M ＥＤＴＡを１０mMまで添加することによって
停止される。トリス-HCl（pH８．０）を３００mMまで添
加し、そしてサンプルはフェノール／グロロホルム
（１：１）の等容積で１回、そしてクロロホルムの等容
積で抽出される。核酸はエタノール２．５容積の添加に
よってこの生成物から沈澱される。
に溶解され、１００mMカコジル酸カリウム（pH６．
８），１００μM ｄＣＴＰ，１mM 2−メルカプトエタノ
ール，１mM塩化コバルトを添加し、そしてデオキシチジ
ルターミナルトランスフェラーゼ（pH Biochemicals ）
１０単位を加え、反応物を３７℃で３０秒間インキュベ
ートすることによって酵素的に尾部処理される。反応は
０．２５M ＥＤＴＡを１０mMまで添加することによって
停止される。トリス-HCl（pH８．０）を３００mMまで添
加し、そしてサンプルはフェノール／グロロホルム
（１：１）の等容積で１回、そしてクロロホルムの等容
積で抽出される。核酸はエタノール２．５容積の添加に
よってこの生成物から沈澱される。
【０１２５】ｄＣ尾部処理されたハイブリッド分子は、
１０mM KCl中１７０μg ／mlオリゴ（dG）14-18 セルロ
ースで４３℃にて１０分間、そして２３℃にて１０分間
アンニールされる。この反応生成物は次に１００mM硫酸
アンモニウム、１mM 2-メルカプトエタノール、１００
mMMgCl2 , １００μｇ／mlウシ血清アルブミン（シグ
マ、コーンファクターＶ），および１００μM ニコチナ
マイドアデニンジヌクレオチドを含む１００μＬへ希釈
される。２番目のストランドのｃＤＮＡ合成は、ＲＮア
ーゼＨ（P-L Biochemicals）１単位、E. coli ＤＮＡリ
ガーゼ１単位、およびＤＮＡポリメラーゼＩ１０単位を
添加することによって開始され、そして１６℃で１２時
間インキュベートされる。
１０mM KCl中１７０μg ／mlオリゴ（dG）14-18 セルロ
ースで４３℃にて１０分間、そして２３℃にて１０分間
アンニールされる。この反応生成物は次に１００mM硫酸
アンモニウム、１mM 2-メルカプトエタノール、１００
mMMgCl2 , １００μｇ／mlウシ血清アルブミン（シグ
マ、コーンファクターＶ），および１００μM ニコチナ
マイドアデニンジヌクレオチドを含む１００μＬへ希釈
される。２番目のストランドのｃＤＮＡ合成は、ＲＮア
ーゼＨ（P-L Biochemicals）１単位、E. coli ＤＮＡリ
ガーゼ１単位、およびＤＮＡポリメラーゼＩ１０単位を
添加することによって開始され、そして１６℃で１２時
間インキュベートされる。
【０１２６】次にサンプルは前に記載したようにセファ
ローズ CL-4B上でクロマトグラフィーされる。二重スト
ランドＤＮＡはエタノール沈澱され、そしてＲＮＡ−ｃ
ＤＮＡハイブリッド尾部処理について記載したようにｄ
Ｃ尾部処理される。
ローズ CL-4B上でクロマトグラフィーされる。二重スト
ランドＤＮＡはエタノール沈澱され、そしてＲＮＡ−ｃ
ＤＮＡハイブリッド尾部処理について記載したようにｄ
Ｃ尾部処理される。
【０１２７】 ２．ヒトＡＨＦ ＤＮＡについてスクリーニング 上に記載したようにして得られたｄＣ尾分処理された二
重ストランドｃＤＮＡは、１０mMトリス-HCl（pH８．
０），１mM ＥＤＴＡ，１００mM NaCl中３７℃で２時
間等モル量のｄＧ尾分処理 pBR 322 New England Nucl
ear ）でアンニールされる。アンニールされたキメラ様
分子はバクテリア形質転換に使用するまで−２０℃で冷
凍される。
重ストランドｃＤＮＡは、１０mMトリス-HCl（pH８．
０），１mM ＥＤＴＡ，１００mM NaCl中３７℃で２時
間等モル量のｄＧ尾分処理 pBR 322 New England Nucl
ear ）でアンニールされる。アンニールされたキメラ様
分子はバクテリア形質転換に使用するまで−２０℃で冷
凍される。
【０１２８】バクテリア形質転換は、E. coli MC1061株
（ソース）を使用して実施される。細胞（５０ml）は６
００nmにおける光学密度０．２５まで生育される。細胞
は２５００rpm において１２分間遠心することによって
濃縮され、無菌１００mM CaCl2 中で洗浄され、そして
前に記載したように遠心によってペレット化される。細
胞は無菌１００mM CaCl2 中に再懸濁され、そして４℃
に12時間保たれる。アンニールしたキメラ様分子は、適
切な細胞２００μＬ当たり５ｎｇの二重ストランドｃＤ
ＮＡの比で４℃において３０分間インキュベートされ
る。次にバクテリアは４２℃２分のヒートショックへか
けられる。Ｌ−ブロス１．０mlが加えられ、細胞は３７
℃で１時間インキュベートされる。細胞は次に５μｇ／
mlテトラサイクリンを含有するＬＢ−寒天プレート上に
プレートされる。
（ソース）を使用して実施される。細胞（５０ml）は６
００nmにおける光学密度０．２５まで生育される。細胞
は２５００rpm において１２分間遠心することによって
濃縮され、無菌１００mM CaCl2 中で洗浄され、そして
前に記載したように遠心によってペレット化される。細
胞は無菌１００mM CaCl2 中に再懸濁され、そして４℃
に12時間保たれる。アンニールしたキメラ様分子は、適
切な細胞２００μＬ当たり５ｎｇの二重ストランドｃＤ
ＮＡの比で４℃において３０分間インキュベートされ
る。次にバクテリアは４２℃２分のヒートショックへか
けられる。Ｌ−ブロス１．０mlが加えられ、細胞は３７
℃で１時間インキュベートされる。細胞は次に５μｇ／
mlテトラサイクリンを含有するＬＢ−寒天プレート上に
プレートされる。
【０１２９】ヒトＡＨＦクローンは、その記載を参照と
してこゝに取り入れたGrunstein および Hogness PNAS
U.S.A. 72 ：3961（1975）のコロニーハイブリディゼイ
ション法を使用て同定される。ｃＤＮＡライブラリー
は、Ｌ−ブロス／５μｇ／mlテトラサイクリン寒天プレ
ートの上に重ねたニトロセルロースフィルター（Schlei
cher and Schuell）上にプレートされる。コロニーは３
７℃で一夜生育され、次にフィルターは無菌 Whatman 3
M ペーパー上に置かれる。次にあらかじめ湿したニトロ
セルロースフィルターをマスターフィルターに対して押
し付け、これらフィルターを１８ゲージ針を使用して止
める。レプリカフィルターを次に３７℃においてＬＢ−
テトラサイクリンプレート上でコロニーが１〜２cmの直
径に達するまで発育させる。次にフィルターは１５０μ
ｇ／mlクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートへ
移され、３７℃で１６〜２４時間インキュベートされ
る。
してこゝに取り入れたGrunstein および Hogness PNAS
U.S.A. 72 ：3961（1975）のコロニーハイブリディゼイ
ション法を使用て同定される。ｃＤＮＡライブラリー
は、Ｌ−ブロス／５μｇ／mlテトラサイクリン寒天プレ
ートの上に重ねたニトロセルロースフィルター（Schlei
cher and Schuell）上にプレートされる。コロニーは３
７℃で一夜生育され、次にフィルターは無菌 Whatman 3
M ペーパー上に置かれる。次にあらかじめ湿したニトロ
セルロースフィルターをマスターフィルターに対して押
し付け、これらフィルターを１８ゲージ針を使用して止
める。レプリカフィルターを次に３７℃においてＬＢ−
テトラサイクリンプレート上でコロニーが１〜２cmの直
径に達するまで発育させる。次にフィルターは１５０μ
ｇ／mlクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートへ
移され、３７℃で１６〜２４時間インキュベートされ
る。
【０１３０】次にフィルターが除去され、０．５M NaOH
で室温で５分間飽和させた Whatman3M ペーパー上に置
かれる。次にフィルターは１M トリス-HCl（pH７．
５），１．５M NaClで飽和させた Whatman 3M 上に、そ
して次に 2ｘ標準食塩クエン酸塩（SSC ）で飽和させた
Whatman 3M 上に置くことによって中和される。 SSC
（1x）は０．１５M NaCl, ０．０１５M クエン酸ナトリ
ウムである。
で室温で５分間飽和させた Whatman3M ペーパー上に置
かれる。次にフィルターは１M トリス-HCl（pH７．
５），１．５M NaClで飽和させた Whatman 3M 上に、そ
して次に 2ｘ標準食塩クエン酸塩（SSC ）で飽和させた
Whatman 3M 上に置くことによって中和される。 SSC
（1x）は０．１５M NaCl, ０．０１５M クエン酸ナトリ
ウムである。
【０１３１】フィルターを風乾し、減圧下８０℃で２時
間焼付ける。フィルターのプレハイブリディゼイション
は、１０mMトリス-HCl（pH８．０）, １mM ＥＤＴＡ，
０．１％ＳＤＳ中６５℃で３０分間、そして7x SSC,5x
Denhardt's（1x Denhardt'sは０．０２％ポリビニルピ
ロリジン、０．０２％フィコル，０．０２％ウシ血清ア
ルブミンである）、１００μｇ／ml変性サケ精子ＤＮ
Ａ，および０．１％ＳＤＳ中３０分間で実施される。
間焼付ける。フィルターのプレハイブリディゼイション
は、１０mMトリス-HCl（pH８．０）, １mM ＥＤＴＡ，
０．１％ＳＤＳ中６５℃で３０分間、そして7x SSC,5x
Denhardt's（1x Denhardt'sは０．０２％ポリビニルピ
ロリジン、０．０２％フィコル，０．０２％ウシ血清ア
ルブミンである）、１００μｇ／ml変性サケ精子ＤＮ
Ａ，および０．１％ＳＤＳ中３０分間で実施される。
【０１３２】上で記載したように調製した 32p標識ヒト
エクソンＤＮＡが１０6 cpm ／mlまで添加され、ハイブ
リディゼイションが３７℃で１２〜１６時間実施され
る。次にフィルターは７x SSC,０．１％ＳＤＳの数回の
交換で３７℃において１〜２時間洗浄される。次にフィ
ルターは風乾され、コダックXAR スクリーンを使用して
オートラジオグラフィーへかけられる。
エクソンＤＮＡが１０6 cpm ／mlまで添加され、ハイブ
リディゼイションが３７℃で１２〜１６時間実施され
る。次にフィルターは７x SSC,０．１％ＳＤＳの数回の
交換で３７℃において１〜２時間洗浄される。次にフィ
ルターは風乾され、コダックXAR スクリーンを使用して
オートラジオグラフィーへかけられる。
【０１３３】バックグランド上にハイブリディゼイショ
ン信号を示すコロニーが、プラスミドＤＮＡのラピット
プレップ精製のため、テトラサイクリン５μg ／mlを含
むＬ−ブロス中で生育される。プラスミドＤＮＡは、そ
の記載を参照としてこゝに取り入れた Holmes et al.,
Anal. Biochem., 114 ：193 （1981）の方法によって精
製される。このＤＮＡの部品標品を制限エンドヌクレア
ーゼPst1で開裂し、そして断片を１％アガロース／TBE
ゲルを通して電気透析し、そしてその記載をこゝに参照
として取り入れた E. Southern, J. Mol. Biol. 98： 5
03（1975）の操作に従ってしみをつける。ニトロセルロ
ースフィルターは、コロニーハイブリディゼイションに
ついて記載したように、放射標識したヒトＡＨＦエクソ
ンＤＮＡでハイブリッド化される。ＡＨＦエクソンＤＮ
Ａへハイブリッド化する PstＩインサートを含んだプラ
スミドがＤＮＡ配列分析に使用される。
ン信号を示すコロニーが、プラスミドＤＮＡのラピット
プレップ精製のため、テトラサイクリン５μg ／mlを含
むＬ−ブロス中で生育される。プラスミドＤＮＡは、そ
の記載を参照としてこゝに取り入れた Holmes et al.,
Anal. Biochem., 114 ：193 （1981）の方法によって精
製される。このＤＮＡの部品標品を制限エンドヌクレア
ーゼPst1で開裂し、そして断片を１％アガロース／TBE
ゲルを通して電気透析し、そしてその記載をこゝに参照
として取り入れた E. Southern, J. Mol. Biol. 98： 5
03（1975）の操作に従ってしみをつける。ニトロセルロ
ースフィルターは、コロニーハイブリディゼイションに
ついて記載したように、放射標識したヒトＡＨＦエクソ
ンＤＮＡでハイブリッド化される。ＡＨＦエクソンＤＮ
Ａへハイブリッド化する PstＩインサートを含んだプラ
スミドがＤＮＡ配列分析に使用される。
【０１３４】配列決定のため、プラスミドＤＮＡ（培養
物０．７５mlから前出Holmes et al. の操作により精
製）が制限エンドヌクレアーゼ Sau3aＩで完結まで消化
される。34-S1 であると同定された生成したＤＮＡ断片
は、図４に図示したＤＮＡ配列を持っている。このＤＮ
Ａはフェノール／クロロホルム抽出後エタノール沈澱さ
れ、１０μＬＴＥ（１０mMトリス-HCl（pH７．４），１
０mM MgCl2 , １０mMジチオスレイトール, １mM ＡＴ
Ｐおよび過剰の T4 ＤＮＡリガーゼ１００μＬ中におい
て、Bam H1開裂 M13 mp 9 の複製形ＤＮＡとリゲートす
る。リゲーションは１５℃において２〜４時間実施され
る。
物０．７５mlから前出Holmes et al. の操作により精
製）が制限エンドヌクレアーゼ Sau3aＩで完結まで消化
される。34-S1 であると同定された生成したＤＮＡ断片
は、図４に図示したＤＮＡ配列を持っている。このＤＮ
Ａはフェノール／クロロホルム抽出後エタノール沈澱さ
れ、１０μＬＴＥ（１０mMトリス-HCl（pH７．４），１
０mM MgCl2 , １０mMジチオスレイトール, １mM ＡＴ
Ｐおよび過剰の T4 ＤＮＡリガーゼ１００μＬ中におい
て、Bam H1開裂 M13 mp 9 の複製形ＤＮＡとリゲートす
る。リゲーションは１５℃において２〜４時間実施され
る。
【０１３５】このリゲーション反応物５μＬは、前記し
た E. coli JM101／TG1 株２００μＬを形質転換するた
めに使用される。組換えは、Davis etal., J. Mol. Bio
l. 36 ： 413（1968）によって記載されているベーター
ガラクトシダーゼ活性のための指示として X-galを含ん
でいるＬＢ寒天プレート上で生育する時白い溶菌斑とし
て同定される。
た E. coli JM101／TG1 株２００μＬを形質転換するた
めに使用される。組換えは、Davis etal., J. Mol. Bio
l. 36 ： 413（1968）によって記載されているベーター
ガラクトシダーゼ活性のための指示として X-galを含ん
でいるＬＢ寒天プレート上で生育する時白い溶菌斑とし
て同定される。
【０１３６】ヒトエクソンへハイブリッド化する組換え
ファージ包囲配列は、その記載をこゝに参照として取り
入れた Benton et al., Science 196 ： 180（1977）の
操作により、放射標識したヒトＡＨＦエクソンをプロー
ブとして使用して同定される。ハイブリディゼイション
信号を示す溶菌斑を取り、Ｌ−ブロス１．５ml培地中で
生育させる。これら培養物から調製した単一ストランド
ファージＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプライムＤＮＡ
合成反応に鋳型として使用される。配列化はジデオキシ
鎖成端方法を使用して実施される。例えば、Sanger et
al., PNAS U.S.A. 74 ：5463（1977）参照。
ファージ包囲配列は、その記載をこゝに参照として取り
入れた Benton et al., Science 196 ： 180（1977）の
操作により、放射標識したヒトＡＨＦエクソンをプロー
ブとして使用して同定される。ハイブリディゼイション
信号を示す溶菌斑を取り、Ｌ−ブロス１．５ml培地中で
生育させる。これら培養物から調製した単一ストランド
ファージＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプライムＤＮＡ
合成反応に鋳型として使用される。配列化はジデオキシ
鎖成端方法を使用して実施される。例えば、Sanger et
al., PNAS U.S.A. 74 ：5463（1977）参照。
【０１３７】ヒトＡＨＦ組換え型はそれらのヌクレオチ
ド配列をヒトＡＨＦのヒトエクソン配列から既知のそれ
と比較することにより同定される。
ド配列をヒトＡＨＦのヒトエクソン配列から既知のそれ
と比較することにより同定される。
【０１３８】３． ブタＡＨＦ ｍＲＮＡ ヒトＡＨＦ組換え型は、全くヒト組織ｃＤＮＡライブラ
リーについて記載したように構成したブタ組織ライブラ
リーをスクリーニングするために使用される。見込みあ
るブタＡＨＦ組換えＤＮＡクローンは、先に記載したよ
うにブタ 32p標識エクソン断片を使用し、Grunstein-Ho
gness 法によって同定される。プローブは、その記載を
こゝに参照として取り入れたRigby et al., J. Mol. Bi
ol. 133：237 （1977）によって記載されたニック−ト
ランスレーションによって 32pで標識したブタＡＨＦエ
クソンセグメントである。
リーについて記載したように構成したブタ組織ライブラ
リーをスクリーニングするために使用される。見込みあ
るブタＡＨＦ組換えＤＮＡクローンは、先に記載したよ
うにブタ 32p標識エクソン断片を使用し、Grunstein-Ho
gness 法によって同定される。プローブは、その記載を
こゝに参照として取り入れたRigby et al., J. Mol. Bi
ol. 133：237 （1977）によって記載されたニック−ト
ランスレーションによって 32pで標識したブタＡＨＦエ
クソンセグメントである。
【０１３９】ハイブリディゼイションを示すコロニーは
前記したラピッドプレッププラスミド精製目的のために
生育される。プラスミドＤＮＡは制限エンドヌクレアー
ゼ Pst 1で開裂され、１％アガロース／TBE を通して電
気泳動され、E. Southern （1975）の操作によってしみ
をつけられる。しみは 32pで標識したニックトランスレ
ートされたブタＡＨＦ組換えＤＮＡとハイブリッド化さ
れる。
前記したラピッドプレッププラスミド精製目的のために
生育される。プラスミドＤＮＡは制限エンドヌクレアー
ゼ Pst 1で開裂され、１％アガロース／TBE を通して電
気泳動され、E. Southern （1975）の操作によってしみ
をつけられる。しみは 32pで標識したニックトランスレ
ートされたブタＡＨＦ組換えＤＮＡとハイブリッド化さ
れる。
【０１４０】全長さのクローンは、この分野でよく知ら
れているように（“遺伝子ウオーキング”）、例えば両
方のクローンに共通な制限酵素部位において重複するク
ローンからのＤＮＡ断片をリゲートすることにより、慣
用の態様で構成される。
れているように（“遺伝子ウオーキング”）、例えば両
方のクローンに共通な制限酵素部位において重複するク
ローンからのＤＮＡ断片をリゲートすることにより、慣
用の態様で構成される。
【０１４１】 ４．ステップ２または３からの全長さのクローンの同定 既存のクローンの５’端とｍＲＮＡの５’端との間の距
離は、その配列が既存のＡＨＦクローンの５’（アミノ
末端）区域から由来するオリゴヌクレオチドプライマー
を使用し、Agarwal et al.，“J.B.C.” 256（２）：10
23-1028 （1981）に記載されたプライマー延長技術によ
って分析することができる。もしこの操作を用いて発達
したゲルが二以上の転写を示せば、最も強いバンドが全
体のｍＲＮＡ転写を表しているものと考えなければなら
ない。
離は、その配列が既存のＡＨＦクローンの５’（アミノ
末端）区域から由来するオリゴヌクレオチドプライマー
を使用し、Agarwal et al.，“J.B.C.” 256（２）：10
23-1028 （1981）に記載されたプライマー延長技術によ
って分析することができる。もしこの操作を用いて発達
したゲルが二以上の転写を示せば、最も強いバンドが全
体のｍＲＮＡ転写を表しているものと考えなければなら
ない。
【０１４２】しかしながら、５’未ほん訳配列の長い区
域を含んでいる多数のｍＲＮＡが存在する。このよう
に、ヒトＡＨＦ ＤＮＡの発現は完全なｃＤＮＡクロー
ンの獲得次第であってはならない。例えば、配列分析に
よって、メチオニンコードンと、続いて既知の真核タン
パク分泌信号と類似または同一であり、そして残りのコ
ードンを持つフレーム中にある配列の存在を示すクロー
ンが得られる。形質転換および発現は、予期されたサイ
ズでありそしてポリ（Ｔ）３’末端を含有するメチオニ
ン分泌信号配列を含有するクローンについて実施しなけ
ればならない。
域を含んでいる多数のｍＲＮＡが存在する。このよう
に、ヒトＡＨＦ ＤＮＡの発現は完全なｃＤＮＡクロー
ンの獲得次第であってはならない。例えば、配列分析に
よって、メチオニンコードンと、続いて既知の真核タン
パク分泌信号と類似または同一であり、そして残りのコ
ードンを持つフレーム中にある配列の存在を示すクロー
ンが得られる。形質転換および発現は、予期されたサイ
ズでありそしてポリ（Ｔ）３’末端を含有するメチオニ
ン分泌信号配列を含有するクローンについて実施しなけ
ればならない。
【０１４３】５．代替操作 前記１ないし３の方法の代わりとして、ブタまたはヒト
ＡＨＦのためのｃＤＮＡクローンは以下の態様でバクテ
リオファージベクターを使用して同定されることが好ま
しい。
ＡＨＦのためのｃＤＮＡクローンは以下の態様でバクテ
リオファージベクターを使用して同定されることが好ま
しい。
【０１４４】ＡＨＦ合成に責任あるヒト胎児肝臓組織か
らのｍＲＮＡが、実施例５のセクション１において述べ
たCox により記載され、Chirgwinet al.によって修飾さ
れた、グアニジン塩酸塩法によって調製された。一番目
のストランドのｃＤＮＡは、前出実施例６、セクション
１に記載した操作によってポリＡ+ 胎児肝臓ＲＮＡ１０
μｇから合成された。詳しくは、このＲＮＡ１０μｇは
１０mMメチル水銀ハイドロオキサイド１０μＬ中で室温
で変性された。２−メルカプトエタノール１４０mMがメ
チル水銀ハイドロオキサイドを不活性化するために添加
された。次にこのＲＮＡは、１４０mM KCl, １００mMト
リス− HCl（pH８．３，４２℃），各デオキシヌクレオ
チドトリリン酸１mM, ２００μｇ／mlオリゴ（dT）12-1
8,１０ mM MgCl2 , および０．１μCi 32 p-dCTP／mlを
含んでいる５０μＬへ希釈された。これら反応はＡＭＶ
逆トランスクリプターゼ（Life Sceiences）１７単位／
μＬの３μＬを添加した後、４２℃で１時間実施され
た。
らのｍＲＮＡが、実施例５のセクション１において述べ
たCox により記載され、Chirgwinet al.によって修飾さ
れた、グアニジン塩酸塩法によって調製された。一番目
のストランドのｃＤＮＡは、前出実施例６、セクション
１に記載した操作によってポリＡ+ 胎児肝臓ＲＮＡ１０
μｇから合成された。詳しくは、このＲＮＡ１０μｇは
１０mMメチル水銀ハイドロオキサイド１０μＬ中で室温
で変性された。２−メルカプトエタノール１４０mMがメ
チル水銀ハイドロオキサイドを不活性化するために添加
された。次にこのＲＮＡは、１４０mM KCl, １００mMト
リス− HCl（pH８．３，４２℃），各デオキシヌクレオ
チドトリリン酸１mM, ２００μｇ／mlオリゴ（dT）12-1
8,１０ mM MgCl2 , および０．１μCi 32 p-dCTP／mlを
含んでいる５０μＬへ希釈された。これら反応はＡＭＶ
逆トランスクリプターゼ（Life Sceiences）１７単位／
μＬの３μＬを添加した後、４２℃で１時間実施され
た。
【０１４５】プライマー延長したライブラリーの１番目
のストランド合成のため、独特な相補性３８マーの２０
０ピコグラムが CH3HgOH変性ステップに含められ、そし
て反応物は１４０mMベーターメルカプトエタノール,
０．７M KCl, １mM ＥＤＴＡ，２０mMトリス− HCl
（pH８．３，４２℃），RNアーゼ（Biotec）１単位／μ
Ｌとなし、５０℃で２分間および４２℃で２分間インキ
ュベートされた。次にこれは１４０mM KCl, １００mMト
リス-HCl（pH８．３，４２℃），各デオキシヌクレオチ
ドトリリン酸１mM, １０mM MgCl2 , および０．１μCi
32 p-dCTP／μＬを含む５０μＬへ希釈された。反応物
は１７単位／μＬＡＭＶ逆トランスクリプターゼ３μＬ
の添加後、４２℃で１時間インキューベートされた。
のストランド合成のため、独特な相補性３８マーの２０
０ピコグラムが CH3HgOH変性ステップに含められ、そし
て反応物は１４０mMベーターメルカプトエタノール,
０．７M KCl, １mM ＥＤＴＡ，２０mMトリス− HCl
（pH８．３，４２℃），RNアーゼ（Biotec）１単位／μ
Ｌとなし、５０℃で２分間および４２℃で２分間インキ
ュベートされた。次にこれは１４０mM KCl, １００mMト
リス-HCl（pH８．３，４２℃），各デオキシヌクレオチ
ドトリリン酸１mM, １０mM MgCl2 , および０．１μCi
32 p-dCTP／μＬを含む５０μＬへ希釈された。反応物
は１７単位／μＬＡＭＶ逆トランスクリプターゼ３μＬ
の添加後、４２℃で１時間インキューベートされた。
【０１４６】１番目のストランド合成後、反応物は１０
mM MgCl2 , ５０mMトリス pH ７．４，５mM２−メルカ
プトエタノール、７．５mM NH4SO3 , 各デオキシヌクレ
オチドトリリン酸２５０μM を含む１５０μＬへ希釈さ
れ、そして２番目のストランドの合成がRNアーゼ（E. c
oli ）１単位およびＤＮＡポリメラーゼＩ４５単位の添
加によって開始された。反応物は１６℃で８時間インキ
ュベートされ、そしてＥＤＴＡを２０mMへ添加すること
によって停止され、水で最終容積２００μＬとされた。
次に EcoR1メチル化がＳ−アデノシルメチオニンを５０
μM へ、そしてEcoR1メチラーゼ４０単位を添加するこ
とによって実施された。これら反応物は３７℃で１時間
インキュベートされ、フェノール／クロロホルム抽出に
よって停止され、１０mMトリス-HCl（pH８．０），１mM
ＥＤＴＡで平衡化されたアファデックスG50 を用いてク
ロマトグラフィーされた。空容積をプールし、エタノー
ル添加によって沈澱させた。
mM MgCl2 , ５０mMトリス pH ７．４，５mM２−メルカ
プトエタノール、７．５mM NH4SO3 , 各デオキシヌクレ
オチドトリリン酸２５０μM を含む１５０μＬへ希釈さ
れ、そして２番目のストランドの合成がRNアーゼ（E. c
oli ）１単位およびＤＮＡポリメラーゼＩ４５単位の添
加によって開始された。反応物は１６℃で８時間インキ
ュベートされ、そしてＥＤＴＡを２０mMへ添加すること
によって停止され、水で最終容積２００μＬとされた。
次に EcoR1メチル化がＳ−アデノシルメチオニンを５０
μM へ、そしてEcoR1メチラーゼ４０単位を添加するこ
とによって実施された。これら反応物は３７℃で１時間
インキュベートされ、フェノール／クロロホルム抽出に
よって停止され、１０mMトリス-HCl（pH８．０），１mM
ＥＤＴＡで平衡化されたアファデックスG50 を用いてク
ロマトグラフィーされた。空容積をプールし、エタノー
ル添加によって沈澱させた。
【０１４７】ｃＤＮＡ分子は、５０mMトリス pH ８．
３，１０mM MgCl2 , １０mM２−メルカプトエタノー
ル、５０mM NaCl,各デオキシヌクレオチドトリリン酸５
０μM,１００μｇ／ml卵アルブミンおよび T4 ポリメラ
ーゼ５単位を含有する２００μＬ中において鈍末端化さ
れた。反応は３７℃で３０分間インキュベートされ、次
にフェノール／クロロホルム抽出によって停止された。
次に核酸はエタノール添加によって沈澱された。
３，１０mM MgCl2 , １０mM２−メルカプトエタノー
ル、５０mM NaCl,各デオキシヌクレオチドトリリン酸５
０μM,１００μｇ／ml卵アルブミンおよび T4 ポリメラ
ーゼ５単位を含有する２００μＬ中において鈍末端化さ
れた。反応は３７℃で３０分間インキュベートされ、次
にフェノール／クロロホルム抽出によって停止された。
次に核酸はエタノール添加によって沈澱された。
【０１４８】EcoR1 “リンカー”（Collaborative Rese
arch）が次に、合計容積４５μＬ中において前出の
Manities et al., 243頁の標準条件で、鈍化ｃＤＮＡへ
リゲートされた。反応はＥＤＴＡを１５mMへ添加するこ
とにより停止され、フェノール／クロロホルムで抽出さ
れた。核酸はエタノールによって沈澱され、遠心によっ
てペレット化された。リンカー処理されたｃＤＮＡは１
００μM トリス-HCl（pH７．２），５mM MgCl2 , ５０
mM NaCl ２００μＬ中に再溶解され、そして EcoR1３０
０単位で３７℃で２時間消化された。反応物は次にフェ
ノール／クロロホルムで抽出され、１０mMトリス（pH
８．０）１mM ＥＤＴＡ，０．１M NaOHで平衡化された
セファロース CL-4B上でクロマトグラフィーにかけられ
た。空容積中のｃＤＮＡは集め、エタノールで沈澱し、
遠心によってペレット化された。
arch）が次に、合計容積４５μＬ中において前出の
Manities et al., 243頁の標準条件で、鈍化ｃＤＮＡへ
リゲートされた。反応はＥＤＴＡを１５mMへ添加するこ
とにより停止され、フェノール／クロロホルムで抽出さ
れた。核酸はエタノールによって沈澱され、遠心によっ
てペレット化された。リンカー処理されたｃＤＮＡは１
００μM トリス-HCl（pH７．２），５mM MgCl2 , ５０
mM NaCl ２００μＬ中に再溶解され、そして EcoR1３０
０単位で３７℃で２時間消化された。反応物は次にフェ
ノール／クロロホルムで抽出され、１０mMトリス（pH
８．０）１mM ＥＤＴＡ，０．１M NaOHで平衡化された
セファロース CL-4B上でクロマトグラフィーにかけられ
た。空容積中のｃＤＮＡは集め、エタノールで沈澱し、
遠心によってペレット化された。
【０１４９】ｃＤＮＡは、１０mMトリス-HCl（pH８．
０），１mM ＥＤＴＡ中に再溶解され、そして EcoR1開
裂フォスファターゼ処理ラムダ Charon 21a ＤＮＡへ、
ｃＤＮＡ対ベクターＤＮＡの種々の比率において標準リ
ゲーション条件でリゲートされた。リゲートされたＤＮ
Ａはパッケージされ、そして前出 Manitis et al., 64,
256頁に確立された操作を用いてタイターされた。該ラ
イブラリーはプレートされ、そして前出 Benton および
Davisに記載された条件のもとで 32p−標識ヒトエクソ
ンＤＮＡを使用してスクリーニングされた。約１０，０
００塩基対にまたがる重複するクローンが得られ、そし
てその実質的部分がヒトＡＨＦをコードする１本の長い
開いた読取りフレームを解明するために配列化された。
それから得られたヒトＡＨＦをコードする組換えＤＮＡ
ヌクレオチド配列、および推論されたヒトＡＨＦのため
のアミノ酸配列が図７ないし図１４に示されている。重
複するクローンが当分野で良く知られた慣用技術を用
い、すなわち重複するクローンからのＤＮＡ断片を両方
のクローンに共通な制限酵素部位においてリゲートする
ことにより、ベクター pSP64（Promega Biotec）中にア
センブルされた。pSP64-VIIIと命名された、図７ないし
図１４に示したヌクレオチド配列を含んでいるpSP64 組
換えクローンは、アメリカン、タイプ、カルチャー、コ
レクションに寄託されている。
０），１mM ＥＤＴＡ中に再溶解され、そして EcoR1開
裂フォスファターゼ処理ラムダ Charon 21a ＤＮＡへ、
ｃＤＮＡ対ベクターＤＮＡの種々の比率において標準リ
ゲーション条件でリゲートされた。リゲートされたＤＮ
Ａはパッケージされ、そして前出 Manitis et al., 64,
256頁に確立された操作を用いてタイターされた。該ラ
イブラリーはプレートされ、そして前出 Benton および
Davisに記載された条件のもとで 32p−標識ヒトエクソ
ンＤＮＡを使用してスクリーニングされた。約１０，０
００塩基対にまたがる重複するクローンが得られ、そし
てその実質的部分がヒトＡＨＦをコードする１本の長い
開いた読取りフレームを解明するために配列化された。
それから得られたヒトＡＨＦをコードする組換えＤＮＡ
ヌクレオチド配列、および推論されたヒトＡＨＦのため
のアミノ酸配列が図７ないし図１４に示されている。重
複するクローンが当分野で良く知られた慣用技術を用
い、すなわち重複するクローンからのＤＮＡ断片を両方
のクローンに共通な制限酵素部位においてリゲートする
ことにより、ベクター pSP64（Promega Biotec）中にア
センブルされた。pSP64-VIIIと命名された、図７ないし
図１４に示したヌクレオチド配列を含んでいるpSP64 組
換えクローンは、アメリカン、タイプ、カルチャー、コ
レクションに寄託されている。
【０１５０】実施例７ ヒトまたはブタＡＨＦの発現 この実施例は、実施例６の方法によって得られた全長さ
のクローンを同時形質転換系に用いる、ＡＨＦの発現を
意図する。
のクローンを同時形質転換系に用いる、ＡＨＦの発現を
意図する。
【０１５１】１．ＡＨＦ形質転換ベクターを得るための
直接法を以下に記載する。pCVSVLプラスミドを PstＩで
部分的に消化し、消化物をゲル電気泳動上で分離する。
可視化後、全長さのプラスミドに相当する線状ＤＮＡ断
片をpCVSVL-B1 として単離する。
直接法を以下に記載する。pCVSVLプラスミドを PstＩで
部分的に消化し、消化物をゲル電気泳動上で分離する。
可視化後、全長さのプラスミドに相当する線状ＤＮＡ断
片をpCVSVL-B1 として単離する。
【０１５２】ＡＨＦのためのｃＤＮＡを実施例５のクロ
ーニングベクターからＰｓｔ Ｉによる部分消化によっ
て抽出する。部分的消化物をゲル電気泳動上に分離し、
そして全長さのｃＤＮＡの分子量に相当するバンドを単
離する。ｐＣＶＳＶＬ−Ｂ１をこのＤＮＡ断片でアンニ
ールし、１５℃においてＴ４リガーゼでリゲートし、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ １０１株中へトランスフェクト
し、トランスフォーマントをテトラサイクリン耐性につ
いて選択する。選択したＥ．ｃｏｌｉトランスフォーマ
ントをテトラサイクリン存在下に育成する。プラスミド
ｐＣＶＳＶＬ−Ｂ１ａが慣用方法で回収される。該プラ
スミド中のｃＤＮＡの適切な配向は、適当なエンドヌク
レアーゼによる不斉消化により慣用態様で決定すること
ができる。
ーニングベクターからＰｓｔ Ｉによる部分消化によっ
て抽出する。部分的消化物をゲル電気泳動上に分離し、
そして全長さのｃＤＮＡの分子量に相当するバンドを単
離する。ｐＣＶＳＶＬ−Ｂ１をこのＤＮＡ断片でアンニ
ールし、１５℃においてＴ４リガーゼでリゲートし、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ １０１株中へトランスフェクト
し、トランスフォーマントをテトラサイクリン耐性につ
いて選択する。選択したＥ．ｃｏｌｉトランスフォーマ
ントをテトラサイクリン存在下に育成する。プラスミド
ｐＣＶＳＶＬ−Ｂ１ａが慣用方法で回収される。該プラ
スミド中のｃＤＮＡの適切な配向は、適当なエンドヌク
レアーゼによる不斉消化により慣用態様で決定すること
ができる。
【０１５３】２．同時形質転換：選択および増幅 プラスミドpCVSVL-A1aもしくはpCVSVL-B1aと、pAdD26SV
pA＃3 （前出 Kaufmanet al. ）とを混合し（５０μｇ
HP および０．５μｇpAdD26SVpA＃3 ）、そして NaOAc
pH ４．５を０．３M へそしてエタノール２．５容積の
添加によって再沈澱する。沈澱したＤＮＡを風乾し、2X
HEBSS（０．５ml）中に再懸濁し、そして記載（前出 K
aufman et al. ）のように０．２５M CaCl2 （０．５m
l）と激しく混合する。カルシウム−フォスフェート−
ＤＮＡ沈澱を室温で３０分間落着かせ、そして CHO DUK
K-B1細胞（Chasin および Urlaub 1980, コロンビア大
学から入手可能）へ適用する。これらの細胞の発育およ
び維持は記載されている（前出 Kaufmanet al.および C
hasin およびUrlaub, 1980）。
pA＃3 （前出 Kaufmanet al. ）とを混合し（５０μｇ
HP および０．５μｇpAdD26SVpA＃3 ）、そして NaOAc
pH ４．５を０．３M へそしてエタノール２．５容積の
添加によって再沈澱する。沈澱したＤＮＡを風乾し、2X
HEBSS（０．５ml）中に再懸濁し、そして記載（前出 K
aufman et al. ）のように０．２５M CaCl2 （０．５m
l）と激しく混合する。カルシウム−フォスフェート−
ＤＮＡ沈澱を室温で３０分間落着かせ、そして CHO DUK
K-B1細胞（Chasin および Urlaub 1980, コロンビア大
学から入手可能）へ適用する。これらの細胞の発育およ
び維持は記載されている（前出 Kaufmanet al.および C
hasin およびUrlaub, 1980）。
【０１５４】このDUKK-B1 細胞をトランスフェクション
前に５×１０5 ／１０cm皿で２４時間副次培養する。室
温で３０分間インキュベートした後、１０％ウシ胎児血
清を含む培地を適用し、細胞を３７℃で４，５時間イン
キュベートする。該培地は次に、１０％ウシ胎児血清、
チミジン、アデノシンおよびデオキシアデノシン１０μ
ｇ／ml，それにペニシリンおよびストレプトマイシンを
含むａ−培地２mlの単層から除去される。２日後該細胞
は１：１５の割合で１０％透析ウシ胎児血清、ペニシリ
ンおよびストレプトマイシンを含み、ヌクレオチドを欠
くａ−培地中へ副次培養される。細胞は次に４〜５日後
同じ培地を再び供給される。
前に５×１０5 ／１０cm皿で２４時間副次培養する。室
温で３０分間インキュベートした後、１０％ウシ胎児血
清を含む培地を適用し、細胞を３７℃で４，５時間イン
キュベートする。該培地は次に、１０％ウシ胎児血清、
チミジン、アデノシンおよびデオキシアデノシン１０μ
ｇ／ml，それにペニシリンおよびストレプトマイシンを
含むａ−培地２mlの単層から除去される。２日後該細胞
は１：１５の割合で１０％透析ウシ胎児血清、ペニシリ
ンおよびストレプトマイシンを含み、ヌクレオチドを欠
くａ−培地中へ副次培養される。細胞は次に４〜５日後
同じ培地を再び供給される。
【０１５５】選択培地中への副次培養１０〜１２日後、
コロニーが出現する。ＡＨＦ遺伝子のメトトレキセート
（ＭＴＸ）選択および検出、選択遺伝子増幅は Axel et
al.の米国特許第 4,399,216号、または前出のKaufman
et al.に従って実施される。
コロニーが出現する。ＡＨＦ遺伝子のメトトレキセート
（ＭＴＸ）選択および検出、選択遺伝子増幅は Axel et
al.の米国特許第 4,399,216号、または前出のKaufman
et al.に従って実施される。
【０１５６】ＡＨＦ収率は、DUKK-B1 細胞の代わりに、
永久細胞ラインEA. hy926 （ Edgell et al., “Proc．
Natl. Acad. Sci.”80：3734-3737 （1983））を同時形
質転換することによって改良し得る。この場合同時形質
転換する選択遺伝子は、Haber et al., “Somatic Cell
Genetics ” 4：499-508 （1982）に記載された優性DH
FR 遺伝子でなければならない。さもなければ、同時形
質転換および培養は実質上本明細書のどこかに述べてい
るとおりである。
永久細胞ラインEA. hy926 （ Edgell et al., “Proc．
Natl. Acad. Sci.”80：3734-3737 （1983））を同時形
質転換することによって改良し得る。この場合同時形質
転換する選択遺伝子は、Haber et al., “Somatic Cell
Genetics ” 4：499-508 （1982）に記載された優性DH
FR 遺伝子でなければならない。さもなければ、同時形
質転換および培養は実質上本明細書のどこかに述べてい
るとおりである。
【０１５７】３．ＡＨＦの生産 セクション２において選択されたＡＨＦ生産ＣＨＯトラ
ンスフォーマントは、標準技術を使って種カルチャー中
に維持される。該カルチャーは慣用培地中で細胞を培養
することにより１０Ｌまでスケールアップされる。この
培地はＭＴＸを含有する必要はなく、選択遺伝子復帰突
然変異株を除去するように、ヌクレオチドを含有しない
であろう。
ンスフォーマントは、標準技術を使って種カルチャー中
に維持される。該カルチャーは慣用培地中で細胞を培養
することにより１０Ｌまでスケールアップされる。この
培地はＭＴＸを含有する必要はなく、選択遺伝子復帰突
然変異株を除去するように、ヌクレオチドを含有しない
であろう。
【０１５８】培養上清は、血漿サンプルについて使用す
るための標準アッセイ法（ファクターVIII欠乏血漿の凝
血時間の短縮）に従って凝血活性についてモニターされ
る。上清は、ファクターVIIIアッセイの感度を増すため
に、ポリエチレングリコールおよびグリシン沈澱（血漿
からＡＨＦの精製に使用するため既知であるように）の
ような慣用技術によって精製し得る。
るための標準アッセイ法（ファクターVIII欠乏血漿の凝
血時間の短縮）に従って凝血活性についてモニターされ
る。上清は、ファクターVIIIアッセイの感度を増すため
に、ポリエチレングリコールおよびグリシン沈澱（血漿
からＡＨＦの精製に使用するため既知であるように）の
ような慣用技術によって精製し得る。
【０１５９】ファクターVIII活性がピークに達した時、
細胞が遠心によって培地から分離される。次にファクタ
ーVIIIが回収され、ポリエチレングリコールおよびグリ
シン沈澱によって精製される。凝血活性がファクターVI
II欠乏血漿において示される。
細胞が遠心によって培地から分離される。次にファクタ
ーVIIIが回収され、ポリエチレングリコールおよびグリ
シン沈澱によって精製される。凝血活性がファクターVI
II欠乏血漿において示される。
【０１６０】４．ＡＨＦの生産のための代替操作 全体のＡＨＦコーディング区域を含んでいる全長さのｃ
ＤＮＡが前記した HH-25中のエクソン、該エクソンの
５’および３’区域が重複している２種のｃＤＮＡクロ
ーン、そして３’ｃＤＮＡクローンが重複しそして成端
コードンを過ぎて続いている３番目のクローンから形成
された。これは、合成Sal I 部位がイニシエーターメチ
オニンに対してちょうど５’に、そしてＡＨＦをコード
する配列の末端のほん訳停止信号に対して３’に配置さ
れるように形成された。これはpSP64 のポリリンカー S
alＩ部位中へ配置し、そしてそれから切り取ることを許
容した。このクローン（sSP64-VIII）からのSal I 断片
が精製され、そして pCVSVL2へリゲートされた。 pCVSV
L2は、慣用の操作によって達成されるSV40ポリアデニル
化配列の３’に位置する PstＩ部位を欠いていること、
およびアデノビールス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）
から上流に SV40 Ava II（Ｄ）断片の重複を含んでいる
ことを除き、発現ベクターpCVSVL（Kaufman et al.，Mo
l. Cell Biol.,2：1304（1982）, その記載を参照とし
てこゝに取り入れる）と同一であるプラスミドである。
pCVSVL2 は pAdD26SVpA （１）（前出 Kaufman et al.
参照）から、二つの SV40 Ava II“Ｄ”断片の各末端に
おいて XhoＩリンカーを加え、そしてそれらをpAdD26SV
pA（１）の XhoＩ部位へ挿入することによって誘導され
た。Ava II“Ｄ”断片は、SV40後期プロモーターが Ad2
主要後期プロモーターと同じ配向になるように両方共挿
入される。pCVSVLおよびpAdD26 VpA（３）については、
前出 Kaufman et al. 参照。pSP64-VIIIの SalＩ断片を
pCVSVL2中へ挿入するため、pCVSVL2 中の独特の PstＩ
部位は Rothstein et al., Methods Enzym.,69 ：98（1
980）に記載の操作によって SalＩ部位へ変えられ、そ
して pSP64-VIIIから切り取った SalＩ断片が pCVSVL2-
VIIIが得られるように挿入された。
ＤＮＡが前記した HH-25中のエクソン、該エクソンの
５’および３’区域が重複している２種のｃＤＮＡクロ
ーン、そして３’ｃＤＮＡクローンが重複しそして成端
コードンを過ぎて続いている３番目のクローンから形成
された。これは、合成Sal I 部位がイニシエーターメチ
オニンに対してちょうど５’に、そしてＡＨＦをコード
する配列の末端のほん訳停止信号に対して３’に配置さ
れるように形成された。これはpSP64 のポリリンカー S
alＩ部位中へ配置し、そしてそれから切り取ることを許
容した。このクローン（sSP64-VIII）からのSal I 断片
が精製され、そして pCVSVL2へリゲートされた。 pCVSV
L2は、慣用の操作によって達成されるSV40ポリアデニル
化配列の３’に位置する PstＩ部位を欠いていること、
およびアデノビールス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）
から上流に SV40 Ava II（Ｄ）断片の重複を含んでいる
ことを除き、発現ベクターpCVSVL（Kaufman et al.，Mo
l. Cell Biol.,2：1304（1982）, その記載を参照とし
てこゝに取り入れる）と同一であるプラスミドである。
pCVSVL2 は pAdD26SVpA （１）（前出 Kaufman et al.
参照）から、二つの SV40 Ava II“Ｄ”断片の各末端に
おいて XhoＩリンカーを加え、そしてそれらをpAdD26SV
pA（１）の XhoＩ部位へ挿入することによって誘導され
た。Ava II“Ｄ”断片は、SV40後期プロモーターが Ad2
主要後期プロモーターと同じ配向になるように両方共挿
入される。pCVSVLおよびpAdD26 VpA（３）については、
前出 Kaufman et al. 参照。pSP64-VIIIの SalＩ断片を
pCVSVL2中へ挿入するため、pCVSVL2 中の独特の PstＩ
部位は Rothstein et al., Methods Enzym.,69 ：98（1
980）に記載の操作によって SalＩ部位へ変えられ、そ
して pSP64-VIIIから切り取った SalＩ断片が pCVSVL2-
VIIIが得られるように挿入された。
【０１６１】pCVSVL2-VIIIは、ベクターのアデノビール
スＭＬＰからＡＨＦをコードする配列の転写を許容する
正確な５’から３’への配向を含んでいる。pCVSVL2-VI
IIはアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションへ
寄託されている。
スＭＬＰからＡＨＦをコードする配列の転写を許容する
正確な５’から３’への配向を含んでいる。pCVSVL2-VI
IIはアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションへ
寄託されている。
【０１６２】pCVSVL2-VIIIは、サル COS-7細胞（Mellon
et al.,Cell 27 ：279 （1981））中へ、 Sampayracお
よび Danna, PNAS U.S.A. 78：7575（1981）に記載され
たＤＥＡＥデキストラントランスフェクションプロトコ
ールを使用して導入された。細胞は血清を含まない培地
中で培養され、トランスフェクション３日後、ＡＨＦ活
性についてアッセイされた。
et al.,Cell 27 ：279 （1981））中へ、 Sampayracお
よび Danna, PNAS U.S.A. 78：7575（1981）に記載され
たＤＥＡＥデキストラントランスフェクションプロトコ
ールを使用して導入された。細胞は血清を含まない培地
中で培養され、トランスフェクション３日後、ＡＨＦ活
性についてアッセイされた。
【０１６３】ファクターVIII：Ｃ活性は、Didishein, S
cience 129：389 （1959）に記載された染色体基質アッ
セイによって測定され、ヒトファクターVIII：Ｃ発現が
約０．０５単位／mlのレベルで達成されたことを確実に
した。
cience 129：389 （1959）に記載された染色体基質アッ
セイによって測定され、ヒトファクターVIII：Ｃ発現が
約０．０５単位／mlのレベルで達成されたことを確実に
した。
【図１】実施例１に記載した６９，０００ダルトントロ
ンビン開裂産物のアミノ末端配列について決定されたア
ミノ酸配列（Ａ）の図である。１番目の残基は同定でき
なかった。この配列は、実施例３に記載されたブタＡＨ
Ｆエクソンのヌクレオチド配列から推論された配列
（Ｂ）、および実施例４に記載されたヒトＡＨＦエクソ
ンと比較されている。
ンビン開裂産物のアミノ末端配列について決定されたア
ミノ酸配列（Ａ）の図である。１番目の残基は同定でき
なかった。この配列は、実施例３に記載されたブタＡＨ
Ｆエクソンのヌクレオチド配列から推論された配列
（Ｂ）、および実施例４に記載されたヒトＡＨＦエクソ
ンと比較されている。
【図２】（Ａ）アミノ末端のウシトロンビン消化断片
と、（Ｂ）Aassらにより単離された１６６KdブタＡＨＦ
断片の４０Kdトロンビン開裂産物の単一文字で表したア
ミノ酸配列を図示する。
と、（Ｂ）Aassらにより単離された１６６KdブタＡＨＦ
断片の４０Kdトロンビン開裂産物の単一文字で表したア
ミノ酸配列を図示する。
【図３】ＡＨＦをコードするブタ遺伝子の少なくとも一
部の同定および単離のためのオリゴヌクレオチドの設計
を図示する。
部の同定および単離のためのオリゴヌクレオチドの設計
を図示する。
【図４】実施例３に記載したバクテリオファージPB34か
ら得られた、ブタＡＨＦエクソンを含む Sma IＤＮＡ断
片（34-S1)のためのＤＮＡ配列を図示する。
ら得られた、ブタＡＨＦエクソンを含む Sma IＤＮＡ断
片（34-S1)のためのＤＮＡ配列を図示する。
【図５】実施例３に記載した、ブタＡＨＦのためのエク
ソンを持つ Hae III挿入 34-H1のＤＮＡ配列の図であ
る。この配列は図４に示した長い配列内に含まれ、そし
て図４の配列のヌクレオチド250-615 に相当する。
ソンを持つ Hae III挿入 34-H1のＤＮＡ配列の図であ
る。この配列は図４に示した長い配列内に含まれ、そし
て図４の配列のヌクレオチド250-615 に相当する。
【図６】実施例４に記載したヒトＡＨＦのためのエクソ
ンの一部を示す、クローン 25-S1の Sau3A1 インサート
のためのヌクレオチド34-8のためのＤＮＡ配列および推
論したアミノ酸配列の図である。
ンの一部を示す、クローン 25-S1の Sau3A1 インサート
のためのヌクレオチド34-8のためのＤＮＡ配列および推
論したアミノ酸配列の図である。
【図７】ヒトＡＨＦをコードする全体の配列を含むＤＮ
Ａヌクレオチド配列（１本のみを示す）、およびヒトＡ
ＨＦの推論したアミノ酸配列を図示する。
Ａヌクレオチド配列（１本のみを示す）、およびヒトＡ
ＨＦの推論したアミノ酸配列を図示する。
【図８】同上。
【図９】同上。
【図１０】同上。
【図１１】同上。
【図１２】同上。
【図１３】同上。
【図１４】同上。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】アミノ酸配列： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 を有するヒトファクターＶＩＩＩ：Ｃをコードする単離
されたＤＮＡであって、配列５’ＣＧＣ ＡＧＣ ＴＴ
Ｔ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＣＡ ＣＧＡＣＡＣ
ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴＴ ＣＧＴ ＣＧＡＣＧＡ ＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ＡＧＧ ３’を有するポリデオキシヌクレ
オチドを含んでいるＤＮＡ。 - 【請求項２】ヒトゲノムＤＮＡから切り取られたもので
ある請求項１のＤＮＡ。 - 【請求項３】非ヒト源からのＤＮＡへ直接または間接に
結合している請求項１のＤＮＡ。 - 【請求項４】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 を有するヒトファクターＶＩＩＩ：ＣをコードするＤＮ
Ａのためのベクターであって、配列： ５’ＣＧＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＡＡ
ＡＣＡ ＣＧＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴＴ
ＣＧＴ ＣＧＡＧＴＧ ＧＡＧ ＡＧＧ ３’よりなる
ＤＮＡセグメントを含んでいるベクター。 - 【請求項５】以下の配列： 【化１７】 ５’ＣＧＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＡＡ
ＡＣＡ ＣＧＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴＴ
ＣＧＴ ＣＧＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＡＧＧ ３’または
その反転相補体の少なくとも１０ヌクレオチド配列に対
応するプローブをもってｃＲＮＡライブラリーをスクリ
ーニングし、該プローブとハイブリッド化するｍＲＮＡ
からｃＤＮＡライブラリーを形成し、そして該ｃＤＮＡ
ライブラリーからのＡＨＦｃＤＮＡをリゲートすること
によって図７ないし図１４に示したアミノ酸配列を有す
るヒトファクターＶＩＩＩ：Ｃをコードする遺伝子を形
成することを特徴とするヒトファクターＶＩＩＩ：Ｃを
コードする遺伝子の単離方法。 - 【請求項６】図７ないし図１４に示したＤＮＡヌクレオ
チド配列、または図７ないし図１４に示したＤＮＡヌク
レオチド配列へハイブリダイズする１種または２種以上
のＤＮＡ配列から選ばれた１種または２種以上のＤＮＡ
配列を含み、かつ発現においてファクターＶＩＩＩ：Ｃ
活性を示す図７ないし図１４に示したアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする請求項１のＤＮＡ。 - 【請求項７】アミノ酸配列： 【化１８】 【化１９】 【化２０】 【化２１】 【化２２】 【化２３】 【化２４】 を有するファクターＶＩＩＩ：Ｃの活性を生産するのに
十分な、該ファクターＶＩＩＩ：Ｃのアミノ酸基をコー
ドする外来ＤＮＡを含んでいる、形質転換された哺乳動
物細胞。
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|---|---|---|---|
| US06/546,650 US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1983-10-28 | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US64403684A | 1984-08-24 | 1984-08-24 | |
| US546650 | 1984-08-24 | ||
| US644036 | 1984-08-24 |
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Family
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| JP1215850A Pending JPH02182188A (ja) | 1983-10-28 | 1989-08-21 | ファクター８および関連生産物の製造 |
| JP5024748A Expired - Lifetime JP2549049B2 (ja) | 1983-10-28 | 1993-01-20 | ファクターｖｉｉｉおよび関連生産物の製造 |
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| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
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| US5045455A (en) * | 1984-01-12 | 1991-09-03 | Chiron Corporation | Factor VIII:C cDNA cloning and expression |
| US5004804A (en) * | 1984-01-12 | 1991-04-02 | Nordisk Gentofte | Method and composition for preparation of factor VIIIC |
| US4716117A (en) * | 1984-10-26 | 1987-12-29 | Chiron Corporation | Monoclonal antibodies to factor VIIIC |
| ZA852099B (en) * | 1984-03-26 | 1985-12-24 | Meloy Lab | Recombinant factor viii-c. |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| IL74909A (en) * | 1984-04-20 | 1992-01-15 | Genentech Inc | Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein |
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| US8597910B1 (en) | 1985-04-11 | 2013-12-03 | Children's Medical Center Corporation | DNA encoding Von Willebrand Factor (VWF) and methods and cells for producing VFW, and VFW produced by the DNA, methods and cells |
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| DE3531360A1 (de) * | 1985-09-03 | 1987-05-07 | Merck Patent Gmbh | Dna-sequenzen, rekombinante dna-molekuele und verfahren zur herstellung des enzyms mutarotase aus acinetobacter calcoaceticus |
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| US5250421A (en) * | 1986-01-03 | 1993-10-05 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C-type proteins |
| EP0253870B1 (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-31 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor viii:c-type proteins |
| US5595886A (en) | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| FR2599754B1 (fr) * | 1986-06-06 | 1989-12-29 | Transgene Sa | Procede de preparation de facteur viii a partir de cellules de mammiferes |
| EP0254076B1 (en) | 1986-07-11 | 1991-05-08 | Miles Inc. | Improved recombinant protein production |
| EP0302925A4 (en) * | 1987-01-30 | 1989-04-24 | Biogen Nv | METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII IN LARGE QUANTITIES. |
| CA1331157C (en) * | 1987-04-06 | 1994-08-02 | Randal J. Kaufman | Method for producing factor viii:c-type proteins |
| US6060447A (en) * | 1987-05-19 | 2000-05-09 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
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| US5563045A (en) * | 1992-11-13 | 1996-10-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric procoagulant proteins |
| US5910481A (en) * | 1995-11-13 | 1999-06-08 | Immuno Ag | Hybrid proteins with modified activity |
| US6221349B1 (en) | 1998-10-20 | 2001-04-24 | Avigen, Inc. | Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells |
| US6200560B1 (en) | 1998-10-20 | 2001-03-13 | Avigen, Inc. | Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells |
| WO2005033321A2 (en) | 2003-09-30 | 2005-04-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor |
| WO2005123928A1 (en) * | 2004-06-08 | 2005-12-29 | Battelle Memorial Institute | Production of human coagulation factor viii from plant cells and whole plants |
| EP2359865B1 (en) | 2005-04-07 | 2013-10-02 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Method of increasing the function of an AAV vector |
| US20130023033A1 (en) | 2010-03-29 | 2013-01-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| US9315825B2 (en) | 2010-03-29 | 2016-04-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| MX353930B (es) | 2011-02-17 | 2018-02-02 | Univ Pennsylvania | Composiciones y metodos para alterar la especificidad tisular y mejorar la transferencia de genes mediada por vector viral adeno-asociado 9. |
| WO2015012924A2 (en) | 2013-04-29 | 2015-01-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof |
| EP3626274A3 (en) | 2015-04-16 | 2020-06-17 | Emory University | Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof |
| WO2022032140A2 (en) | 2020-08-07 | 2022-02-10 | Amicus Therapeutics, Inc. | Vesicle targeting proteins and uses of same |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US602312A (en) * | 1898-04-12 | eades | ||
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| US4663280A (en) * | 1983-05-19 | 1987-05-05 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors |
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| DK165506C (da) * | 1984-01-12 | 1993-04-19 | Chiron Corp | Proteinpraeparat med koagulationsaktivitet samt fremgangsmaade til fremstilling deraf |
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| IL74909A (en) * | 1984-04-20 | 1992-01-15 | Genentech Inc | Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein |
-
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