FI86436C - Foerfarande foer framstaellning av faktor viii:c och daertill hoerande vektorer och saollningsmedel. - Google Patents

Description

1 86436

Menetelmä tekijä VIII:C:n valmistamiseksi ja siihen liittyviä vektoreita ja seulontaväline 5 Keksinnön tausta Tämä keksintö koskee yhdistelmävektoria, joka sisältää ihmisen tekijää VIII:C koodaavaa DNA:ta ja yhdis-telmä-DNA-ekspressiovektoria, joka mahdollistaa ihmisen tekijän VIII:C ekspression. Keksintö koskee myös menetel-10 mää tekijän VIII:C prokoagulanttiaktiivisuutta omaavan proteiinin valmistamiseksi sekä seulontavälinettä. Seulontaväline deoksiribonukleotidisekvenssien ja ribonuk-leotidisekvenssien tunnistamiseksi, jotka sekvenssit koo-daavat ainakin osaa ihmisen tekijää VIII:C:tä.

15 Tekijä VIII:C on veriplasmaproteiini, josta on va jausta tai joka puuttuu hemofilia A -sairaudessa. Tämä sairaus on perinnöllinen vuotohäiriö, jota sairastaa noin yksi mies 20 000:sta. Tekijä VIII:C on tunnettu myös nimillä tai siitä on käytetty nimityksiä tekijä VIII, anti-20 hemofiliatekijä (AHF), antihemofiilinen globuliini (AHG), hemofiliatekijä A, verihiutalekofaktori, tromboplastino-geeni ja trombosytolysiini. Siitä käytetään nimitystä "tekijä VIII:C" sen osoittamiseksi, että se on hyytymis-; aktiivisuuteen vaikuttava yhdiste. Tässä käytettyinä "te- ·:* 25 kijä VIII:C" ja "AHF" ovat synonyymejä.

Vaikka AHF:n eristämistä veriplasmasta on kuvattu : kirjallisuudessa, AHF:n täsmällistä rakennetta on vasta identifioitu, mikä johtuu osaksi siitä, ettei ole ollut saatavana riittäviä määriä puhdasta materiaalia sekä mo-30 nien epäpuhtauksien ja puhdistusaineiden proteolyyttises-tä luonteesta. Vaikka epäpuhdasta AHF:ää on ollut jonkin verran saatavana tuoreena pakastetusta ihmisen plasmasta valmistettuna tiivistettynä valmisteena, teke-vät AHF:n äärimmäisen pieni pitoisuus ihmisen plasmassa 2 86436 ja ihmisen plasman hankkimisen ja käsittelyn kalleus tämän materiaalin hinnasta johtuvan hemofilian laajamittaisen hoidon esteen.

Tämä keksintö tekee mahdolliseksi tuottaa ihmisen 5 AHF:ää yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttämällä.

AHF, kuten muutkin proteiinit, koostuu suunnilleen 20 erilaisesta aminohaposta, jotka ovat asettuneet tiettyyn järjestykseen. Geenimanipulaatiomenetelmiä käyttämällä on kehitetty menetelmä, joka tekee mahdolliseksi 10 AHF:n tuotannon identifioimalla ja kloonaamalla ihmisen AHF-proteiinia koodaava geeni, kloonaamalla tämä geeni, transformoimalla soveltuva isäntä tämän geenin sisältävällä vektorilla, saattamalla tällaisessa isännässä oleva ihmisen AHF-geeni ilmentymään ja ottamalla talteen si-15 ten tuotettu ihmisen AHF. Tässä esitetään myös sian AHF:n tuottaminen yhdistelmä-DNAmenetelmin samoin kuin tällaiseen sian AHF:n tuotantoon liittyvät tuotteet ja menetelmät.

Viime aikoina kehitetyt menetelmät ovat tehneet 20 mahdolliseksi käyttää mikro-organismeja, joilla on kyky nopeaan ja runsaaseen kasvuun, kaupallisesti hyödyllisten proteiinien ja peptidien syntetisoimiseen, riippumatta näiden luonnollisesta lähteestä. Nämä menetelmät tekevät mahdolliseksi geneettisesti antaa soveltuvalle mikro-or-25 ganismille kyky syntetisoida proteiinia tai peptidiä, joka normaalisti valmistaa toinen organismi. Näissä menetelmissä käytetään hyväksi niitä perusriippuvuuksia, jotka vallitsevat kaikissa elävissä organismeissa geneettisen materiaalin, tavallisesti DNA:n ja organismin syn-- 30 tetisoimien proteiinien välillä. Tämä riippuvuus on sellainen, että proteiinin aminohappojakson tuotantoa koodaa sarja DNA:ssa olevia kolmen nukleotidin jaksoja. On olemassa yksi tai useampia trinukleotidisekvenssiryhmiä 3 86436 (joita kutsutaan kodoneiksi), jotka spesifisesti koodaa-vat kunkin proteiineissa yleisimmin esiintyvistä 20 aminohaposta tuotantoa. Kunkin trinukleotidijakson ja sen koodaaman vastaavan aminohapon välinen spesifinen riippu-5 vuus muodostaa geneettisen koodin. Seurauksena on se, että jokaisen proteiinin tai peptidin aminohapposekvenssiä heijastaa vastaava nukleotidisekvenssi hyvin tunnetun riippuvuussuhteen mukaisesti. Lisäksi voi tämän nukleo-tidisekvenssin periaatteessa lukea mikä tahansa elävä 10 organismi. Geneettistä koodia käsittelee J.D. Watson teoksessa Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin, Inc. 1977, joka mainitaan tässä kokonaisuudessaan viitteenä, erityisesti sivut 347-377; C.F. Norton teoksessa Microbiology, Addison Wesley, 1981; ja US-patenttijulkai-15 su 4 363 877, joka mainitaan kokonaisuudessaan tässä viitteenä.

Ne 20 aminohappoa, joista proteiinit koostuvat, ovat fenyylialaniini (tästedes käytetään joskus ilmausta "Phe" tai "F"), leusiini ("leu", "L"), isoleusiini 20 ("Ile", "I"), metioniini ("Met", "M"), väliini ("Vai", "V"), seriini ("Ser", "S"), proliini ("Pro", "P"), treo-niini ("Thr", "T"), alaniini ("Ala", "A"), tyrosiini ("tyr", "Y"), histidiini ("His", "H"), glutamiini ("Gin", "Q"), asparagiini ("Asp", "N"), glutamiinihappo ("Glu", 25 "E"), kysteiini ("Cys", "C"), tryptofaani ("Trp", "W"), arginiini ("Arg", "R") ja glysiini ("Gly", "G"). Aminohapot, joita koodaavat eri trinukleotidien, joiden tietty kodoni voi sisältää, erilaiset yhdistelmät, ovat nähtä-: . vissä taulukossa 1.

4 86436

Taulukko 1

Geneettinen koodi

Ensimmäinen Toinen asema Kolmas asema 5 asema T C A G

T Phe Ser Tyr Cys T

Phe Ser Tyr Cys C

Leu Ser Stop* Stop* A

Leu Ser Stop* Trp G

10 C Leu Pro His Arg T

Leu Pro His Arg C

Leu Pro Gin Arg A

Leu Pro Gin Arg G

A Ile Thr Asp Ser T

15 Ile Thr Asp Ser C

Ile Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

G Vai Ala Asp Gly T

Vai Ala Asp Gly C

20 Vai Ala Glu Gly A

Vai Ala Glu Gly G

*"Stop" eli lopetuskodoni lopettaa proteiinin ilmentämisen.

•. Tiettyä proteiinia koodaavan geenin tai DNA-jakson .·. 25 deoksiribonukleotidisekvenssin tunteminen tekee mahdolliseksi mainitun proteiinin aminohapposekvenssin kuvaamisen tarkasti. Päinvastainen väittämä ei kuitenkaan pidä paikkaansa; vaikka metioniinia koodaa vain yksi kodoni, voivat muut aminohapot olla jopa kuuden kodonin koodaamia - 30 (esim. seriini), kuten käy ilmi taulukosta 1. Siten nuk-leotidisekvenssin ennustaminen aminohapposekvenssin perusteella on huomattavan epävarmaa.

Yhteenvetona voidaan sanoa, että tiedettiin hyvin vähän AHF:n rakenteesta ja että huolimatta useiden vuo-35 sien runsaasta työstä, eivät alan asiantuntijat kyenneet 5 86436 määrittämään AHF:n tai sen geenin rakennetta tai saamaan aikaan mitään menettelyä, jolla AHF:ää voitaisiin tuottaa suurin piirtein puhtaana merkittäviä määriä.

Tässä kuvattu menetelmä, jolla ihmisen AHF-geeni 5 kloonataan ja saatetaan ilmentymään, sisältää seuraavat vaiheet: (1) Sian AHF:n puhdistaminen; (2) Sian AHF:n aminohapposekvenssin määrittäminen; (3) oligonukleotidikoettimien muodostaminen ja näi- 10 den koettimien käyttö identifioimiseksi ja/tai eristämiseksi ainakin osa sian AHF:ää koodaavasta geenistä; (4) sian AHF-geenin fragmentin käyttö ihmisen AHF:ää koo-daavan geenimateriaalin identifioimiseksi ja eristämiseksi; 15 (5) Edellä kuvattujen AHF-DNA-fragmenttien käyttö AHF- synteesin tapahtumakohdan määrittämiseksi erilaisten nisäkäskudosten joukosta; (6) Ihmisen ja sian AHF:ää koodaavien cDNA-segmenttien tuottaminen käyttämällä vaiheessa 5 tehdystä kudoksen 20 identifioinnista saatua lähetti-RNA:ta; (7) Täyspitkien ihmisen ja sian cDNA-kloonien muodostaminen vaiheessa 6 tuotetuista cDNA-segmenteistä esimerkiksi liittämällä toisiinsa samoilla restriktioentsyymei-llä pilkotut cDNA-segmentit; .25 (8) AHF-synteesiä ohjaamaan kykenevien DNA-ilmentyrnisvek- toreiden muodostaminen; (9) Soveltuvan isännän transformointi ilmentymisvektoreilla, jotka sisältävät ihmisen tai sian AHF:ää vastaavan täyspitkän cDNA:n; 30 (10) Ihmisen tai sian AHF:n tuottaminen isännässä; ja (11) Tuotetun AHF:n talteenotto.

:*·.· Tämän työn kuluessa on kehitetty uusi menetelmä genomi-DNA-kirjaston tutkimiseksi käyttämällä hyvä.ksi AHF-molekyylin sisältämiin aminohapposekvensseihin perus-***· 35 tuvia oligonukleotidisekvenssejä.

6 8 6 4 3 6

Keksinnön mukaiselle vektoreille, seulontavälinee-lle ja valmistusmenetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

Lyhyt yhteenveto piirroksista 5 Kuvio 1 esittää esimerkissä 1 kuvatun 69 000 daltonin trombiinipilkkomistuotteen aminoterminaalisen jakson määritettyä aminohapposekvenssiä (A). Ensimmäinen ryhmä ei ollut identifioitavissa. Tätä jaksoa verrataan jaksoon (B), joka on päätelty esimerkissä 3 kuvatun sian AHF-ek-10 sonin nukleotidisekvenssin perusteella ja esimerkissä 4 kuvattuun ihmisen AHF-eksonisekvenssiin (C).

Kuvio 2 valaisee Fassin et ai. (infra) eristämän sian 166 kilodaltönin (kd) AHF-fragmentin aminopään nau-dantrombiinipilkkomisfragmentin (A) ja 40 kd:n trombiini-15 pilkkomistuotteen (b) aminohapposekvenssiä.

Kuvio 3 valaisee oligonukleotidikoettimen suunnittelemista ainakin osan sian AHF-geenistä identifioimiseksi ja eristämiseksi.

Kuvio 4 valaisee esimerkissä 3 kuvatusta bakterio-20 fagi PB34:stä peräisin olevan Smal-DNA-fragmentin (34-Sl), joka sisältää sian AHF-eksonin, DNA-sekvenssiä.

Kuvio 5 esittää Haelll-insertin 34-H1, joka sisältää esimerkissä 3 kuvatun sian AHF-eksonin, DNA-sekvens-siä. Tämä sekvenssi on osa kuviossa 4 esitettyä pitempää . 25 sekvenssiä ja vastaa kuvion 4 mukaisen sekvenssin nukleo tidejä 250-615.

Kuvio 6 esittää kloonin 25-S1 Sau3Al-insertin osan, nukleotidistä 34 nukleotidiin 84, DNA-sekvenssiä, joka on osa esimerkissä 4 kuvatusta ihmisen AHF-eksonista : 30 sekä sen perusteella pääteltyä aminohapposekvenssiä.

Kuvio 7 valaisee DNA-nukleotidisekvenssiä (vain toisen säikeen sekvenssi esitetään), joka sisältää koko ihmisen AHF:ää koodaavan jakson sekä sen perusteella pääteltyä ihmisen AHF:n aminohapposekvenssiä.

7 86436

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Seuraavat määritelmät annetaan tämän hakemuksen ymmärtämisen helpottamiseksi. Seuraavien määritelmien on määrä rajoittaa sitä laajaa aluetta, jolla määritelmät 5 eroavat alalla käytössä olevista merkityksistä.

Amplifikaatiolla tarkoitetaan prosessia, jolla so lut tuottavat geenitoistoja kromosomi-DNA:nsa sisällä.

Kotransformaatiolla tarkoitetaan menetelmää, jos sa transformoidaan solu useammalla kuin yhdellä solulle 10 vieraalla eksogeenisellä geenillä, joista yksi antaa so lulle valikoitavissa olevan fenotyypin.

Jälkeen (downstream) tarkoittaa suuntaa nukleotidi jakson 3'-päätä kohden.

Edistäjä (enhancer) on nukleotidijakso, joka voi 15 saada aikaan geenien kopioinnin riippumatta siitä, mikä geeni on kysymyksessä, tämän jakson asemesta suhteessa geeniin tai jakson orientaatiosta.

Geeni on tiettyä valmista proteiinia koodaava de-oksiribonukleotidijakso. Geeniin eivät tässä yhteydessä 20 sisälly reuna-alueet, joita ei lueta, kuten RNA-kopioin-nin aloitussignaalit, polyadenylaatiolisäyskohdat, promoottorit tai edistäjät.

Valikointigeeni on geeni, joka antaa soluille fenotyypin, jossa geeni ilmentyy havaittavissa olevana pro-. 25 teiinina.

Valikointiväline on olosuhde tai aine, joka tekee mahdolliseksi valikointigeenin ilmentymisen detektoinnin.

Fenotyypillä tarkoitetaan solugenotyypin ilmentä-miä solun havaittavissa olevia ominaisuuksia.

: 30 Genotyypillä tarkoitetaan solun sisältämää geneet tistä informaatiota vastakohtana sen ilmentymiselle, joka havaitaan fenotyyppinä.

Ligaatio on prosessi, jossa muodostetaan fosfodi-esterisidos kahden DNA-säikeen 5'- ja 3'-päiden välille. 35 Tämä voidaan saada aikaan lukuisin tunnetuin entsymaat- '-··* tisin menetelmin, joihin kuuluu tylppien päiden ligaatio v: T4-ligaasilla.

8 8 6 4 3 6

Orientaatio tarkoittaa nukleotidien järjestystä DNA-jaksossa. DNA-jakson kääntynyt orientaatio on orientaatio, jossa jakson järjestys 5'-päästä 3'-päähän katsottuna on päinvastainen kuin referenssikohdassa DNA:ssa, 5 josta tämä jakso on saatu. Tällaisiin referenssikohtiin voivat kuulua muiden lähde-DNA:ssa esiintyvien määrättyjen DNA-jaksojen kopioinnin ohjaus tai jakson sisältävien replikoituvien vektoreiden replikaation aloituskohta.

Kopiointi, transkriptio, tarkoittaa RNA:n syntee- 10 siä DNA-templaatista.

Transformaatiolla tarkoitetaan solun genotyypin muuttamista eksogeenisen DNA:n soluun ottamisen kautta. Transformaatio voidaan joissakin tapauksissa detektoida solun fenotyypin muuttumisen kautta. Transformoituneita 15 soluja kutsutaan transformanteiksi. Soluja ennen trans formaatiota olevassa muodossaan kutsutaan parentaaliso-luiksi.

Translaatio tarkoittaa polypeptidisynteesiä lähetti -RNA:sta (mRNA:sta).

20 Tämä keksintö tekee ensimmäistä kertaa mahdolli seksi sian tekijä VIII:C-geenin identifioinnin ja eristämisen yhdistelmä-DNA-menetelmin. Se tekee mahdolliseksi myös ihmisen tekijä VIII:C:tä koodaavan geenin eristämisen ja identifioinnin yhdistelmä-DNA-menetelmin käyttä-25 mällä hyväksi sian AHF-DNA:n ja ihmisen AHF-DNA:n välistä homologiaa ihmisen AHF-geenin paikallistamiseksi ja eristämiseksi. Tällä tavalla, jolla saadaan cDNA-klooneja AHF:n tuottamiseksi ja eristämiseksi, vältetään työläs, aikaa vievä ja kallis ihmisen AHFtn puhdistaminen, joka '30 proteiini on hyvin kallista ja miltei mahdotonta saada.

Sian AHF puhdistetaan ensin perusteellisesti, : edullisimmin puhdistamismenetelmällä, jossa käytetään mo- .··. noklonaalisia vasta-aineita, kuten menetelmällä, jota ovat kuvanneet David Fass et ai. ['Monoclonal Antibodies 35 to Porcine AFH Coagulant and Their Use in the Isolation 9 86436 of Active Coagulent Protein", Blood 59 (1982) 594-600] ja Knutsen et al. ['Porcine Factor VIII:C prepared by affinity Interaction with Von Willebrand Factor and Heterologous Antibodies", Blood 59 (1982) 615-624], jotka molem-5 mat julkaisut mainitaan tässä viitteenä. Sian tekijä VIII:C-polypeptidit sidotaan monoklonaalisiin anti VIII:-C-vastaaineisiin, jotka ovat immobilisoituina soveltuvalle affiniteettikromatografiakolonnille. Kaksi suurimole-kyylistä peptidiä, joiden molekyylikoot ovat noin 166 ja 10 130 kd, eluoituu etyleenidiamiinitetraetikkahapolla. Toi nen proteiinisegmentti, jonkamolekyylipaino on noin 76 kd, eluoidaan sitten kolonnista käyttämällä noin 50-%lista etyleeniglykolia. Näiden polypeptidien ja/tai näiden polypeptidien fragmenttien, jotka saadaan tunnetulla ta-15 valla, esimerkiksi pilkkomalla proteiinit entsymaattisesti käyttämällä proteiinien rikkomiseen naudan trombiinia ja muita soveltuvia aineita, aminohappo-osittaisjaksot määritetään sitten tunnetuin analyysimenetelmin. Näiden materiaalien aminohapposekvenssin perusteella syntetisoi-20 daan oligonukleotidikoettimet, joista ainakin jotkut hyb-ridisoituvat vastaavaa AHF-segmenttiä koodaavien DNA-seg-menttien kanssa. Näitä oligonukleotideja käytetään sitten etsittäessä sian AHF:ää koodaavia geenisegmenttejä.

Kun saadaan osa sian AHF-geenistä, käytetään tätä 25 yhdistelmämateriaalia ihmisen genomi-DNA-kirjaston tutki- miseen ihmisen AHFrää koodaavan geenin paikallistamiseksi '·* ; ja eristämiseksi. Tässä menettelyssä todetaan, että ihmi sen AHF:n ja sian AHF:n välillä on huomattavia yhtäläi-..1 ! syyksiä, ja näitä yhtäläisyyksiä käytetään hyväksi ihmi- 30 sen tekijä VIII:C-geenin tai geenisegmenttien eristämiseksi ja identifioimiseksi.

:*·.] Sian ja ihmisen proteiinien väliset yhtäläisyydet johtuvat vastaavista yhtäläisyyksistä näitä aminohappo-^ jaksoja koodaavissa DNA-jaksoissa. AHF-proteiineja *:*. 35 ίο 8 6 4 3 6 koodaava geneettinen materiaali on ihmisessä ja siassa samanlaista suuressa prosenttiosuudessa asemia ja siten nämä materiaalit hybridisoituvat, kun ne käsitellään esimerkiksi Bentonin ja Davisin menettelyllä /"‘'Screening gt 5 Recombinant Clones by Hybridization to Single Plaques In Situ", Science 196 (1977) 1807, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä.

Ihmisen AHF-geenin kloonattuja segmenttejä käytetään sitten AHF-mRNA:n lähteen identifioimiseksi erilais-10 ten ihmiskudosten joukosta. Samalla tavalla käytetään yhtä tai useampaa kloonattua sian AHF-geenisegmenttiä sian mRNA:n potentiaalisten kudoslähteiden etsimiseen. Tämä vaihe toteutetaan tavanomaisin menettelyin, joihin liittyy RNA:n erottaminen, geelielektroforeesi, siirto nitro-15 selluloosalevyille ja hybridisoiminen radionuklidileima-tun kloonatun DNA:n kanssa, tavalla, jota kuvaavat esimerkiksi Maniatis et ai. /Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982_7. Kun tämä kudoslähde on identifioitu, valmistetaan cDNA-kirjastot 20 (joko plasmidi tai edullisesti bakteriofagi lambda-vek- toreissa, jotka molemmat ovat yleisesti saatavia) ja niistä etsitään AHF-cDNA-kloonit jäljempänä kuvattavalla tavalla. cDNA-kirjaston tutkimisprosessi toistetaan, kunnes saadaan sarja cDNA-klooneja, joiden osoitetaan DNA-sek-25 venssimäärityksen avulla muodostavan koko AHFrää koodaa-··· van DNA-jakson.

: Kun on saatu täyspitkä ihmisen tai sian AHF-cDNA- .·. ; klooni, käytetään tunnettuja ja soveltuvia keinoja AHF- - - proteiinin ilmentämiseksi, esimerkiksi sijoittamista asian- . / 30 mukaiseen vektoriin ja transfektiota sopivaan isäntään, transformoituneiden solujen (transformanttien) valikointia ja näiden transformanttien viljelyä AHF-aktiivisuu-*: den ilmentämiseksi.

·.· : AHF-ilmentymiseen käytettävät isäntä-vektori-sys- 35 teemit voivat olla prokaryoottisia, mutta AHF:n monimut-.···. kaisuuden vuoksi on edullinen ilmentymissysteemi • · · n 86436 eukaryoottinen, edullisesti (ainakin biologisesti aktiivisen AHF:n, jolla on hyydytysvaikutus, ollessa kyseessä) nisäkässysteemi. Tämä saadaan helposti aikaan transformoimalla eukaryoottisolut (yleensä nisäkäs- tai selkäran-5 kaissolut) soveltuvalla AHF-vektorilla. Eukaryoottinen transformointi on yleisesti tunnettu menetelmä ja se voidaan toteuttaa joukolla erilaisia standardimenetelmiä. Näihin kuuluvat protoplastifuusion, DNA-mikroinjektoin-nin, kromosomin transfektoinhin, lyyttisten ja ei-lyyttis-10 ten virusvektorien /esimerkiksi Mulligan et ai., Nature (London) 277 (1979) 108-1147, solu-solu-fuusion /Fournier et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. 74 (1977) 319-323.7, lipidi-rakenteiden (US-patenttijulkaisu 4 394 448) ja DNA-saos-tumien soluendosytoosin /Öachetti et ai., Proc. Nat. Acad. 15 Sei. 74 (1977) 1590-1594./ käyttö. Myös muita eukaryootti-soluja, kuten hiivoja tai hyönteissoluja, voidaan käyttää menestyksellisesti.

Lyyttisten virusvektorien välityksellä tehtävä transformointi on tehokas, mutta epäedullinen useista 20 syistä: Transfektoivan DNA:n maksimikokoa rajoittaa vi-ruskapsidipakkauksen geometria, eksogeenisille geeneille tapahtuu usein deleetio viruksen replikoitumisen aikana, vaaditaan apuvirusta tai erikoistuneita isäntiä, isäntä-solujen tulee olla läpäiseviä ja isäntäsolut kuolevat vi-' '·· 25 rusinfektion aikana.

/' Ei-lyyttiset transformaatiot perustuvat solulinjaan i stabiilina episomina tuotujen virusvektoreiden kopioin- tiin ja luentaan. Nämä järjestelmät vaativat yleensä ai-: nutlaatuisia solulinjoja ja niillä on lukuisia epäkohtia.

30 Katso "Trends in Biochemical Sciences", kesäkuu 1983, s. 209-212.

. . Muille transformointimenetelmille, joissa kromoso- ’·/· min ulkopuolinen DNA otetaan isäntäsolujen kromosomeihin, ' on toisaalta ollut luonteenomaista alhainen transformoi- ·; 35 tumistiheys ja heikko ilmentymistaso. Nämä alkuvaikeudet on voitettu tekemällä transformointi geeneillä, jotka 12 86436 antavat perinnöllisen valikoitavissa olevan fenotyypin sille pienelle alapopulaatiolle soluja, jotka todella transformoituvat (valikointigeenit). Koko transformoitua solupopulaatiota voidaan kasvattaa olosuhteissa, jotka 5 suosivat fenotyypin omaksuneita soluja, jolloin on mahdollista helposti paikallistaa transformoituneet solut.

Sen jälkeen voidaan transformanteista tutkia kyky voimakkaammin ilmentää fenotyyppiä. Tämä saadaan aikaan vaihtamalla valikointiväline sellaiseksi, että havaitaan suurem-10 pi ilmentyminen.

Valikointigeenit jakautuvat kolmeen ryhmään: havaittavissa olevalla tavalla amplifioituneet valikointi-geenit, dominoivat valikointigeenit ja havaittavissa olevalla tavalla amplifioituneet dominoivat valikointigeenit. 15 Detektoitavasti amplifioituneet valikointigeenit ovat geenejä, joiden amplifikaatio voidaan havaita saattamalla isäntäsolut alttiiksi valikointivälineen muutoksille. Detektoitavasti amplifioituneet geenit, jotka eivät ole dominoivasti toimivia, vaativat yleensä parentaaliso-20 lulinjan, jonka genotyypissä on valikointigeenin vajaus. Esimerkkeihin kuuluvat hydroksimetoliglutanyyli CoA-reduk-taasia /"Sinensky, Biochem. Biophys. Res. Commun 78 (1977) 863/, ribonukleotidireduktaasia /Meuth et ai., Cell 3 (1943) 367/, aspartaattitranskarbamylaasia /Kemp et ai., 25 Cell 9 (1976) 541/, adenylaattideaminaasia /DeBatisse et : ai., Mol and Cell Biol 2, nro 1 1 (1982) 1346-1353/, hii- 1"I ren dihydrofolaattireduktaasia (DHFR) ja, defektiivisen 1 promoottorin kanssa, hiiren tymidiinikinaasia (TK) koo- - daavat geenit.

: 30 Dominoivat valikointigeenit ovat geenejä, jotka il- mentyvät transformanteissä riippumatta parentaalisolun genotyypistä. Kaikkein dominoivimmat valikointigeenit ei-vät amplifioidu detektoivalla tavalla, koska fenotyyppi :’· : käsittelee valikointivälinettä niin tehokkaasti, että on 35 vaikea erottaa solulinjoista ne, jotka ovat amplifioineet geenin tai eivät ole sitä tehneet. Esimerkkeihin tämän- 13 86436 tyyppisistä dominoivista valikointigeeneistä kuuluvat pro-karyoottien entsyymejä/ kuten ksantiini-guanidiinifosfo-ribosyylitransferaasia /Mulligan et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. 78, nro 4 (1981) 2072-20767 ja aminoglykosidi-3'-fos-5 fotransferaasia /Colbere. Garapin et ai. J- Mol. Biol. 150 (1981) 1-14./, koodaavat geenit.

Jotkut dominoivat valikointigeenit amplifioituvat myös havaittavalla tavalla. Soveltuviin esimerkkeihin kuuluvat DHFR-mutanttigeeni /Baber et ai., Somatic Cell Genet 10 4 (1982) 499-598.7, solupintamarkkerit, kuten HLA-antigee- nit ja sellaisia entsyymejä kuin spesifisiä esteraaseja, jotka tuottavat fluoresoivia tai värillisiä tuotteita fluorogeenisistä tai kromogeenisistä substraateista, koodaavat geenit, kuten alalla tiedetään.

15 Havaittavissa olevalla tavalla amplifioituvat, do minoivat valikointigeenit ovat edullisia tässä yhteydessä käytettäviksi. Tulisi ottaa huomioon, että dominoiva valikointigeeni voidaan muuttaa joissakin tapauksissa havaittavissa olevalla tavalla amplifioituvaksi geeniksi ai-20 heuttamalla geeniin soveltuvia mutaatioita.

Valikointigeenien kaupallinen hyöty oli aluksi rajoitettu. Vaikka ne antoivat mahdollisuuden valita trans-formantit, joilla on taipumus amplifioidä vastaanotettua DNA:ta, tuottivat useimmat valikointigeenit kaupallisesti 25 arvottomia tuotteita. Kaupallisesti arvokkaita tuotteita koodaavat geenit eivät toisaalta yleensä antaneet helpos-I* - ti (tai edes detektoitavia) fenotyyppejä transformanteil- ; leen. Näin tapahtuisi esimerkiksi entsyymeillä tai hormo- / neilla, jotka eivät anna transformoiduille soluille ainut- : 30 laatuisia ravinnemetabolia- tai detoksifikaatiokykyjä.

Useimmat kaupallisesti kiinnostavat proteiinit kuuluvat tähän ryhmään, esimerkiksi hormonit, veren hyytymiseen osallistuvat proteiinit ja fibrinolyyttiset entsyymit.

Myöhemmin havaittiin, että eukaryoottisoluilla, 35 joilla on taipumus transformoitua valikointigeenillä ja "" amplifioida sitä, on sama taipumus tuotetta vastaavan 14 8643 6 geenin suhteen. Seuraamalla valikointigeeniä voitiin identifioida transformanttisolualapopulaatio, joka ilmentää ja amplifioi tuotetta vastaavaa geeniä rinnan valikointi-geenin kanssa. Käytäntönä on ollut viljellä transformant-5 teja valikointivälineen läsnä ollessa ja päätellä, että transformantit, joissa valikointigeenin ilmentyminen on lisääntynyt, ilmentävät voimakkaammin myös tuotegeeniä.

Näin ei aina ole asianlaita, kuten jäljempänä tarkemmin kuvataan. Axel et ai. (US-patenttijulkaisu 4 399 216) käyt-10 tävät termiä kotransformaatio kuvaamaan prosessia, jossa solu transformoidaan useammalla kuin yhdellä erilaisella geenillä sisälsivätpä vektorisysteemit sitten kovalentti-sesti kytkettyjä tai kytkemättömiä geenejä ja viedäänpä geenit jälkimmäisessä tapauksessa isäntäsoluihin peräk-15 käin tai samanaikaisesti. Kotransformaation pitäisi "mahdollistaa itse asiassa minkä tahansa määritellyn geenin vieminen ja pysyvä integroiminen viljeltyihin soluihin" /Viigler et ai. Cell 16 (1975) 777-7857 ja "käyttämällä kotransformaatiomenetelmää on mahdollista tuottaa euka-20 ryoottisoluja, jotka syntetisoivat haluttuja proteiini-ja muita materiaaleja" (US-patenttijulkaisu 4 399 216, sarake 3, rivit 37-42).

Transformointivektorit AHF-kotransformaatiossa käytettävät vektorit si-: - 25 sältävät valikointigeenin ja AHF-geenin. Transformaatio- ja kotransformaatiovektoreissa esiintyy lisäksi muita rakenneosia, kuten edistäjiä, promoottoreita, introneita, ! ylimääräistä DNA:ta, polyadenylaatiokohtia ja 3'-puolen .* koodaamattomia alueita, kuten jäljempänä kuvataan.

• : 30 Soveltuvia valikointigeenejä kuvataan edellä. On edullista, että valikointiväline on sellainen, joka estää solun kasvun valikointigeenin puuttuessa. Sillä tavalla ' laajamittaisessa viljelyssä esiintyvät taantuvat solut, : * ' jotka menettävät valikointigeenin (ja oletettavasti myös *. 35 AHF-geenin) , eivät pääse liiaksi kasvamaan fermentoinnin ‘"I aikana. Kaupallisessa AHF-tuotannossa olisi kuitenkin is 86436 edullista välttää solumyrkkyjen käyttöä ja yksinkertaistaa sillä tavalla tuotteen puhdistusvaihetta. Toivottava valikointigeeni olisi siten geeni, joka antaa transfor-manteille kyvyn käyttää kasvun kannalta ratkaisevaa ravin-5 netta, jota ne eivät muuten pystyisi käyttämään. Edellä kuvattu TK-geeni on esimerkki tällaisesta geenistä.

Kotransformaatiossa on käytetty kahta vektoriryh-mää. Ensimmäinen ryhmä muodostuu kytkemättömistä vektoreista. Siinä valikointigeeniä ja AHF-geeniä ei ole sidot-10 tu kovalenttisesti. Tämä vektoriryhmä on edullinen, koska ei tarvita vaihetta, jossa nämä kaksi geeniä ligatoidaan tai muuten kytketään. Tämä yksinkertaistaa transformaatioprosessia, koska valikointi- ja tuotegeenit saadaan yleensä eri lähteistä eivätkä ne ligatoidu villin tyypin 15 ympäristössään. Kotransformaation aikana käytettävä AHF-ja valikointigeenien moolisuhde voidaan lisäksi säätää sellaiseksi, että kotransformaatioteho paranee.

Toisen kotransformaatiovektorien ryhmän muodostavat kytketyt vektorit. Nämä vektorit eroavat kytkemättö-20 mistä vektoreista siinä suhteessa, että valikointi- ja AHF-geenit on liitetty kovalenttisesti, edullisesti li-gaation kautta.

Tässä yhteydessä käytettävät vektorit voivat sisältää myös edistäjiä. Edistäjät ovat toiminnallisesti eri-'· 25 laisia kuin promoottorit, mutta näyttävät toimivan yhdessä promoottorien kanssa. Niiden solutason toimintaa ei tun-: .·. neta hyvin, mutta niiden ainutlaatuisena ominaispiirteenä • ] ^ on kyky aktivoida tai tehostaa kopiointia olematta riip puvaisia asemasta tai orientaatiosta. Promoottorien tulee ; - 30 olla geenin edellä, kun taas edistäjiä voi esiintyä pro- moottorin edellä eli 5’-suuntaan siitä, geenin sisällä in-tronina tai geenin jälkeen geenin ja polyadenylaariokon- dan välissä tai polyadenylaatiokohdan 3'-puolella. Kään- • : tyneet promoottorit eivät ole toimivia, mutta kääntyneet 35 edistäjät ovat. Edistäjät ovat cis-toimivia, so. ne vai-kuttavat promoottoreihin vain esiintyessään samassa ie 86436 DNA-säikeessä. Edistäjiä käsitellään yleisesti julkaisussa Khoury et ai., Cell 33 (1983) 313-314.

Edullisia edistäjiä saadaan eläinviruksista, kuten simianvirus 40:stä, polyoomaviruksesta, naudanpapillooma-5 viruksesta, retroviruksesta tai adenoviruksesta. Virus-edistäjiä on helppo saada yleisesti saatavissa olevista viruksista. Lukuisten virusten, esimerkiksi Rous-sarkoo-maviruksen ja simianvirus 40:n, edistäjäalueet tunnetaan hyvin. Katso Luciw et ai., Cell 33 (1983) 705-716. Olisi 10 rutiinikemiaa paljastaa nämä alueet kyseessä olevaa virusta koskevien julkaistujen restriktiokarttojen perusteella ja, mikäli tarpeen, muuttaa kohtia sillä tavalla, että edistäjä voidaan liittää vektoriin halutulla tavalla. Katso esimerkiksi Kaufman et ai., J. Mol. Biol. 159 15 (1982) 601-621 ja Mol. Cell. Biol. 2, nro 11 (1982) 1304- 1319, jotka molemmat julkaisut mainitaan tässä viitteenä. Edistäjä voidaan vaihtoehtoisesti syntetisoida sekvenssi-tietojen perusteella; virusedistäjien koot (yleensä alle noin 150 emäsparia) ovat riittävän pieniä, jotta tämä 20 voidaan tehdä käytännöllisesti.

Toinen rakenneosa, jonka tulisi esiintyä vektori-rakennelmassa, on polyadenylaatiosilmukoitumiskohta (eli lisäyskohta). Tämä on DNA-jakso, joka sijaitsee geenin luettujen alueiden jälkeen ja jonka jälkeen kopiointi 25 välittömästi pysähtyy ja adeniiniribonukleotidit liite-tään polyadeniininukleotidihännän muodostamiseksi lähet-• ; ti-RNA:n 3'-päähän. Polyadenylaatio on tärkeä lähetti- RNA:n stabiloimiseksi solussa tapahtuvaa hajoamista vastaan, joka on tapahtuma, joka vähentää lähetti-RNA:n pi-30 toisuutta ja siten tuoteproteiinin määrää.

Eukaryoottien polyadenylaatiokohdat tunnetaan hy-* ·.· vin. Eukaryoottigeeneissä esiintyy konsensus jakso: Heksa- : nukleotidi 5 '-AAUAAA-3 ' on 11-30 nukleotidin päässä poly- adenylaation aloituskohdasta. Polyadenylaatiokohtia sisäl-;·· 35 täviä DNA-jaksoja voidaan saada viruksista julkaistujen ···' raporttien mukaisesti. Polyadenylaatiokohtia on 17 86436 saatavissa esimerkiksi hiiren betaglobuliinigeenistä ja simianvirus 40:n varhaisen ja myöhäisen alueen geeneistä, mutta virusten polyadenylaatiokohdat ovat edullisia. Koska nämä jaksot tunnetaan, ne voidaan syntetisoida in 5 vitro ja ligatoida vektoreihin tavanomaisesti.

Polyadenylaatioalueen tulee sijaita joko AHF-ja/tai valikointigeenin jälkeen. Se voidaan ligatoida vain valikointigeeniin eikä ollenkaan tuotegeeniin ja tämä pätee, olivatpa vektorit sitten kytkettyjä tai kytke-10 mättömiä. Jakso, joka erottaa polyadenylaatiokohdan luennan lopetuskodonista, on edullisesti DNA-oligonukleotidi, jota ei lueta, kuten promoottoriton eukaryoottigeeni.

Koska tällaisilla oligonukleotideilla ja geeneillä ei ole promoottoria, ne eivät ilmenny. Oligonukleotidia tulisi 15 olla huomattavan pitkälti, jopa noin 1 000 emäksen verran, lopetuskodonin ja polyadenylaatiokohdan välissä. Tämän 3'-puolen oligonukleotidi, jota ei lueta, johtaa yleensä tuotesaantojen paranemiseen. Vektori voi loppua noin 10-30 emäsparia konsensusjakson jälkeen, mutta on 20 edullista säilyttää polyadenylaatiokohdan jälkeen sen villin tyypin ympäristössä esiintyvät 31-pään jaksot. Nämä jaksot ulottuvat tyypillisesti noin 200-600 emäsparin päähän polyadenylaatiokohdan jälkeen.

Tässä kuvatut vektorit voidaan syntetisoida alan 25 asiantuntijoille tutuilla menetelmillä. Vektorien rakenneosat, kuten valikointigeenit, edistäjät, promoottorit ja vastaavat, voidaan saada joko luonnollisista lähteistä tai syntetisoida edellä esitetyllä tavalla. Jos rakenneosia esiintyy DNA:ssa, jota on saatavissa suuria määriä, 30 esimerkkeinä virusten toiminnalliset komponentit tai jos niitä voidaan syntetisoida, esimerkkeinä polyadenylaatio-'1 kohdat, voidaan restriktioentsyymejä asianmukaisesti käyttämällä periaatteessa saada suuria määriä vektoria yksinkertaisesti viljelemällä lähdeorganismia, pilkkomal-'.! 35 la sen DNA sopivalla endonukleaasilla, erottamalla DNA- y fragmentit, identifioimalla mielenkiinnon kohteena olevan ie 86436 rakenneosan sisältävä DNA ja ottamalla se talteen. Tavallisesti muodostetaan pieni määrä transformaatiovektoria ja ligatoidaan se sitten soveltuvaan, autonomisesti repli-koituvaan synteesivektoriin, kuten prokaryoottiplasmidiin 5 tai fagiin. Useimmissa tapauksissa voidaan käyttää plas-midia pBR322. Katso Kaufman et ai., op. cit.

Synteesivektoreita käytetään ligatoitujen trans-formointivektorien kloonaamiseen tavanomaisesti, esimerkiksi transfektoimalla sopiva prokaryoottinen organismi, 10 replikoimalla synteesivektoria runsaslukuiseksi ja ottamalla talteen synteesivektori hajottamalla solu ja erottamalla synteesivektori solutähteistä.

Talteen kerätyllä synteesivektorilla voidaan trans-fektoida suoraan eukaryoottisolut tai transformointivek-15 tori voidaan erottaa synteesivektorista tekemällä asianmukainen endonukleaasipilkkominen, erottaminen molekyy-lipainon mukaan ja transformointivektorin talteenotto. Transformointivektorin erottaminen ei ole välttämätöntä, kunhan synteesivektorin muut osat eivät vaikuta haitalli-20 sesti geenin amplifikaatioon, kopiointiin tai luentaan eukaryoottisolussa. Tässä yhteydessä edullinen synteesi-vektori on esimerkiksi E. coli plasmidin pBR322 mutantti, josta on poistettu eukaryoottisoluille haitalliset jaksot. Katso Kaufman et ai., op. cit. Käyttämällä tätä mutanttia 25 vältetään tarve poistaa plasmiditähde ennen kotransfor-maatiota.

Kotransformaatio, valikointi ja amplifikaation havaitseminen

Transformoitava solu voi olla mikä tahansa eukary-30 oottisolu, hiivaprotoplastit mukaan luettuina, mutta yleensä se on muu kuin sienisolu. Primaariset kudosviljel-mäsolut (suhteellisen erilaistumattomat solut, kuten kan-: tasolut, mukaan luettuina) ja immortaali- ja/tai trans formoidut solulinjat ovat soveltuvia. Ehdokassolujen ge-35 notyypissä ei tarvitse olla valikointigeenin vajausta, ·' kunhan valikointigeeni on dominoivasti toimiva.

19 86436

Solut ovat edullisesti pysyviä nisäkässolulinjo-ja, kuten edellä mainittiin. Solulinjat, joiden tiedetään stabiilisti integroivan valikointigeenit kromosomaaliseen DNA:hansa, ovat parhaita, esimerkiksi kiinanhamsterin mu-5 nasolulinjat (CHO-solulinjät). Käyttökelpoisia ovat myös HeLa, COS-apinasolut, melanoomasolulinjät, kuten Bowes-solulinja, Hiiren L-solut, hiiren fibroblastit ja hiiren NIH 3T3 -solut.

Kytkemättömillä vektoreilla toteutettava kotrans-10 formaatio voidaan tehdä peräkkäin tai samanaikaisesti (US-patenttijulkaisu 4 399 216). Menetelmiä, joilla saadaan aikaan DNA:n vastaanotto soluun, kuvataan edellä. Vektorin mikroinjektoinnilla solun tumaan saavutetaan parhaat transformointitehot, mutta parenteraalisolujen kä-15 sittely kalsiumfosfaattisaostuman muodossa olevalla DNA:11a on helpoin tapa. Kotransformointiteho paranee huomattavas-l L, kun koiransformoinnissa käytetään Luotegeenin mooli-ylimäärää valikointigeeniin nähden, joka ylimäärä on suuruusluokkaa 100:1.

20 Transformointiolosuhteissa käsitelty solupopulaa tio käsitellään sitten transformanttien identifioimiseksi. Vain pienellä osapopulaatiolla mistä tahansa viljelmästä, joka on kotransformaatiokäsitelty, on valikointi-:·. geenifenotyyppi. Viljelmän solut tutkitaan tämän fenotyy- 25 pin löytämiseksi. Tämä voidaan tehdä tutkimalla solut yksitellen solujeniäjittelulaitteella silloin, kun feno-tyyppi on sellainen, että se tuottaa signaalin, esimerkiksi fluoresenssisignaalin fluorogeenisen substraatin pilkkoutuessa valikointigeenin tuottaman entsyymin vai-30 kutuksesta. Fenotyyppi on kuitenkin edullisesti sellainen, että se sallii vain transformanttien kasvun tai hengissä säilymisen erityisellä kasvualustalla, kuten edellä tarkemmin kuvattiin.

Valikointitransformanteista tutkitaan sitten tuo-; 35 tegeenin ligaatio niiden kromosomiin tai itse tuotteen ;· ilmentyminen. Edellinen voidaan tehdä käyttämällä 20 86436

Southern blotting -analyysiä, jälkimmäinen tavanomaisin immunologisin tai entsymaattisin tutkimuksin.

Kun transformantit on identifioitu, pyritään tehostamaan tuotegeenin ilmentymistä kloonaamalla edelleen 5 valikointiaineen, kuten MTX:n, läsnä ollessa. Katso US-patenttijulkaisu 4 399 216.

Tässä kuvatun menetelmän mukaisesti tuotetut ko-transformantit ovat soveltuvia korkeampien organismien transfektointiin in vivo tunnetuin menetelmin. Isäntä-10 eläimestä peräisin olevat primaariset kudosviljelmäsolut tai pysyvät solulinjat kotransformoidaan ja niillä inoku-loidaan isäntä tai suurinpiirtein muuten syngeneeinen isäntä, jonka genotyypissä on tuoteproteiinigeenin vajaus.

15 Keksintö on paremmin ymmärrettävissä tutustumalla seuraaviin valaiseviin suoritusmuotoihin, jotka ovat puhtaasti esimerkinomaisia ja joita ei tulisi pitää millään tavalla tämän keksinnön todellista piiriä, jota kuvataan patenttivaatimuksissa, rajoittavina.

20 Ellei toisin mainita, restriktioendonukleaaseja käytetään niiden myyjien suosittelemissa olosuhteissa ja heidän suosittelemallaan tavalla. Ligaatioreaktiot tehdään Maniatisin et ai. kuvaamalla tavalla (Molecular :·. Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- 25 tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 245- 6), joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä, käyttämällä sivulla 246 kuvattua puskuria ja DNA-pitoisuutta 1-100 ^ug/ml lämpötilassa 23°C tylppäpäiselle DNA:lle ja 16°C "tarttuvapäiselle" DNA:lie. Tässä kuvattu "fosfataasikä-30 sittely" tarkoittaa DNA:n defosforylaatiota ja se tehdään tavalla, jotka kuvaavat Maniatis et ai., supra, sivulta 133. "Kinaasikäsittely" tarkoittaa DNA:n fosfory-laatiota. Elektroforeesi tehdään 0,5 - 1,5-%:isilla aga-roosigeeleillä, jotka sisältävät 90 mmol/1 Tris-boraattia ·;;; 35 ja 10 mmol/1 EDTA:a. "Nick-translaatio" tarkoittaa mene- 32 ··- telmää DNA:n leimaamiseksi P:llä, jota kuvaavat Rigby 2i 86436 et ai. /J. Mol. Biol. 113 (1977) 237/. Kaikissa radio- 32 nuklidileimatuissa DNA:issa käytetään merkkiaineena P käytettiinpä mitä tahansa leimausmenetelmää.

"Pikavalmistuksella" ("rapid prep") tarkoitetaan 5 nopeaa bakteriofagin tai plasmidin DNA:n tuotantoa pienessä mitassa, jota kuvaavat esimerkiksi Maniatis et ai., supra, s. 365-373.

Tässä kuvataan myös farmaseuttinen AHF-val-miste. Farmaseuttinen ihmisen AHF-valmiste voidaan 10 valmistaa parenteraaliseen antotapaan sopivaksi alalla tunnetuin menettelytavoin.

Ihmiselle käytettäväksi tarkoitettu farmaseuttinen valmiste sisältää transformoiduista soluista kerättyä steriloitua AHF:ää. AHF-polypeptidin tai sen 15 AHF-aktiivisuuden aikaansaavan riittävän osan lisäksi valmiste voi sisältää yhtä tai useampaa hyväksyttävää kantoainetta ja mahdollisesti muita terapeuttisia aineita. Kantoaineen (aineiden) tulee olla "hyväksyttävä” siinä mielessä, että se sopii yhteen valmisteen muiden 20 aineosien kanssa eikä ole haitallinen vastaanottajalleen. Valmisteen on mukava olla yksikköannosmuodossa ja se voidaan valmistaa millä tahansa farmasian alalla tunnetulla menetelmällä.

Tässä kuvattu parenteraalisesti annettavaksi 25 soveltuva farmaseuttinen valmiste voi mukavasti . koostua steriilistä kylmäkuivatusta AHF-polypeptidival- ; misteesta, joka voidaan saattaa käyttökuntoon lisäämällä steriloitua liuosta, jolloin saadaan liuoksia, jotka edul-lisesti ovat isotonisia vastaanottajan veren kanssa. Val-30 miste voi olla yksikkö- tai moniannossäiliöissä, esimerkiksi suljetuissa ampulleissa tai pulloissa.

Tulisi ymmärtää, että steriilin AHF:n tai sen liuoksen lisäksi tässä kuvattu farmaseuttinen valmiste voi sisältää yhtä tai useampaa muuta aineossaa, kuten 35 laimennusaineita, puskureita, sideaineita, pinta-aktii-visia aineita, sakeutusaineita, voiteluaineita, 22 864 36 säilöntäaineita (hapettumisenestoaineet mukaan luettuina) ja vastaavia. Gelatiini, laktoosi, tärkkelys, magnesium-stearaatti, hienojakoinen silikageeli, kaakaovoi, talkki, kasvi- ja eläinrasvat ja -öljyt, kasviperäinen kumi ja 5 polyalkyleeniglykoli sekä muut tunnetut lääkkeisiin käytettävät kantoaineet ovat kaikki soveltuvia tämän keksinnön mukaisten farmaseuttisten valmisteiden valmistukseen. Parenteraaliseen käyttöön tarkoitettuihin valmisteisiin kuuluvat ampulli, joka sisältää kantajana käytettävään ve-10 teen tai muuhun farmaseuttisesti hyväksyttävään nesteeseen valmistettua steriiliä liuosta tai suspensiota tai ampulli, joka sisältää steriiliä kiinteää AHF:ää laimennettavaksi farmaseuttisesti hyväksyttävällä nesteellä.

Tässä kuvattu farmaseuttinen valmiste on käyttö-kelpoinen hemofilia A:n hoidossa. Nämä valmisteet tarjoavat myös tärkeän välineen hyyttymiseen liittyvien prosessien tutkimiseksi in vivo samoin kuin in vitro sekä AFF-molekyylin immunologisten ja biologisten ominaisuuksien tutkimiseen.

20 Esimerkki 1

Proteiinisekvenssianalyysi

Sian tekijä VIII:C:n puhdisti tri David Fass julkaistujen menetelmien mukaisesti, /knutsen ja Fass (1982) ; Fass et ai. (1982), supra/. 76 000 daltonin proteiinin 25 naudantrombiinipilkkomistuotteelle tehdään aminohapposek-• .·. venssianalyysi seuraavassa kuvattavalla tavalla.

; Monoklonaalista anti-VIII:C-vasta-ainetta sisältä- vään kolonniin sidotut sian AHF-polypeptidit voidaan eluoi-:γ da peräkkäin kahdessa vaiheessa /kass, et ai. (1982)/.

30 Kaksi suurempimolekyylistä spesiestä, 166 000 ja 130 000 daltonia, voidaan eluoida EDTA:lla. Jäljelle jäävä poly-. * peptidi, jonka molekyylipaino on noin 76 000 daltonia, voidaan sitten eluoida 50-%:isella etyleeniglykolilla.

76 000 daltonin proteiini pilkotaan trombiinilla, 35 kun sille on tehty ensin perusteellinen dialyysi liuok-sessa, joka sisältää 50 mmol/1 Tris-HCl:ää (pH 7,5) ja 23 86436 0,15 mol/1 NaCl. Pilkkomiset naudan trombiinilla tehdään huoneen lämmössä 60 minuutin ajan käyttämällä naudan trom-biinia 1 yksikkö/ml, minkä jälkeen lisätään vielä trombii-nia 1 yksikkö/ml ja inkuboidaan vielä 60 minuuttia. Trom-5 biinipilkkomiset pysäytetään kuumentamalla 10 minuuttia 90°C:ssa 0,01-%:isessa SDSzssä. 76 000 daltonin proteiinin trombiiniprikkomisen päätuote on 69 000 daltonin (69 kd:n) polypeptidi.

Alle 1 ^,ug edellä kuvatusta 69 kd:n polypeptidispe-10 sieksestä jodataan käytettäväksi radioaktiivisena markke-rina SDS-geelielektroforeesin jälkeen. U.K. Laemmlin menetelmän mukaisesti /Nature 227 (1970) 680/, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä. Polypeptidi, liuotettuna TAS-puskuriin /50 mM Tris-asetaatti (pH 7,8), 0,1 & SDS:ää/, 15 lisätään 100 ^,ul:aan samaa puskuria, joka sisältää 5 mCi kantajasta vapaata jodi-125:tä. Lisätään 50 yul liuosta, joka sisältää 2,5 mg/ml kloramiini T:tä (Baker) TAS-pusku-rissa ja liuosta sekoitetaan 1 minuutti. Reaktiot päätetään lisäämällä 50 yul liuosta, joka sisältää 2,5 mg/ml 20 natriummetabisulfaattia TAS-puskurissa ja sekoittamalla 1 minuutti. Leimattu proteiini erotetaan siihen liitty-125 mättömästä I:stä kromatografisesti käyttämällä pientä Sephadex G-25 M -kolonnia (PD-10, Pharmacia). Kolonni tasapainotetaan ennalta useilla kolonnin tilavuuksilla 25 TAS-puskuria, joka sisältää 2,5 mg/ml natriumjodidia. Kerätään huokostilavuus ja proteiinin yhtenäisyys analysoidaan SDS-geelielektroforeesilla Laemmlin /(1970), supra/ menettelytavan mukaisesti.

Radionuklidileimattu 69 kd:n proteiini lisätään 30 leimaamattomaan vastineeseensa myöhemmin tehtävää tarkastelua varten. Proteiini väkevöidään sitten yksilöllisesti • ··! elektroforeettisesti. Proteiiniliuokset säädetään sisäl- ·"' tämään 0,1 % SDSzää ja 10 mmol/1 ditiotreitolia ja lisä- *. tään Coomassie-briljanttisinistä (Serva) sen verran, että 35 liuoksesta tulee hyvin vaaleansininen.

24 864 36

Liuoksia dialysoidaan sitten vähän aikaa (1-2 h) TAS-puskurissa käyttämällä Spectrapore-dialyysiletkua (valmistaja Spectrum Medical Industries, Inc., molekyyli-painoraja noin 14 000). Dialysoidut proteiininäytteet 5 asetetaan sitten elektroforeettiseen väkevöintilaitteeseen, jonka mallia ovat ehdottaneet Hankapiller et ai. /Enzyme Structures, Part I, Meth. Enzymol., 91 (1983) 2277 ja konsentroidaan elektroforeettisesti 24 tuntia 50 V:n jännitteellä.

10 Edellä kuvatulla menettelyllä väkevöityä 69 kd:n AHF-polypeptidiä käsitellään elektroforeettisesti SDS-po-lyakryyliamidigeelillä Laemmlin (supra) mukaisesti. Puhdistunut proteiini, joka identifioidaan radionuklidileima-tun merkkipolypeptidin autoradiografiän avulla, irrotetaan 15 geelistä ja elektroeluoidaan ja väkevöidään Hankapillerin et ai. (supra) kuvaamalla tavalla. Väkevöity näyte soveltuu suoraan aminohapposekventointiin, joka tehdään käyttämällä Hewickin et ai. /J. Biol. Chem. 256 (1981) 7990J kuvaamaa kaasufaasisekventoijaa.

20 69 000 daltonin trombiinipilkkomistuotteen amino- terminaalinen, ryhmien 2-42 välinen sekvenssi on kuviossa 1 esitetyn kaltainen. Ensimmäinen ryhmä "X" ei ollut identifioitavissa. 166 kd:n AHF-fragmentin aminopään (A) ja 40 kd:n naudantrombiinipilkkomistuotteen (B) aminohappo-25 sekvenssit, joista Fass et ai. (supra) ovat raportoineet, esitetään kuviossa 2. 76 kd:n polypeptidin aminopään aminohapposekvenssi on: X-Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gin Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile Phe.

. . Esimerkki 2 30 Sian AHF-geenille tarkoitettujen oligonukleotidi- . . koettimien kemiallinen synteesi (a) Pentapeptidikoetinyhdistelmä Kun sian AHF-fragmentin aminohapposekvenssi on osittain määritetty, on mahdollista suunnitella ja synte-35 tisoidä sian AHF-oligonukleotidikoettimia. Geneettisen ' . koodin (taulukko 1) perusteella on mahdollista ennustaa 25 86436 geenisekvenssi, joka koodaa tätä aminohapposekvenssiä. Koska geneettinen koodi on degeneroitunut, on olemassa useampia kuin yksi mahdollinen DNA-koodausjakso kullekin aminohapposekvenssille. Siten valmistetaan useita eli 5 yhdistelmä! komplementaarisia oligonukleotidikoetinjaksoja sellaiselle AHF-molekyylin osalle, joka vaatii vain kohtuullisen määrän oligonukleotideja oikean DNA-jakson varmistamiseksi. Tällaiset alueet valitaan etsimällä 5-8 peräkkäisen aminohapon muodostamia ryhmiä, joilla on alhai-10 sin degeneroitumisaste. Kun tämä alue on valittu, syntetisoidaan yhdistelmä oligonukleotideja, joka sisältää kaikki mahdolliset DNA-jaksot, jotka voisivat koodata valitun alueen 5-8 aminohappoa.

Sian AHF:n 69 000 daltonin trombiinipilkkomisfrag-15 mentissa on pentapeptidijakso aminopäästä lukien 18. aminohaposta 22. aminohappoon, jota voisi koodata korkeintaan 16 erilaista DNA-sekvenssiä, joista kussakin on viisi ko-donia ja 15 nukleotidia.

20 18 20 22

Trp - Asp - Tyr - Gly - Met Mahdolliset mRNA-sekvenssit UGG GAU UAU GGU AUG

tai tai tai

*’-· GAC UAC GGC

25 tai ! GGA

tai

GGG

30 Koettimet valmistetaan syntetisoimalla rajoitettu lukumäärä oligonukleotidien seoksia, joissa on 2-8 tai useampia oligonukleotideja seosta kohden. Näitä seoksia kutsutaan yhdistelmiksi. Valmistetaan niin paljon yhdis-telmiä, että ne kattavat kaikki mahdolliset koodaussek-."·. 35 venssit.

26 86436 Nämä oligonukleotidit voidaan syntetisoida käsin, esimerkiksi fosfotriesterimenetelmällä, jota kuvaavat esimerkiksi R.L. Letsinger et ai. /J. Am. Chem. Soc. 98 (1967) 36557, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä.

5 Halutuille polypeptidijaksoille tarkoitetut syn teettiset oligonukleotidikoettimet valmistetaan kuitenkin edullisesti kemiallisesti identtisellä tavalla täysin automaattisen Applied Biosystems-DNA-syntetisoijan, malli 380A, avulla, kuten edellä mainittiin.

10 Siten valmistetut oligonukleotidit voidaan sitten puhdistaa RP-HPLC-kolonnilla H. Fritzin et ai. kuvaamalla tavalla /Biochemistry 17 (1978) 12577, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä. Kun on tehty detritylaatio 80-%:isella HOAc:lla, on saatava oligonukleotidi normaa-15 listi puhdasta ja sitä voidaan käyttää suoraan koettimena. Jos tuotteessa on epäpuhtauksia, voidaan synteettistä DNA:ta puhdistaa edelleen samalla HPLC-kolonnilla, edullisesti hieman erilaista gradienttisysteemiä käyttäen.

Oligonukleotidit leimataan esimerkiksi käyttämällä 32 20 [ P7ATP:tä ja T4-polynukleotidikinaasia ja niiden sek venssi tarkistetaan joko kaksisuuntaisella homokromato-grafiällä, jota kuvaavat Sanger et ai. /PNAS USA 70 (1973) 12097 tai Maxam-Gilbert-menetelmällä /Meth. Enzymology 65 (1977) 4997/ jotka julkaisut mainitaan tässä viitteenä. 25 (b) 45 nukleotidia sisältävät koettimet Tämän keksinnön ainutlaatuisena puolena on ollut oligonukleotidien käyttö AHF-geenin tai sen fragmenttien etsimiseen genomi-DNA-kirjastosta. Vaikka oligonukleoti-deja on käytetty cDNA-kirjastojen tutkimiseen, katso esi-30 merkiksi M. Jaye et. ai., Nucleic Acids Research 11 (1982) 2325, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä, on genomi-kirjastoja aiemmin tutkittu menestyksellisesti vain cDNA-koettimilla, so. koettimilla, jota muodostettiin vasta sen jälkeen, kun kuvatun proteiinin mRNA:n kudoslähde 35 oli identifioitu ja käytetty sitä hyväksi muodostettaessa 27 86436 cDNA-klooni, joka sopi tarkasti yhteen genomitutkimuksella etsityn geenin DNA-sekvenssin kanssa.

Tässä tapauksessa on osoitettu mahdolliseksi käyttää oligonukleotideja sellaisten geenisegmenttien identi-5 fioimiseksi genomikirjastosta, jotka koodaavat mielenkiinnon kohteena olevien proteiinien aminohapposekvenssiä ja tällaisten geenien identifiointi tarjoaa täsmällisen koettimen mRNA-, cDNA- tai muissa genomitutkimusmenetelmissä käytettäväksi.

10 Edullisesti käytetään, kuten tässäkin, oligonuk leotide ja, jotka vastaavat vähintään kahta mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin aminohapposekvenssin segmenttiä. Vähintään yhtä oligonukleotidikoettimista käytetään edullisesti yhden tai useamman oligonukleotidin yhdistel-15 män muodossa, joka yhdistelmä sisältää kaikki mahdolliset DNA-sekvenssit, jotka voisivat koodata valittuja aminohapposekvenssejä. Edullisesti käytetään yhtä suhteellisen lyhyttä koetinta, esimerkiksi 11-25 nukleotidin, edullisesti 15-20 nukleotidin mittaista, yhdessä suhteellisen 20 pitkän koettimen, esimerkiksi 30-200 nukleotidin, edullisesti 40-50 nukleotidin mittaisen kanssa. Toista koetinta voidaan käyttää varmistukseen eikä se aina ole välttämätön DNA-segmentin identifioinnin kannalta. Edullisesti vähintään toinen koettimista, edullisemmin pitempi niistä, 25 suunnitellaan alla kuvattavien sääntöjen 1-4 mukaisesti.

Sääntö 1

Kodonin suosituimmuusasema

Muiden näkökohtien puuttuessa valittiin nukleoti-disekvenssi, joka sopi yhteen samanlaisissa nisäkäsgee-30 neissä vallitsevien tai esiintyvien samanlaisten jaksojen kanssa. Katso Mechanisms of Ageing Dev. 18 (1982).

Sääntö 2

Edullinen GT-pariutuminen

Nukleotidi G, sen lisäksi, että se liittyy vastin-35 nukleotidiinsa C, voi muodostaa heikkoja sidoksia myös nukleotidin T kanssa. Katso K.L. Agarwal et ai., J. Biol.

28 86436

Chem. 256 (1981) 1023. Kun on valittava G tai A epävarman kodonin kolmanteen asemaan, on siksi edullista valita G, sillä jos tuloksena oleva hybridaatio tapahtuisi, vaikka tässä asemassa oleva todellinen nukleotidi olisi T eikä 5 C, olisi hybridaatio silti pysyvä. Jos valittaisiin väärin A, riittäisi vastaava A:C-yhteensopimattomuus tuhoamaan koettimen kyvyn hybridisoitua genomi-DNA:n kanssa.

Sääntö 3 5'CG-jaksojen välttäminen 10 Kun tehdään valinta mahdollisten epävarmojen nuk leotidien joukosta, valitaan nukleotidit, jotka eivät sisällä kodonin sisäistä tai kodonien välistä 5'C^G-jaksoa.

Sääntö 4

Yhteensopimattomuuksien asema 15 Valittaessa käytettäviä kodonijaksoja, kiinnitet tiin huomiota siihen väittämään, että molekyylin päiden lähellä esiintyvät yhteensopimattomuudet eivät vaikuta haitallisesti hybridisaation stabiilisuuteen, kuten lähellä molekyylin keskustaa sijaitsevat yhteensopimatto-20 muudet tekevät. Niinpä, kun esimerkiksi oli huomattavia epäilyksiä tietyn kodonin sekvenssin suhteen ja tämä kodoni sijaitsi lähellä koettimen keskustaa, pyrittiin testaamaan mahdollisten nukleotidijaksojen yhdistelmä tämän kodonin suhteen, kun taas lähellä koettimen päitä olevat 25 kodoniasemat ratkaistiin todennäköisemmin kodonin suosituimmuusaseman perusteella.

45-meerikoettimille valittu sekvenssi samoin kuin aminohapposekvenssit, mahdolliset DNA-sekvenssit ja "todellinen koetinsekvenssi", so. AHF-eksonille määritetyn 30 todellisen koodaussäikeen komplementti, esitetään kuviossa 3.

Siten niistä nukleotidiasemista, joihin liittyi valinnan mahdollisuus, kolme peitettiin käyttämällä yhdis-telmiä, jotka sisälsivät molempia mahdollisia nukleotidi-35 vaihtoehtoja, viisi ennustettiin oikein, yksi ennustettiin 29 8 6 4 3 6 sillä tavalla, että neutraalisuus säilyi, vaikkakin väärin ja neljä muuta olivat väärin.

Huolimatta noin 11-%:isesta yhteensopimattomuudesta (5/45) on 45-meerioligonukleotidien yhdistelmä riittä-5 vä voimakkaasti identifioimaan sian AHF-geenifragmentin, kuten jäljempänä kuvataan.

Esimerkki 3

Sian genomikirjaston seulonta

Sian genomikirjasto muodostetaan käyttämällä bak-10 teriofagivektoria Lambda J1. Lambda J1 saadaan L47.1:stä /Loenen et ai., Gene 20 (1980) 2497 korvaamalla 1,37 ke:n (kiloemäksen) ja 2,83 ke:n EcoRI-BamHI-fragmentit 95 emäs-parin EcoRI-Hindlll-Xbal-Bglll-BamHI-polykytkijällä.

6,6 ke:n BamHI-fragmentti esiintyy silloin suorana tois-15 tona päinvastoin orientoituneena kuin L47.1:ssä. Kloo-nauskapasiteetti BamHI-fragmenttien suhteen on 8,6 - 23,8 ke. BamHl-pilkotcu sian DNA /preparoitu Piccinin et ai. kuvaamalla tavalla, Cell 30 (1982) 2057 uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja väkevöidään sentrifu-20 goimalla Microfugessa. 0,67 ^,ug BamHI-pilkottua sian DNA:ta ligatoidaan 2 ^,ug:aan Lambda J1 :n BamHI-"haaroja", jotka on preparoitu Maniatisin et ai. (supra, s. 275-279) kuvaamalla tavalla, 10 ^ul:ssa ligaatiopuskuria käyttämällä 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia (Maniatis et ai., supra, 25 s. 291) .

5

Noin 4 x 10 plakin muodostavaa yksikköä (pfu) siirrostetaan E. coli -kannalle 15 cm:n muovisilla petrimaljoilla, jotka sisältävät NZCYM-agaroosia, tiheydeksi noin 8 000 pfu/malja. Nämä yhdistelmäfagit tutkitaan Woon 30 (1979) menetelmällä käyttämällä edellä kuvattua 45-meeri- 32 koetinta, joka on radionuklidileimattu P:llä edellä esitetyllä tavalla, koettimena. Suodattimia hybridisoidaan sitten liuoksessa, jossa on 5 x SSC, 5 x Denhardt's, 0,1 % Λ λ SDS:ää ja 5 x 10 cpm/ml koetinta, 45 C:ssa 16 tuntia, 35 pestään liuoksella, jossa on 5 x SSC ja 0,1 % SDS:ää, 50°C:ssa ja tehdään autoradiografia kuvanvahvistuslevyjä 30 8 6 4 3 6 käyttäen (DuPont Lightning-Plus). Autoradiografia tuo esille lukuisia fageja, jotka hybridisoituivat vaihtele-vassa määrin 45-meerin kanssa. Suodattimet denaturoidaan sitten 0,5 M NaOH:lla, neutraloidaan liuoksella, joka si-5 sältää 1,0 mol/1 Trisiä (pH 7,5) ja 1,5 mol/1 NaCl ja hybridisoidaan 15-meerin kanssa 45-meerin yhteydessä kuvatulla tavalla, paitsi että hybridisaatio ja pesu tehtiin 37°C:n lämpötilassa. Yksi fagi, joka hybridisoitui kummankin koettimen kanssa, poimitaan alkuperäiseltä mal-10 jalta, siirrostetaan 100 pfu ja plakit tutkitaan edellä kuvatulla tavalla käyttämällä koettimena 15-meeriä.

Positiivinen fagi, nimeltään PB34, poimitaan palasena ja siitä valmistetaan maljalysaatti Manitisn et ai. (supra, s. 65-66) kuvaamalla tavalla. Pieni määrä PB34-15 DNA:ta eristetään käyttämällä Maniatisin et ai. (supra, s. 371-372) kuvaamaa menettelyä. 10 ^ul tätä DNA:ta pilkottiin restriktioentsyymillä Haelll ja käsiteltiin sitten fosfataasilla käyttämällä vasikan alkalista fosfataa-sia (Boehringer-Mannheim). Uutetaan fenolilla, lisätään 20 20 ng Smal-pilkottua M13mp8-DNA:ta, lisätään liuokseen

NaCl pitoisuudeksi 0,2 mol/1 ja saostetaan nukleiinihappo lisäämällä kaksinkertainen tilavuus etanolia. Saostunut DNA pelletoidaan sentrifugoimalla, liuotetaan takaisin 2 ^uljaan ligaatioseosta, DNA:ta ligatoidaan 30 mi-25 nuuttia 23°C:ssa, laimennetaan 50 .ul:ksi ligaasipusku-rilla ja ligatoidaan vielä kolme tuntia. 5 ^ul tätä reak-tioseosta käytetään E. coli -kannan JM101/TG1 transfor-mointiin.

Solut tehdään transformointikompetenteiksi kas-30 vattamalla niitä optiseen tiheyteen 0,5 aallonpituudella 600 nm mitattuna (O.D.60Q = 0/5) 37°C:ssa 50 ml:ssa SOBM-alustaa (SOBM sisältää 2 % tryptonia, 0,5 % hiivauutetta, 0,1 mol/1 NaCl, 0,11 g/1 KOH ja 20 mmol/1 MgSO^). Solut ·· pelletoidaan sentrifugoimalla kierrosnopeudella 2 500 35 min""1 10 minuuttia 4°C:ssa. Solut suspendoidaan takaisin - ^ 3,5 ml:aan liuosta, joka sisältää 100 mmol/1 RbCl, 31 86436 45 mmol/1 MnCl^, 50 mmol/1 CaC^ ja 10 mmol/1 kalium-MES, pH 7,4 (MES = metyylietaanisulfonihappo). 200 ^ul kompetentteja soluja transformoidaan DNA:11a, joka sisältää 5 ml ligaatioreaktioseosta, 0°C:ssa 30 minuuttia.

5 Soluja lämpöshokkikäsitellään 42°C:ssa 90 sekuntia, minkä jälkeen lisätään 4 ml 0,8-%:ista agaroosi/SOBM:ää, joka sisältää 100 yUl stationäärisiä JM101/TG1-soluja ja tehdään siirrostus 10 cm:n SOBM-agarpetrimaljoille.

Subklooni, joka sisältää 15-meerin kanssa hybridi-10 soituvaa PB34:n Haelll-fragmenttia, identifioidaan tutkimalla se Bentonin ja Davisin (supra) menettelyllä. Tämä klooni eristetään ja preparoidaan käytettäväksi templaat-tina. Tässä kloonissa, joka nimettiin 34-H1:ksi, esiintyvän HaeIII-fragmentin DNA-sekvenssi esitetään kuviossa 5.

15 M13-templaatti-DNA preparoidaan kasvattamalla 1,5 ml in-fektoituja soluja viisi tuntia 37°C:ssa. Solut pelletoi-daan sentrifugoimalla 10 minuuttia Beckman-mikrofugissa.

1,0 ml supernatanttia (sisältää viruksen) poistetaan ja lisätään 200 ^ul 20-%:ista polyetyleeniglykolia, joka si-20 sältää 2,5 mol/1 NaCl. Tätä näytettä inkuboidaan sitten huoneen lämpötilassa 15 minuuttia ja sentrifugoidaan sen jälkeen viisi minuuttia Beckman-mikrofugissa. Pelletti liuotetaan 100 ^ul:aan TE:tä, lisätään 7,5 ^ul 4 M NaCHCOO, pH 4,5 ja näytettä uutetaan kahdesti seoksella, 25 joka koostuu fenolista ja kloroformista suhteessa 1:1 ja kerran kloroformilla. Yksisäikeinen fagi-DNA saostetaan sitten lisäämällä kaksinkertainen tilavuus etanolia. Saostunut DNA pelletoidaan sentrifugoimalla Beckman-mikrofugissa ja liuotetaan 30 ^ul:aan 1 mM Tris-puskuria (pH 8,0), 30 joka sisältää 0,1 mmol/1 EDTA. DNA-sekventointi tehdään dideoksiketjuterminaatiomenetelmällä /katso esimerkiksi Sanger et ai., PNAS USA 74 (1977) 5463] käyttämällä 15-meeriä alukkeena. Havaittu sekvenssi, joka sisältyy ku-... vioissa 4 ja 5 esitettyihin sekvensseihin, vahvisti sen, 35 että tämä subklooni sisältää sian AHF-eksonin, koska se sisältää identtiset 14 aminohappoa, jotka esiintyvät 32 86436 kuviossa 1 esitetyn 69 kd:n fragmentin aminoterminaalisen jakson alueella fenyylialaniini2 - glutamiini^. Lisävahvistus saatiin tekemällä sekventointi 34-H1-vektorin Haelll-insertin 5'-päästä alkaen käyttämällä alukkeena 5 "Universal primer":iä (Bethesda Research Labs) tässä vektorissa olevan polykytkijän lähellä. Tämän kloonin insert-ti 34-H1 kloonattiin myös uudelleen M13mpg):ään pilkkomalla DNA EcoRItllä ja HindIII:lla, tekemällä fosfataasikä-sittely vasikan alkalisella fosfataasilla ja ligatoimal-10 la EcoRI-, Hindlll-pilkottuun M13mp9:ään. Tämä klooni, joka sisältää Haelll-segmentin invertoituneena universaali-alukkeeseen nähden, sekventoitiin myös edellä kuvatulla tavalla. Saadut koko insertin 34-H1 sekvenssitiedot esitetään kuviossa 5. Tämä sekvenssi vahvistaa sen, että tä-15 mä subklooni sisältää sian AHF-geenin eksonin, joka voisi koodata, nukleotidialueella 169-267, ainakin 30 69 kd:n fragmentin (kuvio 1) aminohappoa fenyylialanii-ni2:sta arginiini^^:een.

Näyttää todennäköiseltä, että arginiini^^ rajoit-20 tuu introniin, koska nukleotidin 267 jälkeen on terminaa-tiokodonit (kuvio 5) kaikissa kolmessa lukukehyksessä ja tältä alueelta nukleotidien 266 ja 267 välistä löytyy myös samanlainen jakso kuin konsensus-51-silmukointikohtajakso. Lisäksi aminohappojakso, jota voisi koodata tämän 25 jälkeen oleva DNA, eroaa täysin sian AHF:n 69 kd:n fragmentissa havaitusta.

PB34-DNA pilkottiin BamHI:llä, käsiteltiin elektro-foreettisesti agaroosigeelillä ja vyöhykkeet visualisoitiin UV-valolla, kun geeli oli värjätty liuoksella, joka 30 sisälsi 5 ^ug/rnl etidiumbromidia. Havaittiin kolme in-serttiä, joiden pituudet olivat noin 6,6, 6,0 ja 1,8 ke. Geelissä oleva DNA siirrettiin nitroselluloosaan Maniatisin et ai. (supra, s. 383-386) kuvaamalla tavalla. Suodatti--j. men hybridisaatio 15-meerin kanssa ja autoradiografia teh- 35 tiin edellä kuvatulla tavalla. Autoradiografia osoitti, 33 86436 että 6,0 ke:n vyöhyke sisälsi AHF-geenifragmentin, joka hybridisoitui 15-meerikoettimen kanssa.

Siten oli ensimmäistä kertaa eristetty ja identifioitu osa sian AHFrää koodaavasta geenistä. Bakterio-5 fagi lambda-yhdistelmäklooni PB 34 on talletettu kokoelmaan the American Type Culture Collection 28.10.1983 numerolla ATCC 40087.

Esimerkki 4

Ihmisen AHF-geenin paikallistaminen 10 Maniatisin et ai. /Cell 15 (1978) 687'J kuvaamasta ihmisen genomikirjastosta etsitään ihmisen AHF-geeniä infektoimalla E. coli -kanta LE392 (yleisesti saatavil- 5 la) 6x10 pfu:lla ja siirrostamalla 15 cm:n NZCYM-agar- maljoille tiheydeksi 20 000 pfu/malja. Nämä fagit tutki- 15 taan käyttämällä Bentonin ja Davisin (supra) menettelyä koettimena esimerkissä 3 kuvattu 6,0 ke:n sian AHF-frag- 32 mentti, joka on leimattu P:llä nicktranslaatiomenetel-mällä. Fagi, joka antaa voimakkaan hybridisaatiosignaalin, poimitaan, siirrostetaan noin 100 pfu/10 cm:n malja ja 20 tutkitaan rinnakkaisnäytteinä edellä kuvatulla tavalla käyttämällä radionuklidileimattua 45-meeriä toisena koettimena ja 6,0 kb:n BamHI-fragmenttia PB34:stä toisena. Fagi, nimeltään HH25, joka hybridisoituu kumpaankin koet-timeen, identifioidaan, valmistetaan maljakantaviljel-25 mä ja valmistetaan pikavalmistus-DNA edellä kuvatulla tavalla. Fagi-DNA pilkotaan Sau3AI:llä, fosfataasikäsitel-lään vasikan alkalisella fosfataasilla, uutetaan fenolilla ja saostetaan rinnan BamHI-pilkotun M13 mp8-DNA:n (20 ng) kanssa. Saostunut DNA pelletoidaan sentrifugoi-30 maila ja liuotetaan takaisin 2 ^ul:aan ligaasipuskuria, joka sisältää T4-DNA-ligaasia. Ligaatiota tehdään kaksi minuuttia 16°C:ssa, laimennetaan 50 ^,ul:ksi ligaasipus-kurilla, joka sisältää T4-DNA-ligaasia ja inkuboidaan vielä kolme tuntia 16°C:ssa. 5 ^,ul:lla tätä reaktioseos-35 ta transformoidaan E. coli -kanta JM101/TG1 edellä esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

34 8 6 4 3 6

Plakit tutkitaan Bentonin ja Davisin menettelyllä käyttämällä koettimena radionuklidileimattua 15-meeriä. Fagiplakki, 25-S1, joka hybridisoituu, eristetään ja valmistetaan yksisäikeinen fagi-DNA käytettäväksi DNA-sek-5 ventointitemplaattina edellä kuvatulla tavalla. Sekven-tointi tehdään Sangerin et ai. (supra) kuvaamalla dideok-siketjuterminaatiomenetelmällä käyttämällä 15-meeriä aluk-keena, jolloin saadaan kuviossa 6 esitetty yksisäikeinen DNA-sekvenssi. 84 tällä tavalla sekventoitua nukleotidia 10 oli 85-%:isesti homologisia sian AHF:n homologisen alueen kanssa. Vain yhden aminohapon ero vallitsee myös kuviossa 1 esitetyn sian AHF:n 69 kd:n fragmentin alueen 2-16 ja kuviossa 6 esitetyn ihmisen nukleotidisekvenssin perusteella päätellyn vastaavan alueen välillä. Tämä korkea 15 homologia-aste osoittaa, että yhdistelmäfagin HH-25 DNA on alkuisin AHF-geenistä.

Täten on ensimmäisen kerran eristetty ja identifioitu ihmisen AHF-geenin eräs eksoni. Bakteriofagi lambda-yhdistelmä HH25 on talletettu kokoelmaan the 20 American Type Culture Collection 28.10.1983 numerolla ATCC 40086.

Esimerkki 5 AHF:ää aktiivisesti transkriboivien solujen identifiointi

Edellä kuvatut sian ja ihmisen AHF-eksonit ovat 25 käyttökelpoisia erilaisiin tarkoituksiin, joista yksi on seulontavälineenä, joka tekee mahdolliseksi identifioida : kudos, joka on AHF:n synteesikohta in vivo. Saatavana on joukko seulontamenetelmiä, jotka perustuvat eksonin käyttöön tarkkana komplementtina mRNAille, jota syntyy AHF:n 30 luonnollisen ilmentymisen aikana. Tutkimusmenettelyissä käsitellään elimistön eri osista peräisin olevaa kudosta siinä olevan mRNA:n vapauttamiseksi, joka mRNA sitten hyb-ridisoidaan AHF-eksonin sisältävän DNA:n kanssa ja jos mRNA-molekyyli hybridisoituu mainittuun eksoniin, on ku-35 dos, josta mainittu mRNA on peräisin, AHF:n lähde.

35 86436 1 . Seulontamenettely

Erilaisista elimistä, munuaiset, maksa, haima, perna, luuydin, imusolmukkeet jne. mukaan luettuina, saatu sian tai ihmisen kudos käsitellään Coxin /Methods Enzymol 5 12B (1968) 120/, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä, kuvaamalla guanidiinihydrokloridiuutolla, johon tehdään joitakin muunnoksia. Lyhyesti sanottuna kudos siirretään 8 M guanidiinihydrokloridiliuokseen /tai 4 M guanidiini-isotiosyanaattiin, jota ehdottavat Chirgwin et ai., 10 Biochemistry 18 (1979) 5294, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä, katso myös Maniatis et ai., supra, sivulta 189/, joka sisältää 50 mmol/1 Tris-puskuria (pH 7,5) ja 10 mmol/1 EDTA ja homogenisoidaan Omnimixer-laitteessa (Sorvali) huippunopeudella 1 minuutti. Homogenaatti kir-15 kastetaan sentrifugoimalla kierrosnopeudella 5 000 min viisi minuuttia Sorval HB-4 -roottorissa, ja RNA saoste-taan lisäämällä 0,5-kertainen tilavuus etanolia. RNA liuotetaan ja saostetaan vielä kolme kertaa 6 M guanidii-nihydrokloridistä ennen sen liuottamista veteen.

20 Tämän erän sisältämä lähetti-RNA rikastetaan käsit telemällä kromatografisesti oligo(dT)selluloosalla (Collaborative Research).

Tälle mRNA:lle tehdään sitten elektroforeesi aga-roosigeelissä, joka sisältää formaldehydiä, Maniatisin et 25 ai. (supra, s. 202-3) kuvaamalla tavalla. Geelissä oleva mRNA siirretään sitten nitroselluloosasuodattimeen (Maniatis et ai., supra, s. 203-4).

Siten saatu mRNA hybridisoidaan edellä kuvatulla tavalla saadun radionuklidileimatun sian tai ihmisen ek-30 soni-DNA:n kanssa ja hybridien esiintyminen detektoidaan autoradiografiällä. Radioaktiivinen signaali osoittaa, . - että mRNA:n kudoslähde on AHF-synteesin lähde elimistössä.

mRNA voidaan vaihtoehtoisesti seuloa käyttämällä S1-suojaus-"seulontamenetelmää.

35 S1-nukleaasi on entsyymi, joka hydrolysoi yksisäi- keistä DNA:ta, mutta ei emäspareja sisältäviä nukleotideja, 36 86436 kuten hybridisoitua mRNA/DNA:ta. Siten radioaktiivisen vyöhykkeen läsnäolo akryyliamidigeelielektroforeesin ja autoradiografiän jälkeen osoittaa, että AHF-eksonia vastaavan yksisäikeisen DNA:n on suojannut komplementaarinen 5 mRNA, ts. AHF:ää vastaava mRNA. Siten kudos, josta tämä mRNA oli peräisin, on AHF-synteesin tapahtumapaikka in vivo. Tätä kudosta voidaan käyttää AHF-mRNA:n lähteenä. Tämä tutkimusmenetelmä voi olla jonkin verran herkempi kuin edellä kuvattu tutkimusmenetelmä.

10 Koetin, joka koostuu mRNA:lle komplementaarisesta yksisäikeisestä, radionuklidileimatusta DNA:sta, syntetisoidaan käyttämällä M13:n universaalialuketta alukkeena sian genomin subkloonin DNA-synteesille 34-H1. Reaktio tehdään 100 ^ul:ssa liuosta, joka sisältää 50 mmol/1 Tris-15 puskuria (pH 7,4), 5 mmol/1 MgS^, 1 mmol/1 2-merkapto- etanolia, 50 mmol/1 NaCl, 40 -umol/l dGTP, dTTP, dCTP, 32 60 ^,uCi P-dATP (400 Ci/mmol) , 10 ng universaalialuketta, 200-400 ng 34-53-templataatti-DNA:ta ja DNA-polyme-raasi I Klenow-fragmenttia (E. coli). Reaktioseosta inku-20 boidaan 23°C:ssa 60 minuuttia, 10 minuuttia 70°C:ssa, lisätään 50 yksikköä PstI ja inkuboidaan vielä 60 minuuttia .

Reaktio päätetään uuttamalla fenoli-kloroformiseok-sella, lisätään NaCl pitoisuudeksi 0,2 mol/1 ja saoste-25 taan sitten kaksinkertaisella tilavuudella 100-%:ista etanolia. Saostunut DNA pelletoidaan sentrifugoimalla, : liuotetaan takaisin 20-%:iseen sakkaroosilluokseen, joka

sisältää 50 mmol/1 NaOH ja 0,1 % kresolivihreää ja käsi-tellään sitten elektroforeettisesti 2-%:isen agaroosin 30 läpi 50 raM NaOH-liuoksessa, joka sisältää 10 mmol/1 EDTA. Syntyvä yksisäikeinen fragmentti paikallistetaan autora-- · diografian avulla, vyöhyke otetaan irti ja eristetään DNA

tekemällä elektroeluutio dialyysiletkussa.

Näyte-mRNA preparoidaan maksasta, pernasta jne.

35 kudoksesta edellä kuvatulla guanidiinihydrokloridimene-: telmällä.

37 86436

Koetin hybridisoidaan sitten näyte-mRNA:hän (saatu oligo(dT)kromatografiarikastusvaiheesta) 50-%:isessa form-amidissa, joka sisältää 0,4 mol/1 NaCl, 40 mmol/1 PIPE /piperatsiini-N ,N ' -bis (2-etaanisulf onihappo)_7 (pH 6,5), 5 1 iranol/1 EDTA, 5-50 ^,ug mRNA ja 2 yUg leimattua DNA: ta, 15 yUl:n tilavuudessa. Hybridisaatio päätetään lisäämällä 200 yUl kylmää S1-nukleaasipuskuria /0,25 M NaCl, 0,3 M NaCH^COO (pH 4,5), 1 mM ZnSO^, 5 % glyserolia ja 1 000 yksikköä S1-nukleaasia/. Reaktioseosta inkuboidaan 45°C:ssa 10 30 minuuttia. Näytteet uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla hiivan tRNA-kantajän (10 ^ug) kanssa ja tehdään analyyttinen elektroforeesi 5-%:isillä polyakryyli-amidisekventointigeeleillä Maxam-Gilbertin /PNAS USA 74 ( 1977) 560_7 kuvaamalla tavalla.

15 Esimerkki 6 AHF-eksoni-DNA:n käyttö AHF-mRNA:n saamiseen kudoksesta

Kun mRNA-lähteenä oleva kudos on identifioitu, uutetaan tästä kudoksesta AHF-mRNA:ta ja käytetään sitä 20 cDNA-kirjaston muodostamiseen. cDNA-kirjastoa käytetään sitten AHF-aminohapposekvenssiä koodaavan täyspitkän cDNA-kloonin identifiointiin ja rakentamiseen, jossa cDNA:ssa ei ole genomikloonin sisältämiä introneita, kuten jäljempänä kuvataan. Sen jälkeen AHF-proteiinia koo-25 daava cDNA sijoitetaan sopivaan ilmentymisvektoriin AHF:n ilmentämiseksi sopivassa isännässä.

Koska ihmisen AHF:stä on suuri kysyntä hemofilian hoitoon ja muihin käyttötarkoituksiin, kuvataan ihmisen AHF-cDNA:n valmistusta.

30 1. Ihmisen AHF:ää vastaavan mRNA:n saaminen AHF-synteesistä vastaavasta ihmiskudoksesta preparoidaan mRNA Coxin kuvaamalla ja Chirgwinin muuntamalla guanidiinihydrokloridiuuttomenetelmällä edellä kuvatulla tavalla.

35 Oligo(dT)selluloosakromatografiakolonnista saatu mRNA fraktioidaan edelleen sedimentoimalla sakkaroosi- 38 8 6 4 3 6 gradienteilla 5 —> 20 %, jotka sisältävät 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,4), 1 mmol/1 EDTA ja 0,2 % SDS, sentri-fugoiden 24 tuntia kierrosnopeudella 22 000 min”^ Beckman SW28-roottorissa. Kerätään 1,0 ml:n fraktioita, lisätään 5 natriumasetaattia pitoisuudeksi 0,2 mol/1 ja saostetaan fraktiot kahdesti ennen liuottamista veteen. Fraktioidun RNA:n kokojakautuma määritetään tekemällä elektroforeesi 1,4-%:isilla agaroosigeeleillä, jotka sisältävät 2,2 mol/1 formaldehydiä.

10 mRNA, joka sedimentoituu S-arvolla (Svedberg-arvol la) , joka on suurempi kuin 28, yhdistetään kaksisäikeinen cDNA:n synteesiä varten. 10 ^,ug tätä RNA:ta denaturoidaan huoneen lämpötilassa 10 yul:ssa 10 mM metyylielohopea-hydroksidia. Lisätään 140 mM 2-merkaptoetanolia metyyli-15 elohopeahydroksidin inaktivoimiseksi. RNA laimennetaan sitten 50 ,ul:ksi liuoksella, joka sisältää 140 mmol/1 / KC1, 100 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,3 42 C:ssa), 1 mmol/1 ku takin deoksiribonukleotiditrifosfaattia, 200 ^ug/ml oli-go(dT) 12-18, 10 mmol/1 MgC^ ja 0,1 uCi "^P-dCTP/ml. Nämä 20 reaktiot tehdään 42°C:ssa yksi tunti sen jälkeen, kun on lisätty 3 ^ul AMV-käänteistranskriptaasiliuosta (17 yk-sikköä/^ul) (Life Sciences). Reaktio päätetään lisäämällä 0,25 M EDTA (pH 8,0) pitoisuudeksi 20 mmol/1. Saatu seos uutetaan kerran yhtä suurella tilavuudella fenoli-kloro-' . 25 formiseosta (1:1) ja sitten kerran kloroformilla. Näyte :· käsitellään sitten kromatografisesti 5 ml:n Sepharose : : CL-4B -kolonnilla (Pharmacia), joka on tasapainotettu j liuoksella, joka sisältää 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 3,00), . . 100 mmol/1 NaCl ja 1 mmol/1 EDTA. Kerätään huokostila- 30 vuus ja nukleiinihapot saostetaan lisäämällä 2,5-kertai-nen tilavuus etanolia.

Edellä mainittujen menettelyjen yhteydessä käyte-tään edullisesti myös AHF-eksonioligonukleotidisegmenttiä oligo-dTr:n sijasta käänteiskopiointialukkeena, kuten ·;- 35 Ullrich et ai. /Nature 303 (1983) 821_7 kuvaavat.

39 86436 RNA-cDNA-hybridit liuotetaan 35 ^ul:aan deionisoi- tua vettä, tehdään liuoksesta 100 inM kaliumkakodylaatin (pH 6,8), 100 ,.uM dCTP:n, 1 mM 2-merkaptoetanolin ja 1 mM / kobolttikloridin suhteen ja "muodostetaan hännät" entsy-5 maattisesti lisäämällä 10 yksikköä deoksitidyyliterminaa-litransferaasia (pH Biochemicals) ja inkuboimalla reak-tioseosta 30 sekuntia 37°C:ssa. Reaktio päätetään lisäämällä 0,25 M EDTA pitoisuudeksi 10 mmol/1. Lisätään Tris-HCl (pH 8,0) pitoisuudeksi 300 mmol/1 ja näyte uutetaan 10 kerran yhtä suurella tilavuudella fenoli-kloroformiseosta (1:1) ja sitten yhtä suurella tilavuudella kloroformia. Nukleiinihapot saostetaan tästä tuotteesta lisäämällä 2,5-kertainen tilavuus etanolia.

dC-häntäiset hybridimolekyylit anneloidaan sitten 15 seoksella, joka sisältää 170 ^ug/ml oligo(dG)14-18-sellu-loosaa, 10 mmol/1 KCl ja 1 mmol/1 EDTA, 10 minuuttia 43°C:ssa ja sitten vielä 10 minuuttia 23°C:ssa. Tämä reaktiotuote laimennetaan sitten 100 ul:ksi liuosta, jo- / ka sisältää 100 mmol/1 ammoniumsulfaattia, 1 mmol/1 20 2-merkaptoetanolia, 100 mmol/1 MgC^/ 100 ^ug/ml naudan seerumialbumiinia (Sigma, Cohn-fraktio V) ja 100 ^umol/1 nikotiiniamidiadeniinidinukleotidia. Toisen säikeen cDNA-synteesi aloitetaan lisäämällä 1 yksikkö RNaasia (P-L Biochemicals), 1 yksikkö E. coli -DNA-ligaasia ja 25 10 yksikköä DNA-polymeraasi I:tä ja inkuboidaan 16°C:ssa 12 tuntia.

Näyte käsitellään sitten kromatografisesti Sepha-rose CL-4B:llä edellä kuvatulla tavalla. Kaksisäikeinen DNA saostetaan etanolilla ja varustetaan dC-hännillä 30 RNA-cDNA-hybridin yhteydessä kuvatulla tavalla.

2. Ihmisen AHF-DNA:n etsiminen

Edellä kuvatulla tavalla saatu cD-häntäinen kaksisäikeinen cDNA anneloidaan yhtä suuren moolimäärän kanssa cG-häntäistä pBR322 (New England Nuclear) 10 mM Tris-35 HCl:ssä (pH 8,0), joka sisältää 10 mmol/1 EDTA ja 100 mmol/1 NaCl, 37°C:ssa kaksi tuntia. Anneloituja kimeerisiä 4o 86436 molekyylejä säilytetään sitten pakastettuina -20°C:ssa, kunnes ne käytetään bakteerien transformointiin.

Bakteerien transformointi tehdään käyttämällä E. coli -kantaa MC1061. Soluja (50 ml) kasvatetaan optiseen 5 tiheyteen 0,25 aallonpituudella 600 nm mitattuna. Solut -1 väkevöidään sentrifugoimalla kierrosnopeudella 2 500 min 12 minuuttia, pestään 10 ml :11a steriiliä 100 mM CaC^-liuosta ja pelletoidaan uudelleen sentrifugoimalla edellä kuvatulla tavalla. Solut suspendoidaan takaisin 2 ml:aan 10 steriiliä 100 mM CaC^-liuosta ja annetaan seistä 4°C:ssa 12 tuntia. Anneloituja kimeerisiä molekyylejä inkuboidaan suhteessa 5 ng kaksisäikeistä cDNA:ta/200 yUl kompetentteja soluja 4°C:ssa 30 minuuttia. Sitten bakteereja lämpö-käsitellään kaksi minuuttia 42°C:ssa. Sitten lisätään 15 1,0 ml L-lientä, ja soluja inkuboidaan yksi tunti 37°C:ssa.

Solut siirrostetaan sitten LB-agarmaljoille, jotka sisältävät 5 ^,ug/ml tetrasykliiniä.

Ihmisen AHF-kloonit identifioidaan käyttämällä Grunsteinin ja Hognessin /PNAS USA 72 (1975) 3961), joka 20 julkaisu mainitaan tässä viitteenä, pesäkehybridisaatio-menettelyä. cDNA-kirjasto siirrostetaan nitroselluloosa-suodattimelle (Schleicher and Schuell), joka on L-liemi-agarmaljalla, joka sisältää 5 ,ug/ml tetrasykliiniä. Pe-säkkeitä kasvatetaan yön yli 37 C:ssa ja sitten suodatin 25 asetetaan steriilille Whatman 3 M -paperille. Esikostu-tettu nitroselluloosasuodatin painetaan sitten vasten originaalisuodatinta ja suodattimet kiinnitetään neulalla (nro 18). Repiikäsuodatinta kasvatetaan sitten LB-tet-rasykliinimaljalla 37°C:ssa, kunnes pesäkkeiden läpimitta 30 on 1-2 mm. Sitten suodattimet siirretään LB-maljoille, jotka sisältävät 150 ^.ug/rnl kloramfenikolia ja inkuboidaan 37°C:ssa 16-24 tuntia.

Suodattimet siirretään sitten pois ja sijoitetaan Whatman 3 M -paperille, joka on kyllästetty 0,5 M NaOH:lla, 35 viideksi minuutiksi huoneen lämpötilassa. Suodattimet neutraloidaan sitten asettamalla ne Whatman 3 M -paperille, 41 86436 joka on kyllästetty 1 M Tris-HCl:lla (pH 7,5) , joka sisältää 1,5 mol/r NaCl ja sitten Whatman 3 M -paperille joka on kyllästetty 2 x SSCtllä (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitraatti).

5 Suodattimet kuivataan ilmassa ja pidetään alipai neessa 80°C:ssa kaksi tuntia. Suodattimien esihybridi-saatio tehdään 65°C:ssa 30 minuuttia 10 mM Tris-HCl:ssa (pH 8,0), joka sisältää 1 mmol/1 EDTA ja 0,1 % SDS:ää ja sitten 30 minuuttia liuoksessa, jossa on 7 x SSC, 5 x 10 Denhardt's (1 x Denhardt's = 0,02 % polyvinyylipyrrolido-nia, 0,02 % fikollia ja 0,02 % naudan seerumialbumiinia), 100 ,ug/ml denaturoitua lohenmaiti-DNA:ta ja 0,1 % SDS.

' 32

Lisätään edellä kuvatulla tavalla valmistettua P-lei- g mattua ihmisen eksoni-DNA:ta pitoisuudeksi 10 cpm/ml ja 15 hybridisoidaan 12-16 tuntia 37°C:ssa. Suodattimia pestään sitten 7 x SSC:llä, joka sisältää 0,1 % SDS, 1-2 tuntia vaihtaen liuosta useaan kertaan 37°C:ssa. Suodattimet kuivataan sitten ilmassa ja niille tehdään autoradiografia Kodak XAR-filmiä ja DuPont Lighting Plus -kuvanvahvistus-20 levyä käyttäen.

Pesäkkeitä, jotka antavat taustaa voimakkaamman hybridisaatiosignaalin, kasvatetaan L-liemessä, joka sisältää 50 ^ug/ml tetrasykliiniä plasmidi-DNA:n pikapuhdis-tusta varten. Plasmidi-DNA puhdistetaan Holmesin et ai.

25 /Anal. Biochem. 114 (1981) 193/, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä, menetelmällä. Annos tätä DNA:ta pilkotaan restriktioendonukleaasilla PstI ja fragmentit käsitellään elektroforeettisesti 1-%:isillä agaroosi/TBE-gee-leillä ja muodostetaan täplät E. Southernin /J. Mol. Biol. 30 98 (1975) 503, Methods Enzymol, 69 (1980) 152/, jotka julkaisut mainitaan tässä viitteenä, menetelmän mukaisesti. Nitroselluloosasuodattimet hybridisoidaan radionukli-dileimatun ihmisen AHF-eksoni-DNA:n kanssa pesäkehybridi-saation yhteydessä kuvatulla tavalla. Plasmidit, jotka : 35 sisälsivät AHF-eksoni-DNA:n kanssa hybridisoituvia Pstl- inserttejä, käytetään DNA-sekvenssianalyysiin.

42 86436

Sekventointia varten plasmidi-DNA (puhdistettu 0,75 ml:sta viljelmää Holmesin et ai., supra, menetelmällä) pilkotaan täydellisesti restriktioendonukleaasilla Sau3al. Saatavalla DNA-segmentillä, joka identifioidaan 5 34-Sl:ksi, on kuviossa 4 esitetty DNA-sekvenssi. DNA saostctaan etanolilla fenoli-kloroformiuuton jälkeen ja liuotetaan takaisin 10 ^ulraan TE:tä (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM EDTA). 5 ^ul DNA-liuosta ja 20 ng BamHI-pil-kottua M13 mp 9:n replikatiivisen muodon DNA:ta ligatoi-10 daan 100 ^ulissa 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), joka sisältää 10 mmol(l ditiotreitolia, 1 mmol/1 ATP:tä ja ylimäärin T4-DNA-ligaasia. Ligaatiot tehdään 15°C:ssa 2-4.

5 ^ulilla ligaatioreaktioseoksia transformoidaan 200 yul E. coli -kantaa JM101/TG1 edellä kuvatulla taval-15 la. Yhdistelmät identifioidaan valkeina täplinä, kun kasvatus tehdään LB-agarmaljoilla, jotka sisältävät X-gal:ia beta-galaktosidaasiaktiivisuuden indikoijana, Davisin et ai. /J. Mol. Biol. 36 (1968) 4137 kuvaamalla tavalla.

Yhdistelmätagissa olevat jaksot, jotka hybridisoi-20 tuvat ihmisen eksoniin, identifioidaan Bentonin et ai. /"Science 196 (1977) 1807/ joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä, menetelmällä käyttämällä radionuklidileimattua ihmisen AHF-eksonia koettimena. Hybridisaatiosignaalin antavat plakit poimitaan ja niitä viljellään 1,5 ml:n L-lie-25 miviljelminä. Näistä viljelmistä preparoitua yksisäikeis-'·* tä fagi-DNA:ta käytetään templaattina DNA-synteesireak- tioissa, joissa alukkeena toimii oligonukleotidi. Sekven-tointi tehdään käyttämällä dideoksiketjuterminaatiomene-telmää, katso esimerkiksi Sanger et ai., PNAS USA 74 30 (1977) 5463.

Ihmisen AHF-yhdistelmät identifioidaan vertaamalla niiden nukleotidisekvenssiä siihen, mitä tiedetään ihmisen AHF:ää koodaavasta eksonijaksosta.

3. Sian AHF-mRNA

35 Ihmisen AHF-yhdistelmiä käytetään tutkittaessa sian kudoskirjasto, joka on muodostettu täsmälleen samalla 43 86436 tavalla kuin ihmisen kudos-cDNA-kirjasto. Mahdolliset sian AHF-yhdistelmä-DNA-kloonit identifioidaan Grunstein- 32

Hogness-menettelyllä käyttämällä sian P-leimattua ekso- nifragmenttia koettimena edellä kuvatulla tavalla. Koetin 32 5 on sian AHF-eksonisegmentti, joka on leimattu P:llä nick-translaatiomenetelmällä, jota kuvaavat Rigby et ai. /J.

Mol. Biol. 113 (1977) 237y» joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä.

Hybridaatiosignaaleja antavia pesäkkeitä kasvatetaan 10 plasmidin pikapuhdistusta varten edellä kuvatulla tavalla.

Plasmidi-DNA pilkotaan restriktioendonukleaasilla Pst1, käsitellään elektroforeettisesti 1-%:isillä agaroosi/TBE- geeleillä ja muodostetaan täplät E. Southernin (1975) me- 32 netelmällä. Täplät hybridisoidaan P:llä leimatun, nick-15 translaatiokäsitellyn sian AHF-yhdistelmäDNA:n kanssa.

Täyspitkät kloonit voidaan rakentaa tavanomaisella tavalla, kuten ligatoimalla osittain päällekkäisten kloonien DNA-fragmentit kummallekin kloonille yhteisistä restriktioentsyymikohdista, kuten alalla on tunnettua 20 ("geenivaellus").

4. Vaiheesta 2 tai 3 saatujen täyspitkien kloonien identifiointi

Olemassa olevan kloonin 5'-pään ja mRNA:n 5'-pään välinen etäisyys voidaan määrittää Agarwalin et ai.

25 P'j.b.C." 256(2) (1981) 1023-10287 kuvaamalla alukelaa-jennusmenetelmällä, jossa käytetään hyväksi oligonukleo-tidialuketta, jonka jakso on alkuisin olemassa olevan AHF-kloonin 5'-alueelta (aminoterminaaliselta alueelta).

Jos tällä menettelyllä kehitetyissä geeleissä näkyy useam-30 pia kuin yksi transkriptiotuote, tulisi intensiivisintä vyöhykettä pitää täydellistä mRNA-transkriptiä edustavana.

On kuitenkin olemassa monia mRNA:ita, jotka sisältävät pitkän alueen 5'-pään sekvenssiä, jolle ei tehdä 35 luentaa. Siten ihmisen AHF-DNA:n ilmentyminen ei ehkä ole "... riippuvainen täydellisen cDNA-kloonin saamisesta. Voidaan 44 86436 esimerkiksi saada klooni, jossa DNA-sekventoinnin perusteella esiintyy metioniinikodoni, jota seuraa jakso, joka on analoginen tai identtinen tunnetun eukaryoottisen proteiinierityssignaalin kanssa ja joka on kehyksessä mui-5 den kodonien kanssa. Transformointi ja ilmentäminen tulisi tehdä kloonilla, joka sisältää met-erityssignaalijakson, joka on odotettua kokoa ja sisältää poly(T)-3'-pään.

5. Vaihtoehtoinen menttelytapa

Vaihtoehtona edellä kuvatuissa kohdissa 1-3 esite-10 tyille menetelmille on edullista identifioida sian ja ihmisen AHF:ää vastaavat cDNA-kloonit käyttämällä bakterio-fagivektoria seuraavalla tavalla.

Ihmissikiön maksakudoksesta, jossa AHF-synteesi tapahtuu, saatu mRNA preparoitiin Coxin kuvaamalla ja 15 chirwinin muuntamalla guanidiinihydrokloridimenetelmällä esimerkin 5 kohdassa 1 esitetyllä tavalla. Ensimmäinen säie cDNA:sta syntetisoitiin 10 ^ug:sta polyA+-sikiönmak-sa-RNA:ta esimerkissä 6, kohdassa 1 (supra) kuvatulla menettelyllä. Tarkemmin ilmaistuna 10 ^,ug tätä RNA: ta dena-20 turoitiin huoneen lämpötilassa 10 ^ulissa 10 mM metyyli-elohopeahydroksidia. Lisättiin 140 mM 2-merkaptoetanolia metyylielohopeahydroksidin inaktivoimiseksi. RNA laimennettiin 50 yuliksi liuosta, joka sisälsi 140 mmol/1 KC1, 100 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,3 42°C:ssa), 1 mmol/1 kutakin 25 deoksinukleotiditrifosfaattia, 200 ,ug/ml oligo(dT)12-18, '. 32 10 mmol/1 MgCl2 ja 0,1 ^uCi P-dCTP:tä/ml. Näiden reaktioiden annettiin jatkua yksi tunti 42°C:ssa, kun oli lisätty 3 ^ul AMV-käänteistranskriptaasia (17 yksikköä/ml) (Life Sciences).

30 Alukkeella laajennetun kirjaston ensimmäisen säi keen synteesiä varten sisällytettiin 200 pikomoolia ainutlaatuista komplementaarista 38-meeriä CH^HgOH-vaiheeseen, ja kun seosta oli pidetty 10 minuuttia 23°C:ssa, lisättiin siihen beta-merkaptoetanolia pitoisuudeksi 140 mmol/1, 35 KC1 0,7 mol/1, EDTA 1 mmol/1, Tris-HCl 20 mmol/1 (pH 8,3 . / 4 2°C:ssa) ja RNaasia (Biotec) 1 yksikkö/^,ul ja inkuboitiin 45 86436 50°C:ssa kaksi minuuttia ja 42°C:ssa kaksi minuuttia. Tämä seos laimennettiin sitten 50 ^ulrksi seosta, joka sisälsi 140 mmol/1 KC1, 100 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,3 42° C:ssa), 1 mmol/1 kutakin deoksinukleotiditrifosfaattia, 5 10 mmol/1 MgCl2 ja 0,1 ^uCi 33P-dCTP:tä/^ul. Reaktio- seosta inkuboitiin 42°C:ssa yksi tunti, kun oli lisätty 3 yUl AMV-käänteistranskriptaasia (17 yksikköä/^,ul) .

Ensimmäisen säikeen synteesin jälkeen reaktioseok-set laimennettiin 150 ^uliksi seosta, joka sisälsi 10 10 mmol/1 MgCl2, 50 mmol/1 Tris (pH 7,4), 5 mmol/1 2-merkap-toetanolia, 7,5 mmol/1 NH4SO^ ja 250 yum/1 kutakin deoksinukleotiditrifosfaattia ja initioitiin toisen säikeen synteesi lisäämällä 1 yksikkö RNaasia H:ta (E. coli) ja 45 yksikköä DNA-polymeraasi I. Reaktioseoksia inkuboitiin 15 16°C:ssa kahdeksan tuntia, päätettiin rektiot lisäämällä EDTA pitoisuudeksi 20 mmol/1 ja täytettiin lopputilavuu-teen 200 yUl vedellä. EcoRI-metylointi tehtiin sitten lisäämällä S-adenosyylimetioniinia pitoisuudeksi 50 yumol/l ja 40 yksikköä EcoRI-metylaasia. Näitä reaktioseoksia in-20 kuboitiin yksi tunti 37°C:ssa, reaktiot päätettiin uuttamalla fenolilla ja kloroformilla ja seokset käsiteltiin kromatografisesti käyttämällä Sephade>^G50, joka oli tasapainotettu liuoksella, joka sisälsi 10 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmol/1 EDTA ja 0,1 mol/1 NaCl. Huokostilavuus 25 kerättiin yhteen ja saostettiin lisäämällä etanolia.

cDNA-molekyylit tehtiin tylppäpäisiksi seoksessa (200 yul), joka sisälsi 50 mmol/1 Tris (pH 8,3), 10 mmol/1 MgCl2, 10 mmol/1 2-merkaptoetanolia, 50 mmol/1 NaCl, 50 ^umol/1 kutakin deoksinukleotiditrifosfaattia, 100 30 ^ug/ml ovalbumiinia ja viisi yksikköä T4-polymeraasia.

Reaktioseosta inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia ja päätettiin sitten reaktio fenoli-kloroformiuutolla. Nukleiinihapot saostettiin sitten lisäämällä etanolia.

EcoRI-"kytkijät" (Collaborative Research) ligatoi-35 tiin sitten tylppäpäisiin cDNA-molekyyleihin tavanomaisis-' / sa olosuhteissa (Maniatis et ai., supra, s. 243) 46 86436 kokonaistilavuudessa 45 ^ul. Reaktiot päätettiin lisäämällä EDTA pitoisuudeksi 15 mmol/1 ja uutettiin fenolilla ja kloroformilla. Nukleiinihapot saostettiin etanolilla ja pelletoitiin sentrifugoimalla. Kytkijöillä varustettu cDNA 5 liuotettiin uudelleen 200 ^ul:aan liuosta, joka sisälsi 100 ^umol/1 Tris-HCl (pH 7,2) ja 5 mmol/1 MgCl2c 50 mmol/1 NaCl ja pilkottiin 300 yksiköllä EcoRI kaksi tuntia 37°C:ssa. Reaktioseos uutettiin sitten fenolilla ja kloroformilla ja käsiteltiin kromatografisesti Sepharose CL-10 4B:llä, joka oli tasapainotettu 10 mM Trisrllä (pH 8,0), joka sisälsi 1 mmol/1 EDTA ja 0,1 mol/1 NaCl. Huokostila-vuudessa oleva cDNA kerättiin, saostettiin etanolilla ja pelletoitiin sentrifugoimalla.

cDNA liuotettiin uudelleen 10 mM Tris.HCltiin (pH 15 8,0), joka sisälsi 1 mmol/1 EDTA ja ligatoitiin EcoRI-pil- kottuun, fosfataasikäsiteltyyn lambda Charon 21A -DNArhan erilaisissa cDNA/vektori-DNA-suhteissa käyttämällä tavanomaisia ligaatio-olosuhteita. Ligatoitu DNA pakattiin ja määritettiin tiitteri käyttämällä vakiintuneita menette- 20 lyjä (Maniatis et ai., supra, s. 64, 256). Kirjastot siir- 32 rostettiin maljalle ja tutkittiin käyttämällä P-leimat-tua ihmisen eksoni-DNA:ta olosuhteissa, joita kuvaavat Benton ja Davis (supra). Saatiin osittain päällekkäisiä klooneja, jotka ulottuivat noin 10 000 emäsparin yli ja 25 huomattava osa niistä sekventoitiin ja osoitettiin yhdeksi pitkäksi, ihmisen AHF:ää koodaavaksi, avoimeksi kehykseksi. Siitä saatu, ihmisen AHF:ää koodaava yhdistelmä-DNA-nukleotidijakso sekä päätelty ihmisen AHF-sekvenssi esitetään kuviossa 7. Osittain päällekkäiset kloonit si-30 joitettiin vektoriin pSP64 (Promega Biotec) käyttämällä alalla hyvin tunnettuja tavanomaisia menetelmiä, ts. li-: gatoimalla osittain päällekkäisistä klooneista saatavia .DNA-fragmentteja kummallekin kloonille yhteisistä restrik-tioentsyymikohdista. pSP64-yhdistelmäklooni, joka sisältää 35 kuviossa 7 esitetyn nukleotidijakson, ja jolle on annettu 47 86436 nimi pSP64-VIII, on talletettu the American Type Culture Collectioniin 23.8.1984 numerolla ATCC 39812.

Esimerkki 7

Ihmisen tai sian AHF:n ilmentäminen 5 Tämä esimerkki käsittelee ihmisen AHF:n ilmentämis tä käyttämällä täyspitkää, esimerkin 6 mukaisesti saatua, kloonia kotransformaatiosysteemissä.

1. Transformointivektorin valmistus

Seuraavassa kuvataan suoraa menetelmää AHF-trans- 10 formointivektorin saamiseksi. Plasmidi pCVSVL pilkotaan osittain Pstl:llä ja pilkkomistuote erotetaan geelielektro-foreesilla. Näkyväksi tekemisen jälkeen täyspitkää plasmi-dia vastaava lineaarinen DNA-fragmentti-vyöhyke eristetään pCVSVL-ΒΙ:nä.

15 cDNA, joka koodaa AHF:ää, eristetään esimerkin 5 kloonausvektoreista pilkkomalla osittain Pstlrllä. Osit-taispilkkomistuote erotetaan geelielektroforeesilla ja vyöhyke, joka vastaa täyspitkän cDNA:n molekyylipainoa, eristetään. pCVSVL-B1 anneloidaan tämän DNA-fragmentin 20 kanssa, ligatoidaan T4-ligaasilla 15°C:ssa, transfektoi-daan E. coli -kantaan HB101 ja valikoidaan transformantit tetrasykliiniresistenssin perusteella. Valittuja E. coli -transformantteja kasvatetaan tetrasykliinin läsnä ollessa. Plasmidi pCVSVL-B.la otetaan talteen tavanomaisesti.

25 cDNA:n oikea orientoituminen plasmidissa voidaan määrittää tavanomaisesti tekemällä asymmetrinen pilkkominen yhdellä tai useammalla sopivalla endonukleaasilla.

2. Kotransformaatio; valikointi ja amplifikaatio

Plasmidi pCVSVL-Ala tai pCVSVL-Bla ja plasmidi 30 pAdD26SVpA# 3 (Kaufman et ai., op. cit.) sekoitetaan keskenään (50 ^ug HP:tä ja 0,5 ^,ug pAdD265pA# 3) ja saoste-taan lisäämällä NaOAc (pH 4,5) pitoisuudeksi 0,3 M ja 2,5-kertainen tilavuus etanolia. Saostuneen DNA:n annetaan kuivua ilmassa, suspendoidaan takaisin 2 x HEBSSrään 35 (0,5 ml) ja sekoitetaan voimakkaasti 0,25 M CaC^^n kans sa (0,5 ml) Kaufman et ai. (op. cit.) kuvaamalla tavalla.

48 86436

Kalsium-fosfaatti-DNA:n annetaan seistä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja lisätään CHO DUKX-B1 -soluihin (Chasin ja Urlaub, 1980, saatavana Columbia Universitystä). Näiden solujen kasvatusta ja ylläpitoa on kuvattu kirjallisuudes-5 sa (Kaufman et ai., op. cit.; Chasin ja Urlaub 1980).

5 DUKX-B1-soluja siirrostetaan tiheydeksi 5 x 10 / 10 cm:n malja 24 tuntia ennen transfektointia. Kun on in-kuboitu 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, lisätään 5 ml alustaa, joka sisältää 10 % naudan sikiöseerumia ja soluja 10 inkuboidaan 37°C:ssa 4,5 tuntia. Sitten tämä alusta poistetaan yksisolukerrokselta ja lisätään 2 ml alustaa, joka sisältää 10 % naudan sikiöseerumia, 10 ^ug/ml tymidiiniä, adenosiinia ja deoksiadenosiinia ja penisilliiniä ja streptomysiiniä. Kahden vuorokauden kuluttua soluja siir-15 rostetaan suhteessa 1:15 alustaan, joka sisältää 10 % di-alysoitua naudan sikiöseerumia ja penisilliiniä ja streptomysiiniä, mutta josta puuttuvat nukleotidit. Solut ruokitaan sitten uudelleen samalla alustalla 4-5 vuorokauden kuluttua.

20 Pesäkkeet ilmestyvät 10-12 päivän kuluttua siirros- tamisesta selektiiviseen alustaan. Metotreksaatti(MTX)-valikointi, AHF-geenin detektointi ja valikointigeenin amp-lifikaatio tehdään Axelin et ai. (US-patenttijulkaisu 4 399 216) tai Kaufmanin et ai. (op. cit.) mukaan.

25 AHF-saantoja voidaan parantaa kotransformoimalla pysyvä solulinja EA.hy 926 /Edgell et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. 80 (1983) 3734-37377 DUKX-B1-solujen sijasta. Tässä tapauksessa tulisi kotransformointivalikointigee-nin olla dominoiva DHFR-geeni, jota kuvaavat Haber et ai.

30 /Somatic Cell Genetics 4 (1982) 499-5087· Kotransformaa-tio ja viljely tapahtuvat muuten suurin piirtein tässä hakemuksessa toisaalla kuvatulla tavalla.

3. AHF:n tuottaminen AHF:ää tuottavia CHO-1 transformantteja, jotka vali-35 koitiin kohdassa 2, pidetään yllä siemenviljelmässä tavanomaisin menetelmin. Viljelmä kasvatetaan 10 l:ksi 49 86 436 viljelemällä soluja tavanomaisessa alustassa. Tämän alustan ei tarvitse sisältää MTX:ää eikä se sisällä nukleosi-deja valikointigeenitaantumien poissulkemiseksi.

Viljelmäsupernatantin hyydytysaktiivisuutta seura-5 taan tavanomaisilla kokeilla, jotka on tarkoitettu veri-plasmanäytteille käytettäviksi (hyytymisajan lyheneminen plasmalla, jossa on tekijä VIII:n vajaus). Supernatantti voidaan puhdistaa tavanomaisin menetelmin, kuten saota-malla polyetyleeniglykolilla ja glysiinillä (jotka ovat 10 tunnettuja menetelmiä käytettäviksi veriplasmasta saadun AHF:n puhdistamiseksi), tekijä VIII -kokeiden herkkyyden parantamiseksi.

Kun tekijä VIII -aktiivisuus on saavuttanut huippuarvon, solut erotetaan viljelyalustasta sentrifugoimal-15 la. Sitten otetaan talteen tekijä VIII ja puhdistetaan se seostamalla polyetyleeniglykolilla ja glysiinillä. Hyydytysaktiivisuus osoitetaan plasmassa, jossa on tekijä VIII -vajaus.

4. Vaihtoehtoinen menettelytapa AHF:n tuottamisek-20 si

Koko AHFrää koodaavan alueen sisältävä täyspitkä cDNA muodostettiin edellä kuvatussa HH-25:ssä olevasta eksonista, kahdesta cDNA-kloonista, jotka ulottuivat mainitun eksonin 5'- ja 3'-päätealueiden yli ja kolmannesta 25 kloonista, joka ulottui 3'-cDNA-kloonin päälle ja jatkui yli lopetuskodonin. Tämä jakso muodostettiin sellaiseksi, että synteettiset Sali-kohdat tulivat sijoitetuiksi heti initiaattorimetioniinin 5'-puolelle ja asemaan, joka oli AHF-koodausjaksojen päässä olevan translaation lopetus-30 signaalin 3'-puolella. Tämä teki mahdolliseksi sijoitta misen pSP64:n sali-kohtaan ja irrottamisen tästä kohdas-ta. Tästä kloonista (pSP64-VIII) saatu Sali-fragmentti puhdistettiin ja ligatoitiin pCVSVL2:een. pCVSVL2 on plasmidi, joka muuten on identtinen ilmentymisvektorin 35 pCVSVL kanssa [Kaufman, et ai., Mol. Cell Biol. 2 (1982) so 8 6 4 36 1304, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä], mutta siitä puuttuu Pstl-kohta, joka sijaitsee tavanomaisin menettelyin aikaansaadun telyin aikaansaadun SV40-polyade-nylaatiojakson 3'-puolella ja se sisältää SV40:n Avall-5 "D"-fragmentin kahdentuman adenoviruksen myöhäisen pää- promoottorin (MLP, major late promoter) jälkeen. pCVSVL2 saatiin pAdD26SVpA(1):stä (katso Kaufman et ai., supra) lisäämällä Xhol-kytkijät kummankin SV40:n Avail-"D"-fragmentin molempiin päihin ja sijoittamalla mainitut 10 fragmentit pAdD26SVpA(1):een Xhol-kohtaan. AvaII-"D" fragmentit sijoitetaan molemmat sillä tavalla, että SV40:n myöhäinen promoottori on samoin orientoituneena kuin Ad2:n myöhäinen promoottori. Plasmideja pCVSVL ja pAdD26SVpA(3) kuvaavat Kaufman et ai. (supra). pSP64-15 VIII:n Sali-fragmentin sijoittamiseksi pCVSVL2:een muutettiin pCVSVL2:n ainutkertainen Pstl-kohta Sali-kohdaksi Rothsteinin et ai.[Methods Enzym. 69 (1980) 98] kuvaamalla tavalla ja sijoitettiin pSP64-VIll:sta saatu Sali fragmentti, jolloin saatiin pCVSVL2-VIII. pCVSVL2-VIIl 20 sisältää oikean 5'—>3'-orientaation, joka tekee mahdolliseksi AHF:ää koodaavien jaksojen kopioimisen vektorin adenovirus-MLP:stä. pCVSVL2-VIII on talletettu the American Type Culture Collectioniin 23.8.1984 numerolla ATCC 39813.

25 pCVSVL2-VIII vietiin apinan C0S-7-soluihin [Mellon et ai., Cell 27 (1981) 279] käyttämällä DEAE-dektraani transfektointiohjelmaa, jota kuvaavat Sampayrac ja Danna [PNAS USA 78 (1981) 7575]. Soluja viljeltiin seerumiva-paassa alustassa, josta tutkittiin AHF-aktiivisuus kolmen 30 päivän kuluttua transfektoinnista.

Tekijä VIII:C-aktiivisuus määritettiin kokeella, jossa käytettiin kromogeenista substraattia ja jota kuvaa Didisheim [Science 129 (1959) 389], mikä vahvisti sen, että oli saavutettu ihmisen tekijä VIIl:C:n ilmentyminen 35 tasolla noin 0,05 yksikköä/ml.

Claims (6)

1. Yhdistelmävektori, joka sisältää ihmisen tekijää VIII:C koodaavaa DNA:ta, tunnettu siitä, 5 että se sisältää polydeoksiribonukleotidin, jolla on sekvenssi : 5'CGC AGC TTT CAG AAG AAA ACA CGA CAC TAT TTT ATT GCT GCA GTG GAG AGG 3' 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että mainittu DNA on ihmisen genomi-DNA:ta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmävekto- 15 ri, tunnettu siitä, että ihmisen tekijää VIII:C koodaava DNA on liitetty heterologiseen DNArhan.

4. Yhdistelmä-DNA-ekspressiovektori, joka mahdollistaa ihmisen tekijän VIII:C ekspression, tunnet-t u siitä, että se sisältää DNA-segmentin, jolla on se- 20 kvenssi: 5’CGC AGC TTT CAG AAG AAA ACA CGA CAC TAT TTT ATT GCT GCA GTG GAG AGG 3’ 25 ja joka on toiminnallisesti liitetty heterologiseen säätelysekvenssiin.

5. Seulontaväline deoksiribonukleotidisekvenssien ja ribonukleotidisekvenssien tunnistamiseksi, jotka sekvenssit koodaavat ainakin osaa ihmisen tekijää VIII:C:tä, 30 tunnettu siitä, että se olennaisena osana sisäl tää deoksiribonukleotidin, jolla on sekvenssi 5’TTT CAG AAG AGA ACC CGA CAC TAT TTC ATT GCT GCG GTG GAG CAG CTC TGG GAT -· i 35 TAC GGG ATG AGC GAA TCC CCC CGG GCG CTA AGA AAC AGG 3' 52 8 6 4 3 6 tai tämän käänteinen komplementtisekvenssi.

6. Menetelmä tekijän VIII:C prokoagulanttiaktiivi-suutta omaavan proteiinin valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että 5 (1) viljellään eukaryoottisolua, joka on transfor moitu kaksisäikeisellä DNA:11a, joka (a) on toiminnallisesti liitetty heterologiseen säätelysekvenssiin, (b) hybridisoituu stringent-olosuhteissa seuraavaa n nukleo-tidisekvenssiin: 10 5'GAC ATT TAT GAT GAG GAT GAA ATT CAG AGC CCC CGC AGC TTT CAG AAG AAA ACA CGA CAC TAT TTT ATT GCT GCA GTG GAG AGG 15 ja (c) koodaa proteiinia, joka ekspressoituneena omaa ihmisen tekijän VIII:C prokoagulanttiaktiivisutta, ja (2) otetaan mainittu proteiini talteen viljelmästä. 53 86436