JPH02227078A - ファクター８および関連生産物の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発皿Ω皇１ 本発明は、ヒトファクター■；Ｃの細胞生産をコードす
る組換えデオキシリボ核酸（Ｄ　Ｎ　Ａ）およびブタフ
ァクターＶＩ：ＣをコードするＤＮＡの製造、ファクタ
ー■：ＣをコードするＤＮＡ分子を得る方法、そのよう
なりＮＡを使用するヒトおよびブタファクター■：Ｃの
発現、それにそのようなりローンを得るために、そして
ヒトファクター■：Ｃの発現を達成するために使用され
るデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを
含む新規化合物に関する。本発明はまた、組換えＤＮＡ
技術によるヒトＡＨＦおよ鴛その製造に関する。

ファクター■：Ｃは血友病Ａに欠乏または存在しない血
漿タンパクである。この病気は、男性約２０．０００人
中１人がかかる遺伝性出血病である。ファクター■：Ｃ
はまた、ファクター■、抗血友病因子（ＡＨＦ）、抗血
友病グロブリン（ＡＨＧ）、血友病ファクターＡ、血小
板助因子、トロンボプラスチノジエン、トロンボサイト
リシンとしても知られ、そしてそのように呼ばれている
。

それが凝血活性に影響する化合物であることを指示する
ために、“ファクター■：Ｃ”と呼ばれる。

ここで使用するように、“ファクター■：Ｃ゛とＡＨＦ
”とは同義語である。

血漿からのＡＨＦの単離は文献に記載されているけれど
も、ＡＨＦの詳細な構造は、一部は純粋な材料の十分な
量の入手不能性と、そして多数の夾雑物および精製剤の
タンパク分解性のため、これまで同定されていない。不
純なＡＨＦのいくらかの量は新しい冷凍ヒト血漿から処
理した濃縮製剤として提供されているが、ヒト血漿中の
ＡＨＦの極めて低い濃度と、そしてヒト血漿の入手およ
び処理の高いコストが、血友病の広範な治療に対してこ
の物質のコストを禁止的にしている。

本発明は、組換えＤＮＡ技術の使用によりヒトＡＨＦの
製造を可能にする。

ＡＨＦは、他のタンパクと同様に、特定の配列に並んだ
２０種あまりの異なるアミノ酸からなっている。遺伝子
操作技術を使用し、ヒ）ＡＨＦタンパクをコードする遺
伝子を同定し、そしてクローニングし、該遺伝子を組換
えＤＮＡベクター中へ挿入し、適当な宿主を該遺伝子を
含む該ベクターで形質転換し、そのような宿主中にヒト
ＡＨＦ遺伝子を発現させ、そしてそれによって生産され
たヒト、ＡＨＦを採取することにより、ＡＨＦの生産を
可能とする方法が開発された。同様に、本発明は、組換
えＤＮＡ技術によってブタＡＨＦの製造、そしてそのよ
うなブタＡＨＦ生産に関連した製品および方法を提供す
ることを可能にする。

最近開発された技術は、それらの起源は天然であるにも
かかわらず、商業的に有用なタンパクおよびペプチドの
合成のため、急速にそして豊富に成長し得る微生物を採
用することを可能にした。

これら技術は、適当な微生物へ通常他の生物によってつ
くられるタンパクまたはペプチドを合成する能力を遺伝
的に賦与することを可能にする。この技術は、遺伝子物
質、通常ＤＮＡと、生物によって合成されるタンパクと
の間に、すべての生きている生物に存在する基本的関係
を使用する。この関係とは、タンパクのアミノ酸配列の
生産はＤＮＡの３個のヌクレオチド配列のシリーズによ
ってコードされることである。タンパク中に最も普通に
存在する２０種のアミノ酸のめいめいの生産に対して特
異的にコードする１組またはそれ以上のトリヌクレオチ
ド配列群（コードンと呼ばれる）が存在する。めいめい
の与えられたトリヌクレオチド配列と、それをコードす
る対応するアミノ酸との間の特異的関係が遺伝暗号を構
成する。その結果、すべてのタンパクまたはペプチドの
アミノ酸配列は、良く理解された関係に従って、対応す
るヌクレオチド配列によって表現される。さらに、この
ヌクレオチド配列は、原則として、どんな生きた生物に
よってもほん訳されることができる。

遺伝暗号の議論については、その記載を参照としてここ
に取りいれたＪ、Ｄ、　Ｗａｔｓｏｎ、　Ｍｅｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　　（Ｗ、Ａ、
　Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｉｎｃ、、１９７７）　。

特に３４７−７７頁；　　Ｃ，Ｆ、　Ｎｏｒｔｏｎ、　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

（Ａｄｄｉｓｏｎ、　Ｗｅｓｌｅｙ　１９８１）　、お
よび米国特許第４゜３６３、８７７号参照。

それからタンパクがつくられる２０種類のアミノ酸は、
フェニルアラニン（以後時に−“Ｐｈｅ　”またはＦ”
と略す）、ロイシン（“Ｌｅｕ＋”　″）イソロイシン
（Ｉｌｅ　　＋”　　”）、メチオニン（“Ｍｅｔ”　
ＩＩＭ”）、バリン（“Ｖａｌ、”Ｖ”）セリン（”Ｓ
ｅｔ　　＋　　”ｓ　”）＋プロリン（“Ｐｒ。

“Ｐ”）、スレオニン（“Ｔｈｒ　　＋　　“Ｔ″）、
アラニン（Ａｌａ　　１”Ａ”）＋チロシン（“Ｔｙｒ
″Ｙ″）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、”Ｈ”）、グルタミン
（“Ｇｉｎ　　＋　　“Ｑ”）、アスパラギン（“Ａｓ
ｐ、”Ｎ　　″）、グルタミン酸（Ｇｌｕ６Ｅ″）、シ
スティン（“Ｃｙｓ　　、　　“Ｃ′″）、トリプトフ
ァン（“Ｔｒｐ、”―”）、アルギニン（Ａｒｇ　″　
ＩＩＲ”）およびグリシン（“Ｇｕｙ“Ｇ”）である。

与えられたコードン中に含まれることができるトリヌク
レオチドの種々の組合せによってコードされるアミノ酸
は表１に見られる。

（以下余白） 表１　遺伝暗号 Ｐｈｅ Ｐｈｅ ｅｕ ｅｕ ｅｕ ｅｕ ｅｕ ｅｕ ｉｅ １ｅ １ｅ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ ＊　　５ｔｏｐ Ｓｅｒ　　　Ｔｙｒ　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　　Ｔ
Ｓｅｒ　　　Ｔｙｒ　　　　　　Ｃｙｓ　　　　　　Ｃ
５ｅｒ　　　５ｔｏｐ　＊　　　　５ｔｏｐ　＊　　　
　ＡＳｅｒ　　　５ｔｏｐ＊　　　　Ｔｒｐ　　　　　
　ＧＰｒｏ　　Ｈｉｓ　　　　Ａｒｇ　　　　ＴＰｒｏ
　　Ｈｉｓ　　　　Ａｒｇ　　　　ＣＰｒｏ　　　Ｇｉ
ｎ　　　　　　ＡｒｇＰｒｏ　　　Ｇｉｎ　　　　　　
ＡｒｇＴｈｒ　　　Ａｓｐ　　　　　　５ｅｒＴｈｒ　
　　Ａｓｐ　　　　　　５ｅｒＴｈｒ　　　Ｌｙｓ　　
　　　　ＡｒｇＴｈｒ　　　Ｌｙｓ　　　　　　Ａｒｇ
Ａｌａ　　　Ａｓｐ　　　　　　ＧｌｙＡｌａ　　　Ａ
ｓｐ　　　　　　ＧｌｙＡｌａ　　　Ｇｌｕ　　　　　
　ＧｌｙＡｌａ　　　Ｇｌｕ　　　　　　Ｇｌｙはタン
パクの発現を停止する。

特定のタンパクをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列の
デオキシヌクレオチド配列を知ることは、該タンパクの
アミノ酸゛配列の正確な記述を許容する。しかしながら
逆は必ずしも真ならず、メチオニンはたった１種のコー
ドンでコードされるが、他のアミノ酸は、第１表から明
らかなように、６種までのコードン（例えばセリン）に
よってコードされることができる。このように、アミノ
酸配列からヌクレオチド配列を予測するにはかなりの不
確実性が存在する。

要約すると、本発明以前にはＡＨＦの構造については非
常に少ししか知られておらず、そして多年にわたる多大
の労作にもかかわらず、当業者はＡＨＦまたはその遺伝
子の構造を決定し、またはＡＨＦを実質上純粋な形で実
質的な量において生産できる操作を提供することが不可
能であった。

ヒトＡＨＦのための遺伝子がクローン化され、発現され
るこ＼に記載する方法は、以下のステップを含む。

（１）　　ブタＡＨＦの楕製； （２）ブタＡＨＦのアミノ酸配列の決定：（３）オリゴ
ヌクレオチドプローブの調製およびブタＡＨＦをコード
　する遺伝子の少なくとも断片を同定および／または単
離するためにそれら゛プローブの使用； （４）　　ヒトＡＨＦをコードするヒト遺伝物質を同定
および単離するためにブタＡＨＦ遺伝子断片の使用； （５）　　種々の哺乳類組織からＡＨＦの合成部位の決
定のため前記ＡＦＦ　　ＤＮＡ断片の使用；（６）　　
ステップ５における組織同定から得られたメツセンジャ
ーＲＮＡを使用して、ヒトおよびブタＡＨＦをコードす
るｃＤＮＡセグメントの製造： （７）ステップ６において製造されたｃＤＮＡセグメン
トから、例え　ば同じ制限酵素によって切断されたｃＤ
ＮＡセグメントをリゲーションすることによって全長さ
のヒトおよびブタｃＤＮＡクローンの構成； （８）ＡＨＦ合成を命令し得るＤＮＡ発現ベクターのＧ
生成； （９）　　ヒトまたはブタＡＨＦのための全長さのｃＤ
ＮＡを持つ発現ベ　フタ−による適当な宿主の形質転換
； Ｑｌ　　宿主中のヒトまたはブタＡＨＦの発現；０υ　
発現されたＡＨＦの採取； この作業の途中において、ゲノムＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするための新技術がＡ）（Ｆ分子中に含
まれているアミノ酸配列を基にしてオリゴヌクレオチド
プローブを使用して開発された。

本発明は上記方法と、それに関連して作られ１種々のヌ
クレオチド、ベクターおよび他の製品を含む。

皿血■五垂仄段所 第１図は、実施例１に記載した６９，０００ダルトント
ロンビン開裂産物のアミノ末端配列について決定された
アミノ酸配列（Ａ）の図である。

１番目の残基は同定できなかった。この配列は、実施例
３に記載されたブタＡＨＦエクソンのヌクレオチド配列
から推論された配列（Ｂ）、および実施例４に記載され
たヒトＡＨＦエクソンと比較されている。

第２図は、（Ａ）アミノ末端のウシトロンビン消化断片
と、（Ｂ）後出Ａａｓｓらにより単離された１６６Ｋｄ
ブタＡＨＦ断片の４０Ｋｄ）ロンビン開裂産物の単一文
字で表したアミノ酸配列を図示する。

第３図は、ＡＨＦをコードするブタ遺伝子の少なくとも
一部の同定および単離のためのオリゴヌクレオチドの設
計を図示する。

第４図は、実施例３に記載したバクテリオファージＰＢ
３４から得られた、ブタＡＨＦエクソンを含むＳｍａｌ
ＤＮＡ断片（３４−５１）のためのＤＮＡ配列を図示す
る。

第５図は、実施例３に記載した、ブタＡＨＦのためのエ
クソンを持つＨａｅ　ＩＩＩ挿入３４−ＨｌのＤＮＡ配
列の図である。この配列は第４図に示した長い配列内に
含まれ、そして第４図の配列のヌクレオチド２５０−６
１５に相当する。

第６図は、実施例４に記載したヒトＡＨＦのためのエク
ソンの一部を示す、クローン２５−３Ｌの５ａｕ３Ａ１
インサートのためのヌクレオチド３４−８４のためのＤ
ＮＡ配列および推論したアミノ酸配列の図である。

第７図は、ヒトＡＨＦをコードする全体の配列を含むＤ
ＮＡヌクレオチド配列（１本のみを示す）、およびヒト
ＡＨＦの推論したアミノ酸配列を図示する。

の−　な。

本出願の理解を容易にするため、以下の定義が供給され
る。この分野において通用している意義と異なる場合に
は、以下の定義が゛支配する。

増幅とは、細胞がそれらの染色体ＤＮＡ内で遺伝子反復
を生産する過程を意味する。

同時形質転換とは、そのうちの一つが細胞に選択し得る
表現型を与える、該細胞にとって異質の二つ以上の外来
遺伝子をもって細胞を形質転換する過程を意味する。

下流とは、ヌクレオチド配列の３゛末端へ向かって進行
する方向を意味する。

エンハンサ−とは、遺伝子の本体、遺伝子に関して配列
の位置、または配列の配向に関係なく、遺伝子の転写を
可能とし得るヌクレオチド配列である。

遺伝子とは、与えられた成熟タンパクをコードするデオ
キシリボヌクレオチド配列である。ここでの目的に対し
ては、遺伝子は、ＲＮＡ転写開始信号、ポリアデニル化
付加部位、プロモーターまたはエンハンサ−のようなほ
ん訳されない両端域は含まない。

選択遺伝子とは、検出し得るタンパクとして該遺伝子を
発現する表現型を細胞へ与える遺伝子である。

選択剤とは、選択遺伝子の発現の検出を可能とする条件
または物質である。

遺伝子型とは、表現型として観察される、その発現に対
向して細胞内に含まれる遺伝情報である。

リゲーションとは、２本のＤＮＡ鎖の５°および３°末
端間にフォスフオシエステル結合を形成する過程である
。これはＴ４リガーゼによる鈍い末端連結を含む、いく
つかの良く知られた酵素性技術によって達成することが
できる。

配向とは、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの順序を意味す
る。ＤＮＡ配列の反転配位とは、他の配位に関して該配
位の５°から３゛への順序が、該配位を得たＤＮＡ中の
基準点と比較した時反対になっている順序である。その
ような基準点は、起源ＤＮＡまたは該配列を含んでいる
複製し得るベクターの複製源中の池の特定ＤＮＡ配列の
転写の方向を含むことができる。

転写とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を意味する。

形質転換とは、外来ＤＮＡの細胞による摂取によって細
胞の遺伝子型を変えることを意味する。

形質転換は、ある場合には細胞の表現型の変化によって
検出することができる。形質転換した細胞はトランスフ
ォーマントと呼ばれる。形質転換前細胞は、親細胞と呼
ばれる。

はん訳とは、メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から
ポリペプチドの合成を意味する。

本発明は、組換えＤＮＡ技術によって、ブタファクター
■：Ｃ遺伝子の同定および単離を始めて可能にする。本
発明はまた、ＡＨＦのためのヒト遺伝子を発見および単
離するため、ブタＡＨＦＤＮＡとヒ）ＡＨＦ　　ＤＮＡ
との間の相同の利点を利用することにより、組換えＤＮ
Ａ技術により、ヒトファクター■：Ｃを暗号化する遺伝
子の単離および同定を始めて可能にする。ブタＡＨＦ遺
伝子との相同を経由するＡＨＦ製造のためのｃＤＮＡク
ローンへのこのルートは、非常に高価でありかつ実質上
入手できないヒ）ＡＩ（Ｆを精製するための退屈な時間
のかかるそして費用のかがる必要性を回避する。

ブタＡＨＦは、最も好ましくは、Ｄａｖｉｄ　Ｆａｓｓ
　ｅｔａｌ、　　”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　ＡＩＩＦＣｏａｇ
ｕｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈ
ｅｌｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆＡｃｔｉｖｅ　Ｃｏａｇｕ
ｌｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　、　Ｂｌｏｏｄ　５９　
：　５９４−６００（１９Ｂ２）　、およびＫｎｕｔｓ
ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　”　ＰｏｒｃｉｎｅＦａｃ　ｔ
ｏｒ■：　Ｃｐｒｅ−ｐａｒｅｄ　ｂｙ　ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ　　Ｖｏｎ　　
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　　Ｆａｃｔｏｒ　　ａｎｄＨｅ
ｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ八ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　　”へ
Ｊ二ＬＩト９］１．５９　：　６１５−２４　（１９８
２）に記載されているモノクロナール抗体精製技術によ
って最初高度に精製される。上記論文の記載を参照とし
てここに取り入れる。ブタファクター■：Ｃポリペプチ
ドは、適当なアフィニティークロマトグラフィーカラム
上に固定化された抗■：Ｃモノクロナール抗体へ結合さ
れる。約１６６および１３０Ｋｄの分子サイズを有する
２種の大きい分子量ポリペプチドがエチレンジアミンテ
トラ酢酸で溶離される。次に約７６Ｋｄの分子量を持つ
他のタンパクセグメントが約５０％のエチレングリコー
ルを用いてカラムから溶離される。どれらポリペプチド
、および／またはウシトロンビンまたはタンパクを切断
する他の適当な試薬を使用する、該タンパクの酵素消化
のような、既知の方法で得られたこれらポリペプチドの
断片の部分的アミノ酸配列が、次に既知の分析方法によ
って決定される。

これら物質のアミノ酸配列を基にして、オリゴヌクレオ
チドプローブが合成され、その少なくともいくつかはＡ
ＨＦの対応するセグメントをコードするＤＮＡとハイブ
リッド化されるであろう。これらオリゴヌクレオチドは
次に、ブタＡＨＦをコードする遺伝子のセグメントをス
クリーニングするために使用される。

ＡＨＦのためのブタ遺伝子一部分が得られれば、繊組換
え物質はヒトＡＨＦをコードする遺伝子を探索し、そし
て単離するため、ヒトゲノムＤＮＡをスクリーンするた
めに使用される。この操作において、ヒ１−ＡＨＦとブ
タＡＨＦとの間に、かなりの類似性が存在することが確
立され、そしてこれら類似性の利益がヒトファクター■
：Ｃ遺伝子または遺伝子セグメントを単離し、そして同
定するために用いられる。

ブタおよびヒトタンパクの類似性は、アミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列の対応する類似性に帰せられる。ヒ
トおよびブタのＡＨＦタンパクをコードする遺伝物質は
、高いパーセントの部分において同一であり、そのため
、例えばＢｅｎ　ｔｏｎおよびＤａｖｉｓのＳｃｒｅｅ
ｎｉｎｇ　ｇｔ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｃ１０ｎｅ
ｓｂｙ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｎ　　ｔｏ　Ｓｉｎｇ
ｌｅ　Ｐｌａｑｕｅｓ　　Ｉｎ　５ｉｔｕふユ旦ルＪ−
１９６：　１８０　　（１９７７）の操作へかける時、
ハイブリッド化を示す、該論文の記載を参照としてここ
に取り入れる。　ヒトＡＨＦのための遺伝子のクローン
化したセグメントは、次に種々のヒト組織の中からＡＨ
Ｆ　　ｍＲＮＡの源を同定するために使用される。同様
に、ブタＡＨＦのためのクローン化したセグメントの一
つまたはそれ以上がブタＡＨＦのための可能性ある組織
源をスクリニングするために使用される。このステップ
は、例えば Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ、　　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）に記載されて
いるように、ＲＮＡ抽出、ゲル電気泳動、ニトロセルロ
ースシートへの移換、および放射標識したクローン化Ｄ
ＮＡへのハイブリッド化を含む。この組織源が同定され
れば、ｃＤＮＡライブラリーがつくられ（プラスミドま
たは好ましくはバクテリオファージラムダベクター中に
、両方とも一般に入手可能）、そして以下に記載するよ
うにＡＨＦ　　ｃＤＮＡクローンについてスクリーニン
グされる。ｃＤＮＡライブラリースクリーニングのプロ
セスは、ＤＮＡ配列決定により、ＡＨＦをコードする全
体ＤＮＡ遺伝子配列を含むことを示す一組のｃＤＮＡク
ローンが得られるまで繰り返される。

全長さのヒトまたはブタＡＨＦ　　ｃＤＮＡが得られた
ならば、ＡＨＦ活性を発現するため、既知の適当な手段
、例えば適当なベクターへの挿入、適当な宿主中へのト
ランスフェクション、形質転換された細胞（トランスフ
ォーマント）の選択、およびこれらトランスフォーマン
トの培養がＡＨＦタンパクを発現するために使用される
。

ＡＨＦの発現のための宿主ベクター系は原核細胞でもよ
いが、しかしＡＨＦの複雑性は好ましい発現系を真核細
胞、特に（少なくとも凝血活性を有する生物学的に活性
なＡＨＦに対しては）哺乳動物系のものとする。これは
真核細胞（通常哺乳類またはを椎動物細胞）の適当なＡ
ＨＦベクターによる形質転換によって容易に達成される
。真核細胞形質転換は、一般によく知られたプロセスで
あり、そして種々の標準的方法によって達成することが
できる。これらは、プロトプラスト融合、ＤＮＡミクロ
注入、染色体トランスフェクション、溶菌性または非溶
菌性ビールスベクター（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　”Ｎａｔｕｒｅ　　（Ｌｏｎｄｏｎ）　
２７７　：　１０８４１４　（１９７９）　）　、　Ｉ
ＩＩ胞対線対細胞融合ｏｕｒｎｉｅｒ　ｅｔａｌ、、　
　”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　
”７４・：３１９−３２３（１９７７）　）　、　　リ
ピッド構造（米国特許第４，３９４．４４８号）、およ
びＤＮＡ沈澱の摂取（Ｂａｃｈｅｔｔｉ　ｅｔａｌ、、
　”Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７４　
　：　１５９０−１５９４　　（１９７７）　）の使用
を含む。イーストまたはこん生細胞のような他の真核性
細胞も有利に使用し得る。

溶菌性ビールスベクターによって仲介される形質転換が
効率的であるが、しかし多数の理由により不利である。

トランスフェクトされたＤＮＡの最大サイズがビールス
のカブジッドバッキングの形状によって制限される、外
来遺伝子がビールス複製中しばしば消失する、ヘルパー
ビールスまたは特異化された宿主の必要性が存在する、
宿主細胞はパーミツシブでなければならない、そして宿
主がビールス感染の途中で殺されることである。

非溶園性形質転換は、安定なエピソームとしである細胞
ライン中に導入されたビールスベクターの転写およびほ
ん訳を基にする。これら系は独特な細胞ラインを必要と
し、そして多数の不利益を蒙る。“Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ″、　１
９８３年３月号、　ｐｐ、２０９−２１２参照。

他方、染色体外ＤＮＡが宿主細胞の染色体中に摂取され
る他の形質転換方法は、低い形質転換傾度および低い発
現レベルによって特徴づけされていた。これら当初の難
点は、実際に形質転換された細胞（選択遺伝子）の小集
団を遺伝的に選択し得る表現型を与える遺伝子で形質転
換することによって緩和された。形質転換された細胞の
全集団は、獲得した表現型を有する細胞に有利な条件で
育成されることができ、そのため形質転換された細胞を
好都合に探索することを可能とする。その後、トランス
フォーマントは該表現型をもっと強く表現する能力につ
いてスクリーニングされることができる。これらは、よ
り高い発現を検出するような方法で、選択剤を変更する
ことによって達成される。

選択遺伝子は三つのカテゴリー、すなわち検出し得るよ
うに増幅された選択遺伝子、優性選択遺伝子、および検
出し得るように増幅された優性選択遺伝子に分けられる
。

検出し得るように増幅された選択された遺伝子は、増幅
が宿主細胞を選択剤の変更へ曝露することによって検出
することができる遺伝子である。

優性に活動しない検出し得るように増幅された遺伝子は
、一般に選択遺伝子を遺伝子型的に欠く親細胞ラインを
必要とする。その例は、ヒドロキシメトールグルタニル
Ｃｏ＾レダクターゼ（Ｓｉｎｅｎｓｋｙ。

“Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ
ｏｍｍｕｎ、　”　７Ｂ　：　８６３　　（１９７７）
　）　、　　リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｍｅｕｔ
ｈｅｔ　ａｌ、　”Ｃｅ１ｌ　：　３　　：　３６７　
　（１９４３）　）　、アスパルテートトランスカルバ
ミラーゼ（Ｋｅｏ＋ｐ　ｅｔ　ａｔ。

”Ｃｅｌビ　９：５４１　　（１９７６）　、アデニレ
ートデアミナーゼ（ＤｅＢａｔｉｓｓｅ　ｅｔ　ａｌ、
　”　Ｍｏｌ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

２　　（１１）　　：１３４６−１３５３　　（１９８
２）　）　、マウスジヒドロフオレートレダクターゼ（
ＤＨＦＲ）、および欠陥プロモーターと共にマウスチミ
ジンキナーゼ（ＴＫ）に対する遺伝子を含む。

優性選択遺伝子は、親細胞の遺伝子型に関係なくトラン
スフォーマント中に発現される遺伝子である。大部分の
優性選択遺伝子は、その表現型が選択剤による処理にお
いて高度に効果的なため、遺伝子を増幅した、または増
幅しなかった細胞ラインを識別することが困難であるた
めに、検出し得るように増幅されない。このタイプの優
性選択遺伝子は、キサンチンーグアニンフォスフォリボ
シルトランスフェラーゼ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、”Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　”７８　（４）　
　：　　２０７２−２０７６　（１９８１）　）　。

およびアミノグルコシド３゛　−フォスフオドランスフ
ェラーゼ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、　”　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　　”　、　１５０　　：　１−１４　（１
９８１）　）　（Ｄヨうな、原核生物酵素に対する遺伝
子を含む。

いくらかの優性選択遺伝子は検出できるように増幅され
る。適当な実例は、Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

“Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　　”　　
４：４９９−５０８　　（１９８２）に記載された変異
ＤＨＦＲ遺伝子、ＨＬＡ抗原のような細胞表面マーカー
、およびこの分野でよく知られているように螢光源また
は色素源物質から螢光物質または着色物質を生産する特
異性エステラーゼのような酵素をコードする遺伝子を含
む。

検出し得るように増幅された優性選択遺伝子がここで使
用するために好ましい。ある場合は、優性選択遺伝子は
遺伝子の適当な変異によって検出し得るように増幅され
た遺伝子へ変えることができることを理解すべきである
。

選択遺伝子は最初躍られた商業的有用性しがなかった。

それらは摂取したＤＮＡ委増幅する性質を有するトラン
スフォーマントを選択することを可能としたが、大部分
の選択遺伝子は商業的価値のない生産物を生産した。他
方、商業的に価値ある生産物のための遺伝子は、一般に
それらのトランスフォーマントへ容易に検出し得る（ま
たは単に検出し得る）表現型を与えなかった。これは、
例えば独特の栄養代謝または無毒化能力で形質転換され
た細胞を与えない酵素またはホルモンについて真理であ
ろう。商業的に興味ある大部分のタンパクはこのグルー
プ、例えばホルモン、血液凝固に関与するタンパク、お
よびフィブリン溶解酵素に属する。

後に、形質転換される性質を有し、そして選択遺伝子を
増幅する真核細胞は、生産物遺伝子の場合と同じことを
するであろうということが発見された。選択遺伝子を追
従することにより、選択遺伝子と同時に、生産物遺伝子
を同時発現し、同時増幅するトランスフォーマント細胞
の小集団を同定することができた。トランスフォーマン
トを選択剤の存在下に培養し、そして選択遺伝子の増加
した発現を有するトランスフォーマントは生産物遺伝子
の増加した発現をも示すであろうと結論するのが実際で
あった。これは後でもっと詳細に論するように、常に正
しいとは限らない、　Ａｘｅｌら（米国特許第４．３９
９．２１６号）は、ある細胞を、共有結合した、または
結合しない遺伝子を含むベクター系によろうと、そして
後者の場合、遺伝子が宿主細胞中へ後から、または同時
に導入されようと、二辺上の異なった遺伝子で形質転換
する過程を記載するために、同時形質転換なる術語を使
用している。同時形質転換は、“実質上任意の遺伝子の
培養細胞中への導入および統合を許容しくＷｉｇｌｅｒ
ｅｔ　ａｌ、　＠Ｃｅ１ｌ”、　　１６　：　７７７−
７８５．　（１９７５）　）　、および“同時形質転換
過程の使用により、所望のタンパク性および他の物質を
合成する真核細胞を生産することが可能″　（米国特許
第４，３９９，２１６号、カラム３．３７−４２行）で
なければならない。

壓ｊｄｉ換ニジ乙久ニー ＡＦＨ同時形質転換に使用されるベクターは、選択遺伝
子およびＡＨＦ遺伝子を含むであろう。

加えて、形質転換または同時異質転換ベクター中に、後
で記載するようなエンハンサ−、プロモーター、イント
ロン、アクセサリ−ＤＮＡ、ポリアデニル化部位、およ
び３゛非コーテイング域のような他の要素が通常存在す
るであろう。

適当な選択遺伝子は上に記載した。選択剤は選択遺伝子
の不存在下で細胞生育を阻止するものであることが好ま
しい。そのため、選択遺伝子を失った大規模培養中の復
帰突然変異細胞は、醗酵物を過度に生育させないであろ
う。しかしながら、ＡＨＦの商業生産においては、細胞
毒素の使用を避け、それにより製品精製工程を単純化す
ることが望ましいであろう。このため、望ましい選択遺
伝子は、トランスフォーマントがさもなければ使用でき
ない生育にとって重要な栄養を使用することを可能にす
るものであろう。前述したＴＫ遺伝子は一例である。

二つのクラスのベクターが同時形質転換に用いられた。

第一のクラスの未結合ベクターである。

ここでは選択遺伝子およびＡＨＦ遺伝子は共有結合され
ない。二つの遺伝子のリゲーシヲンまたは他の結合ステ
ップが必要ないので、このクラスのベクターが好ましい
。このことは、選択遺伝子および生産物遺伝子 してそれらの野生タイプ環境においてリゲートされない
から、形質転換過程を単純化する。加えて、同時形質転
換特使用されるＡＨＦおよび選択遺伝子のモル比は、同
時形質転換効率を増すように調節することができる。

同時形質転換ベクターの第二のクラスは、結合したベク
ターである。これらベクターは、選択およびＡＨＦベク
ターが好ましくはリゲーションによって共有結合されて
いる点において未結合ベクターから区別される。

こ＼ではベクターはエンハンサ−を含むことができる。

エンハンサ−は機能的にプロモーターから区別されるが
、しかしプロモーターと協力して作用するように見える
。それらの細胞レベル上の機能は良くわかっていないが
、それらの独特な特徴は、位置もしくは配位に依有する
ことなく転写を活性化または可能化する能力である。プ
ロセロターは遺伝子の上流でなければならないが、エン
ハンサ−はイントロンのように、遺伝子内でプロモータ
ーから上流または５゛に、または遺伝子とポリアデニル
化部位との間で遺伝子から下流に、またはポリアデニル
化部位から３′に存在することができる。反転したプロ
モーターは機能しないが、しかし反転したエンハンサ−
は機能する。エンハンサ−はシス活性、すなわちプロモ
ーターに対しそれらが同じＤＮＡ鎮上に存在する場合の
み効果がある。エンハンサ−の−量的議論については、
にｈｏｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、“Ｃｅ１ｌ　”　３３　：
　３１３−３１４　　（１９８３）参照。

好ましいエンハンサ−は、サルビールス４０、ポリオマ
ビールス、ウシバピロマビールス、レトロビールスまた
はアデノビールスのような動物ビールスから得られる。

ビールスエンハンサーハ、大衆が入手し得るビールスか
ら容易に得ることができる。いくつかのビールス、例え
ばラウスザルコーマビールスおよびサルビールス４０の
ためのエンハンサ−域は良く知られている。Ｌｕｃｉｗ
　ｅｔ　ａｌ。

“Ｃｅｌビ３３：　７０５−７１６　（１９８３）参照
０問題のビールスの公表された制限マツプを基にしてこ
れら域を切除し、そしてもし必要ならばエンハンサ−を
所望のベクターに接合することを可能とするように部位
を修飾することは日常的な化学的事項である。例えば、
Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　”　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ。

ｌ￥９　：　６０１−６２１　（１９８２）および“Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

１（１１）　　：　　１３０４−１３１９　（１９８２
）参照、これら両者の記載を参照としてこ＼に取り入れ
る０代わりに、エンハンサ−は配列データから合成する
ことができる。ビールスエンハンサ−のサイズは、これ
を実際の達成できるほど十分に小さい（一般に約１５０
ｂｐ以下）。

ベクターアセンブリ中に存在しなければならない他の要
素は、ポリアデニル化接合（付加）部位である。これは
ほん訳された遺伝子区域から下流に位置するＤＮＡ配列
であり、そこから少し下流に転写ストップおよびアデニ
ンリボヌクレオチドが付加され、メツセンジャーＲＮ’
Ａの３′末端にポリアデニンヌクレオチド連部を形成す
る。ポリアデニル化は、メツセンジャーＲＮＡのレベル
、従って生産物タンパクのレベルを減らす事象である、
細胞中の分解に対してメツセンジャーＲＮＡを安定化す
るのに重要である。

真核性ポリアデニル化部位は良く知られている。

真核性遺伝子の中にコンセンサスな配列が存在する。ヘ
キサヌクレオチド５”−ＡＡＵＡＡＡ　−３’　は、ポ
リアデニル化がスタートする点から１１−３０ヌクレオ
チドに発見される。ポリアデニル化部位を含むＤＮＡ配
列は発表された報告に従ってビールスから得ることがで
きる。例示的なポリアデニル化配列はマウスベータグロ
ブリン、およびサルビールス４０後期または早期域遺伝
子から得ることができるが、しかしビールスのポリアデ
ニル化部位が好ましい、これら配列は既知であるから、
それらは生体外で合成することができ、そしてベクター
へ慣用の手法でリゲートすることができる。

ポリアデニル化域は、ＡＨＦおよび／または選択遺伝子
のどちらからも下流に配置されなければならないが、ど
ちらの遺伝子ヘリゲートすることもできる。それは生産
物遺伝子ではなく、選択遺伝子のみヘリゲートすること
ができ、そしてベクターが結合していても結合していな
くてもそうである。はん訳ストップコードンからポリア
デニル化部位を分離する配列は、好ましくはプロモート
されない真核性遺伝子のようなほん訳されないオリゴヌ
クレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドおよ
び遺伝子はプロモーターを付与されないので、それらは
発現されないであろう。該オリゴヌクレオチドはストッ
プコードンからポリアデニル化部位まで約１，０００塩
基までのオーダーでかなりの距離延長しなければならな
い。この３゛非はん訳オリゴヌクレオチドは、一般に生
産物収率の増加をもたらす。該ベクターはコンセンサス
配列から下流約１０ないし約３０ｂｐで終わることがで
きるが、しかしその野性タイプ環境においてポリアデニ
ル化部位から下流に見出される３”配列を保持すること
が好ましい。これら配列は、典型的にはポリアデニル化
部位から下流へ約２００ないし６００塩基対延長する。

こ−に記載したベクターは当業者によく知られた技術に
よって合成することができる。選択遺伝子、エンハンサ
−、プロモーター等のようなベクターの成分は天然源か
ら得ることもできるし、または前記のように合成するこ
ともできる。基本的には、もし成分がビールス機能のよ
うな成分のように、大量に入手し得るＤＮＡ中に見出さ
れるならば、またはポリアデニル化部位のようにそれら
を合成し得るならば、適当な制限酵素の使用により、大
量のベクターは、単に起源生物を培養し、そのＤＮＡを
適当なエンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡ断片を分離
し、興味ある要素を含んでいるＤＮＡを同定し、そして
それを回収することによって得ることができる。通常、
形質転換ベクターは小量組立てられ、そして次に真核性
プラスミドまたはファージのような適当な自律的に複製
する合成ベクターヘリゲートされるであろう。大部分の
場合、ｐＢＲ３２２プラスミドを使用することができる
。前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ参照。

合成ベクターは、例えばパーミツシブな真核生物のトラ
ンスフェクション、高コピー数への合成ベクターの複製
、細胞熔解による合成ベクターの回収、および細胞片か
ら合成ベクターの分離によって、慣用手法によりリゲー
トした形質転換ベクターをクローン化するために使用さ
れる。

合成ベクターの得られる収穫物は真核性細胞へ直接トラ
ンスフェクトすることができ、または形質転換ベクター
は、適当なエンドヌクレアーゼ消化、分子量による分離
、および形質転換ベクターの回収によって、合成ベクタ
ーから救出することができる。形質転換ベクター救出は
、合成ベクターの残部が真核性遺伝子増幅、転写または
ほん訳に悪影響しない限り必要でない。例えば、こ＼で
好ましい合成ベクターは、真核細胞に対して有害な配列
を除去したＥ、　Ｃｏ１１変異株プラスミドｐＢＲ３２
２である。前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ参照。この
変異株の使用は、同時形質転換前に、プラスミド残部を
除去する必要性を全くなくす。

および　　の 形質転換すべき細胞はイースプロトプラストを含む任意
の真核細胞でよいが、しかし通常は非カビ細胞である。

−人体外移植体（幹細胞のような比較的未分化細胞を含
む）、および死滅しないおよび／または形質転換された
細胞ラインが適当である。候補細胞は、選択遺伝子が優
性である限り選択遺伝子を遺伝子型的に欠けていなくて
もよい。

細胞は、好ましくは前に論じたように安定な哺乳類細胞
ラインであろう。それらの染色体ＤＮＡ中へ選択遺伝子
を安定に統合することが知られた細胞ライン、例えばチ
ャイニーズハムスター卵（ＣＩＩＯ）細胞ラインが最良
である。ＣＯＳサル細胞、Ｂｏｗｅｓ細胞ラインのよう
なメラノーマ細胞ライン、マウスＬ細胞、マウス線維芽
細胞、およびマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞も使用し得る。

未結合ベクターによる同時転換は、順次または同時に達
成することができる（米国特許第４．３９９゜２１６号
を見よ）。細胞のＤＮＡ摂取を容易にする方法は前に記
載されている。細胞核中へのベクターのマイクロ注入は
最高形質転換効率を得るであろうが、しかしリン酸カル
シウム沈澱の形のＤＮＡへ親細胞を露出するのが最も便
利である。かなり良い同時形質転換効率は、１００：１
のオーダーの選択遺伝子に対する生成物のモル過剰によ
る同時形質転換から得られる。

形質転換条件へｌＬｌ露された細胞の個体群は次にトラ
ンスフォーマントを同定するために処理される。同時形
質転換のために処理された培養物の小個体群だけが選択
遺伝子の表現型を示すであろう。

培養物中の細胞は表現型についてスクリーニングされる
。これら細胞を個々に細胞選別装置でアッセイすること
によって達成することができ、その場合、表現型は選択
遺伝子によって生産された酵素による螢光源物質の開裂
時の螢光のような信号を発生する表現型である。しかし
ながら、好ましくは該表現型は、前に詳しく論じたよう
な特別の発育培地中でトランスフォーマントのみが発育
または生有することを可能とする。

選択トランスフォーマントは、次に生産物遺伝子のそれ
らの染色体へのリゲーションについて、または生産物自
体の発現についてスクリーニングされる。前者はサウザ
ンブロ７）分析によって達成することができ、後者は標
準的な免疫学的または酵素的アッセイによって達成する
ことができる。

トランスフォーマントが同定されたならば、ＭＴＸのよ
うな選択剤の存在下さらにクローニングすることによっ
て生産物遺伝子の表現を増幅するためのステップが実施
される。米国特許第４，３９９゜２１６号を見よ。

こ＼に記載したプロセスに従って調製し得るトランスフ
ォーマントは、公知技術による高等生物の生体内トラン
スフェクションに適している。可能性ある宿主動物の一
次体外移植物または安定な細胞ラインが同時形質転換さ
れ、そして該宿主、生産物タンパクが遺伝子型的に欠け
ている実質上ほかに同質遺伝子的な宿主に接種される。

本発明は、以下の例証具体例を参照してさらに理解され
るであろう。該具体例は純粋に例示であり、そして請求
の範囲に記載された本発明の真の範囲を限定するものと
解すべきではない。

特記しない限り、制限エンドヌクレアーゼはそれらの商
業的供給者が推奨する条件および態様で使用される。リ
ゲーション反応は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、、　
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１０ｎｉｎ　　Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ。

（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　１９８２）　１２４５−６頁（その記載を
参照としこ＼に取り入れる）に記載されているように、
その第２４６１頁に記載されている緩衝液を使用ひ、そ
してＤＮＡ濃度１〜１００μｇ／■を使用し、鈍いＤＮ
Ａ末端に対しては２３℃の温度において、そしてくっつ
き易いＤＮＡ末端に対しては１６℃において実施される
。

こ＼に記載した“フォスフォターゼ処理”とはＤＮＡの
脱フォスフォリル化を意味し、そして前出Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、の１３３頁等に記載されている態様
で実施される。“キナーゼ処理”とはＤＮＡのフォスフ
ォリル化を意味する。電気泳動は、９０　ｍＭ　）リス
−ホウ酸塩、　　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する０、
　５〜１．５％アガロースゲル中で実施される。

“ニック−トランスレーティングとは、Ｒ４ｇｂｙｅｔ
　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ＋、　Ｂｉｏｌ、　　１１３：
２３７　　（１９７７）に記載されているように、ＤＮ
Ａを３２ｐで標識する方法を意味する。すべての放射標
識したＤＮＡは、どのような標識技術が使用されようが
、３２ｐで標識される。

“ラピッド　プレツブ”とは、例えば前出Ｍａｎｔａｔ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　３６５−３７３頁に記載されてい
るバクテリオファージまたはプラスミドＤＮＡの急速小
規模生産を意味する。

本発明の他の局面によれば、Ａ　ＨＦの医薬製剤が提供
される。本発明に従って生産されたヒＩ−ＡＨＦの医薬
製剤は、この技術分野においてよ（知られた操作に従っ
て非経口投与のために製造される。

ヒトに使用される医薬製剤は、形質転換した細胞から採
取した滅菌したＡＨＦを含む。ＡＨＦポリペプチドまた
はＡＨＦ活性を産生ずるその十分な部分に加え、一種ま
たはそれ以上の許容し得るその担体と、そして場合によ
り他の治療成分を含むことができる。担体は、製剤の他
の成分と共存し得るとの意味において許容し得るもので
なければならず、そしてその受容者にとって有害であっ
てはならない。該製剤は、単位投与形態で便利に提供さ
れることができ、そして薬剤学の分野において良く知ら
れた任意の方法によって製造することができる。

非経口投与に通した本発明の医薬製剤は、有利には、好
ましくは受容者の血液と等張である溶液をつくるため滅
菌した溶液の添加によって復元し得るＡＨＦポリペプチ
ドの無菌凍結乾燥製剤を含むことができる。該製剤は、
単位または多数投与容器、例えばシールしたアンプルま
たはバイアル中に提供することができる。

無菌ＡＨＦまたはその溶液に加え、本発明の医薬製剤は
希釈剤、緩衝剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤
、保存剤（抗酸化剤を含む）その他のような一種または
それ以上の違加の成分を含んでもよい。ゼラチン、乳糖
、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、微粉シリカゲ
ル、ココアバター、タルク、植物性および動物性油脂、
植物性ゴム、およびポリアルキレングリコール、および
医薬用の他の既知の担体はすべて本発明の医薬製剤の製
造に適している。非経口用途のための製剤は、担体であ
る水または薬剤学的に許容し得る液体の無菌溶液または
懸濁液のアンプル、または薬剤学的に許容し得る液体で
希釈するための無菌固体ＡＨＦを含む。

本発明の医薬製剤は、血友病Ａの治療に有用である。こ
れら製剤はまた、血液凝固が関与するプロセスの生体内
および生体外研究において、およびＡＨＦ分子の免疫学
的および生物学的特徴の研究において、重要な道具を提
供する。

実施例１　久ＺべＬ起死分析 ブタファクター■：Ｃを前出のＫｎｕｔｓｅｎおよびＦ
ａｓｓ　（１９８２）　　；Ｆａｓｓｅｔ　ａｌ、　（
１９８２）に発表された操作に従って、Ｄａｖｉｄ　Ｆ
ａｓｓによって精製された。

アミノ酸配列分析は、以下に記載する７６．０００ダル
トンタンパクのウシトロンビン消化生成物について実施
される。

抗■：Ｃモノクロナール抗体カラムへ結合したブタＡＨ
Ｆポリペプチドは、２ステツプにおいて次々に溶離され
ることができる（Ｆａｓｓｅｔ　ａｌ、　１９８２）、
二種の巨大分子量スペシス、１６６．０００および１３
０．０００ダルトンはＥＤＴＡで溶離し得る。約７６．
０００ダルトンの分子量を有する残りのポリペプチドは
、次に５０％エチレングリコールで溶離することができ
る。

７６．０００ダルトンの・タンパクは、５ＩＩＩＭトリ
スーＨＣ７！　（ｐＨ７，５）　、　　０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣｅ中における法尻な透析の後、トロンビンで消化す
る。ウシトロンビン消化は、ウシトロンビン１単位／ｄ
を用いて室温で６０分間実施し、さらにトロンビン１単
位／戚を加え、そしてさらに６０分間インキュベートす
る。トロンビン消化は０．０１％ＳＤＳ中９０℃で１０
分間加熱することによって打ち切る。７６．０００ダル
トンタンパクの主なトロンビン消化生成物は、６９．０
００ダルトン（６９Ｋｄ）のポリペプチドである。

前記の６９Ｋｄポリペプチドスペシスの１Ｍｇ以下を、
Ｕ、　Ｋ。

Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７７　：　８８
０　　（１９７０）　　（その記載をこ＼に参照として
取り入れる）の操作によりＳＤＳゲル電気泳動後、放射
性マーカーとして役立つようにヨード化する。ＴＡｓｉ
ｆｉ液（５０ｍＭトリス−酢酸塩（ｐＨ７，８）　、　
０．１％５ＤＳ）中に溶解したポリペプチドを、担体を
含まないヨウ素−１２５の５　ｍｃｉを含む同じ緩衝液
１００μｌへ加える。ＴＡＳ緩衝液中２．５■／献のク
ロラミンＴ（ベーカー）５０μｌを加え、溶液を１分間
かきまぜる０反応をＴＡＳ緩衝液中メタ重亜硫酸ナトリ
ウム２．５ｗ／１ｒＩｉ熔液５０μｌを加え、１分間か
きまぜることによって停止する。標識したタンパクは小
容積のセファデックスＧ−２５Ｍカラム（ＰＤ−１０，
ファルマシア）を使用するクロマトグラフィーにより、
取り込まれなかった１１２ｓから分離する。該カラムは
、ヨウ化ナトリウム２．５■／献を含むＴＡＳ緩衝液の
数倍カラム容積をもってあらかじめ平衡化される。空容
積を集め、そしてタンパク完全性を前出Ｌａｅｍｍｌｉ
　（１９７０）の操作に従ってＳＤＳゲル電気泳動によ
って分析する。

放射標識した６９Ｋｄタンパクを後のモニタリングのた
めその未標識対応タンパクへ加える。該タンパクは次に
個々に電気泳動的に濃縮される。

タンパク溶液は０．１％ＳＤＳ、１０５Ｍジチオスレイ
トールへ関節され、そしてＣｏｏｓａｓｓｉｅブリリア
ントブルー（Ｓｅｒｖａ　）を加え、溶液を非常に薄く
ブルーに着色する。

溶液は次にスペクトラポア透析チューブ（約１４．００
０の分子量カットを有するＳｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、製）を使用
してＴＡＳ緩衝液中で大体透析する。透析したタンパク
サンプルは、次にＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

Ｅｎｚｙｍｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、　Ｐａｒｔ　　
Ｉ　、９１　：　２２７　　（１９８３）によって示さ
れた設計の電気泳動濃縮装置に入れられ、ＴＡＳ緩衝液
中で２４時間５０ボルトで濃縮される。

上の操作で濃縮された６９ＫｄＡＨＦポリペプチドは、
前出Ｌａｅｍｍｌｉに従って５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルを通して電気泳動される。放射標識されたトレー
サーポリペプチドのオートラジオグラフィーによって同
定される、精製されたタンパクがゲルから切り出され、
電気溶離され、そして前出Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、によって記載されたように濃縮される。濃縮
されたタンパクは、Ｈｅｗｉｃｋｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５６　ニア９９０　（１９
８１）に記載された気相シーケネーターを使用する直接
アミノ酸配列分析に通している。

６９．０００ダルトントロンビン開裂生成物の２−４２
残基を延びるアミノ末端配列は、第１図に図示するとお
りである。１番目の残基“Ｘ”は同定できなかった。前
出Ｆａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、によって記載された１６６Ｋ
ｄＡＨＦ断片の（Ａ）アミノ末端および（Ｂ）それから
の４０Ｋｄウシトロンビン消化生成物のアミノ酸配列は
第２図に示されている。７６Ｋｄポリペプチドのアミノ
末端は、Ｘ−１ｉｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ
　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＬ
ｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｌ
ｅ　Ｐｈｅである。

（ａ）ペンタペプチドプローブ給源 決定されたブタＡＨＦ断片の部分的アミノ酸配列は、ブ
タＡＨＦオリゴヌクレオチドプローブを設計し、そして
合成することを許容する。遺伝暗号（表１）から、この
アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を予測することが
可能である。遺伝暗号は変性であるので、アミノ酸配列
毎に二つ以上の可能性あるＤＮＡコード配列が存在する
。従って、正確なりＮＡ配列を確かめるため、合理的な
数のオリゴヌクレオチドのみを必要とするＡＨＦ分子の
区域に対して複数の相補性オリゴヌクレオチドプローブ
配列が容易される。そのような区域は、最低の変性度を
有する５個ないし８個の連続するアミノ酸配列をサーチ
することによって選択される。該区域が選択された後、
オリゴヌクレオチドの給源が合成され、それは選択され
た区域の５１１！ｉないし８個のアミノ酸をコードでき
るすべての可能性あるＤＮＡ配列を含むであろう。

ブタＡＨＦの６９．０００ダルトントロンビン開裂断片
においては、アミノ末端から１８番目ないし２２番目の
アミノ酸までを含むペンタペプチド配列があり、これは
、１５個のヌクレオチド長さに対し、めいめい５個のコ
ードンを有する１６個までの異なるＤＮＡ配列によって
コードされることができる。

（以下余白） 可能性あるｍＲＮＡ配列 Ｔｒｐ　　−Ａｓｐ　　−Ｔｙｒ　　−Ｇｌｙ　　−Ｍ
ｅｔＵＧＧ　　　ＧＡＵ　　　ＵＡＵ　　　ＧＧＵ　　
　ＡＵＧまたは　または　または ＧＡＣＵＡＣＧＧＣ または ＧＡ または ＧＧＣ プローブは、混合物あたり２ないし８またはそれ以上の
オリゴヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドの限られ
た数の混合物を合成することによってつくられる。すべ
ての可能性あるコード配列を包囲するのに十分な給源が
つくられる。

これらオリゴヌクレオチドは、例えば、その記載を参照
とじこ−に取り入れるＲ、　Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ａｍ、　　Ｃｈｅｖ＋、
　　Ｓｏｃ、　　９８　：　　３６５５　　（１９６７
）　　に開示されているフォスフオトリエステル法によ
り、人手によって合成することができる。他の方法はこ
の分野で良く知られている。こ＼にその記載を参照とし
て取り入れたＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕ　ｔｈ
ｅｒｓ　＋Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１０
３　　：　３１８５　（１９８１）参照。

しかしながら、好ましくは所望のポリペプチド配列のた
めの合成オリゴヌクレオチドプローブは、上に示した完
全自動アプライド、バイオシステムズ、ＤＮＡシンセサ
イザーの助けにより、同じ化学によって合成される。

このように製造されたオリゴヌクレオチドは、次にその
記載を参照としてこ＼に取り入れたＨｏＦｒｉｔｚ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　１７．：　
１２５７　（１９７Ｂ）に記載されているような逆ＨＰ
ＬＣカラム上で精製することができる。８０％ＨＯＡｃ
による脱トリチル化の後、得られるオリゴヌクレオチド
は通常純粋であり、そしてプローブとして直接使用する
ことができる。もし夾雑物があれば、合成りＮＡは好ま
しくは少し異なる勾配システムを使用して、同じ肝ＬＣ
カラム上でさらに精製することができる。

オリゴヌクレオチドは（−３２ｐ）＾ＴＰおよびＴ４ポ
リペプチドキナーゼを使用することによって標識され、
そしてそれらの配列は、その記載を参照として取り入れ
るＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　Ｕ、Ｓ、
Ａ。

７０　：　１２０９　（１９７３）に記載された二次元
クロマトグラフィーにより、または取止、ｈ鉦鮫旦■　
６５：４９９　　（１９７７）記載のＭａｘａｎ−Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ法によって検定される。

（ｂ）　４５個ヌクレオチドプローブ 本発明の独特な面は、Ａ）（Ｆ遺伝子またはその断片に
ついてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ため、オリゴヌクレオチドプローブを使用することであ
る。オリゴヌクレオチドはＣＤＮＡライブラリーをスク
リーニングするために使用されているが（ここにその記
載を参照として取り入れるＭ、　Ｊａｙｅ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｎｕｃｌｅｉ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

１１　：　２３２５　（１９８２）参照）、ゲノムライ
ブラリーは以前ｃＤＮＡプローブのみにより、すなわち
記載されたタンパクのための組織源が同定され、そして
ゲノムサーチによって発見された遺伝子のＤＮＡ配列に
正確にマツチしたｃＤＮＡを生産するのに用いられた後
で生産されたプローブにより成功してスクリーニングさ
れていた。

本件の場合、興味あるタンパクのアミノ酸配列をコード
するゲノムライブラリー中の遺伝子セグメントを同定す
るためにオリゴヌクレオチドを使用することが可能であ
ることが示され、そしてそのような遺伝子セグメントの
同定はｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはその後のゲノムスクリ
ーニング技術に使用するための性格なプローブを提供す
る。

好ましくは、こ＼でそうであるように、興味あるタンパ
クのアミノ酸配列の少なくとも２個のセグメントに対応
するオリゴヌクレオチドが使用される。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドプローブの少なくとも１個が、選択さ
れたアミノ酸配列をコードし得るすべての可能性あるＤ
ＮＡ配列を総合して含むオリゴヌクレオチドの一つまた
はそれ以上の給源の形で使用される。好ましくは、比較
的短いプローブ、例えば１１ないし２５ヌクレオチド、
好ましくは１５ないし２０ヌクレオチドが比較的長いプ
ローブ、例えば３０ないし２００ヌクレオチド、好まし
くは４０ないし５０ヌクレオチドと組合せて使用される
。２番目のプローブは確認のために使用することができ
、そしてＤＮＡセグメントの同定のためには常に必要で
はない。

好ましくは、プローブの一方、そしてもっと好ましくは
長い方のプローブは以下に記載する規則工ないし４に従
って設計される。

規則１．ユニエＺ区先並 他の配慮なしに、類似の哺乳類遺伝子中の支配的または
類似の配列にマツチしたヌクレオチドが選ばれた。Ｍｅ
ｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ａ　ｅｉｎｈム、　１８：　　
（１９８２）参照。

規則２．宜■友旦工対金 ヌクレオチドＧは、その相補体Ｃへの結合に加えて、ヌ
クレオチドＴと弱い結合を生成し得る。

Ａｇａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｗ。

２５６　　：　１０２３　（１９８１）参照。このため
、不確実なコードンの第３の部分のためＧまたはＡの選
択に直面して、Ｇを選ぶことが好ましい。それはもし生
ずるハイブリッド化が該位置の実際のヌクレオチドがＣ
でなく、Ｔであってもおこるならば、該ハイブリッド化
はなお安定であるからである。もし誤ってＡが選ばれた
ならば、対応するＡ：Ｃ不和合性はプローブがゲノムＤ
ＮＡとハイブリッド化する能力を破壊するのに十分であ
り得る。

規則３．Ｌ別記Ａ至皿避 可能性ある不確実性から選択する時、コードン内にせよ
、コードン間にせよ、５’ＣｐＧ配列を含まないヌクレ
オチドを選択せよ。

規則４．−（ヌニζｚｊ」１置 使用のためコードン配列を選ぶにあたり、分子の末端近
くのミスマツチは、分子の中心近くのミスマツチはどハ
イブリッド化に悪影響しないとの仮説が考慮された。こ
のため、例えば特定のコードンの配列に関して実質的な
疑問が発生し、そしてそのコードンがプローブの中心に
近い場合、傾向は該コードンについて可能性あるヌクレ
オチド配列の給源をテストすることであったが、プロー
ブの末端近くのコードン位置はコードン優先性に基づ（
決定の対象らしかった。

４５−マープローブのため選ばれた配列およびアミノ酸
配列、可能性あるＤＮＡ配列、および実際のプローブ配
列、すなわちＡＨＦエクソンのために決定された実際に
コードするストランドの相補体は第３図に示すとおりで
ある。

このようにして、選択を含むヌクレオチド位置の中で、
３種が両方の可能性あるヌクレオチド選択群を含む給源
を使用することによってカバーされ、５種が正しく予測
され、１種が正しくないが幾分中立性を維持することが
予測され、そして他の４種は誤りであった。　約１１％
のミスマツチ（５／４５）にもか＼わらず、４５−マー
オリゴヌクレオチドの給源は、以下記載するようにブタ
ＡＨＦ遺伝子断片を強く同定するために適切である。

実施例３　ブタゲノムライブラリーのスクリーニング ブタゲノムライブラリーがバクテリオファージベクター
ラムダＪ１を使用して構成される。ラムダＪ１はＬ　４
７．１　　（Ｌｏｅｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、
　２０　：　２４９　　（１９８０）　”）から、１．
３７ｋｂおよび２．８３　ｋｂ　Ｅｃ。

Ｒ１−ＢａＩＩ＋旧断片を９５　ｋｂ　ｔ！ｃｏ　Ｒ１
−Ｈｌｎｄ　　ＩＩ−Ｘｂａ　１−ｂｇｌ　　ＩＩ−Ｂ
ａｇ　ＩＩポリリンカーによって置換することによって
得られるｅ　６．６　ｋｂ　Ｂａｇ旧断片はその時Ｌ　
４７．１に関して逆の配向の直接の反復体として存在す
る。　Ｂａｇ　Ｈ１断片についてクローニング能力は８
．６〜２３．８ｋｂである。　Ｂａ＋ｍ旧開裂ブタＤＮ
Ａ　（Ｐｉｃｃｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ＋　
３０：２０５　　（１９Ｂ２）に記載のように調製した
）をフェノール抽出し、エタノール沈澱し、そしてマイ
クロフユージ中の遠心によって濃縮する。Ｂａｌ１ｌＩ
ＩブタＤＮＡ０．６７ｐｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（前
出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、、　４７４頁）１０単
位を含む１０ｔｔｌリゲーシツン緩衝液中において、前
出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　２７５−２７９
頁に記載するように調製したラムダＪＩＢａ＋ｍ旧アー
ムの２μｇヘリゲートする。リゲートしてＤＮＡはパッ
ケージされ、そして前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、
、　２９１頁に記載されているようにプレートされる。

約４Ｘ１０５ｐｆｕが、８．　　ＯＯＯｐｆｕ／プレー
トの割合でＮＺＣＹＭアガロースを収容した１５ｃｍプ
ラスチソクプトリ皿上のＥ、　ｃｏｌｉ株Ｃ６００上に
プレートされる。これら組換えファージは前述の４５−
マープローブを使用して一〇〇の方法（１９７９）によ
ってスクリーニングされ、プローブとして、前述のよう
に３２ｐで放射標識される。フィルターが次に５　ｘｓ
ｓｃ、　　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ＋　　０．１％ＳＤ
Ｓ。

および５Ｘ１０’ｃｐｍ／淑プローブ中で、４５℃にお
いて１６時間ハイブリッド化され、５ｘｓｓｃ。

０．１％ＳＤＳ中５０℃中塊０され、そして高輝度スク
リーン（デュポン　ライトニンクープラス）を使用する
オートラジオグラフィーへかけられる。

オートラジオグラフィーは、種々の程度で４５−マーと
ハイブリッド化したファージを明らかにする。フィルタ
ーは次に０．５　Ｍ　ＮａＯＨ中で変性され、１．０Ｍ
）リスｐＨ７，５，１，５Ｍ　ＮａＣＪｌ中で中和され
、そしてハイブリッド化および洗浄温度が３７℃である
ほかは４５−マーについて記載したとおりに１５−マー
へハイブリッド化する０両方のプローブへハイブリッド
化された一つのファージを元のプレートから取り、そし
て１００ｐｆｕをプレートし、熔菌斑を前記のように１
５−マーをプローブとして用いてスクリーニングする。

ＰＢ　３４と命名された陽性ファージをプラグとして取
り、そして前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　６５
−６６頁に記載されているようにプレート溶解質をつく
るために使用した。小規模のＰＢ３４ＤＮＡの単離が前
出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ−＋　３７１−３７２
頁記載の操作を使用して達成される。こＤＮＡのｌＯμ
ｌを制限酵素Ｈａｅ　ｍで切断し、次に子ウシアルカリ
性フォスファターゼ（ベーリンガーマンハイム）を使用
してラオスファターゼ処理された。フェノール抽出した
後、Ｓｍａ　１切断Ｍ１３ｍｐ８　Ｄ　Ｎ　Ａを添加し
、溶液を０．２ＭＮａｃｉ、とし、そして２容積のエタ
ノールの添加によって核酸を沈澱する。沈澱したＤＮＡ
は遠心によってペレット化され、そしてリゲーション混
合物２μｌ中に再熔解され、そしてＤＮＡは２３℃で３
０分間リす−トされ、リガーゼ緩衝液で５０μｌへ希釈
され、さらに３時間リゲートされる。この反応物５μｌ
がＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０１／ＴＧ　１株を形質転
換するために使用される。

細胞は、３０８Ｍ培地５０献中（ＳＯＢＭは、トリプト
ン２％、イースト抽出物０．５％＋　Ｎａα０．　Ｉ　
Ｍ、　ＫＯＨｏ、　１１　ｇ／　Ｉｌ、　　２０　ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏｉである）３７℃で０、０．　ｗａ　　Ｏ，
５まで発育させることによって形質転換に対して適応さ
せる。細胞は２５００ｒｐｍにおいて１０分間４℃にお
いて遠心することによってペレット化される。細胞は、
１００＋ＭＲｂＣ１，４５ｍＭ　　ＭｎＣｅｇ　　、　
　　５　０　１１Ｍ　　ＣａＣｌ１ｚ　　、　　　１　
０　　ｓ＋Ｍ　　ＭＥＳ　　カリウムｐＨ６，４（ＭＥ
Ｓ＝メチルエタンスルホン酸）３．５ｄ中に再懸濁され
る。

適切な細胞２００μｌがリゲーシッン反応物５献中に含
まれるＤＮＡで０℃において３０分間形質転換される。

細胞は次に４２℃で９０秒ヒートショックされ、その後
静止ＪＭ　１０１／ＴＧ　１細胞１００ｔｔｌを含有す
ル０．８％アガＯ−Ｘ　／ＳＯＢＭ　４　ｄが添加され
、１０３　ＳＯＢＭアガロースベトリ皿上にプレートさ
れる。

１５−マーヘハイブリッド化する、ＰＢ　３４がらのＨ
ａｅ　ｍ断片を含んでいるサブクローンが、前出のＢｅ
ｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ　ｌｒ）操作を使用してスク
リーニングすることによって同定される。このクローン
が単離され、鋳型として使用するために調製される。　
３４−Ｈｌと命名された、このクローン中に存在するＨ
ａｅ　ｍ断片のＤＮＡ配列が第５図に示されている。Ｍ
　１３鋳型ＤＮＡは感染させた細胞を３７℃で５時間生
育することによって調製される。細胞はベックマンマイ
クロフユージ中で１０分間遠心することによってペレッ
ト化される。上清１．Ｏｄ（ビールスを含んでいる）を
除去し、２０％ポリエチレングリコール、　２．５Ｍ　
Ｎａｌ：ｊ！２００　ｐ　１を加える。このサンプルを
次に室温で１５分間インキュベートし、ベソクマンマイ
クロフユージ中で５分間遠心する。ペレットをＴＥ１０
０ｄ中に溶解し、４　Ｍ　ＮａＣＨａＣＯＯｐＨ４，５
の７．５μｌを加え、そしてサンプルをフェノール−ク
ロロホルム１：１混合物で２回、そしてクロロホルムで
１回抽出する。単一ストランドのファージＤＮＡを次に
エタノール２容積の添加によって沈澱させる。沈澱した
ＤＮＡはベックマンマイクロフユージ中の遠心によって
ペレット化し、１１１１ＭトリスｐＨ８，０゜０、　ｌ
　ｍＭ　ＥＤＴＡ　３０μ！中に溶解する。ＤＮＡ配列
決定は、１５−マーをプライマーとして使用し、ジデオ
キシ鎮成端技術によって実施する。　Ｓａｎｇｅｒａｔ
　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７４　　：５
４６３　（１９７７）参照。

第４図および第５図に示した配列中に含まれる、観察さ
れた配列は、第１に表した６９Ｋｄ断片の７ミノ末端配
列中のフェニルアラニン２からグルタミン七までの区域
によって囲まれた同じ１４個のアミノ酸を含むので、該
サブクローンがブタＡＨＦエクソンを含んでいることを
確認した。それ以上の確認は、３４−Ｈｌベクター中の
ポリリンカーの隣接点にユニバーサルプライマー（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　）をブライ
ミングすることにより、３４−Ｈｌベクター中のＨａｓ
　ｍインサートの５′端から配列決定することによって
得られた。また、３４−Ｈｌと命名されたこのクローン
からのインサートは、ＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ１および旧ｎ
ｄｎｌで制限し、子ウシアルカリ性フォスファターゼで
フォスファターゼ処理し、そしてＥｃｏ　ＲＩ＋旧ｎｄ
　ｍ開裂旧３ｓｐ９ＤＮＡヘリゲートすることにより、
Ｍ１３＋ｗｐＱ中へ再クローンされた。ユニバーサルプ
ライマーに関してＨａｅ　ｍセグメントの反転を含有す
るこのクローンも前述のように配列決定された。インサ
ート３４−旧のすべてについての得られた配列データは
第５図に示されている。この配列は、このサブクローン
は、ヌクレオチド１６９から２６７までにおいて、６９
Ｋｄ断片（第１図）のフェニルアラニン２からアルギニ
ン３１までの少なくとも３０個のアミノ酸をコードでき
るブタＡＨＦ遺伝子のエクソンを含有していることを確
認する。

成端コードンはすべての三つの読み取りフレームにおい
てヌクレオチド２６７　（第５図）から下流に発見する
ことができ、そして一致した５”継木部位配列もヌクレ
オチド２６６−２６７間の該区域に発見されるので、ア
ルギニン３１はイントロンを境界するように見える。さ
らに、下流ＤＮＡによってコードされるであろうアミノ
酸配列は、ブタＡＨＦの６９Ｋｄ断片に観察されるそれ
と完全に異なっている。

ＰＢ３４ＤＮＡはＲａｍ　ＩＩで切断され、そしてアガ
ロースゲルを通して電気泳動され、そしてゲルを５μｇ
／ｍ臭化エチジウム中で染色した後紫外線によって可視
化された。約６．６ｋｂ、　　６．Ｏｋｂ、　　１゜８
ｋｂの三つのインサートが観察された。ゲル中のＤＮＡ
は前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　３８３−３８
６頁に記載のようにニトロセルロースへ移された０口過
物の１５−マーへのハイブリッド化およびオートラジオ
グラフィーが前述のように実施れさた。オートラジオグ
ラフィーは、６．０ｋｂバンドが１５−マープローブへ
ハイブリッド化されたＡＨＦ遺伝子断片を含んでいるこ
とを示した。

このように、ブタＡＨＦをコードする遺伝子の部分がは
じめて単離され、同定された。バクテリオファージラム
ダ組換えクロンＰＢ３４は、ＡＴＣＣ４００８７として
アメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託
されている。

実施例４　ヒトＡＨＦ　　　　の Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　　１５
　：　６７８　（１９７８）によって記載されたヒトゲ
ノムライブラリーが、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＬＥ　３９２株（一般に入手可能）を６Ｘ１
０６ｐｆｕで感染させ、そして１５　ｃｓ　ＮＺＣＹＭ
寒天プレート上に２０．０００　ｐｆｕ／プレートの密
度でプレートすることにより、ヒトＡＨＦ遺伝子につい
てスクリーニングされる。これらファージは前出のＢｅ
ｎｔｏｎおよびＤａｖ　ｉ　ｓの操作を用い、実施例３
に記載した６、０ｋｂブタブタＦ断片でスクリーニング
し、プローブとしてニックトランスレーションによって
３２ｐで標識される。強いハイブリッド化信号を示すフ
ァージを採取し、約１００　ｐｆｕ／１０Ｇｍプレート
でプレートし、一方のプローブとして放射標識した４５
−マーを、そして他方のプローブとして６．０　ｋｂ　
Ｂａｇ旧断片を使用し、前述のように二重にスクリーニ
ングする。両方のプローブへハイブリッド化するＨトコ
５と命名されたファージが同定され、プレートストック
がつくられ、そして前述のようにラピッドブレツブＤＮ
Ａが調製される。ファージＤＮＡがＳａｕ　３Ａ　Ｉで
切断され、子ウシアルカリ性フォスファターゼでフォス
ファターゼ処理され、フェノール抽出され、そしてＢａ
＋ｗ　Ｈ１切断Ｍ１３＋ｗｐ８　Ｄ　Ｎ　Ａの２０ｎｇ
と共沈される。沈澱したＤＮＡは遠心によってペレット
化され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含有するりガーゼ緩衝液
２μβ中に再溶解される。リゲーシ四ンは１６℃におい
て２分間実施され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含有するりガ
ーゼ緩衝液５０ＩＩＩｌへ希釈され、１６℃でさらに３
時間インキエベートされる。この反応混合物５μｌが実
施例に記載したようにＥ。

ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０１／ＴＧ　１株を形質転換するた
めに使用される。

溶菌斑がＢｅｎ　ｔｏｎおよびＤａｖｉｓ操作を使用し
、そして放射標識した１５−マーでプローブすることに
よってスクリーニングされる。ハイブリッド化を示す２
５−３１と命名されたファージ溶菌斑が単離され、そし
て単一ストランドファージＤＮＡが前記のようにＤＮＡ
配列化鋳型として使用するために調製される。配列化は
、プライマーとして１５−マーを使用し、前出Ｓａｎｇ
ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、によって記載されたジデオキシ鎖成
端技術を使用して実施され、そして第６図に示す情報ス
トラン、ドＤＮＡ配列を与える。この態様で配列化され
た８４ヌクレオチドは、ブタＡＨＦの相同区域と８５％
の相同を示した。第１図に示したブタＡＨＦ６９Ｋｄ区
域２−１６と、第６図のヒトヌクレオチド配列から推論
した対応する区域との間には、たった１個のアミノ酸の
違いがある。この高い程度の相同は、組換えファージＨ
Ｈ−２５のＤＮＡはＡＨＦ遺伝子から発散することを示
す。

このように、ヒトＡＨＦ遺伝子のためのエクソンがはじ
めて単離され、同定された。バクチリオファシラムダ組
換えＨトコ５は、寄託番号ＡＴＣＣ４００８６としてア
メリカン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託さ
れている。

実施例５　　ＡＨＦ　　　　に　　　る　　の上に記載
したブタおよびヒトＡＨＦエクソンは種々の機能のため
に有用であり、その一つは生体内においてＡ）（Ｆ合成
部位である組織の同定を許容するスクリーニング剤とし
てである。ＡＨＦの天然の発現の途中に生成されるｍＲ
ＮＡに対する正確な相補体としてエクソンを使用するこ
とを基礎とする多数の方法が利用可能である。このスク
リーニング操作において、生体の各種の部分からの組織
がその内に含まれるｍＲＮＡを放出するように処理され
、そしてＡ　ＨＦに対するエクソンを含んでいるＤＮＡ
断片へハイブリッド化され、そしてもしｍＲＮＡの分子
がそのエクソンへハイブリッド化すれば、該ｍＲＮＡの
源である組織がＡＨＦＯ源である。

１、　スフ１−ニング 腎臓、肝臓、すい臓、ひ臓、骨髄、リンパ節等を含む、
種々の器管からのブタおよびヒト組織が、その記載を参
照とじこ＼に取り入れるＣｏｘ、　Ｍｅｔｈｏｄｓｂス
■匣工、　１２Ｂ　：１２０　　（１９６８）によって
記載されたグアニジン塩酸塩抽出により、いくつかの修
飾を加えて調製される。要約すれば、組織は、８ｉグア
ニジン塩酸塩（またはその記載をこ＼に参照として取り
入れたＣｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ１８　：　５２９４　（１９７９）によ
って提案された４Ｍグアニジンイソチオシアネート、ま
た前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、、　１８９頁その
他を参照）、５０Ｉｌ１Ｍトリス（ＰＨ７，５）　、　
　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ中へ体外移植し、最高スピード
で１分間オムニミキサー（Ｓｏｒｖａｌｌ　）中でホモ
ジナイズする。ホモジネートを５ｏｒｖａｌｌ　ＨＢ＝
４０−ター中で５分間５０００ｒｐｍで清澄化し、ＲＮ
Ａを０．５容積のエタノールの添加によって沈澱する。

該ＲＮＡは熔解し、水に溶解する前に６ｉグアニジン塩
酸塩からさらに３回沈澱する。

この給源からのメツセンジャーＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ
　）セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ）上のクロマトグラフィーによってエンリッ
チされる。

このｍＲＮＡは次に、前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、＋　２０２−３頁に記載されているように、ホルム
アルデヒドを含有するアガロースゲルを通る電気泳動頁
かけられる。ゲル中のｍＲＮＡは次にニトロセルロース
フィルターへ移される（前出Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａ
ｌ、、　２０３−４頁）。

このようにして得られたｍＲＮＡは、上で得られた放射
標識したブタまたはヒトエクソンＤＮＡでハイブリッド
化され、ハイブリッドの存在がオートラジオグラフィー
によって検出される。放射性信号は、ｍＲＮＡの組織源
は体内におけるＡＨＦ合成の源であることを指示する。

代わりに、ｍＲＮＡはＳ１保護スクリーニング法によっ
てスクリーニングされることができる。

Ｓｌヌクレアーゼは、単一ストランドＤＮＡを加水分解
するが、しかしハイブリッド化したｍＲＮＡ／ＤＮＡの
ような塩基対合したヌクレオチドは加水分解しない酵素
である。このため、アクリルアミドゲル電気泳動および
オートラジオグラフィー後の放射性バンドの存在は、Ａ
）（Ｆエクソンに対応する単一ストランドＤＮＡが相補
性ｍＲＮＡ、すなわちＡＨＦに対するｍＲＮＡによって
保護されていることを示す。このため、このｍＲＮＡの
源であった組織は生体内におけるＡＨＦの合成部位であ
る。このスクリーニング方法は上に記載したスクリーニ
ング方法よりもいくらかはもっと感受性である。

該ｍＲＮＡに対し相補性である、単一ストランドの放射
標識されたＤＮＡよりなるプローブが、ブタゲノムサブ
クローン３４−旧のＤＮＡ合成を開始するためＭ１３の
ユニバーサルプライマーを使用して合成される。この反
応は、５０＋ｗＭ）リスｐＨ７，４，５＋＋＋Ｍ　　Ｍ
ｇＣＪ！ｚ　、　　１ｍＭ　２−メルカプトエタノール
＋　　５０＋ｍＭ　　ＮａＣｅ、ユニバーサルプライマ
ーｌＯｎＬ　３４−５３鋳型ＤＮＡ２００−４００　ｎ
ｇ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｅ、　ｃｏｌｉ
　）のＫｌｅｎｏｗ断片の溶液１００μ！中で実施され
る。反応液は２３℃で６０分間、７０℃で１０分間イン
キュベートされ、Ｐｓｔ１５０単位が添加され、追加の
６０分間インキュベートされる。

反応はフェノール／クロロホルム抽出によって停止され
、Ｎａ（ｊ！が０．２Ｍへ添加され、そして次に１００
％エタノール２容積で沈澱される。沈澱したＤＮＡは遠
心によりペレット化され、２０％シェークロース、５０
　ａ＋Ｍ　ＮａＯＨ，０，１％クレゾールグリーン中に
再熔解され、そして次に５０ａ＋Ｍ　ＮａＯＨ。

１０ｓＭＥＤＴＡ中の２％アガロースを通して電気泳動
される。得られる単一ストランド断片はオートラジオグ
ラフィーによって探索され、バンドが切除され、そして
ＤＮＡが透析チューブ中の電気溶離によって単離される
。

サンプルｍＲＮＡは、上述のグアニジン塩酸塩法によっ
て肝臓、ひ臓等の組織から調製される。

次にプローブは、５０％ホルムアミド、０．４ＭＮａａ
ｚ、　　４０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ　Ｃピヘラジ／−Ｎ、Ｎ
’−ビス（２−エタンスルホン酸））ｐＨ６，５，１ｍ
ＭＥＤＴＡ、５−５０Ｍｇ　　ｍＲＮＡ、１５ｔｔｌ中
２μｇの標識ＤＮＡ中で、サンプルｍＲＮＡ（オリゴ（
ｄＴ）クロマトブラフイーエンリッチステップから得ら
れた）へハイブリッド化される。ハイブリッド化は、冷
たいＳ１ヌクレアーゼ緩衝液２００μｌ１（０，２５Ｍ
　ＮａＣｅ、　　０．３Ｍ　ＮａＣＨ３ＣＯＯ，ｐＨ４
，５）　、　　１ｍＭ　ＺｎＳＯ４゜５％グリセロール
、３１ヌクレア一ゼ１０００単位の添加によって停止さ
れる。サンプルをフェノール抽出し、イーストｔＲＮＡ
１０μｇと共にエタノール沈澱し、そしてＭａｘａｍ−
Ｇｉｌｂｅｒｔ、　ＰＮＡＳ　ＩＪ。

Ｓ、Ａ、　７４　　：　５６０　（１９７７）に記載し
た５％ポリアクリルアミド配列決定ゲルを通す電気泳動
にによる分析へかける。

実施例６　　　かＡＦＨ’ｍＲＮＡをえるてたｍＲＮＡ
の源である組織が同定されれば、該組織からのＡＨＦｍ
ＲＮＡが抽出され、ＣＤＮＡライブラリーを構成するた
めに使用れる。このｃＤＮＡライブラリーは、以下に記
載するようにゲノムクローン中に含まれたイントロンな
しに、ＡＨＦのアミノ配列をコードする全長さのＣＤＮ
Ａクローンを同定し、構成するために用いられる。その
後で、ＡＨＦタンパクをコードするｃＤＮＡが、ＡＨＦ
発現のため適当な宿主中の適当な発現ベクター中に挿入
される。

ヒトＡＨＦは血友病治療または他の用途のため大きい需
要があるので、ヒトＡＨＦｃＤＮＡの調製を記載する。

１、　ヒトＡＨＦのためのｍＲＮＡの ＡＨＦ合成に責任あるヒト組織からのｍＲＮＡは、前に
記載したようにＣｏｘにより記載され、Ｃｈｉｒｇｗｉ
ｎによって修飾されたグアニジン塩酸塩法によってｆｊ
Ｊｆ！！された。

オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーカラムか
ら得られたｍＲＮＡのそれ以上の分画は、１０ｍＭトリ
ス−Ｈα（ｐＨ７，４）、４ｍＭＥＤＴＡおよび０．２
％ＳＤＳを含む５−２０％シェークロース勾配上にベッ
クマン５Ｗ２８中において２４時間２２．００Ｏｒｐｍ
で遠心することによる沈澱によって得られる。分画（１
，ＯｍＲ）が集められ、酢酸ナトリウムが０．２Ｍまで
添加され、そして分画は水に溶解する前に２回エタノー
ル沈澱された。分画したＲＮＡ０サイズ分布は、２．２
１’ｌホルムアルデヒドを含有する１、４％アガロース
ゲルを通す電気泳動によって決定された。

２８より大きいＳ　（Ｓｖｅｄｂｅｒｇ）価を有するｍ
ＲＮＡ沈降物を二重ストランドｃＤＮＡの合成のために
プールする。このＲＮＡの１０Ｍｇを１０ｍＭメチル水
銀ハイドロオキサイド１０μｌ中において室温で変性す
る。１４０ｎＨの２−メルカプトエタノールをメチル水
銀ハイドロオキサイドを不活性化するために添加する。

次にＲＮＡは、１４０ｍＭ　ＫＣ７！、　　１００　ｍ
Ｍ　）リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，３、４２℃）。

各デオキシヌクレオチドトリフオスフェート１ｍＭ。

２００μｇ／ｍＪｌオリゴ（ｄＴ）　１２−１８．１０
ｍＭ　　Ｍｇα２゜および０．１μＣｉ　３２ｐ−ｄＣ
ＴＰ　／献を含んでいる５０μｌへ希釈される。これら
反応は、ＡＭＶ逆トランスクリプターゼ（Ｌｉｆｅ　５
ｃｉｅｎｃｅｓ　）　　１７単位／μｌの３μｌを添加
した後、４２℃で１時間実施される。反応は０．２５Ｍ
　ＥＤＴＡ　（ｐ　Ｈ８，０）を２０ｍＭまで添加する
ことによって停止される。得られる混合物はフェノール
／クロロホルム（１：１）の等容積で１回、そしてクロ
ロホルムで１回抽出される。次にサンプルは１０ｍＭ）
リス−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，０）　、　　１００ｍＭ　
　Ｎａａｚ、　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ中に平衡化したセ
ファロースＣＬ−４８カラム（ファルマシア）５献上で
クロマトグラフィーされる。空容積が集められ、そして
核酸（ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを含んでいる）が
エタノール２．５容積の添加によって沈澱される。

好ましくは、上の操作と組合せて、Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅ
ｔａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　　３０３：　　８２１　（
１９８３）に記載されているように、ＡＨＦエクソンオ
リゴヌクレオチドセグメントも逆転写を開始するためオ
リゴｄＴｒの代わりに使用される。

ＲＮＡ−ｃＤＮＡは脱イオン水３５μ！中に溶解され、
１００＋＋＋Ｍカコジル酸カリウム（ｐＨ６，８）。

１００μＭ　ｄＣＴＰ、１ｓ？１２−メルカプトエタノ
ール、１ｓ＋Ｍ塩化コバルトを添加し、そしてデオキシ
チジルターミナルトランスフエラーゼ（ｐＨＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）　１０単位を加え、反応物を３７℃で
３０秒間インキュベートすることによって酵素的に連部
処理される。反応は０．２５ＭＥＤＴＡを１０ｍＭまで
添加することによって停止される。トリス−ＨＣｊ！　
（ｐＨ８，０）を３００ｍＭまで添加し、そしてサンプ
ルはフェノール／グロロホルム（１：　１）の等容積で
１回、そしてクロロホルムの等容積で抽出される。核酸
はエタノール２．５容積の添加によってこの生成物から
沈澱される。

ｄＣＣ郡部処理れたハイブリッド分子は、ｌ。

ｍＭ　ＫＣｅ中１７０＃ｇ／ｍｅオリゴ（ｄＧ）　１４
−１８セルロースで４３℃にて１０分間、そして２３℃
にて１０分間アンニールされる。この反応生成物は次に
１００＋＋＋Ｍ硫酸アンモニウム、１＋ｎＭ２−メルカ
プトエタノール、１００ｍＭＭｇＣ１ｚ　、　　１００
μｇ／ｄウシ血清アルブミン（シグマ、コーンファクタ
ーｖ）、および１００μｉニコチナマイドアデニンジヌ
クレオチドを含む１００μｌへ希釈される。

２番目のストランドのｃＤＮＡ合或は、ＲＮアーゼＨ（
Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　　１単位、Ｅ、
　ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ１単位、およびＤＮＡポリ
メラーゼ■１０単位を添加することによって開始され、
そして１６℃で１２時間インキュベートされる。

次にサンプルは前に記載したようにセファローズＣＬ−
４Ｂ上でクロマトグラフィーされる。二重ストランドＤ
ＮＡはエタノール沈澱され、そしてＲＮＡ−ｃＤＮＡハ
イブリッド尾部処理について記載したようにｄＣＣ郡部
処理れる。

２、　ヒトＡＨＦ　　ＤＮＡについてスフ曹−ニング上
に記載したようにして得られたｄＣ尾分処理された二重
ストランドｃＤＮＡは、１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ！　（
ｐＨ８，０）　、　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　　１００
ｍＭ　　ＮａＣ１中３７℃で２時間等モル量のｄＧ尾公
娼理ｐＢＲ３２２Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ　）でアンニールされる。

アンニールされたキメラ様分子はバクテリア形質転換に
使用するまで一２０℃で冷凍される。

バクテリア形質転換は、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＭＣ１０６１
株（ソース）を使用して実施される。ｓｉＩ胞（５０ｄ
）は６００ｎ−における光学密度０．２５まで生育され
る。

細胞は２５００ｒｐ−において１２分間遠心することに
よって濃縮され、無菌１００ｍＭ　　ＣａＣＪｌｚ中で
洗浄され、そして前に記載したように遠心によってペレ
ット化される。細胞は無菌１００ｓＭ　　ＣａＣｅｚ中
に再懸濁され、そして４℃に１２時間保たれる。

アンニールしたキメラ様分子は、適切な細胞２００μｌ
当たり５ｎｇの二重ストランドｃＤＮＡの比で４℃にお
いて３０分間インキュベートされる。

次にバクテリアは４２℃２分のヒートシラツクへかけら
れる。Ｌ−プロス１．　Ｏｄが加えられ、細胞は３７℃
で１時間インキエベートされる。細胞は次に５μｇ／ｄ
テトラサイタリンを含有するＬＢ−寒天プレート上にプ
レートされる。

ヒトＡＨＦクローンは、その記載を参照とじてこ＼に取
り入れたＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ　Ｐ
ＮＡＳＵ、Ｓ、Ａ、　７２　：　３９６１　（１９７５
）のコロニーハイブリディゼイション法を使用で同定さ
れる。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｌ−ブロス１５μｇ／
ｙｎＪｌテトラサイクリン寒天プレートの上に重ねたニ
トロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａ
ｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）上にプレートされる。コロニー
は３７℃で一夜生育され、次にフィルターは無菌Ｗｈａ
ｔｏ＋ａｎ　３Ｍペーパー上に置かれる。次にあらかじ
め湿したニトロセルロースフィルターをマスターフィル
ターに対して押し付け、これらフィルターを１８ゲージ
針を使用して止める。レプリカフィルターを次に３７℃
においてＬＢ−テトラサイクリンプレート上でコロニー
が１〜２ｃｍの直径に達するまで発育させる。

次にフィルターは１５０μｇ／ｍＲクロラムフェニコー
ルを含有するＬＢプレートへ移され、３７℃で１６〜２
４時間インキエベートされる。

次にフィルターが除去され、０．５　Ｍ　ＮａＯＨで室
温で５分間飽和させたＷｈａｔｍａｎ　３Ｍペーパー上
に置かれる０次ニフィルターはＩＭ　トリス−８０！　
（ｐＨ７゜５）　、　　１．５Ｍ　ＮａＣｊ！で飽和さ
せたＷｈａｔｍａｎ　３Ｍ上に、そして次に２ｘ標準食
塩クエン酸塩（ＳＳＣ）で飽和させたＷｈａｔｎ＋ａｎ
　３Ｍ上に置くことによって中和される。ＳＳＣ（ｌｘ
）は０．１５Ｍ　ＮａＣｅ、　　０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウムである。

フィルターを風乾し、減圧下８０℃で２時間焼付ける。

フィルターのプレバイブリプ・イゼイションは、１０ｍ
Ｍ）リス−Ｉｃｅ　（ｐＨ８，０）　、　　１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で３０分間、そして
７ｘ　ＳＳＣ，５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　（ｌｘ　
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは０．０２％ポリビニルピロリジ
ン、０．０２％フィコル、０゜０２％ウシ血清アルブミ
ンである）、１００μｇ／戴変性サケ精子ＤＮＡ、およ
び０．１％ＳＤＳ中３０分間で実施される。

上で記載したように調製した３２ｐ標識ヒトエクソンＤ
ＮＡが１０’　ｃｐｍ　／ｒｒｄｌまで添加され、ハイ
ブリディゼイションが３７℃で１２〜１６時間実施され
る。次にフィルターは７　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ
の数回の交換で３７℃において１〜２時間洗浄される。

次にフィルターは風乾され、コダックＸＡＲスクリーン
を使用してオートラジオグラフィーへかけられる。　バ
ックグランド上にハイブリデイゼイション信号を示すコ
ロニーが、プラスミドＤＮＡのラビットプレツブ精製の
ため、テトラサイクリン５μｇ　／ｍＡを含むし一プロ
ス中で生育される。プラスミドＤＮＡは、その記載を参
照としてこ−に取り入れたＨｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、
、＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１１４　　：ｔ９３（１９８１）の方法によって精製さ
れる。

このＤＮＡの部品標品を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ
ｌで開裂し、そして断片を１％アガロース／ＴＨＥゲル
を通して電気透析し、そしてその記載をこ−に参照とし
て取り入れたＥ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ＋
。

拒ｏ１．９８：　　５０３　（１９７５）の操作に従っ
てじみをつける。ニトロセルロースフィルターは、コロ
ニーハイブリディゼイションについて記載したように、
放射標識したヒトＡＨＦエクソンＤＮＡでハイブリッド
化される。ＡＨＦエクソンＤＮＡヘハイブリソド化する
Ｐｓｔｌインサートを含んだプラスミドがＤＮＡ配列分
析に使用される。

配列決定のため、プラスミドＤＮＡ　（培養物０゜７５
、ｄから前出Ｈｏ１ｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、の操作により
精製）が制附エンドヌクレアーゼ５ａｕ３ａ　Ｉで完結
まで消化される。３４−５ｌであると同定された生成し
たＤＮＡ断片は、第４図に図示したＤＮＡ配列を持って
いる。このＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出後エ
タノール沈澱され、ｌＯμｊ！！ＴＥ（１０ｍＭ）リス
−Ｈα（ｐＨ７，４）　、　　１０ａ＋Ｍ　　Ｍｇα２
，１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　　ＡＴＰおよ
び過剰のＴ４ＤＮＡリガーゼ１００＃Ｎ中において、Ｂ
ａｌ１ｌＨ１開裂Ｍ１３　ｍｐ　９の複製形ＤＮＡとリ
ゲートする。

リゲーションは１５℃において２〜４時間実施される。

　このリゲーション反応物５μｌは、前記したＥ、　ｃ
ｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ／ＴＧＩ株２００μｌを形質転換す
るために使用される０組換えは、Ｄａｖｉｓ　ｅｔａｌ
、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　３６　：　４１３　（１
９６８）によって記載されているベーターガラクトシダ
ーゼ活性のための指示としてＸ−ｇａｌを含んでいるＬ
Ｂ寒天プレート上で生育する時白い溶菌斑として同定さ
れる。

ヒトエクソンへハイブリッド化する組換えファージ包囲
配列は、その記載をこ＼に参照として取り入れたＢｅｎ
ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９６　　
：　　１８０　（１９７７）の操作により、放射標識し
たヒトＡＨＦエクソンをプローブとして使用して同定さ
れる。ハイブリディゼイション信号を示す溶菌斑を取り
、Ｌ−ブロス１．５淑培地中で生育させる。これら培養
物から調製した単一ストランドファージＤＮＡは、オリ
ゴヌクレオチドプライムＤＮＡ合成反応に鋳型として使
用される。配列化はジデオキシ鎖成端方法を使用して実
施される。例えば、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ
ＮＡＳ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４　　：　５４６３　（１９
７７）参照。

ヒトＡＨＦ組換え型はそれらのヌクレオチド配列をヒト
ＡＨＦのヒトエクソン配”ＦＪから既知のそれと比較す
ることにより同定される。

３、ブＡＨＦ　ｍＲＮＡ ヒ）ＡＨＦ組換え型は、全くヒト組織ｃ　ＤＮＡライブ
ラリーについて記載したように構成したブタ組織ライブ
ラリーをスクリーニングするために使用される。見込み
あるブタＡＨＦ組換えＤＮＡクローンは、先に記載した
ようにブタ３２ｐ標識工クソン断片を使用し、Ｇｒｕｎ
ｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ法によって同定される。プ
ローブは、その記載をこ−に参照として取り入れたＲｉ
ｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ１１
３３　　：２３７　　（１９７７）によって記載された
ニック−トランスレーションによって３２ｐで標識した
ブタＡＨＦエクソンセグメントである。

ハイブリディゼイションを示すコロニーは前記したラピ
ソドプレソププラスミド精製目的のために生育される。

プラスミドＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで
開裂され、１％アガロース／ＴＢＥを通して電気泳動さ
れ、Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　　（１９７５）の操作に
よってしみをつけられる。しみは３２ｐで標識したニッ
クトランスレートされたブタＡＨＦ組換えＤＮＡとハイ
ブリッド化される。

全長さのクローンは、この分野でよ（知られているよう
に（“遺伝子ウオーキング）、例えば両方のクローンに
共通な制限酵素部位において重複するクローンからのＤ
ＮＡ断片をリゲートすることにより、慣用の態様で構成
される。

４、　ステ　プ２または３からの　　ざのクローン辺ｆ
ｆｉむ 既存のクローンの５°端とｍＲＮＡの５゛端との間の距
離は、その配列が既存のＡＨＦクローンの５゛　（アミ
ノ末端）区域から由来するオリゴヌクレオチドブライマ
ーを使用し、＾ｇａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｂ、Ｃ，’韮（２１：　１０２３−１０２８　　（
１９８１）に記載されたブライマー延長技術によって分
析することができる。もしこの操作を用いて発達したゲ
ルが二辺上の転写を示せば、最も強いバンドが全体のｍ
ＲＮＡ転写を表しているものと考えなければならない。

しかしながら、５゛未はん訳配列の長い区域を含んでい
る多数のｍ　ＲＮ　Ａが存在する。このように、ヒトＡ
ＨＦ　　ＤＮＡの発現は完全なｃ　ＤＮＡクローンの獲
得次第であってはならない。例えば、配列分析によって
、メチオニンコードンと、続いて既知の真核タンパク分
泌信号と類似または同一であり、そして残りのコードン
を持つフレーム中にある配列の存在を示すクローンが得
られる。形質転換および発現は、予期されたサイズであ
りそしてポリ　（Ｔ）３’末端を含有するメチオニン分
泌信号配列を含有するクローンについて実施しなければ
ならない。

５、代替操作 前記１ないし３の方法の代わりとして、ブタまたはヒト
ＡＨＦのためのｃＤＮＡクローンは以下の態様でバクテ
リオファージヘクターを使用して同定されることが好ま
しい。

ＡＨＦ合成に責任あるヒト胎児肝臓組織からのｍＲＮＡ
が、実施例５のセクション１において述べたＣｏｘによ
り記載され、Ｃｈｉｒｇｈｉｎｅｔ　ａｌ、によって修
飾された、グアニジン塩酸塩法によって１１製された。

一番目のストランドのｃＤＮＡは、前出実施例６、セク
ション１に記載した操作によってポリＡ＋胎児肝１ｆｉ
ＲＮＡ１０μｇから合成された。

詳しくは、このＲＮＡｌ０μｇは１０ｍＭメチル水銀ハ
イドロオキサイド１０ｔｔｌ中で室温で変性された。２
−メルカプトエタノール１４０ｍＭがメチル水銀ハイド
ロオキサイドを不活性化するために添加された。次にこ
のＲＮＡは、１４０ｍＭＫα。

１００ｍＭ）リス−Ｈα（ｐＨ８，３，４２℃）、各デ
オキシヌクレオチドトリリン酸１ｍＭ、２００μｍｇ／
献オリゴ（ｄＴ）　１２−１８．１０　ｍＭ　Ｍｇα２
．および０．１μＣｉ　３２　ｐ−ｄＣＴＰ／献を含ん
でいる５０μｌへ希釈された。これら反応はＡＭＶ逆ト
ランスクリプターゼ（Ｌｉｆｅ　５ｃｅｉｅｎｃｅｓ）
　１７単位／ｐｉの３μβを添加した後、４２℃で１時
間実施された。

ブライマー延長したライブラリーの１番目のストランド
合成のため、独特な相補性３８マーの２００ピコグラム
がＣＨ３Ｈｇ０１１変性ステツプに含められ、そして反
応物は１４０ｍＭベーターメルカプトエタノール、　　
０．７Ｍ　ＫＣＩ、　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　　２０
ＩＩＩＭトリスーＨＣ１（ｐＨ８，３、４２℃”）　、
　ＲＮアーゼ（Ｂｉｏｔｅｃ）　１単位／ｌｔｌとなし
、５０℃で２分間および４２℃で２分間インキュベート
された。次にこれは１４０ｍＭ　ＫＣＩ、　　１００ｍ
Ｍ）リス−Ｈα（ｐＨ８゜３．４２℃）、各デオキシヌ
クレオチドトリリン酸１ｍＭ、　　１０ｍＭ　　Ｍｇα
２．および０．１μＣｉ　３２　ｐｄＣＴＰ／μｌを含
む５０μ！へ希釈された。反応物は１７単位／μｌＡＭ
Ｖ逆トランスクリプターゼ３μｌの添加後、４２℃で１
時間インキニーベートされた。

１番目のストランド合成後、反応物は１０ｍＭＭｇＣｅ
２．　５０　ｍＭ　）リスｐＨ７，４，５−Ｍ２−メル
カプトエタノール、７．５　ｍＭ　ＮＨ４ＳＯ３、各デ
オキシヌクレオチドトリリン酸２５０μｉを含む１５０
μｌへ希釈され、そして２番目のストランドの合成がＲ
Ｎアーゼ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　　１単位およびＤＮＡ
ポリメラーゼ１４５単位の添加によって開始された。

反応物は１６℃で８時間インキュベートされ、そしてＥ
ＤＴＡを２０ｍＭへ添加することによって停止され、水
で最終容積２００μｌとされた。次にＥｃｏＲ１メチル
化がＳ−アデノシルメチオニンを５０μ門へ、そしてＥ
ｃｏＲ１メチラーゼ４０単位を添加することによって実
施された。これら反応物は３７°Ｃで１時間インキュベ
ートされ、フェノール／クロロホルム抽出によって停止
され、１０ｍＭトリス−ＨＣ１！（ｐＨ８，０）　、　
　１＋ｎＭＥＤＴＡで平衡化されたアファデックスＧ５
０を用いてクロマトグラフィーされた。空容積をプール
し、エタノール添加によって沈澱させた。

ｃＤＮＡ分子は、５０ＩＩＩＭトリスｐＨ８，３，１０
ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　、　　１０ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、５０ｍＭ　ＮａＣ１，各デオキシヌクレオチ
ドトリリン酸５０μＭ、　１００μｇ／ｍ！卵アルブミ
ンおよびＴ４ポリメラーゼ５単位を含有する２００μｌ
中において鈍末端化された。反応は３７℃で３０分間イ
ンキエベートされ、次にフェノール／クロロホルム抽出
によって停止された。次に核酸はエタノール添加によっ
て沈澱された。

ＥｃｏＲｌ　　″リンカー　　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔ
ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）が次に、合計容積４５μ！
中において前出のＭａｎｉｔｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　
２４３頁の標準条件で、鈍化ｃＤＮＡヘリゲートされた
。反応はＥＤＴＡを１５ｍＭへ添加することにより停止
され、フェノール／クロロホルムで抽出された。核酸は
エタノールによって沈澱され、遠心によってペレット化
された。

リンカ−処理されたｃＤＮＡは１００μｉ　トリスＨα
（ｐＨ７，２）　、　　５ｍＭ　　Ｍｇｃｉ！ｚ　、　
　５０ｍＭ　ＮａＣ１２００μ！中に再溶解され、そし
てＥｃｏＲｌ　３００単位で３７℃で２時間消化された
。反応物は次にフェノール／クロロホルムで抽出され、
１０ｍＭトリス（ｐＨ８，０）　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
、　　０．ＩＭ　ＮａＯＨで平衡化されたセファロース
ＣＬ−４Ｂ上でクロマトグーｙ−ｙイーにかけられた。

空容積中のｃＤＮＡは集め、エタノールで沈澱し、遠心
によってペレット化された。

ｃ　ＤＮＡは、１０ＩＩＩＭトリスーＨＣｊ！　（ｐＨ
８，０）　、　　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ中に再熔解され、
そしてＥｃｏＲ１開裂フォスファターゼ処理ラムダＣｈ
ａｒｏｎ　２１ａ　Ｄ　Ｎ　Ａへ、ｃＤＮＡ対ベクター
ＤＮＡの種々の比率において標準リゲーション条件でリ
ゲートされた。リゲートされたＤＮＡはパッケージされ
、そして前出Ｍａｎｉｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　６４，
２５６頁に確立された操作を用いてタイターされた。該
ライブラリーはプレートされ、そして前出Ｂｅｎ　ｔｏ
ｎおよびＤａｖｉｓに記載された条件のもとで３２ｐ−
標識ヒトエクソンＤＮＡを使用してスクリーニングされ
た。約１０゜０００塩基対にまたがる重複するクローン
が得られ、そしてその実質的部分がヒトＡＨＦをコード
する１本の長い開いた読取りフレームを解明するために
配列化された。それから得られたヒトＡＨＦをコードす
る組換えＤＮＡヌクレオチド配列、および推論されたヒ
トＡＨＦのためのアミノ酸配列が第７図に示されている
。重複するクローンが当分野で良く知られた慣用技術を
用い、すなわち重複するクローンからのＤＮＡ断片を両
方のクローンに共通な制限酵素部位においてリゲートす
ることにより、ベクターｐＳＰ６４　（Ｐｒｏｍｅｇａ
　Ｂｉｏｔｅｃ）中にアセンブルされた。ｐＳＰ６４−
■と命名された、第７図に示したヌクレオチド配列を含
んでいるｐＳＰ６４組換えクローンは、アメリカン、タ
イプ、カルチャー、コレクションに寄託されている。

実施例７　ヒト　たはブ　ＡＨＦの この実施例は、実施例６の方法によって得られた全長さ
のクローンを同時形質転換系に用いる、ＡＩ−ＩＦの発
現を意図する。

１、ＡＨＦ形質転換ベクターを得るための直接法を以下
に記載する。ｐＣＶＳＶＵプラスミドをＰｓｔｌで部分
的に消化し、消化物をゲル電気泳動上で分離する、可視
化後、全長さのプラスミドに相当する線状ＤＮＡ断片を
ｐＣＶＳＶＬ−Ｂｌとして単離する。

ＡＨＦのためのｃＤＮＡ実施例５のクローニングベクタ
ーからＰｓｔ　Ｉによる部分消化によって救出する０部
分的消化物をゲル電気泳動上に分離し、そして全長さの
ｃＤＮＡの分子量に相当するバンドを単離する。ｐＣＶ
ＳＶＬ−８１をこのＤＮＡ断片でアンニールし、１５℃
においてＴ４リガーゼでリゲートシ、Ｅ、　ｃｏｌｉ　
ＨＢ　１０１株中へトランスフェクトし、トランスフォ
ーマントをテトラサイタリン耐性について選択する０選
択したＥ、　ｃｏｌｉ　トランスフォーマントをテトラ
サイクリン存在下に育成する。プラスミドｐＣＶＳＶＬ
−Ｂｌａが慣用方法で回収される。該プラスミド中のｃ
ＤＮＡの適切な配向は、適当なエンドヌクレアーゼによ
る不斉消化により慣用態様で決定することができる。

２、：　　　および プラスミドｐＣＶＳＶＬ−ＡｌａもしくはｐＣＶＳＶＬ
−Ｂｌａと、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ＃３　　（前出Ｋａ
ｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）とを混合Ｌ（５０μｇＨ
Ｐおよび０．５１Ｊ　ｇ　ｐＡｄＤ２６ＳＶｐ＾＃３）
、そしてＮａ０Ａｃ　ｐＨ４，５を０．３Ｍへそしてエ
タノール２．５容積の添加によって再沈澱する。沈澱し
たＤＮＡを風乾し、２Ｘ　ＨＥＢＳＳ　（０，５ｄ）中
に再懸濁し、そして記載（前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　
ａｌ、　）のように０．２５　Ｍ　ＣａＣ１ｚ　　（０
，５ｍ）と激しく混合する。カルシウム−フォスフェー
ト−ＤＮＡ沈澱を室温で３０分間落着かせ、そしてＣＨ
ＯＤＵＫＫ−Ｂｌ細胞（Ｃｈａｓｉｎ　　およびＵｒｌ
ａｕｂ　１９８０．コロンビア大学から入手可能）へ適
用する。これらの細胞の発育および維持は記載されてい
る（前出Ｋａｕｆｍａｎｅｔ　ａｌ、およびＣｈａｓｉ
ｎおよびＵｒｌａｕｂ、　１９８０）。

このＤＵＫＫ−Ｂｌ　ｉｌｌ胞をトランスフェクション
前に５Ｘ１０’／１０ａａ皿で２４時間副次培養する。

室温で３０分間インキュベートした後、１０％ウシ胎児
血清を含む培地を適用し、細胞を３７℃で４．５時間イ
ンキュベートする。該培地は次に、１０％ウシ胎児血清
、チミジン、アデノシンおよびデオキシアデノシン１０
μｇ　／ｄ、それにペニシリンおよびストレプトマイシ
ンを含むａ−培地２戴の単層から除去される。２日後該
細胞は１：１５の割合で１０％透析ウシつ児血清、ペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含み、ヌクレオチド
を欠くａ−培地中へ副次培養される。ａ＋胞は次に４〜
５日後同じ培地を再び供給される。

選択培地中への副次培養１０〜１２日後、コロニーが出
現する。ＡＨＦ遺伝子のメトトレキセート（ＭＴＸ）選
択および検出、選択遺伝子増幅はＡｘｅｌ　ｅｔ　ａｌ
、の米国特許第４．３９９．２１６号、または前出のＫ
ａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、に従って実施される。

ＡＨＦ収率は、ＤＵＫＫ−Ｂｌ細胞の代わりに、永久細
胞ラインＨＡ、　ｈｙ９２６　　（Ｅｄｇｅｌｌ　ｅｔ
　ａｌ、、　　”Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　”　８０　：　３
７３４−３７３７　（１９８３）　）を同時形質転換す
ることによって改良し得る。この場合同時形質転換する
選択遺伝子は、Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋”Ｓｏｎ＋
ａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　”　４：４９
９−５０８　　（１９８２）に記載された優性ＤＨＰＲ
遺伝子でなければならない。さもなければ、同時形質転
換および培養は実質上本明細書のどこかに述べていると
おりである。

３、人且上坐生産 セクション２において選択されたΔＨＦ生産ＣＨＯ）ラ
ンスフォーマントは、標準技術を使って種カルチャー中
に維持される。該カルチャーは慣用培地中で細胞を培養
することにより１０１までスケールアップされる。この
培地はＭＴＸを含有する必要はなく、選択遺伝子復帰突
然変異株を除去するように、ヌクレオチドを含有しない
であろう。

培養上清は、血漿サンプルについて使用するための標準
アッセイ法（ファクター■欠乏血漿の凝血時間の短縮）
に従って凝血活性についてモニターされる。上清は、フ
ァクター■アッセイの感度を増すために、ポリエチレン
グリコールおよびグリシン沈澱（血漿からＡ）（Ｆの精
製に使用するため既知であるように）のような慣用技術
によって精製し得る。

ファクター■活性がピークに達した時、細胞が遠心によ
って培地から分離される。次にファクター■が回収され
、ポリエチレングリコールおよびグリシン沈澱によって
精製される。凝血活性がファクター■欠乏血漿において
示される。

４、ＡＨＦの　　のための 全体のＡＨＦコーディング区域を含んでいる全長さのｃ
ＤＮＡが前記した０Ｂ−２５中のエクソン、該エクソン
の５゛および３′区域が重複している２種のｃＤＮＡク
ローン、そして３”　ｃＤＮＡクローンが重複しそして
成端コードンを過ぎて続いている３番目のクローンから
形成された。これは、合成Ｓａｌ　１部位がイニシエー
ターメチオニンに対してちょうど５°に、そしてＡＨＦ
をコードする配列の末端のほん訳停止信号に対して３”
に配置されるように形成された。これはｐＳＰ６４のポ
リリンカ−５ａ１１部位中へ配置し、そしてそれから切
り取ることを許容した。このクローン（ｓＳＰ６４−■
）からのＳａｌ　ｌ断片が精製され、そしてｐＣＶＳＶ
Ｌ２ヘリゲートされた。ｐＣＶＳＶＬ２は、慣用の操作
によって達成されるＳＶ４０ポリアデニル化配列の３′
に位置するＰｓｔ１部位を欠いていること、およびアデ
ノビールス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から上流に
ＳＶ４０　Ａｖａ　ＩＩ　（Ｄ）断片の重複を含んでい
ることを除き、発現ベクターｐＣＶＳＶＬ　（Ｋａｕｆ
ｍａｎ　ｅｔａｔ、　、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ
ｌ、、　２　：　１３０４　（１９８２）　、その記載
を参照とじてこ＼に取り入れる）と同一であるプラスミ
ドである。ｐＣＶＳＶＬ２はｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ　（
１１（前出Ｋａｕｆ＋ｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、参照）から
、二つの５Ｖ４０Ａｖａｌｌ”Ｄ’″断片の各末端にお
いてＸｈｏ　Ｉリンカ−を加え、そしてそれらを ｐＡｄＤ２６ｓＶｐ＾（１）のＸｈｏ　１部位へ挿入す
ることによって誘導された。Ａｖａ　Ｕ“Ｄ“断片は、
ＳＶ４０後期プロモーターがＡｄ２主要後期プロモータ
ーと同じ配向になるように両方共挿入される。ｐｃｖｓ
ｖｔ、およびｐＡｄＤ２６　ＶｐＡ（３１については、
前出Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ。

参照。ｐＳＰ６４−■の５ａｌｌ断片をｐＣＶＳＶＬ２
中へ挿入するため、ｐＣＶＳＶＬ２中の独特（７）Ｐ；
ｔＩ部位ハＲｏｔｈｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍ、、　６９　　：　９８　（１
９８０）に記載の操作によってＳａ＋１部位へ変えられ
、そしてｐＳＰ６４−■から切り取ったＳａｌ　ｌ断片
がｐＣＶＳＶＬ２−■が得られるように挿入された。

ｐＣＶＳＶＬ２−■は、ベクターのアデノビールスＭＬ
ＰからＡＨＦをコードする配列の転写を許容する正確な
５゛から３′への配向を含んでいる。ｐＣＶＳＶＬ２−
■はアメリカン、タイプ、カルチャー、コレクションへ
寄託されている。

ｐＣＶＳＶＬ２−■は、サルＣＯ５−７細胞（Ｍｅｌｌ
ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　２７　　：２７９　　（１９８１）　）中へ
、ＳａｍｐａｙｒａｃおよびＤａｎｎａ、　ＰＮＡＳ　
Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８　：　７５７５　（１９８１）に記
載されたＤＥＡＥデキストラントランスフェクションプ
ロトコールを使用して導入された。細胞は血清を含まな
い培地中で培養され、トランスフェクション３日後、Ａ
ＨＦ活性についてアッセイされた。

ファクター■：Ｃ活性は、Ｄｉｄｉｓｈｅｉｎ、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ１２９：３８９　　（１９５９）に記載され
た染色体基質アッセイによって測定され、ヒトファクタ
ー■：Ｃ発現が約０．０５単位／献のレベルで達成され
たことを確実にした。

４、　図」Ｂλ直厘ｊα先叫 第１図は、実施例１に記載した６９，０００ダルトント
ロンビン開裂産物のアミノ末端配列について決定された
アミノ酸配列（Ａ）の図である。

１番目の残基は同定できなかった。この配列は、実施例
３に記載されたブタＡＨＦエクソンのヌクレオチド配列
から推論された配列（Ｂ）、および実施例４に記載され
たヒトＡＨＦエクソンと比較されている。

第２図は、（Ａ）アミノ末端のウシトロンビン消化断片
と、（Ｂ）後出Ａａｓｓらにより単離された１６６Ｋｄ
ブタＡＨＦ断片の４０Ｋｄ）ロンビン開裂産物の単一文
字で表したアミノ酸配列を図示する。

第３図は、ＡＨＦをコードするブタ遺伝子の少なくとも
一部の同定および単離のためのオリゴヌクレオチドの設
計を図示する。

第４図は、実施例３に記載したバタテリオファージＰＢ
３４から得られた、ブタＡＨＦエクソンを含むＳｍａＩ
ＤＮＡ断片（３４−Ｓｔ）のためのＤＮＡ配列を図示す
る。

第５図は、実施低３に記載した、ブタＡｔ（Ｆのための
エクソンを持つＨａｅ　ＩＩＩ挿入３４−８１のＤＮＡ
配列の図である。この配列は第４図に示した長い配列内
に含まれ、そして第４図の配列のヌクレオチド２５０−
６１５に相当する。

第６図は、実施例４に記載したヒトＡＨＦのためのエク
ソンの一部を示す、クローン２５−５ｌの５ａｕ３Ａ１
　インサートのためのヌクレオチド３４−８のためのＤ
ＮＡ配列および推論したアミノ酸配列の図である。

第７図は、ヒ１−ＡＨＦをコードする全体の配列を含む
ＤＮＡヌクレオチド配列（１本のみを示す）、およびヒ
Ｉ−ＡＨＦの推論したアミノ酸配列を図示する。

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ｃｃＣ１ｌｉ手続補正書 （方式） 事件の表示 平成１年特許願第２ １５８５１号 ２゜ 発明の名称 ファクター■および関連生産物の製造 ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）あるタンパクを生産する生物のゲノムＤＮＡライ
   ブラリーを形成し、その配列が該タンパク中に含まれる
   アミノ酸配列のみに基づいて選択された少なくとも１種
   のオリゴヌクレオチドプローブを形成し、前記ゲノムラ
   イブラリーを前記オリゴヌクレオチドとＤＮＡ／ＤＮＡ
   ハイブリディゼイションを有利にする条件下で接触させ
   、前記オリゴヌクレオチドへハイブリッド化するゲノム
   ＤＮＡを同定し、そして前記オリゴヌクレオチドへハイ
   ブリッド化するＤＮＡを含有するゲノムＤＮＡを単離す
   ることを含む、あるタンパクの少なくとも一部をコード
   する遺伝子断片の単離方法。
2. （２）少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブは
   、めいめいがＤＮＡ配列において前記アミノ酸配列に対
   応する異なるＤＮＡ配列を含む複数のオリゴヌクレオチ
   ドを含む、第１項の方法。
3. （３）少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブは
   、その一つが前記タンパク中の選択されたアミノ酸配列
   に対応するめいめいの可能性あるＤＮＡ配列を含む、複
   数のオリゴヌクレオチドを含む、第２項の方法。
4. （４）前記オリゴヌクレオチドプローブは、約１０ない
   し２００ヌクレオチドの長さを有する第２項の方法。
5. （５）前記オリゴヌクレオチドは、１０ないし２０ヌク
   レオチドの長さを有する第２項の方法。
6. （６）前記オリゴヌクレオチドは、約３０ないし２００
   ヌクレオチドの鎖長を有する第２項の方法。
7. （７）前記オリゴヌクレオチドは、約４０ないし５０ヌ
   クレオチドの鎖長を有する第２項の方法。
8. （８）ＤＮＡ配列において前記タンパク中のアミノ酸配
   列に対応する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプロ
   ーブが形成され、各オリゴヌクレオチドプローブが前記
   ゲノムＤＮＡとハイブリッド化条件下接触させられる第
   ２項の方法。
9. （９）一つのオリゴヌクレオチドプローブが１１ないし
   ２０ヌクレオチドの長さを有する複数のオリゴヌクレオ
   チドを含み、他のオリゴヌクレオチドプローブが４０な
   いし２００ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１種
   のオリゴヌクレオチドを含む第８項の方法。
10. （１０）一つのヌクレオチドプローブが４０ないし９０
    ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１種のオリゴヌ
    クレオチドを含む第８項の方法。