JPH09173081A - ヒト第ｉｘ因子ポリペプチド前駆体をコードする人工ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト第IX因子ポリペプチドの合成用人工ＤＮ
Ａの提供。 【解決手段】 組換えＤＮＡ技術によって製造され、イ
ンビボでビタミンＫ−依存性酵素の作用によりヒト第IX
因子ポリペプチドに変換し得るヒト第IX因子ポリペプチ
ド前駆体をコードし、かつ、下記のアミノ酸配列 【化１】 をコードするフクレオチド配列を含有する人工ＤＮＡ又
はその相補体、並びにその発現用ベヒクル及び組換え細
菌宿主細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト第IX因子ポリ
ペプチド前駆体コードする人工ＤＮＡに関する。本発明
はまた、クローニングベヒクル内に該人工ＤＮＡを含む
組換えＤＮＡ、および該組換えＤＮＡで形質転換された
細菌宿主細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】第IX
因子（クリスマス因子又は抗血友病Ｂ因子）は、内因性
血液凝固経路による凝血に必要なセリンタンパク分解酵
素の酵素原である（Ｊackson ＆ Ｎemerson,Ａnn. Ｒ
ev. Ｂio-chem.,49 ， 765-811, 1980）。この因子は肝
で合成され、その生合成にはビタミンＫが必要である
（Ｄi Ｓcipio ＆ Ｄavie，Ｂiochem.,18， 899-904，
1979）。

【０００３】ヒトの第IX因子の精製及び特性決定は既に
行なわれているが、そのアミノ酸配列の詳細については
部分的にしか知見されていない。この因子は、分子量約
60,000の単鎖糖タンパクである（Ｓuomela, Ｅur. Ｊ．
Ｂiochem.,71, 145-154, 1976 ）。他のビタミンＫ−依
存性血漿タンパクと同様に、ヒトの第IX因子はアミノ−
末端領域に約12個のγ−カルボキシグルタミン酸残基を
含む（Ｄi Ｓcipio ＆Ｄavie, Ｂiochem.,18, 899-904,
1979）。

【０００４】凝血過程に於いて、Ｃａイオンの存在下、
第IX因子は、活性化された第ＸＩ因子（ＸＩａ）の作用
を受けて内部ペプチド２個が開裂し、10,000ダルトンの
活性化糖タンパク（activationglycopeptide）を遊離す
る（Ｄi Ｓcipio et al., Ｊ．Ｃlin.Ｉnvest., 61， 1
528-1538，1978）。活性化された第IX因子（IXa ）は、
少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに保持
された２つの鎖から構成されている。第IXa 因子は次
に、活性化された第VIII因子とＣａ⁺⁺イオンとリン脂質
との存在下で第Ｘ因子に作用することによって血液凝固
カスケ―ドの次の段階に参加する（Ｌindquist et al.,
Ｊ．Ｂiol.Ｃhem., 253， 1902-1909, 1978）。

【０００５】第IX因子を欠損した個体（クリスマス病又
は血友病Ｂ）は、生涯続く出血症状を示す。出血は、自
然に又は負傷によって生じ得る。このような出血はどこ
で起こるかわからない。関節での出血が生じる場合が多
く、出血が繰返し生じると、不治の身心障害たる奇形に
至る。これは伴性的疾患であり、男性が罹患し、男性約
30,000人に１人の割合で発生する。

【０００６】従来のクリスマス病診断方法では、凝血ア
ッセイと免疫化学的アッセイとを組合せて血漿中の第IX
因子の力価を測定している。病気中の出血の治療のため
には、第IX因子を補填したヒト血漿タンパク濃縮物を静
脈内に輸血して第IX因子を補充する。血漿中の第IX因子
増加は時間の掛るプロセスである。

【０００７】本出願人は組換ＤＮＡ技術（遺伝子工学）
によるヒト第IX因子の人工的産生を目指して多くの研究
と実験とを重ねた後に顕著な進歩を遂げることに成功し
た。即ち、ヒト第IX因子ゲノム中に見られる長い配列
（extensive sequences ）と実質的に等しいＤＮＡ配列
のクローニングが達成されたのである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、組換えＤＮＡ
技術によって製造され、インビボでビタミンＫ−依存性
酵素の作用によりヒト第IX因子ポリペプチドに変換し得
るヒト第IX因子ポリペプチド前駆体をコードし、かつ、
下記のアミノ酸配列 Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Clu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala をコードするヌクレオチド配列を含有する人工ＤＮＡ、
又はその相補体を提供する。

【０００９】この人工ＤＮＡは、通常、ヒト第IX因子ゲ
ノムから転写され得るヒト第IX因子メッセンジャーＲＮ
Ａに相補的である。

【００１０】本発明はまた、クローニングベヒクルＤＮ
Ａ配列と、前記人工ＤＮＡの配列とを含む組換えＤＮＡ
を提供する。

【００１１】本発明はさらに、前記組換えＤＮＡで形質
転換された細菌宿主細胞を提供する。

【００１２】宿主細胞は、好ましくは、大腸菌細胞であ
る。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、後述する如く、基本的
なヌクレオチド又はジヌクレオチドの“構築ブロック”
を出発構造とし化学的合成と人工的生合成との難しい巧
妙な組合せによって、ヒト第IX因子ゲノムの長いＤＮＡ
配列を得ることができるという知見に基く。

【００１４】本発明の重要な特徴は、クローニングベヒ
クルＤＮＡ配列と、ヒト第IX因子ゲノム中に見られる配
列と実質的に同じ外来配列（即ちベヒクルにとって外来
の配列）とを含む組換ＤＮＡにある。このような外来配
列の 11873個のヌクレオチドを含む部分が同定され、そ
のほとんどの部分はＭaxam−Ｇilbert配列決定法によっ
て配列決定された。この配列の 129個のヌクレオチド鎖
は、特異的タンパクをコードするこの配列の明確な特性
決定を行なうに十分な長さであり、この 129−ヌクレオ
チド鎖は、クローニングベヒクルに挿入された全配列を
特性決定するときにヒト第IX因子ゲノム中に見られる配
列と同程度に有用であると考えられる。従って別のクロ
ーン化配列は、この 129−ヌクレオチド鎖部分が前記ク
ローニングベヒクル配列の１部の領域と同一であるこ
と、即ち双方の配列が同一のオーバーラップ領域を有し
ていることが決定されれば、ヒト第IX因子ゲノムに属す
ると判定され得る。

【００１５】従って、本発明の別の特徴は、クローニン
グベヒクル又はベクターＤＮＡ配列と外来ＤＮＡ配列と
を含んでおり、外来ＤＮＡ配列が実質的に以下の 129個
のヌクレオチド配列から構成されるか又はこの配列を含
むような組換ＤＮＡを含むことである。

【００１６】

【化１】

【００１７】（129 個のヌクレオチドは、横１行に30
個，更に次の横１行に30個の順に読む。） この129 −ヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子ｃＤＮＡ
クローン（図９）から予想されたアミノ酸配列のアミノ
酸位置85〜127 をコードしている。

【００１８】本発明は特に、クローニングベヒクルＤＮ
Ａ配列とクローニングベヒクルに外来の配列とを含んで
おり、外来配列がヒト第IX因子ゲノムのエクソン配列の
実質的に全部を含むような組換ＤＮＡを含む。上記の 1
29−ヌクレオチドの配列は、実質的に前記の如きエクソ
ン配列に対応する。ヒト第IX因子ＤＮＡを単独で特性決
定するエクソン配列の別の例としては、実質的に次式で
示される 203−ヌクレオチド配列がある。

【００１９】

【化２】

【００２０】（この場合にも、ヌクレオチド配列は横１
行に30個，更に次の横１行に30個の順で読む。） この203 −ヌクレオチド配列は、ヒト第IX因子ｃＤＮＡ
クローン（図９）から予想されたアミノ酸配列のアミノ
酸位置128 〜195 をコードしている。

【００２１】ヒト第IX因子ゲノムのイントロン配列はヒ
ト細胞中でｍＲＮＡが転写されるプロセス中に切除され
る。エクソン配列だけがタンパクとして翻訳される。第
IX因子をコードするＤＮＡはヒトｍＲＮＡから調製され
た。この cＤＮＡは部分的に配列決定され、上記と同じ
129−及び 203−ヌクレオチド配列を含むことが知見さ
れた。

【００２２】本発明は更に、クローニングベヒクル配列
とクローニングベヒクル配列にとって外来のＤＮＡ配列
とを含んでおり、外来配列がヒト第IX因子ｍＲＮＡに相
補的なＤＮＡ配列を含むような組換えＤＮＡを含む。こ
のような組換えｃＤＮＡはヒト肝ｍＲＮＡ由来の組換ｃ
ＤＮＡクローンライブラリーから単離され得る。即ち、
プローブとしてヒト第IX因子ゲノムＤＮＡのエクソン
（又はその一部）を使用してライブラリーをスクリーニ
ングし、得られたクローンを単離する。

【００２３】本発明は更に、外来配列がヒト第IX因子Ｄ
ＮＡの断片、特に少なくとも50個好ましくは少なくとも
75個のヌクレオチド又は塩基対から成る長さの断片であ
るような組換えＤＮＡを含む。本発明は、上記の 129−
又は 203−塩基対の配列の一部であるか否かに関わりな
く、前記の如き組換えＤＮＡを含む。本発明は特にヒト
第IX因子ゲノムＤＮＡのエクソン配列の一部又は全部を
含む。約 11kbp（11,000ヌクレオチド又はbp）までの長
さの種々の短い鎖を種々の制限エンドヌクレアーゼを用
いて調製した。組換えＤＮＡをクローンから単離するた
めに種々の方法が公知であり、そのいくつかについては
後述する。本発明のＤＮＡは単鎖形でもよく二本鎖形で
もよい。

【００２４】本発明の組換えヒト第IX因子ＤＮＡは組換
えＤＮＡ技術の手段として有用である。即ち、人工ヒト
第IX因子産生及び診断用プローブ調製の第１段階で有用
である。

【００２５】人工ヒト第IX因子の産生のためには、適当
なｃＤＮＡ又はゲノムクローンを哺乳動物又は細菌系の
適当な発現ベクターに導入する方法が検討されている。
哺乳動物でテストした場合、１つのクローン内に適当に
維持されるには遺伝子が長過ぎるかも知れない。従っ
て、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンの適当な部分から人工
“ミニ遺伝子”を設計構築する。ミニ遺伝子はそれ自体
のプロモーターのコントロール下にあるか、又はその代
わりに人工プロモーター例えばマウスのメタロチオネイ
ン（metallo-thioneine ）Ｉプロモーターで置換されて
いる。得られた“ミニ遺伝子”は次に哺乳動物の組織培
養細胞、例えばヘパトームセルラインに導入され、最大
量の生物学的に活性な第IX因子を合成する細胞のクロー
ンが選択される。又は、マウス成長ホルモンで示された
ような“遺伝子育成（ genetic farming）”を使用して
もよい（Ｐalmiter et al., Ｎature 300， 611-615，
1982）。ミニ遺伝子を受精卵の前核に微量注入（マイク
ロインジェクション）し、次に in vivoクローニング
し、血液中に最大量のヒト第IX因子を産生する子孫を選
択する。又は、ｃＤＮＡクローン又はその選択された部
分を適当な強い細菌プロモーター例えばＬacもしくはＴ
rpプロモーター又はλＰ_R もしくはＰＬ_L に結合し、こ
れにより第IX因子ポリペプチドを得ることも検討されて
いる。

【００２６】天然の第IX因子ポリペプチドは、シグナル
及びプロペプチド領域の双方を含む前駆物質として合成
される。これらの領域はいずれも確定鎖長タンパク産生
中に開裂されるのが普通である。更にこの産物も単なる
前駆物質にすぎない。この産物は生物学的には不活性で
あり、特異的ビタミンＫ−依存性カルボキシラーゼの作
用によって所謂“ＧＬＡ”領域内の12個の特異的Ｎ−末
端グルタミン酸残基がガンマ−カルボキシル化される必
要がある。更に、分子の連結ペプチド領域に２つの炭水
化物分子が付加されるが、これらが活性に必要であるか
否かは不明である。カルボキシラーゼに対する基質は未
知であり、前駆物質たる第IX因子ポリペプチド又は確定
鎖長のタンパクのいずれかかも知れない。従って、前駆
物質領域の有無に関わりなく、種々の該当ポリペプチド
が遺伝子工学の方法を用いて細菌宿主中で“構築”され
るであろう。これらのポリペプチドは次に、部分精製さ
れたカルボキシラーゼ酵素製剤の作用下で第IX因子を不
活性から生物学的活性にinvitro変換するための基質と
してテストされるであろう。前記のカルボキシラーゼ酵
素は、肝ミクロソーム又は別の適当なソースから単離さ
れ得る。

【００２７】診断のためには、組換えヒトゲノム第IX因
子ＤＮＡ又は組換えヒトｍＲＮＡ−由来第IX因子ＤＮＡ
は広範囲に使用され得る。これらのＤＮＡは、酵素又は
２種以上の酵素の組合せによって、ＤＮＡのより短い断
片に開裂され、この断片をクローニングベヒクル中に組
換えて“サブクローン”を産生し得る。これらのサブク
ローン自体が制限酵素によって、プローブ調製に適した
ＤＮＡ分子に開裂され得る。（このように定義される）
プローブＤＮＡは何らかの方法でラベルされ、通常は放
射性ラベルされ、普通なら第IX因子を産生するはずのヒ
トＤＮＡ中の突然変異を詳細に検査すべく使用され得
る。体内での突然変異発生が予想される患者のゲノムの
異なるいくつかの領域を検査するために、異なるいくつ
かのプローブが製造された。このようなプローブでハイ
ブリダイゼーションが起こらない場合、このことは患者
のＤＮＡ中でプローブの配列とは異なっていることを示
す。特にクリスマス病がこのような方法論によって検出
又は確認され得ることが判明した。有用なプローブは、
ゲノムＤＮＡのイントロン及び／又はエクソン領域を含
み得るか、又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含み得る。

【００２８】本発明は特に、プローブＤＮＡ、即ち所望
のプローブたる用途に適した長さのラベルされたＤＮＡ
を含む。このＤＮＡ中の少なくともヒト第IX因子ＤＮＡ
プローブ配列は単鎖又は二本鎖のいずれでもよく、この
ような配列は通常、少なくとも15個のヌクレオチド好ま
しくは少なくとも19〜30個のヌクレオチドから成る長さ
を有するであろう。この程度の長さであれば、配列の固
有の特性が維持されると考えてよい。配列は、必ずしも
５kbより大きくはなく、10kbより長いことはめったにな
い。

【００２９】従って、本発明はラベルの有無又はイント
ロンもしくはエクソンもしくは双方の一部の有無に関わ
りなくヒト第IX因子ＤＮＡ配列の一部を含むＤＮＡ分子
を含む。本発明は更に、全てのヒト第IX因子ｍＲＮＡの
一部に対応するヒトｃＤＮＡを含む。本発明は特に、本
発明によるいずれかのＤＮＡの溶液を含む。溶液は、ゲ
ルからの電気溶出によって通常得られる形態である。
本発明は勿論、本発明の組換えＤＮＡのいずれかによっ
て形質転換された宿主を含む。宿主は、使用されるクロ
ーニングベヒクルの性質に従って選択される細菌、例え
ば大腸菌（Ｅ．coli）の適当な菌株であり得る。有用な
宿主としては、Ｐseudomonas，Ｂacillus subtilis，Ｂ
acillus stearothermophilus，他のＢacilli，酵母及び
他の菌類の菌株、並びに（ヒトを含む）哺乳動物細胞が
ある。

【００３０】本発明の組換えＤＮＡで形質転換された宿
主を調製するために本発明と関連して行なわれる１つの
プロセスは以下のステップに基く。

【００３１】(1) ウシ第IX因子の70〜75又は 348〜352
のアミノ酸をコードするウシ第IX因子メッセンジャー
ＲＮＡにあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列
を有するオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、オリゴ
デオキシヌクレオチドをラベルしてプローブを形成す
る； (2) ウシｍＲＮＡの混合物と相補的なＤＮＡを調製す
る； (3) 相補的ＤＮＡをクローニングベクターに挿入して
組換ウシｃＤＮＡの混合物を形成する； (4) 前記組換ウシｃＤＮＡの混合物で宿主を形質転換
してクローンライブラリーを形成し、前記クローンを増
殖する； (5) ステップ１で得られた合成オリゴデオキシヌクレ
オチドプローブでクローンをプローブし、得られた組換
えウシ第IX因子ｃＤＮＡ含有クローンを単離する； (6) 前記クローンの組換えウシ第IX因子ｃＤＮＡを１
種類以上の酵素で消化して、ウシ第IX因子ＤＮＡのより
短いが好ましくは少なくとも50bpの長さを有する配列を
含むウシ第IX因子ｃＤＮＡ分子を生成する；及び (1) 形質転換宿主中の組換えヒトゲノムＤＮＡのライ
ブラリーーを、より短い配列のウシ第IX因子ｃＤＮＡ分
子でプローブしてヒトゲノムＤＮＡを前記組換えウシ第
IX因子ＤＮＡにハイブリダイズし、得られた組換えＤＮ
Ａ−形質転換宿主を単離する。

【００３２】好ましい具体例の説明 本発明の組換えＤＮＡは、クローン化ヒトゲノムＤＮＡ
のライブラリーからプローブを用いて抽出され得る。こ
れは公知の組換えライブラリーであり、本発明は勿論、
このようなライブラリーに存在するヒトゲノム第IX因子
ＤＮＡを包含しない。使用プローブはウシ第IX因子ｃＤ
ＮＡ（ウシｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ）であり、この調
製には、まずウシｍＲＮＡ出発材料から組換えウシｃＤ
ＮＡを調製し、次にオリゴヌクレオチドを化学合成し、
次にこれらを使用して組換えウシｃＤＮＡをプローブし
てウシ第IX因子ｃＤＮＡを抽出し、次に組換えウシ第IX
因子ｃＤＮＡからより短い長さの適当なプローブを調製
するという精巧なプロセスを使用した。最初のテストプ
ローブは、不要な配列を含むと考えられたが、第２のテ
ストプローブは不要な配列を含まず、ヒトゲノム第IX因
子ＤＮＡの単一クローンを首尾良く単離させ得ることが
証明された。このクローンをラムダＨIX-1と命名する。
個々のステップについては、後述の“実施例”の項に於
いてより詳細に説明する。第２のプローブは図５に示す
ウシ第IX因子ｃＤＮＡの247bp のＤＮＡ配列を含む。従
って、本発明は特に、クローニングベヒクル配列とクロ
ーニングベヒクルにとって外来のＤＮＡ配列とを含む組
換えＤＮＡを提供し、この組換えＤＮＡは図５に示すウ
シ第IX因子ｃＤＮＡの247bp 配列（各末端が矢印で示さ
れている）にハイブリダイズする。

【００３３】本発明で使用されるクローニングベヒクル
又はベクターは遺伝子工学技術で公知のいかなるもので
もよい（但し、宿主と適合するものが選択される）。こ
れらの例としてＥ．coliプラスミド、例えば pＢＲ322,
pＡＴ153 及びその改変形と、宿主範囲のより広いプラ
スミド、例えば別の細菌宿主に特異的なＲＰ４プラスミ
ドと、ファージ特にラムダファージと、コスミドとがあ
る。コスミドクローニングベヒクルは、プラスミドに挿
入されたｃｏｓ（接着端部位）を含むファージＤＮＡの
断片を含む。得られる組換５ＤＮＡは環状であり、付加
的外来ＤＮＡの極めて大きい断片を収容する能力を有す
る。

【００３４】ヒト第IX因子ゲノムＤＮＡの断片は、クロ
ーン化ＤＮＡを種々の制限酵素で消化することによって
調製され得る。所望の場合、断片をクローニングベヒク
ルに再結合して別の組換５ＤＮＡを調製し、これにより
“サブクローン”を得ることができる。この具体例に関
して新規なクローニングベヒクルが調製された。これ
は、一端にＢamＨＩ制限部位、他端にＨind III 制限部
位及び中間にＰvuII制限部位を備えたＤＮＡ配列を有す
る２つの接着端をもつ１対の相補的オリゴヌクレオチド
に、ＢamＨＩと Ｈind III とで二重消化したｐＡＴ15
3 を結合することによって調製された改変ｐＡＴ153 で
ある。

【００３５】本文中では特にヒトゲノム第IX因子ＤＮＡ
に関して本発明を説明しているが、本発明は実質的に同
じ配列を含むヒト第IX因子ｃＤＮＡ（ヒト第IX因子ｍＲ
ＮＡに相補的）を含む。ヒトｃＤＮＡのライブラリーが
調製され、ヒト第IX因子ゲノムＤＮＡでプローブされて
ライブラリーからヒト第IX因子ｃＤＮＡが単離された。
このためにプローブＤＮＡは比較的短いことが有利であ
り、少なくとも１つのエクソン配列を含むことが必要で
ある。従って、本発明はクローニングベクター配列とヒ
ト第IX因子ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡに含まれたヌク
レオチドの配列とを含む組換ちえＤＮＡで形質転換され
た宿主の調製プロセスを含んでおり、該プロセスは、ヒ
ト第IX因子ゲノムのエクソン領域の一部又は全部に相補
的な配列を含むラベルＤＮＡを含むプローブを用いてヒ
トｍＲＮＡに相補的な組換えＤＮＡを含むクローンのラ
イブラリーをプローブする操作を含む。

【００３６】

【実施例】

Ａ．使用細菌 Ｅ．coli Ｋ-12 株ＭＣ1061（Ｃasadaban ＆ Ｃohe
n, Ｊ．Ｍol. Ｂiol.,138， 179-207, 1980），Ｅ．col
i Ｋ−12株ＨＢ101 （Ｂoyer ＆ Ｒoulland-Ｄussoi
x, Ｊ．Ｍol. Ｂiol.41， 459-472, 1962）及び遺伝子
工学での使用が公知な菌株たるＥ．coli Ｋ−12株Ｋ80
3 。

【００３７】Ｂ．ウシ第IX因子、抗−ウシ第IX因子抗体
及びウシｍＲＮＡのソースと精製 高度に精製されたウシ第IX因子とウサギ抗−ウシ第IX因
子抗血清とはＤr.Ｍ．Ｐ．Ｅsnouf から贈与された。変
性ポリアクリルアミドゲルで精製ウシ第IX因子を分析す
ると、99％より高い純度であることが判明した。Ｃhoo
et al., Ｂiochem.,Ｊ． 199， 527-535，1981に記載の
如く、純粋ウシ第IX因子を結合しておいたＳepharose-4
Ｂカラムに粗抗血清を通すことによって、免疫沈澱テス
ト用の特異的抗−第IX因子免疫グロブリンを精製した。

【００３８】ウシ mＲＮＡは仔ウシ肝から採取し塩酸グ
アニジン法で単離した（Ｃhirgwinet al., Ｂiochem.,1
8， 5294-5299, 1979）。ｍＲＮＡ調製物をオリゴｄＴ
−セルロースカラム（Ｃaton及びＲobertson, Ｎucl.Ａ
cids Ｒes., 7， 1445-1456, 1979）に通し、ポリ
（Ａ）＋ｍＲＮＡを単離した。Ｐelham 及びＪackson
（Ｅur. Ｊ．Ｂiochem.,67， 247-256, 1976）に記載の
如く、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを³⁵Ｓ−システインの存在
下ウサギ網状赤血球細胞不含系で翻訳した。翻訳反応終
了後、特異的抗−第IX因子免疫グロブリンを添加して第
IX因子ポリペプチドを沈澱させた。Ｃhoo et al., Ｂio
chem.,Ｊ． 181，285-294,1979に記載の如き免疫沈澱手
順を用いた。免疫沈澱材料を完全に洗い、二次元ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルを用い（Ｃhoo et al.，Ｂio
chem.,Ｊ． 181， 285-294, 1979）、１つの次元の等電
点電気泳動と別の次元の電気泳動とによって分離した。
基準点として機能させるために既知分子量のいくつかの
ポリペプチドをこの手順で処理した。免疫沈澱材料は４
つの顕著なスポットを示した。これらは全て分子量50,0
00のの領域に存在し、別々に離れた等電点を有してい
た。分子量約50,000のこれら目立ったスポットは、可能
なプレペプチドシグナル配列を付加したポリペプチド単
鎖を示しており、公表データに基く推定と一致する（Ｋ
atayama et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ，7
6， 4990-4994, 1979）。

【００３９】ラベルされていない純粋ウシ第IX因子の存
在下で免疫沈澱しない同じ材料についてゲル分析を繰返
すと、４つのスポットが弱い強度で出現した。このこと
は、翻訳産物が純粋な第IX因子によって特異的に競合す
る（compete ）ことを示す。３番目には、コントロール
（対照）ウサギ抗血清、即ち第IX因子で免疫を与えない
ウサギから得た抗血清を用いて免疫沈澱を実施した。４
つのスポットは全く出現しなかった。従って、これらの
結果は、翻訳産物が第IX因子ポリペプチドであったこと
を示す。

【００４０】前記の如き特異的な免疫学的／無細胞翻訳
アッセイを使用してショ糖勾配遠心分離によって第IX因
子ｍＲＮＡの増加をモニターした。ショ糖勾配遠心分離
による連続的な 2回の分離によって全ポリ（Ａ）＋ｍＲ
ＮＡを分離した。勾配から得た個々の画分を上記方法で
検定すると、サイズ20〜22 Ｓvedberg ユニット（約2.
5kbのＲＮＡ）領域の画分でウシ第IX因子ｍＲＮＡが
（約10倍に）増加していることが判明した。この濃厚画
分を次のクローニングテストに使用した。

【００４１】Ｃ．特異的ウシ第IX因子デオキシオリゴヌ
クレオチド混合物の合成 ウシ第IX因子のアミノ酸配列に関する知識（Ｋatayama
et al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ，76， 4990-
4994，1979）に基いて、オリゴヌクレオチドプローブの
２種の混合物の合成を設計した。これらのプローブは、
タンパクの２つの異なる領域をコードするＤＮＡ配列か
ら構成されていた。選択領域としては、類似のセリンタ
ンパク分解酵素とプロトロンビンとＣ因子と第VII 因子
と第Ｘ因子とに於いて異なる配列を有することがわかっ
ている領域が選択された。これらの領域は70-75 のアミ
ノ酸及び348-352 のアミノ酸にそれぞれ対応していた。
70-75 アミノ酸の領域が特に有利であった。何故なら合
成オリゴヌクレオチドの混合物、即ちオリゴＮ２Ａとオ
リゴＮ２Ｂとの混合物が70-75 アミノ酸に対応するｍＲ
ＮＡの17個のヌクレオチドの領域に生じ得る16個の可能
な配列の全てを含んでいたからである。オリゴＮ２Ａ−
Ｎ２Ｂ混合物を以後“オリゴＮ２”と略称する。

【００４２】図１は、ウシ第IX因子の既知のアミノ酸配
列の２つの選択領域と、対応するｍＲＮＡと、合成オリ
ゴヌクレオチドとを示す。アミノ酸のいくつかは１つ以
上のヌクレオチドトリプレットでコードされているの
で、図示の70-75 アミノ酸のｍＲＮＡ配列中には４つの
未確定部分が存在しており、従って、16個の異なる配列
が考えられる。

【００４３】ヌクレオチド混合物オリゴＮ１及びオリゴ
Ｎ２の合成には、Ｄuckworth et al.,Ｎucl.Ａcids Ｒ
es., 9， 1691-1706，1981の固相ホスホトリエステル法
を２つのやり方で修正したものを用いた。第１には、ホ
スホトリエステル基を形成するためにｐ−クロロフェニ
ル遮断基でなくｏ−クロロフェニル遮断基を使用し、モ
ノヌクレオチドとジヌクレオチドとの“構築ブロック”
に組込んだ。図２及び図３は（ａ）ジヌクレオチド及び
（ｂ）モノヌクレオチドの“構築ブロック”を示す。Ｄ
ＭＴは４，４−ジメトキシトリチルであり、Ｂは選択ヌ
クレオチド次第で６−Ｎ−ベンゾイル−アデニン−９−
イル，４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−１−イル，２−Ｎ
−イソブチリルグアニン−９−イル又はチミン−１−イ
ルである。第２には、モノ−又はジヌクレオチド“構築
ブロック”を順次付加するための“反応セル”を小型化
し、縮合剤１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−
ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）との縮
合ステップを、 3.5μモルのポリジメチルアクリルアミ
ド樹脂と17.5μモルの導入ジヌクレオチド（又は３５μ
モルのモノヌクレオチド）と ２１０μモルのＭＳＮＴ
とを含む容量 0.5mlのピリジン中で行なった。

【００４４】図４は、オリゴヌクレオチド合成用のマイ
クロ反応セル１とストッパー２との実寸を70％に縮小し
た立面図である。デバイスはストッパー２の入口端にガ
ラス−ＰＴＦＥ管状ジョイント３を有する。ストッパー
は内管４を有しており、管４の下端はスリガラス性のテ
ーパ状中空オス部材５に挿通され、焼結ガラスから成る
ストッパーの出口６に挿入されている。セル１はストッ
パーの部材５と相補的なスリガラス性メス部材７を有し
ており、部材７は反応チャンバ８に続く。チャンバ８の
下端は焼結ガラスから成る出口９で終結している。これ
は、ガラス管10と 1.2mmの“インターフロー”タップ11
とに連通している。タップ11の前方で別のガラス管10が
出口のガラス−ＰＴＦＥ管状ジョイント12に続いてい
る。ストッパーとセルとに備えられた耳状突起対の組合
せによって、ストッパーとセルとが（図示しない）バネ
によって液密的に接合され得る。

【００４５】合成と脱保護とが終了すると、高圧液体ク
ロマトグラフィー（Ｄuckworth etal.,上記）によって
分画を行ない、正しい鎖長の産物に対応するピーク管を
検出した。このために、［γ−³²Ｐ］−ＡＴＰとＴ4 ポ
リヌクレオチドキナーゼとを用いて画分の5'−ヒドロキ
シル端をラベルし、次に20％の７Ｍ尿素ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけた。上記方法で17個及び14個の
ヌクレオチド鎖の“マーカー”オリゴヌクレオチドを別
々にラベルし、これらを同じくゲル電気泳動で処理して
17−及び14−オリゴヌクレオチドのゲルの位置を測定し
た。

【００４６】Ｄ．ウシ mＲＮＡに対するｃＤＮＡ配列の
ライブラリーの調製 クローン化 cＤＮＡライブラリーを作成するために２つ
の異なる方法を使用した。

【００４７】（ｉ）ＭboＩライブラリー 第一鎖ｃＤＮＡの合成にはショ糖勾配で濃縮したポリ
（Ａ）＋ウシｍＲＮＡを鋳型として用いた。条件として
Ｈuddleston ＆ Ｂrownlee,Ｎucl.Ａcids Ｒes.,10，
1029-1030, 1981に記載の条件を使用したが、但し、２
μg のオリゴＮ1と20〜30μg のｍＲＮＡと10μＣｉの
［α−³²Ｐ］−ｄＡＴＰ（Ａmersham, 3,000Ｃｉ／m mo
l ）と50Ｕの逆転写酵素とを反応容量50μl で使用し
た。図１の“ｄＮＴＰ”は合成に必要な４種のデオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートの混合物を意味する。オ
リゴＮ１はｍＲＮＡの対応する領域にハイブリダイズし
（図１参照）、これにより転写開始用プライマーとして
作用する。これを用いて第IX因子ｍＲＮＡを更に濃縮し
た。ｃＤＮＡ合成反応が終ると、ｃＤＮＡをフェノール
で抽出し、Ｓephadex-Ｇ100 カラムで塩除去してからア
ルカリ（ 0.1Ｍ ＮａＯＨ，1mＭ ＥＤＴＡ）を用いて
60℃で30分間処理してｍＲＮＡ鎖を除去した。次に第二
鎖ＤＮＡの合成は、公知の方法通りに行なった （Ｈud
dleston ＆ Ｂrownlee,Ｎucl.Ａcids Ｒes.,10，1029
-1038，1981）。

【００４８】次に、二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＭboＩで開
裂し、プラスミドベクターｐＢＲ322 に結合した。ベク
ター pＢＲ322 は予めＢamＨＩで切断し、ベクターの自
己再結合をできるだけ抑制するために仔ウシ腸アルカリ
性ホスファターゼで処理しておいた。ホスファターゼ処
理では、５μg のＢamＨＩ切断ｐＢＲ322 プラスミドを
0.5μg の仔ウシ腸ホスファターゼ（Ｂoehringer,10ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌバッファ中， pＨ 8.0）と共に反応容
量50μl で37℃で10分間インキュベートした（Ｈuddles
ton ＆Ｂrownlee 参照，前出）。

【００４９】結合したＤＮＡを用いてＥ．coli株 ＭＣ
1061を形質転換した。形質転換のためには、Ｅ．coli
ＭＣ1061を、 600nmでの吸光度 0.2で示されるような早
期指数期まで増殖させ、“受容能（competent ）”を与
えた。受容能を与えるには、ペレット化した細菌細胞を
初期増殖培地の１／２容量の100mＭ Ｃa Ｃｌ，15容量
／容量％グリセロール及び 10mＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯ
Ｈ， pＨ 6.6，０℃で処理し、再度ペレット化し次に１
／50容量の同じ液で処理した。−70℃までのドライアイ
ス／エタノール浴で細胞を直ちに凍結した。

【００５０】形質転換を行なうために、 200μl の部分
サンプルを10μl の組換えＤＮＡと混合し、０℃で10分
間次いで37℃で５分間インキュベートした。次に、 200
μlのＬ−ブロス（バクトトリプトン10ｇ，酵母抽出物
５ｇ，塩化ナトリウム10ｇ，１ｌまで脱イオン水補充）
を添加し、37℃で更に30分間インキュベートした。次に
溶液を適当な抗生物質寒天にプレートした（下記参
照）。このようにして、約7,000個のアンピシリン耐性
コロニーのライブラリーを得た。これらのコロニーは、
ｐＢＲ322 のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むのでアンピ
シリン耐性であった。これらの約85％がテトラサイクリ
ン感受性であった。

【００５１】（ii）ｄＣ／ｄＧテイルを付けたライブラ
リー このライブラリーの調製では、第一鎖ｃＤＮＡは前記ラ
イブラリーの場合と同様に合成されたが、ｃＤＮＡ合成
を開始させるプライマーとしてオリゴｄＴ_12-18 を使用
した。次にターミナルトランスフェラーゼを用いて cＤ
ＮＡにｄＣＴＰテイルを付け、オリゴｄＧ_12-18 プライ
マーと逆転写酵素とを用いてバックコピー（逆転写）
し、Ｌand et al., Ｎucl.Ａcids Ｒes., 9， 2251-22
66，1981の方法をそのまま用いて二本鎖ＤＮＡを得た。
更にｄＣＴＰテイルをつないだ後、この材料をｄＧＴＰ
テイルを付けた pＢＲ322 プラスミドのＰstＩ部位にハ
イブリダイズしてアニールした。このハイブリッドＤＮ
ＡをＥ．coli株 ＭＣ1061の形質転換に使用した。約1
0,000個のテトラサイクリン耐性コロニーライブラリー
を得た。これらの約80％は、アンピシリン耐性遺伝子の
ＰstＩ部位にＤＮＡが挿入されているためアンピシリン
感受性であった。

【００５２】Ｅ．特異的ウシ第IX因子クローンの単離 （ｉ）ＭboＩライブラリーからの単離 コロニーライブラリーを無秩序に 13 Ｗhatman 541フィ
ルターペーパーに移し、クロラムフェニコールと共に増
幅してコロニー中のプラスミドのコピー数をＧergen et
al., Ｎucl.Ａcids Ｒes., 1， 2115-2136（1979）に
記載の如く増加させた。Ｗallace et al.,Ｎucl.Ａcids
Ｒes., 9， 879-894（1981）に記載の如く、６×ＮＥ
Ｔ（１×ＮＥＴ＝0.15m ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，
15mＭトリス−ＨＣｌ， pＨ 7.5），５×Ｄenhardt's,
0.5％ ＮＰ40非イオン性界面活性剤及び１μg ／mlの
酵母ＲＮＡ中でフィルターを65℃で 4時間プレハイブリ
ダイズした。

【００５３】３×10⁵ cpm（ 0.7ng／ml）のラベルオリ
ゴＮ２プローブを含有する同じ溶液中でハイブリダイゼ
ーションを47℃で20時間続けた。ラベル付けとしては
［γ−³²Ｐ］−ＡＴＰとＴ４ホスホキナーゼ（Ｈuddles
ton ＆ Ｂrownlee,Ｎucl.Ａcids Ｒes.,10， 1029-10
38, 1981）とを用いてオリゴヌクレオチドを5'ヒドロキ
シル末端でリン酸化した。

【００５４】ハイブリダイゼーションが終ると、フィル
ターを０〜４℃（２時間），25℃（10分），37℃（10
分）及び47℃（10分）の順序で洗った。このスクリーニ
ング後のフィルターをラジオオートグラフィーにかける
と、１つのコロニーがバックグラウンドより高いプラス
の信号を示した。このコロニーをＢIX-1クローンと命名
した。

【００５５】（ii）ｄＣ／ｄＧテイルの付いたライブラ
リーからの単離 前記の如きオリゴＮ２プローブを使用しこのライブラリ
ーを順序正しくスクリーニングすると１つのプラスのク
ローンが同定された。これをＢIX-2クローンと命名し
た。

【００５６】Ｆ．ウシ第IX因子ｃＤＮＡクローンの配列
特性決定 制限エンドヌクレアーゼ開裂によるＢIX-1クローンの特
性決定によれば、このクローンは約430bp のＤＮＡイン
サートを含有していた（簡略化のためデータは省略す
る）。図５に、Ｍaxam−Ｇilbert法によって決定された
コード鎖のヌクレオチド配列の一部を示す。この鎖は 3
04個のヌクレオチドを含んでおり、ウシ第IX因子配列と
の一致の直接的証拠となる。従って、（アミノ酸残基52
-139に対応する） 304−ヌクレオチド配列のほぼ全部
が、既知のウシ第IX因子アミノ酸配列データ（Ｋatayam
a et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,76， 4990-4994,
1979）から予想されたヌクレオチド配列と一致する。こ
の領域では、コードされるアミノ酸がＴhrでなくＡspで
あるヌクレオチド38-40 以外にはＢIX-1と第IX因子の公
表データとの間の不一致は存在しない。このアミノ酸変
化は第２の独立ｃＤＮＡクローンに於いても観察された
（ＢIX-2，下記参照）。 304−ヌクレオチド配列の残
部，即ち図５のかっこ内の部分は、Ｋatayama の公表ウ
シ第IX因子アミノ酸データと一致しない。

【００５７】図５では下線部分はオリゴＮ２プローブ配
列に対応する配列を示しており、＊印はナンセンスコド
ンを示しており、かっこ内部分はＫatayama のアミノ酸
データに一致しない配列を示しており、矢印はＨinf Ｉ
制限部位を示している。Ｋatayama のアミノ酸番号系が
使用されており、この配列はプラスミドのテトラサイク
リン耐性遺伝子の転写方向と対向方向に方向付けされて
いる。

【００５８】同様の方法でＢIX-2クローンは 102個のヌ
クレオチドのＤＮＡインサートを有することが知見され
た。このインサートは図５のヌクレオチド7-108 に亘
る。この領域では、ＢIX-1及びＢIX-2の２つのクローン
のヌクレオチド配列は等しかった。

【００５９】Ｇ．ヒト第IX因子遺伝子の単離 （ｉ）出発クローン−λＨIX-1 Ｌawn et al., Ｃell,15， 1157-1174, 1978によって調
製されたクローンヒトゲノムＤＮＡのライブラリ即ちＨ
aeIII ／ＡluＩラムダファージＣharon 4 Ａライブラリ
ーを使用した。Ｔ．Ｍaniatis et al., Ｃell,15， 68
7, 1978に記載のin situプラークハイブリダイゼーショ
ン手順を用いてこのライブラリーから10⁶ 個のファージ
組換体をスクリーニングした。プレハイブリダイゼーシ
ョンとハイブリダイゼーションとを50％ホルムアミド中
42℃で行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルタ
ーを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝ 0.15mＭ Ｎa Ｃｌ， 1
5mＭクエン酸ナトリウム， pＨ 7.2）と 0.1％ ＳＤＳ
とを用いて室温で洗い、次に１×ＳＳＣと 0.1％ ＳＤ
Ｓとを用いて65℃で洗った。

【００６０】ＢIX-1中でクローニングされた第IX因子 c
ＤＮＡから得た制限断片たる２つのＤＮＡ分子をラジオ
ラベルし、ハイブリダイゼーションのプローブとして使
用した。第１の断片は、図５の番号系のヌクレオチド−
8-317 に対応しており、ＢIX-1プラスミドＤＮＡのＳau
3ＡＩ消化によって単離された。ニックトランスレーシ
ョン（Ｒigby et al.,Ｊ．Ｍol. Ｂiol., 113，237-25
1, 1977,修正，vide infra）を用いて［α−³²Ｐ］−ｄ
ＡＴＰを組込むことによって単離ＤＮＡを高特異的活性
にラベルした。このプローブを使用して10個のクローン
を単離した。これらをプラーク精製し、ＢIX-1クローン
から得た 247−ヌクレオチド断片とリハイブリダイズし
た。ヌクレオチド3-249 から誘導されたこの断片が図５
に示されている。この断片は、Ｋatayama のウシ第IX因
子アミノ酸配列と一致する配列のみを含んでおり、ＢIX
-1プラスミドＤＮＡのＨinf Ｉ消化によって単離され
た。この 247−ヌクレオチドプローブによって唯一つの
クローンがプラスのハイブリダイゼーション信号を示し
た。このクローンを更にプラーク精製し、得られたクロ
ーンを“λＨIX-1”と命名した。

【００６１】（ii）以後のゲノムクローン ヒト肝ｍＲＮＡから得た組換ヒト第IX因子ｃＤＮＡのサ
ブクローンｐＡＴIX cVII を以下の項Ｌに記載の如く調
製し、Ｈind III 及びＢamＨＩで消化して直線化した。
得られた 2kbのｃＤＮＡ分子を１％のアガロースゲル電
気泳動で精製した。電気溶出後、このｃＤＮＡ約100ng
を［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰ（前出）でニックトランスレー
トし、これをハイブリダイゼーションプローブとして使
用し、標準的ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件を用いて別のゲノムクローン用のＨaeIII ／ Ａlu
ＩラムダファージＣharon 4ＡヒトゲノムＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングした。このようにして得られた
２つの更に別のヒト第IX因子ゲノムクローンをλＨIX-2
及びλＨIX-3と命名した。

【００６２】Ｈ．ヒト第IX因子ゲノムクローンの特性決
定 （ｉ）制限マップ 出発λＨIX-1クローンの特性決定のために、種々の制限
エンドヌクレアーゼを用いる種々の単一消化及び二重消
化による開裂と、ウシ第IX因子ｃＤＮＡプローブを用い
るＳouthern ブロッティングとを実施した（簡単のため
に結果は省略する）。その後に単離されたλＨIX-2及び
３クローンの特性決定にも同様のプロセスを用いたが、
但し、Ｓouthern ブロットのためにヒトｃＤＮＡプロー
ブｐＡＴIX cVII （以下の項Ｌ参照）を使用した。これ
らの結果より、λＨIX-2及び３に対応する第IX因子ゲノ
ム中の配列が図６の（ｅ）に示すλＨIX-1とオーバーラ
ップすることが明らかになった。図６の（ｄ）は、制限
酵素ＥcoＲＩ（Ｅ），Ｈind III （Ｈ），ＢglII
（Ｂ），ＢamＨＩ（Ｂａ）及びＰvuII（Ｐ）とを用いた
解析の結果が要約されており、これが制限酵素マップの
役割を果す。

【００６３】（ii）配列決定 以下の項Ｊ（ii）に記載の制限酵素マップの知見に基い
て多数のサブクローンを単離した。これらの大部分はベ
クターｐＡＴ153 ／ＰvuII／８に存在していた。これら
のサブクローンの例が図６の（ｃ）に示されており、適
当な長さの多数のサブクローンをＭaxam−Ｇilbert法
（Ｍaxam ＆ Ｇilbert, Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,Ｕ
ＳＡ，74，56-564, 1980）による配列解析に使用した。

【００６４】まず、サブクローンｐＨIX-17 から得た
1.4kbのＥcoＲＩ制限断片の部分を配列解析した。以下
の項Ｊ（ｉ）参照。 403−ヌクレオチド（塩基対）鎖を
配列解析すると、 129−ヌクレオチド鎖がエクソン領域
中に存在することが確認された。この 129−ヌクレオチ
ド鎖を上記の第IX因子ＤＮＡの決定に使用した。

【００６５】続いて、遺伝子の中央部の 11873塩基領域
を配列決定した（図６の（ｂ）参照）。図７はＤＮＡの
一本鎖の配列を示す。ヌクレオチドは５′→３′方向で
任意に１から 11873まで番号付けされている。元来の 4
03−ヌクレオチド配列は図７のヌクレオチド4372から47
74であり、Ｏ−Ｏ′で示されている。 403−ヌクレオチ
ドの内部に存在する 129−ヌクレオチド配列は図７のヌ
クレオチド4442から4570でありＪ−Ｊ′で示される。こ
れは正確に“ｗ”エクソンに対応する。

【００６６】詳細には、ヌクレオチド配列1-7830は２つ
の短いエクソン（それぞれヌクレオチド 4442-4570及び
7140-7342）を含んでおり、これらは図６（ a）及び図
９でｗ及びｘ，図７でＪ−′Ｊ及びＪ′−Ｊ″で示され
ている。これらは、ヒト第IX因子ｃＤＮＡクローン（図
９）から予想されたアミノ酸配列のアミノ酸85-127及び
128-195をそれぞれコードしている。これらの２つのエ
クソン領域に於いてゲノムクローン及び本発明のｃＤＮ
Ａクローンから予想されたアミノ酸配列に違いはない。
残基7831-11873間の遺伝子の配列は完全ではなく、いく
つかのギャップを含むが、２つの“ＡluＩ反復”配列た
るヌクレオチド 7960-8155及び 9671-9938を含むので遺
伝子の特性決定に役立つ。ＡluＩ配列は多くの遺伝子中
に見られる。反復は正確ではないが、これらの配列の間
には典型的な程度の相同性が見られる。この別の特性決
定は制限酵素マップの正確度に関する有用なクロスチェ
ックとなり得る。このことは、図８の制限酵素チャート
図よりいっそう明らかである。

【００６７】図８は図７の 11873−ヌクレオチド鎖の配
列の配列データのコンピュータ解析で得られたチャート
図である。図８の第１番目の縦列は図７のヌクレオチド
に付された任意のヌクレオチド番号である。第２列は全
配列を１としたきの割合で示されるヌクレオチド番号で
ある。第３列は第４列に示す種々の短いヌクレオチド配
列内でＤＮＡを切断する制限酵素を示す。第４列の短い
配列は第１列の番号のヌクレオチドで始まる。このチャ
ート図を用いて、図６の（ｄ）に示す制限部位の位置と
図６の（ｃ）に示す配列のいくつかとを極めて正確に決
定し得る。例えば配列II−IVは以下の部位での制限によ
って生じる（各部位の5'端の最初のヌクレオチド番号で
示す。

【００６８】 II ： 3624− 4769、 III ： 6380− 7378、 IV ： 10589− 11868。

【００６９】特に重要な部位を図８に矢印で示す。対応
するヌクレオチド番号のいくつかを図６の（ｃ）に示
す。与えられた番号は各部位の５端のヌクレオチドの番
号である。

【００７０】図６の（ｃ）に示すサブクローンＶ，VI，
VII 及びVIIIの配列解析を更に進めると、第IX因子遺伝
子が少なくとも６つのイントロンで隔てられた少なくと
も７つのエクソン領域に分割されていることが判明す
る。図６の（ａ）でエクソンの位置は、t, u，ｖ，ｗ，
ｘ，ｙ及びｚの符号を付けた実線ブロックで示されてい
る。“ｚ”エクソンは格段に長い最長のエクソンであ
り、その3'端はｍＲＮＡの3'端と一致している。ｃＤＮ
Ａ配列に対するこれらのエクソンの相対位置に関しては
以下（項Ｌ）で検討するが、図６の（ａ）に示す“ｔ”
エクソンが遺伝子の5'端のマーカーでないことは明らか
である。何故ならその配列が cＤＮＡクローン（後述）
の末端に相当する5'端の配列と整合しないからである。
このことは、第IX因子遺伝子が5'端では図６の27kb領域
より長く少なくとも１つの別のエクソンを含むことを意
味する。

【００７１】更に、 pＨIX-17 ＤＮＡをＥcoＲＩで消化
した。消化した材料を 0.8％のアガロースゲルで分離
し、電気溶出によって 1.4kbの断片を溶液中に単離し
た。これは常法で保存し得る。この 1.4kbの分子を最初
の配列決定に使用した。約 1.0kbのみが挿入ＤＮＡであ
り、残りの 0.4kbは pＢＲ322 に属する。挿入ＤＮＡの
403−ヌクレオチドの鎖を配列決定し、図７にＯ−Ｏ′
として示す。また、同じ 1.4kbの断片をラベルして項Ｍ
でのプローブとして用いた。

【００７２】Ｉ．ベクターｐＡＴ153 ／ＰvuII／８の構
築 第IX因子ゲノムクローンのＰvuII断片のサブクローニン
グを行なうため及び得られたサブクローンの特性決定を
容易にするために、プラスミドｐＡＴ153 の誘導体を調
製した（Ｔwig ＆Ｓherratt,Ｎature, 283， 216-218,
1980）。部分的に相補的な２つの合成デオキシオリゴヌ
クレオチド，オリゴＮ３及びオリゴＮ４を、項Ｃに前出
の固相ホスホトリエステル法で合成した。各々が、“垂
れ下り（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ ）”ＢamＨＩ及びＨ
ind III 認識配列と内部ＰvuII認識配列とを有する。図
10はオリゴＮ３とオリゴＮ４との構造を示す。ＢamＨＩ
とＨind III とはdsＤＮＡを開裂し、付着性又は“垂れ
下り”末端を生じる。例えばＨind IIIは、各鎖のアデ
ニン担持ヌクレオチド間で −ＡＡＧＣＴＴ、 −ＴＴＣＧＡＡ を開裂し、オリゴＮ３／Ｎ４組合せ中に存在する接着端
相補鎖 −Ａ −ＴＴＣＧＡ を生じる。

【００７３】ｐＡＴ153 をＨind III とＢamＨＩとで消
化し、 0.7％アガロースゲル電気泳動とＵＶ光下の臭化
エチジウム螢光によって可視化された適当なバンドの電
気溶出とを順次行なって、3393−ヌクレオチド鎖の直線
状断片をより短い 346−ヌクレオチド鎖の断片から分離
した。項Ｄ（ｉ）に記載の如く仔ウシ腸ホスファターゼ
により処理し、ＢamＨＩ−Ｈind III3393 −鎖の断片を
オリゴＮ３とオリゴＮ４との当モル混合物に結合した。
この混合物はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰと
によって予処理されて各々の5'末端ＯＨ基がリン酸化さ
れていた。ＭＣ1061のコンピテント菌（前出）を形質転
換し、終濃度20μg ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロ
スにプレートしてから、以後の解析用に11個のコロニー
を選択した。１mlのプラスミド調製物（Ｈolmes and Ｑ
uigley, Ａnalytical Ｂiochem.,114，193-197 （198
1））を11個のコロニーから単離した。次にプラスミド
ＤＮＡについて、制限酵素ＢamＨＩ，Ｈind III 及びＰ
vuIIによって直線化され得る能力を分析した。このアッ
セイで４つのクローンがプラスであり、プラスミドの新
しく構築された部分をＭaxam−Ｇilbert法で配列解析す
るために１つのラベルｐＡＴ153 ／ＰvuII／８を選択し
た。配列のこの部分を特有の制限部位に沿って図11に示
す。下線部分がプラスミド配列の新規な部分である。残
りの部分は親プラスミドｐＡＴ153 に存在している。ベ
クターを（ホスファターゼで処理後）挿入ＰvuII部位に
平滑端クローニングせしめる。クローン化ＤＮＡは適当
な内部制限部位を持たないと推定されるのでＢamＨＩ／
Ｈind III ，ＢamＨＩ／ＣlaＩ又はＢamＨＩ／ＥcoＲＩ
二重消化によって切除され得る。ＰvuII部位に隣接の部
位も³²Ｐで末端ラベルしてＭaxam−Ｇilbert配列決定法
によるクローン化ＤＮＡの端部の特性決定のために使用
され得る。

【００７４】Ｊ．ヒト第IX因子遺伝子のサブクローニン
グ 第IX因子遺伝子の配列決定を行なって血友病Ｂ患者のゲ
ノムＤＮＡの解析（項Ｍ参照）用プローブとして使用す
べきＤＮＡ小断片を単離し易くするための第１ステップ
として以下のサブクローニングテストを実施した。

【００７５】（ｉ）ｐＢＲ322 プラスミドへのサブクロ
ーニング λＨIX-1クローン内の第IX因子ＤＮＡインサート内の約
11kbのＢglII断片（図６）をｐＢＲ322 のＢamＨＩ部位
に挿入した。Ｅ．coli株 ＨＢ101 の形質転換を行なっ
た。得られた“サブクローン”を pＨIX-17 （図12）と
命名した。

【００７６】（ii）ｐＡＴ153 ／ＰvuII／8 へのサブク
ローニング （ａ）ｐＨIX−17からプラスミドＤＮＡを調製しＰvuII
で開裂した。いずれもｐＨIX-17 のＤＮＡインサートか
ら誘導されたばらばらの５つの断片を単離した。これら
の断片のサイズは、約2.3, 1.3, 1.2, 1.1及び 1.0kbで
あった。これらの断片をｐＡＴ153 ／ＰvuＩＩ８8 ベク
ターのＰvuII部位に平滑端結合し、Ｅ．coli ＨＢ101
を形質転換した。2.3, 1.3, 1.2, 1.1及び 1.0kbの断片
を担う５つの組換えＤＮＡクローンが得られた。これら
をそれぞれｐＡＴIXＰvu-1, 2, 3,4 及び 5と命名し
た。図６の（ｃ）ではｐＡＴIXＰvu-2からの第IX因子Ｄ
ＮＡがIVと略記され、ｐＡＴIXＰvu-5のものはIII と略
記されている。

【００７７】（ｂ）λＨIX-1ゲノムクローンからのファ
ージＤＮＡをＥcoＲＩで消化した。いずれもファージへ
のインサートから誘導された異なる３つの断片（約5,
2.3, 0.96kb，図６）を単離し、ＥcoＲＩ部位でｐＡＴ1
53 ／ＰvuII／８に挿入し、Ｅ．coli ＨＢ101 にクロ
ーニングしてサブクローンを形成した。各断片より得ら
れた３つのクローンをそれぞれｐＡＴIXＥco- １，２及
び４と命名し、図６の（ｄ）の制限マップに示す。ｐＡ
ＴIX Ｅco-1をＥcoＲＩとＢglIIとによって更に消化
し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫlenow 断片を用いて制限
部位の“垂れ下り端”にデオキシヌクレオシドトリホス
フェートを充填した。アガロースゲル電気泳動と電気溶
出によって得られた 1.1kbの断片を単離し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いてｐＡＴ153 ／ＰvuIIのＰvuII部位に平
滑端結合し、Ｅ．coli ＭＣ1061を形質転換せしめた。
得られたサブクローンをｐＡＴIXＢＥと命名し、その第
IX因子ＤＮＡ配列を図６の（ｃ）でIIと略記する。

【００７８】（ｃ）λＨIX-2からのファージＤＮＡをＨ
ind III とＥcoＲＩとで消化し、特に1.8kb と2.6kb と
の断片を得た。これらの断片を別々に溶出し、上記
（ｂ）の如く充填し、上記の如くｐＡＴ153 ／ＰvuII／
８のＰvuII部位にクローニングし、Ｅ．coli ＭＣ1061
を形質転換せしめた。得られたクローンをそれぞれｐＡ
ＴIXＨＥ-1及びｐＡＴIXＥco-6と命名し、それぞれの第
IX因子ＤＮＡ配列を図６の（ｃ）にＶ及びVIと略記す
る。

【００７９】（ｄ）λＨIX-3からのファージＤＮＡをＥ
coＲＩ及びＨind III で消化し、2.3kb 及び2.7kb の断
片を上記（ｃ）と全く同様にサブクローニングした。得
られたクローンをそれぞれｐＡＴIXＥＨ-1及びｐＡＴIX
ＨＥ-2と命名し、図６の（ｃ）に略号VII 及びVIIIで示
す。

【００８０】Ｋ．ヒト肝ｍＲＮＡから得たｃＤＮＡクロ
ーンライブラリーの調製 ヒト肝からｍＲＮＡを抽出し、“翻訳アッセイ”を使用
しないこと以外は前記の項ＢのウシｍＲＮＡの場合と全
く同様にして20-22 Ｓvedberg ユニットの濃縮したｍＲ
ＮＡ画分を調製した。二本鎖ＤＮＡを構築するための第
１ステップでは、米国スタンフォード大学のＰ．Ｂerg
教授の研究室より教示戴いた“Ｓtanford プロトコル”
を使用した。これ自体はＷickens, Ｂuell ＆ Ｓchim
ke（Ｊ．Ｂiol.Ｃhem., 253， 2483-2495，1978）の修
正方法であり、以下の記載に含まれるいくつかの別の修
正は本出願に係る研究中になされたものである。

【００８１】第一鎖ｃＤＮＡの合成のためには、６μg
のポリ（Ａ）＋20-22 ＳヒトｍＲＮＡを５μl の10×バ
ッファ（ 0.5Ｍトリス−塩化物，室温で pＨ 8.5， 0.4
ＭＫＣｌ，0.08Ｍ Ｍg Ｃｌ₂ 及び４ｍＭジチオトレイ
トール）と20μl の各2.5mＭの４種のデオキシヌクレオ
シドトリホスフェートの混合物と 0.5μl のオリゴｄＴ
_12-18 と１μl （ 0.5μＣｉ含有）の［α−³²Ｐ］−ｄ
ＡＴＰと２μl の逆転写酵素（14ユニット／μl ）と共
に、脱イオン水を加えて容量50μl にしてインキュベー
トした。42℃で１時間インキュベートし、溶液を 1.5分
間沸騰させ、次に氷で急冷した。第二鎖の合成のために
は、上記溶液に20μl の５×第二鎖バッファ（ 250ｍＭ
のＨepes／ＫＯＨ， pＨ6.9 ，250mＭ ＫＣｌ， 50mＭ
ＭgＣｌ₂ ）と４μl の各2.5mＭの４種のデオキシヌ
クレオシドトリホスフェートの混合物と、10μl のＥ．
coliＤＮＡポリロラーゼＩ（６ユニット／μl ）とを直
接添加し、脱イオン水を加えて溶液量を 100μl にし
た。15℃で５時間インキュベートした後、 400μl のＳ
₁ ヌクレアーゼバッファ（0.03Ｍ酢酸ナトリウム，pＨ
4.4 ，0.25Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ Ｚn ＳＯ₄ ）と１μ
l のＳ₁ ヌクレアーゼ（ 500ユニット／μl ）とを加え
てＳ₁ ヌクレアーゼ消化を生起した。37℃で30分間イン
キュベートした後、10μl の 0.5Ｍ ＥＤＴＡ（ pＨ
8.0）を加えた。等容のフェノール：クロロホルム
（１：１）混合物と共に振盪し、次に水相をエーテル抽
出し倍容のエタノールを加えてdsＤＮＡを沈澱させるこ
とによって二本鎖ＤＮＡを脱タンパク処理した。−20℃
で16時間維持後、dsＤＮＡを遠心分離によって回収し
た。Ｓ₁ 端にＤＮＡポリメラーゼＩを“充填する”ため
に、 0.02mＭ dＮＴＰと６ユニットのＤＮＡポリメラー
ゼＩとを加えた25μl の 50mＭトリス−塩化物， pＨ
7.5， 10mＭ Ｍg Ｃｌ，5mＭジチオトレイトールに溶
解したサンプルを更にインキュベートした。室温で10分
間インキュベートした後、５μl のＥＤＴＡ（ 0.1Ｍ，
pＨ 7.4）と３μl の５％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）とを加えた。

【００８２】プロトコルの以下の部分は“Ｓtanford プ
ロトコル”とは異なっている。サンプルを分画するため
に“ミニ”−ＳephacrylＳ400 カラムと使い捨て１mlピ
ペットと 0.2Ｍ Ｎa Ｃｌ，10ｍＭトリス−塩化物， p
Ｈ 7.5及び１ｍＭ ＥＤＴＡとを用いた。放射能の“急
上昇”ピークの最初の70％をプールし（ 0.4ml），等容
の n−ブタノール：クロロホルム（１：４）と共に振盪
して脱タンパク処理した。担体として１μg の酵母ＲＮ
Ａ（ＢＤＨ）を水相に加え、次に倍容のエタノールを加
えた。−20℃で16時間維持後、遠心分離によって二本鎖
ＤＮＡを回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて（上記Ｉ
及びＪ（ii）参照）、仔ウシ腸ホスファターゼ処理しＰ
vuII切断した pＡＴ153 ／ＰvuII／８中に平滑端結合し
た。トライアルテストによれば、サンプルのバルクを 2
00ngのベクターＤＮＡと共に適当なバッファ（１ｍＭ
ＡＴＰ， 50mＭトリス−塩酸塩， pＨ 7.4， 10mＭ Ｍ
gＣｌ₂ 及び 12mＭジチオトレイトール）中で10μl の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用し、総量 0.2μl でインキュ
ベートすると、その後Ｅ．coli ＭＣ1061コンピテント
菌を形質転換したときに合計で58,000のアンピシリン耐
性コロニーが得られた。これらのうちの20％までは、ベ
クター自体の再結合により誘導された“バックグラウン
ド”非組換体から誘導されたと推定された。Ｅ． coli
を37℃で更に6時間増殖させて 20-22ＳｃＤＮＡライブ
ラリーを増幅した。第IX因子ｃＤＮＡクローンをスクリ
ーニングするまでは増幅ライブラリーの１mlの部分サン
プルを15％のグリセロールを含むＬ−ブロス中に−20℃
で保存した。

【００８３】Ｌ．ヒト第IX因子ｃＤＮＡクローンの単離
及び配列解析 増幅 20-22ＳヒトｃＤＮＡライブラリーの 6,000個のコ
ロニーを15cmの寒天プレート10個の各々にプレートし、
１晩増殖させてから、Ｗhatman 541フィルターペーパー
にブロットした。上記の項Ｅ（ｉ）と同様にして、ハイ
ブラダイゼーション用のフィルターを調製し、固定化コ
ロニーを、ｐＡＴIXＢＥサブクローン（項Ｊ，前出）か
ら単離し［α−³²Ｐ］−ニックトランスレーションした
ヒト第IX因子ゲノムＤＮＡの1.1kb 分子にプローブし
た。第IX因子ゲノム cＤＮＡのこの直線状1.1kb 部分
は、ｐＡＴIXＢＥを制限酵素ＢamＨＩ及びＨind III で
開裂し次に 1.5％アガロースゲル電気泳動でベクターか
ら1.1kb 部分を分離することによって単離された。電気
溶出後、前記同様のニックトランスレーションを実施
し、材料を３×ＳＳＣと10× Ｄenhardts溶液と 0.1％
ＳＤＳと50μg ／mlの超音波処理変性Ｅ．coliＤＮＡと
100μg ／mlの超音波処理変性ニシン精子ＤＮＡとの中
での65℃，16時間のハイブリダイゼーション反応に使用
した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを65℃で
３×ＳＳＣ， 0.1％ＳＤＳ（１／２時間ずつ２回），及
び２×ＳＳＣ， 0.1％ＳＤＳ（１／２時間ずつ２回）を
用いて順次洗った。ラジオオートグラフィー後、７つの
クローンがプラスで選択されたが、希釈し上記同様のハ
イブリダイゼーションによって再スクリーニングすると
５つだけがプラスであることが判明した。これらの５つ
のクローンの各々からプラスミドＤＮＡを単離し、１％
アガロースゲル電気泳動での電気泳動度から判断した５
つのうちの最長と考えられるクローンを配列解析用に選
択し、ｐＡＴIX cVII と命名した。部分的配列解析のた
めにｐＡＴIX CVII と命名された２番目に長いクローン
も選択した。

【００８４】Ｍaxam−Ｇilbert法で配列決定を行なっ
た。配列の2778−ヌクレオチド鎖の部分を図９に示す。
ヌクレオチド115-2002はクローンｐＡＴIX cVII の配列
決定から誘導された（このクローンは5'方向でヌクレオ
チド17まで伸びるので実際にはもっと長い。17と 111と
の間の配列は主として人為的クローニング操作の故に、
配列の残りの部分に対して逆転している）。ヌクレオチ
ド 1-130は図９のヌクレオチド1-1548から伸びるクロー
ンｐＡＴIX cVIから誘導された。配列 2002-2778は４つ
の付加的クローン即ち pＡＴIX108.1, pＡＴIX108.2, p
ＡＴIX108.3 及びpＡＴIXＤＢなる名称のクローンの単
離によって誘導された。最初の３つは上記の項Ｋと全く
同様の手順を用いるが、二本鎖ＤＮＡをサイズに従って
分画するために“Ｓephacryl”Ｓ-400でのクロマトグラ
フィーの代わりにショ糖濃度勾配遠心分離を用いて構築
されたｃＤＮＡクローンのミニライブラリー（名称ＧＧ
Ｂ108 ）から誘導された。分子量 1kb-5kbの画分を選択
し約20％のバックグラウンド非組換えクローンを含む1
0,000個の独立クローンの増幅ライブラリーを得た。ク
ローンｐＡＴIXＤＢは別のｃＤＮＡライブラリー（名称
ＤＢ１）から誘導された。ＤＢ１は項Ｋの記載と同様に
構築されたが、出発材料として全ポリＡ＋ヒト肝ｍＲＮ
Ａを使用し、ＤＮＡをサイズに従って分画するためには
ミニライブラリーＧＧＢ108 の構築の場合と同じくショ
糖濃度勾配遠心分離を使用した。このライブラリーの複
雑さ（complexity）は95,000であり、50％のバックグラ
ウンド非組換体を含むと推定された。クローン pＡＴIX
108.1 と pＡＴIX108.2 とは30個のハイブリダイゼーシ
ョンプラスのクローンから成るグループから選択され
た。後者のクローンはＳau 3ＡＩ制限酵素断片から誘導
された³²Ｐ−ニックトランスレーションしたプローブを
用いたミニライブラリーＧＧＢ108 のＧrunstein−Ｈog
nessスクリーニングによって単離された。Ｓau 3ＡＩ制
限酵素断片自体は、クローン pＡＴIX cVII のヌクレオ
チド 1796-2002から誘導された。 pＡＴIX108.1からヌ
クレオチド 2009-2756の配列を決定した（図９）。これ
によれば、 pＡＴIX108.2 の一部、特にヌクレオチド 1
950-2086の配列が pＡＴIX cVII とのオーバーラップを
生じた。残りの28個のハイブリダイゼーションプラスの
クローンをスクリーニングするために、制限酵素ＥcoＲ
Ｉ，ＢamＨＩ及びＨind III による三重消化を行ない、
消化産物から2480位の切断部から3'方向に伸びるＥcoＲ
Ｉ制限断片をスクリーニングした。この方法でクローン
pＡＴIX108.3 を選択し、ヌクレオチド 2642-2778から
配列決定した。このクローンの後に３つのＡヌクレオチ
ドが続いており、その後同様の方法でクローン pＡＴIX
ＤＢを単離することによって、先の配列がポリＡテイル
の痕跡マーカー（vestigial marke ）であることが確認
された。 pＡＴIXＤＢは2760-2778 から配列決定され42
個のＡヌクレオチドで終結しており、従ってｍＲＮＡの
3'端をマークする。

【００８５】図９は、推定アミノ酸配列が 456個のアミ
ノ酸のタンパクをコードしており、この中には確定鎖長
の第IX因子タンパクのＮ末端チロシン残基（Ｙ^* ）に先
行する前駆体アミノ酸配列の41個の残基が含まれている
ことを示す。タンパクの前駆体部分は、塩基性アミノ酸
領域（アミノ酸−１乃至−４）と、より普通の疎水性シ
グナルペプチド領域（アミノ酸−21乃至−36）とを示
す。

【００８６】確定第IX因子タンパクは、アミノ酸７，
８，15，17，20，21，26，27，30，33，36及び40に12個
の可能なγ−カルボキシグルタミン酸残基を有する 415
個のアミノ酸から成る。２つの可能なカルボハイドレー
ト付加部位は、アミノ酸残基157 及び167 にある。活性
ペプチドは残基146-180 を包含しており、これらは第IX
因子の活性化の際（発明の背景参照）Ｒ−Ａ及びＲ−Ｖ
結合のペプチド開裂によって切除される。これにより、
残基1-145 に亘るＬ鎖と残基181-415 に亘るＨ鎖とが残
る。

【００８７】エクソン間の境界の正確な位置（項Ｈ，前
出）とｍＲＮＡ中でこれらがいかに結合されるかを図９
に示されている。エクソンはｔ，ｕ，ｖ，ｗ，ｘ，ｙ，
ｚで示される。エクソン領域とタンパク領域とがほぼ一
致していることが理解されよう。例えば、シグナルペプ
チドのエクソンはＧＬＡ領域のエクソンとは別のもので
ある。また、活性ペプチドのエクソンはセリンタンパク
分解酵素領域から離れている。

【００８８】mＲＮＡの3'非コード領域は長く、1390個
の残基から成る（ＵＡＡＵＧＡ二重停止コドン1389-139
4 を含むが、ポリＡテイルを含まない）。

【００８９】第IX因子ｃＤＮＡは制限酵素ＨaeIII によ
って開裂されて、ヌクレオチド133-1440の断片、即ち確
定第IX因子タンパク配列を完全に含むＤＮＡの1307−ヌ
クレオチド鎖の領域を生じ得る。ＨaeIII により認識さ
れるヌクレオチド配列はＧＧＣＣである。この断片は、
細菌，酵母又は哺乳動物の細胞中で適当なプロモーター
から第IX因子タンパクを発現するための好適な出発材料
になるであろう。別の好適な出発材料は（疎水性シグナ
ルペプチド領域の早期部分に対応する）残基41の唯一つ
のＳtuＩ部位を使用し、これを適当なプロモーターに結
合して誘導されるであろう。ＳtuＩによって認識される
ヌクレオチド配列はＡＧＧＣＣＴである。

【００９０】Ｍ．健常ＤＮＡとクリスマス病患者ＤＮＡ
とのＳouthern 分析 （ｉ）健 常 標準（Ｓouthern ）ブロット法（Ｓouthern,Ｊ．Ｍol.
Ｂiol., 98， 503-517, 1975）を使用した。典型的なテ
ストでは、（未培養血球又は培養リンパ球から調製され
た）10〜20μg のヒトゲノムＤＮＡを多数の制限エンド
ヌクレアーゼの１つで消化し、単一ゲルスロットに充填
した。 0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセ
ルロースに移した後、³²Ｐ−ラベルプローブII又は 1.4
kbＥcoＲＩ断片（項Ｈ参照）をプローブとしてハイブリ
ダイズした。プローブをラベルするために、Ｒigby et
al.,前出の方法を以下の如く修正して使用し、ニックト
ランスレーションを実施した。0.05Ｍのトリス−ＨＣ
ｌ， pＨ 7.5と0.01Ｍ ＭgＣｌ₂ と 0.001Ｍジチオト
レイトールと各々が20μl 容量中での終濃度20μＭを示
すｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰとの中で、約 100ng
のプローブと40μＣｉの［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰ（活性約
3,000Ｃｉ／ｍＭ，Ａmersham ＩnternationalＰＬＣか
ら入手）とを混合した。これに１μl の“溶液Ｘ”を加
えた。“溶液Ｘ”は、６ユニットのＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（Ｅ．coli）と 0.6ngのスイ臓ＤＮase Ｉ（Ｗorthin
gton）と１μg の結晶性ＢＳＡとを、0.05Ｍのトリス−
ＨＣｌ， pＨ 7.5と0.01Ｍ Ｍg Ｃｌ₂ と 0.001Ｍジチ
オトレイトールとを含む50容量／容量％のグリセロール
10μl に混合して調製されたものである。混合物を15℃
で２時間インキュベートし、高分子量ＤＮＡをＧ-100
“Ｓephadex ”クロマトグラフィーで精製した。図13
は、プローブII（図６）又はラベルされた1.4kb ＥcoＲ
Ｉ断片によってプローブされた健常個体から得たＤＮＡ
の主バンドを示す。使用した４つの酵素，ＥcoＲＩ，Ｈ
ind III ，ＢglII及びＢclＩの各々について約4.8 ，5.
2 ，11及び 1.7kbの単一主バンドが得られた。

【００９１】これらの制限断片がクローンλＨIX-1の制
限マッブで観察される断片と同じ長さを有していたこと
は、Ｓouthern ブロット法の条件が全ＤＮＡ調製物中の
第IX因子遺伝子を検出し得るべく十分に正確であったこ
とを確証する。これがクリスマス病患者の血液から採取
したＤＮＡの分析の基礎になる。

【００９２】（ii）遺伝子欠失を伴うクリスマス病患者 何人かのクリスマス病患者の遺伝子変容アッセイに本発
明プローブが有効であることは、以下のテストで証明さ
れた。テストのために、第IX因子に対する抗体が増えて
いる２人の重症のクリスマス病患者を選択した。50mlの
血液から得たＤＮＡをＥcoＲＩ，Ｈind III ，ＢglII及
びＢclＩのそれぞれで別々に消化し、³²Ｐ−ニックトラ
ンスレーションしたプローブII（図６）でプローブする
ためのＳouthern ブロットを調製した。コントロール消
化物が図13のパターンを生じるような条件下ではいずれ
の患者にも特異的バンドは全く観察されなかった。ま
た、プローブIIの代りにプローブＩ，III 又はIV（図
６）を使用したときにも患者の特異的バンドは観察され
なかった。“マイナス”信号が生じるような何らかのミ
スが人為的実験操作中に生じる可能性があり、これをコ
ントロールするために、第IX因子遺伝子プローブ（この
場合 pＡＴIX cVII −ｃＤＮＡプローブ）をヒトＡ１ア
ポリポタンパク（Ｓhoulders and Ｂaralle，Ｎucl.Ａ
cids Ｒes.,10，4873-4882, 1982）に特異的な非対応
常染色体遺伝子プローブと混合した。この実験によれ
ば、患者１がＥcoＲＩ消化物中の12kbバンドによって特
徴付けられる正常Ａ１アポリポタンパク遺伝子を有する
ことが証明され、同時に正常第IX因子遺伝子に特有のも
のとして pＡＴIX cVII で観察される 5.5kbバンドが欠
如していることが確認された。結論として、患者はいず
れも第IX因子遺伝子から少なくとも18kbが欠失した配列
を有していた。同じく第IX因子に対する抗体が増えてい
た別の２人の患者、即ち患者３及び４は、本発明の第IX
因子遺伝子のプローブの或るものを用いるとＳouthern
ブロットの正常位置又は異常位置にバンドを生じたが、
他のものを用いるとこのようなバンドは生じなかった。
このことは、これらの患者では遺伝子の欠失があまり広
範囲に及んでいないこと、欠失がおそらく約９kbの長さ
であることを示唆する。

【００９３】これらの結果より血族中での血友病患者及
び女性異型接合体（保因者）の診断が可能になることが
予想され、このことについては目下検討中である。バン
ドが存在しないか又は異常位置にバンドが存在するかに
関わりなく、患者のＤＮＡ中に見られる変容パターンは
“疾病マーカー”の機能を果し、保因者の疑いがあると
きにこのパターンの有無を検査するとよい。胎児細胞の
ＤＮＡを羊膜穿刺で入手することができるならば、出産
前診断にも同じテストを使用し得る。“遺伝子診断法”
は胎児第IX因子タンパクレベルのアッセイに基く既存の
出産前診断法をかなり改良し、更に、妊娠のより初期に
検査実施し得るという利点を与える。対立遺伝子マーカ
ーとして第IX因子遺伝子内の天然多形性を用いる遺伝的
方法では、 100％の保因者検出が可能となり、或る程度
の確率で患者を生じる従来のやや不完全な方法を改良す
る。

【００９４】寄託機関は、特許請求の範囲に示す如くＮ
ational Ｃollec-tion of Ｉndustrial Ｂacteria,Ｔ
orry Ｒesearch Ｓta- tion，ＰＯ Ｂox 31, 135 Ａ
bbeyＲoad,Ａberdeen ＡＢ9 8ＤＧ Ｓcotland であ
る。また、λＨIX-1b ファージの好適宿主たる上記Ｅ．
coli Ｋ−12株803 は、1982年 7月26日にＮＣＩＢに受
託番号 11752で寄託された。全ての寄託は、特許手続の
ための微生物寄託についての国際間承認に関するブダペ
スト条約の規約に基いてなされたものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシ第IX因子ポリペプチドの刊行物に記載され
ているアミノ酸配列の構造と、この配列に翻訳する際に
用いられるｍＲＮＡの推定配列と、本発明で合成される
オリゴヌクレオチド（オリゴ−Ｎ２及びＮ２）の構造と
を示す；

【図２】図１及び図11に示すオリゴヌクレオチドの合成
に使用される“構築ブロック”の化学式を示す。

【図３】図１及び図11に示すオリゴヌクレオチドの合成
に使用される“構築ブロック”の化学式を示す。

【図４】オリゴヌクレオチドの合成装置を示す部分断面
立面図である。

【図５】本発明で得られるウシ第IX因子ｃＤＮＡの一部
の配列を示す。

【図６】約27kbの長さのヒト第IX因子ゲノムＤＮＡの構
成（organisation）を示すマップであり、 5部に分けら
れており、（ａ）はエクソン領域；（ｂ）は配列決定さ
れた11,873−ヌクレオチド鎖；（ｃ）は種々のエンドヌ
クレアーゼを用いた制限によって得られサブクローニン
グされた後、プローブとして使用されるｃＤＮＡ分子；
（ｄ）は種々のエンドヌクレアーゼを用いた制限によっ
て得られたＤＮＡ分子；（ｅ）はラムダファージベクタ
ー中の３つのクローンから得られたヒト第IX因子ゲノム
ＤＮＡの３つの領域をそれぞれ示す。

【図７Ａ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｂ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｃ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｄ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｅ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｆ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｇ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｈ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図７Ｉ】図６（ｂ）のＤＮＡの配列とコードされてい
るタンパクの一部とを示す。

【図８Ａ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｂ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｃ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｄ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｅ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｆ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｇ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｈ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｉ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｊ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｋ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｌ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｍ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図８Ｎ】図７Ａから７Ｉの配列の制限酵素チャート図
を示す。

【図９Ａ】ヒト第IX因子 cＤＮＡとそれがコードしてい
るタンパクとの配列の一部を示す。

【図９Ｂ】ヒト第IX因子 cＤＮＡとそれがコードしてい
るタンパクとの配列の一部を示す。

【図９Ｃ】ヒト第IX因子 cＤＮＡとそれがコードしてい
るタンパクとの配列の一部を示す。

【図１０】本発明で合成される１対の相補的オリゴヌク
レオチド（オリゴＮ３及びＮ４）の構造を示す。

【図１１】ｐＡＴ153 に対して相違を示す領域で本発明
ベクターｐＡＴ153 ／ＰvuII／８のＤＮＡ配列の一部を
示す。

【図１２】プローブ作製と初期配列決定とに使用される
1.4kb断片のオリジンを示す本発明のプラスミド pＨ第
IX17のダイヤグラムを示す。

【図１３】制限酵素ＥcoＲＩ（Ｅ），Ｈind III
（Ｈ），ＢglII（Ｂ）及びＢclＩ（Ｂc）により切断さ
れた正常ヒトＤＮＡの“Ｓouthern ブロット”を本発明
の組換ヒト第IX因子ＤＮＡのサブクローンでプローブす
るときの主放射能バンドの位置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 コン・ホン・チヨー アメリカ合衆国、カリフオルニア・94114、 サン・フランシスコ、ロウアー・テラス・ 127

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組換えＤＮＡ技術によって製造され、イ
   ンビボでビタミンＫ−依存性酵素の作用によりヒト第IX
   因子ポリペプチドに変換し得るヒト第IX因子ポリペプチ
   ド前駆体をコードし、かつ下記のアミノ酸配列 Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala をコードするヌクレオチド配列を含有する人工ＤＮＡ、
   又はその相補体。
2. 【請求項２】 ヒト第IX因子ゲノムから転写され得るヒ
   ト第IX因子メッセンジャーＲＮＡに相補的である請求項
   １に記載の人工ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 クローニングベヒクルＤＮＡ配列と、こ
   のクローニングベヒクルとは異種であり、組換えＤＮＡ
   技術によって製造され、インビボでビタミンＫ−依存性
   酵素の作用によりヒト第IX因子ポリペプチドに変換し得
   るヒト第IX因子ポリペプチド前駆体をコードし、かつ下
   記のアミノ酸配列 Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala をコードするヌクレオチド配列を含有する人工ＤＮＡの
   配列とを含む組換えＤＮＡ。
4. 【請求項４】 クローニングベヒクルＤＮＡ配列と、こ
   のクローニングベヒクルとは異種であり、組換えＤＮＡ
   技術によって製造され、インビボでビタミンＫ−依存性
   酵素の作用によりヒト第IX因子ポリペプチドに変換し得
   るヒト第IX因子ポリペプチド前駆体をコードし、かつ下
   記のアミノ酸配列 Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala をコードするヌクレオチド配列を含有する人工ＤＮＡの
   配列とを含んでいる組換えＤＮＡで形質転換された細菌
   宿主細胞。
5. 【請求項５】 大腸菌である、請求項４に記載の宿主細
   胞。