JPS62111690A - ヒト―プロテインｃをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は一般に、血漿蛋白質及びそれらをコードする
ＤＮＡ配列に関し、そしてさらに詳しくはヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白
質の発現に関する。

〔従来の技術〕

プロティンＣは、インビボにおける血液凝固の制御及び
フィブリン溶解活性の発生において１要な役割を演する
セリンプロテアーゼのチモーゲン（ｚｙｍｏｇｅｎ）又
は前駆体である。これは肝臓内で単鎖ポリペプチドとし
て合成され、この単鎖ポリペプチドはかなりのプロセシ
ングヲ受ケて、ジスルフィド結合により一体化されたヘ
ビー鎖（Ｍｒ＝４０，０００）及びライト鎖（Ｍｒ＝２
１，０００　）から成る２本鎖分子となる。循環する２
本鎖中間体が、ヘビー鎖のアミン末端からの１２−残基
ヘテテドのスロンビン介在開裂により、“活性化された
プロティンＣ’　（ＡＰＣ）として知られている生物学
的に活性な形態の分子に転換される。この開裂反応は、
インビボにおいて、内皮細胞コファクターであるスロン
ボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）により
増強される（　Ｅｓｍｏｎ及びＯｗｅｎ、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。

１９８１）。

プロティンｃｈビタミンに一依存性グリコプロテインで
あって、約９残基のγ−カルデキシグルタミン酸（Ｇｌ
ｍ　）及び１当量のβ−ヒドロキンアス／？ラギン酸を
含有し、これらはそれぞれグルタミン酸残基及びアスパ
ラギンｒＲ残基の翻訳後修飾によって形成される。プロ
ティンＣ中の特定のγ−カルデキシグルタミン酸残基の
翻訳後形成はビタミンＫを必要とする。これらの異常な
アミノ醗残基はカルシウムイオンに結合し、そしてこの
蛋白質とホスホリピドとの相互作用を担轟すると信じら
れ、この相互作用はプロティンＣの生物学的活性を必要
とする。

他のビタミンに一依存性血漿蛋白實、例えはファクター
■、ファクター■、及びファクターＸの凝固促進作用と
異り、活性化されたプロティンＣは限定された蛋白質分
解によるファクター■扱ひファクター■ａの不活性化を
介して凝固過程の制御物質として機能する。プロティン
Ｃによるファクター■１及び■への不活性化は酸性ホス
ホリピド及びカルシウムイオンの存在に依存する。テロ
ティンＳはＡＰＣにより触媒されるファクター■ａの蛋
白質分解を促進することによりこの活性を制御すること
が報告されている（　Ｗａｌｋｅｒ　、　Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ　、Ｃｈｅｍ。

２５５　二　５５２１−５５２４．　１９８０）　。

プロティンＣはまた１組織型プラスミノーグンアクチベ
ーターの作用と関連付けられている（　Ｋ１５ｉ＠ｌ及
びＦｕｊｉｋａｗａ、Ｂ＊ｈｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔ、Ｍｌ
ｔｔ。

７３　：２９−４２．１９８３）。ウシＡＰＣのイヌへ
の注入はプラスミノーグンアクチベーター活性の増加を
もたらす（Ｃｏｍｐ及びＥｇｍｏｎ　＋　Ｊ、Ｃｌ１ｎ
。

は培養された内皮細胞へのＭ（の添加がや件調節された
培地中でのフィブリン溶解活性の急速で投与量依存的な
増加を導き、細胞によるウロキナーゼ関連及び組織型プ
ラスミノ−ｒンアクチベーターの両省の活性の増加を反
映することを示している。

先天性のプロティンＣ欠Ｄ４は再発性血栓性疾患と関連
しく　Ｂｒｏｅｋｍａｎｓ等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ
、Ｍｅｄ。

３０９：３４０−３４４．１９８３：及びＳ＠１１ｇ５
ｏｈｎ等、　Ｎ６Ｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３１０　
：５５９−５６２．１９８４）、そして遺伝子的不調又
は外傷、例えは肝臓病又は外科手術から生ずるであろう
。この状態は一般に経口抗縦固剤により治療される。プ
ロティンＣ含有正常血漿の注入によっても有利な結果が
得られた（　Ｑａｒｄｉｎｅｔ及びＧｒｉｆｆｉｎ　ａ
　Ｐｒｏｇ、　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ｒ　Ｂｒ
ｏｗｎ。

Ｇｒｕｎａ及び５ｔｒａｔｔｏｎ　ＩＱ　、ニューヨー
ク、１３：２５６−２７８を参照のこと）。さらに、若
干の研究者は、デロテ４ンＣの抗凝固活性が血栓性不調
、例えば静脈血栓症の治療において有用であることを見
出している（ＷＯ８５１００５２１）。世界の幾つかの
地域で、１６，０００の個体中およそ１個体がプロティ
ンＣ欠損を示すことが予想される。さらに、プロティン
Ｃの完全な欠損は初生児においては致命的である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

天然プロティンＣは凝因子濃縮物から（Ｍａｒｌａｒ等
、Ｂｌｏｏｄ、５９：１０６７−１０７２）又は血漿か
ら（Ｋ１５ｉｅｌ　ｅ前掲）精製することができるが、
出発材料の限定された人手可能性及び血漿中でのプロテ
ィンＣの低い濃度のために、この方法は複雑で高価な方
法である。従って、ヒト血液に由来する生成物の療法的
使用は、例えば肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス、
又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ　）の原因剤によ
る病気の伝染の危険を有する。血栓性疾患の治療におけ
るプロティンＣの臨床的適用の可能性の観点から、プロ
ティンＣ及び活性化されたプロティンＣの有用な童の製
造が明らかに重要である。

〔問題点を解決するだめの手段〕

要約すれば、この発明は、ヒト−プロテインＣ又は活性
化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／
又は生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を開示する。さらに、この発明は、哺乳類宿主細胞Ｄ
ＮＡに組み込まれることができ、プロモーター、及びこ
れに続きその下流にあるヒト−プロテインＣ又は活性化
されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又
は活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を
宮有し、このヌクレオチド配列の転写が前記デデニレー
ションシグナルが存在する。１つの具体例においては、
この発現ベクターは、前記ヌクレオチド配列とポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルとの間に位置する選択マーカーを
含有し、この選択マーカーの転写は前記プロモーターに
より指令される。発現ベクターはまた１セツトのＲＮＡ
スプライシング部位を含有することができる。

この発明の関連する観点は、活性化されたヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ生物学的活性を活性化後に有する
蛋白質を発現するためにトランスフェクトされた哺乳類
細胞を開示する。この哺乳類細胞は哺乳類宿主細胞ＤＮ
Ａに組み込まれ得る発現ベクターによりトランスフェク
トされ、この発現ベクターは、プロモーター、並びにこ
れに続きその下流に存在する、ヒト−プロテインＣと実
質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白質をコード
するヌクレオチド配列を含有する。１つの具体例におい
て１選択マーカーが細胞に導入され、そして安定にトラ
ンスフェクトされた細胞が選択される。活性化されたヒ
ト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を有する
蛋白質を発現するために形質転換された哺乳類細胞も開
示される。

この発明の他の観点は、活性化されたヒト−プロテイン
Ｃと実質的に１ＥｆＪじ生物学的活性を活性化後に有す
る蛋白質の製造方法を開示する。この方法は、（ａ）ヒ
ト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を
有する蛋白ＪＲをコードする配列を含んで成る発現ユニ
ットを哺乳類宿主細胞に導入し；（ｂ）この哺乳類宿主
細胞を適当な培地中で増殖せしめ；そして（ｃ）前記発
現ユニットによりコードされておりそして前記哺乳類宿
主細胞によって生産された蛋白質生成物を単離すること
を含んで成る。この方法によって製造された蛋白質生成
物も開示される。活性化されたヒト−プロテインＣと実
質的に同じ構造及び／又は生物学的活性を有する蛋白質
の製造方法も開示される。

この発明において記載される蛋白質は、皿液縦固の制御
を言む活性療法物質として使用することができる。さら
に、これらの蛋白５！は、適当な医薬組成物を提供する
ために生理的に許容される担体及び／又ＵＮＩ釈剤と混
合することができる。

この発明の他の観点は、詳細な記載及び図面への言及に
よって明らかになるであろう。

〔具体的な説明〕

この発明を記載するに先立って以下に使用する用語の定
義を記載するのが発明の理解のために有用であろう。

生物学的活性：生物学的内容物（すなわち生物体又はイ
ンビトロ模倣物）中の分子により行われる１つの機能又
は１セツトの機能である。蛋白質の生物学的活性は触媒
活性とエフェクター活性とに分けることができる。ビタ
ミンに一依存性血漿蛋白質の触媒活性は基質の活性化又
は不油性化をもたらす他の血漿蛋白質基質の特異的蛋白
質分熱的開裂を含む。エフェクター活性は生物学的に活
性な分子のカルシウムもしくは他の小分子への、大分子
、例えは蛋白質への、又は細胞への％異的結合を首む。

エフェクター活性はしはしは生理的条件下での触媒活性
を増強し、又はそのために必須である。

プロティンＣＫついては、生物学的活性はその抗凝固性
及びフィブリン溶解性により特徴付けられる。プロティ
ンＣは、活性化された場合、ホスホリピド及びカルシウ
ムの存在下でファクターＶａ及びファクター■ａを不活
性化する。プロティンＳはこの機能の制御に関与するよ
うである（　Ｗａｌｋｅｒ　＋前掲）Ｏ活性化されたプ
ロティンＣはまたフィブリン溶解を増強し、この効果は
シラスミノ−ｒンアクチベーター阻害物質のレベルを低
下せしめることにより介在されると信じられる（　ｖａ
ｎ　Ｈｌｎｓｂｅｒｇｈ等、　Ｂｌｏｏｄ　６５　：　
４４１−４５１．１９８５）。後でさらに十分に記載す
るように、プロティンＣ遺伝子のエクソン■及び■によ
りコードされるプロティンＣのその部分はその触媒活性
を主として担当するであろう。

デレープロペプチド：　幾つかの蛋白質のアミン末為に
存在し、そして一般にトランスロケーション中にその蛋
白質から開裂されるアミノ酸配列テする。プレープロペ
プチドはその蛋白質を細胞の分泌経路に向ける配列（シ
グナル配列）を含んで成り、そして疎水性アミノ酸のコ
アの存在により特徴付けられる。これらはまたプロセシ
ングシグナルを含む。この明細書において使用する場合
。

”デレープロペプチド”なる語はまた天然プレープロペ
プチドの部分を意味する。

る主たるヌクレオチド配列を、該主たるヌクレオ配列の
転写を指令しそして制御する他のヌクレオチド配列と共
に含んで成るＤＮＡ　構成である。発現ユニットは少な
くとも、前記の生たるヌクレオチド配列、並ひに該主た
るヌクレオチド配列の上流に位置しそして作用可能に（
ｏｐ＠ｒａｂｌｙ）連結されているプロモーター配列及
び下流に位置するポリアゾニレ−ジョンシグナルから成
る。発現の効率を増強するために追加の遺伝子要素が含
まれることもできる。

発現ベクター二　％に、注目の蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列をプロモーター及び該蛋白質の発現を促進するた
めの他の配列と共に官有するＤＮＡ分子である。発現ベ
クターはさらに、宿主細胞中でのその複製をもたらす遺
伝情報を官有する。組換ＤＮＡのために一般に使用され
る発現ベクターの例はデラスミｖ及び幾つかのウィルス
である。但し、発現ベクターはこれら両省の要素を含有
することもできる。これらはまた選択マーカーを官有す
ることができる。

前記のごとく、デロテ４ンＣは肝臓において生産され、
そしてその生合成のためにビタミンＫを安求する。ビタ
ミンには、ライト鎖のアミン末端領域中の特定のγ−力
ルボキシグルタミン酸の形成のために必要である。これ
らのアミノ酸残基は翻訳後修飾によって形成され、そし
てホスホリピドへのカルシウム介在結合のために必要と
される。さらに、プロティンＣは、やはり翻訳後修飾に
よって形成される１個のβ−ヒドロキシアス・’ラキン
酸を含有する。しかしながら、このアミノ酸残基の役割
は知られていない。

テｏ　ｆインＣの活性が特定のグルタミン醒残基のγ−
カルボキンル化全冨む翻訳後修飾に依存し、そして特定
のアス／ンラギン酸残括のヒドロキシル化にも依存する
かもしれないという事実があれは。

微生物中でのプロティンＣのクローニンング及ヒ発現を
介して活性な生成物が生成することはできそうにない。

従って、この発明は、γ−カルデキシル化されており、
そして活性化されたヒト−プロテインＣの生物学的活性
を活性化後に有する蛋白債を、永久的に該蛋白質を発現
するようにトランスフェクトされた呻乳類細胞を用いて
製造する方法を提供する。

この発明はさらに、γ−カルボキシル化されておりそし
て活性化を必要としないで、活性化されたヒト−プロテ
インＣの生物学的活性を有する蛋白ｆＸを製造する方法
を提供する。

ウシ−プロティンＣのライト鎖及びヘビー８は配列決定
されている（　Ｆｅｒｎｌｕｎｄ及び５ｔｅｎｆ　ｌｏ
　。

１９８２：及び５ｔｅｎｆｌｏ及びＦ＠ｒｎｌｕｎｄ　
＋　３ＬＢｌｏ１．Ｃｈｅｍ、、２５７：　１２１８０
−１２１９０゜１９８２）。ヒト−プロテインＣの単離
及び特徴付けはＫ１５ｔｅｌ　＋　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　
ｆｎｖｓｓｔ、　＋　６４　ニア６１−７６９．１９７
９により記載されている。

アミノ末端アス・ぐラギン酸残基を除き、ヒト−プロテ
インＣのヘビー鎖のアミノ末端配列はウシの蛋白質のヘ
ビー鎖中に存在する最初の８個のアミノ酸と異る。ヒト
の酵素及びウシの酵素の両省の抗凝固活性に高度に稲％
異的であることが見出された。種特異性はプロティンＳ
により介在されると信じられる（　Ｗａｌｋ＠ｒ　、　
Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒ４５Ｉ１．２２　：３２１−３２７
．１９８１）。しかしながら、ヒト及びウシの蛋白質は
相互に、並びにプロスロンビン、ファクター■、７丁り
ター■及びファクターＸを包含する他のビタミンに一依
存性血漿蛋白質と、かなりの全体的構造的類似性を示す
、類似性は、ライト鎖中のＧｌａ残基の存在及びヘビー
鎖中の活性部位セリン、並ひにライト鎖のアミノ末端領
域中の他のアミノ酸配列の類似を包含する。

この発明においては、λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリ
ーをヒト肝臓ｍＲＮＡから調製した。次に、このライブ
ラリーをヒト−プロテインＣに対する１２５Ｉモ性クロ
ーンをさらに、λｇｔｌｌベクター中でのβ−がラクト
シダーゼとプロティンＣとの融合蛋白質の合成について
分析した。

クローンの１つが抗体プローブとの強いシグナルを与え
、そして約１４００　ｂｐの挿入部を含有することが見
出された。ＤＮＡ挿入部のＩ）ＮＡ配列分析により、　
Ｆｅｒｎｌｕｎｄ及び５ｔｅｎｆｌｏ　（Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ　。

により決定されたウシ−プロティンＣの大部分と高度に
相同性を示す予想通ジのアミノ酸配列が示された。

ＤＮＡ挿入部は、ライト鎖のアミノ酸６４から始まり、
完全なヘビー鎖コード領域を含み、そして終止コドンに
進む、プロティンＣのコード領域のほとんどを含んでい
た。さらに、ヘビー鎖の終止コドンに続き、３′非コ一
ド配列の２９４塩基対及び９塩基対のポ’）＜Ａ）ティ
／Ｉ／か存在した。プロセシング及ヒポリアデニレーシ
ョンシグナルＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａがこのｃ　ＤＮＡ
挿入部中のポリ（Ａ）テイルから１３塩基対上流に存在
した。この配列は。

２個の可能性あるポリアブ二し−ション部位の１つであ
った。

ｅ　ＤＮＡ配列はまた位置１５６−１５７にジペプチド
Ｌｙｓ　−Ａｒｇを含有していた。これはヘビー鎖から
ライト鎖を隔離し、そして蛋白質分解的開裂によるプロ
セシングの過程で除去され、２本鎖分子の分泌をもたら
す。スロンビンによる活性化の除、ヒト−プロテインＣ
のヘビー鎖はアルギニン−１６９とロイシン−１７０の
間で開裂され、活性化波デチドをもたらす（第２図）。

同様の方法により、プレープロペデテド及ヒプロテイン
Ｃの初めの２３個のアミノ酸のためのコード配クリを欠
く第２のｃ　ＤＮＡを単離した。このｃ　ＤＮＡをハイ
プリダイゼーシ、ンデロープとして用い、コード配列の
残りをλシャロン４Ａ中のヒトデツムＤＮＡライブラリ
ィから得た（　Ｆｏｓｔｅｒなど、　、　Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　８２　：　４６７
３〜４６７７．１９８５）。プロティンＣ遺伝子のため
のオーバーラツプ挿入部を含む、３種の異なるλシャロ
ン７γ〜ノを単離した。

３８１１のファージクローン上のエクソンの位置を、上
記の１４００　ｂｐのｃＤＮＡから製造されたプローブ
を用いる、これらのクローンの消化物のサデンブロット
ハイプリダイゼーションによって決定した。これらのク
ローン中のゲノムＤＮＡ挿入部を、単一の及び二重の制
限＃素による消化、及びこれに続くアガロースゲル電気
泳動、サデンプロッティング及びヒトプロティンＣのた
めにｃ　ＤＮＡに由来する放射性標識された５′及び３
′プローブに対するハイツリダイゼイションによって、
第３図に示されるようにマツピングした。

ＤＮＡ配列決定研究を、チェインターミネータ−法（ｄ
ｌｄ＠ｏｘｙ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　
ｍｅｔｈｏｄ　）を用いて行なった。第４図に示される
ように、ヒト−プロテインＣのための遺伝子のヌクレオ
チド配列は、およそ１ｌｋｂのＤＮＡにわたる。これら
の研究はさらに、４２個のアミノ酸の潜在的なプレープ
ロ（プチドを表わす。−１〜〜２０の領域におけるウシ
−プロティンＣのプレーグロペデチドとの相同性に基づ
いて、位置−１０のＡｔａ残蓬の後のグレグロ配列がシ
グナルペプチダーゼによって開裂されるらしい。成熟タ
ン・４り質へのプロセシングは、アミノ末端のプロ４ｆ
チドを除去するために残基−１の後の、並びにＬ鎖及び
Ｈ鎖を連結するＬｙｓ　−ＡｒｇＸ）ペプチドを除去す
るために残基１５５及び１５７での追加のタンノ９り分
解性開裂ヲ含む。この最終プロセシングは、１５５個の
アミノ酸のＬ鎖及び２６２個のアミノ酸のＨ鎖をもたら
す。

プロティンＣの遺伝子は、２５〜８８５ヌクレオチドの
サイズ範囲の８個のエクソン、及び９２〜２６６８ヌク
レオチドのサイズ範囲の７個のイントロンから成る。エ
クソン！及びエクソン■の一部は、４２個のアミノ酸の
グレーグ口（グチドをコードする。エクソン■の残る部
分、エクソン■、エクソン■、エクソン■及びエクソン
■の一部はプロティンＣのＬ鎖をコードする。エクソン
■の残る部分、エキタン■及びエキタン■はプロティン
ＣのＨ＠”ｋコードする。こトープロチインＣのアミノ
酸配列及びＤＮＡ配列は第２図に示されている。

プロティンＣのための遺伝子中のイントロンの位置は、
種々の機能げメインの間に主として存在する。エクソン
■は、グレーグロベプチドの高度に保存され次領域及び
γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬａ　）ドメインにわ
たる。エクソン■は、Ｇｌｍ及び成長因子ドメインを連
結する８個のアミノ酸を含む。エクソン■及び■はそれ
ぞれ、潜在的な成長因子ドメインを表わし、他方エクソ
ン■は、活性化ペプチドを含む連結領域を包含する。

エクソン■及び■は、すべてのセリングロテアーゼに典
型的な触媒ドメインを包含する。

ヒトーグレア’ロブロチインＣのためのアミノ酸配列及
び仮の構造が第５図に示されている。プロティンＣはＬ
ｙｓ−Ａｒｙ　　ジペプチドなしに示されており、この
ジペプチドはＬ鎖及びＨ鎖を連結するものである。７個
のイントロン（Ａ−Ｇ）の位置は実線によって示されて
いる。既知のタンパク分解性開裂部位の両端に存在する
アミノ酸は円で囲んである。◆は、潜在的な炭水化物結
合部位を示す。Ｌ鎖、活性化ペプチド及びＨ鎖中の第１
のアミノ酸は番号１から始まる。この番号扛第２図及び
第４図に示される番号とは異なる。

炭水化物の付層部位は、第５図の番号スキームに従えば
、Ｌ鎖中の残基９７及びＨ鎖中の残基７９．１４４及び
１６０に位置する。炭水化物部分は、Ａｇｎに共有結合
される。はとんどの場合、炭水化物の付Ｎ環境は、Ａｓ
ｎ−Ｘ−８ｅｒ又ｆｌＡａｎ−Ｘ−Ｔｈｒ　（ここでＸ
−は任意のアミノ酸である）によって表わされ得る。

上に示されるように、プロティンｃＨ，凝固過程におい
て調節の役割を演する。エクソン■及び■によってコ′
−ドされる触媒ドメインは、一定の血漿゛タンパク質（
すなわち、因子■、及び■ａ）を％異的に開裂するセリ
ンプロテアーゼ活性を有し。

それらの活性化又は不活性化をもたらす。この選択的タ
ンノ々り分解の結果、プロティンＣは抗凝固活性及びフ
ィブリン溶解活性を示す。

ｒツムクローン中の介在配列の存在のために、ゲノム配
列及びｃ　ＤＮＡ配列を単に連結し、完全なコード配列
を提供することは、許容できる発現ユニットを構成する
ために十分ではない。従って、　゛ｒツムクローンを用
いて発現ユニットを構成する場合、下にさらに十分に記
載されている理由のために、これらの介在配列を削除す
ることが必要である。

５′コード領域はまた、他の方法によっても得ることが
でき、そしてそれ故に、介在配列を削除する必要性がな
いであろう。５′コード領域は、既存のｃ　ＤＮＡ又は
ｒツムクローンに由来するプローブを用いての追加のラ
イブラリーを検索することによって得ることができる。

この方法を用いて、完全な長さのｅ　ＤＮＡを単離した
。さらに、ビタミンに一依存性血漿タン・９り質のアミ
ノ末端部分は、それらの各自のカルシウム結合活性を担
当する。

この機械的類似性の結果として、これらの分子のカルシ
ウム結合ドメインを取シ換えることができ。

そして結果として生じる分子の触媒ドメインに特微的な
活性をなお保持することができる。たとえば、１９８５
年４月１７日に出願されたアメリカ特許出願番号第７２
４，３１１号に記載されているように、■因子のアミノ
−末端部分（カルシウム結合ドメイン）を、アミノｉ！
！３６で■因子に連結し、■因子の活性を有するタンパ
ク質を得ることができる。■因子、■因子、Ｘ因子、ｆ
口トロンビン及びプロティンＳ＃ｉ、このアミノ−末端
配列の相同性をプロティンＣと共有する。従って、これ
らの任意のタン・にり質のための遺伝子の５′−コード
領域を含むクローン化された配列を、プロティンＣの遺
伝子の対応する配列と交換することができるでる。さら
に、適切なコード配列を、いくつかのビタミンに依存性
血漿タンパク質の既知のアミノ酸配列又はこの明ａｉｉ
Ｆに開示されているｒツムプロティンＣのエクソンの配
列に基づいて合成することができる。合成ヌクレオチド
配列を製造するための技法は当業界において良く知られ
ている。たとえば、オーバーラツプするオリゴヌクレオ
チドのセットを合成し、そして対にアニーリングしてオ
ーバーラツプする接着末端を有する二重鎖断片を得るこ
とができる。次に、これらの断片を任意の制限と同様に
連結することができるであろう。次に、この得られる合
成断片を、便利な制限部位においてｃＤＮＡに連結する
。この結合配列を、必要な一合、オリゴヌクレオチド指
令突然変異誘発によって変形することができる。

完全なコード配列を代表するクローンを得た場合、必要
ならは、その適切な領域を連結し、目的とするコード配
列を形成することができる。１又は複数のライブラリー
から得られた断片を適切な制限エンドヌクレアーゼによ
り切断し、そして正しい方向に＃素により一緒に連結す
る。断片及び特定の選択された制限エンドヌクレアーゼ
に依存して、欠失突然変異誘発の６ループアウト”（ｔ
ｏｏｐ　ｏｕｔ　）方法により又は制限エンドヌクレア
ーゼによる開裂及び突然変異誘発の組み合せにより不所
望のＤＮＡ配列を除去することが必要であろう。そのよ
うにして得られた配列は、好ましくは、連続するオープ
ンリーディングフレームの形で存在すべきである。すな
わち、高等な真核生物の遺伝子に一般的に見出される介
在配列（イントロン）を欠くべきである。クローン化さ
れ念遺公子中でのイントロンの存在は、その遺伝子配列
が補乳類宿主細胞中に導入される場合、ｍＲＮＡの異常
なスプライシング及び／又は遺伝子発現の低下した効率
又は増幅に基づく不安定性を導ひく場合がある。このコ
ード配列は、本発明に従って生成されたプロティンＣの
正しいプロセシング及び分泌を促進するために、さらに
グレープロペプチドをコードすることが好ましい。この
グレープロペプチドは、プロティンＣ又は他の分泌され
るプロティン、たとえば■因子、■因子又はプロスロン
ピンのそれであることができる。

いくつかの環境下で、活性なプロティンＣを直接的に生
成することが望ましく、それによって、インビトロ又は
インビデのいづれかでタンパク質生成物を活性化する必
要性が除去されるであろう。

プロティンＣの成熟及び活性化に関与する開裂部位は既
知である（　Ｆｏａｔｅｒ及びＤａｖｉｅ　＋前記）。

ＡＰＣヲコードする配列を、オリゴヌクレオチド指令欠
失突然変異誘発により活性化ペプチドをコードする領域
を削除することによって構成することができる。次に、
この得られるタンパク質は、分泌経路のタンノ々り分解
プロセシングによって活性化されるであろう。

次に、プロティンＣ又は活性化されたプロティンＣのた
めのコード配列を適切な発現ベクターに導入し、今度は
これを哺乳類細胞系をトランスフェクトするために用い
る。

本発明の実施において使用するための発現ベクターは、
哨乳類細胞中に導入された外来性遺伝子の転写を指令す
ることができるプロモーターを含むであろう。ウィルス
プロモーターは、転写を指令する効率のために好ましい
。特に好ましいプロモーターは、アデノウィルス２から
の主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒ　ｌａｔ＠ｐｒｏ
ｍｏｔｏｒ　）である〇そのような発現ベクターはまた
、好ましくは、プロモーターから下流であってプロティ
ンＣ配列のための挿入部位から上流に、又はプロティン
Ｃ配列それ自体内に位置するＲＮＡスプライス部位のセ
ットを官むであろう。好捷しいＲＮＡスプライス部位は
、アデノウィルス遺伝子及び／又は免役グロブリン遺伝
子から得ることができる。また、挿入部位の下流に位置
するポリアデニル化シグナルを、発現ベクター中に貧む
。ウィルスのポリアデニル化シグナル、たとえはＳＶ４
０からの初期又は後期ポリアデニル化シグナル又はアデ
ノウィルス５ＥＴｂ領域からのアデニル化シグナルが特
に好ましい。特に好ましい態様においては、発現ベクタ
ーはまた、非コードウィルス性リーダー配列、たとえば
プロモーター及びＲＮＡスプライス部位の間に位置する
アデノウィルス２の３分節系リーダーを富む。好ましい
ベクターはまた、二ンノ・ンサー配列、たとえばＳＶ４
０のエンノーンサー、及びアデノウィルスＶＡ　ＲＮＡ
　ｆｔコードする配列を含むことができる。

次に、クローン化された遺伝子配列を、リン酸カルシウ
ム介在トランスフェクシ、ンによって、培養された呻乳
類細胞中に導入することができる（　Ｗｉｇｌｅｒなど
、、Ｃｅ１ｌ　１４：　７２５．１９７８：４５６．１
９７３）。ＤＮＡ及びリン酸カルシウムから沈降物が形
成され、そしてこの沈降物が細胞に適用される。細胞の
いくらかは、ＤＮＡ　’ｉ取り込み、そして数日間それ
を細胞内に保持する。これらの細胞の少部分（典型的に
は、１０−’）は、ｒツム中にＤＮＡを組込む。これら
の組込み体を同定するために１選択可能な表現型（選択
マーカー）を与える遺伝子を、一般的に、注目の遺伝子
と一緒に細胞中に導入する。好ましい、選択１−カーは
、薬剤、たとえばネオマイシン、ヒグロマイシン、又は
メトトレキセートに対して耐性を与える遺伝子を富む。

選択マーカーを、注目の遺伝子と同時に、別のプラスミ
ド上で細胞中に導入することができ、又はそれらを、同
じプラスミド上で導入することができる。同じプラスミ
ド上で導入される場合１選択マーカー及び注目の遺伝子
は異なるプロモーター又は同じプロモーターの制御下に
存在することができる。１つの態様においては、選択マ
ーカーを、プロティンＣ’５コードする配列を含む同じ
プラスミド上に、両配列が同じプロモーターによって制
御されるように配置する（ジシストロン性メツセージと
して知られている配置）。

このタイプの構成物は当業界において既知である（ｆｃ
とえば、ヨーａ−／／４′特許公開第１１７，０５８号
）。１キヤリアーＤＮＡ　’　として知られている追加
のＤＮＡ　’ｉ、細胞中に導入される混合物中に添加す
ることもまた有利であろう。細胞がＤＮＡ　’ｉ取り込
んだ後、しばらくの間、典型的には１〜２日間増殖全許
容にし、注目の遺伝子の発現を始める。

次に、安定した状態で選択マーカーを発現する細胞の増
殖のためについて選択するために薬物選択を適用する。

そのような細胞のクローンを、プロティンＣの発現につ
いてスクリーンすることができる二 組み込まれた遺伝子配列のコピ数を、一定の選択マーカ
ー（たとえば、メトトレキセートに対して耐性を与える
ジヒドロホレートレダクターゼ）を用いることによって
増幅を介して増加せしめることができる。選択マーカー
金、注目の遺伝子と一緒に細胞中に導入し、そして薬物
による選択を行なう。次に、薬物の濃度をしだめに増し
、そしておのおのの段階で耐性の細胞を選択する。クロ
ーン化された配列の増加したコピー数について選択する
ことによって、コードされたタンパク質の発現レベルを
実質的に増大することができる。

本発明により製造されたプロティンＣを、Ｋｌｍｔｅｌ
及びＤａｖｉｅ　（前記）の方法の変法によって精製す
ることができる。プロティンＣを含む培地をクエン酸ナ
トリウム及び塩化・ｆリウムと混合し、そして沈降物を
集める。その沈降物を洗浄し、再溶解し、そして硫酸ア
ンモニウムにより再沈降せしめ、次にリン酸ナトリウム
−ベンズアミノン中に溶解し、透析し、そしてＤＥＡＥ
−８ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０カラムにかける。プロテ
ィンＣｉ含有するピーク（ｆロスロンビンもまた含んで
いる）全、さらに、ヘノ母リンーアガロース上でのアフ
ィニティークロマトダラフィー（Ｃｏｍｐ及びＥｓｍｏ
ｎ　ｒＢ１ｏｏｄ５４：１２７２．１９７９）又は免疫
吸着法によって精製する。

本発明により製造され几プロティンＣを、Ｈ鎖のアミン
末端からの活性化ペプチドの除去によって活性化するこ
とができる。活性化を、α−スロンビン（Ｍａｒｌａｒ
など、、Ｂ１ｏｏｄ５９：１０６７〜１０７２．１９８
２）、）リゾシン（Ｍａｒｌａｒなど、、前記）、又は
Ｒｕ５ｓｅｌｌのマムシの毒のＸ因子活性剤を用いて行
なうことができる。

次の例を要約すれば、例１はヒト−プロテインＣをコー
ドするＤＮＡ配列のクローニングを記載する。例２は、
例１中で単離された配列からの７’。

ティンＣのための完全な長さのコード配列の造成性記載
する。例３は、プロティンＣＤＮＡのための発現ベクタ
ーの造成法を記載する。例４は、トランスフェクトされ
た哺乳類細胞を用いてのプロティンＣの製造を記載する
。例５は、プロティンＣをコードする完全な長さのｃ　
ＤＮＡ及びトランスフェクトされた晴乳類細用中でのそ
の発現を記載する。

以下／に白 他に断らない限りは、ペテスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｊｅｓ：ＢＲＬ　）およびニュー・イングラ
ンド・バイオラブ７、　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ　）から得た制限エンドヌクレアーゼおよ
び他のＤＮＡ＆飾酵素〔例えば、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ、子牛アルカリホスファターゼ、クレノー（Ｋ
１＠ｎｏｖ　）　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリヌクレ
オチドリガーゼ）を製造業者による指示の通りに使用す
る。

オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ
・モデル３８０ＡＤＮＡ合成材（Ａｐｐｌｉ＠ｄＢｉｏ
ｓｙｓｔ＠ｍａ　Ｍｏｄｅｔ３８０　Ａ　ＤＮＡ　５ｙ
ｎｔｈ＠５ｉｚｅｒ）で合成し変成ｒル上でのポリアク
リルアミドダル電気泳動によって精製することができる
。イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｉｌ　）細胞は、マニアテス
（Ｍａｎｌａｔｌｇ　）等〔モレキュラー・クローニン
グニア・２？ラトリー・マニュアル（Ｍｏｌ＠ｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍ
ａｎｕａｔ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラデ
ラトリー（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　）、１９８２年〕によって記載され
てｂる如ぐに形質転換することができる。Ｍ１３および
ｐＵＣクローニングベクターおよび宿主株はＢＲＬから
得た。

例１ ０−ニング ヒト−プロテインＣの一部をコードするｅ　ＤＮＡはフ
ォスター（Ｆｏｓｔｅｒ　）およびグヴ４−（Ｄａｖｉ
ａ）（前掲）によって記載されているように調製した。

簡単に言えは、常法によってヒト−肝臓ｍＲＮＡからλ
ｇｔｌｌ　　ｃＤＮＡライブラリーを鉤裂した。クロー
ンは、ヒト−プロテインＣに対する、１２５ニーラベル
したアフィニティー精製抗体を用いてヌクＩＪ−ニング
し、ファージは、平板リセート（１ｙｓａｔｅ）法〔マ
ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｇ　）等、前掲〕、それニ続
く塩化セシウムグラヅエントでのバンド形成によってポ
ジティブクローンから調製した。ｃＤＮＡ挿入部は、Ｅ
ｅｏ　ＲＩを用いて取り出し、プラスミドｐＵＣＱ中に
サブクローン化した〔グイエイラ（Ｖｔｅｉｒａ　）お
よびメツ７ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）、ノーン（Ｇｅｎ
ｅ）　１９　：　２５９〜２６８頁、１９８２年〕。制
限断片をファージベクターＭ１３ｍｐｌＯおよびｍ１３
ｍｐＨ中にサブクローン化し〔メッシング（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ）　、メス、イン・エンディモロ７７頁、１９８３
年〕、ノブオキシ法〔サンガー（Ｓａｎｇ＠ｒ　）等、
デロク、ナトル、アカド、サイ。

〜５４６７頁、１９７７年〕によって配列決定した。ヒ
ト−プロテインＣの既知の配列〔キシエル（Ｋｉａｉ・
ｌ）、前掲〕に相当し、そしてライト鎖のアミノ酸６４
で始まりヘビー鎖を通って３′非コード領域に伸ひてい
るプロティンＣをコードするＤＮＡを含有するクローン
を選択した。このクローンをλＨＣｌ３７５と名付けた
。アミノ酸２４からプロティンＣをコードする第２のｃ
　ＤＮＡクローンを同定した。このクローンからの挿入
部ｆ：ｐｔＪｃＱ中にサブクローン化し、このプラスミ
ドをｐＨ０６Ｌと名付けた（第１図）。このクローンは
、ヘビー鎖コード領域、終止コドンおよび３′非コード
領域を含むプロティンＣの王たる部分をコードする。

λＨＣｌ３７５からのｅＤＮＡｉφ入部をα−３２Ｐ　
ｄＮＴＰを用いてニックトランスレーションし、これを
用いてター（Ｗｏｏ）によって改変された〔メス、イン
、エンザイモロノー（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）６８：３８１〜３９５頁、１９７９年〕、ベ
ントン（Ｂｅｎｔｏｎ　）およびディグ４　ｙ、　（Ｄ
ａｖｉｇ　）のプラークハイブリダイゼーション法（サ
イエンス１９６　：１８・１〜１８２頁、１９７７年）
により、ファージλシャロン４人中のヒト−ゲノムライ
ブラリーをプローブした〔マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｇ　）等。

セル（９見）１５：６８７〜７０２負、１９７８年〕。

ポジティブクローンを単離しプラーク鞘製した〔フォス
ター（Ｆｏｓｔ・ｒ〕等、ゾロク、ナト年、参考に引用
〕。ポジティブクローンから調製したファージＤＮＡ　
［シルハゲイー（５ｉｌｈａｖｙ　）等、エクス被りメ
ンツ・ウィズ・ジーン・フユージ嘗ン（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｏｎ＠Ｆｕｓｉｏｎ）中、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラデラトリー（Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　）、１９８４年Ｅ′ｆ！：ＥｃｏＲＩｔたはＢｇｌ■
で消化し、ゲノム挿入部をｎ製してｐＵＣＱ内にサブク
ローン化した。

挿入制限断片をＭ１３ベクター内にサブクローン化し、
配列を決定してその同一性を確認して完全な遺伝子のＤ
ＮＡ配列を確立した。

ｐＨＣλ６ＬのｃＤＮＡ％入ｉｔニツクトランスレーシ
ョンシ、これを用いてファージスシャロン４Ａライブラ
リーをプローブした。ｃ　ＤＮＡの５′および３′未満
から調製したプローブにノ・イブリダイズする１個のゲ
ノムクローンを同定した。このファージクローンをＥｃ
ｏＲＩで消化して、プロティンＣ遺伝子の５′末端に対
応する４、４ｋｂ断片をｐＵＣＱ中にサブクローン化し
た。得られた組換プラスミドをｐＨＣＲ４，４と名付け
た。完全ＤＮＡ配列分析によって、　　ｐＨＣＲ４，４
中の挿入部が１２６３ｂｐ（塩基対）のイントロンによ
って分離される７０〜１６７ｂｐのエクソンを２つ含ん
でいることが示された。第１のエクソンはアミノ−４２
〜−１９をコードし、第２のエクソンはアミノ酸−１９
〜３７をコードする。配列分析によって、完全プロティ
ンＣ遺伝子のＤＮＡ配列が確認された。

上記したように１次には、ゲノムクローンを用いて本発
明において使用するのに満足なコード配列を造成するた
めに、イントロンを除去することが必要である。

例２ プロティンＣの完全長コード配列の造成デレーデロベデ
チドヲ包含するプロティンＣの完全長コード配列を、　
ｃＤＮＡ及びゲノムクローンの適描な断片を結合せしめ
ることによって造成した。これは、イントロンをゲノム
クローン（ｐＨＣＲ４，４）から取り除き、そして融合
されたエクソンを都合の良い制限部位でｃＤＮＡ　（ｐ
ＨＣλ６Ｌから）に結合させることによって達成した。

次いで、所望とするゲノム：　ｅＤＮＡ結合を、オリゴ
ヌクレオチド指令欠失突然変異誘発によって不所望の配
クリをループ・アウトさせることによって形成した。

プラスミドｐＨＣλ６Ｌは、ｐＵＣ９のＥｃｏＲ１部位
においてクローニングされたプロティンＣ部分的ｃ　Ｄ
ＮＡを含有していた（第１図）。ｃＤＮＡ挿入部を２個
の断片としてサブクローニングし、ゲノムクローンから
の最も５′−側のコード領域に結合させるためのそれヲ
ｖ！４製した。プラスミドｐＨＣλ６ＬｉＥｃｏＲＩ及
び５ａｔＩで消化し、そして次に反応混合物をフェノー
ル及びＣＨＣｌ３で抽出し、エタノールで沈殿させた。

得られたＤＮＡ断片を連結緩衝液中で再懸濁させ、そし
てＴ　４ＤＮＡ　ＩＪガーゼを添加した。連結混合物を
１５℃で１４時間にわたってインキ、ベートした。Ｅ、
コリ　ＪＭ８３の形質転換のために連結混合物のアリコ
ートを使用し、そしてＸ　−ｇａｔ含有ＬＢ寒天上に細
胞をプレートした。

白色のコロニーを選び出し、そしてプラスミドＤＮＡを
調製した。このＤＮＡを制限酵素消化によって分析し、
よってｃ　ＤＮＡの３′部分（約１４５０　ｂｐ挿入部
）及びｃＤＮＡの５′部分（約６５　ｂｐ挿入部）を含
有するクローンを同定した。これちのクローンを、それ
ぞれｐ９Ｃ３’及びｐ９Ｃ５’として表示する（６図）
。

ｅＤＮＡから失われている５′コード領域は、ｒツムク
ローンｐＨＣＲ４，４のエクソン■及び■中に宮まれて
いる。このプラスミドは、約４４００塩基対（ｂｐ）の
挿入部金含有しており、そしてイントロン内中に位置す
るＥｃｏＲ■部位のところでその３′末端上で終端して
いる。

コード配列’ｚ　Ｐ）ＩｃＲ４，４から除去するため、
シラスミドをＰｓｔｌ及びＥｃｏＲｌ　で消化し、そし
て得られた断片をアがロースグル′亀気泳動法によって
分離した。エクソン■及び■を含有する約２５４０ｂｐ
　の断片をｒルから単離し、セしてＣＴＡＢで抽出した
（　Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら＃　Ａｎａｔｙｔ、　Ｂｔｏ
ｅｈｅｍ。

１０３：２６４．１９８０）。この断片、５′Ｐ−Ｒと
呼ぶ、をｐＵＣ９中にサブクローニングしてプラスミド
ｐ　５’Ｐ　−Ｒを製造した（第７図）。

ｐｓ’ｐ　−Ｒ中のイントロン（イントロンＡと呼ぶ）
全２段階法で除去した（第７図）。プラスミドをＡｐａ
　ｌで消化したところ、イントロン内のユニーク部位で
切断がおこり、３′オーバーハング末端が残留した。次
いで、＃ｌ！ｌ化状たプラスミドをＢａｔ３１エキンヌ
クレアーゼ又はＴ４ポリマーゼで処理して約４００ｂｐ
’ｉそれぞれの末端から除去し、そして得られた断片末
鴻ｉｓ１ヌクレアーゼで平滑末端化した。この線状化プ
ラスミドをリガーゼで再環化し、そしてＥ、コＩＪＪＭ
８３の形質転換のために使用した。プラスミドＤＮＡ　
ｉ抽出し、そしてイントロン内中のＳｍｉ　ｌ及びＳｓ
ｔ　ｌ制限部位の存在に関して分析し、また、３００〜
４００　ｂｐ　に減らし九Ｓｍａ　Ｔ　−Ｓｓｔ　Ｔ断
片を有するプラスミドを選び出し、ｐ５’ＰΔａＲと表
示した。

イントロンＡの残りを、７．ｏＬｔａｒ及びＳｍ１ｔｈ
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　＠　１９８３　
）により２プライマー法に関して記載されるのと本質的
に同様にしてオリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発
によって除去した。ｐｓ’ｐΔａＲ１ｋＰｓｔｌ及びＥ
ｅｏＲｉで消化し、そしてプロティンＣ断片を、Ｐｓｔ
　ｌ及びＥｃｏＲＩ　で消化したＭ１３ｍｐ９中にサブ
クローニングし九。玉鎖フ丁−ノゴ法を鋳型として調製
し、そしてオリゴヌクレオチドｎｕｔ−１（第１表）に
アニールした。この突然変異誘発オリゴヌクレオチドは
、連結されるべきエクソンＩ及び■配列に対して相補的
な配列を含有する。Ｍ１３ユニバーサル配列！ライマー
を同じ鋳型上で３′〜ｍｕｔ−１にアニールした。この
プライマーをＴ４りが一ゼの存在においてＤＮＡポリメ
ラーゼ１　（Ｋｔｅｎｏｖ断片）及びヌクレオシドトリ
ホスフェートを使用して延長した。得られた２デユプレ
ツクスＤＮＡ　１ｍをＥ。

コＩＪＪＭ１０３に形質転換し、そして得られたプラー
クを厳密なハイブリダイゼーション条件の下で、３２ｐ
−標識された突然変異誘発オリゴヌクレオチドをプロー
ブとして使用して、スクリーニングした。ポジティブプ
ラークからのＤＮＡを単離し、そしてオリゴヌクレオチ
ドプライマー１（第１表）全使用して配列決定した。こ
のプライマーはエクソン■中にプライムし、欠失連結を
またぐＤＮＡ配列の決定が可能になった。エクソン■及
び■の正しいインフレーム融合を有する分子が選らばれ
た。Ｐａｔｌ−ＥｃｏＲ１断片ｆ　、　Ｍ　１３の複製
形から、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロース
ゲル電気泳動によって単離し、そしてｐＵＣ９中にサブ
クローニングしてプラスミドｐ５’ｌ−ｍｅ作製する（
第７図）。

第８図に示すとおり、ｃＤＮＡに５′コード領域を連結
するために、ｐ５／　Ｉ　−Ｉｔの約１２７７　ｂｐ　
Ｐｇｔｌ−Ｅｃｏ　ＲＩ　断片を、プラスミドのＰ＋ｔ
”ｊ−ＥｅｏＲ［消化から単離し、アガロース）ｆ／Ｉ
／電気体動によって精製する。６５ｂｐの最も５′側の
ｃＤＮＡ断片をｐ９Ｃ５’の５ａｔＩ＋ＥｃｏＲＩ？Ａ
化物から単崩し、アクリルアミドデル上の電気泳動でｆ
＃製する。２つの断片をそれらのＥｃｏＲ１末端で連結
し、得られる約１３３０ｂｐのＰｓｔＩ−８ａｔ１１ｔ
７′ｒ片をＰｓｔ　Ｉ＋ＳａＡ　Ｉ−消化Ｍ１３ｍｐ９
中ヘサブクローニングする（第８図）。

正鎖フ了−ジＤＮＡを、オリゴヌクレオチド指令欠失変
異誘発用の＠型として炸裂する。オリゴヌクレオチドｍ
ｕｔ−２（表１）をこの鋳型にアニールし、オリゴヌク
レオチドｍｕｔ　−３（表１）を第２プライマーとして
上流にアニールする。このデライマーを前記のように延
長する。オリゴヌクレオチドｍｕｔ−２は、アミノ酸２
３〜２６をコードするエクソン■配列をコドン２７でｃ
　ＤＮＡへ融合させることを指令する。第２プライマー
（ｎｕｔ−３）は、翻訳開始点から３５　ｂｐ上流にＥ
ｃｏＲＩ　ｓ位を導入する。得られるファー−／をＮｅ
ｏｌおよびＸｈｏ１部位の不存在及び導入されたＥｃｏ
Ｒｌ　部位の存在についてスクリーニングする。望まし
い制限ノやターンを示すファージＤＮＡを、プライマー
２（表１）を使用して配列決定し、エクソン■とｅＤＮ
Ａとの間の正しい連結の存在を確認する。正しい配列を
もつファージＤＮＡを選択し、５′をコード領域を含ん
でなるＰｓｔ　ｌ　−５ａｔｌ　ＩＩ、ｔＴ片を、Ｍ１
３組換えファージの複製形からｉ離する。この断片をア
ガロースグル電気泳動によって精製し、Ｐ＋ｔｌ及び５
ａｔ１により消化され７’ＣｐＵＣ９へ挿入してプラス
ミドｐＣ５’ｅｎｄを作製する。

第９図に示すとおり、プラスミドｐｃ５’ｅｎｄｉＥｃ
ｏＲ１および５ａｔＩで消化し、５′プロティンＣ断片
をアガロースｌ”　＃５ｇ、気泳動およびＣＴＡＢ抽出
によってＮ製するＣｅＤＮＡの残？）を、５ａｔＩ　−
ＥｃｏＲ１断片としてｐ９Ｃ３’から単離する。２個の
断片を、ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ９へ、３方連結に
より導入する。連結混合物全使用してＥ、コＩＪＪＭ８
３を形質転換し、その細胞をＬ　Ｂ　＋Ｘ　−ｇｈＬ上
にプレートし、プラスミドＩＸ’ＪＡを白色コロニーか
ら単離する。得られるプラスミドをＰＭＭＣと称する。

これは、＋Ｆ１１５００ｂｐＥｃｏＲ１断片上にヒト−
プロテインＣの完全なコード配列を含んでいる。

以下余白 例３ プロティンＣの発現ベクターの造成 ＰＭＭＣからゾロティンＣコード神入部全ＥｃｏＲ１断
片として取り出し、過当な咄乳類細胞発埃ベクターに挿
入する。典型的なベクターはｐＤ７であジ、ＳＶ４０エ
ンハンサ−とアデノフィルス２主食後期プロモーターと
３分節リーダーを含む。

プラスミドｐＤ７はプラスミドｐＤＨＦＲ１［ｌから詐
取された（　Ｂ＠ｒｋｎ＠ｒおよび５ｈａｒｐ　、　Ｎ
ｕｓ、　Ａｃ１ｄｓ。

Ｒ＊ｇ、１３．８４１〜８５７負、１９８５年）。

ｐＤＨＦＲ１中のＤＨＥＲ配列のすぐ上流のＰｓｔ１部
位ｔ−Ｂｃｔ１部位に変換した。これは１００μｔの緩
衝液Ａ（１０−のトリス（Ｐ’８）、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ２゜６　ｍ、ＶＬのＮａＣ２，７ｍＭのβ−ＭＳＨ）
中で１０μＩのプラスミド′ｆｔ５ユニットのＢａｔｌ
で１０分間３７℃にて消化して行なった。ＤＮＡをフェ
ノール抽出し、ＥｔＯＨｔＸ、ｆ）ｉし、１０ｍＭのｄ
ＣＴＰと１６ユニツトのＴ　４　ＤＮＡ　ポリメラーゼ
を営む緩衝液Ｂ（５０ｍＭのトリス（ｐ？１Ｂ　）　、
　７　ｍＭのＭｇＣｌ２．７　ｍＭのβ−ＭＳＨ）４０
μＬに再懸濁し、そして１２０℃で６０分間インキ−ベ
ートした。ＥｔｏＨ沈澱の後に、ＤＮＡ”ｔ４００ユニ
ットのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを宮む緩衝液Ｃ（
１０ｍＭのトリス（−８）、１０ｍＭのＭｇＣ２２，１
ｒｎＭのＤＴＴ　、　１．４　ｍＭのＡＴＰ）１４μを
中で２．５μｙのキナーゼ処理したＢＣｌ　ｌリンカ−
に連結した。フェノール抽出とＥｔＯＨ沈澱の後、ＤＮ
Ａを１２０　Ａｔの緩衝液Ｄ（７５ｍＭのＫＣｌ、６ｍ
Ｍのトリス（ＪＨ７，５）、１０ｍＭのＭｇｃ１２゜１
ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁し、８０ユニ−ットのＢｅＬｌ
で５０℃にて６０分曲消化し、それからアガロース中で
電気泳動させた。そのケ゛ルらＦｏｒｍｌ［ｌプラスミ
ドＤＮＡ　（１０μｌを単離し、５０ユニツトのＴ４ポ
リヌクレオチドリガーゼを含む緩衝ｇ、Ｃ１０μを中で
２時間１２℃にて連結させ、それを用いてＥ、Ｃｏ１１
　ＨＢＩＯＩを形質転換した。ポジティブコロニーを迅
速ＤＮＡ論製分析法で特定し１、ポジティブコロニーか
ら調製したプラスミドＤＮＡ　（ｐＩＩＩＦＲ’と叶ぶ
）をｄＡＭ７　Ｅ、コリに形質転換した。

ｐＤＨＦＲ’　（１５４）　オよひｐｓＶ４０　（ｐＭ
Ｌ−１（７）Ｂ　ＪＬｎｉＨＩ部位にクローニングした
ＢａｍＨＩ消化５Ｖ４０ＤＮＡ　）　（２５μｇ）２５
ユニツトのＢｃｌ　　Ｉを含む緩衝液ＤＩ　００μを中
で６０分間５０℃にて開裂した後、５０ユニツトのＢａ
ｍＨＩ’＆添加し、６０分間３７℃でさらにインキュベ
−トして、プラスミドｐＤ２’を作成した。　ＤＮＡ断
片を７ガロースｒル電気泳動法で分離し、４．９ｋｂの
ｐＤＨＦＲ’断片と０．２ｋｂＳＶ４０断片を単離した
。これらの断片（２００ｎ、！ｉ’のｐＤＨＦＲ’ＤＮ
Ａと１００　ｎｌのＳＶ　４０　ＤＮＡ　）を１００ユ
ニツトで４ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩衝液ＣＩ
Ｏμを中で４時間１２℃にてインキユベートし、得られ
る造成体（ｐＤ２’　）　ｋ用いてＥ、コリＲＲＩを形
質転換した。

！ラスミドｐＤ２’をｐＢＲ３２２領域の１ポイゾン”
配列を除去して変形した（　Ｌｕｍｋｙ及びＢｏｔｅｈ
ａｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　２９３　、７９〜８１頁、１９８１年）
。プラスミドｐＤ２’　（６，６μｇ）および！ラスミ
ドｐＭＬ−１（Ｌｕ５ｋｙおよびＢｏｔｅｈａｎ　ｗ前
掲）（４μｇ）を夫夫１０ユニ、トのＥｅｏ　ＲＩおよ
びＮｒｕｌを含む緩衝ｌＡ３０μを中で２時間３７℃に
てインキユベートした後、アがロースダル電気泳動を行
なった。

１．７ｋｂのｐＤ２’断片と１．８ｋｂのｐＭＬ−１断
片を単離し、それら（各５０ｎＪ９）ｅｌｏｏユニット
のＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを宮む緩麺Ｉ液２０μ
を中で２時間１２℃にて相互に連結した後、Ｅ、コリＨ
Ｂ　１０１に形質転換した。所望の造成物（ｐＤ２と呼
ぶ）を含むコロニーを迅速調製分析法で特定した。次に
、１０μｙのｐＤ２を５０μｔの緩衝液Ａ中テ夫々２０
ユニットのＥｃｏＲＩおよびＢｇｔ　Ｉｔで２時山］３
７℃にて消化した。ＤＮＡ　ｉアガロース中で１気泳動
させ、所望の、ｐＢＲ３２２，３’スプライス部位、お
よびポＩＪ　Ａ配列ｉｆむ２，８ｋｂ断片（断片Ｃ）を
単離した。

ｐＤ３’ｔ−造成するのに用いるａ！りの断片を作成す
るために、ｐＤＨＦＲＩＩｌを変形して５ａｃｌｌ　（
Ｓｓｔ　ＩＩ　）部位をＨ１ｎｄｌｎ部位またはＫｐｎ
　１部位に変侠した。

１０μｙのｐＤＨＦＲＩｎを２０ユニツトのＳｓｔ■で
２時間３７℃にて消化した後フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱を行なった。再懸濁したＤＮＡを１０ｍＭの
ｄＣＴＰと１６ユニツトのＴ　４　ＤＮＡポリメラーゼ
を含む緩衝液Ｂ１００μを中で６０分間１２℃にてイン
キュベートし、フェノール抽出し、透析し、そしてエタ
ノール沈澱した。ＤＮＡ　（５μ、１ｔ４ｏ。

ユニットのＴ　４　ＤＮＡ　リガーゼを含む緩衝液２０
μを中で１０時間１２℃にて、５０Ｊのキナーゼ処理し
たＨ１ｎｄｌｌｌリンカ−ま次はＫｐｎ　ｌリンカ−と
遅結し、フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱した
。５０μＬの緩衝液Ａに再懸濁後、得られるプラスミド
を適当であれは５０ユニツトのＨｌｎｄ　ｌまたはＫｐ
ｎ　ｌで消化し、アガロース中で電気泳動させた。ダル
から単離したＤＮＡ（２５０ｎｇ）　ｅ４００ユニット
のＴ　４　ＤＮＡリガーゼを言む緩衝液Ｃ３０μを中で
４時間１２℃にて連結し、それを用いてＥ。

コリＲＲｉを形質転換した。得られるプラスミドはｐＤ
ＨＦＲＩｌｌ　（Ｈｉｎｄ　ｉｎ　）およびｐＤＨＦＲ
ＩＩＩ　（Ｋｐｎ　Ｉ　）と相称した。ｐＤＨＦＲＩ　
（Ｋｐｎ　Ｉ　）から、ＢｇｔｌｌおよびＫｐｎ　Ｉで
消化した後アガロース）ｆＡ／電気泳動して７００ｂｐ
　Ｋｐｎ　Ｉ−ＢｇＬｎ断片（断片Ａ）ｔ−精製した。

以下のようにしてＳＶ４０エンハンサ−配列をｐＤＨＦ
Ｒｍ　（Ｈｉｎｄ　ｍ　）に挿入した。５０μｇのＳＶ
４０ＤＮＡを５０ユニツトのＨｌｎｄ　ＩＩｌ’ｃ含む
ａＩ［ｍＡｌ２Ｏμを中で２時間３７℃にてインキュベ
ー）　Ｌ、Ｈ１ｎｄ１１ｃｓＶ４０断片（５０８９−９
６８ｂｐ）ｅｆｆ／Ｉ／精製した。プラスミドｐＤＨＦ
ＲＩＩＩ　（Ｈｌｎｄ　ｍ　）　（１０４）ｆ　２５０
　ｎ、ｌｉ’の仔つシ腸ホスファターゼで１時間３７℃
にて処理し、フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱
した。線状のプラスミド（５０ｎ、１ｉｌ）ｉ１６μｔ
の緩衝液Ｃ中で２００ユニツトのＴ４ポリヌクレオチド
リガーゼを用いて３時間１２℃にて２５０ｎ９のＨｉｎ
ｄ　ｍ　ＣＳＶ４０と連結し、Ｅ、　Ｃｏｌ　ｉ　ＨＢ
ＩＯＩに形質転換した。

ｐＤ３の最終造成のため、断片Ａと断片Ｂ（各５０ｎｇ
）ｋ２ｏｏユニットのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを
用いて４時間１２℃にて１０　ｎｇの断片Ｃと連結し、
そしてＥ、コリＲＲＩのトランスフェクションを行なっ
た。迅速調製分析法でポジティブコロニーを検出し、ｐ
Ｄ３の大規模調製を行なった。

プラスミドｐＤａを、ＢｃｔＩ挿入部位１ＥｃｏＲ１部
位に変換してプロティンＣ配列の挿入を受容するように
変形する。第１に、　ｐＤ３のアデノウィルス５０−１
マツプユニット配列の最左端に存在するＥｃｏＲＩｍ位
を、それを慣用のリンカ−手法でＢａｍＨ１部位に変換
して除去することが必要である。

すなわち、プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、線状化し
たＤＮＡをＴ４ポリメラーゼおよび４種全部のデオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートで処理して平滑末端を形
成する。次にプラスミドｔ−ＢａｒｎＨ１部位を含むオ
クトヌクレオチドに遅結し、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化
して余剰のリンカ−を除去し、そして呻乳類細胞発現配
列を含む断片をＰＭＬ−１のＢａｍＨＩｉ位にクローニ
ングする。得られるプラスミドをＥ、コリＨＢ　１０１
に形質転換し、プラスミドＤＮＡをｖ！４製し、正しい
変換体を選別する。同様な仕方で、ＢｃＬ１部位を適当
なオクトヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲ１部位
に変換する。得られるベクターはｐＤ７として知られる
。次にＰＭＭＣからの１，５ｋｂのプロティンＣＥｅｏ
ＲＩ断片’ｉ　ｐＤ７のＥｃｏＲ１部位に挿入して発現
ベクターｐＤ７Ｃ（第１０図）を作成する。

ｐＤ５を用いることにより、ポリシストロンメツセージ
からのタンパクＣ配列の発現を回部にするベクターを造
成する。該ｐＤ５は５′非コード領域の大部分を欠如し
ているＤＨＦＲコード配列ｔ−含有するｐＤ３に類似し
たプラスミドである。ＤＨＦＲＨＦ上更に変形し、メト
トレキセートに対するその結合親和性を減少する。

ベクターｐＤ５はｐＤ３について記載した方法と同様の
方法で造成され、そしてこれはＢａｍＨ１部位が異種性
ＤＮＡの押入部位である点およびＳＶ４０ポリアゾニレ
−ジョンシグナルを含有スるＢｃｔＩ　−ＢａｍＨＩ　
ＳＶ４０断片がレイトオリエンテーション（１ａｔｅ　
ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にある点においてのみｐＤ３
と異っている。

ＤＨＦＲＨＦ上、最初にＰｓｔＩおよびＳｓｔ　Ｙでｐ
Ｄ）ＩＦＩ［ｌ’を消化り次イｆ　４００　ｂｐ　ＤＨ
ＦＲＶＨｒ片ヲ単削することにより変形される。これは
Ｍｌファージベクター中でサブクーロン化され次いでシ
モンセンおよびレピンタンにより記載される如く（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ８０　：　
２４９５−２４９９．１９８３）突然変異誘発される。

誘発はＤＨＦＲＨＦ中、１個の塩基対変化をもたらす。

次いで変化させた断片をｐＤＨＦＲｌ［１に再挿入しプ
ラスミＰ　ｐＤＨＲ’　ｍを得る。

次いでＤＨＦＲ配夕ＩＪの５′非コード領域を除去する
。

プラスミドｐＤＨＦＲｒｌｌｌをＦｎｕ４ＨＩ（これは
、約２０の部位でプラスミドを切断する）で開裂し、次
いでＴ　４　ＤＮＡポリメラーゼ及び全ての４棟類のデ
オキシヌクレオチドトリホスフェートで処理することに
より平滑末端を生じさせる。ＢａｍＨＩリンカ−を末端
に結合させ１次いで混合物をＢａｍＨＩおよびＮｅａｒ
で消化させる。ＤＨＦＲｒｃＤＮＡ　ｆ宮む０．６　ｋ
ｂ　Ｂａｍ　ＨＩ　−Ｎｅｏ　Ｉ断片を単離する。デラ
スミ）’　ｐＤＨＦＲｍをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで
消化し次いでＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルを
含む０．２ｋｂ断片を単離する。次いで、アーリーオリ
エンテーション（ｅａｒｌｙ　ｏｒｌｅｎｔａｔｌｏｎ
　）においてポリアデニル化シグナルをＤ）ＬＦＲｒｌ
；ｉｔ片に結合させる。ＢａｍＨＩで消化後、生成する
ＢａｍＨＩ断片をｐＤ５のＢ−ａｍＨＩ部位に挿入し１
次いで連結混合物を、Ｅ、コ’）−ＨＢＩＱｌを形質変
換するために用いる。プラスミドＤＮＡを調製し次いで
制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーンする。Ａ
ｄ２主賛主動後期プロモーター転写のため正しい配向ｆ
ＤＨＦＲｒ挿、！４１有ｆるデ５　、ｘ　ミ）’　ｋ　
ｐＤ５　（ＤＨＦＲｒ）と命名する。

プラスミドｐＤ５　（ＤＨＦＲｒ）を用いてデロテづン
Ｃを発現するため、ＰＭＭＣをＥＣａ　ＲＩで消化し次
いで１．５ｋｂプロティンＣ断片を単離する。Ｅｃ。

Ｒ１末端を、リンカ−の付加によりＢａ１ｌ末端に変換
する。プラスミドｐＤ５　（ＤＨＦＲ’°）をＢａｍＨ
Ｉで部分消化してＤＨＦＲｒ配夕１１の５′末湘でそれ
を解裂させ次いでプロティンＣ断片に結合させる。プラ
スミドＤＮＡ　ｉ正しい方向性およびプロティンＣ断片
の挿入部についてスクリーニングする。ｐＤ５（ｐｃ　
−ＤＨＦＲｒ）と命名した生成ベクターを第１１図に示
す。

例４ ／」１ハムスターの腎臓細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ
１０）を、記載されるのと本質的に同じ方法でｐＤ７Ｃ
全周いてトランスフェクトする（クイグラ−等、　Ｃｅ
１ｌ　１４　ニア２５　、１９７８　：カルサロおよび
ピアリン＊　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃａ１ｌ　Ｇｏｎ＠ｔｉ
ｃｓ　７　：６０３　＊１９８１：およびＧｒａｈａｍ
　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄ＠ｒ　Ｅｂ　＋Ｖｌｒｏ１ｏｇｙ
５２：４５６．１９７３）。細胞を６Ｃ）＋ｓ組織培養
ペトリ皿内のダルベツコ培地（１０％の熱不活性化クシ
胎児血清が加えられ更にグルタミンおよびペニシリン−
ストレプトマイシンが補足されている）中、３７℃、５
％Ｃ０２でコンフルエンシー２０％に増殖させる。合計
１０μｌのＤＮＡ　ｔ　）ラスフェクトする次め用いる
。１１固の６０ｍ皿：３．７５μ、９Ｌ：ＤｐＤ７Ｃ，
１，２５μＩのｐｋｏ　−ｎｅｏ　（５ｏｕｔｈｅｒｎ
　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　＋Ｊ、Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、Ｇ＠ｎ＠ｔ　１　：　３２７−３４１　、１
９８２　）および５μＩのサケ精子ＤＮＡ、　ＤＮＡ　
ｔ−０，３ＭのＮａ０Ａｃおよび７５％エタノール中で
沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し次いで２０μｔの
１０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８）およびｌ　ｍＭＥＤ
ＴＡ　　中に再溶解する。ＤＮＡ　’ｉ水４４０　ｐ！
、　、並びに２８０ｍＭのＮａＣ１、１，５ｍＭのＮａ
ＨＰＯ４ｔ　１２　ｍＭのデキストロースおよび５０威
のＨＥＰＥＳ　（Ｐｉ−１７，１２）の５００μｔと一
緒にする。２５０ｍＭのＣａＣｔ２６０　ｆｉｔを上記
混合物に滴加し次いで溶液を室温で３０分間放置する。

次いで溶液全細胞に添〃口し、細胞を４時間３７℃に戻
す。培地全除去し次いで血ｆｆｊｆＣ宮翁するダルベツ
コ培地の２０％ＤＭＳ０５ｍｇを２分間室温で派別する
。直ちに培地を２回交換して皿を洗浄し、次いで新鮮な
培地で一夜インキユベートする。ＤＮＡを添加後、２４
時間目に培地を除去し次いで選択培地（血清を官有する
ダルベツコ培地中、１（ｌｙ／−のＧ　４１８　、４９
８１ｌ１ｍ９．ギブコ）を添加する。約１０〜１３日後
、ｐｋｏ　−ｎｅ。

遺伝子を担み入れて０４１８に対して削性の細胞金代衣
する個々のクローンを、９６個のウェルを有するプレー
トに移し次いでプロティンアッセイのため１０％ウシ胎
児血ｒ９を力１１えたダルベツコ培地中で増殖させる。

プロティンＣの分析のため、培地全遠心分離することに
より細胞および細胞破片を分離し、次いでプロティンＣ
ポリペプチド部分よぴ生物活性について分析する。細胞
をトリプシンを用いて皿から取り出し、幼鮮な培地で洗
浄し、遠心分離し更に一２０℃で凍結させる。分析用に
＃Ｉ胞ペレットをＰＢＳ中で解凍し、ベレット化し１次
いで０．２５％トリトンＸ−１００を官有するＰＢＳ中
に再懸濁させる。サンプルを希釈し次いでポリペプチド
および活性を分析する。

プロティンＣについてのＥＬＩＳＡ［次のように行う。

ヒトプロティンＣ（０，Ｉ　ＭＮ＆２ＣＯ３中５ｎＵｒ
ｎｔ１ｐ）１９．６）に対する抗体（モノクローナルも
しくはポリクローナル）２００μｔを、９６個のウェル
を有するプレートの各ウェル中で２時１１１３７℃でイ
ンキ−ベートする。次いでウェルをＰＢＳ中、２２０μ
ｔの、１％ウシ血清アルグミン（ＢＳＡ　）および０．
０５％トウィーン２０と共に３７℃で２時間インキュベ
ートする。プレートを水で抗い、風乾し、４℃で株存す
る。サンプルを分析するため、２００μｔのサンプルを
抗体でコートされたウェル中で、室温にて１時間づンキ
ュベートする。次いでウェルを０．０５チトウイーン２
０を含有するＰＢ８２００μｔで４回洗浄する。５６ｍ
９／ｌのＭｇＣｌ２を含有するｐｉ（９，８０ジエタノ
ールアミン緩＠ｎ（ＩＡ１７ｔす９６−）に溶解した２
００μｔのｐ−ニトロフェニルホスフェート（３０〜）
をウェルに添力口する。

＃素反応を３７℃で行ない次いで黄色の展開を。

ＥＬＩＳＡプレート読みとり器を用い４０５　ｎｍで監
視する。

キーゼルおよびデビー（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ８０：３２０−３３２．１９８１）により記
載さレル如く、スロンビンによりプロティンＣを活性化
した後、血漿のカオリン−セファリン凝固時間を勉長さ
せるその能力により、該プロティンＣ生物活性を分析す
る。

例５ プロティンＣをコードする完全長ｃＤＮＡの発現Ａ、　
　ｃＤＮＡの単離 プロティンＣのプレープロペプチド（第４図のエクソン
１）のアミノ酸−４２〜１９に相当するエクソンを含む
ゲノムフラグメントを単離し、ニック翻訳し、Ｇｕｂｆ
ｅｒおよびＨｏ　ｆ　ｆｍａｎの技法（譚門且：２６３
〜２６９．１９８３年）により、ｍＲＮＡ　ｆ用いて、
ＨＥＰＧ２　ｍ胞から造成芒れたｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングするためのプローブとして用いた。こ
のセルラインは、ヒト肝細胞から誘導されたもので、プ
ロティンＣを合成することが予め示されたものであった
（Ｆａ　ｉ　ｒおよびＢａｈｎａｋ％Ｂｌｏｏｄ　６４
　：　１９４〜２０４゜１９８４年）。７丁−ジｇｔ　
１１のＥｅｏ　ＲＩ部位内に挿入されたｅ　ＤＮＡを含
む１０のポジティブクローンを単離し、プロティンＣ遺
伝子の５′非コード領域に対応するオリゴヌクレオチド
プローブによりスクリーニングした。１のクローンもこ
のプローブによりポジティブであり、その全ヌクレオチ
ド配列を決定した。このｃ　ＤＮＡに７０　ｂｐの５′
非翻訳配列、とトーデレデロプロテインＣに対する全コ
ード配列、および第２ポリアゾニレ−ジョン部位（第２
図）に対応する全３′非コード領域を含んでいた。

プロティンＣｃＤＮＡの発現がベクターｐＤＸ中で達成
され念。このベクターは、ｐＤ３　（例３に記載ンオヨ
ひｐＤ３’即ちＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナル
（即ち、ＳＶ４０　ＢａｍＨＩ　［２５３３ｂｐ　］　
〜Ｂｅ１１（２７７０ｂｐ］１１７Ｔ片）がレートオリ
エンテーションにあることを除いてｐＤ３と同一のベク
ターから誘導された。従って、ｐＤ３’は遺伝子挿入部
位としてＢａｍ部位を含む。

ｐＤＸ金成生するために、ｐＤ３’中のＥｃｏＲＩ部位
ｆ、ＥｃｏＲＩ　開裂、Ｓ１ヌクレアーゼとのインキエ
ペーション、および引続（Ｂｅｌ　ｌリンカ−による連
結により、Ｂｅ１１部位に変形した。ポジティブに四足
されたコロニーからＤＮＡを論断し、変化した制限部位
を宮む１．９　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｐｓｔ断片全７ガ
ロースｒル′亀気泳動によＶ調製した。第２の変形にお
いては、遺伝子を発現ベクター中に挿入するための位置
としてＥｃｏＲＩ部位を形成するために、ＢｃｌＩ開裂
ｐＤａをキナーゼ処理されたＥｅ。

ＲＩ−Ｂｃｌ　ｌアダプター（オリゴヌクレオチドｚＣ
５２５，５’ＧＧＡＡＴＴＣＴ３’、およびＺＣ５２６
，５’ＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣ３’から造成ンと連結し
た。ポジティブコロニーを制限エンドヌクレアーゼ分析
により同定し、これからのＤＮＡを用いて変形制限部位
を言む２．３　ｋｂＸｈｏ　Ｉ　−ＰＩＴ　Ｉ断片を単
離した。上記の２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
ととにインキュベートし、Ｅ、コリＨＢＩＯＩに形質＆
換し、制限分析によりポジティブコロニーをｌｎＪ定し
た。

次いで、ｐＤＸと呼ばれる、かかるＤＮＡの調製を行っ
た。このプラスミドは外来性遺伝子の挿入のためのユニ
ークＥｅｏＲＩ部位を言む。

次に、プロティンＣｅＤＮＡ　ｆ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片と
してｐＤＸ中に挿入した。組換プラスミドを制限分析に
よりスクリーニングしてプロモーター要素に対して正し
い方向のプロティンＣ挿入部を有するプラストを同定し
、プラスミドＤＮＡ　（ＰＤＸ／ＰＣと表示される）を
正しいクローンから調製した（第１２図）。ｐＤＸ／Ｐ
Ｃ中のｅＤＮＡ神入部は５′非コード憤域中にＡＴＧコ
ドンを言むから（第２図）、トランスフェクションおよ
び発現実験の前にｃ　ＤＮＡに対して欠失変異誘発が行
われた。３塩基対の欠失がオリゴヌクレオチド指令変異
誘発の標準操作に従って行われたＯ変形ｅＤＮＡを含む
ｐＤＸにもとづくベクターをｐ５９４と表示した。

Ｃ，ｅＤＮＡ発現 プラスミドｐ５９４を燐酸カルシウム沈澱によりＣＯ８
細胞中にトランスフェクトした。４時間後に、新たな培
地（５μＩＩ／ｎｔのビタミ４を補充）を添加した。適
当な時間（通常４８または７２時間）で、培地を収得し
、細胞を回収し、溶解した。

培地又は細胞抽出物中に分泌されたプロティンＣを、Ｅ
ＬＩＳＡにより、ｅ　ＤＮＡクローンの初期同定に用い
たのと同一のアフィニティーＮａした。ｊｒ　ＩＪジク
ロール抗体を用いて、分析した。分析の結果（第２表）
は、プロティンＣが実験サンプル中で合成されており、
トランスフェクトされた細胞から容易に分泌されたこと
金示しており、プロティンＣの約９０％が培地中に認め
られた。

組換蛋白のγ−ｐルゴキシル化オ輻度を評価するために
、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈澱ＲＬＩち血漿
からガンマ−カルボキシル化蛋白のみを選択的に沈澱さ
せるプロセス（Ｂａｊａｊ他、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ＠ｍ、　　２５６　：　２５３〜２５
９．１９８１年）に付した。抗原物質の７０％以上をク
エン酸バリウムにより沈澱させることができた。

組換プロティンＣを、その凝固を引き延ばす能力を測定
することにより、抗凝固性活性の分析に付し友。透析し
た培地サンプルｆｔＰｒｏｔａｅｃ（Ａｍ＠ｒｉｃａｎ
　Ｄｉａｇｎｏｔｌｃｍ）により処理してプロティンＣ
を活性化した。次に、サンプルをインビトロ−クロッテ
ィングアッセイ（Ｓｕｇｏ他、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｓｍ、　　２６０　：　１０４５３．１
９８５年）に付し、クロッティング時間を測定した。組
換物質の活性は、天然産のプロティンＣのそれと本質的
に同一であることが認められた。

以下全白 表２ 分泌 なし　　　　０　　　　　０　　　検除ずｐ５９４　　
　１６５　　　２０　　　８９％以上の説明から、説明
のためにこの明細１においては本発明の特定の態様を記
述したけれども、本発明の精神と範囲から逸脱すること
なく１種々の変更がなされ得るということが理解される
であろう。従って、本発明は、竹許錆求の範囲による場
合を除いては、限定して理解されるべきものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＨＣλ６Ｌ中のプロティンＣｃＤＮＡの部分
的制限地図である。コード領域が中空箱により示されて
いる。 第２図は完全なプロティンＣｅＤＮＡのヌクレオチド配
列及びプロティンＣの推定されるアミノ酸配列を示す。 矢印は連結（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ　）ジペプチドの除
去及びペプチドの活性化のための開裂部位を示す。 第３因はヒトープロティンＣｉコードするゲノムＤＮＡ
の制限酵素地図を示す。線の下の数値は長さをキロペー
ス（ｋｂ　）で示す。 ゛第４図はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及びイ
ントロンを含む完全ゲノム配列を示す。矢じりはイント
ロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。３′末
端のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−
Ａのポリアゾニレ−ジョン又はプロセシング配列箱に囲
まれており、◆は潜在的な炭水化物付加部位であυ；ｌ
は連結（ｃｏｎｎｅｅｔｌｎｇ）ジペプチドのプロセシ
ングのための可能性ある開裂部位であり；↓にプロティ
ンＣが油性化され友プロティンＣに転換される場合のヘ
ビー鎖中の開裂部位であり；・はポリアゾニレ−ジョン
部位である。 第５囚はヒト−プロテインＣの構造の概略の二次元モデ
ルを示す。 第６図はプロティンＣの部分的ｃ　ＤＮＡクローンの５
′及び３′部分のサブクローニングｅ示ｆ。 第７図は、エクソンＩとエクソン■との連結をもたらす
、）ｌａミツムクローンらのイントロンＡの除去を示す
。 第８図は第１図のａ　ＤＮＡ挿入部の最も５′側部分へ
のエクソンＩ及び■の融合を示す。 第９図はプロティンＣのための完全コード配列ｔａんで
成るプラスミドの造成を示す。 第１０図は発現ベクターｐＤＴＣを示す。使用されてい
る記号は、　ｏｒｉアデノウィルス５０−１マツプユニ
ット配列であり；ＥはＳＶ４０エンハンサ−であシ；　
Ａｄ２ＭＬＰはアデノウィルス２主安後期プロモーター
であす；Ｌｌ−３はアデノウィルス２−３分節系（ｔｒ
ｉｐａｒｔｉｔｅ　）リーダーであり；５’ｍｓは５′
スプライシング部位であ、！１１　：　３’ｍｓは３′
スプライシング部位であり；ｐＡはＳＶ４０初期ポリ７
７’ニレーシ、ンシグナルであ＃）：゛そしてΔはｐＢ
Ｒ３２２の１ポイゾン’　（ｐｏｉｓｏｎ）配列の除去
領域である。 第１１！ｌｃ発ｍヘクｐ−ｐＤ５　（ｐｃ−ｏｕｐＲｒ
）６示す。ＤＨＦＲｒｔ！メトトレキセート耐性変異ソ
ヒドロフォレートラダクターゼ遺伝子配列を示し：ｐＡ
ｆ１８Ｖ４０後期ポリアゾニレ−ジョンシグナルに示す
。他の記号は第７図に関して記載した通りである。 第１２図は発現ベクターＰ　ＤＸ／Ｐ　Ｃを示す。使用
されている記号は第１１図に関して記載し九通りである
。 ＋３１下全白 図面の浄書（内容に変更なしＩ ＦＩＧ。６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト−プロテインＣ又は活性化されたヒト−プロテ
   インＣと実質的に同じ生物学的活性を有する蛋白質をコ
   ードするＤＮＡ配列。 ２、ヒト−プロテインＣをコードする、第４図の塩基対
   １〜塩基剤８９７２の配列を含んで成るＤＮＡ配列。 ３、ヒト−プロテインＣ又は活性化されたヒト−プロテ
   インＣと実質的に同じ生物学活性を有する蛋白質をコー
   ドするＤＮＡ配列を含んで成る組換発現ベクター。 ４、第２図中の１位のアラニンから始まって４１９位の
   プロリンで終る配列を含んで成るアミノ酸配列。 ５、第２図の１位のアラニンから始まつて４１９位のプ
   ロリンで終るアミノ酸配列をコード するｃＤＮＡを含んで成る組換発現ベクター。 ６、第４図の１８５位のバリンから始まつて２２３位の
   ロイシンまで、及び２２４位のグリシンに続きそして４
   １９位のプロリンで終るアミノ酸配列をコードする配列
   を含んで成り、プロテインＣのセリンプロテアーゼ活性
   を有する蛋白質をコードする、ＤＮＡ配列。 ７、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】をコード
   するＤＮＡ 配列を含有する特許請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ配
   列。 ８、哺乳類宿主細胞ＤＮＡへ組み込まれ得る発現ベクタ
   ーであって、プロモーター、これに続きその下流にある
   ヒト−プロテインＣ又は活性化されたヒト−プロテイン
   Ｃと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白質を
   コードするヌクレオチド配列、並びにこれに続きその下
   流にあるポリアデニレーションシグナルを含有し、前記
   ヌクレオチド配列の転写が前記プロモーターにより指令
   される、ベクター。 ９、活性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ構
   造及び／又は生物学的活性を活性化後に有する蛋白質を
   発現するためにトランスフェクトされている哺乳類細胞
   。 １０、前記細胞が哺乳類宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ
   得る発現ベクターによりトランスフェクトされ、この発
   現ベクターが、プロモーター、これに続きその下流にあ
   るヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又は活
   性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、並び
   にこれに続きその下流にあるポリアデニレーションシグ
   ナルを含有しており、前記ヌクレオチド配列の転写が前
   記プロモーターにより指令される、特許請求の範囲第９
   項に記載の細胞。 １１、活性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ
   構造及び／又は生物学的活性を有する蛋白質を発現する
   ためにトランスフェクトされた哺乳類細胞。 １２、活性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ
   構造及び／又は生物学的活性を活性化後に有する蛋白質
   の製造方法であって、ヒト−プロテインＣと実質的に同
   じ構造及び／又は活性を有する蛋白質をコードする配列
   を含んで成る発現ユニットを哺乳類宿主細胞中に導入し
   ；該哺乳類宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ；そし
   て前記発現ユニットによりコードされておりそして前記
   哺乳類宿主細胞により生産された蛋白質生成物を単離す
   ることを含んで成る方法。 １３、前記発現ユニットと共に選択マーカーを宿主細胞
   に導入することをさらに含んで成る特許請求の範囲第１
   ２項に記載の方法。 １４、前記蛋白質生成物を活性化して、活性化されたヒ
   ト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を有する
   蛋白質を製造する段階をさらに含んで成る特許請求の範
   囲第１２項に記載の方法。 １５、前記活性化段階が、−スロンビン、トリプシン、
   及びＲｕｓｓｅｌｌのマムシ毒ファクターＸアクチベー
   ターから成る群から選択されたプロテアーゼによる蛋白
   質生成物の開裂を含んで成る特許請求の範囲第１４項に
   記載の方法。 １６、前記発現ユニットが哺乳類宿主細胞ＤＮＡ中に組
   み込まれ得る発現ベクター上に含まれており、この発現
   ベクターがプロモーター、これに続きその下流にあるヒ
   ト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を
   有する蛋白質をコードするヌクレオ配列、並びにこれに
   続きその下流にあるポリアデニレーションシグナルを含
   有し、前記ヌクレオチド配列の転写が前記プロモーター
   により指令される、特許請求の範囲第１２項に記載の方
   法。 １７、活性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ
   構造及び／又は生物学的活性を有する蛋白質の製造方法
   であって、活性化されたヒト−プロテインＣと実質的に
   同じ構造及び／又は活性を有する蛋白質をコードする配
   列を含んで成る発現ユニットを哺乳類宿主細胞に導入し
   ；この哺乳類宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ；そ
   して前記発現ユニットによりコードされておりそして前
   記哺乳類宿主細胞により生産された蛋白質生成物を単離
   することを含んで成る方法。 １８、活性な療法物質として使用するための、特許請求
   の範囲第１２項又は特許請求の範囲第１７項の方法に従
   って製造された蛋白質。 １９、特許請求の範囲第１２項又は第１７項の方法に従
   つて製造された蛋白質及び生理的に許容される担体及び
   ／又は稀釈剤を含んで成る医薬組成物。