JPH08511423A

JPH08511423A - 血友病治療のためのアデノウイルスベクター

Info

Publication number: JPH08511423A
Application number: JP7501744A
Authority: JP
Inventors: コネリ，シーラ; カレコ，マイケル; スミス，セオドア
Original assignee: ジェネティックセラピー，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-06-10
Filing date: 1994-04-13
Publication date: 1996-12-03
Also published as: CA2162497A1; EP0710288A4; EP0710288A1; WO1994029471A1; ATE322547T1; US6649375B2; US20020064812A1; US5935935A; EP0710288B1; DE69434689D1

Abstract

(57)【要約】凝固因子、例えば因子VIIIあるいは因子IXなどをコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を含む一つのアデノウイルスベクター。このようなベクターは宿主にある血友病を治療するのに有効な量で宿主に投与することが出来る。このベクターは肝細胞を非常に効率的に感染させ、これにより肝細胞は凝固因子をコード化するＤＮＡ配列を発現する。

Description

【発明の詳細な説明】血友病治療のためのアデノウイルスベクターこの出願は１９９３年６月１０日受理された出願番号０７４，９２０を部分継承するものである。発明の分野この発明はアデノウイルスベクターに関する。より詳細には、この発明は血友病治療に使用されるアデノウイルスベクターに関する。発明の背景血友病ＡおよびＢは、それぞれ凝固因子VIIIおよびIXの欠損により生じるＸ連鎖劣性出血疾患である。アメリカ合衆国では血友病Ａの患者約１７，０００人および血友病Ｂの患者２，８００人が存在する。両血友病の臨床上の説明は、自発的かつ長びく出血という出来事である。患者はしばしば関節出血に苦しみ、これが障害性関節症に導く。現在の治療は、血友病Ａに対してプラスマ誘導凝固因子、すなわち組換え因子VIIIを静脈内注入して出血をとめることに向けられる。しかし治療は凝固因子の利用可能性、生体内での短い半減期、および１年に優に１００，０００ドルに達する高い治療費により限定される。遺伝子治療は血友病治療の新しい方法についての将来の見込みを提供する。研究者のいくつかのグループが因子VIIIおよび因子IXをコード化するＲＮＡを含むレトロウイルスベクターについての研究を実施した。実質的にこのようなベクターで生体内にこれらの因子の治療レベルを産み出すための今日までのすべての試みは成功していない。因子VIIIに対するｃＤＮＡおよびＲＮＡはとりわけ動かすことが困難である。ヘーベン、他、生物科学ジャーナル、２６５巻、７３１８−７３２３ページ（１９９０年）およびイズラエル、他、血液、７５巻、５号、１０７４−１０８０ページ（１９９０年３月１日）は、Ｂ領域欠失ヒト因子VIIIをコード化するＤＮＡ（ＲＮＡ）を含むレトロウイルスベクターを用いた試験管内マウス繊維芽細胞の感染を記述している。この感染細胞は試験管内での機能的ヒト因子VIIIを発現することが発見されてはいるが、タンパク質は低水準で発現されたに過ぎなかった。最近ヘーベン、他、ヒト遺伝子治療、４巻、１７９−１８６ページ（１９９３年）はヒト因子VIIIをコード化するＤＮＡを含むレトロウイルスベクターで繊維芽細胞を感染させた。これらの細胞は次いで免疫不全マウスに移植された。移植２ケ月後に移植組織から回収された細胞は組織培養で再成長した時にまだ因子VI IIを分泌する性能を持っていたが、ヒト因子VIIIは受容体マウスのプラスマサンプル内では検出されなかった。リンチ、他、ヒト遺伝子治療、４巻２５９−２７２ページ（１９９３年）はヒト因子VIII ｃＤＮＡを含むレトロウイルスベクターのプラスミド形態を用いたＰＥ５０１パッケージング細胞の形質移入を記述している。このウイルスは収穫され、両栄養性レトロウイルスパッケージング細胞を感染するのに使用された。しかし感染細胞はヒト因子VIIIおよびウイルス力価を他のｃＤＮＡを含む類似のレトロウイルスベクターより大きさが約２ランク低い量で生産したに終った。リンチ、他は更に他のｃＤＮＡ配列と比較してヒト因子VIII配列を含むベクターＲＮＡの累積が１００倍も少ないことを発見した。リンチ、他は因子VIIIに取り組み次のような難点について報告している。高力価因子VIII含有レトロウイルスベクター株は生成が困難であり、因子VIII ｃＤＮＡ配列含有レトロウイルスベクターは因子VIII ｃＤＮＡ配列の部分を再配列およびもしくは欠失させる傾向がある。更に因子VIII ｍＲＮＡはもともと不安定である。またＢ領域欠失因子VIIIコーディング領域は１．２キロベースＲＮＡ累積阻害シグナルを含む。かくしてこの文献は因子VIIIによる遺伝子治療にレトロウイルスを用いるアプローチで作業することは重要な問題があり、また僅か限定された発現が行われたに過ぎなかったことを開示する。出願人はヒト因子VIIIが動物モデルで発現されたという報告について知ってはいない。研究者達は更にレトロウイルスベクターを用いる因子IXの治療水準を達成することにも大きな困難を経験した。パーマー、他、血液、７３巻、２号、４３８−４４５ページ（１９８９年２月）はヒト因子IXをコード化するＤＮＡ（ＲＮＡ）を含むレトロウイルスベクターを用いたヒト皮膚繊維芽細胞の形質導入を開示する。この形質導入繊維芽細胞は次いでラットおよびヌードマウスに供与された。このような繊維芽細胞はヒト因子IXを動物血液中に１９０ｎｇ／ｍｌまでの量で過渡的に発現することが発見されたが、この量は治療水準にあるとは一般に考えられていない。シャーフマン、他、全米科学アカデミー紀要、８８巻、４６２６−４６３０ページ（１９９１年６月）はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターの制御下でβガラクトシダーゼを含むレトロウイルスベクターを使ったマウス繊維芽細胞移植片の形質導入を開示する。この繊維芽細胞は次いでマウスに移植され、６０日目までにβガラクトシダーゼ遺伝子の発現が得られた。シャーフマン、他はイヌ因子IXで形質導入された繊維芽細胞を開示するが、彼等は短期間および非治療水準の発現を得たに過ぎなかった。ディ、他、全米科学アカデミー紀要、８９巻、１０８９２−１０８９５ページ（１９９２年１１月）はマウス筋クレアチンキナーゼエンハンサーおよびヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制御下でイヌ因子IX ＤＮＡを含むレトロウイルスベクターを用いるマウス一次筋芽細胞の形質移入を開示する。形質移入筋芽細胞は次いでマウスの後脚に注入された。６ケ月間にわたるイヌ因子IXの発現が得られた。しかしプラスマ内に分泌される因子IXの定常状態水準（１０⁷注入細胞に対し１０ｎｇ／ｍｌ）は治療価値としては十分なものではない。ジェラード、他、自然遺伝学、３巻、１８０−１８３ページ（１９９３年２月）は、レトロウイルスＬＴＲの制御下でヒト因子IX遺伝子を含むレトロウイルスベクターを用いる一次ヒトケラチノサイトの形質移入を開示する。形質転換ケラチノサイトは次いでヌードマウスに移植され、またヒト因子IXは約１週間後に血流内で検出された。しかし因子IXの量は２．５ｎｇ／ｍｌ、つまり治療用量の約１％に過ぎなかった。ケイ、他、サイエンス、２６２巻、１１７−１１９ページ（１９９３年１０月１日）は因子IX ＤＮＡを含むレトロウイルスベクターの部分肝切除の後のイヌ門脈血管系への直接注入を開示する。この動物は５ケ月間以上にわたりイヌ因子 IXを低水準で発現した。このような因子IXの発現は治療される動物の全血血餅形成時間および部分トロンボプラスチン時間を減少させることにはなったけれども、この技術がヒトに適用される前に因子IXの水準を高めることがまず達成されなければならないと著者は述べた。ズー、他、中国における科学、３６巻、９号、３３−４１ページ（１９９３年９月）はヒト因子をコード化するＤＮＡを含むレトロウイルスベクターによるラビット皮膚繊維芽細胞の形質移入を開示する。この繊維芽細胞は次いで自己移植あるいは同種移植としてラビットに移植された。ヒト因子IXの発現はラビット内で１０ケ月以上維持された。４８０ｎｇ／ｍｌまでのラビットプラスマでの因子 IXの水準は達成されたと主張された。しかし因子IXを測定するために使用された検定は偽陽性結果を生成するポテンシャルを持つ抗ラビット抗体を採用した。ルー、他、中国における科学、３６巻、１１号、１３４１−１３５１ページ（１９９３年１１月）およびスー、他、ヒト遺伝子治療、３巻、５４３−５５２ページ（１９９２年）はヒト遺伝子治療実験を開示し、ここでヒト皮膚維持芽細胞は二人の血友病患者から採取され、ヒト因子 IXをコード化するＤＮＡを含むレトロウイルスベクターで形質移入された。この細胞は次いで患者に注射された。一人の患者ではヒト因子IXの濃度は７１ｎｇ／ｍｌから２２０ｎｇ／ｍｌに増加し、最高水準は２４５ｎｇ／ｍｌになった。この患者の凝固活性は２．９％から標準の６．３％まで増加した。他の患者においては、因子IXのプラスマ水準が１３０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍｌに増加し、５．５ケ月の間２２０ｎｇ／ｍｌの水準で維持された。しかし凝固活性は増加しなかった。これらの患者に関する前処理因子IXデータが欠乏しているため、治療で見られる因子IXの増加が少しあったことを理解することを困難にしている。血友病Ａおよび血友病Ｂの遺伝子治療にレトロウイルスを使用する試みについて科学的文献から引き出された結論は、真に一致協力した努力および数多くの試みにも拘らず、大体においてこの分野はヒト因子VIIIあるいはヒト因子IXを生体内で発現する治療水準を達成するために使用出来るレトロウイルスベクターを生産するのに失敗した。因子VIIIへの取組みが特に困難であり、その結果はいずれも同じように不十分であった。前記の実験戦略は労力を要するものであり臨床的にも出過ぎたものであった。アデノウイルスベクターはも一つの遺伝子治療へのアプローチを提供する。アデノウイルスゲノムは約３６キロベース対の線形二本鎖ＤＮＡ分子である。ウイルスゲノムの各端部は逆方向末端反復（すなわちＩＴＲ）として知られるウイルス複製に必要な短い配列を持つ。アデノウイルスについてよく特性付けられた分子遺伝学が遺伝子移転に対し有利なベクターを提供する。ウイルスゲノムの一部は外来起点のＤＮＡで代替することが出来る。加えて組換え型アデノウイルスは構造上安定しており、大規模な増幅後でも再配列ウイルスは観察されていない。組換え型アデノウイルスは数多くの細胞型への遺伝子転移に有効なベクターとして使用されてきた。以下にある肝細胞形質導入についてのいくつかの報告がある。ジャック、他、自然遺伝学、１巻、３７２−３７８ページ（１９９２年）、（アルファ−１−抗トリプシン）；リ、他、ヒト遺伝子治療、４巻、４０３−４０９ページ（１９９３年）（β−ガラクトシダーゼ）；ストラットフォード−ペリコーデット、他、ヒト遺伝子治療、１巻、２４１−２５６ページ（１９９０年）（オルニチントランスカルバミラーゼ）；スミス、他、自然遺伝学、５巻、３９７−４０２ページ（１９９３年）（因子IX）；およびアメリカ医学協会ジャーナル、２６９巻、７号、８３８ページ（１９９３年２月１７日）（マーカータンパク質）。因子VIIIは肝細胞で主として合成されるため（ケリー、他、英国血液学ジャーナル、５６巻、５３５−５４３ページ（１９８４年）；ワイオン、他、ネイチャー、３１７巻、７２６−７２９ページ（１９８５年）；ゼレコフスカ、他、ネイチャー、３１７巻、７２９−７３２ページ（１９８５年））、因子VIII含有組換え型アデノウイルスで肝細胞を形質導入すると、因子 VIIIタンパク質の生体内での発現を生成し、血友病Ａに対する有効な遺伝子治療に基礎を置く療法となる。発明者は動物宿主に投与した際に凝固因子の治療水準を生み出す高力価で安定したアデノウイルスの生産方法を発見した。これらのベクターは遺伝子の転移を生体内で媒介し、これまでに記述されたものに比べて治療実験観察記録を労力が少なく出過ぎてもいないものとしている。図面の簡単な説明この発明は下記の図面と関連してこれから説明される。ここで図１はプラスミドｐＧ１の構築の工程図である。図２はｐＧ１プラスミド内での多重クローニング部位の配列である。図３はプラスミドｐＧ１の地図である。図４はプラスミドｐＧ１Ｈ９の地図である。図５はプラスミドｐｈｆａｃIXの地図である。図６はプラスミドｐＧ１Ｈ９Ｂの地図である。図７はプラスミドｐＨＲの構築の工程図である。図８はＩＴＲ，包膜シグナル、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルス三部分リーダー配列、およびＰＣＲ増幅を用いる結合配列の集合の工程図である。図９はｐＡｖＳ６の構築の工程図である。図１０はｐＡｖＳ６の地図である。図１１はヒト因子IXｃＤＮＡ配列である。図１２はｐＡｖＳ６Ｈ９Ｂの地図である。図１３はＡｖ１Ｈ９Ｂ生成の工程図である。図１４はＡｖ１Ｈ９Ｂの実質細胞内注射あるいは門静脈内注射で与えられるマウス内の因子IXプラスマ水準のグラフである。図１５はマウス肝臓における因子IXＤＮＡの存在を確認するためのサザン分析のオートラジオグラムである。図１６はプラスミドｐＭＴ２ＬＡの地図である。図１７はＢ領域欠失ヒト因子VIIIｃＤＮＡの配列である。図１８はプラスミドｐＡｖＳ６Ｈ８１の地図である。図１９はＡｖ１Ｈ８１構築の工程図である。図２０はプラスミドｐＡＴ２−３ｅＧの地図である。図２１はプラスミドｐＡｖＡＬ１の地図である。図２２はプラスミドｐＧＥＭ（ｓａｃ）の地図である。図２３はプラスミドｐＧＥＭの地図である。図２４はプラスミドｐＧＥＭａｌｂの地図である。図２５はプラスミドｐＧＥＭａｌｂＦ８Ｂの地図である。図２６はプラスミドｐＡｖＡＬＨ８１の地図である。図２７はプラスミドｐｇｅｍＦ８Ｂ２の地図である。図２８はプラスミドｐＢＧＳ１９−ＡＩｇＩの地図である。図２９はプラスミドｐＵＣ１９の地図である。図３０はプラスミドｐＵＣ１９−ＡＩｇＩの地図である。図３１はプラスミドｐＢＧＳ１９の地図である。図３２はプラスミドｐＧｅｍＡＰＦ８Ｂの地図である。図３３はプラスミドｐＡｖＡＰＨ８１の地図である。図３４はプラスミドｐＧｅｍＡＰｅｘＦ８の地図である。図３５はプラスミドｐＡＬＡＰＦ８Ｂの地図である。図３６はプラスミドｐＡｖＡＬＡＰＨ８１の地図である。図３７はＡｖ１ＡＬＨ８１生成の工程図である。図３８はＡｖ１ＡＬＨ８１ＤＮＡの制限消化分析のブロット（点染）である。図３９はアデノウイルスベクターＡｄ５−ｄ１３２７，Ａｖ１ＡＬＨ８１、およびＡｖ１ＡＬＡＰＨ８１の工程図である。図４０はヒト因子VIII特異的エリザ検定の標準両対数曲線である。図４１および４２は二つの別個の実験でマウスプラスマ内でのヒト因子VIIIの量の経時変化を示すグラフである。図４３はＡｖ１ＡＬＨ８１の各種用量注入後のマウスプラスマ内でのヒト因子 VIIIの生体内発現の経時変化を示すグラフである。図４４および図４５は実験用マウスおよび対照マウスのヒト因子VIII半減期を示すグラフである。図４６はＡｖ１ＡＬＨ８１の４×１０⁹ｐｆｕの条件下でマウス内でのヒト因子VIIIの生体内発現を示すグラフである。図４７はプラスミドｐＢＬＳＫＨ９ＣＩの地図である。図４８はプラスミドｐＢＬＳＫＨ９Ｄの地図である。図４９はプラスミドｐＢＬＨ９ＣＩＮＴの地図である。図５０はプラスミドｐＢＬＨ９ＥＩＮＴの地図である。図５１はプラスミドｐＢＬＨ９Ｅの地図である。図５２はプラスミドｐＢＬＨ９Ｆの地図である。図５３はプラスミドｐＡＶ１Ｈ９Ｄの地図である。図５４はプラスミドｐＡＶ１Ｈ９ＥＲの地図である。図５５はプラスミドｐＡＶ１Ｈ９ＦＲの地図である。図５６はＡｖ１Ｈ９Ｂ，Ａｄ１Ｈ９Ｄ，Ａｄ１Ｈ９ＥＲおよびＡｄ１Ｈ９ＦＲで処理したマウス内での因子IX発現を示すグラフである。図５７は１×１０⁹ｐｆｕのＡｖ１Ｈ９Ｂ，Ａｄ１Ｈ９ＤあるいはＡｄ１Ｈ９ＥＲで処理したマウス内での因子IX発現を持つグラフである。図５８は５×１０⁷ｐｆｕのＡｄ１Ｈ９ＥＲあるいはＡｄ１Ｈ９ＦＲで処理したマウス内での因子IX発現を示すグラフである。また、図５９はＨｅｐＧ２およびヒーラ細胞内での因子IXの試験管内発現、および２ ×１０⁸ｐｆｕのＡｖ１Ｈ９Ｂ，Ａｄ１Ｈ９Ｄ、あるいはＡｄ１Ｈ９ＥＲで処理した因子IXの生体内発現を示すグラフである。３個の棒グラフの各グループで、最左端の棒グラフはＡｖ１Ｈ９Ｂに関するデータ、真中はＡｄ１Ｈ９Ｄ、また最右端の棒グラフはＡｄ１Ｈ９ＥＲに関するデータを表している。発明の詳細な説明この発明の一つの見地に従って、一つの凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を含む一つのアデノウイルスベクターが提供される。ここで使用される「一つの凝固因子をコード化するＤＮＡ配列」という用語は、一つの全長凝固因子あるいは凝固因子の断片、誘導体、あるいは類似体をコード化するＤＮＡを意味する。すなわちそのＤＮＡは、全長凝固因子をコード化する全長遺伝子、あるいは切形遺伝子、もしくは凝固因子活性を持つそのような凝固因子の断片あるいは誘導体もしくは類似体をコード化する突然変異遺伝子である。「ＤＮＡ配列」という用語は一般にポリデオキシリボヌクレオチド分子を言い、より詳細には隣接するペントースの３′および５′炭素間のホスホジエステル結合により相互に結合した線形系列のデオキシリボヌクレオチドを言う。一つの実施例において、ＤＮＡ配列は因子VIIIあるいは因子VIIIの凝固活性を持つその断片、誘導体、あるいは類似体をコード化する。も一つの実施例において、ＤＮＡ配列は因子IXあるいは因子IXの凝固活性を持つその断片、誘導体、あるいは類似体をコード化する。ヒト因子IXをコード化するＤＮＡ配列は１９９１年２月１９日デイヴィ、他に発行されたアメリカ合衆国特許番号４，９９４，３７１およびナショナルリサーチデヴェロップメントコーポレイションに発行されたヨーロッパ特許番号ＥＰＯ１０７２７８１３１（特許付与公告１９８９年１１月１５日）で示され説明される。因子VIIIおよびその断片あるいは誘導体をコード化するＤＮＡ配列は１９８８年７月１２日、トゥール、ジュニア他に発行されたアメリカ合衆国特許番号４，７５７，００６、１９８９年９月１９日にトゥール、ジュニア他に発行された同４，８６８，１１２、１９９１年４月２日、クオ、他に発行された同５，００４，８０４、および１９９２年９月２２日スキャンデッルラ、他に発行された同５，１４９，６３７に示され説明される。本発明者達は凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を含むアデノウイルスベクターで宿主を生体内で感染させることにより、生体内で凝固因子、あるいは凝固因子活性を持つ断片もしくは誘導体あるいは類似体の発現を有効な治療水準で達成出来ることを発見した。一般にこのような有効治療水準は、凝固因子の正常な水準の約５％もしくはそれ以上であった（北イングランド医療ジャーナル、３２８巻、７号、４５３−４５９ページ（１９９３年２月１８日）。血液、７４巻、１号、２０７−２１２ページ（１９８９年７月））。この水準は一般に因子VIIIでは約１０ｎｇ／ｍｌもしくはそれ以上、また因子IXでは約２５０ｎｇ／ｍｌもしくはそれ以上であった。凝固因子をコード化するＤＮＡ配列は適切なプロモーターの制御下にある。使用される適切なプロモーターは必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；唾液腺ウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター；呼吸シンシチアルウイルスプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；アルブミンプロモーター；マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどの誘導プロモーター；メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター； α−１抗トリプシンプロモーター；Ｂ型肝炎表面抗原プロモーター；トランスフェリンプロモーター；アポリポタンパクＡ−１プロモーター；因子VIIIプロモーター；および因子IXプロモーターを含む。しかしこの発明の範囲は特異的プロモーターに限定されるものではないことは理解されねばならない。一つの実施例において、ＤＮＡ配列が因子VIIIあるいはその断片、誘導体、もしくは類似体をコード化する時に、ＤＮＡ配列を制御するプロモーターは望ましくは例えば肝細胞内で活性であるマウスアルブミンプロモーターなどのような組織特異的プロモーターである。この実施例の範囲はいずれの理論的類推に限定されるものではないが、発明者達は組織特異的プロモーターを使用することにより、生産者細胞に対して起り得る因子VIIIの毒性が避けられるということを確信するものである。マウスアルブミンが使用される際に、これは肝細胞内で活性であり、アデノウイルスベクターは肝細胞以外の細胞内で選択的に成長する。生成アデノウイルスベクターが宿主に投与される時には、そのベクターは当業者にとって周知の方法により宿主に投与され、これによりベクターは移動し肝細胞を感染させる。感染肝細胞は次いで治療量で因子VIIIを発現する。因子VIIIは肝細胞に対して毒性がなく、かくして治療水準での発現を続ける。更にも一つの実施例において、ＤＮＡが因子IXあるいはその断片、誘導体、もしくは類似体をコード化する時、ＤＮＡ配列を制御するプロモーターは望ましくは例えばラウス肉腫ウイルスプロモーターのような組織特異的ではない強力プロモーターである。因子IXは大抵の細胞に対し毒性ではないと考えられているため、アデノウイルスベクターはいずれの細胞型においても成長し、また患者に対し有効治療量で投与され、これによりアデノウイルスベクターは移動して例えば肝細胞などのような細胞を感染させ、これにより因子IXは治療量で発現されることになるであろう。遺伝子導入マウスにおいて、ｃＤＮＡの発現の増加はイントロンと同じく５′ および３′未翻訳領域のとり込みにより得られることがいくつかの報告で明らかにされた（チュー、他、核酸研究、１５巻、８８１−８８４ページ（１９８７年）；ブリンスター、他、全米科学アカデミー紀要、８５巻、８３６−８４０ページ（１９８８年）；ジャラット他、ＥＭＢＯＪ．，９巻、１０号、３２９５− ３３０１ページ（１９９０年）；およびチェー、他、分子細胞生物学、１１巻、３０７０−３０７４ページ（１９９１年））。しかしアデノウイルスベクターバックボーンにとり込まれた外因性遺伝子発現の改良におけるゲノム要素の有効性についてはこれまでに示されてはいない。一つの実施例において、凝固因子をコード化するＤＮＡ配列はまた、発現を高めるためにイントロンおよび他のゲノム要素を含むことが出来る。ここで使用される「ゲノム要素」という用語は、通常ｃＤＮＡにはとり込まれずまたアデノウイルスゲノムの一部でもない自然発生遺伝子にあるヌクレオチドの配列を意味する。ベクターに含まれ得るこのようなゲノムは必ずしもそれに限定されないが、イントロン、凝固因子をコード化する遺伝子の５′未翻訳領域、および３′未翻訳領域、あるいはそのような５′および３′未翻訳領域およびイントロンの一部分を含む。使用されるイントロンの例は、必ずしもそれに限定されないが、因子IX遺伝子、あるいはその部分の７個のイントロンのいずれか（ＥＭＢＯＪ．，９巻、１０号、３２９５−３３０１ページ（１９９０年））；あるいは因子VIII遺伝子の２５個のイントロンのいずれか（ギッシア、ネイチャー、３１２巻、３２６−３３０ページ（１９８４年））、もしくはその部分；あるいはアポリポタンパクＡ−１遺伝子の第１エキソンおよびイントロンを含む。ＤＮＡ配列が因子IXあるいはその断片、誘導体、もしくは類似体をコード化する時、ベクターは１実施例においては更に因子IX ＤＮＡ配列の完全３′未翻訳領域を含む。も一つの実施例においては、ベクターは完全５′未翻訳領域および中心切形第１イントロンを更に含む。更に一つの実施例では、ベクターは因子IX 遺伝子の完全第７イントロンを含むことが出来る。このような要素がベクターに含まれる時、因子IXの発現の改善された水準が得られる。この発明の範囲はいずれかの理論的類推に限定する意図はないけれども、このような発現の改良は（ｉ）ゲノム配列へのエンハンサーのとり込み、（ｉｉ）ｍＲＮＡの安定化、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡの細胞形質への加工および輸送の改良、およびもしくは（ｉｖ）改良されたポリアデニル化、によるものである。も一つの実施例において、アポリポタンパクＡ−１遺伝子の第１エキソンおよび第１イントロンがもし望ましければアポリポタンパクＡ−１遺伝子プロモーターと共に使用することが出来る（全米科学アカデミー紀要、８０巻、６１４７− ６１５１ページ（１９８３年１０月）；生物科学ジャーナル、２６６巻、２７号、１８０４５−１８０５０ページ（１９９１年９月））。前記イントロンおよびもしくはエキソンは、更に凝固因子をコード化する遺伝子の５′未翻訳領域およびもしくは３′未翻訳領域と併用することが出来る。一つの望ましい実施例において、アポリポタンパクＡ−１プロモーターは単独で、あるいは第１エキソンおよびもしくは第１イントロンと併用して、因子VIII 遺伝子と併用して使用される。使用されるアデノウイルスベクターは、１実施例において、基本的に完全なアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターである（シェンク他、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１巻、（３号）、１ −３９ページ（１９８４年））。代替的にアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの少くとも一部が欠失している修飾アデノウイルスベクターである。望ましい実施例において、アデノウイルスベクターはアデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス３′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列、および凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を制御するプロモーターよりなる。このベクターは少くとも大多数のアデノウイルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列からは自由であるが、すべてのＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列、更にアデノウイルス主要後期プロモーターにより促進されるアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列から自由ではない。１実施例において、ベクターはＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列よりなるグループから選択される少くとも１個のＤＮＡ配列の少くとも一部からは自由である。も一つの実施例において、ベクターは少くとも大多数のアデノウイルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列から自由であり、またＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列の一つから自由であり、更にＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列以外のものの一部から自由である。更にまたも一つの実施例では、７２キロダルトン結合タンパク質をコード化するＥ２ａ領域にある遺伝子は、温度感受性タンパク質を生産するために突然変異され、それはウイルス粒子が生産される温度の３２℃で活性であり、動物あるいはヒト宿主の温度である３７℃では不活性となる。この温度感受性突然変異体は、エンシンジャー、他、ウイルス学ジャーナル、１０巻、３２８−３３９ページ（１９７２年）、ヴァンダーヴリート、他、ウイルス学ジャーナル、１５巻、３４８−３５４ページ（１９７５年）、およびフリーフェルド、他、ウイルス学、１２４巻、３８０−３８９ページ（１９８３年）に説明されている。またも一つの実施例では、ベクターは少くとも多数のＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列から自由であり、Ｅ２およびＥ４ＤＮＡ配列よりなるグループから選択される少くとも１個のＤＮＡ配列の少くとも一部から自由であり、またアデノウイルス主要後期プロモーターにより促進されるアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列から自由である。望ましい実施例においてこのようなベクターは、標準方法に従って一つのシャトルプラスミドを構築することによりまず構成され、このプラスミドは５′末端で開始し「臨界左末端要素」を含み、それはアデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、およびＥ１ａエンハンサー配列；（アデノウイルスプロモーターあるいは外来プロモーターでもよい）プロモーター；（前に記載した）多重クローニング部位；ポリＡシグナル；およびアデノウイルスゲノムの分接に対応するＤＮＡ分接よりなる。このベクターは更に三部分リーダー配列を含む。アデノウイルスゲノムに対応するＤＮＡ分接は修飾あるいは突然変異アデノウイルスを用いて相同的組換えの基質として利用することが出来、またこのような配列は、例えばゲノムの塩基３３２９から塩基６２４６までのものより短いアデノウイルス５ゲノムの分接を含む。プラスミドは更に選択マーカーおよび複製起点を含む。複製起点は細菌性複製起点であり得る。このようなシャトルプラスミドの例は図１０で示されるｐＡＶＳ６を含む。凝固因子をコード化する望ましいＤＮＡ配列は次いでプラスミドベクターを生産するために多重クローニング部位に挿入される。この構築は次いでアデノウイルスベクターの生産に使用される。相同的組換えは少くとも多数のＥ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列が欠失している修飾あるいは突然変異アデノウイルスを使って実行される。このような相同的組換えは、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ₄）沈殿により２９３細胞のようなヘルパー細胞にプラスミドベクターおよび修飾アデノウイルスを同時形質移入して実行することが出来る。このような相同的組換えに際し、組換えアデノウイルスベクターは、ＮｏｔＩ部位および相同的組換え断片の間でシャトルプラスミドから誘導されるＤＮＡ配列、および相同的組換え断片および３′ＩＴＲの間のＥ１およびＥ３欠失アデノウイルスから誘導されるＤＮＡを含むように形成される。１実施例において相同的組換え断片は、アデノウイルス５（ＡＴＣＣＶＲ− ５）ゲノムのヌクレオチド３３２９から６２４６でオーバーラップする。このような相同的組換えを通じて、アデノウイルス５′ＩＴＲ；アデノウイルス包膜シグナル；Ｅ１ａエンハンサー配列；プロモーター；凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列；ポリＡシグナル；少くとも多数のＥ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列から自由であるアデノウイルスＤＮＡ；およびアデノウイルス３′ＩＴＲを含むベクターが形成される。ベクターは更に三部分リーダー配列を含む。このベクターは、Ｅ１ａおよびＥ１ｂＤＮＡ配列を含みウイルス複製に必要な２９３ヘルパー細胞系のようなヘルパー細胞系に感染性アデノウイルス粒子を生成するために形質移入される。１実施例においては、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス５′ＩＴＲ；アデノウイルス３′ＩＴＲ；アデノウイルス包膜シグナル；凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列；および凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を制御するプロモーターよりなる。このベクターはアデノウイルスＥ１，Ｅ２，Ｅ３およびＥ４ＤＮＡ配列から自由であり、またベクターはアデノウイルス主要後期プロモーターにより促進されるアデノウイルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列から自由である。すなわちベクターはアデノウイルス構造タンパク質をコード化するＤＮＡから自由である。このようなベクターは標準方法によりアデノウイルスゲノムからアデノウイルス５′ＩＴＲ，アデノウイルス３′ＩＴＲおよびアデノウイルス包膜シグナルを除去して構築することが出来る。この成分、同じく（アデノウイルスプロモーターあるいは非アデノウイルスプロモーターである）プロモーター、三部分リーダー配列，ポリＡシグナルおよび選択マーカーは、標準方法により、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ−（ストラータジェン社）などの塩基プラスミドあるいは「出発物（スターター）」プラスミドに結合し、適切なクローニングベクターを形成することが出来る。クローニングベクターは、凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列のクローニングベクターへの挿入を容易にするために多重クローニング部位を含むことがある。一般に多重クローニング部位は「希有」制限酵素部位；すなわち１０，０００塩基対毎から１００，０００塩基対毎に１回の頻度で真核細胞遺伝子に見出される部位を含む。この発明に従って適切なベクターはかくして多重クローニング部位の適切な制限部位で標準方法によりクローニングベクターを切断し、次いで凝固因子をコード化するＤＮＡ配列をクローニングベクターに結合することにより形成される。ベクターは次いで必要な包膜材を提供するヘルパーアデノウイルスを用いて感染性非複製組換えアデノウイルス粒子内にパッケージされる。ヘルパーウイルスがそれ自身を包膜しないようにするため、ヘルパーウイルスが欠陥包膜シグナルを持つことが望ましい。採用される包膜欠陥ヘルパーウイルスの例は、グレーブル、他、ウイルス学ジャーナル、６６巻、７２３−７３１ページ（１９９２年）に記載されている。ベクターおよび包膜欠陥ヘルパーウイルスは感染性ウイルス粒子を生成するために適切な細胞系に形質移入される。形質移入は電気穿孔法、リン酸カルシウム沈澱、顕微注射により、あるいはプロテオリポソームを通じて行われる。適切な細胞系の例は、必ずしもそれに限定されないが、ヒーラ細胞あるいは２９３（胚腎臓上皮）細胞（ＡＴＣＣＮＯ．ＣＲＬ１５７３）を含む。感染性ウイルス粒子（すなわちアデノウイルスベクター）は次いで肝細胞などのような真核細胞に形質導入され、これにより凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列が宿主内での真核細胞により発現される。感染性ではあるが複製欠陥ウイルス粒子よりなり、凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を含むベクターは、宿主の血友病を治療するのに有効な量で投与される。１実施例において、ベクター粒子は１プラーク形成単位から約１×１０¹⁴プラーク形成単位、望ましくは約１×１０⁶プラーク形成単位から約１×１０¹³プラーク形成単位の量で投与される。宿主はヒトあるいは非ヒト動物宿主である。望ましい非ヒト動物宿主は哺乳類であり、もっとも望ましいのはイヌあるいは非ヒト霊長類である。望ましくは、感染性ベクター粒子は（例えば末梢静脈注射を経由するような）例えば静脈内投与のように全身投与され、あるいは筋肉内、腹腔内、もしくは鼻腔内で門静脈を経由して胆管に投与される。ベクター粒子は患者に投与するのに適した薬理的許容担体と併用することが出来る。担体は液状担体（例えば食塩溶液）、あるいは例えばマイクロキャリアビードのような固形担体である。前記記載の通り、ゲノム要素のアデノウイルスベクターへのとり込みが凝固因子をコード化するＤＮＡ配列の発現の向上を提供することを発明者は発見した。かくしてこの発明のも一つの見地に従って、異種タンパク質をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列、およびそのようなＤＮＡ配列の発現に影響を与える少くとも１個のゲノム要素を含むアデノウイルスベクターが提供される。「ゲノム要素」という用語は前に定義された通り使用される。このゲノム要素は必ずしもそれに限定されないが、イントロン，５′未翻訳領域，３′未翻訳領域、前記イントロンおよび３′ 更に５′未翻訳領域の部分を含む。アデノウイルスベクターは前記記載の通りである。異種タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は、少くとも１個の治療剤をコード化するＤＮＡ配列である。「治療」という用語は包括的な意味で使用され、治療薬、予防薬、および置換剤を含む。アデノウイルスベクターに入れられる治療剤をコード化するＤＮＡ配列は必ずしもそれに限定されないが、以下に記すものを含む。前記記載の因子VIIIおよび因子IXをコード化するＤＮＡ；ＴＮＦ−αなどのような腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子をコード化するＤＮＡ配列；インターフェロン−α，インターフェロン− βおよびインターフェロンγなどのインターフェロンをコード化する遺伝子；ＩＬ−１，ＩＬ−１β、およびインターロイキン２から１４などのようなインターロイキンをコード化する遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦをコード化する遺伝子；アデノシンデアミナーゼすなわちＡＤＡをコード化する遺伝子；リンパ球の成長因子であるリンホカインなどのような細胞成長因子をコード化する遺伝子；可溶性ＣＤ４をコード化する遺伝子；Ｔ細胞受容体；コレステロールの移送および代謝にかかわるＬＤＬ受容体，ＡｐｏＥ，ＡｐｏＣ，ＡｐｏＡＩおよび他の遺伝子；アルファ−１アンチトリプシン（α１ＡＴ）遺伝子，オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子，ＣＦＴＲ遺伝子，インシュリン遺伝子，単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子，サイトメガロウイルスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子および水痘帯状庖疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などのようなウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；抗体の抗原結合領域のＦｃ受容体、およびＢ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型ウイルス肝炎の複製を阻害するアンチセンス配列などのようなウイルス複製を阻害するアンチセンス配列。ＤＮＡ配列を調節するプロモーターは前記記載のものから選択することが出来る。１実施例において、ゲノム要素および異種タンパク質をコード化するＤＮＡ配列は同じ内在性遺伝子の部分である。例えば、アデノウイルスベクターは因子IX および因子VIIIゲノム要素をコード化するＤＮＡを含む。も一つの実施例では、異種タンパク質およびゲノム要素をコード化するＤＮＡ配列は異なった内在性遺伝子から取られる。例えばアデノウイルスベクターは因子VIIIおよび因子IXゲノム要素をコード化するＤＮＡを含む。更にも一つの実施例において、アデノウイルスベクターが異種タンパク質および同じ内在性遺伝子からの少くとも１個のゲノム要素をコード化するＤＮＡを含むようにアデノウイルスベクターを構築することが出来る。異種タンパク質をコード化するＤＮＡは、異種タンパク質をコード化するＤＮＡに通常存在する少くとも１個のエキソンが除去され、も一つの遺伝子に存在する１個もしくはそれ以上のエキソンにより代替されるように修飾される。この発明の見地の範囲は何らの理論的推論により限定されるものではないけれども、出願人が確信していることは、異種タンパク質をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を含むアデノウイルスベクター内に少くとも１個のゲノム要素を含有させることにより、誰でも内在性転写、ＲＮＡ処理および異種タンパク質をコード化するＤＮＡ配列の翻訳に接近することが出来、それにより異種タンパク質の発現増加を提供出来るということである。この発明は以下の実施例に関連してこれから説明される。しかし、この発明の範囲はそれに限定されるものではない。実施例１因子IX遺伝子を含むアデノウイルスベクターの構築Ａ．ｐＧ１Ｈ９の構築プラスミドｐＧ１（１９９１年７月２５日公告、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／１０７２８に記載）（図３）は、ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９８０−９９０ページ（１９８９年）によりｐＬＮＳＸから構築された。プラスミドｐＧ１の構築戦略は図１で示される。５′モロニー肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片、３′ＬＴＲ、細菌複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含む３．０キロベースＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片が別個に分離された。７個のユニーククローニング部位を含むリンカーが、次いでＥｃｏＲＩ／Ｃ１ａＩ断片をそれ自身の上に閉じるために使用され、かくしてプラスミドｐＧＯを生成した。プラスミドｐＧＯは５′ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片をｐＧＯのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、ベクタープラスミドｐＧ１を生成するために使用された。かくしてｐＧ１は、ＭｏＭｕＳＶから誘導される５′部分、真正ＡＴＧ出発コドンがＴＡＧに突然変異しているｇａｇの短い部分（ベンダー、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６３９−１６４９ページ（１９８７年））、５′から３′までにＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，Ｓａ１Ｉ，ＢａｍＨＩ，ＨｈｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＡｐａＩ、およびＣ１ａＩ部位を含む５４塩基対多重クローニング部位（ＭＣＳ）、および（ヴァンビファレン、他、コールドスプリングハーバー、２巻、５６７ページ、（１９８５年）に記載されているように）塩基対７７６４から７８１３までの番号を付されたＭｏＭｕＬＶの３′部分よりなる（図２）。ＭＣＳはｐＧ１プラスミド、ｎｅｏ^R遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、およびヒグロマイシン^R遺伝子、またＳＶ４０プロモーターの非切断制限酵素のスクリーンにもとづき最大数のユニーク挿入部位を生成するために設計された。ｐＧ１（図３）はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。因子IX遺伝子，ＳＶ４０プロモーター、およびｎｅｏ^R遺伝子を含むｐＬＩＸＳＮ（パーマー、他、血液、７３巻、２号、４３８−４４５ページ（１９８９年２月））もまたＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。生成するＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片は因子IX遺伝子を含み、次いでＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＧＩと結合しｐＧ１Ｈ９を生成した（図４）。因子IX遺伝子は更に米国特許番号４，９９４，３７１号で開示された方法に従って得ることも可能であった。Ｂ．ｐＧ１Ｈ９Ｂの構築第一ＡＴＧで出発するヒト因子IX ｃＤＮＡの５′部分が天然５′ヒト因子IX 配列と同一であるようにｐＧ１Ｈ９Ｂ（図６）が構築された。これはＤＮＡ配列に逆位があるためｐＧ１Ｈ９の場合にはならない。ｐＧ１Ｈ９Ｂは次のように構築された。まず、ヒト因子IXのｃＤＮＡクローンがヒト肝臓ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、次いでプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（ストラータジェン社、ラホーラ、カリフォルニア）にサブクローンすることにより生成された。生成プラスミドはｐｈｆａｃｌＸと名付けられた（図５）。このプラスミドの因子IX配列の５′末端は次いでＧ１Ｈ９にある因子IXの配列の５′末端と代替するために使用された。ｐｈｆａｃｌＸは次いでＢａｍＨＩおよびＤｒａＩで切断され、因子IX ｃＤＮＡの５′末端に対応する３３４塩基対断片は分離された。ｐＧ１Ｈ９はＤｒａＩおよびＣ１ａＩで切断され、因子 IX ｃＤＮＡの３′末端をコード化する１２５３塩基対断片は分離された。因子 IX ｃＤＮＡをコード化する２個の分離断片はｐＧ１Ｈ９バックボーンに結合され、それはＢａｍＨＩおよびＣ１ａＩで切断され、ｐＧ１Ｈ９Ｂを生成した（図６）。Ｃ．ｐＡｖＳ６の構築アデノウイルス構築シャトルプラスミドｐＡｖＳ６はクローニング技術にもとづくポリメラーゼ連鎖反応を含む標準クローニング技術を用いるいくつかの段階で構築された。まず２９１３塩基対Ｂｇ１ＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ断片はＡｄ−ｄ１３２７から除去され、平滑断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ−（ストラータジェン社、ラホーラ、カリフォルニア）のＸｈｏＩ部位に挿入された（図７）。Ａｄ−ｄ１３２７は、アデノウイルス５ゲノムの塩基２８５９１から３０４７４（あるいは地図単位７８．５から８４．７）を含むＸｂａＩ断片でＥ３領域に位置するものが欠失していることを除けばアデノウイルス５と同一である。Ａｄ −ｄ１３２７におけるＥ３欠失はＡｄ−ｄ１３２４におけるＥ３欠失と類似しており、後者はジンマパーヤ他、細胞、３１巻、５４３ページ（１９８３年）に記述されている。完全アデノウイルスゲノムはジェンバンクアクセス番号Ｍ７３２６０で登録されており、ここで参考文献としてとり込まれており、ウイルスはアメリカ合衆国、メリーランド、ロックヴィル、アメリカンタイプカルチャーコレクションでアクセス番号ＶＲ−５で利用出来る。Ａｄ−ｄ１３２７はアデノウイルス５（Ａｄ５）から従来の方法により構築された。この方法は下記の通り簡単に略述されており、これまでにジョーンズおよびシェンク、細胞、１３巻、１８１−１８８ページ（１９８７年）で説明されている。Ａｄ５ＤＮＡはビリオン（ウイルス粒子）のタンパク質分解消化により分離され、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼで部分的に切断される。ＸｂａＩ断片は次いで断片の混合物として結合により再集合される。この結果、２８５９１塩基対から３０４７４塩基対の配列が除かれていることを除けばＡｄ５に類似する一つの配列を持つある結合ゲノムを生成する。このＤＮＡは次いで適当な細胞（例えばＫＢ細胞，ヒーラ細胞，２９３細胞）に形質移入され、プラーク形成が出来るように軟寒天で重ねられる。個々のプラークは次いで分離され、増幅され、１８７８塩基対Ｅ３領域ＸｂａＩ断片の不在を確認するためスクリーンされる。この断片の配向は、Ｂｇ１ＩＩ部位がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近く、またＨｉｎｄＩＩＩ部位がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳのＴ３ＲＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近くなるようにされた。このプラスミドはｐＨＲと名付けられた（図７）。第２に、ＩＴＲ，包膜シグナル，ラウス肉腫ウイルスプロモーター，アデノウイルス三部分リーダー（ＴＰＬ）配列および結合配列がＰＣＲ増幅を用いるブロックとして再集合された（図８）。ＩＴＲおよび包膜シグナル（ここで参考文献としてとり込まれたＡｄ−ｄ１３２７の配列１−３９２［Ａｄ５，ジェンバンク、アクセス番号７３２６０からの配列と同一のもの］）はＮｏｔＩあるいはＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーを用いてＡｄ−ｄ１３２７から一緒に増幅された（増幅１）。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーターはＡｓｃＩ部位およびＳｆｉＩ部位を含むプライマーを用いてプラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ（配列２０９から６０５；インバイトロジェン社、サンジエゴ、カリフォルニア）から増幅された（増幅２）。増幅１および２からのＤＮＡ産物はＮｏｔＩプライマーおよびＳｆｉＩプライマーだけで「オーバーラップ」ＰＣＲ法を用いて結合された（増幅３）（ホートン、他、バイオテクニク、８巻、５２８−５３５ページ（１９９０年））。反応１および２からのそれぞれの初期ＤＮＡ増幅産物のＡｓｃＩ含有末端の間で相補的にこれら２個の部分の結合が増幅中に行われた。次いでＳｆｉＩおよびＸｂａＩ部位をそれぞれ含有するプライマーを用いてＡｄ−ｄ１３２７で１６時間感染された２９３細胞（ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ１５７３）から分離されたｍＲＮＡから作られたｃＤＮＡからＴＰＬが増幅された（増幅４）（Ａｄ−ｄ１３２７の配列６０４９から９７３０〔Ａｄ５、ジェンバンク、アクセス番号Ｍ７３２６０からの類似の配列と同一のもの］）。増幅反応３および４からのＤＮＡ断片は次いでＮｏｔＩおよびＸｂａＩプライマーでＰＣＲを用いて結合され（増幅５）、かくして完全な遺伝子ブロックを生成した。第３として、ＩＴＲ包膜シグナルＴＰＬ断片は次いで精製され、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで切断され、ＮｏｔＩ，ＸｂａＩ切断され、ＮｏｔＩ，ＸｂａＩ切断ｐＨＲプラスミドに挿入された。このプラスミドはｐＡｖＳ６Ａと名付けられ、その配向は断片のＮｏｔＩ部位がＴ７ＲＮＡポリメラーゼ部位に隣接するものとなった（図９）。第４として、ＳＶ４０初期ポリＡシグナルはＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＳＶ４０ＤＮＡから除去され、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理されｐＡｖＳ６を生成するためにプラスミドｐＡｖＳ６Ａ−（図９）のＳａ１Ｉ部位に挿入された（図９および図１０）。Ｄ．Ａｖ１Ｈ９Ｂの構築完全タンパク質コーディング配列、５′未翻訳ＤＮＡの２６塩基対（翻訳はメッセージの第３ＡＴＧで出発するものと仮定）、および３′未翻訳ＤＮＡの１６０塩基対を含む因子IXｃＤＮＡ（図１１）はＣ１ａＩで制限消化によりｐＧ１Ｈ９Ｂから切除され、次いでクレノウを使って５′オーバーハングに注入され、更にＳｍａＩで制限消化された。因子IX ｃＤＮＡはまた米国特許番号４，９９４，３７１で開示された方法に従って得ることが出来た。因子IXをコード化する断片は１．０％のアガロースゲル内での電気泳動に続き、電気溶出により分離された。この断片はｐＡｖＳ６にサブクローンされ、ＦｃｏＲＶで線形化され子ウシ腸ホスファターゼで処理された。生成するシャトルプラスミドｐＡｖＳ６Ｈ９Ｂ（図１２）はアデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）の５′逆方向末端反復、Ａｄ５の複製起点、Ａｄ５包膜シグナルＥ１ａエンハンサー、ＲＳＶプロモーター、Ａｄ５の三部分リーダー配列、因子IX ｃＤＮＡ、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルおよびヌクレオチド位置３３２９−６２４６からのＡｄ５配列を含有する。組換えアデノウイルスベクターＡｖ１Ｈ９Ｂは図１３で示されるように生成された。１．５×１０⁶ ２９３細胞は６０ｍｍ組織培養皿でＡｄ−ｄ１３２７の大型ＣｌａＩ断片（Ａｄ５のＥ３欠失突然変異体）４μｇおよびＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化されたシャトルプラスミド５μｇで同時形質移入された。形質移入はＢＲＬのトランスフィニティ（超限数）リン酸カルシウム形質移入システムを用いて行われた。形質移入の約１５時間後に、ＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿物を含有する培地から除去され、細胞はＰＢＳでゆるやかに洗浄され、次いで２ＸＭＥＭ（ＦＢＳ１５％を補充されたＧ１ＢＣＯの２ｘ修飾イーグル培地）およびシープラークアガロースの１：１混合物で覆われた。プラークは無菌パスツールピペットを使ってとり出され、エッペンドルフ管の感染培地（ＦＢＳ１％，改良最少必要培地）０．１ｍｌに移された。再懸濁プラークは３回の凍結融解サイクルを受け、次いでマイクロフュージ（微細物除去物）内で全速での１５秒間遠心分離により細胞デブリを清澄化された。組換えアデノウイルスは以下の通り２９３細胞内で増幅された。皿当り約５× １０⁵ ２９３細胞が３０ｍｍ皿に接種された。翌日培地は細胞から除去され、感染培地０．２ｍｌおよび再懸濁プラーク０．１ｍｌで代替された。プレートは９０分間３７℃でＣＯ₂、５％の恒温器で軽くゆすりながら保温された。続いて完全培地（ＦＢＳ１０％，ＩＭＥＭ）２ｍｌが加えられた。約４０時間後細胞変性効果が明らかに現われた。細胞は集まり出し、プレートから離れ始めた。細胞と培地はプラスチック管に移され、凍結融解サイクルを４回受け、２０００ｘｇで５分間遠心分離された。生成された上澄みは粗ウイルス溶菌液（ＣＶＬ１）として引用される。ウイルスＤＮＡは各ＣＶＬ１のアリコートから分離され、次いで以下に述べるようにＰＣＲにより因子IXの存在を確認するために分析された。上澄みの６０μ ｌアリコートがエッペンドルフ管に移され８０℃で５分間保温された。サンプルはマイクロフュージで５分間全速で遠心分離され、次いで上澄み５μｌがＰＣＲ分析に使用された。ＰＣＲ分析はパーキンエルマーシータスジーンアンプキットを用いて行われた。ヒト因子IX ｃＤＮＡの異なった部分を増幅する２個の異なった対のプライマーが使用された。すべてのサンプルが期待された増幅帯を産出した。実施例２実施例１のベクターの試験管内および生体内機能因子IX ｃＤＮＡを含有する組換えアデノウイルスベクターは、ヒト因子IXを２９３細胞に発現する能力を検定された。約５×１０⁵ ２９３細胞が６０ｍｍ皿当り接種された。翌日、培地は組換えアデノウイルス０．１ｍｌおよび感染培地で代替された。プレートは３７℃でＣＯ₂ ５％内でゆっくりふりながら１時間保温され、次いで完全培地４ｍｌが追加された。細胞は５回ＰＢＳでゆっくり洗浄され、次いで完全培地４ｍｌが追加された。培地サンプルは２４時間後に集められ、５分間１５００ｘｇで遠心分離された。上澄みはエリザ（アッセラクロム１Ｘ：Ａｇエリザキット，アメリカンバイオプロダクツ社）によりヒト因子IXを検定され、この水準は２個のサンプルで４４５および５３８ｎｇ／ｍｌであり、これは組換えアデノウイルスベクターがヒト因子IXを発現出来ることを示していた。非感染２９３細胞は因子IXのバックグラウンド水準を産出した。１個の組換えアデノウイルスが大規模ウイルス調製のために選択された。約５ ×１０⁶ ２９３細胞が１５ｃｍ組織培養皿に接種された。翌日、培地は感染培地４ｍｌおよび粗ウイルス株１ｍｌで代替された。次いでプレートは３７℃、ＣＯ₂ ５％で９０分間ゆっくりふりながら保温され、続いて完全培地１５ｍｌが加えられた。約４０時間後、細胞変性効果が明らかに見えた時、細胞および培地は５０ｍｌプラスチック管に移された。細胞は凍結融解５サイクルで溶離され、細胞デブリは５回１５００ｘｇで遠心分離により除去された。上澄みはＣＶＬ２と名付けられた。ＣＶＬ２，１５ｍｌが感染培地３５ｍｌで混合され、この混合物５ｍｌが殆ど密集した２９３細胞の１０個の１５ｃｍプレートそれぞれに加えられた。プレートは３７℃，ＣＯ₂ ５％で１時間ゆっくりふりながら保温され、その後各プレートに完全培地１５ｍｌが加えられた。２４時間後に細胞変性効果が観察された。細胞は丸くはなったが溶離はしなかった。細胞および培地は１０分間２０００ｘｇで遠心分離された。細胞ペレットは完全培地６ｍｌで再懸濁された。細胞は凍結融解５サイクルで溶離され、その後ＳＷ４０ローターで７０００回転／分で１０分間４℃で遠心分離された。上澄み内のウイルスは以下のようなＣｓＣｌ段階勾配で精製された。ＴＤ緩衝液（トリス２５ｍＭ，ＮａＣｌ，１３７ｍＭ，ＫＣ１．５ｍＭ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄，０．７ｍＭ，ｐＨ７．５）内でＣｓＣｌ，１．２５ｇ／ｍｌ，３．０ｍｌがウルトラクリアベックマン＃３４４０６０超遠心管に置かれた。これはＴＤ緩衝液のＣｓＣｌ，１．４０ｇ／ｍの３．０ｍｌで下敷きされた。ＣｓＣｌ層はウイルス上澄み４．５ｍｌで上敷きされた。遠心分離は３５，０００回転／分、２２℃で１時間ＳＷ４０ローターで行われた。２個の帯が見え、上の帯は空カプシドよりなり、下の帯は無傷組換えアデノウイルスより構成されていた。下の帯は３ｍｌの注射器および２１ゲージの針で集められ、次いで以下のように再帯化された。ＴＤ緩衝液内で１．３３ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ９．０ｍｌが超遠心管に置かれた。これは最初のスピンから集められたウイルスで上敷きされた。遠心分離は３５，０００回転／分で、２２℃、１８時間行われた。乳光色帯が前記の通り集められ、グリセロールが最終濃度１０％になるように加えられた。アデノウイルスが、トリスｐＨ７．４，１０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂，１０ｍＭ、およびグリセロール１０％で構成される１リットルに対し４℃で透析された。透析は４時間行われ、緩衝液は１時間毎の間隔で３回取り替えられた。ウイルスは回収され、無菌エッペンドルフ管のアリコートに−７０℃で貯蔵された。このウイルス調製の力価は９．６×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌであった。最初の生体内実験で、この組換えアデノウイルスＡｖ１Ｈ９Ｂは３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに３種の異なった方法：肝臓への実質細胞内注射、門静脈内への注入、および尾静脈内への注入により注射された。実質細胞内注射を受けた動物はメトフェンで麻酔された。長さ約７ｍｍの経方向切開が剣状突起のすぐ下で行われた。中葉部および側葉部に突出が生じるように側腹部に圧力が加えられた。注射に際し、ウイルス（１×１０⁹ｐｆｕ）の０．１ｍｌがハンクス平衡食塩水（ＨＢＳＳ）で１．０ｍｌに希釈された。ウイルスは肝臓の４個の異なった部位に注射された：０．２５ｍｌが中葉の半分それぞれに注射され、また左側葉の左側および右側に注射された。各注射は約１分にわたり行われた。針の除去に際し、注射部位にわたり小部分のゲルフォームを置くことで止血が行われた。２分後にゲルフォームはとり除かれ、肝臓は腹腔内にゆっくりと置かれ、皮膚切開はオートクリップで閉じられた。手術後数分内に動物は目覚め、１時間以内で歩行可能となった。ＡｄＨ９Ｂの門静脈注入を受ける動物はメトフェンで麻酔された。正中線経方向切開が骨盤のすぐ上の剣状突起から行われた。腸は湿潤綿棒で動物の左外側にゆっくりと押し付けられた。ウイルス（１×１０⁹ｐｆｕ）の０．１ｍｌアリコートがＨＢＳＳで１．０ｍｌに希釈された。１ｍｌ注射器および２７ゲージ針を使ってウイルス懸濁液が３０秒にわたり門静脈に注入された。３×３ｍｍ片のゲルフォームが注射部位に置かれた。針が次いで抜かれた。湿潤綿棒を使って５分間ゲルフォームにゆるやかに圧を加えることで止血が行われた。ゲルフォームは適当に取り除かれた。腸はゆっくりと腹腔内に戻された。切開はオートクリップを使って閉じられた。動物は手術後３０分以内に目覚め、１時間以内に歩行可能となった。Ａｖ１Ｈ９Ｂの尾静脈注入はＨＢＳＳで１．０ｍｌに希釈されたウイルス（１ ×１０⁹ｐｆｕ）の０．１ｍｌを用いて行われた。ウイルス懸濁液は２７ゲージの針を使って１０秒にわたり注入された。実質細胞内注射および門静脈注入を受ける動物は、ウイルスを受けない対照マウスと同様にウイルス受渡し２日後、６日後および９日後に後方眼縁部叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｐｌｅｘｕｓ）を経て採血された。ヒト因子IXのプラスマ水準はエリザで測定された。結果は図１４で示される。この点でマウスの肝臓のベクター水準を測定することが重要であった。従って実質細胞内注射および門静脈注入を受けた動物および負の対照マウスは注入９日後に犠牲にされ、更に尾注射を受けたマウスは注入２日後に犠牲にされた。各マウスの肝臓は除去され、かみそりの刃で広範囲に細分された。各肝臓の片半分は１５ｍｌ円すい型試験管に入れられ、溶離緩衝液（トリス１０ｍＭ，ＮａＣｌ，０．１４Ｍ，ｐＨ７．６）１．０ｍｌが加えられた。組織は１ｍｌ注射器および２０ゲージ針を用いて均質化された。次に、２× ＰＫ緩衝液（トリスｐＨ７．５，２００ｍＭ，ＥＤＴＡ２５ｍＭ，ＮａＣｌ，３００ｍＭ，ＳＤＳ２％（Ｗ／Ｖ）、およびタンパク質分解酵素５００μｇ／ｍｌ）の１．０ｍｌが加えられた。試験管は数回逆さにされ、次いで３７℃で一晩保温された。サンプルはフェノール／クロロホルム（１：１）で２回、クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出された。ＤＮＡはエタノール沈殿され、エタノール７０％で洗浄され、ｐＨ７．５のトリス１０ｍＭ，ＥＤＴＡ，１ｍＭで再懸濁された。サザン分析が肝臓のベクター水準を計量するために実施された。各ＤＮＡサンプルの１０マイクログラムがＢａｍＨＩで切断された。消化ＤＮＡサンプルはトリス４０ｍＭ，酢酸ソーダ２０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ７．５内で０．８％シーケムアガロースゲルの電気泳動を受けた。電気泳動の後、ゲルは苛性ソーダ０．２Ｎ，ＮａＣｌ０．６Ｍで１時間処理し、次いでｐＨ７．４トリス１Ｍ，ＮａＣｌ０．６Ｍ３０分間で中和された。ＤＮＡは１０× ＳＳＣのブロッティングによりナイロン膜に移された。ナイロン膜は８０℃で１時間真空オーブンで焼成される。それは３時間４２℃で５× デンハート溶液、５× ＳＳＣ，ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム５０ｍＭ，サケ精子ＤＮＡ２５０μｇ／ｍｌ，ＳＤＳ、０．１％、およびホルムアミド５０％で前ハイブリッド形成された。膜は２４時間４２℃で１×デンハート溶液，５× ＳＳＣ，ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム２０ｍＭ，サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ，ＳＤＳ０．１％，ホルムアミド５０％、およびランダムプライマー標識ヒト因子IXｃＤＮＡ３３μＣｉでランダム形成された。ランダムプライマー標識化はＢＲＬキットで行われた。膜は２× ＳＳＣ，ＳＤＳ０．１％で２０分間室温で洗浄され、次いで２× ＳＳＣ，ＳＤＳ０．１％で５０分間洗浄、次いで３０分間０．１× ＳＳＣ，ＳＤＳ、０．１％で６８℃で洗浄された。膜はフィルムに１６時間曝され、次いで現像された。オートラジオグラムのコピーが図１５で示される。投与の三つのルートすべては同一の結果を示した。因子IXの帯は肝細胞当り平均５−１０コピーを示す強度を持つ適当なサイズであった。実施例３Ａｖ１Ｈ９Ｂで注射されたマウスの因子IXの生体内発現第２の大規模なＡｖ１Ｈ９Ｂのウイルス調製が、２８個の２９３細胞の１５ｃｍプレートがウイルス増幅に使用されたことを除き前記の同じ実験記録を用いて行われた。この調製は最初のウイルス調製よりもより厚みのあるＣｓＣｌ勾配遠心分離に対するたんぱく光帯を産出した。このウイルス調製の力価は１．１×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌであった。発現の時間経過を追うように設計された第２の生体内実験は新しいＡｖ１Ｈ９Ｂを用いて開始された。ウイルスは前記の通りマウスに投与されたが、但しウイルス懸濁液（１×１０¹⁰ｐｆｕ）０．１ｍｌが感染培地で１．０ｍｌまで希釈された。２７匹のマウスが組換えアデノウイルスの注射を受けた。２０匹のマウスは尾静脈注射を受け、内１８匹はＡｖ１Ｈ９Ｂまた２匹はＡｖ１１ａｃＺ４（β ガラクトシダーゼをコード化するもの）を受け、また他の４匹のマウスは肝臓の実質細胞内注射を受け、３匹は筋肉内注射を受けた。負の対照マウスは注射されなかった。ヒト因子IXのプラスマ水準は表１で示される。表１で示されるように、ＩＰはＡｖ１Ｈ９Ｂの実質細胞内注射を意味し、ＴＶはＡｖ１Ｈ９Ｂの尾静脈注射を意味し、ＩＭはＡｖ１Ｈ９Ｂの筋肉内注射を意味し、ＬａｃＺはＡｖ１１ａｃＺ４の尾静脈注射を意味し、またＮＩは注射なし（対照）を意昧する。実施例４ヒト因子IXの生物活性の検定マウスプラスマ内のヒト因子IXの生物活性は免疫捕捉色素原検定を用いて測定された。９６ウエルマイクロタイタプレートがヒト因子IXを認識するが不活性化しないエルカテク，インコーポレイテッドから得たＢＧＩＸＩモノクローナル抗体で被覆された。被覆は抗体の１０μｇ／ｍｌ懸濁液を１０μｌ各ウエルに加え、室温で一晩保温することにより行われた。組換えアデノウイルス（１：５および１：１０の希釈液１００μｌ）で注射２週間後に実施例３でマウス７から得たプラスマサンプルがウエルに加えられ、ヒト因子IXは結合可能となった。ウエルは未結合材料を除去するために洗浄され、捕捉されたヒト因子IXは因子XIａ（エンザイムリサーチラブス）の２μｇ／ｍｌの１００μｌを加え、３７℃で３０分間保温することにより活性化された。ウエルは洗浄され、次いでリン脂質５．０μ ｇ（カビファーマシア社、フランクリン、オハイオ）、因子Ｘ０．１単位（カビ）、因子VIII ０．５単位（エルカテク）、Ｉ−２５８１トロンビン阻害剤３．４μｇ（カビ）およびＣａＣｌ₂，２．５ｍＭを含む混合物が加えられた。プレートは３７℃で３０分間で保温され、その間に因子Ｘは因子Ｘａに転換された。Ｎ−Ｎ−アルファベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−Ｐ−ニトロアニリド−ジヒドロクロライド、つまり色素原因子Ｘａ基質０．５ｍＭの１００μｌが次いで加えられ、プレートは室温で１０分間保温された。色の発展は５０％酢酸５０μｌを加えることにより停止した。４０５ｎｍでの吸光度がバイオラッドマイクロプレートリーダーを用いて測定された。標準曲線（両対数および両線形）が正常プールヒトプラスマを使って生成され、５０００ｎｇ／ｍｌの因子IX水準が想定された。生物活性因子IXは両対数法によれば５１１ｎｇ／ｍｌであり、両線形法によれば４１５ｎｇ／ｍｌであると測定された。この結果は実験誤差の範囲内にあり基本的には実施例３（４２２ｎｇ／ｍｌ）で測定された全因子IXのすべては生物活性であることを示すものである。実施例５因子VIII誘導体をコード化するＤＮＡを含むアデノウイルスベクターの構築ｐＡＶＳ６Ｈ８１はｐＭＴ２ＬＡ（図１６）およびｐＡＶＳ６（図１０）から構築された。ｐＭＴ２ＬＡ（ジェネティックインスティチュート、ケンブリッジ、マサチューセッツ）は因子VIIIのＢ領域が欠失したヒト因子VIIIの誘導体をコード化するｃＤＮＡを含む。このようなＤＮＡは更にトウール、他、ネイチャー、３１２巻、３４２−３４９ページ（１９８４年１１月）、ヴィーハー、他、ネイチャー、３１２巻、３３７−３４２ページ（１９８４年１１月）、およびトゥール、他、全米科学アカデミー紀要、８３巻、５９３９−５９４２ページ（１９８６年８月）に記載されている。このｃＤＮＡはラウス肉腫ウイルスプロモーターにより制御されている。４．６キロベースｃＤＮＡ（図１７）は天然５′未翻訳ＤＮＡ、および３′未翻訳ＤＮＡの２１６塩基対を含んでいない。Ｂ領域欠失は全長因子VIIIのコーディング配列のヌクレオチド２３３４−４９７３を除去する。Ｂ領域欠失因子VIIIのｃＤＮＡは米国特許番号４，８６８，１１２で開示された方法に従って得ることも出来る。ｃＤＮＡはＸｈｏＩおよびＳａｌＩで制限消化によりプラスミドｐＭＴ２ＬＡから切除された。末端はクレノウを使って充填され、因子VIII誘導体をコード化する断片は０．８％アガロースゲルで分離され、続いて電気溶出された。この断片はｐＡＶＳ６（図１０）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローンされ、ｐＡＶＳ６Ｈ８１を生成した（図１８）。組換えアデノウイルスベクターＡｖ１Ｈ８１は図１９で描かれるように生成される。１．５×１０⁶ ２９３細胞は６０ｍｍ組織培養皿でＡｄｄ１３２７の大型Ｃ１ａＩ断片４μｇおよびＮｏｔＩで消化したｐＡｖＳ６Ｈ８１５μｇを使って同時形質移入される。形質移入はＢＲＬの超限数（トランスフィニティ）リン酸カルシウム形質移入システムを用いて行われる。形質移入の約１５時間後に、ＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿物を含有する培地が皿から除去され、細胞はゆっくりとＰＢＳで洗浄され、次いで２× ＭＥＭおよび２％シープラークアガロースの混合物で上敷きされた。組換えアデノウイルスはプラークから調製され、ヒト因子VIII ｃＤＮＡの存在をＰＣＲにより分析することが出来る。実施例６因子VIIIプラスゲノム要素をコード化するＤＮＡを含むアデノウイルスベクターの生成Ａ．ｐＡｖＡＬＨ８１の構築肝臓特異的転写因子結合部位（ｅＧ結合部位、リュー、他、分子細胞生物学、１１巻７７３−７８４ページ（１９９１年）およびディペルシオ、他、分子細胞生物学、１１巻、４４０５−４４１４ページ（１９９１年））の３．５コピーを含有するマウスアルブミンプロモーター（ザレツト、他、全米科学アカデミー紀要、８５巻、９０７６−９０８０ページ（１９８８年））が、５′オリゴとしてＭ１ｕＩ制御部位の追加でｐＡＴ２−３ｅＧのｎｔｓ４２８１−４２９９（ヌクレオチド）に相補的であるオリゴＭＧＭ８．２９３，および３′オリゴとしてＢａｍＨＩ，Ｃ１ａＩ、およびＳａ１Ｉ制限部位の追加でｐＡＴ２−３ｅＧのｎｔｓ５２３１−５２１２に相補的であるオリゴＭＧＭ５．２９３，を使用して、ｐＡＴ２−３ｅＧからＰＣＲ増幅された。このＰＣＲ産物はＭ１ｕＩおよびＢａｍＨＩで切断され、Ｍ１ｕＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＡＶＳ６（図１０）に挿入されｐＡＶＡＬ１（図２１）を生成した。９６４塩基対ＰＣＲ生成アルブミンプロモーターの配列は配列決定で立証された。加えてｐＡＶＡＬ１（図２１）にあるＭ１ｕＩ部位（ｎｔ４２８）およびＢａｍＨＩ部位（ｎｔ１３９２）のいずれか一つの側の少くとも５０塩基対が同じく配列決定により立証されている。プラスミドｐＡＴ−２−３ｅＧはディペルシオ、他、分子細胞生物学、１１巻、４４０５−４４１４ページ（１９９１年）およびザレット、他、全米科学アカデミー紀要、８５巻、９０７６−９０８０ページ（１９８８年）で開示された方法に従って調製され、これは肝臓特異的転写因子結合部位の２個のコピーを用いたマウスアルブミンプロモーターの調製を開示する。プラスミドｐＡＴ２−３ｅＧはブダペスト条約の下で２０８９２メリーランド，ロックヴィル，パークローンドライブ１２３０のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されており、割当てられたアクセス番号は６９６０３である。ＩＴＲ，包膜シグナル（ｐＡＶＳ６の構築参照）、およびアルブミンプロモーターはＮｏｔＩ（末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填された）およびＳａ１Ｉの消化でｐＡＶＡＬ１から除去され、ｐＧＥＭ（ｓａｃ）（図２２）に挿入され、Ｓａ１ＩおよびＳｍａＩで切断されｐＧＥＭａｌｂ（図２４）を生成した（ｐＧＥＭ（ｓａｃ）はＳａｃＩでｐＧＥＭ（図２３、プロメガ社）を切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよび再結合で末端を平滑化し、これによりＳａｃＩ部位を除去した）。Ｂ領域欠失因子VIII ｃＤＮＡの５′領域を含有する１９１４塩基対断片はＢａｍＨＩ（５′末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填）の消化およびＸｈｏＩの消化によりｐＭＴ２ＬＡ（図１６）から分離され、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで充填）およびＳａ１Ｉの消化によりｐＧＥＭａｌｂに挿入され、ｐＧＥＭａｌｂＦ８Ｂ（図２５）を生成した。ｐＧＥＭａｌｂＦ８ＢはＭ１ｕＩおよびＳｐｅＩで切断され、生成する１５５６塩基対断片はｐＡｖＳ６Ｈ８１（図１８）に挿入され、Ｍ１ｕＩおよびＳｐｅＩで切断され、アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｖＡＬＨ８１（図２６）を生成した。Ｍ１ｕＩ部位（ｎｔ４２９）およびＳｐｅＩ部位（ｎｔ１９８５）のいずれかの側の少くとも５０塩基対がＡｖ１ＡＬＨ８１ウイルスＤＮＡ（以下参照）の配列決定により立証されている。因子VIII Ｂ領域欠失ｃＤＮＡの配列がジェネティクスインスティチュートから得られたもとのプラスミド、ｐＭＴ２ＬＡ（図１６）からの塩基１０７５から５７３２までの配列決定により立証されている。この配列はジェネティクスインスティチュートにより２個の塩基として報告された配列とは異なる。１個の塩基変更、ｐＭＴ２ＬＡのｎｔ１３１７はジェネティクスインスティチュートによりＴであると報告され（トウール、他、ネイチャー、３１２巻、３４２−３４７ページ（１９８４年））またウッド、他、ネイチャー、３１２巻、３３０−３３７ページ（１９８４年））ではＡである、と報告された。加えて、ジェネティクスインスティチュートによりＴであると報告されたｐＭＴ２ＬＡのｎｔ５７２１は削除され、かくして因子VIII ３′未翻訳領域内にＢａｍＨＩ部位を創り出した。この突然変異は因子VIIIコーディング領域を変えるものではない。Ｂ．ｐＡｖＡＰＨ８１の構築１９１３塩基対断片はＢａｍＨＩでの消化によりｐＡＶＳ６Ｈ８１（図１８）から分離され、ｐＧＥＭ（ｓａｃ）（図２２）に挿入され、ＢａｍＨＩで切断されｐＧｅｍＦ８Ｂ２（図２７）を生成した。ＡＴＧＣジェンバンク＃Ｘ０７４９６に対するＡｐｏＡ１プロモーター、第１エキソン（未翻訳）、第１イントロンおよび第２エキソンはｐＢＧＳ１９−ＡＩｇＩ（図２８）を鋳型として使用しＰＣＲ増幅された。ｐＢＧＳ１９−ＡＩｇＩ（図２８）は２段階で構築された：１）１３キロベースＳａ１Ｉ断片がラムダＡ１１０３から除去され（スワンソン、他、形質転換研究、１巻、１４２−１４７ページ（１９９２年））、ｐＵＣ１９（図２９、ジブコＢＲＬ）に挿入され、ｐＵＣ−ＡＩｇＩを生成した（図３０）。２）２キロベースＳｍａＩ断片がｐＵＣ１９−ＡＩｇＩから分離され（図３０）、ｐＢＧＳ１９に挿入され（図３１）、ｐＢＧＳ１９−ＡＩｇＩを生成した（図２８）。ｐＢＧＳ１９（ＡＴＣＣＮｏ．３７４３７）はｐＵＣ１９のカナマイシン類似体である。ｐＢＧＳ１９−ＡＩｇＩのＰＣＲ増幅は５′オリゴとしてＸｂａＩおよびＭ１ｕＩ部位を含有するｐＢＧＳ１９−ＡＩｇＩの塩基５８６２から１６に相補的であるオリゴＳＳＣ１．５９３，およびヒト因子VIII（ジェンバンク＃Ｋ０１７４０）、（ＳａｃＩ部位に対するｎｔｓ１５１−１６５、およびｐＢＧＳ１９−ＡＩｇＩのｎｔｓ４６３−４８７に相補的であり、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ部位の追加でＡｐｏＡ１遺伝子（ジェンバンク＃Ｘ０７４９６）に対し相補的である３′オリゴＳＳＣ２．５９３，を用いて行われた。このＰＣＲ断片はＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化され生成する５０９塩基対断片はＸｂａＩ−ＳａｃＩで消化されるｐＧｅｍＦ８Ｂ２（図２７）に挿入されｐＧｅｍＡＰＦ８Ｂを生成した。ｐＧｅｍＡＰＦ８Ｂは次いでＭ１ｕＩ− ＳｐｅＩで消化され、生成する１０８４塩基対断片はＭ１ｕＩおよびＳｐｅＩで切断されるｐＡＶＳ６Ｈ８１（図１８）に結合され、シャトルプラスミドｐＡｖＡＰＨ８１（図３３）を生成した。ＰＣＲ創出ＡｐｏＡ１プロモーター領域およびすべてのクローニング結合を含むｎｔｓ２９０から１６１９までのｐＡｖＡＰＨ８１の配列は立証された。Ｃ．ｐＡｖＡＬＡＰＨ８１の構築ＥｃｏＲＩおよびＳａ１Ｉ部位、および３′オリゴ，ＳＳ２．５９３（前記参照）の追加によりＡｐｏＡ１遺伝子（ジェンバンク＃Ｘ０７４９６）およびｐＢＧＳ１９−Ａ１ｇ１（図２８）のｎｔｓ２５２−２７４に相補的である５′オリゴＳＳＣ３．５９３，を用いるｐＧｅｍＡＰＦ８Ｂ（図３２）のＰＣＲ増幅により、Ｓａ１Ｉ部位がＡｐｏＡ１転写開始部位から上流に加えられた。ＰＣＲ断面はＳａ１Ｉ−ＳａｃＩで消化され、生じる２５０塩基対断片はＳａ１Ｉ−ＳａｃＩで切断されるｐＧｅｍＦ８Ｂ２（図２７）に挿入されｐＧｅｍＡＰｅｘＦ８Ｂ（図３４）を生成した。プラスミドｐＡＬＡＰＦ−８Ｂ（図３５）は、ｐＧＥＭａｌｂ（図２４）から分離される９５３塩基対Ｍ１ｕＩ−Ｓａ１Ｉ断片、ｐＧｅｍＡＰｅｘＦ８Ｂ（図３４）から分離される８２５塩基対Ｓａ１Ｉ−ＳｐｅＩ断片、Ｍ１ｕＩ−ＳｐｅＩで切断されたｐＧｅｍＡＰＦ８Ｂ（図３２）への挿入という三方向結合で生成された。１７７８塩基対Ｍ１ｕＩ−ＳｐｅＩ断片は、ｐＡＬＡＰＦ８Ｂ（図３５）から分離され、ｐＡＶＳ６Ｈ８１に挿入され、シャトルプラスミドｐＡｖＡＬＡＰＨ−８１（図３６）を生成した。Ｄ．組換えアデノウイルスベクターの生成組換えアデノウイルスベクターＡｖ１ＡＬＨ８１は図３７で略述されるように生成された。２×１０⁶ ２９３細胞はＡｄ−ｄ１３２７の大型Ｃ１ａＩ断片１０μｇおよび未消化シャトルプラスミドｐＡｖＡＬＨ８１（図２６）１０μｇを用いて１００ｍｍ組織培養皿で同時形質移入された。形質移入はＢＲＬの超限数リン酸カルシウム形質移入システムを用いて行われた。ＤＮＡ追加約１２時間後に細胞は１× ＰＢＳの２Ｘで洗浄され、次いで２ＸＭＥＭ（１５％ＦＢＳを補充したＧＩＢＣＯ社の２Ｘ修飾イーグル培地）および２％シープラークアガロースの１：１混合物で上敷きされた。プラークは無菌パスツールピペットで収穫され、エッペンドルフ管の感染培地（改良最少必要培地［ＩＭＥＭ］，ＦＢＳ２％）の０．１ｍｌに移され、また凍結融解サイクル３回を受けた。細胞デブリはマイクロフュージ内で、全速１５秒の遠心分離により除去された。プラークは以下に述べるような形で組換えアデノウイルスの存在を確認するためスクリーンされた。約５×１０⁵ ２９３細胞が６個のウエル組織培養皿の各ウエルに接種された。翌日、培地は細胞から除去され、感染培地０．４ｍｌおよび再懸濁プラーク０．０５ｍｌで取り替えられた。プレートは３７℃／ＣＯ₂ ５％保温器で９０分間振動させながら保温され、その後完全培地（ＩＭＥＭ，ＦＢＳ１０％）２ｍｌが加えられた。細胞変性効果（ＣＰＥ）が完成し、細胞が丸くなりプレートから分離するようになった時（感染後約４０−１２０時間）、細胞および培地は１５ｍｌ円錘試験管に移され、１０００回転／分、５分間遠心分離され、ペレット細胞にされた。培地は細胞ペレットから除去され、細胞は以下に述べるように処理された。細胞はＰＫ緩衝液（ｐＨ８．０のトリス５ｍＭ，ｐＨ８．０のＥＤＴＡ５ｍＭおよびＳＤＳ０．５％）２５０μｌプラスプロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌ内で再懸濁され、３７℃で４時間あるいは一晩保温された。この溶液はエッペンドルフ管に移され、フェノール１Ｘ，フェノール−ＣＨＣｌ₃ １ＸおよびＣＨＣｌ₃ １Ｘの等量を用いて抽出され、エタノール沈殿された。ペレットはＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０のトリス１０ｍＭ，ｐＨ８．０のＥＤＴＡ１ｍＭ）５０μｌで再懸濁され、ゲノムＤＮＡは制限消化で分析された。１個のプラークが期待通りの産物を産出した。このＡｖ１ＡＬＨ８１プラークは次の通り精製されたプラークであった。ウエル当り５×１０⁵ ２９３細胞が６個の組織培養プレートで平板培養された。翌日、培地は細胞から除去され、再懸濁プラークの３種の異なった量、２５μｌ，２．５μｌおよび０．２５μｌを含む感染培地０．４ｍｌが各ウエルに加えられた。プレートは１時間半３７℃／ＣＯ₂５％保温器で振動され、その後培地は除去され、ウエルは前記の通り２ＸＭＥＭおよびシープラークアガロース２％の１：１混合物で上敷きされた。プラークは感染の９日後にすべてのウエルで可視となった。いくつかのプラークが最低の希釈ウエル（再懸濁プラークの０．２５μｌ）から取り出され、前記の通りＡｖ１ＡＬＨ８１の存在を確認するためにスクリーンされた。すべてのプラークが予期されたウイルスを産出した。１個のプラーク−精製プラークが大規模ウイルス調製のために選択された。５ ×１０⁵細胞が６個のウエルプレートの各ウエルに平板培養され、翌日、前記の再懸濁プラーク−精製プラーク５０μｌで感染された。感染５日後にＣＰＥは完成され、細胞および培地は１５ｍｌ円錘試験管に移され４回凍結融解サイクルを受け、次いで１０００回転／分、５分間の遠心分離により細胞デブリが清澄化された。生じた上澄みは粗ウイルス溶菌液＃１（ＣＶＬ−１）として引用される。このＣＶＬは以下に述べる約２×１０⁷ ２９３細胞を含有する１５０ｍｍプレートを感染させるために使用された。培地は感染培地１．２５ｍｌプラスＣＶＬ１００μｌで取り替えられ、プレートは１時間半前記の通り振動され、その後完全培地２０ｍｌが加えられた。感染約２０時間後、ＣＰＥは完成され、細胞および培地は５０ｍｌ円錘試験管に移され、５分間１０００回転／分で回転され、上澄みが除去および取り置かれ、また細胞ペレットは上澄み５ｍｌで再懸濁された。４回の凍結融解サイクルの後、ＣＶＬは前記の通り細胞デブリを除去された。生じる上澄みはＣＶＬ−２として引用される。２９３細胞の３０−８０％密集１５０ｍｍプレートは以下に述ベるようにＣＶＬ−２を使用して感染された。ＣＶＬ−２６００μｌが感染培地３８ｍｌに加えられ、培地はプレートから除去されＣＶＬ−２感染培地混合物１．２５ｍｌで取り替えられた。プレートは前記の通り１時間半振動され、その後完全培地２０ｍｌが各ウエルに加えられた。３０時間後ＣＰＥは完成され細胞は次に述べるように処理された。細胞および培地は２５０ｍｌの遠心分離ボトルに収穫され１５００回転／分で１０分間回転された。細胞ペレットは上澄み２０ｍｌに再懸濁された。細胞は５回凍結融解サイクルで溶離され、次いでＳＷローターで７０００回転／分で１０分間遠心分離された。上澄み内のウイルスは次のようなＣｓＣｌ階段勾配で精製された。ＴＤ緩衝液（トリス２５ｍＭ，ＮａＣｌ１３７ｍＭ，ＫＣｌ５ｍＭ，ｐＨ７．５Ｎａ₂ＨＰＯ₄０．７ｍＭ）内でＣｓＣｌ１．２５ｇ／ｍｌの３．０ｍｌがウルトラクリアベックマン＃３４４０６０超遠心分離管４個の中に入れられた。ＴＤ緩衝液内ＣｓＣｌ１．４ｇ／ｍｌの３．０ｍｌが次いで下敷きされた。ＣｓＣｌ層はウイルス上澄み５．０ｍｌで上敷きされた。３５，０００回転／分２２℃で１時間ＳＷ４０ローターで遠心分離が行われた。２個の帯が可視となり、上部帯は空カプシドであり、下部帯は無傷組換えアデノウイルスよりなる。下部帯は３ｍｌ注射器および１８ゲージ針で集められ、次いでＴＤ緩衝液内１．３３ｇ／ｍｌＣｓＣｌの８．０ｍｌを２個の超遠心管に入れることにより再帯化され、最初の回転から採取されたウイルスで上敷きされた。遠心分離は３５，０００回転／分２２℃で１８時間行われた。ウイルス帯は前記の通り採取され、グリセロールが最終濃度１０％になるように加えられた。ウイルスはｐＨ７．４のトリス１０ｍＭ，ＭｇＣｌ₂１０ｍＭおよびグリセロール１０％の１リットルに対し４℃で透析された。透析は毎時間緩衝液を取り替え４時間継続した。ウイルスは回収され、無菌エッペンドルフ管のアリコートで−７０℃で貯蔵された。このウイルス調製（ロット＃ＭＳ１−１）の力価は１．５×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌであった。第２のＡｖ１ＡＬＨ８１ウイルス調製は前記と類似の方法で行われ、再びＣＶＬ−２の６００μｌおよび８０％密集２９３細胞の３０−１５０ｍｍプレートが使用された。第２の調製（ロット＃ＭＳ１−２）の力価は９×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌであった。この段階でウイルスＤＮＡは欠失あるいは再配列を照合された。因子VIII ｃＤＮＡ配列を含有するレトロウイルスベクターを利用する研究が高頻度で因子VI II ｃＤＮＡの部分を欠失させ、およびもしくは再配列させることを示しており（リンチ、他、１９９３年）、また類似の再配列が因子VIII含有アデノウイルスベクターで見ることが出来る。従って、ウイルスＤＮＡは以下に述べるようにＡｖＡＬＨ８１の両方のロット（ＭＳ１−１およびＭＳ１−２）から分離された。精製ウイルス１００μｌがＴＥ１００μｌ，ＳＤＳ１０％の５μｌおよびプロテイナーゼＫ（シグマ社）１０ｍｇ／ｍｌの２０μｌに加えられ、３７℃で一晩消化された。ウイルスＤＮＡは等量のフェノール１Ｘ，フェノール−ＣＨＣｌ₃ １ＸおよびＣＨＣｌ₃ １Ｘで抽出され、次いで上澄みはセントリコン１０濃縮器（エミコン社）にかけられ、その量がＴＥの追加で２ｍｌに増加し、５０００回転／分で１時間回転された。セントリコンは次いでＴＥ２ｍｌで洗浄され、３０分間、５０００回転／分で回転された。ＤＮＡはセントリコンの上部チャンバを逆転させ、収集管に挿入し、３０００回転／分で５分間遠心分離して回収された。精製ＤＮＡの最終量は１００μｌに増加し、ＤＮＡ濃度が計算された。ＭＳ１−１，ＭＳ１−２およびｄ１３２７ＤＮＡの１０μｇがＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩあるいはＮｄｅＩで一晩消化され、０．８％アガロースゲル上で流された。ＤＮＡ断片は臭化エチジウム染色で視覚化された（図３８）。Ａｖ１ＡＬＨ８１の両ロットは同じのように見え、またすべての制限断片は予測サイズのものであった。従って因子VIII含有レトロウイルスベクター（リンチ、他、１９９３年）とは異なり、Ａｖ１ＡＬＨ８１のゲノムは安定である。組換えアデノウイルスベクターＡｖ１ＡＬＡＰＨ８１は図３９で概略されている通り生成された。２×１０⁶ ２９３細胞は未消化シャトルプラスミド，ｐＡｖＡＬＡＰＨ８１（図３６）の１０μｇで１００ｍｍ組織培養皿で同時形質移入された。アデノウイルスベクターＡｖ１ＡＬＡＰＨ８１の生成は次いでアデノウイルスベクターＡｖ１ＡＬＨ８１と同じ方法で実施された。Ａｖ１ＡＰＨ８１は同じ方法で生成出来る。実施例７因子VIIIプラスゲノム要素をコード化するＤＮＡを含むアデノウイルスベクターの生体内発現Ａ．因子VIII三重サンドイッチ・エリザマウス生体内、あるいは組織培養細胞として試験管内で因子VIII発現をＡｖ１ＡＬＨ８１が検定される前に、マウスプラスマに存在するヒト因子VIIIの低い水準を測定することの出来る検定を開発する必要があった。ただ一つ商業的に利用出来る因子VIII検定法、コーテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ，カビファーマシューティカルズ社）は因子VIIIタンパク質の生物活性を測定し、組織培養細胞にある因子VIII水準を測定するのに使用することが出来る。しかしコーテストはヒト因子 VIIIを動物因子VIIIと区別することが出来ず、従って動物プラスマにあるヒト因子VIIIを測定するためには有用ではない。組織培養培地あるいは動物プラスマに存在するヒト因子VIIIの量を測定するために、定量因子VIII三重サンドイッチ・エリザが開発された。このエリザはとりわけマウスおよびイヌにあるヒト因子VI IIを測定することが出来、また因子VIII濃度を下方１．０ｎｇ／ｍｌまで再生的に測定することが出来る。この検定は次のように行われる。９６ウエルマイクロタイタプレートが、因子VIIIタンパク質のユニークエピトープと共に２種の商業的に利用出来るモノクローナル抗体で被覆され、一晩４ ℃で保温され、プラスチックウエルへの接着を可能にする。各抗体（Ｎ７、バイオデザイン社；およびＥＳＨ２、アメリカンダイアグノスティカ社）の０．５ｕｇが希釈緩衝液（Ｎａ₂ＣＯ₃ １．５９ｇ，ＮａＨＣＯ₃ ２．９３ｇ，無菌水１リットル，ｐＨ９．６）に希釈され、この希釈液の１０μｌが各ウエルに加えられた。これらの抗体は一次抗体を構成する。検定の感受性を増加させるために協力して作用する２種の捕捉抗体の使用はこれまでに説明されたことはない。一般の保温の後、ウエル当り２００μｌの１ＸＰＢＳの３Ｘでゆるやかに洗浄され、乾燥点染された。遮断薬〔ＰＢＳ１Ｘ，ウマ血清（熱不活性、バイオウィタッカー社）１０％、およびＣａＣｌ₂ １ｍｍ］が加えられ、２時間室温で保温され、その後プレートはウエル当り２００μｌの洗浄剤［ＰＢＳ１Ｘ，トウィーン２０（シグマ社）］３Ｘで洗浄され、乾燥点染される。サンプルは次いでＴＮＴＣ（ｐＨ７．２トリス５０ｍｍ，ＣａＣｌ₂ ５ｍｍ，トウィーン２００．１％，ＮａＣｌ０．５Ｍ）で適当に（通常５倍溶液で）希釈され、ウエルはアリコートされ、１時間３７℃で保温され、その後ウエルは前記の洗浄剤で洗浄される。因子VIII阻害体抗体を含有する血友病者から得た希釈血清である二次抗体（遮断薬溶液の１：１０００希釈）が加えられ、１時間３７℃で結合が可能となり、その後ウエルは前記の洗浄剤で洗浄される。第３の抗体、つまりホースラディッシュペルオキシダーゼに共役する商業的に利用可能な山羊抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ，ピアス，０．８ｍｇ／ｍｌ，１：５０００で遮断薬で希釈、ウエル当り１００μｌ）が加えられ、１時間３７℃で保温される。過剰抗体は次いでウエルから洗浄で除かれ（前記の通り、但し５Ｘ）、ＨＲＰにより切断される時に青色を産出する基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（キルケガードアンドペリーラブズ；商業的利用可能溶液１００μｌ）が各ウエルに加えられる。展開する色の量はサンプル内に存在する因子VIIIの量に比例する。酸停止溶液（ＴＢＭ停止溶液、キルケガードアンドペリーラブズ，ウエル当り１００μｌ）を用いて２−３分後に反応は停止し、吸光度はマイクロタイタプレートリーダーを使って測定される。典型的な標準曲線が０．０７８ｎｇ／ｍｌから４０．００ｎｇ／ｍｌにわたる全長ヒト因子VIII タンパク質濃度を用いて図４０で示される。Ｂ．マウスプラスマ内のＢ領域欠失因子VIIIの半減期研究この感受性のきわめて高い因子VIIIエリザの開発後、マウスプラスマ内のＢ領域欠失（ＢＤＤ）因子VIIIの半減期研究がとり上げられた。ヒトおよびイヌの全長ヒト因子VIIIの半減期が１０乃至１２時間（ブリンクハウス、他、全米科学アカデミー紀要、８２巻、８７５２−８７５６ページ（１９８５年））であるのに対し、マウス内でのヒト因子VIIIの半減期は１時間に過ぎないとの報告があった（ベーベン、他、１９９３年）。マウス内のＢＤＤヒト因子VIIIの半減期の測定はそれに続くマウスを生体内モデルとして利用する遺伝子実験記録に対するＡｖ１ＡＬＨ８１の効能評価にとって重要であった。半減期の研究は２回行われた。最初の実験（図４１）では５匹のＣ５７ｂ１／６メスのマウスが尾静脈からＢＤＤ因子VIIIタンパク質４００ｎｇを注射された。注射後０．５，１．５，２．５および６．５時間後に血液が抜き取られた。第２の実験では注射後２乃至１４時間後の時間帯に焦点がしぼられ、４匹のＣ５７ｂ１／６メスマウスがＢＤＤ因子VIII ５００ｎｇを尾静脈から注射された。血液は注射後２，５，８，１２および１４時間目に抜き取られ、プラスマはヒト因子VIII抗原の存在を確認するために分析された。この結果は図４１および４２で示される。マウス内のヒト因子VIIIの半減期は４−５時間であると計算された。この結果はヘーべン他（１９９３年）により計算された半減期と対照的である。しかしヘーベン他による研究（１９９３年）において、マウス内での因子VIIIの半減期はほんの２時間だけ分析されたに過ぎなかった。ここで報告される研究では、注射後３０分から２時間までの間でマウスプラズマ内での因子VIII抗原の水準に急激な減少（半減期１．７時間）が見出され（図４１）続く時点で４−５時間の半減期に減少度が低下して横ばい状態となった（図４１および４２）。従ってマウスにおけるヒトＢＤＤ因子VIIIの半減期はヒトおよびイヌにおけるヒト因子VIIIよりも約２−３倍短いということをこの結果は示している。Ｃ．試験管内での生物活性因子VIIIの生産生物活性因子VIIIの試験管内での生産でＡｖ１ＡＬＨ８１の形質導入が生じたかどうかを測定するために、以下に述べるようにプラーク精製Ａｖ１ＡＬＨ８１の２個の異なるプラークから生成される２９３細胞がＣＶＬ−１で感染された。培地は１．５×１０⁷細胞を含有する２９３細胞の３−１５０ｍｍプレートから除去され、感染培地１．１５ｍｌプラスいずれかのＡｖＡＬＨ８１プラーク（プラーク１あるいはプラーク２）からのＣＶＬ−１１００μｌ、もしくは負の対照プレートとして感染培地１．２５ｍｌで取り替えられた。プレートは前記の通り１．５時間振動され、その後完全培地２０ｍｌが各プレートに加えられた。培地の１．０ｍｌが各プレートから０，１２および２４時間の時点で収穫され、前記のヒト因子VIII特異的エリザを用いて因子VIII抗原の存在を分析され、コーテスト検定（カビファーマシューティカルズ）を用いて生物活性を分析された。この結果は下記の表IIで示される。表IIで示されるように、細胞はエリザで測定されたように因子VIII全抗原１０ −２０ｎｇ／ｍｌを生産し、また１２時間の時点で、因子VIIIの７ｎｇ／ｍｌが生物活性であった。しかし２４時間後にはこの生物活性は失われた。１２時間後の生物活性因子VIIIの低い水準および２４時間後の活性因子VIIIの欠如は、１２時間で開始２４時間で完成する細胞変性効果を細胞が受けているという事実により説明することで出来る。従って因子VIIIの新規合成は多分１２時間で減少を開始し、培地に存在する因子VIII は２４時間までに分解した。Ｄ．Ａｖ１ＡＬＨ８１からのＢＤＤ因子VIIIの生体内発現ヒトＢＤＤ因子VIIIがＡｖ１ＡＬＨ８１から生体内で発現されたかどうかを測定し、もしそうであるなら、因子VIII発現の時間経過を追って行くために、１５匹のＣ５７ｂｌ／６メスマウスがＡｖ１ＡＬＨ８１で注射された。ウイルスは注射媒体（ＩＭＥＭ＋ＦＢＳ１％）で全体の量が０．５ｍｌになるように希釈された。５匹のマウスが１×１０¹⁰ｐｆｕ（ウイルス６７μｌ；１．５×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌの濃度）の用量を受け、５匹のマウスは４×１０⁹ｐｆｕ（ウイルス２７μｌ）の用量を受け、また５匹のマウスは１×１０⁹ｐｆｕ（ウイルス７μ ｌ）を受けた。ウイルス懸濁液は０．５ｍｌ注射器および２７ゲージ針を用いて１０秒間で尾静脈経由で注入された。対照マウスは注射を受けなかった。１匹のマウスはＡｖ１ＡＬＨ８１１×１０¹⁰ｐｆｕを受けたが注射２日後に死んだ。血液が１週間間隔で抜き取られ、エリザによりヒト因子VIIIの存在確認のため分析された。注射後最初の５週間の分析結果が下記表IIIで示され、図４３でグラフで示される。ウイルス最大容量（１×１０¹⁰ｐｆｕ）を受けたマウスは注射１週および２週後、それぞれヒトＢＤＤ因子VIIIを４２および３５ｎｇ／ｍｌ産出した。もしもこれらの値がマウス内のヒト因子VIIIの半減期（４−５時間、前記参照）をヒトの場合（１０−１２時間）と比較して差異を修正する場合には、プラスマの水準は１週および２週において因子VIIIがそれぞれ１２６および９６ｎｇ／ｍｌに調節される。ヒトの因子VIII の生理水準は１００−２００ｎｇ／ｍｌであり、治療水準は〜１０ｎｇ／ｍｌとなる。従ってこれらのマウスは因子VIIIの生理水準を産出していることになる。加えてＡｖ１ＡＬＨ８１４×１０⁹ｐｆｕという低い用量を受けたマウスは十分に治療水準を上回る因子VIIIタンパク質を生産している。動物モデルにおけるヒト因子VIIIの発現はこれまで示されたことはなかった。しかし注射の３週から５週間後、因子VIIIの水準は大幅に低下した。３週で因子VIIIの減少が因子VIII抗原に対する免疫応答によるものかどうかを測定するために、第２の半減期研究が全長ヒト因子VIIIタンパク質を用いて行われた。最大のウイルス用量（１×１０¹⁰ｐｆｕ）を受けた４匹のマウス、および４匹の対照マウスが尾静脈を経由して全長ヒト因子VIII ５００ｎｇを注射された。血液が注射の１，２，４，８および１２時間後に取り出され、エリザによりヒト因子VI II抗原の存在を確認するために分析された。図４４および図５５はこの分析の結果を示す。全長因子VIIIの半減期はマウスの両セットで類似しており、約３．０時間あると計算することが出来る。これらのデータから二つの結論が導き出される。１）マウスプラスマの全長因子VIIIおよびＢＤＤ因子VIIIの半減期は、それぞれ３時間および４−５時間として比較することが出来、また２）３週間でマウスの因子VIII発現の喪失はマウスプラスマの特異的抗体による因子VIIIの急速な除去によるものではなく、従って肝臓からのベクターの喪失（あるいはベクターを含有する細胞の喪失）によるものか、もしくは因子VIII ｃＤＮＡの転写の減少による、ということである。マウス内の因子VIIIの時間経過が繰返され、そのデータは図４６で示される。実施例８１５匹のＣ５７ｂ１／６メスマウスが尾静脈を経由してＡｖ１ＡＬＨ８１４ ×１０⁹ｐｆｕ（ウイルス２７μｌ）を注射媒体（ＩＭＥＭ＋ＦＢＳ１％）で注射された。ウイルス懸濁液は尾静脈を経由して０．５ｍｌ注射器および２７ゲージ針を用いて１０秒以上で注入された。対照マウスは注射されなかった。血液は１週毎に採取され、エリザによりヒト因子VIII抗原の存在を確認するため分析された。実施例９ゲノム要素を持つ因子IX配列を含むアデノウイルスベクターの構築因子IX配列がゲノム要素、つまりヒト因子IX遺伝子からの配列をとり込んだベクターが調製された。これらの要素は５′未翻訳領域、中心切形第一イントロン、完全３′未翻訳領域および自然発生ポリアデニル化部位を含んでいた。５′ゲノム要素はゲノム因子IXクローンを鋳型として用いてＰＣＲ増幅により得られた。３個のプライム未翻訳領域がスー博士（中国、上海）から提供されたプラスミドより得られた。これらの要素をた易く得ることの出来る代替的なアプローチはそれらをヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅する方法である。因子IXプロモーターの９塩基対、５′未翻訳領域、コーディング領域および３ ′未翻訳領域の１６２塩基対断片を含む因子IX配列は、ＢａｍＨＩからＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＫＧ５ＩＸ−２（ユニバーシティオブオクスフォード、英国、ジョージブラウンリーより得たもの）から切除された。この断片については更にアンソン、他、ネイチャー、３１５巻、６８３−６８５ページ（１９８５年）に記載されている。この挿入はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ストラータジェン社）のポリリンカーに挿入されＢＬＳＫＨ９ＣＩを形成した（図４７）。因子IX配列は完全に配列化されており、正しいものと立証された。ゲノム遺伝子を持つ因子IXＤＮＡはまた、米国特許番号４，９９４，３７１およびヨーロッパ特許ＥＰＯ１０７２７８Ｂ１で開示された方法に従って得ることが出来た。コーディング配列の下流部分、完全３′未翻訳領域、天然因子IXポリアデニル化シグナルおよびポリアデニル化部位の前の３３１塩基対を含む一つの断片がＰｐｕＭＩおよびＢｇ１ＩＩでｐＣＭＶＩＸａ（中国、上海、フーダンユニバーシティ、ジェリースーの提供による）から切除された。Ｂｇ１ＩＩ一本鎖オーバーハングは平滑化された。ｐＢＬＳＫＨ９ＣＩはＰｐｕＭＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断され、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は平滑化され、バックボーン断片はＰｐｕＭＩ平滑結合としてｐＣＭＶＩＸａから得られる断片と結合された。生じるプラスミドｐＢＬＳＫＨ９Ｄ（図４８）はプロモーターの９塩基対、５′未翻訳領域、完全因子IXコーディング配列、全３′未翻訳領域、天然ポリアデニル化シグナルおよびポリアデニル化シグナルから下流の３３１塩基対を含んでいる。中心切形第一イントロンを含む構築物を生成するために、クローニング中間体が調製された。この中間体はコーディング配列から下流のＢｃ１Ｉ部位を除去し上流Ｂｃ１Ｉ部位にクローニングすることを可能にした。ｐＢ１ＳＫＨ９ＣＩにあるｃＤＮＡの３′末端はＰｐｕＭＩからＨｉｎｄＩＩＩに移された。プラスミドバックボーンにある一本鎖オーバーハングは平滑化されｐＢＬＨ９ＣＩＮＴを産出するために結合された（図４９）。ｐＢＬＨ９ＣＩＮＴにあるｃＤＮＡの５′末端は２ＰＣＲ生成断片を用いて３方向結合を持つ中心切形第一イントロンを含むように修飾された。これらの断片はファージプレップスを鋳型として用いて生成された（吉武，エス．、他、バイオケミストリー、２４巻、３７３６−３７５０ページ（１９８５年））。２個のＰＣＲ生成断片は（５′から３′までに）以下のものを含んでいた：１）ＳｐｅＩ部位、Ｓａ１Ｉ部位、完全５′未翻訳領域、因子IX遺伝子の第一エキソン、因子IX第一イントロンの最初の９９１塩基対およびＡａｔＩＩ部位。２）ＡａｔＩＩ部位、因子IX第一イントロンの最後の４４８塩基対および因子IX 第２エキソンの上流部分にある自然発生Ｂｃ１Ｉ部位の前に延びるこのエキソンの一部分。ＰＣＲ断片１はＳｐｅＩおよびＡａｔＩＩで消化された。ＰＣＲ断片２はＡａｔＩＩおよびＢｃ１Ｉで消化された。ＢＬＨ９ＣＩＮＴはＳｐｅＩおよびＢｃ１Ｉで消化され、バックボーン断片は分離された。３個の断片は３方向結合で結合されプラスミドｐＢＬＨ９ＥＩＮＴを生成した（図５０）。このプラスミドは因子IXの５′未翻訳領域、第一エキソン、中心切形第一イントロンおよびＰｐｕＭＩ部位までのコーディング配列を含む。ｐＢＬＨ９Ｅ（図５１）を生成するために、コーディング配列の３′末端が再挿入された。因子IX配列の３′末端はｐＢＬＳＫＨ９ＣＩから切除され、ＡｖａＩ−ＡｖａＩ断片としてｐＢＬＨ９ＥＩＮＴバックボーンに挿入された。生成するプラスミドｐＢＬＨ９Ｅ（図５１）は因子IX５′未翻訳領域、第一エキソン、中心切形第一イントロン、コーディング領域の残渣および３′未翻訳領域の１６２塩基対を含んでいた。ｐＢＬＨ９Ｆ（図５２）を生成するために、コーディング配列の３′末端および全３′未翻訳領域を含む断片がｐＢＬＳＫＨ９Ｄから切除され、ＡｖａＩ−ＡｖａＩ断片としてｐＢＬＨ９ＥＩＮＴバックボーンに挿入された。かくしてｐＢＬＨ９Ｆは５′未翻訳領域、第一エキソン、切形第一イントロン、コーディング配列の残渣、全３′未翻訳領域およびポリアデニル化部位から下流の３００塩基対を持つ。因子IX配列は次いでｐＢＬＳＫＨ９Ｄ，ｐＢＬＨ９ＥおよびｐＢＬＨ９Ｆから切除され、ＳｐｅＩ−Ｃ１ａＩ断片としてｐＡｖＳ６バックボーンに挿入された。生成するプラスミドはそれぞれｐＡＶ１Ｈ９Ｄ（図５３）、ｐＡｖ１Ｈ９ＥおよびｐＡｖ１Ｈ９Ｆと名付けられた。しかしｐＡｖ１Ｈ９ＥおよびｐＡｖ１Ｈ９Ｆが配列化された時、過誤が因子IX遺伝子の５′未翻訳領域で発見された。これらの過誤は修復された。配列の過誤はｐＢＬＨ９ＥＩＮＴまでさかのぼり探し出された。ミニプレップ１個のプラスミドは以下のプラスミド生成のために使用されてきた。ｐＢＬＨ９ＥＩＮＴミニプレップ６は正しい配列を持つことが発見された。ｐＢＬＨ９ＥＩＮＴミニプレップ６にあるＳｐｅＩからＡｐｔＩＩまでの断片はｐＡｖ１Ｈ９ＥおよびｐＡｖ１Ｈ９Ｆにある対応する断片に取り替り、それぞれｐＡｖ１Ｈ９ＥＲ（図５４）およびｐＡｖ１Ｈ９ＦＲを産出するために使用することが出来た。これらのプラスミドはアデノウイルスタイプ５ＩＴＲ、ＲＳＶプロモーター、三部分リーダー、因子IX配列、ＳＶ４０ポリアデニル化部位（これはｐＡｖ１Ｈ９ＤおよびｐＡｖ１Ｈ９ＦＲ内では余分のもの）およびアデノウイルス相同組換え領域を含む。ｐＡｖ１Ｈ９Ｄ，ｐＡｖ１Ｈ９ＥＲおよびｐＡｖ１Ｈ９ＦＲは次いで前記記載のアデノウイルスベクターを生成するために使用された。要約すると、線形化プラスミドはＡｄｄ１３２７の大型Ｃ１ａＩ切断断片を２９３細胞に挿入して同時形質移入された。プラークは選択され、拡大され、スクリーンされた。選択された３個のベクター分離物はＡｄ１Ｈ９Ｄ，Ａｄ１Ｈ９ＥＲ、Ａｄ１Ｈ９ＦＲと名付けられた。これは大規模プレップに成長し、プラークは２９３細胞に力価された。実施例１０２×１０⁸ｐｆｕのＡｖ１Ｈ９Ｂ、Ａｄ１Ｈ９Ｄ、Ａｄ１Ｈ９ＥＲあるいはＡｄ１Ｈ９ＦＲが尾静脈を経由してＣ５７Ｂ１／６マウスに注射された。２匹のマウスはそれぞれウイルスを受けた。１週間後プラスマはそれぞれヒト因子IX抗原および生物活性のためエリザおよび前記記載の免疫色素形成生物学的検定によりサンプル化された。図５６で示されるエリザの結果は、ゲノム要素の取り込みが因子IXの発見を劇的に増加させたことを示す。Ａｄ１Ｈ９ＦＲベクターは最大の発現を成し遂げ、それはＡｖ１Ｈ９Ｂで得られた水準より２００倍も大きかった。８匹の実験マウスおよび１匹の負の対照マウス（後者はベータガラクトシダーゼベクター、Ａｖ１ＬａｃＺ４を注射された）は下記の表IVで示される。これらの結果は、Ａｄ１Ｈ９Ｄ、Ａｄ１Ｈ９ＥＲおよびＡｄ１Ｈ９ＦＲから発現されたヒト因子IXが機能的であることを示した。肝臓はベクター注射１週間後に収穫され、ＤＮＡおよびＲＮＡが調製された。サザン分析は４個のベクターすべてに対し肝細胞当りベクターコピーが平均１−２個であることを示した（データは示されていない）。ノーザン分析は因子IXプラスマ水準に匹敵する帯強度を持つそれぞれのベクターに対する正しいサイズのＲＮＡ種を明らかにした。（データは示されていない）。実施例１１１×１０⁹ｐｆｕのＡｖ１Ｈ９Ｂ、Ａｄ１Ｈ９ＢあるいはＡｄ１Ｈ９ＥＲが尾静脈を経由してＣ５７Ｂ１／６マウスに注射された。５×１０⁷ｐｆｕのＡｄ１Ｈ９ＥＲおよびＡｄ１Ｈ９ＦＲもまたＣ５７Ｂ１／６マウスに尾静脈注入で投与された。各養生のためのコホートサイズはマウス５匹であった。指定された時点でプラスマは獲得されヒト因子IXのためエリザで検定された。図５７および５８で示された結果は、再度ゲノム要素の因子IX配列への取り込みが劇的に因子IX発現を増加させたことを示す。標準に接近する因子IXの水準はＡｄ１Ｈ９ＤおよびＡｄ１Ｈ９ＥＲの１×１０⁹ｐｆｕという低い用量で得られた。Ａｄ１Ｈ９ＦＲの５×１０⁷ｐｆｕのきわめて低い用量の注射がマウスにあるヒト因子IXの潜在的な治療水準の発現に帰着した。それぞれの場合において、Ａｄ１Ｈ９Ｄ、Ａｄ１Ｈ９ＥＲおよびＡｄ１Ｈ９ＦＲからの高水準の発現は、実験の１０−１２週にわたる存続した。これはＡｖ１Ｈ９Ｂのより高度な用量でこれまでに達成された発現の７週間継続を上回ることになった。実施例１２Ａｖ１Ｈ９Ｂ、Ａｄ１Ｈ９ＤおよびＡｄ１Ｈ９ＥＲからの発現は組織培養で検証された。ＨｅｐＧ２およびヒーラ細胞は２の感染多重度（細胞当り２ｐｆｕ）で形質導入された。４８時間後培地は採取されヒト因子IXをエリザで検定された。図５９で示されるデータは、２×１０⁸ｐｆｕのウイルスを受けたマウスに生体内で見られるものに対応するＡｄ１Ｈ９ＤおよびＡｄ１Ｈ９ＥＲを持つＨｅｐＧ２細胞の改良が増加していることを示す。ヒーラ細胞では、３′未翻訳領域（Ａｄ１Ｈ９Ｄ）の取り込みが何らかの効果も示さず、一方イントロン（Ａｄ１Ｈ９ＥＲ）の取り込みは発現を劇的に改良した。この明細書で引用されるすべての特許、公開情報およびデータベース入力はこの発明が関係する当業者の水準を示している。このような特許、公開情報（公開特許出願を含む）およびデータベース入力すべての開示は、これらの個別の特許、公開情報およびデータベース入力が特異的かつ個別に引用として取り込まれていることを示すかのようにその全体として同じ範囲で引用文献としてここに特異的に取り込まれている。しかしこの発明の範囲は前記の特異な実施例に限定されるものではない。この発明は特に前記のもの以外にも実施することが出来、しかもなお添付する請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者カレコ，マイケルアメリカ合衆国，20854 メリーランド, ロックヴィル，ハースストーンコート８ (72)発明者スミス，セオドアアメリカ合衆国，20878 メリーランド, ジャーマンタウン，クラブヒルドライブ 20165

Claims

【特許請求の範囲】１．凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を含む一つのアデノウイルスベクター。２．前記ＤＮＡ配列が因子VIIIあるいは因子VIIIの凝固活性を持つ断片、その誘導体もしくは類似体をコード化することを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。３．前記ＤＮＡ配列が因子IXあるいは因子IXの凝固活性を持つ断片、その誘導体もしくは類似体をコード化することを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。４．アデノウイルスベクターを生成する一つのプラスミドベクターであって、前記プラスミドベクターが凝固因子をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列を含むプラスミドベクター。５．宿主にある血友病を治療する一つの方法であって、前記宿主に請求の範囲第１項記載のアデノウイルスベクターを投与し、前記ベクターは前記宿主にある血友病の治療に有効な量で投与されることよりなる一つの方法。６．前記ベクターが更に組織特異的プロモーターを含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のベクター。７．前記組織特異的プロモーターがマウスアルブミンプロモーターであることを特徴とする請求の範囲第６項記載のベクター。８．前記ベクターが更に組織特異的でないプロモーターを含むことを特徴とする請求の範囲第３項記載のベクター。９．組織特異的プロモーターでない前記プロモーターがラウス肉腫ウイルスプロモーターであることを特徴とする請求の範囲第８項記載のベクター。１０．前記ベクターが更に少くとも１個のゲノム要素を含むことを特徴とする請求の範囲第３項記載のベクター。１１．前記ゲノム要素が因子IX ＤＮＡ配列の全３′未翻訳領域であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のベクター。１２．前記ベクターが更に因子IX ＤＮＡ配列の全５′未翻訳領域を含むことを特徴とする請求の範囲第１１項記載のベクター。１３．前記ベクターが因子IX ＤＮＡ配列の全３′未翻訳領域、因子IX ＤＮＡ配列の全５′未翻訳領域および因子IX ＤＮＡ遺伝子の中心切形第一イントロンを含むことを特徴とする請求の範囲第１０項記載のベクター。１４．前記ベクターが更に因子IX遺伝子の全第七イントロンを含むことを特徴とする請求の範囲第１０項記載のベクター。１５．前記ベクターが更に少くとも１個のゲノム要素を含むことを特徴とする請求の範囲第２項記載のベクター。１６．前記ベクターがＡｐｏＡ１プロモーターを含むことを特徴とする請求の範囲第１５項記載のベクター。１７．前記ベクターが更にアポリポタンパク質Ａ−１遺伝子の第一イントロンを含むことを特徴とする請求の範囲第１６項記載のベクター。１８．前記ベクターが更にアポリポタンパク質Ａ−１遺伝子の第一エキソンを含むことを特徴とする請求の範囲第１６項記載のベクター。１９．前記ベクターが更にアポリポタンパク質Ａ−１遺伝子の第一イントロンおよびアポリポタンパク質Ａ−１遺伝子の第一エキソンを含むことを特徴とする請求の範囲第１６項記載のベクター。２０．異種タンパク質をコード化する少くとも１個のＤＮＡ配列および異種タンパク質をコード化する前記少くとも１個のＤＮＡ配列の発現に作用する少くとも１個のゲノム要素を含む一つのアデノウイルスベクター。