JP2017197579A - 核酸送達の区画化方法ならびにその組成物および使用 - Google Patents

核酸送達の区画化方法ならびにその組成物および使用 Download PDF

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Abstract

【課題】核酸分子を対象の区画化された組織または臓器に送達する方法、区画化された組織または臓器の実質に核酸分子を送達するための使用および方法を提供すること。
【解決手段】ａ)宿主の体循環から組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分を区画化し；そしてｂ)送達剤(delivered agent)を組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に直接投与することを含み、該送達剤は核酸分子を含み、これにより送達剤は区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の実質細胞に入ることによる方法により解決される。本方法および使用を疾患および状態の処置および産業用途、農業用途および動物用途に使用できる。組織または臓器の実質への投与のために製剤されたアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスまたは他の組み換えウイルスを含む組成物も提供される。
【選択図】なし

Description

関連出願
２０１２年２月７日出願の“核酸送達の区画化方法ならびにその組成物および使用”なる名称の米国仮出願番号６１／６３３,２８７に基づく優先権を主張する。
本出願は、米国仮出願番号６１／６３３,２８７に基づく優先権を主張し、これと同日に出願した“核酸送達の区画化方法ならびにその組成物および使用”なる表題の米国特許出願番号(Attorney Docket No. 33809.00551.US01/551)に関する。
許容される限り、上記関連出願の各々の発明を、その全体を引用することにより本願明細書に包含させる。
電子的に提出した配列表の引用による取り込み
電子版の配列表をここに提出し、その内容を、その全体を引用することにより本願明細書に包含させる。２０１３年２月７日に電子ファイルを作成しており、そのサイズは３キロバイトであり、ファイル名551seqPC1.txtである。
発明の分野
ここに提供されるのは、核酸分子を対象の区画化された組織または臓器に送達する方法である。またここで提供されるのは、区画化された組織または臓器の実質(parenchyma)に核酸分子を送達するための使用および方法である。本方法および使用は疾患および状態の処置におよび産業用途、農業用途および動物用途に使用できる。またここで提供されるのは、組織または臓器の実質に投与するために調製された、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスまたは他の組み換えウイルスを含む組成物である。
背景
遺伝子治療は、核酸分子を対象に投与し、該個体内の遺伝子を補うまたは変える治療方法である。特に、遺伝子治療は疾患処置の目的で使用される。遺伝子治療は遺伝子の変異または欠失により発症する遺伝子疾患の根本的処置であると見なされる。治療を必要とする対象へタンパク質をコードする遺伝子を導入するための種々の方法が試みられているが、満足な治療効果が得られた例は殆どない。それゆえに、遺伝子治療適用のために対象に核酸分子を送達する新たな方法が必要とされている。
要約
ここに提供されるのは、対象に核酸分子を送達する方法である。本方法は、疾患および状態を処置するための適用を含む遺伝子治療適用ならびに産業用途、農業用途および動物用途に使用できる。ここに記載するように、本方法は、ａ)宿主の体循環から組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分を区画化し；そしてｂ)送達剤(delivered agent)を組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に直接投与することを含み、該送達剤は核酸分子を含み、これにより送達剤は区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の実質細胞に入る。組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の区画化は送達剤投与前に、同時にまたは後に実施し得る。一般的に、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の区画化は、送達剤投与前に、典型的に核酸分子含有送達剤送達前最大５分、４分、３分、２分、１分または３０秒に開始する。
提供する方法は、組織、臓器または組織もしくは臓器の部分と体循環の間の連絡を回復させる段階もさらに含み得る。連絡回復段階は、一般的に送達剤投与の予め定めた所定時間後に行われる。所定時間は、送達剤が実質細胞に入るのに十分な時間であり(例えば形質導入による)、そうすることにより連絡回復後、実質細胞に入れない送達剤は２０％以下となる。例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％以下の送達剤が実質細胞に入れない。ある例においては、所定時間は、投与された送達剤が実質細胞に入るのに十分な時間であり、これにより連絡回復後、２０％以下の送達剤が体循環に曝される。例えば、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％以下の送達剤が体循環に曝される。典型的に本発明方法において、所定時間は少なくとも、または少なくとも約１分、２分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、１１５分または１２０分である。具体例において、所定時間は少なくとも丁度もしくは少なくとも約または丁度もしくは約３０分であり、一般的に３０分〜６０分を超えない。
この方法において、区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は、肝臓、脳、脊髄、膵臓、心臓、皮膚、腎臓、肺、血管、骨、筋肉、子宮、子宮頸、前立腺、尿道または腸である。具体例において、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は肝臓である。例えば、本発明方法の例において、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は肝臓であり、所定時間は少なくとも丁度もしくは少なくとも約または丁度もしくは約３０分であり、一般的に３０分〜６０分を超えない。このような例において、所定時間は、実質的に全ての送達剤、一般的に少なくとも８０％の送達剤が肝実質の肝細胞に入るのに十分な時間である。この方法の例において、組織または臓器の部分は区画化されている。例えば、肝臓の部分は区画化されており、その部分は葉、葉のセグメントもしくは部分または肝臓のセグメントである。葉または葉の部分は右葉、左葉、方形葉および尾状葉またはその部分である。
ここに記載するあらゆる方法において、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の区画化は、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分における何れか１つまたはそれ以上の動脈、静脈、導管および／または血管を遮断することにより行われ、これにより組織または臓器またはその部分への血液供給および血流が低減されるかまたは失われる。一般的に、区画化は、区画化する組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に繋がりまたは通り抜ける動脈、静脈、導管および／または血管の全てが遮断されたときに実現される。動脈、静脈、導管および／または血管の遮断は、用手圧迫、実質クランプ、動脈または静脈クランプ、閉塞用カテーテル、縫合器、バンド、止血帯またはケーブルのようなデバイスまたは技法を用いて実施できる。一般的に、本発明方法において、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は、実質クランプでクランピングすることにより区画化する。クランプは腹腔鏡クランプであり得る。ここでのあらゆる方法において、体循環からの組織または臓器の区画化は、組織または臓器またはその部分中の血液を減少させるまたは除去するための吸引の適用も含み得る。
ここに提供する何れの方法においても、送達剤は、核酸分子を含む非ウイルスベクター、ウイルス、ウイルス様粒子、ミニサークル、ナノ粒子および全細胞であり得る。一例では、送達剤は非ウイルスベクターであり、非ウイルスベクターは発現ベクターである。他の例では、送達剤はナノ粒子であり、ナノ粒子は標的化されているか放射標識されている。さらなる例では、送達剤はウイルスである。送達剤がウイルスであるときの例では、ウイルスはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)、レトロウイルス、ワクシニアウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得る。例えば、ウイルスはレンチウイルスであるレトロウイルスであり得る。ウイルスは、一般的にそのゲノムにとって異種である核酸分子を含む組み換えウイルスである。ウイルスは複製欠損ウイルスであり得る。ウイルスは、対象の細胞の核内で複製するウイルスであり得る。ウイルスはまた肝細胞のような非分裂細胞に感染するものを含む。ある例においては、ウイルスは分裂細胞に感染する。このような例において、本方法は、細胞分裂を刺激する段階を含み得る。肝臓が本方法を実施するための標的臓器であるときのような具体例において、ウイルスは肝臓に指向性を示し、肝細胞に入ることができるものである。
例えば、ここで提供する方法の例において、ウイルスは、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に投与された、そのゲノムにおける異種核酸を含むアデノウイルスである。アデノウイルスは血清型１〜血清型５１の何れかの血清型(例えば１、２、４、５・・・５１)であり得る。例えば、アデノウイルスはアデノウイルス２型またはアデノウイルス５型である。本発明方法において使用するアデノウイルスは、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４の何れかのコード領域の１箇所以上に欠失を有するものを含む。例えば、アデノウイルスはＥ１コード領域に欠失を含む。本発明方法における送達剤としてのウイルスは核酸分子を含む。
ここでの何れかの方法において、送達剤は、遺伝子治療のために対象に送達される核酸分子を含む。いくつかの例において、核酸分子はポリペチドをコードしている。コードされたポリペチドは治療ポリペチドであり得る。例えば、コードされたポリペチドは酵素、ホルモン、凝固因子または凝血因子、増殖因子、抗体または抗体の部分、血管形成モジュレーター、免疫調節剤、疼痛モジュレーター、受容体、輸送タンパク質、制御タンパク質、抗原またはアレルゲンであり得る。特に、コードされたポリペチドはインターロイキン、インターフェロン、増殖因子またはそれらの部分および増殖因子受容体またはそれらの部分であり得る。核酸分子の例は、アデノシンデアミナーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(ＣＴＦＲ)、ガルスルファーゼ、ラロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、酸アルファグルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、インスリン、甲状腺ホルモン、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン−１(ＩＬ−１)、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、インターフェロン−α(ＩＦＮ−α)、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ｆｌｔ３)、ニューロピリン−２(ＮＰ２)、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、トランスフォーミング増殖因子αまたはβ、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、線維芽細胞増殖因子受容体(ＦＧＦＲ)、ＦＧＦＲアンタゴニスト(ｓＦＧＦＲ)、トランスフォーミング増殖因子受容体(ＴＧＦＲ)、血管内皮細胞増殖因子受容体(ＶＥＧＦＲ)、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、第VIII因子、第IX因子、フォン・ヴィルブランド因子、成長ホルモン、メタロプロテイナーゼトロンボスポンジンモチーフ１(ＭＥＴＨ−１)、ＭＥＴＨ−２、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ(ＴｒｐＲＳ)フラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、色素上皮由来因子(ＰＥＤＦ)、バソスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲン−Ｅフラグメント、トロンボスポンジン、タムスタチン、カンスタチン、レスチン、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１(ｓＦｌｔ−１)、可溶性血管内皮細胞増殖因子受容体(ｓＦｌｋ)、可溶性ニューロピリン−１(ｓＮＲＰ１)、インターフェロンガンマ誘発タンパク質１０(ＩＰ−１０)、血小板第４因子(ＰＦ−４)、Gro-beta、可溶性エフリンＢ型受容体４(ｓＥｐｈＢ４)、セフリンＢ２、ＩＧＦ−１、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ＨＳＶ−ＴＫ)、カルボキシペプチダーゼＧ２(ＣＰＧ２)、カルボキシルエステラーゼ(ＣＡ)、シトシンデアミナーゼ(ＣＤ)、チトクロムＰ４５０(ｃｙｔ−４５０)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)、ニトロレダクターゼ(ＮＲ)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ＰＮＰ)、チミジンホスホリラーゼ(ＴＰ)、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(ＶＺＶ−ＴＫ)、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通型タンパク質、システイントランスポーター、酸セラミダーゼ、酸α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸β−グルコシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ、酸β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α−マンノシダーゼ、酸β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ニーマン・ピック病Ｃ１型(ＮＰＣ−１)、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)、アセチル−ＣｏＡ：αグルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、酸リパーゼ、ネプリライシン、インスリン分解酵素インスリジン、thimetオリゴペプチダーゼ、カルビンディンＤ２８、パルブアルブミン、低酸素症誘発因子１−アルファ(ＨＩＦ１−アルファ)、サーチュイン−２(ＳＩＲＴ−２)、生存運動神経タンパク質−１(ＳＭＮ−１)、ＳＭＮ−２、グリア細胞由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、毛様体神経栄養因子(ＣＮＦ)、低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬＲ)、リポタンパク質リパーゼ(ＬＰＬ)、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)、ＵＤＰ−グルクロニル−トランスフェラーゼ(ＵＧＴ)、ＵＧＴ１Ａ１、グルコース−６ホスファターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチニダーゼ、ベータ−グルコセレブロシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(ＰＢＤＧ)またはｐ５３をコードするものを含むが、これらに限定されない。
他の例において、コードされたポリペチドは、産業用途、動物用途または農業用途に関わるものであり得る。例えば、核酸分子は、動物における筋肉生産量を増やすか、動物における毛または羊毛生産量を増やすか、動物の成長を促すかまたは栄養素合成もしくは利用に関わるポリペチドであり得る。このような例において、コードされたポリペチドは、ミオスタチン阻害因子、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、成長ホルモン放出因子、ニワトリＳｋｉ、セリントランスアセチラーゼまたはｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼであり得る。ミオスタチン阻害因子はフォリスタチンであり得る。
ここで提供する方法の例において、核酸分子はＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子およびアプタマーであり得る。例えば、核酸分子はマイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸であり得る。このような核酸分子はまた対象において治療効果を発揮し、それゆえに治療核酸分子である。
ここに提供する何れかの方法において、本方法はまた所望により送達剤の投与前に実質組織を同定するために組織または臓器を造影する段階を含んでよい。このような方法を使用して、導管、動脈または血管の管腔への送達剤および核酸分子の投与を最小化できる。例えば、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)、超音波検査(超音波)またはコンピュータ断層撮影(ＣＴ)を実施できる。具体例において、ドップラー超音波検査を本発明方法の実施において使用できる。
さらに、ここでの何れかの方法の実施に際して、送達剤の組織または臓器の実質の細胞への送達を促進するかまたは効率を上昇させるための技法、方法および補助剤を使用し得る。例えば、送達剤を実質細胞への挿入を促進するために脂質、ポリマー補助剤または他の補助剤を用いて調製できる。これらに加えてまたはこれらとは別に、送達剤を、エレクトロポレーション、ソノポレーション、圧、超音波または“遺伝子銃”のような実質細胞への挿入を促進する物理的方法を用いて送達できる。
ここで提供する何れかの方法のさらなる例において、送達剤の細胞への取り込みを促進する薬剤を対象に投与できる。本薬剤を送達剤の投与前に、同時にまたは後に投与してよい。ある例においては、本薬剤はウイルス特異的細胞表面受容体の転写エンハンサーである。例えば、本薬剤はヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤である。ＨＤＡＣ阻害剤の例は、トリスコスタチンＡ、ボリノスタット(ＳＡＨＡ)、ベリノスタット(ＰＸＤ１０１)、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット(ＬＢＨ５８９)、エンチノスタット(ＭＳ−２７５)、Ｃ１９９、モセチノスタット(ＭＧＣＤ０１０３)、ロミデプシン(Istodax)、バルプロ酸、ＰＣＩ−２４７８１、ＳＢ９３９、レスミノスタット、ギビノスタット、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、KevetrinおよびトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)から選択されるを含むが、これらに限定されない。
本方法の実施に際し、区画化された組織への送達剤の送達は、低投与量の薬剤を投与でき、これは、投与された薬剤と発現されるタンパク質の動態が直線的であるためにさらに制御できることを意味する。これは、薬剤を主に静脈内に送達する現存する遺伝子治療方法と対照的である。例えば、本方法により投与される薬剤の量は、静脈内に投与される同じ送達剤の１００分の１以下である。例えば、送達剤の量は、静脈内に投与される同じ送達剤の２００分の１、５００分の１、１０００分の１、５０００分の１、１００００分の１以下の量である。
具体例において、送達剤がそのゲノム内に異種核酸を含むアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)であるとき、投与する送達剤の量は正確にまたは約１０〜１×１０１２粒子、１０〜１×１０６粒子、１×１０３〜１×１０１２粒子、１×１０６〜１×１０１０粒子または１×１０７〜１×１０９粒子；または正確にまたは約１０〜１×１０１２pfu、１０〜１×１０６pfu、１×１０３〜１×１０１２pfu、１×１０６〜１×１０１０pfuまたは１×１０７〜１×１０９pfuである。例えば、投与する送達剤の量は１×１０１２粒子、１×１０１１粒子、１×１０１０粒子、１×１０９粒子、１×１０８粒子、１×１０７粒子、１×１０６粒子、１×１０５粒子、１×１０４粒子、１×１０３粒子以下；または１×１０１２pfu、１×１０１１pfu、１×１０１０pfu、１×１０９pfu、１×１０８pfu、１×１０７pfu、１×１０６pfu、１×１０５pfu、１×１０４pfu、１×１０３pfu以下である。
ここに提供する何れかの方法の例において、送達剤を区画化された組織、臓器または組織もしくは臓器の部分における１以上の座位に送達できる。本方法はまた組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の実質から細胞外の送達剤を除去する段階も含み得る。このような段階は、これは、そうしなければ、送達剤が細胞に挿入されていないとき、区画化の解除により起こり得る送達剤の体循環への暴露をさらに減少または最小化できる。典型的に、解除操作は、組織、臓器または組織もしくは臓器の部分と全身脈管構造の連絡の回復前に行う。区画化を、所定時間後、体循環との連絡の開始により終了する。体循環との連絡回復段階は、動脈、静脈、導管および／または血管を遮断するために使用したデバイスまたは技法の除去を含む。ここでの何れかの方法において、ここに提供する何れかの段階を複数回繰り返すことができる。ある例においては、その後の本方法の反復において、送達剤を同じ区画化部位または異なる区画化部位に投与する。
ここで提供する核酸分子を含む送達剤を送達する方法は、送達する細胞における核酸分子の機能的動作または発現をもたらし得る。いくつかの場合には、核酸分子は細胞から組織に分泌され、いくつかの例では体循環に到達し得るタンパク質をコードできる。それゆえに、ここに提供する方法を、多様な適用に、また特にポリペチドの局所または全身発現が望まれる適用に使用できる。例えば、本発明方法において、核酸分子の送達はポリペチドの産生をもたらし、そこでは送達剤は、本ポリペチドをコードする核酸分子を含む。本方法を実施した場合、ポリペチドの発現は、体循環との連絡回復後、少なくとも３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、６０ヶ月、７２ヶ月、８４ヶ月、９６ヶ月、１０年、１５年またはそれ以上持続する。
それゆえに、ここで提供する方法の例において、核酸分子の送達は疾患または状態の処置を生じる。疾患または状態は、遺伝子欠損または異常細胞またはタンパク質活性が原因である他の疾患もしくは状態であり得る。疾患または状態は、遺伝性酵素欠損、遺伝性免疫欠損、癌、レトロウイルス感染、血友病、糖尿病、筋ジストロフィー、心血管障害、嚢胞性線維症、神経変性障害、外傷、疼痛、鎌状赤血球貧血、自己免疫性疾患、炎症性疾患または高血圧であり得る。このような疾患または状態の例は、血友病ＡおよびＢ、Ｉ型糖尿病、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、II型、家族性高コレステロール血症、無フィブリノーゲン血症、糖原病(ＧＳＤ)Ｉａ型、ＧＳＤ Ｉｂ型、ＧＳＤ II型(ポンペ)、ムコ多糖症(ＭＰＳ１)、ＭＰＳ IIIＡ、ＭＰＳ IIIＢ、ＭＰＳ VII、ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損(ＯＴＣ)、フェニルケトン尿症、肝線維症、肝虚血再灌流傷害、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、ガラクトース血症、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、チロシン血症Ｉ型、メチルマロン酸血症、シトルリン血症、痛風およびレッシュ・ナイハン症候群、スライ症候群、ツェルウェーガー症候群、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)、嚢胞性線維症、急性間欠性ポルフィリン症、多発性硬化症、リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)またはパーキンソン病を含むが、これらに限定されない。本発明方法の具体例において、対象は１８歳未満のヒト小児である。ある例においては、対象は胎児である。例えば、対象は、遺伝子欠損を有すると診断されているものであり得る。
ここに提供するあらゆる方法において、本方法を腹腔鏡検査を介して実施し得る。
ここに提供されるのは、区画化された組織、臓器または組織もしくは臓器の部分への核酸分子の直接実質投与に使用するための、核酸分子を含む送達剤を含む組成物およびその使用である。区画化された組織、臓器または組織もしくは臓器の部分への核酸分子の直接実質投与に使用するための組成物およびその使用は、疾患または状態の処置をもたらし、対象内で異種ポリペチドを産生し、動物における筋肉生産量を増やし、動物において毛の成長を増加させ、動物における羊毛生産量を増やし、動物の成長を促し、または動物で栄養素合成もしくは利用をもたらす。
核酸を区画化された組織または臓器の実質に送達するために使用するここで提供される使用および組成物において、区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は肝臓、脳、脊髄、膵臓、心臓、皮膚、腎臓、肺、血管、骨、筋肉、子宮、子宮頸、前立腺、尿道および腸またはその部分であり得る。特に、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は肝臓である。例として、ここに提供する使用および使用のための組成物は、葉、葉のセグメントもしくは部分または肝臓のセグメントのように区画化された肝臓の部分に核酸を直接実質に送達するために使用できる。葉または葉の部分は右葉、左葉、方形葉および尾状葉またはその部分であり得る。区画化された組織または臓器は、組織または臓器または組織または臓器の部分が体循環から隔離され、これにより組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に繋がりまたは通り抜ける動脈、静脈、導管および／または血管が遮断されるものである。例えば、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は、実質のクランプにより体循環から隔離されることにより区画化されているものである。
区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の実質に核酸を送達するために使用するここで提供される使用および組成物の例において、核酸分子を含む送達剤は核酸分子を含む非ウイルスベクター、ウイルス、ウイルス様粒子、ミニサークル、ナノ粒子および細胞全体であり得る。一例では、送達剤は非ウイルスベクターであり、非ウイルスベクターは発現ベクターである。他の例では、送達剤はナノ粒子であり、ナノ粒子は標的化されているか放射標識されている。さらなる例では、送達剤はウイルスである。例えば、ウイルスはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)、レトロウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスである。レトロウイルスはレンチウイルスであり得る。送達剤は、一般的に核酸分子がそのゲノムに対して異種である組み換えウイルスである。ある例においては、ウイルスは、複製欠損のものである。他の例において、ウイルスは細胞の核で複製できるものである。ここでの例において、ウイルスは非分裂細胞に感染できるものであり、例えば、ウイルスは肝臓に指向性を示し、肝細胞に入ることができるものである。
ここに提供する使用および使用のための組成物の例において、組成物は、区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に送達するために使用するそのゲノムに異種核酸分子を含むアデノウイルスである送達剤を含む。アデノウイルスは任意の血清型１〜血清型５１(例えば１、２、３、４、５、・・・５１)のような任意の血清型であり得る。例えば、アデノウイルスはアデノウイルス２型またはアデノウイルス５型である。ここでの組成物または使用において使用するための任意のアデノウイルスは、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４コード領域の任意の１箇所以上に欠失を有するものを含む。例えば、アデノウイルスはＥ１コード領域における欠失を含む。ここでの組成物および使用における送達剤として、ウイルスは核酸分子を含み、核酸分子はウイルスゲノムに対して異種性である。
ここに適用する任意の使用または組成物において、組成物は、ポリペチドをコードする核酸分子を含む送達剤を含む。コードされたポリペチドは酵素、ホルモン、凝固因子または凝血因子、増殖因子、抗体またはその部分、血管形成モジュレーター、免疫調節剤、疼痛モジュレーター、受容体、輸送タンパク質、制御タンパク質、抗原またはアレルゲンであり得る。例えば、コードされたポリペチドはインターロイキン、インターフェロン、増殖因子またはその部分または増殖因子受容体またはその部分であり得る。ここでの使用および組成物における核酸分子の例は、アデノシンデアミナーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(ＣＴＦＲ)、ガルスルファーゼ、ラロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、酸アルファグルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、インスリン、甲状腺ホルモン、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン−１(ＩＬ−１)、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、インターフェロン−α(ＩＦＮ−α)、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ｆｌｔ３)、ニューロピリン−２(ＮＰ２)、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、トランスフォーミング増殖因子αまたはβ、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、線維芽細胞増殖因子受容体(ＦＧＦＲ)、ＦＧＦＲアンタゴニスト(ｓＦＧＦＲ)、トランスフォーミング増殖因子受容体(ＴＧＦＲ)、血管内皮細胞増殖因子受容体(ＶＥＧＦＲ)、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、第VIII因子、第IX因子、フォン・ヴィルブランド因子、成長ホルモン、メタロプロテイナーゼトロンボスポンジンモチーフ１(ＭＥＴＨ−１)、ＭＥＴＨ−２、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ(ＴｒｐＲＳ)フラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、色素上皮由来因子(ＰＥＤＦ)、バソスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲン−Ｅフラグメント、トロンボスポンジン、タムスタチン、カンスタチン、レスチン、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１(ｓＦｌｔ−１)、可溶性血管内皮細胞増殖因子受容体(ｓＦｌｋ)、可溶性ニューロピリン−１(ｓＮＲＰ１)、インターフェロンガンマ誘発タンパク質１０(ＩＰ−１０)、血小板第４因子(ＰＦ−４)、Gro-beta、可溶性エフリンＢ型受容体４(ｓＥｐｈＢ４)、セフリンＢ２、ＩＧＦ−１、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ＨＳＶ−ＴＫ)、カルボキシペプチダーゼＧ２(ＣＰＧ２)、カルボキシルエステラーゼ(ＣＡ)、シトシンデアミナーゼ(ＣＤ)、チトクロムＰ４５０(ｃｙｔ−４５０)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)、ニトロレダクターゼ(ＮＲ)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ＰＮＰ)、チミジンホスホリラーゼ(ＴＰ)、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(ＶＺＶ−ＴＫ)、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通型タンパク質、システイントランスポーター、酸セラミダーゼ、酸α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸β−グルコシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ、酸β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α−マンノシダーゼ、酸β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ニーマン・ピック病Ｃ１型(ＮＰＣ−１)、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)、アセチル−ＣｏＡ：αグルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、酸リパーゼ、ネプリライシン、インスリン分解酵素インスリジン、thimetオリゴペプチダーゼ、カルビンディンＤ２８、パルブアルブミン、低酸素症誘発因子１−アルファ(ＨＩＦ１−アルファ)、サーチュイン−２(ＳＩＲＴ−２)、生存運動神経タンパク質−１(ＳＭＮ−１)、ＳＭＮ−２、グリア細胞由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、毛様体神経栄養因子(ＣＮＦ)、低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬＲ)、リポタンパク質リパーゼ(ＬＰＬ)、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)、ＵＤＰ−グルクロニル−トランスフェラーゼ群(ＵＧＴ)、ＵＧＴ１Ａ１、グルコース−６ホスファターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチニダーゼ、ベータ−グルコセレブロシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(ＰＢＤＧ)またはｐ５３をコードするものを含むが、これらに限定されない。
ここに提供する使用または組成物の例において、組成物は、動物における筋肉生産量を増やす、動物における毛生産量を増やす、動物における羊毛生産量を増やす、動物の成長を促すまたは栄養素合成もしくは利用に関わるポリペチドをコードする核酸分子を含む送達剤を含む。例えば、コードされたポリペチドはミオスタチン阻害因子、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、成長ホルモン放出因子、ニワトリＳｋｉ、セリントランスアセチラーゼおよびｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼであり得る。具体例において、ミオスタチン阻害因子はフォリスタチンである。
ここに提供する使用または組成物の例において、組成物は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはアプタマーである核酸分子を含む送達剤を含む。核酸分子はマイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンス核酸であり得る。
さらに、ここで提供される使用のための組成物は、組織または臓器の実質の細胞への送達剤の送達を促すまたは効率を高める薬剤または補助剤を含む。例えば、送達剤は、実質細胞への挿入を促進するために脂質、ポリマー補助剤または他の補助剤と調製できる。使用または組成物が肝臓への送達のためである例において、実質細胞は肝細胞であり得る。他の例において、送達剤を送達剤の細胞取り込みを促進する薬剤と製剤できる。例えば、送達剤を、ウイルス特異的細胞表面受容体の転写エンハンサーである薬剤と製剤できる。このような薬剤の例はヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤である。ＨＤＡＣ阻害剤はトリスコスタチンＡ、ボリノスタット(ＳＡＨＡ)、ベリノスタット(ＰＸＤ１０１)、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット(ＬＢＨ５８９)、エンチノスタット(ＭＳ−２７５)、Ｃ１９９、モセチノスタット(ＭＧＣＤ０１０３)、ロミデプシン(Istodax)、バルプロ酸、ＰＣＩ−２４７８１、ＳＢ９３９、レスミノスタット、ギビノスタット、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、KevetrinまたはトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)であり得る。
ここに提供する使用または組成物のあらゆる例において、組成物中の送達剤は、一般的に静脈内投与用に製剤される組成物中の同じ送達剤の量よりも１００分の１の量である。例えば、組成物中の送達剤の量は、静脈内投与用に製剤される組成物中の同じ送達剤の量の２００分の1、５００分の1、１０００分の1、５０００分の１、または１００００分の１以下である。具体例において、使用または組成物は、そのゲノムに異種核酸分子を含むアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである送達剤を含み、ここで、組成物中のウイルスの量は、正確にまたは約２×１０３pfu／mL〜１×１０１４pfu／mL、２×１０３pfu／mL〜１×１０１２pfu／mL、２×１０３pfu／mL〜２×１０１１pfu／mL、１×１０４pfu／mL〜５×１０１１pfu／mL、１×１０５pfu／mL〜１×１０１１pfu／mL、２×１０６pfu／mL〜２×１０１０pfu／mLまたは１×１０８〜１×１０１０pfu／mL；または正確にまたは約２×１０３粒子／mL〜１×１０１４粒子／mL、２×１０３粒子／mL〜１×１０１２粒子／mL、２×１０３粒子／mL〜２×１０１１粒子／mL、１×１０４粒子／mL〜５×１０１１粒子／mL、１×１０５粒子／mL〜１×１０１１粒子／mL、２×１０６粒子／mL〜２×１０１０粒子／mLまたは１×１０８〜１×１０１０粒子／mLである。組成物は、正確にまたは約０.０２mL〜１００mL、０.０５mL〜５０mL、１mL〜１０mL、０.０５mL〜５mLまたは０.０２mL〜１mLの体積で提供される液体組成物であり得る。ここで提供される使用のための組成物は、１回服用量投与または多回服用量投与用に製剤してよい。例えば、組成物は、１回服用量投与のための量のアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを含んでよく、ここで、組成物中のアデノウイルスは正確にまたは約１０〜１×１０１２粒子、１０〜１×１０６粒子、１×１０３〜１×１０１２粒子、１×１０６〜１×１０１０粒子または１×１０７〜１×１０９粒子；または正確にまたは約１０〜１×１０１２pfu、１０〜１×１０６pfu、１×１０３〜１×１０１２pfu、１×１０６〜１×１０１０pfuまたは１×１０７〜１×１０９pfuである。例えば、組成物中のアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスの量は１×１０１２粒子、１×１０１１粒子、１×１０１０粒子、１×１０９粒子、１×１０８粒子、１×１０７粒子、１×１０６粒子、１×１０５粒子、１×１０４粒子、１×１０３粒子以下；または１×１０１２pfu、１×１０１１pfu、１×１０１０pfu、１×１０９pfu、１×１０８pfu、１×１０７pfu、１×１０６pfu、１×１０５pfu、１×１０４pfu、１×１０３pfu以下である。
ここでの使用または使用のための組成物の例において、組成物をヒト患者への投与のために製剤する。組成物を１８歳未満の小児への投与のために製剤し得る。組成物を胎児への投与のために製剤し得る。
ここでの使用または使用のための組成物の例において、区画化された組織への直接実質投与に使用するための核酸分子を含む送達剤を対象内でポリペプチドを発現をさせるために使用できる。核酸分子は治療核酸分子であり得る。核酸分子は治療ポリペチドをコードし得る。それゆえに、区画化された組織または臓器またはその部分の実質への直接送達のためのここでの使用または使用のための組成物は疾患または状態の処置をもたらし得る。このような疾患および状態の例は、遺伝性酵素欠損、遺伝性免疫欠損、ウイルス感染、癌、血友病、糖尿病、筋ジストロフィー、心血管障害、嚢胞性線維症、神経変性障害、外傷、疼痛、鎌状赤血球貧血、自己免疫性疾患、炎症性疾患または高血圧を含むが、これらに限定されない。例えば、疾患または状態は血友病ＡおよびＢ、Ｉ型糖尿病、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、II型、家族性高コレステロール血症、無フィブリノーゲン血症、糖原病(ＧＳＤ)Ｉａ型、ＧＳＤ Ｉｂ型、ＧＳＤ II型(ポンペ)、ムコ多糖症(ＭＰＳ１)、ＭＰＳ IIIＡ、ＭＰＳ IIIＢ、ＭＰＳ VII、ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ(ＯＴＣ)欠損、フェニルケトン尿症、肝線維症、肝虚血再灌流傷害、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、ガラクトース血症、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、チロシン血症Ｉ型、メチルマロン酸血症、シトルリン血症、痛風およびレッシュ・ナイハン症候群、スライ症候群、ツェルウェーガー症候群、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)、嚢胞性線維症、急性間欠性ポルフィリン症、多発性硬化症、リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)またはパーキンソン病であり得る。
ここに提供されるのは、正確にまたは約１０〜１×１０１２pfu、１×１０３pfu〜１×１０１２pfu、１×１０２pfu〜１×１０１０pfu、１×１０３pfu〜１×１０１０pfu、１×１０３pfu〜１×１０９pfu、１×１０３pfu〜１×１０８pfuまたは１×１０６pfu〜１×１０９pfu；または正確にまたは約１０〜１×１０１２粒子、１×１０３粒子〜１×１０１２粒子、１×１０２粒子〜１×１０１０粒子、１×１０３粒子〜１×１０１０粒子、１×１０３粒子〜１×１０９粒子、１×１０３粒子〜１×１０８粒子または１×１０６粒子〜１×１０９粒子の量で直接実質投与のために調製されたアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス組成物を含む容器である。アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスは、一般的に異種核酸分子をそのゲノムに含む。容器は、滅菌および密閉されたものである。容器はシリンジまたはバイアルであり得る。容器はまた組成物の注射用針を含み得る。容器はキャピラリーデバイスを含み得る。例えば、容器は、例えば、送達剤を実質内するために、肝臓のグリソン鞘に進入するためのキャピラリーデバイスを含み得る。
ここで提供する容器の具体例において、組成物は、１×１０１２pfu未満であり、正確に少なくとも正確にまたは少なくとも約１×１０３pfu、１×１０４pfu、１×１０５pfu、１×１０６pfu、１×１０７pfu、１×１０８pfu、１×１０９pfu、１×１０１０pfu、１×１０１１pfu以上；または１×１０１２粒子未満であり、正確に少なくとも正確にまたは少なくとも約１×１０３粒子、１×１０４粒子、１×１０５粒子、１×１０６粒子、１×１０７粒子、１×１０８粒子、１×１０９粒子、１×１０１０粒子、１×１０１１粒子以上である量のアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを含む。
容器中の組成物がアデノウイルスを含むここで提供する例において、アデノウイルスは任意の入手可能なまたは知られた血清型であり得る。例えば、アデノウイルスは血清型１〜血清型５１(例えば１、２、３、４、５・・・５１)である血清型である。アデノウイルスはアデノウイルス２型またはアデノウイルス５型であり得る。一般的に、ここでの容器中に提供される組成物中のアデノウイルスは、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４コード領域の任意の１箇所以上に欠失を含む。例えば、アデノウイルスはＥ１コード領域における欠失を含む。異種核酸分子は、欠失領域の任意の１箇所以上に挿入しても、包含させてもよい。
ここで提供する容器の例において、組成物は核酸分子を含む送達剤を含む。例えば、ウイルスに関して、核酸分子はそのゲノムに対して異種のものである。ある例においては、核酸分子は、ポリペチドをコードする任意の核酸分子であり得る。コードされたポリペチドは酵素、ホルモン、凝固因子または凝血因子、増殖因子、抗体またはその部分、血管形成モジュレーター、免疫調節剤、疼痛モジュレーター、受容体、輸送タンパク質、制御タンパク質、抗原およびアレルゲンであり得る。例えば、コードされたポリペチドはインターロイキン、インターフェロン、増殖因子またはその部分および増殖因子受容体またはその部分である。ここでの容器中に提供される組成物中の核酸分子の例は、アデノシンデアミナーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(ＣＴＦＲ)、ガルスルファーゼ、ラロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、酸アルファグルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、インスリン、甲状腺ホルモン、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン−１(ＩＬ−１)、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、インターフェロン−α(ＩＦＮ−α)、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ｆｌｔ３)、ニューロピリン−２(ＮＰ２)、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、トランスフォーミング増殖因子αまたはβ、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、線維芽細胞増殖因子受容体(ＦＧＦＲ)、ＦＧＦＲアンタゴニスト(ｓＦＧＦＲ)、トランスフォーミング増殖因子受容体(ＴＧＦＲ)、血管内皮細胞増殖因子受容体(ＶＥＧＦＲ)、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、第VIII因子、第IX因子、フォン・ヴィルブランド因子、成長ホルモン、メタロプロテイナーゼトロンボスポンジンモチーフ１(ＭＥＴＨ−１)、ＭＥＴＨ−２、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ(ＴｒｐＲＳ)フラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、色素上皮由来因子(ＰＥＤＦ)、バソスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲン−Ｅフラグメント、トロンボスポンジン、タムスタチン、カンスタチン、レスチン、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１(ｓＦｌｔ−１)、可溶性血管内皮細胞増殖因子受容体(ｓＦｌｋ)、可溶性ニューロピリン−１(ｓＮＲＰ１)、インターフェロンガンマ誘発タンパク質１０(ＩＰ−１０)、血小板第４因子(ＰＦ−４)、Gro-beta、可溶性エフリンＢ型受容体４(ｓＥｐｈＢ４)、セフリンＢ２、ＩＧＦ−１、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ＨＳＶ−ＴＫ)、カルボキシペプチダーゼＧ２(ＣＰＧ２)、カルボキシルエステラーゼ(ＣＡ)、シトシンデアミナーゼ(ＣＤ)、チトクロムＰ４５０(ｃｙｔ−４５０)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)、ニトロレダクターゼ(ＮＲ)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ＰＮＰ)、チミジンホスホリラーゼ(ＴＰ)、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(ＶＺＶ−ＴＫ)、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通型タンパク質、システイントランスポーター、酸セラミダーゼ、酸α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸β−グルコシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ、酸β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α−マンノシダーゼ、酸β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ニーマン・ピック病Ｃ１型(ＮＰＣ−１)、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)、アセチル−ＣｏＡ：αグルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、酸リパーゼ、ネプリライシン、インスリン分解酵素インスリジン、thimetオリゴペプチダーゼ、カルビンディンＤ２８、パルブアルブミン、低酸素症誘発因子１−アルファ(ＨＩＦ１−アルファ)、サーチュイン−２(ＳＩＲＴ−２)、生存運動神経タンパク質−１(ＳＭＮ−１)、ＳＭＮ−２、グリア細胞由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、毛様体神経栄養因子(ＣＮＦ)、低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬＲ)、リポタンパク質リパーゼ(ＬＰＬ)、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)、ＵＤＰ−グルクロニル−トランスフェラーゼ群(ＵＧＴ)、ＵＧＴ１Ａ１、グルコース−６ホスファターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチニダーゼ、ベータ−グルコセレブロシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(ＰＢＤＧ)またはｐ５３をコードするものを含むが、これらに限定されない。
いくつかの場合には、ここに提供する容器中の組成物は、動物における筋肉生産量を増やす、動物における毛生産量を増やす、動物における羊毛生産量を増やす、動物の成長を促すまたは栄養素合成もしくは利用に関わるポリペプチドをコードする。コードされたポリペチドはミオスタチン阻害因子、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、成長ホルモン放出因子、ニワトリＳｋｉ、セリントランスアセチラーゼまたはｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼであり得る。具体例において、ミオスタチン阻害因子はフォリスタチンである。
別々の葉および各葉への血液供給を図示する肝臓の解剖図である。肝臓は伝統的に左葉、右葉、尾状葉および方形葉の４個の葉に分割される。ラットの肝臓において、これらの分割された葉は、中葉(１０)、左側葉(１１)、右葉(１３)および尾状葉(１２)である。中葉は横隔膜の直ぐ下に位置する。これは横隔膜に鎌状靱帯を介して固定され、これは小葉間裂溝を形成し、葉を左および右部分に分ける。中葉は総肝臓質量の４０％近くを占める。左側葉は、中葉の下、尾状葉の上に位置する。小葉間靱帯が、左側葉を尾状葉上部に固定する。左側葉は、総肝臓質量のおおよそ３０％を占める。右葉は大静脈(１)の右に位置し、２個の明確に定義された部分である右上葉および右下葉を含む。右上葉は、球形である。その固定要素は肝−横隔膜靱帯である。右下葉は三角形を有し、大静脈を指す先端を有する。右葉は、総肝臓質量の２０％を占める。尾状葉は、左側葉の直ぐ下の大静脈の左に位置する。本葉は、上部尾状葉部分および下部尾状葉部分の２部分に分割される。上部尾状葉は、小葉間靱帯を介して左側葉におよび肝−胃靱帯を介して胃に固定される。尾状葉の下部部分は胃の後部に位置する。尾状葉は総肝臓質量の７％を占める。
肝臓への血流は門脈静脈(６)および肝動脈(５)を介し、これは、肝臓に進入後、右および左に枝分かれして、それぞれの葉に供給される。第一の分枝は、右葉に供給するための右下門脈静脈(７)および右上門脈静脈(８)として右に分枝する。第二の分枝は、尾状門脈静脈(４)として左に分枝し、これは上部尾状葉分枝および下部尾状葉分枝の２個の静脈に分かれる。門脈静脈は、その主二分枝点に至り、中葉の右部分に供給する右中門脈静脈(９)および対応する葉に供給する左中門脈静脈(２)および左側方門脈静脈(３)に供給する左門脈静脈を構成する。肝臓の動脈血流は肝動脈によりもたらされ、肝臓に入ると、葉に供給するために右および左に分枝し、門脈静脈と同じ分布を構成する。
肝機能および脈構造に基づく肝臓のさらなる分割を描く。３個の主肝静脈(右肝静脈、中肝静脈および左肝静脈)がヒト肝臓を４個の区域に分け(右後部、右前部、左内側区および左外側区)、その各々は門脈系の対応する分枝により供給を受ける。門脈静脈の更なる分枝がヒト肝臓を８個の解剖学的に独立した亜区域に分け、その各々それら自体の遠心性肝静脈系、求心性門脈静脈系、求心性動脈系および胆管系を有する。亜区域ＩおよびIVは左内側区域に対応し、亜区域IIおよびIIIは左外側区域に対応し、亜区域ＶおよびVIIIは右前部に対応し、亜区域VIおよびVIIは右後部に対応する。
静脈内投与により大静脈に(図２Ａ)または間質性投与により茎クランプで尾状葉を通る血流を遮断しながら尾状葉の実質に(図２Ｂ)組み換えアデノウイルスを送達したときのルシフェラーゼ活性の比較を記載する。結果は、一時的区画化後の尾状葉でのみルシフェラーゼの発現を示す。
本区画化方法により送達したときの体循環におけるアデノウイルスＤＮＡの存在を示す。特に、図３Ａは、３０分または６０分後に尾状葉の血管隔離を停止したときアデノウイルスＤＮＡの存在は認められないが、アデノウイルスＤＮＡは、７分または１５分後に尾状葉の血管隔離を停止したときには全身的に検出されたことを示す。図３Ｂは、３０分血管隔離 (茎クランプを用いる)の開始および停止後のアデノウイルスＤＮＡの存在動態を示す。結果は、アデノウイルス注射１分、３分および５分後(クランプ使用中)およびクランプ解放１分、３分および５分後(クランプ解放後)末梢血中にアデノウイルスＤＮＡが存在しないことを示す。
血管隔離中のラット尾状葉への種々の投与量の組み換えアデノウイルスの実質投与による尾状葉のルシフェラーゼ活性レベルを示す。点線は、何れかの投与量で同じベクターの静脈内点滴により達成された発現の最大量を示す。結果は、血管隔離が核酸発現を顕著に増加させ、ウイルスベクターの投与量に基づき用量依存的に制御されたレベルのタンパク質発現を提供することを示す。
肝臓遺伝子治療の区画化モデルにおいて、血管隔離中にラットの尾状葉に組み換えアデノウイルスを実質投与後１年間の尾状葉における持続性ルシフェラーゼ発現を示す。
区画化尾状葉への組み換えアデノウイルスの送達または静脈内への組み換えアデノウイルス送達(IV)により、肝臓の葉で誘発されたサイトカイン(ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＴＧＦβおよびＩＬ−６)の発現レベルを示す。β−アクチンの発現をポジティブコントロールとして使用した。結果は、静脈内にアデノウイルスを投与された群の全葉における強いサイトカイン発現を示す。アデノウイルスを区画化葉に投与された群においては、制御されたサイトカイン発現が尾状葉でのみ観察された。
実質クランプで血流を遮断しながら、ブタの左中葉の実質に組み換えアデノウイルスを送達後、注射部位から近位、中位および遠位の部位での左中葉(ｃｏｍｐ；注射部位)、左側葉、右側葉および右中葉からの組織サンプルにおけるルシフェラーゼ遺伝子発現を示す。結果は、注射部位のみでルシフェラーゼ発現を示す。
ラット肝臓の区画化尾状葉へのアルファフェトプロテイン(ＡＦＰ)をコードする組み換えアデノウイルス送達７日間後のラット血清におけるＡＦＰタンパク質レベルを示す。
詳細な記載
概要
Ａ. 定義
Ｂ. 核酸送達および遺伝子治療
１. 現存する遺伝子治療方法
２. 区画化された組織または臓器への直接送達
Ｃ. 核酸送達の区画化方法
１. 組織または臓器の区画化
ａ. 肝臓
ｂ. 他の臓器
２. 送達剤投与による核酸送達
ａ. 送達方法および投与経路
ｂ. 送達を促進するための方法
ｃ. 投与量および送達レジメン
３. 区画化の終了／解放
Ｄ. 送達剤
１. 核酸分子
２. 核酸分子を含む媒体および構築物
ａ. ウイルスおよびウイルスベクター
ｉ. アデノウイルス
ii.アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)
iii. レトロウイルス
iv. レンチウイルス
ｂ. 非ウイルスベクター
ナノ粒子
ｃ. 全細胞
３. 遺伝子治療剤の例
Ｅ. 組成物、系およびキット
１. 投与製剤
２. 組み合わせ
３. 製品およびキット
Ｆ. 送達、発現または有効性の評価
１. 送達剤のモニタリング
２. 宿主毒性および免疫活性化
Ｇ. 適用および使用方法
１. 疾患および障害処置
ａ. 血友病ＡおよびＢ
ｂ. 家族性高コレステロール血症
ｃ. Ｉ型糖尿病
ｄ. アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損
ｅ. 血管形成および癌
ｆ. 自己免疫性および炎症性障害(例えば多発性硬化症)
ｇ. 急性間欠性ポルフィリン症(ＡＩＰ)
ｈ. サンフィリポ症候群(ムコ多糖症III型；ＭＰＳ III)
ｉ. リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)
２. タンパク質発現および製造
３. 獣医および農業用途
Ｈ. 実施例
Ａ. 定義
特に断らない限り、ここで使用する全ての技法および科学用語は、本発明が属する技法分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の全体にわたり記載されている全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Genbank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公開された資料は、特に断らない限り、その全体を引用により本明細書に包含させる。ここでの用語について複数の定義が存在するならば、本章のものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスが引用されているとき、このような識別子は変わることがあり、インターネット上の特定の情報は導入され、また削除され得るが、同等の情報をインターネットでの検索により取得することができる。それらの引用は、当該情報の利用可能性および公的流布を証するものである。
組織または臓器またはその部分に関して、ここで使用する“区画化”または“区画化された”またはその文法的変異(ここではまた循環性隔離または脈管構造隔離とも呼ぶ)は、体循環からの組織または臓器またはその部分の隔離を意味する。隔離は、組織または臓器またはその部分を横切り、体循環に注がれる、接続するまたは他に連絡している１個以上の、一般的に全ての動脈、静脈、導管または血管の遮断または閉塞により達成される。組織または臓器の区画化は、組織または臓器または組織または臓器の部分もしくは領域への血流の停止または抑止により特徴付けら得る。区画化は、体循環を介する組織および臓器または組織または臓器の部分もしくは領域と体の残りの部分の間の連絡または接続を中断する。区画化は、閉塞用バルーンカテーテル、バンド、止血帯またはクランプを使用するような、動脈、静脈、導管または血管の１個以上を遮断または閉塞するあらゆる方法で達成できる。
ここで使用する“組織または臓器またはその部分への血流は減少するかまたは排除される”との制限または類似するこのような用語は、組織または臓器またはその部分に繋がるまたは通り抜ける動脈、静脈、導管および／または血管からの血液供給または血流に妨害または遮断があり、それにより組織または組織の部分が、血中に含まれて運搬される物質の利用を剥奪されることを意味する。このような遮断は、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に無酸素または虚血をもたらす。組織または臓器への血流の減少または消失のモニターは当業者のレベルの範囲内である。例えば、血流の減少または消失は組織の色；墨汁または他の報告すべき色素を使用した電子常磁性共鳴(ＥＰＲ)酸素測定；組織分光器(ＴｉＳｐｅｃ)の使用；灌流磁気共鳴画像法、陽電子放出断層撮影、近赤外(ＮＩＲ)スペクトロスコピー、光学ドップラー断層撮影、超音波および他の当業者に知られた方法の使用に基づく。本発明方法の目的で、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分への血流は、組織または臓器またはその部分の区画化中、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％より多く、最大約または正確に１００％減少しなければならない。
ここで使用する“体循環”または“全身循環”は、酸素化された血液を左心室から体組織に運搬し、静脈血を右心房に戻す全身循環をいう。
ここで使用する臓器または組織は、特定の機能を発揮する対象の身体の分化した部分をいう。組織は、一般的に、一体となって特殊化した機能を形成する特殊化した細胞の群をいう。例えば、筋肉組織は、収縮できる特殊化した組織である。臓器は、機能を果たす組織で形成される。臓器の例は、眼、耳、肺、肝臓、腎臓、心臓または皮膚を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する“組織または臓器の部分”なる用語は、対象の組織または臓器の部分をいう。該部分は、領域、区域、葉、切片または組織または臓器のその他の部分であり得る。該部分は、一般的に組織または臓器の残りから、該部分の区画化を可能にするために、残りの組織または臓器から離れて移動または遊離できるものである。本薬剤の送達を行うのに十分な部分でもある。区画化および／または本薬剤の送達を行うのに十分な適当なサイズの組織または臓器の部分を決定するのは当業者の技法の範囲内であり、特定の臓器、区画化に使用する機器、処置適応症、投与量、対象のサイズおよび他のパラメータによる。典型的に、組織または臓器の部分は、少なくとも約５mm３、１０mm３以上の体積を有する。例えば、本部分は、０.５cm〜２５cmの範囲の長さ、０.５cm〜２０cmの範囲の高さ(または厚さ)および／または０.５cm〜１５cmの範囲の深さを有する、組織または臓器の何れかの領域であり得る。一例として、肝臓葉の部分または区域は、５cm〜１０cmの長さ、１cm〜３cmの高さおよび１.５cm〜３cmの深さ(先端から)を有する。該部分が区画化可能である限り、小さい領域または部分も意図される。
ここで使用する区画化に関連した連絡の回復は、組織または臓器との体循環の接続が回復または再開するように、組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分の区画化が終了する過程を言う。これは、組織または臓器またはその部分を通り抜ける動脈、静脈、導管または血管の１個以上および一般的に全てを遮断または閉塞するのに使用したデバイス、装置または方法の除去により達成できる。
体循環との連絡を回復させる前の区画化の終了に関してここで使用する所定時間は、以前に知られ、制御できる一定時間を意味する。典型的に、所定時間は、少なくとも正確にまたは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％以上の送達剤が、組織または臓器の実質の細胞(例えば肝臓の肝細胞)の細胞内にある、送達剤の投与または送達に十分な時間である。一般的に、このような時間は、１０％、５％以下の送達剤が区画化終了による連絡回復後体循環に存在する時間である。このような時間は当業者が経験的に決定でき、例えば、特定の標的臓器および送達剤の関数である。具体例において、所定時間は、区画化開始および／または送達剤投与後、少なくとも約または正確に１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分または６０分である。所定時間は、細胞による送達剤の取り込みを増加させる方法、機構または手法により制御できる。このような方法は当業者に知られ、ここに記載する。それゆえに、ある例においては、所定時間は１５分以下、例えば５分〜１５分である。
ここで使用する実質は、臓器の特異的機能を実行し、臓器の大部分を構成する、組織の部分および臓器の関連細胞をいう。それゆえに、実質は、臓器の主たる基本機能を実行する組織である。これらは、上皮性組織、筋肉組織、神経組織およびそれらの関連細胞を含み得る。実質は、結合組織、血管、神経および導管である間質と異なる。それゆえに、実質は結合組織、血管、神経および管を含まない。例えば、肝臓の実質は肝細胞を含み、心臓の実質は筋細胞のような心筋細胞を含み、腎臓の実質はネフロンを含む。皮膚の実質は表皮である。
ここで使用する“実質細胞”は、組織または臓器の実質に含まれるまたは構成する細胞をいう。例えば、肝細胞は、肝質量の７０〜８０％を構成する、肝臓の主組織の細胞である。肺において、全肺細胞の７５％が実質に含まれる。これらは、例えば、間質の線維芽細胞および１型および２型細胞(肺細胞)および刷子細胞のような肺胞を裏打ちする上皮性細胞を含む。皮膚において、実質に見られる細胞は、ケラチン生成細胞のような上皮細胞を含む。当業者は、種々の組織および臓器の実質およびその中の細胞を熟知している。
ここで使用する実質投与は、組織または臓器の実質への投与をいう。実質への投与は、典型的に注射または毛管拡散による。
ここで使用するクランプは、臓器、血管または組織のような構造を圧迫するのに使用する外科的デバイス類をいう。クランプは、一般的に構造を圧迫するために、該構造の逆側に圧または力をかけるために使用しまたは調節できる反対の側または部分を有する。クランプは、鋸歯状顎、締め付けハンドルおよび／または空気注入式バルーンを有し得る。一般的に、クランピング力または圧を調節できる。
ここで使用する“実質クランプ”は、組織または臓器の実質を圧迫できるクランプをいう。実質クランプは茎クランプを含む。
ここで使用する腹腔鏡手術は、小切開(例えば０.５〜１.５cm)によって行い、腹腔鏡を使用する手術をいう。
ここで使用する“送達剤”は、遺伝子治療用核酸分子を含み、核酸分子の細胞への挿入および／またはその発現を促進する、本薬剤または導管、例えば媒体、ベクターまたは構築物をいう。それゆえに、送達剤は、対象に投与され、その中に包含されたまたは結合した核酸分子を含む、物である。送達剤の例は、ウイルス、ウイルス様粒子、ミニサークル、プラスミドまたはベクター、リポソームおよび／またはナノ粒子を含むが、これらに限定されない。例えば、送達剤は、宿主対象への送達のための、核酸分子または他の薬剤、例えばここに提供する非ウイルスベクターまたはウイルスと結合した、脂質ベースまたは他のポリマーベースの組成物、例えばリポソーム、ミセルまたは逆ミセルを含み得る。ある例においては、ネイキッドＤＮＡが送達剤であり得る。送達剤の取り込みは、エレクトロポレーション、ソノポレーションまたは“遺伝子銃”のような種々の機械的手法の使用によりさらに増加または促進できる。
ここで使用する“遺伝子療法”または“遺伝子治療”は、このような治療が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトのある細胞、標的細胞への、異種ＤＮＡのような核酸分子の伝達を含む。ＤＮＡを、該異種ＤＮＡが発現され、それによりコードされる治療的生産物が産生されるような方法で選択標的細胞に導入する。あるいは、異種ＤＮＡは、治療的生産物をコードするＤＮＡの発現をある程度仲介し、それが、治療的生産物の発現を直接的または間接的にある程度仲介する産物、例えばペプチドまたはＲＮＡをコードできる。遺伝子療法を使用して、欠損遺伝子を置き換えるための遺伝子産物をコードする核酸を送達するか、またはそれが導入された哺乳動物または細胞により産生される遺伝子産物を補うこともできる。導入された核酸は、哺乳動物宿主で通常産生されないまたは治療有効量でもしくは治療上有用な時期に産生されない治療化合物(例えばその増殖因子阻害剤または腫瘍壊死因子またはその阻害剤、例えばそのための受容体)をコードできる。治療的生産物をコードする異種ＤＮＡを、その産生または発現を促進するまたは他に変えるために、罹患宿主の細胞に挿入前に修飾できる。
ここで使用する核酸分子は、一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)およびリボ核酸(ＲＮＡ)、ならびにＲＮＡまたはＤＮＡのアナログまたは誘導体をいう。また用語“核酸”には、核酸のアナログ、例えばペプチド核酸(ＰＮＡ)、ホスホロチオエートＤＮＡおよび他のこのようなアナログおよび誘導体が含まれる。核酸類は、例えば、ポリペプチド、制御ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)および機能的ＲＮＡのような、遺伝子産物をコードできる。それゆえに、核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)、プラスミドおよび修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含むＤＮＡを含む、全てのタイプおよびサイズのＤＮＡ分子を含むことを意図する。
ここで使用する治療核酸は、治療的生産物をコードするまたは治療効果を生じることができる核酸分子である。産物は、核酸、例えば制御配列または遺伝子であるかまたは治療活性または効果を有するタンパク質をコードできる。例えば、治療核酸は、リボザイム、アンチセンス、二本鎖ＲＮＡ、タンパク質をコードする核酸およびその他であり得る。
ここで使用する治療的生産物は、治療効果を生じることができる化合物である。化合物はポリペチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
ウイルスのゲノムに含まれる核酸に関して、ここで使用する異種核酸(外来性核酸または異質核酸ともいう)は、それを発現する生物またはウイルスによりインビボで通常産生されないかまたは別の場所で生物またはウイルスにより産生されるかまたは転写、翻訳または他の制御可能生化学的過程に作用することによりＤＮＡのような内在性核酸の発現の変更を仲介するかメディエーターをコードする核酸をいう。それゆえに、異種核酸は、しばしばそれが導入された生物またはウイルスに対して通常内在性ではない。異種核酸は、同じ生物または同じ種または他の種を含む他の生物における他のウイルスからの核酸分子を意味し得る。しかしながら、異種核酸は、内在性であり得るが、異なる場所から発現されるまたはその発現または配列が変えられた(例えば、プラスミド)核酸である。それゆえに、異種核酸は、ＤＮＡのようなカウンターパート核酸分子がゲノム内で見られる正確な配向または位置に存在しない核酸分子を含む。一般的に、必ずではないが、このような核酸は、それが発現される生物またはウイルスにより通常産生されないか、またはウイルスにおける方法と同じ方法では産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。当業者が核酸が発現されるウイルスに対して異種、外来性または異質であると認識するまたは見なすＤＮＡのようなあらゆる核酸が、ここでは異種核酸に包含される。異種核酸の例は診断剤および／または治療剤を含む外来性ペプチド／タンパク質をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。異種核酸によりコードされるタンパク質は、異種核酸が導入されたウイルス内で発現され、分泌され得るかまたはウイルスの表面上で発現され得る。
ここで使用する検出可能標識または検出可能部分は、原子、分子または組成物の存在が直接的または間接的に測定できる、原子、分子または組成物をいう。検出可能標識を、ここでの送達剤に包含させて使用できる。検出可能標識は、例えば、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種および金属を含む。例えば、検出可能部分は、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、コロイド金、鉄、ガドリニウムおよびガリウム−６７を含む。標識を検出する方法は当分野で周知である。このような標識は、例えば、目視検査、蛍光スペクトロスコピー、反射率測定、フローサイトメトリー、Ｘ線、多様な磁気共鳴方法、例えば磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)および磁気共鳴スペクトロスコピー(ＭＲＳ)により検出できる。検出方法はまたコンピュータ断層撮影(ＣＴ)、計算軸断層撮影(ＣＡＴ)、電子ビームコンピュータ断層撮影(ＥＢＣＴ)、高解像度コンピュータ断層撮影(ＨＲＣＴ)、下環状断層撮影、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、スパイラル断層撮影および超音波断層撮影を含む、任意の多様な断層撮影方法を含む。検出可能標識の直接検出は、例えば、エネルギーのような検出可能標識自体の物理的現象またはＸ線またはＭＲＩのような標識自体の粒子放出または吸収をいう。間接検出は、検出可能標識に直接的または間接的に結合する原子、分子または組成物のエネルギーのような物理的現象または検出可能標識に直接的または間接的に結合する原子、分子または組成物の粒子放出または吸収をいう。間接検出の非限定的例において、検出可能標識は、アビジンとの結合により検出できるビオチンである。非標識アビジンを、非特異的結合を遮断するために全身性に投与し、続いて標識アビジンを全身投与する。それゆえに、検出可能標識または検出可能部分の範囲に包含されるのは、結合可能標識または結合可能部分であり、これは、原子、分子または組成物をいい、ここで、該原子、分子または組成物の存在は、他の原子、分子または組成物に結合する標識または部分により検出できる。
ここで使用するＤＮＡ構築物は、天然では見られない方法で結合し、並置されたＤＮＡのセグメントを含む、一本鎖または二本鎖、直鎖または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は人的操作の結果存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
ここで使用するベクター(またはプラスミド)は、異種核酸の発現または複製のために細胞に導入するために使用する分離した配列をいう。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、遺伝子またはその部分をゲノムの染色体への組込みを行うように設計できる。ベクターは、非ウイルス発現ベクターのような非ウイルスベクターを含む。また意図されるのは、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体のような人工染色体であるベクターである。ベクターはまた“ウイルスベクター”または“ウイルス性ベクター”を含む。このような媒体の選択および使用は当業者に周知である。
ここで使用する発現ベクターは、このようなＤＮＡフラグメントの発現をもたらすことができる、プロモーター領域のような制御配列と操作可能に結合したＤＮＡを発現するベクターを含む。このような付加的セグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含んでよく、所望により１個以上の複製起点、１個以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するかまたは両者の配列を含み得る。それゆえに、発現ベクターは、適当な宿主細胞への導入により、クローン化ＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組み換えウイルスまたは他のベクターのような組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をいう。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞および／または原核細胞で複製可能なものおよびエピソームのままものまたは宿主細胞ゲノムに統合されるものを含む。
ここで使用する“ウイルス”は、宿主細胞無しでは増殖または複製できない、感染実体の大きなグループをいう。ウイルスは、典型的に遺伝物質のＲＮＡまたはＤＮＡコアを囲むタンパク質コートを含むが、半透膜がなく、生存細胞中でのみ成長および増殖できる。ウイルスは、ウイルスゲノムの全てまたは一部を含むベクターが、このような粒子の産生のための適当な細胞または細胞株に導入されたようなときに形成されるものを含む。得られたウイルス粒子は、インビトロまたはインビボでの核酸の細胞への伝達を含むが、これに限定されない多様な用途がある。それゆえに、ウイルスは、パッケージされたウイルスゲノムである。ウイルスは、単粒子、粒子のストックまたはウイルスゲノムを意味することができる。
ここで使用するウイルスベクターは、ウイルス起源の少なくとも１個の配列を含み、ウイルスベクター粒子またはウイルスにパッケージできる核酸ベクター構築物をいう。ここでいうウイルスベクターは、タンパク質コート内にパッケージされているとき、ウイルスと同義である。ウイルスベクター粒子またはウイルスは、インビトロまたはインビボでのＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸の細胞内への伝達を目的として使用できる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター(例えば、ＨＳＶ)、バキュロウイルスベクター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)ベクター、パピローマウイルスベクター、サルウイルス(ＳＶ４０)ベクター、シンドビスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクターを含むが、これらに限定されない。適切なウイルスベクターは、例えば、米国特許番号６,０５７,１５５、５,５４３,３２８および５,７５６,０８６に記載されている。ウイルスベクターは、典型的に、細胞内への外来性遺伝子の伝達(媒体またはシャトルとして)のために該外来性遺伝子に操作可能に結合した改変ウイルスを含む。
ここで使用する操作的にまたは操作可能に結合したは、ヌクレオチドの制御およびエフェクター配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位および他のシグナル配列と配置された核酸をいうとき、意図される目的のために協力して機能するようなこのような核酸、例えばＤＮＡとこのようなヌクレオチドの配列の相関をいい、例えば、転写はプロモーターにより開始され、ターミネーターに向かいコーディングセグメントを介して進行する。例えば、核酸のプロモーターへの操作的結合は、ＤＮＡとプロモーターの、このようなＤＮＡの転写が、該ＤＮＡを特に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるような、物理的相関をいう。それゆえに、操作可能に結合したまたは操作可能に関連したは、ＤＮＡのような核酸と、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位および他のシグナル配列のようなヌクレオチドの制御およびエフェクター配列の機能的相関をいう。発現および／または転写を最適化するために、転写または翻訳のいずれかの段階で、発現を妨害し得るまたは減少し得る、余分な、不適切な可能性のある、代替翻訳開始(すなわち、開始)コドンまたは他の配列を除去するために、クローンの５’非翻訳部分を除去、付加または改変する必要があるかもしれない。さらに、コンセンサスリボソーム結合部位を、開始コドンの５’に隣接して導入でき、発現を増強できる(例えば、Kozak J. Biol. Chem. 266: 19867-19870 (1991)およびShine and Delgarno, Nature 254(5495):34-38 (1975)参照)。このような修飾の望ましさ(または必要性)は経験的に決定できる。
ここで使用するアンチセンスは、興味のある遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)に相補的であり、それを不活化する核酸(ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的アナログ)である。
ここで使用する低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)は、遺伝子発現を妨害できる、２０〜２５ヌクレオチド長二本鎖ＲＮＡ分子のクラスをいう。
ここで使用するアプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、細胞または組織のような標的と結合するオリゴヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)をいう。アプタマーを改変し、試験管内進化法(ＳＥＬＥＸ)を使用するような、インビトロ選択方法により標的分子に対して選択できる。種々の標的に対するアプタマーは当業者に知られる。
ここで使用するリボザイムは、それらが特異的配列で他のＲＮＡ分子を開裂を可能にする独特のヘアピンまたはハンマーヘッド型活性中心および独特の二次構造を有するＲＮＡ分子をいう。リボザイムは天然リボザイムならびに任意のＲＮＡ分子を開裂するために改変または設計されたリボザイムを含む。
ここで使用するウイルス様粒子(ＶＬＰ)は、ウイルスに似ているが、ウイルス遺伝子物質をなんら含まない非感染病原体をいう。例えば、ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質(例えば外被またはカプシド)の発現から集合できる。ＶＬＰは、パルボウイルス科(例えばアデノ随伴ウイルス)、レトロウイルス科(例えばＨＩＶ)およびフラビウイルス科(例えばＣ型肝炎ウイルス)から産生されるものを含む。
ここで使用するミニサークルはエピソームであり、細菌プラスミド骨格を欠く環状発現カセットとして産生される、小環状プラスミドまたはＤＮＡベクターをいう。これらは、異種核酸および２個のリコンビナーゼ標的部位を含む親細菌プラスミドから、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼのような部位特異的リコンビナーゼを使用する分子内(ｃｉｓ−)組換えにより産生できる。２個の部位の間の組換えはミニサークルおよび残存ミニプラスミドを産生する。ミニサークルは、ミニプラスミドから別々に回収できる。当業者はミニサークルおよびその製造方法を熟知する。
用語“ネイキッド”ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈降剤を含む、細胞への挿入を助ける、促進するまたは推進するために働くあらゆる送達媒体、複合体または薬剤がない配列をいう。
ここで使用するウイルス粒子(ＶＰ)は、生死が合わさったウイルス粒子の総数をいう。ウイルス粒子の数は、精製ウイルスストックからＯＤ２６０アッセイを使用して決定できる。
ここで使用するプラーク形成単位(pfu)または感染単位(ＩＵ)は、感染性または生存ウイルスの数をいう。それゆえに、調製物中の活性ウイルスの量を繁栄する。pfuは、当業者に知られた標準アッセイであるプラーク形成アッセイまたは終点希釈アッセイを使用して決定できる。
ここで使用する“アデノウイルスベクター”および“アデノウイルス性ベクター”は交換可能に使用し、アデノウイルスゲノムの全てまたは一部を含むポリヌクレオチドを意味することが当分野で十分理解されている。アデノウイルスベクターは、完全ゲノムまたは修飾ゲノムをコードする核酸または細胞に伝達されたとき、特に粒子としてパッケージされたとき、異種核酸の導入に使用できるものをいう。アデノウイルスベクターは、ネイキッドＤＮＡ、アデノウイルスカプシドに被包されたＤＮＡ、他のウイルスまたはウイルス様形態にパッケージされたＤＮＡ(例えば単純ヘルペスおよびＡＡＶ)、リポソームに被包されたＤＮＡ、ポリリシンと複合体化したＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体化したＤＮＡ、トランスフェリンとコンジュゲートしたＤＮＡ、分子を免疫学的に“マスク”するためにおよび／または半減期を延長するためにＰＥＧのような化合物と複合体化したＤＮＡまたは非ウイルスタンパク質とコンジュゲートしたを含むが、これらに限定されない数種の形態のいずれでもよい。
ここで使用する用語“アデノウイルス”または“アデノウイルス粒子”は、全ての群、亜群および血清型を含む、ヒトまたは動物に感染するあらゆるアデノウイルスを含む、アデノウイルスとして分類できる任意のおよび全てのウイルスを含むために使用する。文脈によって、“アデノウイルス”の記載はアデノウイルスベクターを含み得る。少なくとも５１種の血清型のアデノウイルスが存在し、これは数亜群に分類される。例えば、亜群Ａは、アデノウイルス血清型１２、１８および３１を含む。亜群Ｂはアデノウイルス血清型３、７、１１ａ、１１ｐ、１４、１６、２１、３４、３５および５０を含む。亜群Ｃはアデノウイルス血清型１、２、５および６を含む。亜群Ｄはアデノウイルス血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、１９ｐ、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、４２〜４９および５１を含む。亜群Ｅはアデノウイルス血清型４を含む。亜群Ｆはアデノウイルス血清型４０および４１を含む。それゆえに、ここで使用されるアデノウイルスまたはアデノウイルス粒子は、パッケージされたベクターまたはゲノムである。ここでの目的のために、ウイルスは、典型的にゲノム内に異種核酸分子を含み、アデノウイルスベクターがアデノウイルスカプシドに封入されたときに形成される、組み換えアデノウイルスである。
アデノウイルスに包含されるのは、全ての群、亜群および血清型を含む、ヒトまたは動物に感染するあらゆるアデノウイルスを含む、アデノウイルスとして分類できる任意のおよび全てのウイルスである。それゆえに、ここで使用する“アデノウイルス”および“アデノウイルス粒子”は、特に断らない限り、ウイルス自体およびその誘導体をいい、全血清型および亜群および天然に存在するおよび組み換え形態を包含する。包含されるのは、ヒト細胞に感染するアデノウイルスである。アデノウイルスは野生型であってよくまたは当分野で知られる種々の方法でまたはここに開示するとおり修飾されていてよい。このような修飾は、感染性ウイルスを製造するための、粒子内にパッケージされたアデノウイルスゲノムへの修飾を含むが、これらに限定されない。修飾の例は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４コード領域の１箇所以上の欠失のような当分野で知られた欠失を含む。修飾の他の例は、アデノウイルスゲノムのコード領域の全ての欠失を含む。このようなアデノウイルスは“ガットレス”アデノウイルスとして知られる。本用語はまた、あるタイプの細胞または組織で優先的に複製するが、他のタイプでは複製の程度が少ないかまたは複製しないウイルスである、複製コンディショナルアデノウイルスも含む。
ここで使用する“ターゲティング分子”または“ターゲティングリガンド”は、タンパク質、炭水化物、脂質または他のこのような部分を含むが、これらに限定されない、細胞表面分子と結合するあらゆるタンパク質、ポリペチドまたはその部分をいう。ターゲティングリガンドは、増殖因子、サイトカイン、接着分子、神経ペプチド、タンパク質ホルモンおよび一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)を含むが、これらに限定されない。
ここで使用するナノ粒子は、正確にまたは約１〜１０００ナノメートル(nm)、例えば１〜１００nmの顕微鏡的サイズであり、輸送および特性の点で全体単位として行動する分子の送達のためのコロイド性粒子である。ナノ粒子は、分子が吸収され、溶解されまたはマトリックスをとおして分散している一体化ナノ粒子(ナノ球体)および分子が殻様壁により囲まれた水性または油性コアに限局しているナノカプセルを含む。あるいは、分子が表面またはマトリックス内に共有結合できる。ナノ粒子は、例えば、リポソーム、デンドリマー、重合体ミセル、ナノカプセル、ナノ球体および固形脂質ナノ粒子を含む。一般的に、ナノ粒子は生体適合性および生分解性物質、例えば天然または合成ポリマー(例えばゼラチン、アルブミン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノアクリレート)または固形脂質から成る。ナノ粒子は、外側に結合したターゲティング分子を含むものを含む。
ここで使用する部分にコンジュゲートした化合物は、部分に結合した化合物を含む、複合体をいい、ここで、該化合物と該部分の間の結合は、１個以上の共有結合または非共有相互作用、例えば水素結合または静電相互作用に起因する。コンジュゲートはまた本化合物を本部分に連結するリンカーも含み得る。化合物の例は、ナノ粒子およびシデロホアを含むが、これらに限定されない。部分の例は、検出可能部分および治療剤を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する、送達剤、例えばウイルスに関する指向性は、カプシドタンパク質、例えば繊維タンパク質および／またはペントンにより粒子上に与えられる選択的感染性または結合をいう。
ここで使用する、細胞に関する“挿入”、“取り込み”または“進入”は、これにより送達剤が細胞に導入される過程をいう。それゆえに、このような用語は、送達剤が細胞内に位置することを意味する。
ここで使用する形質導入は、ウイルスによる細胞への遺伝子物質の伝達をいう。
ここで使用する、送達核酸分子に関する“持続性”発現は、核酸の臓器への導入後の、ピーク発現の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上が観察される時間をいう。典型的に、コードされたタンパク質が６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１６ヶ月、２４ヶ月以上の長さの期間発現されるならば、発現は持続性である。
ここで使用する用語プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始を担うＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分をいう。プロモーター配列は、一般には、しかし、常にではないが、遺伝子の５’非コーディング領域に見られる。
ここで使用する組み換えＤＮＡ方法を使用する組み換えによる製造は、クローン化ＤＮＡによりコードされたタンパク質の発現のための分子生物学の周知の方法の使用をいう。
あらゆる場所に使用される、対象は脊椎動物、より具体的に哺乳動物(例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラットおよびモルモット)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類およびあらゆる他の動物であり得る。本用語は特定の年齢または性別を意味しない。それゆえに、成熟したおよび生まれたばかりの対象が、雄性であれ雌性であれ、包含されることを意図する。ここで使用する患者または対象は交換可能に使用でき、治療剤を必要とする対象をいうことができる。用語患者または対象はヒトおよび動物対象を含む。治療的、産業的、獣医および農業(例えば、肉生産)使用の両者をここに開示する。
ここで使用する患者はヒト対象をいう。
ここで使用する組成物は任意の混合物をいう。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
ここで使用する組み合わせは、２以上の物質間の何らかの結合をいう。組み合わせは２個以上の別々の物、例えば２個の組成物または２個の収集物であってよく、それらの混合物、例えば、２個以上の物質の単混合物またはこの任意の変形であってよい。組み合わせの要素は、一般的に機能的に結合または関連している。
ここで使用するキットは、所望により他の要素、例えば付加的試剤および組み合わせまたはその要素の使用指示を含む、パッケージされた組み合わせである。キットは、所望により使用指示を含む。
ここで使用する“疾患または障害”は、感染、後天性状態、遺伝性状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、特定可能な症状により特徴付けられる、生物における病態をいう。
ここで使用する“核酸により処置可能な疾患または障害”は、病因または疾患または状態に関連するまたは包含される遺伝子発現を変えること(増加または低減)により、疾患または状態を回復させるために遺伝子産物を発現することにより、または疾患または状態において欠損または不在である遺伝子産物の置換により、外因的に送達した核酸による処置に適しているあらゆる疾患または障害をいう。それゆえに、核酸により処置可能な疾患または障害は、例えば、欠損または不在の遺伝子産物の置換によりまたは外因的に治療剤または産物を投与することにより、遺伝子欠損を処置することを含む、既知遺伝子治療方法および適用を包含することを意図する。当業者は、このような疾患および障害を熟知している。核酸により処置可能な疾患および障害の例は、ここに記載する。
ここで使用する、疾患または状態を有する対象の“処置”は、処置後に対象の症状が一部または完全に軽減するかまたは変化がないままであることを意味する。それゆえに、処置は予防、治療および／または治癒を含む。予防は、可能性がある疾患の予防および／または症状悪化または疾患進行の予防をいう。
ここで使用する処置は、状態、障害または疾患の症状または他の適応症が、回復するまたは他に有利に変わるあらゆる方法を意味する。
ここで使用する治療効果は、疾患または状態の症状を変える、典型的に改善または回復させるまたは疾患または状態を治癒する、対象の処置に起因する効果を意味する。治療有効量は、対象への投与後に治療効果を生じる組成物、分子または化合物の量をいう。
ここで使用する医薬組成物または他の治療剤の投与によるような処置による特定の疾患または障害の症状の改善は、組成物または治療剤の投与に起因し得るまたは関連し得る、症状の、永続性であれ一過性であれ、持続性であれ一時的であれ、何らかの軽減をいう。
ここで使用する予防または予防は、疾患または状態を発症する危険性が軽減する方法をいう。
ここで使用する有効量は、疾患または障害の症状の予防、治療、回復、停止または一部停止に必要な治療剤の量である。
ここで使用する単位投与形態は、当分野で知られるとおり、ヒトおよび動物対象に適切であり、個々にパッケージされた物理的に分離された単位である。
ここで使用する直接投与は、さらなる希釈なしの投与をいう。
ここで使用する単回投与製剤は、直接投与用製剤をいう。
ここで使用する複数回投与製剤は、反復投与において使用するための製剤をいう。
ここで使用する“製品”は、製造および販売されている産物である。
本明細書をとおして使用される、本用語は、パッケージ物に含まれる送達剤、例えば、アデノウイルス粒子を包含することを意図する。
ここで使用する単数表現は、文脈から他の解釈が必要でないかぎり、複数も含む。それゆえに、例えば、“細胞外ドメイン”を含む化合物への言及は、１個または複数個の細胞外ドメインを有する化合物を含む。
ここで使用する用語“または”は、明示的に代替物しか示さないまたは代替物が相互排他的ではない限り、“および／または”を含む。
ここで使用する範囲および量は、“約”特定の値または範囲として表すことができる。約はまた正確な量も含む。それゆえに、“約５塩基”は“約５塩基”およびまた“５塩基”を意味する。
ここで使用する“任意”または“所望により”は、その後に記載された事象または条項が起こるかまたは起こらないことを意味し、本記載は該事象または状況が起こる例および起こらない例を含む。例えば、所望により置換されていてよい基は、その基が置換されていないまたは置換されていることを意味する。
ここで使用するあらゆる保護基、アミノ酸類および他の化合物についての略語は、特に断らない限り、その一般的使用、認識された略語またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature ((1972) Biochem. 11:1726参照)に従う。
開示を明確にするために、そして限定せずに、詳細な記載は下記小区分に分ける。
Ｂ. 核酸送達および遺伝子治療
ここに提供されるのは、全身循環からの臓器の血管隔離により、全身脈管構造から区画化されている臓器または臓器の部分へ、送達剤(核酸分子であるかそれを含む)を対象に送達する方法である。特に、ここに提供されるのは、外来性に送達された核酸分子の発現が、臓器またはその部分への送達剤(核酸分子であるかそれを含む)の投与により、該臓器またはその部分が一時的に区画化(すなわち、血管を奪われているまたは隔離されている)されているとき、持続性および安定であり得るとの発見に基づく方法である。さらに、核酸送達の区画化方法の実施は、先に達成されなかった直線的動態学的投与量−応答を達成する。送達される核酸分は、対象への治療ポリペチドをコードする核酸を含む治療核酸であり得る。それゆえに、本方法は、選択ポリペチドのインビボでの細胞性発現に使用できる。ある例においては、本ペプチド剤は、ポリペチドが対象における障害または状態を処置するかまたは回復させるかまたは他の点で対象のクオリティ・オブ・ライフを改善する、治療現場で有用であり得る。他の例において、本ペプチド剤は、農業現場で、例えば、肉生産の質または量を改善する適用で有用であり得る。
ここに記載する方法は、全身性にウイルスベクターを注入する必要性を無くし(それによりウイルス血症および免疫応答を減らす)、ウイルスベクターの量の著しい減少を可能にし(それにより投与部位の壊死を減らす)、送達される薬剤の量の制御を可能にし、遺伝子発現の量的制御を提供し、そして選択薬剤の持続性発現を提供する、伝統的遺伝子治療方法を越えるいくつかの利点を提供する。
１. 現存する遺伝子治療方法
バイオテクノロジーの基本的挑戦は、インビボで細胞に遺伝子情報を送達する手法の開発である。疾患処置を目的としたまたは生物医学的研究のための体細胞への遺伝子物質の意図した送達は遺伝子治療と呼ばれている。遺伝子治療は、体細胞性および遺伝性遺伝子疾患を含む疾患処置に相当な進歩をもたらす見込みがある。成功するためには、核酸分子は、患部細胞に、有効かつ安全な方法で相当治療上意味のある割合で送達されなければならない。続いて、送達された核酸分子は、不在のまたは部分的または非機能的内在性遺伝子を補い、有利な機能を提供するかまたはドミナントネガティブな内在性遺伝子または感染性生物の遺伝子の活性を遮断する。
現存する遺伝子治療方法は、静脈内注入により核酸分子を組織または臓器に送達する。非ウイルスまたはウイルスベクターを使用した核酸類の静脈内送達は、その広範な適用を妨げているいくつかの問題を伴う。例えば、核酸ベクターの全身性送達は免疫応答を開始させることができ、これは重度の毒性副作用、導入遺伝子産物の中和(例えば発現タンパク質に対する抗体産生による)、核酸またはベクターの細胞取り込み減少、反復注入を必要とする遺伝子発現喪失および／または一過性発現、対象循環に注射すべき高投与量の核酸の必要性、組織損傷、治療中の標的臓器内の圧上昇、ウイルス血症および／または体内の特異的細胞型のターゲティングの困難性をもたらす。これらの問題は、核酸をウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターで送達するときさらに大きくなり得る。さらに、現存する遺伝子治療方法において、ベクター投与量とタンパク質産出量の間に相関関係がない。
例えば、核酸分子を含む送達剤、例えばウイルスの全身投与は、免疫細胞の形質導入および望まない免疫応答の活性化をもたらし得る。食細胞(例えばマクロファージ、好中球)およびナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む異物感染に対する防御の第一線に含まれる生来の免疫細胞が、異物(例えばウイルスベースのベクター)への暴露により活性化される。自然免疫応答の活性化が感染した細胞を殺し、炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン(例えばインターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−１α)を誘発することにより、感染を制限する。サイトカインおよび細胞応答は組織損傷、感染細胞のアポトーシス、他のエフェクター細胞、例えば樹状細胞の動員および適応免疫応答の開始をおこす。血液および組織に存在する抗原提示細胞(ＡＰＣ)、例えば未成熟樹状細胞が異質抗原物質を認識し、取り込み、それによりＮＦ−κＢを活性化するシグナル伝達経路を刺激し、炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌およびＴ細胞活性化分子、例えばＭＨＣ分子および同時刺激分子の上方制御をする。
結果は、細胞性および液性免疫応答の活性化である。液性免疫は、抗原を破壊するために抗原に直接結合し、不活化できる抗体(中和抗体)を産生するかまたは免疫系の他の細胞を活性化する。細胞性免疫は、感染細胞の表面上の異質ペプチドを認識する細胞毒性Ｔ細胞が仲介し、認識されたら、異質抗原を産生するあらゆる細胞が排除される。それゆえに、免疫活性化の結果は、形質導入細胞を排除するエフェクター細胞、例えば細胞毒性Ｔ細胞の活性化ならびに核酸(例えばウイルスベクター)の再投与を阻止する中和抗体を酸性する抗体分泌血漿細胞の産生である。免疫応答の極致およびこのような応答の程度は全身および局所毒性をもたらし得る。
この毒性はまた、送達が広範であり、これによりいくつかの組織または臓器が核酸により形質導入されたとき悪化し得る。このような組織または臓器は毒性を局在化させるために切除できるが、数臓器が形質導入の複数部位を有して含まれるとき、形質導入組織の除去によりすべての有毒作用を処置することは不可能であり得る。核酸の送達が標的臓器の脈管構造を標的としてさえ、望まない免疫応答および毒性が起こり得る。また、臓器全体が有毒作用の標的となり得る。
全身投与では、細胞の十分な形質導入効率を達成し、効率的遺伝子導入を達成するために高投与量が必要である。例えば、ウイルス送達のために、例えば、アデノウイルスベクターの投与のために、１０１０〜１０１３ウイルス粒子(vp)／kg(vp／kg)が投与され、一般的に組織部位での測定可能で再現できる細胞形質導入および発現、例えば肝臓における肝細胞形質導入および発現を達成するために１０１２〜１０１３vp／kgが投与される。高投与量の必要性は、ベクターが組織細胞、例えば肝臓肝細胞に到達する前に免疫応答により血液から除去されるためである。高投与量で、血液および組織の食細胞(例えばクッパー細胞)は飽和となり、高レベル肝細胞形質導入が可能となる。また、核酸の全身性送達は、体中への送達および分配をもたらし、得られた治療が標的部位でしか必要ないならばこれは理想的ではない。このような場合、治療有効性を達成するためにしばしば投与量を上げる必要がある。しかしながら、投与量の増加は、望まない毒性または他の副作用が誘発する可能性を高める。
これらの問題のいくつかを避けるために、送達を臓器またはその部分に局在化させることを試みている他者もいるが、全てのこれらの複雑な状況の取り組みに成功した者はいない。例えば、隔離した静脈または肝動脈への灌流およびその後の肝静脈または動脈閉塞によりウイルスベクター(例えばレンチウイルスまたはアデノウイルス)の送達を肝臓にターゲティングする方法は、肝臓酵素群、サイトカイン、ある種のリンパ球浸潤の上昇および／または非標的化臓器または臓器の部分の汚染をもたらす(例えば米国特許出願番号ＵＳ２００８／００２５９５２、ＵＳ２０１０／００１００６８およびＵＳ２００６／０１８８４８２；Kinoshita et al. (2010) J Surg. Res., 160:47-51参照)。核酸の静脈内送達による肝臓への水力学的遺伝子送達のための方法は、実質細胞への送達を達成するために周囲の実質細胞の原形質膜への“細孔”の形成、また他の臓器の汚染を招き得る。このような方法は、全ての種で有効ではなく、ウイルスベクターに適用可能であることは未だ示されていない(Fabre et al. (2008) Gene Ther., 15:452-62)。さらに、水力学的遺伝子送達方法が有効であるためには流出の阻止が必要であり、そのような侵襲性の手技が臨床的には実現できないことが示されている(Sawyer et al. (2010) Gen Ther., 17:560-4)。主に核酸の直接実質投与および肝内注射に頼る他の方法も、肝臓酵素群上昇、サイトカイン上昇および／または他の臓器またはそれらの部分の汚染をもたらし得る(例えばCrettaz et al. (2006) Hepatology, 44:623-32; Fumoto et al. (2009) Biol. Pharm. Bull., 32:1298-302参照)。
２. 区画化された組織または臓器への直接送達
ここに提供されるのは、脈管構造、リンパおよび／または導管からの隔離により区画化した臓器またはその部分の細胞への送達剤の直接投与による、核酸分子の区画化送達の方法である。本発明方法において、本方法は、１)体循環との連絡を妨げまたは実質的に妨げるために臓器またはその部分へのまたはそこからの血流を遮断する；２)送達剤を組織またはその部分の組織実質細胞に直接投与する；および３)選択した薬剤の細胞内取り込みを可能にするのに十分な時間血管隔離を維持することを特徴とする。これらの特徴の効果は、送達剤、例えばウイルスベクターが、全身免疫応答が開始せず、全身毒性が避けられ、他の非標的化臓器または組織の汚染がないように、全身循環に暴露されないことを可能にする。さらに、送達剤を区画化された組織または臓器の実質細胞に直接投与することにより、細胞取り込みが最大化される。本薬剤の細胞取り込み最大化は、組織または臓器区画化解放により、実質的に全ての送達された核酸分子が細胞における導入遺伝子発現に利用可能であり、体循環に漏れ出る送達剤の量が減少するかまたは排除されることを可能にる。それゆえに、ここに提供する方法は、標的臓器内の所望の細胞のみのターゲティングおよび長時間にわたる導入遺伝子の発現を可能にする。
本方法は、目的とする標的臓器に対して適当であるとして選択した時間区画化した組織または臓器への核酸の送達が、先行技法により利用可能な方法を使用した発現よりはるかに長く、送達される核酸分子の持続性発現を提供する；核酸分子の良好な取り込みおよび発現のために投与される送達剤の量を減らせる；送達剤、例えばウイルスベクターまたは遺伝子改変細胞の全身投与に関わる副作用を避ける；および対象に投与する送達剤の量の調節により、ポリペチド発現量を調節することを初めて提供することの発見に基づく。これらは、遺伝子治療の分野で新しい機会を提供する顕著な改善である。
ポリペプチドをコードする核酸分子の送達のための本方法は、ポリペチドの直接投与の方法を超える利点を提供する。例えば、結果としてコードされたポリペチドの発現が持続性であるために、核酸分子の対象への送達は、処置の中途での反復点滴または注射を必要としない。さらに、ポリペチドが本発明方法において対象自身の形質導入細胞(例えば、肝細胞)により発現されるため、コードされたポリペプチドは適切に翻訳後修飾されている。
さらに、臓器、例えば肝臓の個々の葉または分節への遺伝子送達は有利である。例えば、局所送達は、遺伝子送達の予期しない何らかの有害効果重要ではないかまたは標的化葉除去により容易に処置できることを意味する。本方法において、区画化送達は、組織または臓器の非標的化部分が内部標準として作用することを可能にする。標的化葉の除去も可能にし、それにより標的化葉への遺伝子送達が効果を担っていたことの形式的証明を提供する。
本方法のこれらの性質は、ここで、異種核酸分子を含むアデノウイルス送達薬剤の直接肝臓投与により例示される。ここでの結果は、実質クランピングによる、実質的に全ての投与されたアデノウイルスの細胞取り込みを可能にするのに十分な時間血管隔離または区画化下での肝臓葉の間質性実質細胞へのアデノウイルスの直接投与は、現存する方法を越える多くの利点を示すことを示す。特に、全身注射と比較して、高い効率の肝臓形質導入が観察された。この手法を使用して、持続的で強い遺伝子発現が、免疫抑制無しで達成され、高レベルのタンパク質合成が観察され、１０１１粒子未満、例えば１０１０粒子、１０９粒子、１０８粒子、１０７粒子、１０６粒子、１０５粒子、１０４粒子、１０３粒子以下の低投与量のウイルス投与が、標的化葉または領域における高レベルの導入遺伝子発現に十分かつ有効であった。特に、ここでの結果は、タンパク質産出量を損なうことなく、必要ウイルスが少ないことを示す。結果はまたベクター投与量とタンパク質産出量の間に相関関係があることを示す。例えば、区画化を伴う本投与方法を使用して、少ない量のウイルスベクター(例えば、１０１０粒子未満および１０３粒子、１０２粒子以下ほども少ない)が、投与したウイルスベクター量と発現量の間に正の相関関係を有して、ポリペチド発現をもたらした。また、本方法の実施により、副作用、例えばウイルス血症、炎症性肝臓応答、肝臓サイトカイン発現、一般的肝臓損傷および投与部位壊死および全身毒性が観察されなかった。非毒性および長期導入遺伝子発現を考えると、この手法は、ヒトを含む哺乳動物対象における肝疾患または他の疾患を処置するために、肝臓における導入遺伝子のターゲティング発現による遺伝子治療適用に使用できる。
次のセクションは、ここに提供される核酸送達の区画化方法の手順および本方法の実施のために使用する送達剤および組成物の例をさらに詳述する。本方法において実施できる付加的工程または代替手段の記載は、開示された方法の何れかの特異的方法手順または方法と組み合わせて実施でき、このような組み合わせまたは組み合わせのサブセットが特に意図されている。また下に記載するのは、治療または産業用途、動物用途または農業用途のためのポリペプチドをコードする核酸分子の発現に使用するための区画化送達方法の方法および適用である。本方法において使用する標的化臓器および送達剤を含む種々の工程および試剤は、ここでの記載に基づき、当業者により、送達剤、特定の適用または治療的適応症および特定の対象および他の類似の考察によって何れかの受け入れられる臓器またはその部分への使用のために適合できる。
Ｃ. 核酸送達の区画化方法
ここに提供されるのは、対象への選択された送達剤の投与により核酸分子を送達する方法であって、(１)脈管構造、リンパおよび／または管導系からの隔離またはほぼ完全な隔離により組織、臓器またはその部分を区画化し；(２)選択された送達剤を直接該区画化臓器またはその部分に投与し；(３)区画化を、送達剤投与後十分な時間維持し、隔離を開放し、例えば、臓器またはその部分への血液循環を回復させる各工程を含む方法である。本方法において、組織または臓器またはその部分の区画化は、１０％未満の送達剤が体循環に曝されるおよび／または臓器またはその部分の細胞による８０％を超える選択された送達剤の細胞取り込みを可能にするのに十分な時間、核酸送達剤の投与後維持する。ここで提供する方法は、６０日間を超えて、９０日間を超えて、６ヶ月を超えて、９ヶ月を超えてまたは１年を超えて組織または臓器またはその部分での導入遺伝子産物の持続性発現を提供する。
本方法の実施に際し、所望により、免疫抑制剤を、免疫応答を最小化するかまたは可能性を減らすために、送達剤、例えばウイルスベクターの前および後に対象に投与できる。例えば、細胞毒性リンパ球を抑制する薬剤を投与できる。免疫抑制剤の例は、シクロスポリン(ネオーラル(登録商標)、サンディミュン(登録商標))、プレドニゾン(Novo Prednisone(登録商標)、Apo Prednisone(登録商標))、アザチオプリン(イムラン(登録商標))、タクロリムスまたはＦＫ５０６(プログラフ(登録商標))、ミコフェノール酸モフェチル(セルセプト(登録商標))、シロリムス(ラパミューン(登録商標))、ＯＫＴ３(ムロモナブ CO3(登録商標)、オルソクローン(登録商標))、ＡＴＧＡＭまたはサイモグロブリンを含むが、これらに限定されない。免疫抑制剤が必要か否かの決定は、担当医の技術レベルの範囲内である。有効免疫抑制レジメは当分野で日常的に実施されており、特定のレジメは、例えば、特定の標的臓器、特定の送達剤、特定の遺伝子療法および処置する対象を含む因子による。
ここで提供する核酸の送達方法は、あらゆる哺乳動物対象で実施できる。このような対象の例は、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびヒトを含むが、これらに限定されない。特に、ここに提供する方法はヒトを対象として実施する。特に、本方法は、１８歳未満の小児、例えば乳児、幼児および低年齢の小児であるヒト対象で実施できる。ある例においては、本方法は、子宮内で胎児に実施できる。ここで提供する方法が導入遺伝子産物の持続性で長期の高レベル発現を可能にするため、本方法は、遺伝子産物欠損を補填するためまたは治療剤を外因的に投与するための適用を含む医療適用；移植用臓器の作成；トランスジェニック動物における治療的タンパク質の産生(例えばバイオリアクター)；および農業または動物用途ならびに産業用途を含むが、これらに限定されない多様な適用に使用できる。
ここで提供される対象への核酸送達の区画化方法は１回行っても複数回行ってもよい。例えば、ここで提供する方法はタンパク質製造プロトコル工程中でまたは処置レジメ工程の中で、複数回行ってよい。ある例においては、本明細書の他の場所に記載するとおり、特に高レベルの形質導入または発現が組織または臓器全体で求められるとき、本方法を、複数標的部位での送達を行うために反復する。このような例において、本方法は、一般的に本方法の最初の適用から数分、数時間または数日間以内に反復する。他の例において、本方法は、最初の適用後数週間、数ヶ月または数年後に反復し得る。病理的に必要とするならば、拡大スキームを加え得る。本方法を同じ標的部位に反復する場合には、組織または臓器が先の血管隔離から回復するように十分な時間おく。他の例において、反復するとき、本方法を、先に血管隔離に付されていない標的組織または臓器または領域に適用する。
方法の手順およびその種々の例示的非限定的態様の記載を、次のサブセクションに記載する。
１. 組織または臓器の区画化
ここで提供する方法の第一段階として、組織、臓器またはその部分を、脈管構造系からの隔離により区画化する。ある例においては、区画化はまた導管系および／またはリンパ系からの隔離によりさらに達成される。区画化の開始後、選択された送達剤を投与し、選択された送達剤の細胞取り込みを可能にする十分な時間が経過するまで臓器またはその部分を血管循環を回復させるために解放または終了しない。
任意の組織または臓器またはその部分を、核酸類の送達のためのここでの区画化方法に使用できる。このような組織または臓器は、肝臓、肺、ＣＮＳ(脳または脊髄)、末梢神経系(例えば、神経)、膵臓、胆嚢、内分泌腺(下垂体、副腎、甲状腺など)、心血管臓器(例えば、心臓および血管)、皮膚、泌尿生殖器臓器(腎臓、子宮、子宮頸、前立腺、尿道)、呼吸器系の臓器(例えば、肺または気道)、骨、筋肉および腸を含むが、これらに限定されない。この一覧は網羅的であることを意図せず、当業者はさらなる標的臓器およびその葉を認識する。具体例において、ここでの区画化方法において使用するための組織または臓器またはその部分は肝臓またはその部分である。
一般的に、区画化された組織または臓器またはその部分は、１０％未満および一般的に５％、４％、３％、２％、１％以下の送達剤が体循環に曝されるように十分な時間の血管隔離が受け入れられるものである。一般的に、この所定時間は、実質的に全ての送達剤が組織細胞により取り込まれる、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の送達剤が組織細胞により取り込まれるようなものである。組織細胞による取り込みを可能にし、本送達剤剤の体循環への放出または暴露を妨げる所定時間は、特定の臓器またはその部分、特定の送達剤および組織細胞への直接送達の詳細(例えばエレクトロポレーションの使用)によって定まる。１０％未満の送達剤が体循環に曝されるのに必要な時間を経験的に決定するのは当業者のレベルの範囲内である。例えば、ここに提供するセクションＦは、送達剤送達を評価するためのアッセイおよび方法の例を記載する。ここでの具体例において、臓器またはその部分の区画化は、少なくとも１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分または６０分以上維持する。一般的に、区画化は少なくとも２０分、しかし６０分より長くなく維持する。例えば、臓器またはその部分、例えば肝臓またはその部分の区画化は、少なくとも３０分および一般的に６０分より長くない。それゆえに、特定の送達剤によって、区画化は、短時間臓器組織またはその部分に虚血を生じ得る条件下に維持する。それゆえに、本発明方法において使用する臓器またはその部分は、短時間の虚血が受け入れられるものである。
区画化の開始後に、選択された送達剤を投与する。本発明方法において、区画化は、組織への送達剤の送達の直前に行う。例えば、区画化は、送達剤の送達の最大５分前に、典型的に送達剤の送達の最大４分、３分、２分、１分または３０秒前に開始する。具体例において、血管隔離後の送達剤のより速いまたはより効率的な送達を可能にするために、血管隔離を行うために使用するデバイスを、送達デバイスと適合させるか修飾するか適合可能とし得る。
対象の臓器またはその部分に選択された送達剤を投与するここに提供する方法において、本方法は、臓器またはその部分を通る血流を減少、遮断または隔離するまたは他に組織または臓器またはその部分と循環の接続または連絡を妨げる段階を含む。これは、脈管構造系、管系および／またはリンパ系からの組織または臓器またはその部分の隔離により達成できる。隔離は所定時間であり得る。典型的に、区画化は、所定時間の全虚血を達成する方法により行う。組織または臓器またはその部分を、多数の方法で区画化できる。一例では、隔離は、個々の静脈または動脈を密閉するための１個以上の動脈または静脈クランプ、閉塞用バルーンカテーテルまたは血管ホチキス止めデバイスの使用により達成できる。典型的に、血流を遮断するために、臓器またはその部分に供給される動脈および静脈または管をクランプする。他の例において、血管隔離を、組織を通る血液供給および血流を遮断するための１個以上の実質または茎クランプを使用して実施できる。単血液供給(例えば、臓器またはその部分に供給される動脈および血管が、クランプできる茎内である)を有する臓器またはその部分の合理的隔離のために、単クランプまたは閉塞用バルーンカテーテルが十分である。複合脈管構造または側枝循環を有する他の臓器またはそれらの部分において、複数クランプまたは閉塞用バルーンカテーテルが必要であり得る。脈管構造から組織またはその部分を隔離する方法は当分野で周知であり、組織切除および切断法のような種々の医療手技で使用されている。
組織または臓器の区画化を達成するための方法は、臓器またはその部分を通る血流を遮断するための選択的または非選択的方法を含み得る。例えば、臓器、例えば肝臓の葉、切片または区域の選択的クランピングを実施できる。選択的クランピングの利点は、虚血性傷害が、たとえあったとしても、区画化された選択領域に限定されることである(Chouillard et al. (2010) Annals of Surgical Innovation and Research, 4:2)。
具体例において、区画化は、実質圧迫により達成する。例えば、用手圧迫を、例えば指骨折手法を使用して実施できる。さらなる例において、止血帯、ケーブルまたは結紮デバイスを臓器の領域または部分に適用できる。他の例において、実質クランプを血管、動脈、管またはリンパ管の圧迫に使用し、組織または臓器の領域、葉、切片または区域への血流を遮断する。このようなクランプは、茎クランプおよび臓器の領域または区域を選択的にクランプできる他のクランプを含む。血管隔離および圧排方法に使用するためのクランプは周知であり、当業者が利用可能である。これらは、製造者からの市販のクランプ、例えばAesculap(Center Valley, PA)、Klein Surgical Systems(San Antonio, TX)またはKarl Storz(Germany)を含む。クランプの例は、Kellyクランプ、止血微小鉗子クランプ、ブルドッグクランプ、Debakey-Satinskyクランプ、Longmireクランプ、LinまたはChu肝臓クランプまたはイノクチ肝臓クランプを含むが、これらに限定されない。可膨張性バルーンクランプも用いることができる。クランプの選択およびサイズは特定の対象、対象のサイズ、使用する手術方法および本発明方法により区画化する特定の臓器またはその部分による。特定の適用に適合性であるクランプの同定および選択は当業者のレベルの範囲内である。
実質圧迫のここでの例において、実質組織にかける圧は、血流を停止させるのに十分であるが、周囲組織に重篤な損傷を起こすほど大きすぎないものである。組織損傷または外傷を最小にしながら最適な臓器またはその部分の区画化を達成する理想的圧の決定は当業者、例えば熟練した外科医のレベルの範囲内である。一般的に、クランプは、クランプの遠位、中位および近位顎位置をとおして均一な圧を達成するものである。クランプおよびかける圧はまた、隣接組織領域および周囲脈管構造から組織または臓器の領域または区域の区画化も可能にしなければならない。この区画化は、その適用の期間をとおして、一般的に少なくとも最大３０分〜６０分維持されなければならない。所望により、クランプの力を当分野で知られた方法を使用して、例えば圧迫負荷セル変換器、例えば、2.2.ボタンスタイル圧迫負荷変換器(Interface Advanced Force Measurement; Scottsdale, Az)を使用して決定できる。また、区画化の達成に必要な圧(mmHg)(リーク圧)を、エクスビボまたはインビボで、圧計量器、例えばコール・パーマーデジタル圧測定デバイス(例えばCole-Parmer(登録商標); Vernon Hills, IL)を使用して決定できる。
区画化は、色素、例えばメチレンブルーまたはブロモフェノールブルーまたは他の類似色素を、区画化した標的領域または区域に注入し、その領域への局在化を評価することにより評価できる。例えば、クランプ除去後、クランプが設置されていた両側の組織を切開し、色素の存在について解析できる。色素が隔離組織の部分または領域に浸透していないとき、区画化は達成されている。色素の幾分かの漏出(血流の指標)が、実質圧迫の全期間脈管構造から隔離された領域または組織の部分が存在する限り、クランプの境界周辺の末梢領域で起こり得る。理想的には、区画化は、色素がクランプの境界を越えて隣接組織に浸透しないように達成される。これは実施例６に例示する。
クランプおよび閉塞用バルーンカテーテルに加えて、臓器またはその部分の血流を減らすまたは無くすために吸引を使用できる。さらなる例において、フラッシングを使用して、血液を希釈し、送達剤の循環への暴露をさらに最小化するために隔離した臓器または組織を灌流または部分的灌流できる。フラッシングは、任意の生理学的に適当な溶液、例えば食塩水を使用して達成できる。吸引またはフラッシングを送達剤の投与または送達前に実施し得る。さらに、本発明方法の例において、全身循環から臓器またはその部分を区画化する段階は、造影デバイス、例えば超音波検査、コンピュータ断層撮影または磁気共鳴造影により補助されてよい。一例では、血流遮断を補助するために、組織または臓器の血管パターンおよび他の解剖学的特徴の位置づけに術中超音波を使用できる。
ある例においては、総血隔離の前に虚血プレコンディショニング(ＩＰ)を所定時間実施してもよく、これにより虚血事象を伸ばす可能性がある。プレコンディショニングは、長時間の虚血に臓器またはその部分を耐容性とし、これは、本方法の実施に際し送達剤の組織細胞による取り込みを確実にするために実施し得る。このような方法において、組織またはその部分の血流を、本発明方法における血管隔離の所定時間より短い時間、しかし、低レベル、軽度または中度虚血をもたらす時間遮断する。例えば、組織または臓器を、少なくともまたは最大２分、３分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分以上血流を遮断することによりプレコンディショニングする。次いで、組織または臓器を直ちに虚血１０分以内に再灌流して、持続的虚血−再灌流傷害の状態を作る。再灌流は少なくともまたは最大２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１２分、１５分、２０分以上である。軽度から中度虚血の時間により特徴付けられるプレコンディショニングと続く再灌流の直後、臓器またはその部分を、ここに記載するとおり、送達剤が組織細胞に取り込まれるのを確実にするのに十分な所定時間、ここに記載の何れかの方法を使用して区画化する。
本発明方法の他の例において、臓器またはその部分が低酸素または無酸素に特に敏感であるとき、臓器またはその部分を、臓器またはその部分の体外灌流の提供により区画化する。この方法は、例えば、体循環が維持される心臓バイパス手術で使用される。本発明方法において、体外灌流は、標的臓器またはその部分への閉鎖ループによる血流の維持に役立ち得る。また、体外灌流は、血液の酸素化を含み得る。
臓器またはその部分の区画化を行うための血流遮断は、直視下外科手技または腹腔鏡下手法を含む、当分野で知られた一般的外科手技により実施できる。
臓器区画化の、例えば、全身循環からの血管隔離による、上記方法は、任意の臓器またはその部分で実施し得る。このような臓器の例は、肝臓、腎臓、膵臓、肺または脾臓またはその部分を含むが、これらに限定されない。次のサブセクションは、例示臓器での血管隔離の実施を例示する。
ａ. 肝臓
ヒトおよび他の動物において、肝臓は赤みがかった褐色の分葉臓器である。肝臓は、解毒、タンパク質合成および消化に必要な生化学物質の製造を含む、広範囲な機能を有する。本発明方法を使用して、肝臓は、いくつかの理由のために送達剤を送達する標的として特に良好な臓器である。体内で最大の臓器であり(全体重の２％〜３％)、容易に利用でき、区画化可能な少なくとも１個の葉があり、細胞代謝回転がかなり遅く、タンパク質スクリーニングの能力があり、長時間の無酸素および低酸素症に耐える。さらに、肝臓は、血清タンパク質の代謝および合成におけるその中心的役割のために、核酸分子の送達のための重要な標的臓器である。多数の疾患が知られており、そのいくつかは肝臓特異的遺伝子産物欠損が原因であり、分泌されたまたは細胞内のタンパク質の肝臓製造から利点を得る。これらは、例えば、家族性高コレステロール血症、血友病、ゴーシェおよびファブリー病および尿素サイクル障害および糖原病を含む。それにも係らず、これらの利点にもかかわらず、核酸の肝臓への標的送達は、送達された核酸の長期遺伝子発現の達成が不可能であることにより阻害されている。
肝臓は、横隔膜直下の腹腔の上部右四分円に位置する。それは血管に富んだ構造である。それは、門脈静脈および肝動脈による二重の求心性血液流入および上大静脈へと流れ出る肝静脈に合体する肝静脈をによる１個の遠心性血液流出により特徴付けられる。二重の血管流入は、１５００mL／分の血流を生じ、７５％が門脈静脈および２５％が肝動脈によりもたらされる(Abdalla et al. (2004) Surg. Clin. N. Am., 84:563-585)。図１、パネルＡはラット肝臓の解剖学的および血管配置的構成を記載する。門脈静脈が肝臓に入ると、各葉に供給するために右左に分枝する。第一の分枝は右葉に供給するための右下門脈静脈および右上門脈静脈として右に生じる。第二の分枝は尾状門脈静脈として左に生じ、これは２個の静脈である上部尾状葉分枝および下部尾状葉分枝に分かれる。門脈静脈はその主二分枝上にあり続け、中葉の右部分に供給される右中門脈静脈および対応する葉に供給される左中門脈静脈および左側方門脈静脈を放出させる左門脈静脈をもたらす。肝臓の動脈灌注は肝動脈により提供され、これは、肝臓に入ると、葉に供給されるために右および左に分枝し、門脈静脈と同じ分布に従う。
伝統的ヒト肉眼的解剖学は、表面特性に基づき肝臓を４個の葉に分割する。その前側で、鎌状靱帯は肝臓を左解剖学的葉および右解剖学的葉に分ける。肝臓が内臓表面に向けて反転したとき、右葉と左葉の間にさらに２個の葉があり、これらが尾状葉および方形葉である。
肝臓の機能／血管特徴に基づき、さらに分割することが可能である(図１、パネルＢ)。３個の主肝静脈(右肝静脈、中肝静脈および左肝静脈)がヒト肝臓を４個の割面または分節(右後部、右前部、左内側区および左外側区)にわけ、この各々に門脈系の対応する分枝が供給される。門脈静脈のさらなる分枝が、ヒト肝臓を８個の解剖学的に独立した亜区域に細分し、その各々、それら自体の遠心性肝静脈系、求心性門脈静脈系、求心性動脈系および胆管系を有する。亜区域ＩおよびIVは左内側区に対応し、亜区域IIおよびIIIは左外側区に対応し、亜区域ＶおよびVIIIは右前部に対応し、亜区域VIおよびVIIは右後部に対応する。
肝臓の実質は結合組織嚢(グリソン鞘と呼ばれる)から成り、これは、肝臓を通して中隔を形成し、これは小葉と呼ばれる小単位に分けられる。この実質はまた血管、リンパ管および胆管が通り抜ける。各小葉は肝細胞の六角形配置を含み、これは、中心静脈から放射される１または２細胞厚スタックまたはプレートを形成する。細胞のプレートは、肝類洞系により分けられる。肝細胞の平均寿命は約５ヶ月である。これらの細胞はまた肝実質が失われたとき、強靱に再生もできる。各小葉頂点に存在するのは門脈三分岐であり、これは胆および肝動脈および門脈静脈の末端分枝を有する(小葉間血)。小葉間血に由来する血は、小葉末梢の周りに分布し、これは類洞の入口を経て中心静脈への血流を提供する。
ここに提供する方法において、肝臓またはその葉、領域もしくは区域の区画化は、肝臓またはその葉もしくは区域を、全身循環への連絡から隔離することにより、例えば脈構造、導またはリンパ系から隔離することにより達成できる。区画化を達成する方法は、血および／または実質クランピング手技を含む。肝血隔離および閉塞を行う方法は当分野で周知である(例えばBuell et al. (2001) Arch. Surg., 136:569-575; Belghiti et al. (1999) Annals of Surgery, 229:369-375; Chowdhury (2010) BSMMU J., 3:112-119; Chouillard et al. (2010) Annals of Surgical Innovation and Research, 4:2-12; Chaib et al. (2003) Arq Gastronenterol., 40:131; Abdalla et al. (2004) Surg. Clin. N. Am, 84:563-585参照)。このような方法は、肝血遮断、肝血半閉塞、茎クランピング、部分的血閉塞、血流全遮断および大静脈流保存を伴う肝血流遮断を含むが、これらに限定されない。
本発明方法の例において、肝臓の区域または部分の区画化は、実質の圧迫をもたらす方法により達成できる。例えば、用手圧迫を、例えば、肝実質を母指と１本の指の間で挫滅させる用指遮断により実施できる。他の例では、茎クランピングを、指の間の茎の圧迫またはクランプまたは茎構造(pedicle)に圧を加えることができる他の類似デバイスの使用により、使用する。さらなる例では、区画化を、葉を通り抜ける実質圧迫クランプまたは閉塞クランプの設置により実施できる。肝臓葉の実質圧迫に使用できるクランプの例は、ロングマイヤー・ストームクランプ(V. Mueller, Stainliss, Germany、カタログ＃ SU-9080)、LinまたはChu肝臓クランプ(Ｐilling no.604113-61995)、イノクチ肝臓クランプ(Kanematsu et al. (1984) Jpn. J. Surg., 14:432-3)Dotyクランプ(特許番号３,６６７,４７１)およびVernickクランプ(米国特許番号５,２０３,７８６)を含むが、これらに限定されない。ある例においては、さらに分節性血隔離を、クランプ内に小さな体積の実質を置くことにより達成できる。
典型的に、本方法の実施に際し、肝臓の領域または部分を選択的に区画化するために、葉を他の葉から分けて可動化する。可動化は、実質圧迫またはクランピングを可能にするために葉または領域へ接近することを可能にする。肝臓のある部分または領域だけを可動化できることは、送達剤の選択的送達を達成する方法が可能であることを意味する。肝臓の独立単位へ分割により構造により、特定の葉、区域またはその部分の区画化が、他の区域への血流を維持しながら達成できる。例えば、茎構造、各分割された茎構造または実質領域の選択的クランピングまたは閉塞が、領域または区域の区画化を達成するために実施できる。可動化は、関連する靱帯および／または他の関連する腺の分割を必要とし得る。肝臓の各葉または分節を可動化しまたは隔離するための手技および手法は当業者に周知である。例えば、尾状葉、左葉または左中葉は全て合理的に血的に分離して、利用することができる。哺乳動物種間の肝臓構造の差異は、種毎に、特定の領域または葉が他より隔離により許容性であるとすることを可能にする。当業者は、他の動物において対応する葉を認識し、本発明方法で使用する区画化のための可動化または隔離に適切な葉または区域を決定できる。
ここでの具体例において、尾状葉、左葉または左中葉またはその部分を区画化する。必要であれば、組織または臓器の他の領域または周囲構造を損傷しは影響を与えることなく、脈構造から適切に区画化できる領域の利用を可能にするために、肝臓葉または区域を周囲の付着物からの切断または切り離しを行い得る。例えば、尾状葉は区域IVの後方にあり、下大静脈および門脈静脈と緊密に関連する。尾状葉の可動化は、胃肝網および背側尾状葉−大静脈靱帯の分離により達成できる。肝臓の左葉は、左三角靱帯の切断により可動化できる。類似手技を使用して、ヒトまたは他の対象において対応する葉を可動化できる。
肝臓、その領域、葉または区域が区画化されたら、送達剤をさらに下に記載するとおり区画化葉、領域または区域に送達できる。
ｂ. 他の臓器
ここに提供する方法を、核酸またはコードされたポリペチドの標的、臓器およびその脈構造の利便性、処置する障害または疾患、コードされたポリペチドの性質および他の因子を含む、種々の因子により広範な臓器で使用できる。肝臓に加えて、血隔離および区画化を行うための標的化臓器またはその部分はＣＮＳ(脳または脊髄)、末梢神経系(例えば、神経)、膵臓、胆嚢、内分泌腺(下垂体、副腎、甲状腺など)、心血臓器(例えば、心臓および血)、皮膚、泌尿生殖器臓器(腎臓、子宮、子宮頸、前立腺および尿道)、呼吸器系の臓器(例えば、肺または気道)、骨、筋肉および腸であり得る。当業者がさらなる標的臓器およびその葉を認識するとおり、この一覧は網羅的であることを意図しない。
皮膚は、ここでの区画化方法の実施のための標的臓器である。例えば、皮膚のケラチン生成細胞は遺伝子治療の適切な標的細胞であり、その処置は、遺伝子欠損が原因の疾患または状態、循環中に放出され得るタンパク質の産生による全身疾患および創傷または瘢痕に適する(例えばMeng et al. (1998) J. Clin. Invest., 101:1462; Liu et al. (2001) Yonsei Medical Journal, 42:634-645)。皮膚はまたここでの区画化方法に起因し得る短時間の虚血を受け入れられることが示されている(例えばWillms-Kretschmer and Majno (1969) The American Journal of Pathology, 54:327参照)。例えば、本発明方法において、区画化は、細胞の形質導入または細胞(例えばケラチン生成細胞)へのまたは細胞による送達剤の侵入に十分な時間維持される。例えば、区画化の時間は２時間未満および一般的に少なくとも１０分、１５分、２０分、３０分または６０分であり得る。
皮膚の区画化は、皮膚の末梢循環からの切り離しが可能なここに記載する手法のいずれかにより実施できる。具体例において、クランプを使用できる。このような例において、皮膚のひだを隔離または可動化し、クランプの間に装着する。クランプの圧を、体循環からの隔離が達成されるように、ここに記載のとおり調節できる(例えばWillms-Kretschmer and Majno (1969) The American Journal of Pathology, 54:327参照)。
肺は、ここでの区画化方法の実施のための標的臓器である。肺の遺伝子治療は、とりわけ癌、喘息、嚢胞性線維症、アルファ−１−アンチトリプシン欠損および呼吸窮迫症候群を含む、急性および慢性疾患の治療のために標的化できる。本発明方法において、区画化は、典型的に、肺を通る換気を維持しながら、肺の区域または領域で実施する。例えば、肺の気管支区域を区画化できる。区画化は、血クランプの使用および／または気支の直接実質クランピングにより、気支動脈の閉塞により実施できる。
腎臓の遺伝子治療は、遺伝性腎疾患(例えばアルポート症候群)を含む腎疾患の処置に使用できる。腎臓の区画化は、例えば、腎臓pedicleのクランピングによる、例えば、臓pedicle閉塞、血クランプ、例えば長い湾曲血クランプを使用する、腎実質のクランピングによる局所実質圧迫、または腎臓ケーブル結紮、止血帯または結紮デバイスにより達成できる。実質クランピングのために、Satinsky−またはDebakey-クランプを含むが、これらに限定されない腹腔鏡下実質クランプを使用できる(例えばToren et al. (2010) Can. Urol. Assoc., 4:E133-E136; Ko et al. (2010) Korean J. Urol., 51:8-14 and Joung et al. (2007) Korean J. Urol., 28:265-269参照)。
２. 送達剤投与による核酸分子送達
本発明方法において、核酸を、組織細胞に直接送達剤を投与することにより、臓器または組織またはその部分における細胞に送達する。送達剤は、臓器またはその部分の区画化と同時に、断続的にまたは後に投与できる。典型的に、本発明方法において、送達剤を、臓器またはその部分の区画化の開始直後、例えば臓器またはその部分の区画化開始後、１０分以内または最大１０分および一般的に最大５分に投与する。例えば、送達剤を、対象に区画化開始後最大３０秒、１分、２分、３分、４分または５分、６分、７分、８分、９分または１０分に送達する。
ａ. 送達方法および投与経路
核酸分子の送達剤の投与による送達は、そこからの遺伝子発現に対象の区画化した臓器またはその部分の細胞、特に関連する標的組織細胞に送達剤をに送達できる任意の方法または投与経路による。例えば、送達は実質細胞に直接である。肝臓の場合、標的実質細胞は肝細胞であり、一方非実質細胞は血管内皮細胞、クッパー細胞および支持間質細胞を含む。
ある例においては、患者への送達剤の送達は直接であってよく、この場合対象は送達剤に直接暴露される(例えばインビボ送達)。例えば、送達剤を、組織の実質または間質腔への直接注射により送達できる。他の例において、送達剤の送達は観察的であってよく、この場合細胞は最初にインビトロで送達剤で形質転換され、次いで患者に移植される(例えばエクスビボ送達)。例えば、エクスビボ遺伝子治療方法のために、実質細胞を体から摘出し、エクスビボで送達剤に暴露し、続いて細胞を区画化された組織または臓器またはその部分に再移植する。
具体例において、送達剤を直接組織または臓器注射により送達する。例えば、送達剤を、組織または臓器実質への直接注射により、例えば区画化された組織または臓器またはそれらの部分、例えば筋肉(筋肉内)、肝臓、脳、腎臓およびここに記載したまたは当分野で知られるその他への実質内投与により送達する。実質への間質性送達は全身性送達方法を越える利点がある。例えば送達剤の静脈内、門脈内および動脈内投与による核酸の全身性送達は、送達剤の全身循環への暴露を増加させる。これは非選択的組織ターゲティング、細胞取り込みの効率の減少または低下を生じ、遺伝子発現の減少、組織細胞による取り込みを確実にするための送達剤の大量または高投与量の必要性、免疫細胞の暴露および望まない免疫応答の活性化および全身性送達方法と関連する他の問題を生じる。本発明により、間質腔への直接注射が、組織細胞(例えば血管圧排および隔離による)の区画化と組み合わさり、全身循環への暴露を最小化しながら、組織細胞による送達剤の取り込みの頻度および効率を高めることが判明した。
例えば、組織細胞による送達剤取り込みの頻度および効率上昇に加えて、実質送達はまた送達剤の免疫細胞への暴露を避け得る。例えば、肝臓またはその部分への核酸分子の送達のために、例えば肝内注射による、送達剤の直接実質注射による間質性送達はクッパー細胞貪食を避け得る(例えばCrettaz et al. (2006) Hepatology, 44:623-632参照)。肝臓の食作用性マクロファージであるクッパー細胞は、肝類洞に存在し、それゆえに静脈内投与された送達剤に暴露される。対照的に、肝臓の肝細胞組織細胞はディッセ腔により類洞と分離される。それゆえに、間質腔に存在する肝細胞への送達剤の直接ターゲティングは、クッパー細胞活性化により開始され得る望まない炎症誘発性応答を避け、内在組織細胞による取り込みを高める。同様に、他の臓器の間質性細胞への送達剤の直接送達も意図される。それゆえに、本発明方法において、送達剤またはその組成物は組織実質に直接的に送達される。
典型的に、送達される送達剤は組成物として提供される。このような送達剤および組成物の例は、それぞれセクションＤおよびＥに記載するものである。送達剤は薬学的に許容される液体または水性担体で送達できる。送達剤は組織または臓器またはその部分に、針または他の類似デバイスを使用する注射により直接的に導入できる。送達すべき担体内の送達剤の体積は、正確にまたは約０.５mL〜１００mL、例えば０.５mL〜５０mL、１mL〜２０mL、５mL〜５０mLまたは５mL〜２０mLである。
ｂ. 送達を促進するための方法
一般的に本発明方法は、動脈、静脈および他の関連脈管構造およびまた導管系およびリンパ系の管への注射を避ける注射方法を利用する。実質注射による送達剤の送達は、周囲脈管構造および関連構造から実質組織および細胞を区別する造影手法の使用により補助され得る。造影は注射直前に、注射と同時におよび／または注射後に実施する。このような造影手法は、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)、超音波およびドップラー超音波検査を含む超音波検査手法を含むが、これらに限定されない。例えば、B-glow、３−Ｄ造影またはカラードップラーを使用できる。必要であれば、造影剤を注射して、造影を促進し得る。例えば、このような方法はまた血管または管系の管腔への本剤の進入の可能性を最小化するためにも使用できる。
ここに提供する方法において、必要であれば、組織細胞による送達剤取り込みの有効性を、当業者に知られる種々の手法を使用して高めることができる。送達剤取り込みを向上させる手技は、送達剤の細胞による十分な取り込みを確実にするために必要な時間が短いために、区画化時間(上記)を縮め得ることが理解される。特定の手技の選択は当業者により経験的に決定でき、送達される特定の送達剤、投与経路(例えば特定の組織または臓器)および投与される薬剤の投与量または量による。一例では、送達剤は脂質、ポリマートランスフェクション試薬または他の薬剤と共に製剤できる。他の例において、物理的方法を使用して、送達を向上できる。送達剤の送達を増進するための物理的方法の例は、“遺伝子銃”方法、エレクトロポレーション、ソノポレーション、加圧または超音波を含むが、これらに限定されない。最小組織損傷でインビボ遺伝子送達を向上させるための別法として、送達剤をフェムト秒赤外レーザー(LBGT technology)を使用して投与できる。
一例では、送達剤および特にウイルスまたはウイルス様粒子、例えばアデノウイルスである送達剤の取り込みを、種々の薬剤の存在により向上できる。例えば、送達剤は、ウイルス特異的細胞表面受容体の転写エンハンサーである薬剤または化合物と共に投与できる。このような薬剤または化合物は、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤を含む。ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサム酸類、環状テトラペプチド、ベンズアミド類、求電子ケトン類または脂肪族酸化合物のクラスのものを含む。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤は、トリスコスタチンＡ、ボリノスタット(ＳＡＨＡ)、ベリノスタット(ＰＸＤ１０１)、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット(ＬＢＨ５８９)、エンチノスタット(ＭＳ−２７５)、Ｃ１９９、モセチノスタット(ＭＧＣＤ０１０３)、ロミデプシン(Istodax)、バルプロ酸、ＰＣＩ−２４７８１、ＳＢ９３９、レスミノスタット、ギビノスタット、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、KevetrinまたはトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)を含むが、これらに限定されない。ＨＤＡＣ阻害剤の例は、アデノウイルス受容体ＣＡＲおよび治療的導入遺伝子の転写エンハンサー剤であるバルプロ酸である。アデノウイルス取り込みがバルプロ酸存在下で上昇することを示す研究がある(Segura-Pancheco et al. (2007) Genet. Vaccines Ther., 5:10)。このような例において、ウイルスベクターを本剤と共にまたは別に製剤する。ウイルスベクターを別に製剤する例において、転写エンハンサー剤または化合物を送達剤の送達前に送達する。転写エンハンサー剤は、正確にまたは約１mg／kg〜１００mg／kg、例えば、正確にまたは約２０mg／kg〜６０mg／kg、例えば４０mg／kg投与できる。投与量を分割し、総１日投与量を達成するために分けて投与してよい。例えば、投与サイクルは、１日１回、１日２回、３回、４回または５回であり得る。投与の頻度は少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間または２週間毎日であり得る。本剤を任意の投与経路で、例えば、皮下、静脈内、経口または局所により投与できる。具体例において、本剤を直接実質投与により投与する。
ある例においては、送達剤を、送達剤を結合するかまたは複合化し、細胞への侵入を仲介する薬剤または送達媒体と製剤する。薬剤の例は、カチオン性リポソームおよび脂質、リポタンパク質、合成ポリマーまたはポリペプチド、ミネラル化合物またはビタミン類を含むが、これらに限定されない。ポリマーの例は、ポリカチオン類またはポリアニオン類を含む。例えば、送達剤は、ポリアミン、リン酸カルシウム沈殿、ヒストンタンパク質、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン、両性高分子電解質複合体、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルスからのコートタンパク質およびＮ−置換グリシンのポリマーと製剤できる。
例えば、送達剤を、対象またはそれ由来の細胞に送達する前に脂質中に被包またはリポソームでパッケージしてよい。脂質被包は、一般に核酸と安定に結合しまたは捕捉し、保持することができるリポソームの使用により達成される。縮合核酸送達剤対脂質調節物の比は可変性であり得るが、一般に約１：１(ＤＮＡのmg：脂質のマイクロモル)以上の脂質である。リポソーム製剤は、カチオン(正荷電)製剤、アニオン(負荷電)製剤および中性製剤を含む。このような製剤は当業者に周知であり、容易に入手可能である。例えば、カチオン性脂質の例は、Ｎ[１−２,３−ジオレイルオキシ)プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウム(ＤＯＴＭＡ；リポフェクチン(登録商標)製品ライン下に入手可能)；ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥおよびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥを含むが、これらに限定されない。アニオン性および中性リポソームも容易に入手可能であり、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(ＤＯＰＧ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、例えば市販の製剤Avanti Polar Lipidsから製造できる。リポソームは多重膜小胞(ＭＬＶｓ)、小単層小胞(ＳＵＶｓ)または大単層小胞(ＬＵＣｓ)を含む。
ある例においては、送達剤は、本薬剤の細胞送達をさらに助け、増加させるための官能基またはターゲティング剤、例えば、標的となる細胞で発現される受容体に結合するターゲティング分子を含むナノ粒子であってよい。官能基またはターゲティング剤は、例えば、本剤または複合体と細胞の結合を増進する細胞ターゲティング部分を含む。細胞ターゲティング部分は、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭水化物、(非発現)ポリ核酸または合成化合物であり得るが、これらに限定されない。例えば、細胞ターゲティングシグナルは、細胞の受容体への結合を増進するリガンドであり得る。このようなリガンドは、インスリン、増殖因子(例えばＥＧＦまたはＦＧＦ)、トランスフェリン、ＲＧＤ配列を含むペプチドを含むが、これらに限定されない。他のターゲティング部分は、細胞上のチオール基、スルフヒドリル基またはジスルフィド基と反応する化学基、葉酸および他のビタミン類を含むが、これらに限定されない。
ここでの例において、注入をエレクトロポレーションにより促進し得る。エレクトロポレーションは、細胞に永続性の損傷を与えることなく細胞膜に一過性の細孔を作るためにパルス電場の適用を含み、それにより外来分子の導入を可能とする技法である。電気泳動系により産生される電気パルスの調節により、送達剤は、本手技中に作られた細胞内の通路または細孔を通る道を見つけることができる。筋肉、肝臓、皮膚および他の組織または臓器を含むインビボでの送達剤の送達のためにエレクトロポレーションを使用する方法は当分野で知られる(例えば、米国特許番号５,７０４,９０８；公開米国出願番号ＵＳ２００２／０１０２７２９；Titomirov, A. V., et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1088: 131-134; Muramatsu, T., et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 233: 45-49; Suzuki, T., et al. (1998) FEBS Lett 425: 436-440; Aihara, H. and Miyazaki, J. (1998) Nat Biotechnol 16: 867-870; Mir, L. M., et al. (1998) C R Acad Sci III 321: 893-899; Rizzuto, G., et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 6417-6422; Goto, T., et al (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:354-359; Somiari, S., et al. (2000) Mol Ther 2:178-187参照)。
送達がエクスビボで細胞に、一般に対象から隔離された細胞への送達である例においては、インビボ送達に適用可能な記載した方法を含む、当業者に知られた細胞に核酸を送達するあらゆる方法を使用できる。例えば、核酸の送達は、デキストランが仲介するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンが仲介するトランスフェクション、原形質体融合、エレクトロポレーション、リポソームへの被包またはＤＮＡの直接マイクロ注射を使用して達成できる。また、ウイルスＤＮＡ送達のために、細胞を、ウイルス粒子で形質導入できる。次いで、形質転換細胞は、本発明方法において使用するための送達剤となる。エクスビボ送達および送達剤形質転換細胞の対象への再移植のための方法は当分野で知られ、記載されている(例えば国際公開番号ＷＯ９３／１４７７８参照)。
ｃ. 投与量および送達レジメン
投与する送達剤の量または投与量は、特定の適用に基づき経験的に決定できる。本発明方法のために、用量−応答動態は、投与した送達剤の量、例えばウイルス、例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスまたは他のウイルスと、産生される導入遺伝子産物の間に直接相関関係があるように直線的である。例えば、形質導入ウイルスの４０ゲノムが、治療量のタンパク質産生に十分であることが判明した(例えばNathwani et al. (2002) Blood, 100:1662参照)。それゆえに、本発明方法において、本方法は、治療的量のコードされるタンパク質を産生するために、細胞、例えば、肝細胞のウイルス形質導入による十分なゲノムコピー数を達成するために、低量のウイルスの投与を可能とする。例えば、量は、細胞あたりウイルスの４０またはそれ以上のゲノムでの細胞の形質導入に十分である。本発明方法は、さらに細胞あたりのゲノムコピーを増幅し、それによりさらに現存する方法より低投与量で産物の持続性発現を高める。それゆえに、本方法の使用により、注射した粒子の量、細胞内ゲノムおよび発現されるタンパク質の量の厳密な相関が可能である。
これは、当分野で現存する遺伝子治療方法と比較した利点である。例えば、現存する方法において、アデノウイルスの送達のために、例えば肝臓への送達のために、肝臓形質導入に対する非線形用量応答があり、これにより低用量は検出不可能なタンパク質発現をもたらし、高用量は導入遺伝子発現を達成する(Rosewell et al. (2011) J. Genet. Syndr. Gene Ther., S5:1-16)。しかしながら、高用量は、また免疫活性化を開始し、毒性である。それゆえに、アデノウイルス遺伝子送達の現存する方法を使用して、投与量レベルは、十分な導入遺伝子発現に必要であるレベルと同時に、致死毒性をもたらさないレベルの達成のバランスをとらなければならない。一般的に、現存する方法において、これらの十分なタンパク質製造を達成するために投与されるアデノウイルスの量は相対的に高く、約または約１.５×１０１２ウイルス粒子／キログラム(vp／kg)および一般的に少なくとも１×１０１１ウイルス粒子(vp)／キログラム(kg)(vp／kg)、例えば少なくとも５×１０１１vp／kg以上である。例えば、マカクへの第IX因子をコードするＡＡＶの４×１０１２vp／kg用量の静脈内投与が、８％の第IX因子活性を回復させるための持続的発現を達成するために必要であった(Nathwani et al. (2002) Blood, 100:1662)。ヒト治験は、わずか数日間１０％の第IX因子活性を矯正するために４×１０１１vp／kgの投与量が必要であり、発現は２〜６週間しか継続しないことを示している(Mingozzi et al. (2011) Nature Reviews Genetics, 12:341)。また、典型的に静脈内送達方法により与えられるこれらの量は、なお、軽度の毒性、免疫活性化および／または組織損傷を起こす。
特に、ここでの区画化方法において、投与される送達剤の用量または量は、治療的または予防的効果をもたらすことができるレベルのタンパク質産物が産生されるようなものである。典型的に、本発明方法において本レベルは少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１４ヶ月、１６ヶ月、１８ヶ月、２０ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、６０ヶ月、７２ヶ月、８４ヶ月、９６ヶ月、１０年、１５年以上持続的である。投与した送達剤と産生された産物の量に直線的相関があるため、このような投与量は当業者により決定できる。投与量決定において考慮すべきは、特定の遺伝子療法および治療的生産物、タンパク質産物の半減期、導入遺伝子産物発現に使用したプロモーター、特定の送達剤および他の類似因子を含み得る。
送達剤が非ウイルス核酸であるとき、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投与量は、約または正確に０.００５mg／kg体重〜約または正確に５０mg／kg体重の範囲である。一般的に、投与量は、約または正確に０.００５mg／kg〜約または正確に２０mg／kg、より一般的に約または正確に０.０５mg／kg〜約または正確に５mg／kgである。例えば、非ウイルス核酸(例えばプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸)について、０.０１mg〜２０００mg、例えば０.０５mg〜１５００mg、１mg〜１０００mg、１０mg〜１５００mgまたは１００mg〜１０００mgが送達される。
送達剤がウイルス、例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスまたは他のウイルスであるとき、投与量は、典型的にウイルス粒子(vp)またはプラーク形成単位(pfu)の数値により提供され、投与量は一般的に１×１０１２総粒子または１×１０１２pfuより少なく、一般的に約または正確に１０〜１×１０１２粒子、１０〜１×１０６粒子、１×１０３〜１×１０１２粒子、例えば１×１０６〜１×１０１０粒子または１×１０７〜１×１０９粒子の範囲または約または正確に１０〜１×１０１２pfu、１０〜１×１０６pfu、１×１０３〜１×１０１２pfu、例えば１×１０６〜１×１０１０pfuまたは１×１０７〜１×０９pfuの範囲である。記載のものより低いまたは高い用量が必要であることがある。任意の特定の対象または患者についての特異的投与量および処置レジメンは、特異的遺伝子療法およびその治療的生産物、特異的化合物または薬剤の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食習慣、投与の時間、排泄速度、併用剤、疾患、状態または症状の重症度および経過、対象または患者の疾患、状態または症状に対する傾向、投与方法および担当医の判断を含む多様な因子に依存し得る。正確な投与量の決定は、当分野の熟練した担当医のレベルの範囲内である。
一般的に、ここでの区画化方法を使用して、核酸分子、例えば治療核酸分子の最適送達を達成するために、現存する方法と比較して投与する送達剤の量を顕著に減少できる。さらに、投与する送達剤の量を、送達剤の用量と産生される治療的生産物の量の間の直線的相関のために、制御できる。結果は、同じ送達剤の静脈内投与で達成されるより、本発明方法を使用して最大１００倍以下の送達剤を投与できる。例えば、本発明方法において投与される送達剤の量は、標的臓器または組織に静脈内投与される同じ送達剤の量の最大１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、５０００倍、１００００倍以下である。特定の送達剤、核酸分子および処置する疾患または状態に基づき、本発明方法において投与する送達剤の特定の量の決定は当業者のレベルの範囲内である。
当業者は、種々の疾患または障害の処置に使用するための種々の遺伝子治療ベクターおよび薬剤の適用を熟知する。静脈内送達(または他の投与方法)により当分野で現存するプロトコルにより投与される薬剤の投与量および量に基づき、当業者は本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器またはその部分への実質投与に使用するための同じベクターまたは薬剤の投与量を減らすことにより改変できる。例えば、アデノウイルス、例えばゲノム内に異種核酸分子を含む組み換えアデノウイルスを用いる肝臓標的化遺伝子治療のために、７５kgの平均的ヒト対象において約１.５×１０１１vp〜４.５×１０１３vpに対応する正確にまたは約２×１０９〜６×１０１１vp／kgであるアデノウイルスの投与量をヒトに投与しているが、一般に毒性および／または患者死亡のためにまたは肝細胞形質導入不足のために殆ど成功していない(Brunetti-Pierri et al. (2009) Molecular Therapy, 17:327-333)。本発明方法において、例えば、アデノウイルス、例えばゲノム内に異種核酸分子を含む組み換えアデノウイルスを、肝臓または他の組織または臓器またはその部分に１×１０１２vp未満または１×１０１２pfu未満および典型的に１×１０１０vp未満または１×１０１０pfu未満投与する。例えば、ここでの区画化方法を使用して、１×１０１２vp、１×１０１１vp、１×１０１０vp、１×１０９vp、１×１０８vp、１×１０７vp、１×１０６vp、１×１０５vp、１×１０４vp、１×１０３vp以下のアデノウイルスを肝臓標的化遺伝子治療方法で投与できる。他の例では、ここでの区画化方法を使用して、１×１０１２pfu、１×１０１１pfu、１×１０１０pfu、１×１０９pfu、１×１０８pfu、１×１０７pfu、１×１０６pfu、１×１０５pfu、１×１０４pfu、１×１０３pfu以下のアデノウイルスを肝臓標的化遺伝子治療方法で投与できる。このような例において、この量をヒト対象に投与できる。
ウイルスを、その組成物調製および／または投与量決定のために力価測定する方法は当業者に周知である。例えば、力価を、ウイルスＤＮＡおよびタンパク質濃度を測定するＯＤ２６０アッセイにより決定できる。このようなアッセイを実施するために、増殖培地中の血清および他の因子が吸光度測定値を妨害し得るために、精製ウイルスのストックが必要である。例えば、ウイルスを、ＣｓＣｌ密度勾配または当業者に知られる他の方法を使用するバンドにより精製できる。典型的に、ウイルスの希釈物を製造する。１mLあたりの光学粒子単位(opu)またはウイルス粒子(vp)を吸光度から決定できる。例えば、アデノウイルスについて、vp／mLを、１.１×１０１２をＯＤ２６０吸光度およびウイルス希釈因子と乗算することにより決定できる。ＯＤ２６０アッセイは生存および死滅ウイルスを区別しない。他の例では、力価を、当分野で知られる標準的手技を使用するプラークアッセイの実施により決定できる。典型的に、単層で増殖できる細胞、例えば、２９３細胞を中程度に高い密度(例えば正確にまたは約または７０％以上)で播種し、種々の希釈のウイルスストックと感染させる。細胞の感染および形質導入に十分な時間後、アガロース溶液を細胞に添加する。細胞溶解により形成したプラークは数日間可視であり、最大１０日間計数できる(典型的にプラーク領域を区別できる色素の使用による)。力価を、１mLあたりのプラーク形成単位(pfu)として、プラーク数を希釈因子で割ることにより計算する。さらなる例において、終点希釈アッセイを使用できる。このアッセイは、はるかに高い希釈(一般的に１０−３〜１０−１０)を製造する以外、プラークアッセイと類似する。また、プラークを同定するためのアガロース重層の代わりに、細胞の感染プレートを顕微鏡下に手動で目視して、細胞変性効果(ＣＰＥ)のウェルを同定する。プレートのウェルを、スピアマン・カルバー方法に基づき、終点希釈を決定するために採点できる。
投与処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。投与頻度は、投与する薬剤、対象における疾患または状態の進行および当業者に知られる他の考慮により得る。例えば、送達剤または組成物は、１回または複数回投与で、例えば少なくともまたは約または正確に２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回投与で送達できる。処置はまた単標的部位または複数標的部位であり得る。例えば、送達剤の送達は、標的部位あたり単回注射または標的部位への反復注射であり得る。一例として、嚢胞性線維症のような肺疾患の処置において、対象における十分な導入遺伝子産物および／または機能的改善を達成するために複数回注射で肺の少なくとも２５、５０、７５、８０、８５、９０または９５％を標的とすることが必要であり得る。それゆえに、多数の注射部位を使用できる。反復注射は連続して、例えば前の注射の直後にまたは分、時間、日または年の単位で遅れてもよい。ある例においては、送達剤を、特に高レベルの形質導入または発現が求められるとき、臓器またはその部分の１箇所を超える部位に投与する。例えば、ある態様において、第一投与部位に加えて、送達剤を含む組成物を他の部位または場所に投与する。他の部位または場所は、標的組織の同じ領域または部分の第一部位に隣接するまたは近位の部位または第一部位から離れているがなお同じ標的臓器内にある部位(例えば肝臓または肺の異なる葉または領域)であり得る。
３. 区画化の終了／解放
送達剤の送達後、組織または臓器またはその部分の区画化を、送達剤の十分な取り込みを可能にするおよび／または体循環への送達剤の暴露を最小化するのに十分な時間維持する。例えば、区画化は、体循環を避けながら、細胞への送達剤の挿入を可能にするのに十分な時間である。この区画化の効果は、毒性および免疫活性化が最小化されることを意味する。一般的に、組織または臓器またはその部分の区画化を、毒性および免疫活性化(例えば局所または全身サイトカイン発現、炎症性浸潤、例えば好中球およびリンパ球浸潤および／または組織酵素群で評価して)を制限する、最小化するまたは回避するために維持する。投与する特定の送達剤、標的組織または臓器またはその部分、処置する対象または特定の適用を含む因子に基づき区画化を維持する厳密な時間を決定するのは当業者のレベルの範囲内である。遺伝子発現を評価するための方法および手法および免疫活性化および毒性と関連するパラメータは当業者に知られ、この例はセクションＦに記載する。
ここでの例において、組織または臓器またはその部分の区画化の期間は、１０％未満および一般的に５％、４％、３％、２％、１％以下の送達剤が体循環に曝されるのに十分な時間維持される。送達剤または導入遺伝子産物の全身レベルを評価する方法はセクションＦに提供する。さらに、実施例２は、体循環、例えば末梢血における送達剤を検出するためのアッセイを例示する。
ここでの例において、組織または臓器またはその部分の区画化は、約または正確に８０％、８５％、９０％または９５％以上の選択送達剤が組織臓器またはその部分の細胞による細胞取り込みを可能にする時間維持される。例えば、組織または臓器またはその部分の区画化を、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の送達剤が、組織または臓器の内在細胞により細胞内に存在するように維持する。例えば、肝臓への送達について、肝臓またはその部分の区画化を、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の送達剤が、肝細胞により細胞内に取り込まれるように維持する。送達剤の細胞内存在および局在化を評価する方法はセクションＦに記載する。
ここで提供する方法は、６０日間を超えて、９０日間を超えて、６ヶ月を超えて、７ヶ月を超えて、８ヶ月を超えて、９ヶ月を超えて、１０ヶ月を超えて、１１ヶ月を超えて、１２ヶ月を超えて、１８ヶ月を超えてまたは２４ヶ月を超えて、組織または臓器またはその部分での長期遺伝子発現を達成できる。典型的に、組織または臓器またはその部分の区画化は、少なくとも１年間の遺伝子産物発現を達成できるのに十分な時間維持する。
区画化の最適期間は、特定の標的臓器または組織またはその部分、送達剤および送達に使用する特定の方法を含む種々の因子により変わり得る。例えば、異なる組織または臓器内在細胞は、送達剤の細胞内取り込みについて異なるエンドサイトーシス能および動態を示す。このエンドサイトーシス機能は、特定の送達剤の影響を受け、または依存して変わる。例えば、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスである送達剤に関して、アデノウイルス感染の動態は、その受容体との結合および相互作用により開始され、これは、アデノウイルス亜群Ａ、Ｃ〜Ｆについては、コクサッキーウイルスＢ Ａｄ受容体(ＣＡＲ)である。一次受容体への結合は、結合したウイルスのエンドサイトーシスを仲介する。形質導入後１分以内に、一般的に約２％のウイルスが細胞内にある。分解したアデノウイルスは、エンドソーム内容物の細胞質への遊離によりサイトゾルに出る。形質導入後３０分以内にまたは３０分になる前に、約８０％のウイルスが細胞内にある。さらなる分解により、カプシドが細胞質を通って輸送され、そこで、最終的にウイルスＤＮＡを細胞核に送達する。形質導入後６０分以内にまたは６０分になる前に、全ての導入遺伝子が核に送達される。
ここで、組織または細胞に送達される送達剤は内在細胞により取り込み可能であるものであることは理解される。必要であれば、送達剤を、侵入を増加または仲介するために、特定の細胞によって修飾し得る。例えば、効率的ウイルス侵入のための細胞標的へのウイルスベクターの結合を可能にするアデノウイルスの繊維カプソメア修飾は当分野で知られる(例えばCampos et al. (2007) Curr. Gene Ther., 7:189-204; Russell WC, (2009) J Gen. Virol., 90:1-20参照)。さらに、細胞内取り込みの時間は、取り込みを促進する補助手段の使用により短縮できることは理解される。このような補助手段はエレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、リポプレックス、ポリプレックス、洗剤または取り込み受容体の転写を高める補助剤または化合物との組成物および例えば上記した当業者に知られる他の方法である。細胞、例えばインビボでの組織または臓器内在細胞への送達剤侵入の動態は、当分野で知られる方法により決定できる(例えばセクションＦ参照)。
さらに、血管区画化の最適期間は、臓器または組織またはその部分およびその中の内在細胞の虚血性状態への耐容性に依存し得て、本発明方法において考慮されるべき事項である。いくつかの臓器または組織は、他に比べて虚血性状態への耐容性が低い。例えば、肝細胞は、一般に血管隔離に対して、神経細胞または心筋細胞より長く生存可能である。肝臓は、一般に６０分までまたはそれ以上の血流中断に耐える(Abdalla et al. (2004) Surg. Clin. N. Am, 84:563-585)。腎臓では、血管隔離は、実質的に全ての核酸が組織細胞により取り込まれることは可能にする所定時間実施できる。腎臓は、典型的に最大２時間の虚血に耐えるが、一般的に最大１時間または最大３０分である(Hoffman et al. (1974) AMA Arch. Surg., 109:550-551; Thompson et al. (2006) J. Urology, 177:471-476)。筋肉は虚血に最大４時間耐える(Blaisdell F.W. (2002) Cardiovascular Surgery, 10:620-630)。当業者は、十分な細胞取り込みを達成し、全身暴露を最小化し、かつ臓器またはその部分に虚血をもたらさないまたは可逆性または回復可能である許容される虚血に十分な時間を決定するために、組織または臓器をモニターし、評価できる。例えば、デジタル光処理(ＤＬＰ(登録商標))ハイパースペクトル造影(ＨＳＩ)を使用して、組織または臓器またはその部分の“実時間”組織酸素化地図を作成できる(Best et al. (2011) Proc. SPIE, 7932, 793202)。
具体例において、本発明方法における組織または臓器またはその部分の区画化は１５分より長い。例えば、上記のとおり組織または臓器またはその部分の区画化を維持する時間は、区画化開始および／または送達剤投与後少なくともまたは少なくとも約または正確に最大１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、１１５分または１２０分である。区画化を維持する時間は、取り込みまたは進入を促進する薬剤の存在下で、１５分より短くてよいことは理解される。それゆえに、ここでの例において、組織または臓器またはその部分の区画化を維持する時間は、少なくともまたは少なくとも約または正確に最大５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分以上である。ある態様において、区画化を少なくとも約または正確に最大３０分維持する。一般に、ここでのあらゆる方法において、組織または臓器またはその部分の区画化は、６０分を超えず、例えば１５分より長いが、６０分未満である。
例えば、本発明方法により肝臓またはその部分を区画化する例において、肝臓の区画化を維持する時間は、区画化開始および／または送達剤投与後少なくともまたは少なくとも約または正確に最大１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分または６０分である。一般的に、ここでのあらゆる方法において、肝臓またはその部分の区画化は６０分を超えず、例えば少なくとも正確にまたは少なくとも約１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分であるが、６０分より短い。例えば、区画化は、正確にまたは約１５分〜６０分、１５分〜５０分、１５分〜４０分、１５分〜３０分、２０分〜６０分、２０分〜４０分および一般的に約または凡そ３０分である。
ここでのある例においては、ここで提供する方法は、さらに臓器またはその部分または術野からの細胞外送達剤(すなわち、送達剤を投与しているが、区画化臓器またはその部分の細胞により取り込まれていない部分)の除去を含み得る。除去段階は、臓器またはその部分への血管循環が回復したら、全身循環に到達する送達剤がほとんどないかまったくないようにするための吸収、吸引またはフラッシングを含み得る。それゆえに、除去段階は、臓器またはその部分への血管循環の再開前に実施する。
区画化の時間の後、臓器またはその部分の区画化を終了する。これは、組織または臓器またはその部分と体循環の連絡の回復により行う。例えば、区画化は、臓器またはその部分への血管循環回復により停止する。血管隔離の回復は、組織またはその部分の血流遮断に使用したデバイス、装置または方法の除去により達成できる。例えば、実質クランプを組織から除去し得る。他の例において、領域または組織の部分の圧迫を解放し得る。基本部位である組織、血管、静脈または動脈または導管に損傷が起こらないように、組織または臓器またはその部分への血流遮断に使用したデバイス、装置または手段を注意深く除去することは、熟練した医師のレベル内である。例えば、実質クランプの圧を、組織、臓器またはその部分への血流の回復を制御するために注意深く解放し得る。
Ｄ. 送達剤
本発明方法、使用または組成物において使用するための送達剤は、任意の核酸分子を含む任意の所望の核酸分子または媒体、構築物または複合体であり得る。特に、送達剤は核酸分子であるかまたは核酸分子を含み、当該核酸分子は所望の機能を有するかまたは所望の機能を有する選択ポリペチドをコードする。送達剤は、ＤＮＡ(例えば、二本鎖環状または直鎖状)、ＲＮＡ、リボザイムまたはアプタマーであり得る。さらに送達剤は、ネイキッドＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡまたはアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない任意の形態であり得る。送達剤は、異種核酸分子を含む構築物として提供され得る。インビトロまたはインビボで核酸の細胞への送達について当業者に知られた多くの構築物がある。このような構築物は、ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系を含む。例えば、送達剤は、ナノ粒子(例えば、標的または放射標識ナノ粒子)、プラスミドまたはベクター(例えば、ウイルスベクターまたは発現ベクター)で送達される核酸分子を含む構築物であり得る。このような構築物は当分野で周知であり、ここに記載する組成物および方法での使用に容易に適応可能である。
使用する送達剤の選択は標的組織または臓器部位によることは理解される。標的組織または臓器細胞による細胞取り込みに適合性である送達剤および／または送達方法の経験的決定および同定は当業者のレベルの範囲内である。例えば、レトロウイルスベースのベクターは、一般的に活性に分裂している細胞にのみ形質導入されることは当業者に知られている。肝細胞は一般に静止状態であり、それゆえに、肝細胞へのレトロウイルスベースのベクターの送達は手技を必要とし、これにより本方法は細胞分裂を刺激する段階を含む(例えば肝部分切除術)。対照的に、アデノウイルスベースのベクターは、非分裂細胞に送達されることが可能である。
具体例において、本発明方法において使用する送達剤は、典型的に宿主ゲノムに統合されず、複製を可能にする配列も含まないものである。ゲノムへの組込みがなくても、ここで提供する区画化送達方法は、導入核酸分子の持続的遺伝子発現を６ヶ月を超えて、一般に最大１年または１年を超えて維持できることが本発明により判明した。しかしながら、必要に応じて、ゲノムに統合される核酸を本発明方法において使用こともできる。
１. 核酸分子
本発明方法、使用または組成物において使用される特定の送達剤は、核酸分子であるかまたはそれを含み、それにより、その送達および／または発現が、標的臓器に存在するときまたは血流に分泌されたとき有用である活性または性質を発揮する。例えば、核酸分子の送達および／または発現は、不在または欠損(例えば部分的または非機能的)遺伝子産物を置換し、遺伝子産物の過剰産生を達成し、ＤＮＡワクチンとして作用し、所望の効果または治療的活性を有するポリペチドをコードしまたは遺伝子発現を阻害する。例えば、核酸分子は、所望の効果または治療的結果のためのポリペチドをコードするために選択されたものであり得る。他の例では、核酸分子は、遺伝子または遺伝子産物の核酸ベースの阻害剤、例えば遺伝子の転写または翻訳の阻害剤である。例えば、送達剤は、短干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)配列、アンチセンス配列またはマイクロ−ＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)配列であり得る。さらなる例において、送達剤を、予防的タンパク質を送達するために予防的に使用できる。さらなる例では、核酸分子の送達および／または発現は、例えば、肉生産を改善するため(例えば、ミオスタチン産生遮断による)、農業用途で使用するためのタンパク質をコードし得る。処置する特定の適用または特定の疾患または障害、例えばセクションＧに記載するいずれか、により核酸分子を選択するのは当業者のレベルの範囲内である。
核酸分子はネイキッドＤＮＡとして送達できまたは媒体中または複合体または構築物として送達できる。それゆえに、送達剤は核酸分子であるかそれを含むと理解される。例えば、核酸分子は、核酸分子を含むベクターまたはプラスミド、例えばウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含み得る。核酸分子は、リポソームに被包され得る。核酸分子は、他の薬剤、例えば標的リガンドまたは他の部分と複合体化され、ナノ粒子として送達され得る。
核酸分子は、発現の制御または調節のためにプロモーターないしエンハンサーにより駆動され得る。プロモーターは、コード領域に操作可能に結合する。当業者に知られるあらゆる強力なプロモーターを、ＤＮＡ発現の駆動に使用できる。プロモーターは構成的プロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、組織特異的プロモーター、誘発性または制御可能プロモーターであり得る。特異的態様において、遺伝子治療の目的で導入する核酸分子は、核酸の発現が転写の適当なインデューサーの存在下または非存在下での制御により制御可能であるように、コード領域に操作可能に結合した誘発性プロモーターである。一般的にプロモーターは、コードされたポリペチドの制御された発現を可能にするための、制御されたプロモーターおよび転写因子発現系、例えば公開されたテトラサイクリン制御系または他の制御可能系である(例えば公開国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ０１／３０８４３参照)。他のプロモーターの例は、例えば米国特許番号５,９９８,２０５に記載された、例えば、αフェトプロテイン、ＤＦ３、チロシナーゼ、ＣＥＡ、界面活性剤タンパク質およびＥｒｂＢ２プロモーターを含む、組織選択的プロモーターである。制御可能プロモーター系は、例えば、Clontech(Palo Alto, CA)から入手可能なＴｅｔ−Ｏｎ(およびＴｅｔ−Ｏｆｆ)系である。このプロモーター系は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリンにより制御される導入遺伝子の制御発現を可能にする。他の制御可能プロモーター系が知られている(例えば、発明の名称“Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches”であり、例えばホルモン受容体からの、リガンド結合ドメインおよび転写制御ドメインを含む遺伝子スイッチを記載する公開米国出願番号２００２−０１６８７１４参照)。用い得る他の適切なプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーターおよび／またはＥ３プロモーター、または異種プロモーター、例えばサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター、誘発性プロモーター、例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーターおよびＡｐｏＡＩプロモーターを含むが、これらに限定されない。
ある例においては、ここにおける方法、使用または組成物中の送達剤は、所望のポリペチドをコードする核酸分子であるか、それを含む。本発明方法による送達剤の送達により、コードされたポリペチドは、生物学的治療または薬物として使用できるものであり得る。核酸分子は任意の所望の遺伝子産物、例えばサイトカイン、凝固因子または凝血因子、ホルモン、増殖因子、酵素、輸送タンパク質、制御タンパク質、受容体または抗原をコードし得る。核酸分子は、細胞増殖、細胞分化または代謝を制御するためのホルモンタンパク質をコードし得る。所望の治療的ポリペチドをコードする特定の核酸分子の選択は、処置する特定の疾患または状態により、当業者のレベルの範囲内である。例えば、核酸分子は、処置対象がＩ型糖尿病を有するならばインスリンであり、対象が血友病を有するならば特異的血凝固因子であり、対象がパーキンソン病を有するならばドーパミンでありまたは処置する対象が家族性高コレステロール血症を有するならばＬＤＬ受容体である。当業者は、処置する対象の特定の必要性に基づき、必要なポリペチドおよびそれをコードする核酸をどのように選択するか知っている。核酸分子の例は、免疫調節性タンパク質、酵素群、ホルモン、サイトカイン、受容体、抗体または抗血管形成薬剤をコードする。核酸分子は、融合タンパク質であるタンパク質をコードし得る。
選択核酸分子は、免疫刺激タンパク質であるかまたは免疫調節特性を示すポリペチドをコードし得る。このような核酸分子は、サイトカイン、例えば、インターロイキン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子など、例えばインターロイキン(ＩＬ)−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびｆｌｔ３をコードする遺伝子；免疫細胞(Ｂ７、表面抗原分類２８(ＣＤ２８)、主要組織適合複合体クラスＩ(ＭＨＣクラスＩ)、ＭＨＣクラスII、抗原ペプチド輸送体(ＴＡＰｓ))との相互作用を刺激するタンパク質；腫瘍関連抗原(Ｔ細胞に認識されるメラノーマ抗原１(ＭＡＲＴ−１)からの免疫原性ポリペプチド、ｇｐ１００(メラニン形成細胞タンパク質ｐｍｅｌ−１７)；チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質２、メラニン形成細胞刺激ホルモン受容体、黒色腫関連抗原１(ＭＡＧＥ１)、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、Ｂ黒色腫抗原(ＢＡＧＥ)、癌−生殖系列抗原(ＧＡＧＥ)、癌−精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、変異黒色腫関連抗原１(ＭＵＭ−１)、サイクリン依存性キナーゼ４(ＣＤＫ−４)、カスパーゼ８、モノクローナル抗体Ｋｉ−６７(ＫＩＡ)０２０５により同定される抗原、ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ２Ｒ１７０１、α−フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０、ムチン１(ＭＵＣ−１)、癌胎児性タンパク質、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、細胞分裂制御タンパク質２７(ＣＤＣ−２７)、低密度脂質受容体−ＧＤＰ−ｌ−フコース：β−ｄ−ガラクトシド２−α−ｌ−フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質(ＬＤＬＲ−ＦＵＴ)、テロメラーゼ逆転写酵素および前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ))、阻害シグナルを遮断する抗体をコードするｃＤＮＡ(細胞毒性Ｔリンパ球抗原４(ＣＴＬＡ４)遮断)、ケモカイン(マクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ１)、ＭＩＰ３、ＣＣＲ７リガンドおよびカルレティキュリン)および他のタンパク質を含むが、これらに限定されない。
核酸分子は、リガンドに結合する受容体または増殖因子受容体またはそれらの部分に結合する増殖因子またはそれらの部分であるポリペプチドをコードできる。本増殖因子および増殖因子受容体は当分野で知られる。例えば、Baxley and Serra, Curr. Drug Targets 11(9):1089-102 (2010); Lo, Curr. Mol. Pharmacol. 3(1):37-52 (2010); Barakat and Kaiser, Expert Opin. Investig. Drugs 18(5):637-46 (2009); Trojanowska and Varga, Curr. Opin. Rheumatol. 19(6):568-73 (2007); Jimeno and Hidalgo, Biochim. Biophys. Acta 1766(2):217-29 (2006); Finch and Rubin, J. Natl. Cancer Inst. 98(12):812-24 (2006); Lo et al., Breast Canc. Res. Treat. 95(3):211-8 (2006); Schilephake, Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 31(5):469-84 (2002); George, Urology 60(3 Suppl. 1):115-21 (2002)参照。増殖因子は、例えば、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、トランスフォーミング増殖因子αおよびβおよび血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)を含む。増殖因子受容体は、例えば、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、線維芽細胞増殖因子受容体(ＦＧＦＲ)またはトランスフォーミング増殖因子受容体(ＴＧＦＲ)を含む。
核酸分子は、一本鎖抗体または抗イディオタイプ抗体を含む、抗体または抗体フラグメントであるポリペチドをコードし得る。本抗体は当分野で知られる。例えば、Drugs Today 39(Supl. C):1-16 (2003); Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols; Ed. Dimitrov, A. S., Humana Press, Springer, New York, NY (2009); Zheng et al. (2007) Cell Research, 17:303-306参照。コードされる抗体またはそのフラグメントの非限定的例は、例えば、抗胸腺細胞グロブリン、ムロモナブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブまたはトラスツマブを含む。
核酸分子は、酵素(例えば、ガルスルファーゼ、ラロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、酸アルファグルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ)、ホルモン(例えば、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、インスリン、甲状腺ホルモン、エリスロポエチン)、血管形成モジュレーター、免疫調節剤(デニロイキンジフチトクス；インターロイキン−２)、疼痛モジュレーター(例えば、ＮＰ２)、融合タンパク質(例えば、インシュリン様増殖因子２および酸アルファグルコシダーゼ(ＩＧＦ２−ＧＡＡ)；アバタセプト；アレファセプト；エタネルセプト)、ポリ(ＡＤＰ−リボース)ポリメラーゼ(ＰＡＲＰ)阻害剤、ハイランまたはヒアルロナンの他の誘導体またはアレルゲン(例えば、ピーナッツまたは他の食物アレルゲン)であるが、これらに限定されないポリペプチドをコードし得る。
例えば、核酸分子は、ヒトエリスロポエチンまたはその変異体(例えば米国特許番号４,７０３,００８、受入番号Ｐ０１５８８参照)、ヒトＧ−ＣＳＦまたはその変異体(例えば、受入番号Ｐ０９９１９参照)；ヒトＧＭ−ＣＳＦまたはその変異体(例えばCantrell et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci, 82:6250-4；受入番号Ｐ０４１４１参照)；プラスミノーゲンアクティベーターまたはその変異体(例えば、受入番号Ｐ００７５０参照)；ウロキナーゼまたはその変異体(例えば受入番号Ｐ００７４９参照)；インスリンまたはその変異体(例えば、米国特許番号４,６５２,５２５、米国特許番号４,４３１,７４０、Groskreutz et al. (1994) J. Biol. Chem., 269:6241-5、受入番号Ｐ０１３０８参照)；インターロイキン類、例えばインターロイキン−１またはその変異体(例えば受入番号Ｐ０１５８３、Ｐ０１５８４参照)、インターロイキン−２またはその変異体(例えば受入番号Ｐ６０５６８、米国特許番号４,７３８,９２７参照)、インターロイキン−３またはその変異体(例えば受入番号Ｐ０８７００、欧州公報ＥＰ２７５,５９８または２８２,１８５参照)、インターロイキン−４またはその変異体(例えば、受入番号Ｐ０５１１２参照)、インターロイキン７またはその変異体(例えば受入番号Ｐ１３２３２、米国特許番号４,９６５,１９５参照)、インターフェロンまたはその変異体、第VIII因子またはその変異体(例えば受入番号Ｐ００４５１参照)、第IX因子またはその変異体(例えばＰ００７４０参照)、フォン・ヴィルブランド因子またはその変異体(例えば受入番号Ｐ０４２７５参照)またはヒト成長ホルモンまたはその変異体(例えば受入番号Ｐ０１２４１、Ｐ０１２４２、米国特許番号４,３４２,８３２参照)をコードし得る。
他の興味のある核酸分子は、抗血管形成または自殺タンパク質をコードするものを含む。抗血管形成タンパク質は、例えば、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＴｒｐＲＳフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、ＰＥＤＦ、バソスタチン、細胞外マトリックスタンパク質の種々のフラグメントおよび増殖因子／サイトカイン阻害剤を含む。細胞外マトリックスタンパク質の種々のフラグメントは、アンジオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲン−Ｅフラグメント、トロンボスポンジン、タムスタチン、カンスタチンおよびレスチンを含むが、これらに限定されない。増殖因子／サイトカイン阻害剤は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ｓＮＲＰ１、アンギオポエチン／ｔｉｅアンタゴニスト、ｓＴｉｅ−２、ケモカイン(ＩＰ−１０、ＰＦ−４、Gro-beta、ＩＦＮ−ガンマ(Ｍｉｇ)、ＩＦＮ、ＦＧＦ／ＦＧＦＲアンタゴニスト(ｓＦＧＦＲ)、エフリン／Ｅｐｈアンタゴニスト(ｓＥｐｈＢ４およびセフリンＢ２)、ＰＤＧＦ、ＴＧＦおよびＩＧＦ−１を含むが、これらに限定されない。自殺タンパク質は、ジフテリア毒素Ａの発現のように、細胞死に至り得るタンパク質またはタンパク質の発現が細胞をある薬物に対して選択的感受性とする、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子(ＨＳＶ−ＴＫ)の発現は、細胞を抗ウイルス化合物、例えばアシクロビル、ガンシクロビルおよびＦＩＡＵ(１−(２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル)−５−ヨードウラシル)に感受性とするようなものである。他の自殺タンパク質は、カルボキシペプチダーゼＧ２(ＣＰＧ２)、カルボキシルエステラーゼ(ＣＡ)、シトシンデアミナーゼ(ＣＤ)、チトクロムＰ４５０(ｃｙｔ−４５０)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)、ニトロレダクターゼ(ＮＲ)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ＰＮＰ)、チミジンホスホリラーゼ(ＴＰ)、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(ＶＺＶ−ＴＫ)およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)を含む。他のコードされるタンパク質は、安全性スイッチとして有用な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ＨＳＶ−ＴＫ)(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２５８６０として公開された１９９７年１１月１９日出願の米国特許出願番号０８／９７４,３９１参照)、Ｎｏｓ、ＦａｓＬおよびｓＦａｓＲ(可溶性Ｆａｓ受容体)を含むが、これらに限定されない。
ここでの他の例において、核酸分子は、リソソーム貯蔵障害に関与するタンパク質、特にそこで欠損している酵素をコードするものであり、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通型タンパク質、システイントランスポーター、酸セラミダーゼ、酸α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸β−グルコシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ、酸β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α−マンノシダーゼ、酸β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ニーマン・ピック病Ｃ１型(ＮＰＣ−１)、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)、アセチル−ＣｏＡ：αグルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、β−グルクロニダーゼおよび酸リパーゼを含むが、これらに限定されない。種々のリソソーム貯蔵疾患におけるこのような酵素群の役割は当業者に知られる(例えば公開された米国特許出願番号ＵＳ２００８／００２５９５２；ＵＳ２０１２０００９２６８参照)。酵素の選択は特定のリソソーム障害による。興味のある核酸分子の非限定的例は、ムコ多糖症障害(例えば、スライ症候群)の処置のためのβ−グルクロニダーゼ；ハーラー症候群の処置のためのα−Ｌ−イズロニダーゼ；シャイエ症候群またはハーラー−シャイエ症候群の処置のためのα−Ｌ−イズロニダーゼ；ハンター症候群の処置のためのイズロン酸スルファターゼ；サンフィリポ症候群Ａ(ＭＰＳ IIIＡ)の処置のためのヘパリンスルファミダーゼ；サンフィリポ症候群Ｂ(ＭＰＳ IIIＢ)の処置のためのＮ−アセチルグルコサミニダーゼ；サンフィリポ症候群Ｃ(ＭＰＳ IIIＣ)の処置のためのアセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ；サンフィリポ症候群Ｄ(ＭＰＳ IIIＤ)の処置のためのＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ；モルキオ症候群Ａの処置のためのガラクトース−６−硫酸スルファターゼ；モルキオ症候群Ｂの処置のためのβ−ガラクトシダーゼ；マロトー・ラミー症候群の処置のためのＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ；ファブリー病の処置のためのα−ガラクトシダーゼ；ゴーシェ病の処置のためのグルコセレブロシダーゼまたはグリコーゲン貯蔵障害(例えば、ポンペ病)の処置のためのリソソーム酸α−グルコシダーゼをコードするあらゆるものを含む。
目的とする核酸分子の他の例は、アルツハイマー病の処置のためのタンパク質、例えばメタロエンドペプチダーゼ、例えば、アミロイド−ベータ分解酵素ネプリライシン、インスリン分解酵素インスリジンまたはthimetオリゴペプチダーゼ；ウイルス感染、例えばヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染を処置するための抗レトロウイルス剤として作用できるタンパク質またはペプチド、例えば、エンフュービルタイド(フゼオン(登録商標))；筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)の処置のためのタンパク質、例えば、インスリン増殖因子−１(ＩＧＦ−１)、カルビンディンＤ２８、パルブアルブミン、ＨＩＦ１−アルファ、ＳＩＲＴ−２、ＶＥＧＦ、ＳＭＮ−１、ＳＭＮ−２、ＧＤＮＦまたは毛様体神経栄養因子(ＣＮＦ)であるが、これらに限定されないもの；血友病を有する対象で欠損しているタンパク質、例えば、第VIII因子または第IX因子であるが、これらに限定されないもの；Ｉ型糖尿病処置のためのタンパク質、例えばフューリン切断可能インスリン遺伝子；家族性高コレステロール血症処置のためのタンパク質、例えば低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬＲ)；リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)処置のためのタンパク質、例えばリポタンパク質リパーゼ(ＬＰＬ)；アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損処置のためのタンパク質、例えばＡＡＴ；クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型またはII型処置のためのタンパク質、例えば肝臓ビリルビンＵＤＰ−グルクロニル−トランスフェラーゼまたはその機能的変異体、例えば、ＵＧＴ１Ａ１(Gong et al. (2001) Pharmacogentics, 11:357-68)；グリコーゲン貯蔵欠損１型Ａ処置のためのタンパク質、例えばグルコース−６ホスファターゼ；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ欠損処置のためのタンパク質、例えばホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ガラクトース血症と関連するタンパク質、例えばガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ；フェニルケトン尿症と関連するタンパク質、例えばフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、メープルシロップ尿症と関連するタンパク質、例えば分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ；チロシン血症Ｉ型と関連するタンパク質、例えばフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ；メチルマロン酸血症と関連するタンパク質、例えばメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ；オルニチントランスカルバミラーゼ欠損と関連するタンパク質、例えばオルニチントランスカルバミラーゼ；シトルリン血症と関連するタンパク質、例えばアルギニノコハク酸シンテターゼ；重症複合免疫不全と関連するタンパク質、例えばアデノシンデアミナーゼ；痛風およびレッシュ・ナイハン症候群と関連するタンパク質、例えばヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；ビオチニダーゼ欠損と関連するタンパク質、例えばビオチニダーゼ；ゴーシェ病と関連するタンパク質、例えばベータ−グルコセレブロシダーゼ；スライ症候群と関連するタンパク質、例えばベータ−グルクロニダーゼ；ツェルウェーガー症候群と関連するタンパク質、例えばペルオキシソーム膜タンパク質７０kDa；急性間欠性ポルフィリン症と関連するタンパク質、例えばポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(ＰＢＤＧ)；アルファ−１アンチトリプシン欠損(気腫)と関連するタンパク質、例えばアルファ１アンチトリプシン、癌と関連するタンパク質、例えば腫瘍サプレッサー遺伝子、例えばｐ５３；パーキンソン病処置のためのグルタミン酸デカルボキシラーゼ(ＧＡＤ)をコードするタンパク質；またはリソソーム貯蔵疾患、特にサンフィリポ症候群(別名ムコ多糖症III型、ＭＰＳ III)で欠損しているタンパク質、例えばリソソームスルファミダーゼおよびα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)をコードするあらゆるものを含む、これらに限定されない。
あるいは、治療核酸は、その効果をＲＮＡレベルで、例えば、アンチセンスメッセージまたはリボザイム、スプライシングまたは３’プロセシング(例えば、ポリアデニル化)に影響するタンパク質または細胞内の他の遺伝子の発現レベルに影響するタンパク質をコードすることにより、例えばｍＲＮＡ蓄積の速度の変更、ｍＲＮＡ輸送の変更および／または転写後制御の変化を仲介することにより、発揮する。これらは、とりわけ、増殖に必須のタンパク質をコードするｍＲＮＡを指向できる能力を有するＲＮＡ、例えばＲＮＡｉおよび他の二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスおよびリボザイム、例えば構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼ群、細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子、ヌクレアーゼ(例えばＲＮａｓｅ Ａ)またはプロテアーゼ(例えばトリプシン、パパイン、プロテイナーゼＫおよびカルボキシペプチダーゼ)の改変された細胞質変異体をコードする遺伝子を含む。
例えば、核酸分子は、遺伝子または遺伝子産物の核酸ベースの阻害剤、例えば遺伝子の転写または翻訳の阻害剤であり得る。送達剤は短干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)配列、アンチセンス配列またはマイクロ−ＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)配列であり得る。ＲＮＡは、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば１９〜２５または２１〜２５ヌクレオチド長であり得る。遺伝子の発現産物が、５’非翻訳(ＵＴ)領域、ＯＲＦまたは３’ＵＴ領域を含む、標的遺伝子転写物のヌクレオチドセグメント(例えば少なくとも１９〜２５ヌクレオチド長セグメントまで)と相補的である特異的二本鎖由来ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により標的化されるｓｉＲＮＡ仲介遺伝子サイレンシング方法は当分野で知られる(例えばＰＣＴ国際得国際特許公開番号ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３またはＷＯ０１／２９０５８参照)。ｓｉＲＮＡ配列は、典型的に正確な相補性を有する標的ｍＲＮＡ内の独特の配列と結合し、標的ｍＲＮＡ分子の分解をもたらす。ｓｉＲＮＡ配列はｍＲＮＡ分子のどこにでも結合できる。ｓｉＲＮＡにより標的化される配列は、目的とするポリペチドを発現する遺伝子このようなまたは遺伝子の上流もしくは下流モジュレーターを含む。遺伝子の上流または下流モジュレーターの例は、目的とするポリペチドと相互作用する遺伝子プロモーター、キナーゼまたはホスファターゼと結合する転写因子および目的とするポリペチドに影響を与え得る制御経路に含まれるポリペプチドを含む。ｍｉＲＮＡ配列は、典型的に正確なまたは必ずしも正確ではないが相補性を有する標的ｍＲＮＡ内の独特の配列と結合し、標的ｍＲＮＡ分子の翻訳阻止をもたらす。ｍｉＲＮＡ配列はｍＲＮＡ配列のどこにでも結合できるが、一般的にｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域内と結合する。
ヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列(例えば２１〜２５ヌクレオチド長)は、例えば、低分子ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)配列、長い(例えば６０〜８０ヌクレオチド)前駆体配列の転写と、続くｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列を産生するための細胞ＲＮＡｉ機構によるプロセシングにより発現ベクターから製造できる。あるいは、ヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列(例えば２１〜２５ヌクレオチド長)は、例えば、化学的に合成できる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ配列の化学合成は、Dharmacon, Inc.(Lafayette, CO)、Qiagen(Valencia, CA)およびAmbion(Austin, TX)のような業者から商業的に入手可能である。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子の送達方法は当分野で知られる。例えば、Oh and Park, Adv. Drug. Deliv. Rev. 61(10):850-62 (2009); Gondi and Rao, J. Cell Physiol. 220(2):285-91 (2009);およびWhitehead et al., Nat. Rev. Drug. Discov. 8(2):129-38 (2009)参照。
例えば、核酸分子はアンチセンス核酸配列であり得る。ハイブリダイゼーション相互作用により、アンチセンス核酸は細胞または病原体ｍＲＮＡの発現を遮断する。アンチセンス核酸分子は、例えば、発現ベクターから転写されて、標的ｍＲＮＡおよび／または標的をコードする内在性遺伝子の少なくとも独特の部分と相補性であるＲＮＡを生じる。特異的細胞条件下のアンチセンス核酸ハイブリダイゼーションは、転写および／または翻訳阻害による標的タンパク質発現阻害をもたらす。アンチセンス核酸類の例は、次のIsis Pharmaceuticals, Inc.製品を含むが、これらに限定されない：高コレステロールのためのミポメルセン；冠動脈疾患、炎症および腎疾患のためのＩＳＩＳ−ＣＲＰＲｘ；高トリグリセリドのためのＩＳＩＳ−ＡＰＯＣIIIＲｘ；凝血障害のためのＩＳＩＳ−ＦＸＩＲｘ；冠動脈疾患のためのＢＭＳ−ＰＣＳＫ９Ｒｘ；２型糖尿病のためのＩＳＩＳ−ＳＧＬＴ２Ｒｘ、ＩＳＩＳ−ＰＴＰ１ＢＲｘ、ＩＳＩＳ−ＧＣＧＲＲｘおよびＩＳＩＳ−；肥満のためのＩＳＩＳ−ＦＧＦＲ４Ｒｘ；癌のためのＯＧＸ−０１１ｆ、ＬＹ２１８１３０８、ＩＳＩＳ−ＥＩＦ４ＥＲｘ、ＯＧＸ−４２７、ＩＳＩＳ−ＳＴＡＴ３Ｒｘ；ＡＬＳのためのＩＳＩＳ−ＳＯＤ１Ｒｘ；ＴＴＲアミロイド症のためのＩＳＩＳ−ＴＴＲＲｘ；脊髄性筋萎縮症のためのＩＳＩＳ−ＳＭＮＲｘ；ＣＭＶ網膜炎のためのビトラビーン；潰瘍性大腸炎のためのアリカホルセン；重度細菌感染のためのＡＣＨＮ−４９０；多発性硬化症のためのＡＴＬ１１０２；局所線維症のためのＥＸＣ００１；眼疾患のためのｉＣｏ−００７；および先端巨大症のためのＡＴＬ１１０３。ここで教示する方法を使用して投与できるマイクロＲＮＡの例は、次のSantaris Pharm製品を含むが、これらに限定されない：Ｃ型肝炎のためのMiravirsen；固形腫瘍のためのＥＺＮ−２９６８；癌のためのＥＺＮ−３０４２；アンドロゲン受容体のためのＥＺＮ−４１７６；高コレステロールのためのＳＰＣ４９５５およびＳＰＣ５００１。さらなる治療的マイクロＲＮＡは、癌の処置のための次のMirna Therapeutics, Inc.製品を含む：ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−Ｒｘ０２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−Ｒｘ−０１、ｍｉＲ−Ｒｘ−０３、ｍｉＲ−Ｒｘ−０６およびｍｉＲ−Ｒｘ−０７。
他の例において、核酸分子は、欠損細胞ＲＮＡを修復するかまたは望まない細胞または病原体コード化ＲＮＡを破壊するために設計したリボザイム(例えばハンマーヘッド型またはヘアピンベースリボザイム)であり得る(例えばSullenger (1995) Chem. Biol., 2:249-253; Czubayko et al. (1997) Gene Therapy, 4:943-9; Rossi (1997) Ciba Found. Symp., 209:195-204; James and Gibson (1998) Blood, 91:371-82; Sullenger (1996) Cytokines Mol. Ther., 2:201-5; Hampel (1998) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 58:1-39; or Curcio et al. (1997) Pharmacol Therapy, 74:317-32参照)。
ある例においては、核酸分子は、検出可能であるポリペチドをコードする。このようなポリペプチドの例は、ルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を含むが、これらに限定されない。具体例において、送達剤は、核を含む酸分子ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターであり得る。このような送達剤の例はＡｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃである(例えば実施例１参照)。このようなアデノウイルスは、付加的なまたは異なる核酸分子、例えば当分野で知られたまたはここに記載した任意のものを含むようにさらに修飾してよい。例えば、その中で発現されるルシフェラーゼ導入遺伝子は、非検出ポリペプチドをコードする核酸分子と置換または交換できる。
２. 核酸分子を含む媒体および構築物
核酸分子は、送達のためのベクター、構築物または他の媒体中に提供され得る。この例は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、ナノ粒子または細胞自体である。送達のためのこのような構築物または媒体の製造方法は当業者に周知である。例えば、核酸分子は、当業者に周知の標準的方法を使用して、非ウイルスまたはウイルスベクターに導入できる。いくつかの例では、通例の分子生物学および組み換えＤＮＡ手法を使用できる(例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1998, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)参照)。他の例においては、核酸分子を、何らかの適当な制御配列または配列の制御下にあるように導入できる。他の例において、核酸分子を、調節エレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサーを含む発現カセットの一部として導入できる。適当な調節エレメントは、例えば、所望の発現レベルに基づき、当業者が選択できる。具体例において、調節エレメントは、遺伝子発現を組織特異的細胞に制限するための組織特異的プロモーター、例えば肝臓特異的プロモーターを包含するように選択できる。
ａ. ウイルスおよびウイルスベクター
ウイルスを本発明方法、使用および組成物において送達剤として使用でき、これにより外来核酸配列をウイルスベクターに挿入する。ウイルスは、宿主細胞へのウイルスＤＮＡ伝達に効率的であり、感染でき、ウイルス付着タンパク質(例えばカプシドまたは糖タンパク質)により特異的標的細胞に取り込まれ、そして非必須遺伝子を除去し、異種核酸分子を付加するように操作できるため、インビボでの核酸分子に有用である。多くのウイルスベクターが当業者に知られる。本発明方法で使用できるウイルスの例は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ヘパドナウイルス、バキュロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、オルトミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルスおよびパルボウイルスを含むが、これらに限定されない。具体例において、ウイルスはアデノウイルスである。ウイルスの選択は当業者のレベルの範囲内であり、多くの因子、例えばウイルスＤＮＡの複製または組込みに対する要求、ウイルスの指向性および／またはウイルスの免疫原性による。このようなウイルスおよびその誘導体は周知であり、当業者が利用可能である。例えば、多くがAmerican Type Culture Collection(ATCC, Rockville, Md.)または業者(例えばVector Biolabs, Philadelphia, PA; Applied Biological Materials, Inc., Richmond, British Columbia, Canada)から入手可能である。
組み換えウイルス産生に使用するウイルスベクターは、複製コンピテントウイルスおよび複製欠損ウイルスを含む。複製欠損ウイルスにおいて、ウイルスは、典型的にウイルス複製に関連する１個以上の遺伝子を欠き、感染の第一サイクル以降複製できない。いくつかの例において、複製欠損ウイルスを産生するために、トランスファーベクター、パッケージングベクターまたはヘルパーウイルスが必要である。例えば、パッケージングベクターはコスミドとしてまたは欠損ベクターのパッケージングのためのウイルス構造タンパク質を提供する細胞株に提供され得る。
本発明方法において使用するウイルスベクターはまた選択した導入遺伝子に操作可能に結合する調節エレメント、例えばプロモーターおよびエンハンサーを含む発現カセットも含み得る。上記のとおり、あらゆる適切なプロモーターを使用できる。適切なプロモーターおよびエンハンサーは、選択したウイルスベクターにおいて使用するために、当分野で広範に利用可能である。典型的に、プロモーターは構成的プロモーターである。プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーター、切断型ＣＭＶプロモーター、ヒト血清アルブミンプロモーターまたはα−１−アンチトリプシンプロモーターを含むが、これらに限定されない。例えば、プロモーターは、既知転写リプレッサーへの結合部位が欠失している、切断型ＣＭＶプロモーターである。他の例において、プロモーターは、誘発性プロモーターである。例えば、プロモーターは、誘発性エクジソンプロモーターである。他のプロモーターの例は、ステロイドプロモーター、例えばエストロゲンおよびアンドロゲンプロモーターおよびメタロチオネインプロモーターを含む。エンハンサーは組織特異的または非特異的エンハンサーであり得る。例えば、エンハンサーは肝臓特異的エンハンサーエレメントである。エンハンサーエレメントの例は、ヒト血清アルブミン(ＨＡＳ)エンハンサー、ヒトプロトロンビン(ＨＰｒＴ)エンハンサー、α−１−マイクログロブリンエンハンサー、イントロンアルドラーゼエンハンサーおよびアポリポタンパク質Ｅ肝臓制御領域を含むが、これらに限定されない。
ｉ. アデノウイルス
アデノウイルスは、本発明方法、使用および組成物において興味のある核酸分子を含む送達剤として使用できるウイルスベクターである。アデノウイルスは、約３６kbのゲノムを有する核ＤＮＡウイルスであり、古典的遺伝学および分子生物学を通して十分特徴づけされている(Horwitz, M. S., “Adenoviridae and Their Replication,” in Virology, 2nd edition, Fields, B. N., et al., eds., Raven Press, New York, 1990)。ゲノムは、２種のウイルスタンパク質の一過性産生に照らして、早期(Ｅ１〜Ｅ４として知られる)および後期(Ｌ１〜Ｌ５として知られる)転写単位に分類される。これらの事象の分界はウイルスＤＮＡ複製である。
アデノウイルスは、呼吸器および消化管の上皮細胞に天然指向性を有する。アデノウイルスはまた肝細胞、例えば肝細胞および内皮細胞に感染でき、これは、全身投与後に肝臓へのウイルスのクリアランス後に起こり得る。特に、本発明方法において、実質への直接注射は、肝細胞による選択的肝細胞取り込みを促進する。ウイルス表面上のペントンベースおよび繊維タンパク質がウイルス指向性を生じる。アデノウイルス粒子と宿主細胞の間の複数相互作用が、効率的細胞侵入のために必要である(Nemerow (2000) Virology 274:1-4)。亜群Ｃアデノウイルス、例えばアデノウイルス２および５(Ａｄ２またはＡｄ５)について、ウイルス侵入経路は十分特徴づけされており、２個の異なる細胞表面事象を含むと考えられる。第一に、アデノウイルス繊維ノブとコクサッキー−アデノウイルス受容体(ＣＡＲ)の間の高親和性相互作用が細胞表面へのアデノウイルス粒子付着を仲介する。続くペントンと、共受容体として作用する細胞表面インテグリン類αｖβ３およびαｖβ５の結合が、ウイルス内部移行を増進する。肺上皮細胞を含む多くのヒト組織で発現されるＣＡＲ(Bergelson et al., (1997) Science 275: 1320-1323)は、亜群Ｂ以外のほとんどのアデノウイルス亜群で細胞受容体として機能しているようである(Bergelson et al., (1997) Science 275: 1320-1323; Roelvink et al., (1998) J. Virol. 72: 7909-7915)。
アデノウイルスは５０を超える血清型を含み、これはＡ〜Ｆの６個の亜群に分割される。American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, Md.)および営利および非営利提供者から入手可能なこれらのアデノウイルス血清型のいずれも本発明方法または使用において、当分野で知られるとおりさらなる修飾源として使用できる。また、任意の他の供給元から入手可能な任意の他の血清型のアデノウイルスを使用できまたはさらに修飾できる。例えば、アデノウイルスは、亜群Ａ(例えば、血清型１２、１８、３１)、亜群Ｂ(例えば、血清型３、７、１１ａ、１１ｐ、１４、１６、２１、３４、３５、５０)、亜群Ｃ(例えば、血清型１、２、５、６)、亜群Ｄ(例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、１９ｐ、２０、２２−３０、３２、３３、３６−３９、４２−４９、５１)、亜群Ｅ(例えば、血清型４)、亜群Ｆ(例えば、血清型４０、４１)または任意の他のアデノウイルス血清型のものであり得る。ある態様において、アデノウイルスは亜群Ｃアデノウイルスであるかまたは亜群Ｃアデノウイルスに由来する。亜群Ｃアデノウイルスは、Ａｄ２およびＡｄ５を含むが、これらに限定されない。
アデノウイルスベクターは当分野で入手可能であり(例えばAmerican Type Culture Collection(ATCC), Rockville, Md.から入手可能)、多くの異なるアデノウイルス血清型からの野生型アデノウイルスタンパク質の配列は当分野で知られる(例えばRoberts et al. (1984) J. Biol. Chem., 259:13968-13975; Chroboczek et al. (1992) Virology, 186:280-285; Sprengel et al. (1994) J. Virol., 68:379-389; Chillon et al. (1999) J. Virol., 73:2537-2540; Davison et al. (1993) J. Mol. Biol., 234:1308-1316; www. binf.gmu.edu/wiki/index.php/Human_Adenovirus_Genome_Sequences_and_Annotations)。アデノウイルスベクターは、例えば、American Type Culture Collection(ＡＴＣＣ)または他の営利または非営利提供者から当業者が広く利用できる。ＡＴＣＣから、アデノウイルスはＡＴＣＣ番号ＶＲ−１〜ＶＲ−１６１６として入手可能である。例えば、野生型アデノウイルス２型は、ＡＴＣＣからＶＲ−８４６として入手可能であり、５型はＶＲ−５およびＶＲ−１０８２として入手可能である。当分野でここに記載した血清型のいずれかに由来し、または当業者に知られる任意の適切な方法により、多くの組み換えまたは修飾アデノウイルスを取得できる。
アデノウイルスベクターは遺伝子送達媒として使用する上でいくつかの利点を有しており、その利点には分裂および非分裂細胞の両者への指向、最小病原性、ベクターストックを製造する上での高力価複製能力および大挿入物を運搬する能力が含まれる (例えばBerkner (1992) Curr. Top. Micro. Immunol., 158:39-66; Jolly et al. (1994) Cancer Gene Therapy, 1:51-64参照)。
例えば、アデノウイルスベクターは、第一早期遺伝子領域(Ｅ１〜Ｅ４)に少なくとも１個の欠失を含む欠損アデノウイルスベクターを含む。アデノウイルスベクターの修飾は、当分野で知られる欠失、例えばＥ１、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３またはＥ４コード領域の１個以上の欠失を含む。例えば、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３および／またはＥ４遺伝子の場所への異種核酸分子の置換により製造できる。欠失は、制限エンドヌクレアーゼ群を使用して実施できる。例えば、Ｅ１ａ領域は、Ｅ１ａ領域内の都合よい制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して欠失できる。しばしば、Ｅ３の部分はまた、新ウイルス粒子にパッケージングするために必要なサイズ制限をなお充足しながら、大きな異質ＤＮＡ片の挿入を可能とするために、制限エンドヌクレアーゼ付加により欠失する。これらの領域の欠失のため、アデノウイルスベクターのクローニングキャパシティは約８kbであり得る。このようなアデノウイルスベクターは、第一ウイルス早期遺伝子領域、例えばＥ１ａおよびＥ１ｂ領域を含むＥ１における少なくとも１個の欠失のために、典型的に複製欠損アデノウイルスと呼ばれる。
ウイルスＥ１領域を欠失する早期遺伝子は、組み換えアデノウイルスを複製欠損とし、その後に感染した標的細胞における感染性ウイルス粒子の産生を不可能にする。それゆえに、早期遺伝子欠失アデノウイルスゲノムを複製させ、例えばＥ１欠失アデノウイルスゲノムを複製させ、ウイルス粒子を産生することを可能にするために、不在遺伝子産物を提供する補完システムが必要である。例えば、Ｅ１補完は、典型的にＥ１を発現する細胞株、例えばヒト胚腎臓パッケージング細胞株、すなわち２９３と呼ばれる上皮性細胞株(ＡＴＣＣに受入番号ＣＲＬ−１５７３として寄託)により提供される。細胞株２９３は、細胞株におけるＥ１欠失ウイルスの増殖を“補助”するためのＥ１遺伝子領域産物を提供する、アデノウイルスのＥ１領域を含む(例えば、Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-71, 1977参照)
。さらに、アデノウイルスＥ４領域の部分を有する欠損アデノウイルスの産生に有用な細胞株が報告されている(例えば国際公開出願番号ＷＯ９６／２２３７８参照)。Ｅ３もベクターから欠失させ得るが、ベクター産生に必要ではないため、補完産生細胞から除いてもよい。
ベクターとして複製欠損ウイルスを使用する利点は、最初に感染した細胞で複製できるが、新感染性ウイルス粒子を産生できないため、他の細胞型に拡散できる範囲が制限されていることである。複数欠損アデノウイルスベクターおよび補完細胞株も記載されている(例えば公開出願番号ＷＯ９５／３４６７１、米国特許番号５,９９４,１０６参照)。複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている(Berkner et al., J. Virol. 61:1213-20 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-83 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virol. 57:267-74 (1986); Davidson et al., J. Virol. 61:1226-39 (1987); Zhang et al., BioTechniques 15:868-72 (1993); Berkner (1983) Nuc. Acids Res. 11:6003; Ghosh-Choudhury (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:964; Gilardi et al. (1990) FEBS Lett. 267:60; Mittal (1993) Virus Res. 28:67; Yang (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4601；および国際公開ＰＣＴ ＷＯ１９９５／０２６４１１参照)。
アデノウイルスベクターはまたベクター増殖に必要なＩＴＲおよびΨ以外の全ウイルス遺伝子が除去された“ガットレス”または“ヘルパー依存性型(gutted)”ベクターも含む。このようなアデノウイルスベクターは、ベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要な最小シス作用性ヌクレオチド配列を含むアデノウイルスのゲノムに由来するため、シュードアデノウイルスベクター(ＰＡＶ)と呼ばれる。ＰＡＶベクターは、ＰＡＶゲノムのパッケージングに必要な複製起点およびシス作用性ヌクレオチド配列を含む５’末端逆位配列(ＩＴＲ)および３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含む。これらは、適当な調節エレメント(例えばプロモーターまたはエンハンサー)と共に１個以上の導入遺伝子を含むように修飾できる。ＰＡＶは、ほとんどのウイルスコーディング配列に欠失を含むため、８kbサイズよりはるかに多い運搬能を有し、最大３６kbサイズである(例えば米国特許番号５,８８２,８８７または５,６７０,４８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５５、ＷＯ９７／２５４６６、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９７／００３２６；Morral et al. (1998) Hum. Gene Ther., 10:2709-2716, Kochanek et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93:5731-5736; Parks et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93:13565-13570; Lieber et al. (1996) J. Virol., 70:8944-8960 or Fisher et al. (1996) J. Virol., 217:11-22参照)。
ＰＡＶは、“ヘルパー”ウイルスを有する産生細胞の同時感染により増殖し(例えばＥ１欠失アデノウイルスベクターを使用)、そこで、パッケージング細胞はＥ１遺伝子産物を発言する。ヘルパーウイルスは、粒子集合に必要なウイルス構造タンパク質の産生を含む、不在アデノウイルス機能をトランス補完する。例えば、ヘルパーアデノウイルスベクターゲノムおよびガットレスアデノウイルスベクターゲノムをパッケージング細胞に送達する。本細胞は、標準細胞維持または増殖条件下に置かれ、これによりヘルパーベクターゲノムおよびパッケージング細胞は、一体となって、アデノウイルスベクター粒子のパッケージングのための補完タンパク質を提供する。このようなガットレスアデノウイルスベクター粒子を標準手法で回収できる。ヘルパーベクターゲノムは標準トランスフェクション手法によりプラスミドまたは類似構築物で送達してよくまたはゲノムを含むウイルス粒子による感染を介して送達してよい。このようなウイルス粒子は一般にヘルパーウイルスと呼ばれる。同様に、ガットレスアデノウイルスベクターゲノムをトランスフェクションまたはウイルス感染により細胞に送達できる。
アデノウイルスはまた、異種プロモーターの制御下の複製に必須のアデノウイルス遺伝子の配置の結果として、あるタイプの細胞または組織で複製するが、他のタイプではしないウイルスである、複製コンディショナルアデノウイルスも含む(上記；また米国特許番号５,９９８,２０５、米国特許番号５,８０１,０２９およびＵＳ２００３−０１０４６２５として公開され、公開国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００２／０６７８６１に対応する米国出願番号１０／０８１,９６９参照)。
アデノウイルスはまた例えば、ウイルスの指向性を変えるために、ターゲティングリガンドに対する受容体(タンパク質、脂質、炭水化物またはそれらの部分)を発現する特異的標的細胞の感染を高めるために、ターゲティングリガンドを含むように修飾されているものを含む。アデノウイルスベクターおよびその他は治療的適用に多くの可能性を秘めるが、特異的細胞型へのアデノウイルスベクターの送達を制限するＣＡＲの広範組織分布のために、その有用性は限られている。さらに、インビボでのある種の細胞上のＣＡＲおよび／またはαｖインテグリン受容体の不在はアデノウイルスベクターにより標的化され得る細胞または組織のタイプを制限する。それゆえに、アデノウイルスはまた所望の細胞受容体または組織特異的受容体に対する標的リガンドを包含させるために天然受容体への結合を減少するかまたは無くすおよび／またはカプシドタンパク質、例えばＨＩループ、繊維のＣ末端、ヘキソンのＬ１ループまたはペントンベースのＲＧＤループまたはカプシドタンパク質IXの設計により修飾されているものを含む(例えばKrasnykh et al. (2000) Mol. Ther., 1:391-405; Wickham et al. (2000) Gene Ther., 7:110-4; Dmitriev et al. (1998) J. Virol., 72:9706-12; Mizuguchi et al. (2004) Hum. Gene Ther., 15:1034-44; Wickham et al. (1997) J. Virol., 71:8221-9; Curiel (1999) Ann NY Acad. Sci., 886:158-71参照)。カプシドタンパク質は、例えば、標的リガンドの付加または繊維の他のタイプのアデノウイルス繊維での置換により修飾され得る。標的リガンドは、細胞内または細胞上の部分、例えば細胞表面タンパク質、脂質、炭水化物または他の部分と結合するあらゆるタンパク質またはその部分であり得る。例えば、標的リガンドは、増殖因子、接着分子、サイトカイン、タンパク質ホルモン、神経ペプチド(神経伝達物質)および一本鎖抗体または適切なその部分を含むが、これらに限定されない。他の例において、アデノウイルスベクターはアダプター分子、例えばターゲティングリガンドを伴う抗Ａｄ一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)を含む抗体および融合タンパク質またはＣＡＲの細胞外ドメインとコンジュゲートしてよくまたはターゲティングリガンドを含むポリマー、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分で化学的修飾される(例えばMizuguchi et al. (2004) Hum. Gene Ther., 15:1034-44; Eto et al. (2008) Int. J. Pharm., 354:3-8参照)。
任意の上記アデノウイルスまたは任意の当分野で知られたものをここでの送達剤として使用するために所望の異種核酸分子を含むように修飾できる。所望の異種核酸配列を含むアデノウイルスを、当業者に知られた任意の技法により製造できる(Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917；国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２６４１１)。特に、このようなウイルスは、アデノウイルスベクターおよび異種ＤＮＡ配列を運搬するプラスミドの相同組換えにより製造できる。相同組換えは、適当な細胞株へのアデノウイルスベクターおよびプラスミドの同時導入後に起こりうる。使用する細胞株は、一般的に形質転換性のものである。トランスフェクションは、アデノウイルス粒子の産生株細胞への侵入を支持する試剤の存在下で実施できる。このような試剤は、ポリカチオン類および二機能性試剤を含むが、これらに限定されない。ある例においては、アデノウイルスが欠損アデノウイルスであるならば(早期遺伝子または繊維タンパク質欠失による)、細胞株は、また組換えのリスクを避けるために、欠損アデノウイルスゲノム部分を補完できる配列を、例えば組込型で含む。補完細胞株の例は、Ａｄ５アデノウイルスのゲノムの左手部分を含むヒト胚腎臓株２９３(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59)を含むが、これに限定されない。補完細胞はまた、例えば、アデノウイルスＥ１遺伝子を含むＰＥＲ.Ｃ６細胞株の細胞(ＰＥＲ.Ｃ６は、例えば、Crucell, The Netherlandsから入手可能；ＥＣＡＣＣ受入番号９６０２２９４０で寄託；またFallaux et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1909-1907も参照；また、米国特許番号５,９９４,１２８も参照)またはＡＥ１−２ａ細胞(Gorziglia et al. (1996) J. Virology 70:4173-4178;およびVon Seggern et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:1461-1468)参照)を含む。次いで、増幅したアデノウイルスを慣用の分子生物学的手法により回収し、精製する。
遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用を説明する参考文献は、Vorburger and Hunt (2002) The Oncologist, 7:46-59; Breyer et al. (2001) Current Gene Therapy, 1:149-162; Shirakawa (2009) Drugs News Perspectives, 22:140-5; Wang et al. (2005) Gene Therapy and Mol. Biology, 9:291-300;およびSheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121を含むが、これらに限定されない。
ii.アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)
本発明方法、組成物および使用において送達剤として使用するウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)を含む。ＡＡＶは一本鎖ヒトＤＮＡパルボウイルスであり、そのゲノムのサイズは４.６kbである。ＡＡＶゲノムはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の２個の主要な遺伝子を含む。ｒｅｐ遺伝子はｒｅｐタンパク質をコードする(Ｒｅｐ７６、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０)。ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ複製、レスキュー、転写および組込みをコードし、一方ｃａｐタンパク質はＡＡＶウイルス粒子を形成する。ＡＡＶは、ＡＡＶが増殖性感染(すなわち宿主細胞でそれ自体の複製)をすることを可能にする必須遺伝子産物の供給を、アデノウイルスまたは他のヘルパーウイルス(例えばヘルペスウイルス)に依存することに由来して名づけられている。ヘルパーウイルス非存在下で、ＡＡＶは、ヘルパーウイルス、通常アデノウイルスで宿主細胞の重感染によりレスキューされるまで、プロウイルスとして宿主細胞の染色体に統合される(Muzyczka (1992) Curr. Top. Micro. Immunol., 158:97-129)。
ＡＡＶウイルスは細胞ゲノムに統合され得る。組込み機構は、ウイルス複製、レスキュー、パッケージングおよび組込みに必要なシス作用性ヌクレオチド配列を含むＡＡＶゲノムの両端の末端逆位配列(ＩＴＲ)の存在が仲介する。トランスでｒｅｐタンパク質が仲介するＩＴＲの組込み機能は、ＡＡＶゲノムがヘルパーウイルス非存在下で感染後に細胞染色体に統合されることを可能にする。ＡＡＶのための組込み部位は十分確立されており、ヒトの染色体１９に局在化している(Kotin et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2211-2215)。組込み部位の知識により、宿主遺伝子を活性化または不活化し得るまたはコーディング配列を中断し得る、細胞ゲノムへの無作為挿入事象の危険性が減る。ＡＡＶはまたその宿主範囲が広く、多くの細胞型への指向性を示すため、遺伝子治療適用にも有用である。ＡＡＶはまた非分裂細胞および分裂細胞の両者に感染できる。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８またはＡＡＶ−９を含む任意の天然に存在するＡＡＶ血清型に由来し得る。このようなウイルスは周知であり、当業者が利用可能である(例えばGrimm et al. (2003) Current Gene Therapy, 3:281-304; Muramatsu et al. (1996) Virol., 221:208-217; Chiorini et al. (1997) J. Virol., 71:6823-6833; Chiorini (1999) J. Virol., 73:1309-1319; Rutledge et al. (1998) J. Virol, 72:309-319; Xiao et al. (1999) J. Virol., 73:3994-4003; Gao et al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci., 99:11854-11859; Kotin (1994) Human Gene Therapy, 5:793-801参照)。他の血清型も知られ、入手可能であり、ＡＡＶ−８〜ＡＡＶ−１２を含む。例えば、多くのＡＡＶベクターがAmerican Type Culture Collection(ＡＴＣＣ、Rockville, Md.；例えばＶＲ−１９７、ＶＲ−６４５、ＶＲ−６４６、ＶＲ−６８０、ＶＲ−６８１、ＶＲ−１４４９、ＶＲ−１５２３、ＶＲ−１６１６参照)から入手可能である。また利用可能なものは適合性宿主細胞およびヘルパーウイルスである。ＡＡＶベクターはまた“偽型”ＡＡＶベクターを含み、ここでは、ＡＡＶ−２ベクターゲノムが他のＡＡＶ血清型のカプシド内にクロスパッケージされている(Burger et al. (2004) Mol. Ther., 10:302-17；米国特許番号７,０９４,６０４)。このような偽型ＡＡＶベクターはＡＡＶ−２由来血清型の制限、例えばある細胞、例えば肝臓または筋肉細胞への形質導入における非効率を克服する。
多くのＡＡＶベクターが、全身発現を達成する送達方法によって、多数組織、例えば骨格筋および心筋などの広範な形質導入を示す。これらは、例えば、ＡＡＶ血清型−６、−８および−９を含む。特に、ＡＡＶベクターは、アデノウイルス関連血清型を含む(ＡＡＶ−９；GenBank受入番号ＡＹ５３０６２９.１；Gao et al. (2004) J. Virol., 78:6381-6388)。ＡＡＶ−９は、中枢神経系(ＣＮＳ)を標的とするために血液脳関門を迂回できるベクターである(例えばFoust et al., (2009) Nature Biotechnology, 27:59-65; Duque et al. (2009) Mol. Ther., 17:1187-1196参照)。それゆえに、脳またはＣＮＳに影響するまたは関連するここでの神経変性疾患または他の疾患の例において、ＡＡＶ−９を、送達全身性のための目的とするタンパク質をコードする送達剤として使用できる(例えば血中での発現のために肝臓またはその部分に送達)。
ＡＡＶベクターは、目的とする異種核酸を含む組み換えＡＡＶベクターを含む。このようなベクターを産生する手技は当業者に知られる。例えば、ＡＡＶベクター産生のための標準的手法は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列に挟まれた目的核酸分子を含むＡＡＶベクターゲノムでの宿主細胞のトランスフェクション、トランスで必要なＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の遺伝子をコードするプラスミドによる宿主細胞のトランスフェクションおよび遺伝子導入された細胞のトランスで必要な非ＡＡＶヘルパー機能を提供するためのヘルパーウイルスでの感染を必要とする(Muzyczka (1992) Curr. Top. Micro. Immunol., 158:97-129; U.S. Patent No. 5,139,941)。ヘルパーウイルスはアデノウイルスまたは他のヘルパーウイルスであり得る。ヘルパーウイルスタンパク質がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子転写を活性化し、次いでｒｅｐタンパク質がＡＡＶ ｃａｐ遺伝子転写を活性化する。次いで、ｃａｐタンパク質はＩＴＲ配列を使用して、ＡＡＶゲノムをウイルス粒子にパッケージする。
あるいは、ＡＡＶウイルス粒子の組換えは、複製機能源として使用できる周知ヘルパーウイルスの一つによる感染と組み合わせた、ヘルパー機能遺伝子を含むプラスミドの使用を助ける(例えば米国特許番号５,６２２,８５６および５,１３９,９４１参照)。同様に、当業者は、必要な複製機能を提供するために、ｗｔ ＡＡＶの感染と組み合わせて、アクセサリー機能遺伝子を含むプラスミドを使用できる。三重トランスフェクション方法も、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生に使用でき、これは、ヘルパーウイルスを必要としない方法である(例えば、米国特許番号６,００１,６５０参照)。これは、ｒＡＡＶウイルス粒子産生のためのＡＡＶヘルパー機能ベクター、アクセサリー機能ベクターおよびｒＡＡＶベクターの３種のベクターの使用により達成される。
遺伝子治療におけるＡＡＶウイルスの使用を説明する参考文献は、Sheridan (2011) Nature Biotechnology 29:121を含むが、これに限定されない。
iii. レトロウイルス
本発明方法、組成物および使用において送達剤として使用するウイルスベクターはレトロウイルスベクターを含む(例えば、Miller (1992) Nature, 357:455-460参照)。レトロウイルスベクターは、再配列されていない、単一配列遺伝子を、広範な齧歯類、霊長類およびヒト体細胞に送達する能力により、核酸の細胞への送達によく適合する。レトロウイルスベクターは宿主細胞のゲノム内に統合される。他のウイルスベクターと異なり、これらは分裂細胞にのみ感染する。
レトロウイルスはＲＮＡウイルスであり、ウイルスゲノムがＲＮＡである。宿主細胞がレトロウイルスに感染したとき、ゲノムＲＮＡはＤＮＡ中間体に逆転写され、これが感染細胞の染色体ＤＮＡに極めて効率的に統合される。この統合されたＤＮＡ中間体はプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスの転写および感染性ウイルスへの集合は、適当なヘルパーウイルス存在下または夾雑ヘルパーウイルスの同時産生を伴わず被包を可能にする適当な配列を含む細胞株内で起こる。被包のための配列が適当なベクターとの同時導入により提供されるならば、ヘルパーウイルスは、組み換えレトロウイルスの産生のために必要ではない。
レトロウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、２個の末端反復配列(ＬＴＲ)に挟まれたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの３遺伝子を有する。ｇａｇ遺伝子は内部構造(マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド)タンパク質をコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルス外被糖タンパク質をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転写するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素、逆転写酵素により産生されたＤＮＡを宿主染色体ＤＮＡに統合させるインテグラーゼおよびコードされたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子のプロセシングに作用するプロテアーゼを含む、産物をコードする。５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲは、ウイルス粒子ＲＮＡの転写およびポリアデニル化の促進に作用する。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な全ての他のシス作用性配列を含む。
レトロウイルスベクターは、Coffin et al., Retorviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997)により記載されている。レトロウイルスの例は、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭＭＬＶ)またはマウス幹細胞ウイルス(ＭＳＣＶ)である。レトロウイルスベクターは複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。典型的に、レトロウイルスベクターは、ウイルス粒子複製およびパッケージングのさらなるラウンドに必要な遺伝子のコード領域が欠失しているかまたは他の遺伝子により複製される複製欠損である。結果として、ウイルスは、最初の標的細胞が感染したらその典型的溶解性経路を継続できない。このようなレトロウイルスベクターおよびこのようなウイルス(例えばパッケージング細胞株)の産生に必要な材料は市販されている(例えばClontechｋら入手可能なレトロウイルスベクターおよび系、例えばカタログ番号６３４４０１、６３１５０３、６３１５０１およびその他、Clontech, Moutnain View, CA参照)。
このようなレトロウイルスベクターは、複製に必要なウイルス遺伝子を送達する核酸分子に置き換えることにより、送達剤として産生できる。得られたゲノムは、各末端にＬＴＲを含み、所望の１個または複数個の遺伝子をその間に有する。レトロウイルスを産生する方法は当業者に知られる(例えば国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ０５／２６４１１参照)。レトロウイルスベクターは、ヘルパープラスミドまたはプラスミドを含むパッケージング細胞株に産生できる。パッケージング細胞株は、ベクターカのプシド産生およびウイルス粒子成熟に必要なウイルスタンパク質を提供する(例えばｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子)。典型的に、少なくとも２種のヘルパープラスミド(別々にｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子；およびｅｎｖ遺伝子を含む)を、ベクタープラスミド間の組換えが起こり得ないように、使用する。例えば、レトロウイルスベクターは、トランスフェクションの標準的方法、例えばリン酸カルシウム仲介トランスフェクションを使用して、パッケージング細胞株にトランスファーする。パッケージング細胞株は当業者に周知であり、一般に入手可能である。パッケージング細胞株の例は、ＧＰ２−２９３パッケージング細胞株(カタログ番号６３１５０５、６３１５０７、６３１５１２、Clontech)である。ウイルス粒子産生の十分な時間の後、ウイルスを回収する。所望により、回収したウイルスを、例えば多様な宿主指向性を有するウイルスを産生するために、第二パッケージング細胞株の感染に使用できる。最終結果は、目的とする核酸を含むが、新規ウイルスが宿主細胞内で形成され得ないように、他の構造遺伝子を欠く、複製無能組み換えレトロウイルスである。
遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する参考文献は、Clowes et al., (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al., (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Grossman and Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114; Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121; Cassani et al. (2009) Blood, 114:3546-3556を含む。
iv. レンチウイルス
レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。レンチウイルスの例はＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶである。他のレトロウイルスと異なり、レンチウイルスは非分裂細胞のゲノムに統合できる。それゆえに、例えば、レンチウイルスベクターは、一次肝細胞に効率的に遺伝子を送達することおよび永久に非分裂一次肝細胞のゲノムに統合することが報告されている(Lewis and Emerman (1994) J. Virol., 68:510-6)。レンチウイルスベクターはまたＭＭＬＶレトロウイルスベクターと同じ転写サイレンシング機構を苦にしない。レンチウイルスは、核移入機構と相互作用し、ヌクレオポアを介するウイルス組込み前複合体の活性輸送を仲介する、いくつかのウイルス粒子タンパク質、例えばマトリックスまたはＶＰＲ、に包含される核親和性決定基を有する点で、他のレトロウイルスと異なる。それゆえに、レンチウイルスの宿主細胞のゲノムへの組込みは細胞分裂に依存しない。
他のレトロウイルスと同様、レンチウイルスはウイルスタンパク質をコードする主遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。さらに、また合成の制御、ウイルスＲＮＡのプロセシングおよび他の複製機能に関与する他のアクセサリー遺伝子もある(例えばＨＩＶのＴａｔおよびＲｅｖ)。これら挟まれて、末端反復配列(ＬＴＲ)がある。複製サイクルは、ウイルス糖タンパク質の宿主細胞受容体への結合、膜の融合およびウイルスの細胞への侵入により開始される。侵入によりウイルスは脱殻し、逆転写が起こり、組込み前複合体(ＰＩＣ)の形成に至る。ＰＩＣの形成およびレンチウイルスがＰＩＣの核外被を開始細胞核へ能動的に進入することにより非分裂細胞に感染する能力を発揮するのは他のアクセサリー遺伝子である。プロウイルスが核外被に進入すると、それ自体宿主ゲノムと統合する。
レンチウイルスベクターの例は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶまたはＦＩＶに基づく。安全なレンチウイルスベクターを産生するために、数プラスミドベクター、例えば、４プラスミドベクター系を含むパッケージング細胞株を産生する。例えば、第一プラスミドは、プロモーター、転写ウイルスＲＮＡが新規ウイルスの集合に包含されることを可能にするｇａｇおよびｐｏｌおよびＰｓｉパッケージング配列のみを含むように欠失されるアクセサリータンパク質(例えばｔａｔ、ｂｒｆ、ｖｐｒおよびｎｅｆ)を含み、第二プラスミドは逆転写酵素を含み、第三プラスミドは水疱性口内炎ウイルス外被タンパク質(ＶＳＶ−Ｇ)に置き換わったｅｎｖ遺伝子を含み、第四プラスミドは複製に必要なウイルス遺伝子を送達する核酸分子に置き換えた目的とするベクターを含む。
このようなレンチウイルスベクターおよびレンチウイルスを製造するための系および方法は当分野で知られる(例えばBuchshacher and Wong-Staal (2000) Blood, 95:2499-2504; Blomer et al. (1997) J. Virol., 71:6641-9; Choi et al. (2001) Stem Cells, 19:236-46；米国特許番号６,２１８,１８６参照)。レンチウイルスベクターは複製欠損であり、複製に必要な遺伝子を含まない。レンチウイルスを産生するために、数個のパッケージングプラスミドをパッケージング細胞株、一般的にＨＥＫ ２９３または他の類似細胞株の誘導体(例えば２９３ＦＴ細胞、カタログ番号Ｒ７００−０７、Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)；２９３ＬＴＶ細胞株、カタログ番号ＬＴＶ−１００、Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA；レンチ−Ｐａｃ ２９３Ｔａ細胞株、カタログ番号ＣＬｖ−ＰＫ−０１、GeneCopoeia, Rockville, MD)に遺伝子導入する。パッケージングプラスミドは、別々にウイルス粒子タンパク質(例えばカプシドおよび逆転写酵素)およびベクターにより送達される核酸分子(これはパッケージング細胞株に遺伝子導入できる)をコードする。一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムが転写され、これはウイルス粒子に包装される。レンチウイルスベクターの産生方法は当業者に周知である(例えばNaldine et al. (1996) Science, 272:263-267参照)。レンチウイルスベクターおよびウイルス産生のための系は市販されている(例えば、レンチウイルス発現ベクター、例えばCell Biolabs, Inc.から入手可能なｐＳＭＰＵＷレンチウイルスベクターおよびその誘導体およびレンチウイルス発現およびパッケージング系参照)。
レンチウイルスベクターは遺伝子治療適用に使用されている(例えばManilla et al. (2005) Human Gene Therapy, 16:17-25; Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121参照)。特に、レンチウイルスベクターは短干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の送達に使用されている(Sachdeva et al. (2007) Journal of Medical Virology, 79:118-26)。
ｂ. 非ウイルスベクター
非ウイルスベースの薬剤を本発明方法、使用および組成物において送達剤として使用できる。これらは非ウイルス発現ベクターを含む。非ウイルス発現ベクターは、目的とする核酸、例えばポリペチド、アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする核酸を含み、ここで、該核酸類は発現制御配列(例えばプロモーター)に操作可能に結合している。適切なベクター骨格は、例えば、当分野で通常使用されているもの、例えばプラスミド、ミニサークル類および人工染色体(例えば哺乳動物人工染色体(ＭＡＣｓ)、細菌人工染色体(ＢＡＣｓ)、酵母人工染色体(ＹＡＣｓ)または植物人工染色体(ＰＡＣｓ)を含む。多くのベクターおよび発現系がNovagen(Madison, WI)、Clontech(Palo Alto, CA)、Stratagene(La Jolla, CA)およびInvitrogen/Life Technologies(Carlsbad, CA)から入手可能である。
ベクターは、典型的に１個以上の制御領域を含み、これは、コード化領域に機能的に結合している。制御領域は、プロモーター配列、エンハンサー配列、ＳＭＡＲＳ(足場マトリックス付着領域)、インスレーター、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘発性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域(ＵＴＲｓ)、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列およびイントロンを含むが、これらに限定されない。
哺乳動物宿主細胞でベクターからの転写を制御するプロモーターは種々の源、例えば、ウイルスのゲノム、例えばポリオーマ、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)または異種哺乳動物プロモーター、例えばβ−アクチンプロモーターまたはＥＦ１αプロモーターまたはハイブリッドまたはキメラプロモーター(例えば、β−アクチンプロモーターに融合したＣＭＶプロモーター)から入手可能である。宿主細胞または関連種からのプロモーターもここで有用である。
エンハンサーは、一般に転写開始部位から固定された距離がなく、転写単位の５’または３’のいずれにも機能できるＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロンならびにそのコーディング配列自体にあり得る。通常１０〜３００塩基対(ｂｐ)長であり、シスで機能する。エンハンサーは、通常近くのプロモーターからの転写を増加させるために機能する。エンハンサーはまた転写制御を仲介する応答エレメントも含む。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子で知られているが(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン)、典型的に、一般的発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーターおよび／またはエンハンサーは誘発され得る(例えば化学的または物理的に制御されている)。化学的に制御されたプロモーターおよび／またはエンハンサーは、例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイドまたは金属の存在により制御できる。物理的に制御されたプロモーターおよび／またはエンハンサーは、例えば、環境因子、例えば温度および光により制御できる。所望により、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写する転写単位の領域の発現を最大化するように、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用できる。あるベクターにおいて、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は細胞型特異的方法で活性であり得る。所望により、あるベクターにおいて、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、細胞型と無関係に全真核細胞で活性であり得る。このタイプのプロモーターの例はＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β−アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーターおよびレトロウイルス末端反復配列(ＬＴＲ)である。
ベクターはまた、例えば、複製起点および／またはマーカーも含み得る。マーカー遺伝子は、細胞に選択可能な表現型(例えば、抗生物質耐性)を付与するか、他の方法でも検出可能である。検出可能マーカーの例は大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)およびルシフェラーゼを含む。さらに、発現ベクターは、発現ポリペチドの操作または検出(例えば、局在化)を容易にするために設計したタグ配列を含み得る。タグ配列、例えばＧＦＰ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素またはＦＬＡＧＴＭタグ(Kodak; New Haven, CT)配列は、典型的にコードされたポリペチドおよびマーカーを含む融合ポリペチドとして発現される。このようなタグを、カルボキシルまたはアミノ末端を含むコードされたポリペチドのどこにでも挿入できる。
特に、例えば、目的とする遺伝子、アンチセンスＤＮＡまたはｓｉＲＮＡまたは他の核酸分子をコードする、所望の興味のある核酸分子を含む、所望の核酸分子発現ベクターは、ネイキッドＤＮＡとして送達剤としての送達に使用できる。本発明方法においてネイキッドＤＮＡ送達の効率は、当業者に周知の種々の方法を使用して増加できる(例えばLi and Huang (2006) Gene Therapy, 13:1313-1319参照)。このような方法は、例えば、本明細書の他の場所に記載するとおりおよび当業者に知られるとおり、例えばエレクトロポレーション、ソノポレーションまたは“遺伝子銃”手法を含む。また、送達効率は、ここに記載するとおりリポソームに被包するかまたはポリマーと複合体化することにより上昇できる。特定の例において、核酸はナノ粒子として送達できる。
遺伝子治療における非ベクターの使用を説明する参考文献は、Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121を含む。
ナノ粒子
非ウイルスベース送達剤は、核酸分子が目的とする細胞への特異的ターゲティングのための、ターゲティング分子を含む特定の担体に被包されているかまたはコンジュゲートしている、ナノ粒子(一般的に３〜２００nm)を含む。遺伝子治療のためのナノ粒子の産生は当分野で周知である(例えばCho et al. (2008) Clin. Cancer. Res., 14:1310; Jin et al. (2007) Biotechnol. Prog., 23:32-41参照)。ナノ粒子は、例えばポリ(Ｌ−グルタミン酸(ＰＧＡ)、ポリアミドアミン(ＰＡＭＡＭ)、ポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)およびポリエチレンイミン(ＰＥＩ)からの逐次重合により、ポリマー、例えばポリマー担体(例えばポリ乳酸、多糖、ポリ(シアノアクリレート、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド))またはデンドリマーを産生するための分枝ポリマーとして製造できる。使用できる生分解性ポリマーは、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳−グリコール酸(ＰＬＧＡ)またはポリ(メチルメタクリレートを含む)(ＰＭＭＡ)。他のタイプのナノ粒子を、リポソームを使用して種々の脂質混合物として、酸化鉄を使用して磁気ナノ粒子として、ＳｉＯ２を使用してシリカナノ粒子としてまたは塩化金酸またはクエン酸ナトリウムを使用して金ナノ粒子として産生できる。ナノ粒子系は当業者に周知である。
ナノ粒子は、表面上にターゲティング分子、例えば、標的である細胞に発現される受容体のリガンドであるか他に結合するターゲティング分子をコンジュゲートまたはコーティングすることにより官能化し得る。このようなターゲティング分子は、リガンド、抗体またはペプチドを含むが、これらに限定されない。具体例において、細胞への選択性を高めるためにデュアルリガンド手法を使用できる。ターゲティング分子の例は、増殖因子、例えば、線維芽細胞増殖因子受容体を標的とする線維芽細胞増殖因子である。ターゲティング分子の選択は、標的とする組織または臓器を含む特定の適用により、当業者により経験的に決定され得る。標的化ナノ粒子は当分野で知られる(例えば、Franzen (2011) Expert Opin. Drug. Deliv. 8(3):281-98; Faraji and Wipf (2009) Bioorg. Med. Chem. 17(8):2950-62; Sajja et al., (2009) Curr. Drug. Discov. Technol. 6(1):43-51参照)。特に、ナノ粒子の組織特異的遺伝子送達方法は当分野で知られる(例えばHarris et al. (2010) Biomaterials, 31:998-1006参照)。例えば、実質肝細胞は、アシアロ糖タンパク質受容体(ＡＳＧＰ−Ｒ)および肝臓レクチンを発現する。それゆえに、肝臓特異的ナノ粒子は当分野で知られ、アシアロ糖タンパク質受容体(ＡＳＧＰ−Ｒ)および、例えば、アシアロ−フェチュイン、アシアロ−トランスフェリン、アシアロ−セルロプラスミン、アシアロ−ラクトフェリン、アシアロ−オロソムコイド、ｌａｃ−ＢＳＡ、ヘパトグロブリン、抗体およびガラクトースを含む他の受容体を認識する試剤での官能化を含み得る(例えばPathak et al. (2008) Int. J. Nanomedicine, 3:31-49参照)。
ｃ.細胞自体
本発明方法を、エクスビボで送達された核酸を送達剤として含む細胞を送達に使用できる。例えば、外来性異種核酸を導入した患者またはドナーから隔離した細胞を、本発明方法により患者に直接的に挿入できる。本方法の利点は、細胞に対する免疫応答が血管区画化により低減されていることである。それゆえに、ここに提供されるのは、ここに記載するとおり、遺伝子改変した１個または複数個の細胞を、対象における区画化臓器またはその部分に投与する方法である。方法は、臓器またはその部分を区画化し、遺伝子改変した１個または複数個の細胞を区画化臓器またはその部分に投与し、区画化を、遺伝子改変した１個または複数個の細胞の投与後一定期間維持し、臓器またはその部分への血管循環を回復させることを含む。送達する細胞の量は所望の効果、特定の核酸、処置する対象および他の類似因子により、当業者により決定され得る。
核酸を遺伝子治療目的で導入し得る細胞は、任意の所望の、有用な細胞型であってよく、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；血細胞例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；種々の幹または前駆細胞細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血または胎児肝臓から得られるものを含むが、これらに限定されない。例えば、遺伝子改変細胞は多能性または全能性幹細胞(誘発多能性幹細胞を含む)であってよくまたは胚性、胎児性または完全に分化した細胞であり得る。遺伝子改変細胞は、同じ対象からの細胞であってよくまたはレシピエント対象と同一または異なる種からの細胞であり得る。好ましい例において、遺伝子治療に使用する細胞は患者に対して自己である。細胞の遺伝子操作および細胞移植の方法は当分野で知られる。
典型的に、核酸を、得られた組み換え細胞のインビボで投与する前に細胞に導入する。このような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロ注射、核酸配列含有ウイルスまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体仲介遺伝子導入、マイクロ細胞仲介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含むが、これらに限定されない任意の方法で実施できる。細胞への異質遺伝子の導入のための多くの手法は当分野で知られ(例えば、Loeffler and Behr, Meth. Enzymol.(1993) 217:599-618; Cotten et al., Meth. Enzymol. (1993) 217:618-644; Cline, Pharmac. Ther. (1985) 29:69-92参照)、レシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が妨害されていない限り、使用できる。具体例において、本方法は、核酸が細胞により発現可能であり、遺伝性であり、その細胞子孫で発現可能であるように、核酸の細胞への安定な伝達を可能にするものである。
３. 遺伝子治療剤の例
本発明の方法、使用または組成物において使用するための核酸分子含有送達剤は、目的とする核酸、例えば当業者に知られた任意の遺伝子治療薬剤をコードする任意のウイルスまたは非ウイルスベクターであり得る。処置する特定の疾患または状態により適当な遺伝子治療薬剤を選択するのは当業者のレベルの範囲内である。何百もの遺伝子治療剤が治験中であり、そのいくつかは欧州(例えばGlybera(登録商標), AdLPL)および中国(例えばrAd53, Gendicine(登録商標))で販売承認を受けている(例えばSheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121参照)。
例えば、遺伝子治療ベクターの例は、アデノウイルス−またはＡＡＶベース治療剤を含む。本発明の方法、使用または組成物において使用するためのアデノウイルスベースのまたはＡＡＶベース治療剤の非限定的例は、例えば、癌の処置に使用するための、野生型ヒト腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３をコードする組み換えアデノウイルスベクターであるｒＡｄ−ｐ５３(別名ジェネテシン(登録商標)、Ｇｅｎｋａｘｉｎ(登録商標)、Qi et al. (2006) Modern Oncology, 14:1295-1297)；宿主ｐ５３を不活性化するためのＥ１Ｂ遺伝子を欠くアデノウイルスであるＡｄ５＿ｄｌ１５２０(別名Ｈ１０１またはＯＮＹＸ−０１５；例えばRussell et al. (2012) Nature Biotechnology, 30:658-670参照)；ＡＤ５−Ｄ２４−ＧＭ−ＣＳＦ、例えば、癌の処置に使用するための、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ含有アデノウイルス(Cerullo et al. (2010) Cancer Res., 70:4297)；ｒＡｄ−ＨＳＶｔｋ、例えば、癌の処置に使用するための、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を含む複製欠損アデノウイルス(Cerepro(登録商標)として開発、Ark Therapeutics、例えば米国特許番号６,５７９,８５５参照；AdvantageneによりＰｒｏｓｔＡｔａｋＴＭとして開発；国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００５／０４９０９４)；ｒＡｄ−ＴＮＦα、例えば、癌の処置に使用するための、化学放射線治療誘発性ＥＧＲ−１プロモーター制御下にヒト腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦ−α)を発現する複製欠損アデノウイルスベクター(ＴＮＦｅｒａｄｅＴＭ、GenVec; Rasmussen et al. (2002) Cancer Gene Ther., 9:951-7)；ｒＡｄ−ＦＧＦ４、例えば、血管形成および冠動脈疾患の処置のための、ＦＧＦ−４をコードするアデノウイルスベクター血清型５(GENERX, BioDrugs, 2002, 16:75-6；米国特許番号５,７９２,４５３)；ｒＡｄ−ＶＥＧＦ−Ｄ、例えば、血管形成関連疾患および状態の処置に使用するための、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ−Ｄ)をコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクター５(Ｔｒｉｎａｍ(登録商標)、Ark Therapeutcs；米国特許公開番号ＵＳ２０１２０３０８５２２)；ｒＡｄ−ＰＤＧＦ、例えば、創傷処置に使用するための、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクター５(Excellarate, GAM501 Tissue Repair Co.; Blume et al. (2011) Wound Repair Regen., 19:302-308)；Ａｄ−ＩＦＮβ、例えば、癌の処置のための、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)最初期プロモーターの指示の下ヒトインターフェロン−ベータ遺伝子を発現する、Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠損しているアデノウイルス血清型５ベクター(ＢＧ００００１およびＨ５.１１０ＣＭＶｈＩＦＮ−ベータ、Biogen; Sterman et al.(2010) Mol. Ther., 18:852-860)；例えば、ＬＰＬＤまたは家族性高カイロミクロン血症の対象の処置のためのリポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)遺伝子をコードする遺伝子を含むＡＡＶ(alipogene tiparvovec, Glybera(登録商標)、Amsterdam Molecular Therapeuticsｓ；例えば国際公開出願番号ＷＯ２０１０／１３４８０６；ＷＯ２００１０００２２０、Yla-Herttuala (2012) Mol. Ther., 20:1831-2参照)；ＡＭＴ−０２１、例えば、急性間欠性ポルフィリン症(ＡＩＰ)の対象の処置のための酵素ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(ＰＢＧＤ)をコードする遺伝子を含むＡＡＶ(例えば米国特許公開番号ＵＳ２０１１／０２６２３９９；欧州特許番号ＥＰ１０４９４８７参照)；ｒＡＡＶ９−ＣＭＶ−ｈＮａＧｌｕ、ＣＭＶプロモーター制御下にＮａＧｌｕをコードする遺伝子を含むＡＡＶ−９(例えばFu et al. (2011) Mol. Ther., 19:1025-33参照)を含むが、これらに限定されない。
本発明の方法、使用および組成物において使用するための他の遺伝子治療剤の例は、ｒＡｄ−Ｈ１Ｆ１α(Genzyme/Sunway)、Ｖ９３０／Ｖ９３２(Merck)、ＮＬＸ−Ｐ１０１(Neurologix)、Ｔｏｃａ−５１１(Tocagen, San Dieog)、レンチグロビン(Bluebird Bio)、ＰｒｏＳａｖｉｎ(Oxford BioMedica)、ｒＡＡＶ−１−ＣＢ−ｈＡＡＴ(Applied Genetic Technologies)、ｒＡＡＶ２−ＣＢ−ヒト網膜色素上皮特異的６５ダルトンタンパク質(ＲＰＥ６５)(Applied Genetic Technologies)、ＡＭＴ−１０１(Amsterdam Molecular)、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３(Aventis)、ＣＥＲＥ−１２０(Ceregene, San Diego)、ＣＥＲＥ−１１０(Ceregene, San Diego)、ＳＥＲＣＡ−２ａ(Celladon, La Jolla)、ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１(Genzyme)、ｔｇＡＡＧ７６(Targeted Genetics, Seattle)、ｔｇＡＡＣ９４(Targeted Genetics, Seattle)、ＧＸ−１２(Genexine, Seoul, Korea)、ＳＣ１Ｂ１(ScanCell, Nottingham, UK)、アロベクチン−７(Vical, San Diego)、ＶＭ２０２(ViroMed, Minnetonka, MNまたはＲｅｘｉｎ−Ｇナノ粒子(Epeius Biotechnologies, San Marino, CA)を含むが、これらに限定されない。
Ｅ. 組成物、系およびキット
ここでの区画化方法により組織または臓器またはその部分に送達するために使用する送達剤を含む組成物を提供する。ここに提供する組成物は、インビボ投与に適する。組成物は、実質投与用に製剤される。典型的に、ここでの組成物は注射剤として提供される。注射剤は慣用の形態で、溶液または懸濁液、注射前に溶液または懸濁液に溶解するのに適する固体形態またはエマルジョンとして製造できる。一般に、ここに提供される送達剤組成物は、液体形態である。
本組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。注射のために、担体は典型的に液体である。特に、医薬担体は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない、すなわち組成物が対象に望まない副作用を誘発することなく投与される、または、包含される医薬組成物中の他の成分と有害な方法で相互作用しない、あらゆる担体である。担体は、活性成分の分解を最小化するためおよび対象への有害副作用を最小化するために選択される。例えば、細胞に投与するための薬学的に許容される担体は、典型的に注射による送達が許容される担体であり、細胞を損傷させる洗剤または他の化合物のような薬剤は含まない。
適切な担体およびその製剤はRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)に記載されている。投与用組成物は、無菌水溶液または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。水性担体は、食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。注射媒体として、一般に、担体は、注射溶液に有用な添加物、例えば安定化剤、塩類または食塩水および／または緩衝液を含む水を含む。生理学的に許容される担体の例は、無菌水、食塩水、緩衝化溶液またはデキストロース溶液を含む。例えば、生理学的担体の例は、生理学的食塩水、リン酸緩衝化食塩水、平衡塩類溶液(ＢＳＳ)またはリンゲル溶液および肥厚化剤および可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物を含む溶液を含む。溶液のｐＨは一般的に約５〜約８または約７〜７.５である。必要であれば、製剤のｐＨを薬学的に許容される酸類、塩基類または緩衝液で調節し、その送達の化合物の製剤の安定性を高める。
送達剤(核酸分子であるかまたは核酸分子を含む)は、組成物中の唯一の薬学的に活性成分として製剤できまたは処置する特定の障害のための他の活性剤と組み合わせ得る。所望により、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤をここに提供する組成物に包含させうる。例えば、任意の１種以上の湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および芳香剤、防腐剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスも本組成物に存在し得る。組成物に包含できる他の薬剤および添加物の例は、例えば、水可溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム；油可溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール；および金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸およびリン酸を含む。
本組成物はまた徐放性製剤のために、例えばコラーゲンスポンジを含む生物分解可能な支持体に吸着してまたはリポソーム内に製剤できる。徐放性製剤は、選択期間中、例えば１月または最大約１年、数回の投与量が投与されるように、多回使用量投与用に製剤できる。それゆえに、例えば、リポソームは、１回注射により、１回投与量の計約２〜最大約５倍以上が投与されるように、製剤できる。
本組成物は、急速な排出から保護する担体、例えば時間放出製剤またはコーティングを施し得る。このような担体は、制御放出製剤、例えば、マイクロ被包送達系および生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸および体内に直接設定できる他のタイプのインプラントを含むが、これらに限定されない。本組成物はまたペレット、例えばELVAXペレット(エチレン−ビニルアセテートコポリマー樹脂)でも投与できる。
組織標的化リポソームを含むリポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として適する。例えば、リポソーム製剤は当業者に知られた方法により製造できる(例えば、Kim et al. (1983) Bioch. Bioph. Acta 728:339-348; Assil et al. (1987) Arch Ophthalmol. 105:400；および米国特許番号４,５２２,８１１参照)。送達剤は、リポソーム系の水相に被包され得る。
活性物質は、所望の作用を妨害しない他の活性物質、望まれる作用を補充する物質または他の作用を有する物質、例えば粘弾性物質、例えば約３００万の高分子量(ＭＷ)のヒアルロン酸ナトリウムフラクションである商品名ＨＥＡＬＯＮ(Pharmacia, Inc.製造；例えば、米国特許番号５,２９２,３６２、５,２８２,８５１、５,２７３,０５６、５,２２９,１２７、４,５１７,２９５および４,３２８,８０３参照)として販売されているヒアルロン酸を含む物質とも混合できる。さらなる活性剤を包含し得る。
１. 投与製剤
ここに提供されるのは、静脈内投与される同じ送達剤の量より１００分の１以下である量の送達剤を含む、組織または臓器への実質投与用に製剤された組成物である。例えば、組成物は、標的臓器または組織に静脈内投与される同じ送達剤の量より１００分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、５００分の１、６００分の１、７００分の１、８００分の１、９００分の１、１０００分の１、５０００分の１、１００００分の１以下である量の送達剤を含む、組織または臓器への実質投与用で提供される。本組成物は単回投与製剤または複数回投与製剤として提供され得る。
例えば、組成物は、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである送達剤の一定量を含んで提供される。特に、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスは、ゲノムに少なくとも１個の異種核酸分子、例えば治療核酸分子を含むものである。１回服用量投与のための組成物中のアデノウイルスの量は、１０pfu〜１×１０１２pfu、１×１０２pfu〜１×１０１０、１×１０３pfu〜１×１０１０pfu、１×１０３pfu〜１×１０９pfu、１×１０３pfu〜１×１０８pfuまたは１×１０６pfu〜１×１０９pfuまたは１０粒子〜１×１０１２粒子、１×１０２粒子〜１×１０１０粒子、１×１０３粒子〜１×１０１０粒子、１×１０３粒子〜１×１０９粒子、１×１０３粒子〜１×１０８粒子または１×１０６粒子〜１×１０９粒子である。一般に、１回服用量投与のための組成物中のアデノウイルスの量は１０vp〜１×１０１２vp、１×１０２vp〜１×１０１０vp、１×１０３vp〜１×１０１２vp、１×１０３vp〜１×１０１０vp、１×１０３vp〜１×１０９vp、１×１０３vp〜１×１０８vp、１×１０３vp〜１×１０６vp、１×１０６vp〜１×１０１２vp、１×１０６vp〜１×１０１０vpまたは正確にまたは約１×１０１２vp、１×１０１１vp、１×１０１０vp、１×１０９vp、１×１０８vp、１×１０７vp、１×１０６vp、１×１０５vp、１×１０４vp、１×１０３vp、１×１０２vp、１０vp以下である。他の例において、１回服用量投与のための組成物中のアデノウイルスの量は、１０pfu〜１×１０１２pfu、１×１０２pfu〜１×１０１０pfu、１×１０３pfu〜１×１０１２pfu、１×１０３pfu〜１×１０１０pfu、１×１０３pfu〜１×１０９pfu、１×１０３pfu〜１×１０８pfu、１×１０３pfu〜１×１０６pfu、１×１０６pfu〜１×１０１２pfu、１×１０６pfu〜１×１０１０pfuまたは正確にまたは約１×１０１２pfu、１×１０１１pfu、１×１０１０pfu、１×１０９pfu、１×１０８pfu、１×１０７pfu、１×１０６pfu、１×１０５pfu、１×１０４pfu、１×１０３pfu、１×１０２pfu、１０pfu以下である。本組成物は、１０μL〜５mL、例えば２０μL〜１mLまたは５０μL〜５００μLで製剤され得る。このような組成物において、アデノウイルスは実質投与用に製剤される。具体例において、アデノウイルスは肝臓への実質投与用に製剤される。
２. 組み合わせ
実質投与用に製剤した送達剤を含む組成物は、他の薬剤との組み合わせで提供できる。他の薬剤は、実質細胞による送達剤の侵入の効率を高めるかまたは促進するまたは送達剤に対する免疫応答を修飾する薬剤である。
例えば、ここで提供される組み合わせは、実質投与用に製剤された送達剤および送達剤と結合しまたは複合体化して、細胞への侵入を仲介する薬剤または送達媒体を含む組成物を含む。薬剤の例は、カチオン性リポソームおよび脂質、リポタンパク質、合成ポリマーまたはポリペプチド、ミネラル化合物またはビタミン類を含むが、これらに限定されない。ポリマーの例はポリカチオン類またはポリアニオン類を含む。例えば、送達剤は、ポリアミン、リン酸カルシウム沈殿、ヒストンタンパク質、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン、両性高分子電解質複合体、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルスからのコートタンパク質およびＮ−置換グリシンのポリマーとの組み合わせとして提供される。本薬剤は別々に製剤されても一緒に製剤されてもよい。
さらなる例では、治療的導入遺伝子の発現は転写エンハンサー、例えばヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤、例えば、ヒドロキサム酸、環状テトラペプチド、バルプロ酸およびその他により増進できる。それゆえに、送達剤は、ウイルス特異的細胞表面受容体の転写エンハンサーである薬剤または化合物との組み合わせで提供できる。このような薬剤または化合物は、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤を含む。ＨＤＡＣ阻害剤はヒドロキサム酸類、環状テトラペプチド、ベンズアミド類、求電子ケトン類または脂肪族酸化合物のクラスのものを含む。例えば、ＨＤＡＣ阻害剤は、トリスコスタチンＡ、ボリノスタット(ＳＡＨＡ)、ベリノスタット(ＰＸＤ１０１)、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット(ＬＢＨ５８９)、エンチノスタット(ＭＳ−２７５)、Ｃ１９９、モセチノスタット(ＭＧＣＤ０１０３)、ロミデプシン(Istodax)、バルプロ酸、ＰＣＩ−２４７８１、ＳＢ９３９、レスミノスタット、ギビノスタット、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、KevetrinまたはトリコスタチンＡ(ＴＳＡ)を含むが、これらに限定されない。ＨＤＡＣ阻害剤の例は、アデノウイルス受容体ＣＡＲの転写エンハンサーであるバルプロ酸である。アデノウイルス取り込みがバルプロ酸存在下で増加することを示す試験がある(Segura-Pancheco et al. (2007) Genet. Vaccines Ther., 5:10)。このような例において、送達剤を含む組成物は、付加的薬剤または化合物(例えば転写エンハンサー薬剤)と一緒にまたは別に製剤される。転写エンハンサー薬剤は、正確にまたは約５０mg〜８０００mg、例えばまたは約１００mg〜５０００mg、１０００mg〜４０００mgの量で提供され得る。組み合わせ中の薬剤または化合物組成は単回または多回服用量投与用に製剤できる。付加的薬剤または化合物組成を、許容され、当業者に知られる任意の投与経路用に製剤できる。例えば、転写エンハンサーを経口投与、静脈内投与、皮下投与または実質投与用に製剤できる。
さらなる例では、実質投与用に製剤された送達剤を含む組成物および免疫抑制剤を含む組成物を含む、組み合わせがここで提供される。免疫抑制剤の例は、シクロスポリン(ネオーラル(登録商標)、サンディミュン(登録商標))、プレドニゾン(Novo Prednisone(登録商標)、Apo Prednisone(登録商標))、アザチオプリン(イムラン(登録商標))、タクロリムスまたはＦＫ５０６(プログラフ(登録商標))、ミコフェノール酸モフェチル(セルセプト(登録商標))、シロリムス(ラパミューン(登録商標))、ＯＫＴ３(ムロモナブ CO3(登録商標)、オルソクローン(登録商標))、ＡＴＧＡＭおよびサイモグロブリンを含むが、これらに限定されない。このような例において、送達剤を含む組成物を免疫抑制剤と共にまたは別に製剤する。免疫抑制剤を含む付加的組成物を、許容され、当業者に知られる任意の投与経路用に製剤できる。例えば、免疫抑制剤を経口投与、静脈内投与、皮下投与または実質投与のために投与できる。
３. 製品およびキット
組成物または組み合わせは、貯蔵および／または使用のためにパッケージできる。試剤のパッケージングに使用するためのパッケージング物質は当業者に周知である。パッケージング物質の例は、アンプル、ビン、チューブ、バイアル、容器、シリンジおよび選択製剤および実質投与に適するあらゆるパッケージング物質を含む。例えば、組成物または組み合わせをアンプル、使い捨てシリンジまたはガラス、可塑性または他の適切な物質から製造された複数または単回用量バイアルを含む。パッケージング物質は、実質投与目的での投与を促進するために針または他の注射デバイスを含み得る。包装の選択は特定の送達剤による。一般に、パッケージングはその中に含まれる組成物と非反応性である。また、組成物およびパッケージング物質は無菌である。
例えば、送達剤を含む組成物を、投与により十分な量の送達剤(例えばウイルス粒子)が送達されるような量を含む、容器、例えば密閉無菌バイアルまたはシリンジに提供できる。組成物中の送達剤、例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスの量は、正確にまたは約１０pfu〜１×１０１２pfu、１×１０２pfu〜１×１０１０、１×１０３pfu〜１×１０１０pfu、１×１０３pfu〜１×１０９pfu、１×１０３pfu〜１×１０８pfuまたは１×１０６pfu〜１×１０９pfu；または正確にまたは約１０粒子〜１×１０１２粒子、１×１０２粒子〜１×１０１０粒子、１×１０３粒子〜１×１０１０粒子、１×１０３粒子〜１×１０９粒子、１×１０３粒子〜１×１０８粒子または１×１０６粒子〜１×１０９粒子である。容器中の組成物の体積は５０μL〜５０mL、５０μL〜５mL、５０μL〜５００μL、１００μL〜１０mL、１００μL〜５mL、１００μL〜２mL、１００μL〜１mL、２００μL〜４mL、２００μL〜２mL、１mL〜１０mLまたは１mL〜２mLであり得る。例えば、容器は、単回使用または複数回使用投与用に提供され得る。容器中の薬剤の体積は１００μL〜１０mLであってよく、ここで、このような体積中の少なくとも約１０〜１０１０プラーク形成単位(pfu)または粒子、例えば１０２〜１０６プラーク形成単位(pfu)または粒子を含む約２０〜５mL、例えば２０〜５００μl、５０〜１５０μl、１００μL〜１０mLまたは２００μl〜２mLが送達される。
送達剤を含む組成物または組み合わせは、パッケージング物質、単回または多回服用量投与のための実質投与用に製剤された一定量の薬剤および送達剤が特定の核酸分子の送達において使用されるおよび／または特定の適用において使用されることを指示するラベルを含む製品としてパッケージされ得る。
このような包含された組成物、組み合わせおよび製品はキットで提供できる。特に、アンプル、ビン、チューブ、バイアル、容器、シリンジとその中に包含された送達剤組成物を含むキットが提供される。キットは、所望により送達剤投与を可能にするためのデバイス、例えばシリンジ、針または他の注射デバイスを備え得る。組成物は、投与のための道具中に含まれていてよくまたは後に加えるべき別物として提供できる。キットは、所望により、投与量、投与レジメンおよび投与のための指示を含む適用のための指示を含む。他の試剤もまた提供され得る。例えば、キットは、所望により組織または臓器またはその部分の区画化を行うデバイス、組織または臓器の動員を行うための道具、区画化をモニターするためのタイマーおよび本方法の実施に際して使用される他の試剤を含み得る。例えば、キットは実質クランプを含み得る。
Ｆ. 送達、発現または有効性の評価
ここでの区画化方法の実施に際し、送達剤の送達、核酸分子の発現を確認するためおよび／または本方法の実施を他に確認するために、任意の数のパラメータをモニターまたは評価できる。例えば、送達剤の細胞への侵入、実質または体循環への送達剤の存在を評価でき、コードされるポリペチドの発現を評価でき、組織の毒性をモニターまたは評価できおよび／または免疫系の活性化を決定できる。当業者このような方法および手法を熟知する。このような方法および手法を所望により実施してよい。
１. 送達剤のモニタリング
例えば、ここでの区画化方法を使用した送達剤の送達または投与により、対象における送達剤の存在を評価または検出できる。例えば、血管隔離前、途中および後の送達剤の全身放出または導入遺伝子産物の末梢血への発現を測定するためのここに例示するアッセイを実施できる。典型的に、本発明方法において、１０％未満および一般的に５％、４％、３％、２％または１％未満の導入遺伝子産物が、本発明方法を使用したここでの組織または部分への送達剤への直接投与後に、体循環で検出される。
送達剤検出は、送達剤または核酸分子の検出可能部分へのコンジュゲーションまたは操作可能な結合により容易になり得る。検出可能部分は当業者に周知であり、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種および金属を含むが、これらに限定されない。例えば、検出可能部分は、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、コロイド金、鉄、ガドリニウムおよびガリウム−６７および当業者に周知の他の部分を含む。
送達剤を、組織または体液サンプルからモニターできる。例えば、実質組織および特に区画化領域を回収し、処置し(例えば均質化により)、ＲＮＡまたはＤＮＡをそこから単離または精製できる。アッセイし得る体液は、例えば、末梢血を含む。組織または体液からＲＮＡおよびＤＮＡを抽出する方法は当業者に周知である。例えば、TRIzol(登録商標)ベースの方法は、典型的に生物学的物質からのＲＮＡ抽出に使用される(例えばTRIzol(登録商標)試薬、Life Technologies, Carlsbad, CA)。例えば、遺伝子特異的プライマーまたはプローブを設計でき、送達剤または核酸分子を、ＰＣＲおよび当業者に知られる他の標準的方法を使用して検出できる。これは、ＰＣＲをルシフェラーゼに対するプライマーを使用して実施した実施例においてここで例示する。
組織(例えば均質化サンプル)または生物体液サンプル中のその検出は、蛍光光度計、ルミノメーター、比色プレートリーダー、ガイガーカウンター、液体シンチレーションカウンターを使用しても行い得る。方法の選択は特定の検出可能部分により、当業者のレベルの範囲内である。例えば、ルシフェラーゼ活性は、ここで実施例に例示するとおりルミノメーターを使用して評価できる。さらに、検出は、所望により対象からの生物学的サンプルにおける送達剤によりコードされるポリペチドの発現の検出により実施する。ポリペチドは、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫蛍光またはＥＬＩＳＡを含むが、これらに限定されない当業者に知られる手技を使用して実施できる。
具体例において、組織または臓器からの実質細胞を単離し、送達剤の細胞内存在について評価できる。特に、実質細胞の単離は、典型的にトリプシン、コラゲナーゼ類および／または他のプロテアーゼを使用する組織の酵素消化による。このような手技は当業者に周知である(例えばSomers et al. (2007) DMD, 35:1797-1805; Methods in Cell Biology, vol XIII, David M. Prescott ed., Academic Press, 1976; Chapter 4, “Preparation of Isolated Rat Liver Cells”, pp 29-83参照)。例えば、組織を、血を除去するために、例えばリン酸緩衝化食塩水で灌流し得る。組織をハサミで刻み、プロテアーゼ含有消化媒体で消化させる。これは、典型的に細胞懸濁液を作製し、これを濾過して細胞を回収し得る。残存プロテアーゼは、例えば、胎児ウシ血清中への細胞の回収により、不活性化できる。次いで、細胞を洗浄し、特定の細胞と適合性であることが知られた選択した細胞培養培地で培養する。細胞生存能を評価でき、新たに単離した細胞を、送達剤の細胞内存在についてアッセイできる。細胞内送達物の存在は、細胞膜の固定化および透過処理により評価できる(例えば市販の試薬、例えばORTHOPermeaFixTM(ＯＰＦ)またはFIX&PERM Cell Permeabilization kit(登録商標)；An Der Grub Bio Research GmbH, Imtecを使用)。細胞を、フローサイトメトリーにより、プレートリーダーデバイス(例えば蛍光光度計、ルミノメーターまたは比色プレートリーダー)の使用によりまたは放射活性評価により評価できる。さらに、所望により、顕微鏡検査方法を使用できる。さらに、細胞ホモジネートを調製し、ウェスタンブロット分析に使用できる。
２. 宿主毒性および免疫活性化
送達剤投与により開始される組織毒性および免疫応答を評価できる。例えば、毒性を、根底にある組織または臓器またはその部分の病理組織学により評価できる。組織サンプルをバイオプシーにより得て、組織学的分析のために、典型的にヘマトキシリンおよびエオシンを使用して染色し得る。細胞異常性を評価できる。例えば、組織病理学的分析は、免疫活性化と関連する炎症性細胞浸潤、例えばリンパ性または好中球浸潤を同定できる。同じ対象の同じ組織または臓器の区画化されていない領域との比較もなし得る。他の例において、本発明方法により処置されていないコントロール対象からの組織を使用できる。
組織または臓器の傷害により上方制御される、現れるまたは結合する因子またはマーカーの発現の評価により毒性もモニターできる。例えば、組織傷害の生化学的マーカーを評価できる。このようなマーカーは当業者に知られ、特定の組織または臓器により変わる。例えば、肝臓に関して、肝臓傷害または損傷と関連する既知バイオマーカー結合は、例えば、アラニントランスフェラーゼ(ＡＬＴ)、アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)、アルカリホスファターゼまたはビリルビンを含む。このようなマーカーのベースラインレベルを、ここでの手技の開始前に対象で決定できる。正常コントロール対象に、このような酵素群の正常レベルの指標として使用できる。さらに、マーカーのレベルを、組織または臓器の区画化された領域と区画化されていない領域で比較し得る。典型的に、少なくともコントロールの２倍であるマーカー、例えばＡＬＴのレベルは、組織損傷、例えば肝臓損傷の指標である。
さらなる例では、免疫活性化の他のマーカーを評価できる。免疫活性化のマーカーは、局所組織で評価できる。他の例において、免疫活性化のマーカーを、体循環で評価できる。本発明方法において、送達剤後投与、免疫活性化のマーカー、例えばサイトカイン発現は顕著に上昇しないか、対象の体循環で上昇しない。さらに、送達剤を投与した臓器またはその部分では幾分増加しても、観察される局所免疫活性化は、現存する遺伝子治療方法で観察されるより少ない。このようなマーカーのベースライン値を正常対象からまたは本発明方法における送達剤の投与前の処置対象から決定できる。さらに、区画化の効果を、区画化されている組織または臓器の部分と、区画化されていない組織または臓器の部分の免疫マーカーを比較することにより決定できる。
例えば、送達剤に対する中和抗体の存在を評価または決定できる。具体例において、ウイルス特異的中和抗体を検出できる。典型的に、血清を、例えば本発明方法でウイルスを投与している対象から採取する。血清中の中和抗体の存在および量を評価するための種々のアッセイは当業者に知られる。例えば、中和抗体を、ウイルス機能の血清阻害に基づき(Mandel et al. (1978) Adv. Virus. Res., 23:205-68)、プラークアッセイを使用し(Harvey et al. (1999) J. Virol., 73:6729-6742)、ヒト血清によるアデノウイルスカプシドタンパク質のウェスタンブロット(Vincent et al. (2001) J. Virol., 75:1516-1521)および定量的形態学的基準(Vincent et al. (2001))に基づき検出できる。中和抗体の血清レベルはまた抗ウイルス特異的抗体を使用して評価できる。例えば、抗Ａｄ５抗体を使用できる(例えば６５Ｈ６、Thermo Scientific, Rockford, IL)。
他の例において、サイトカインおよび特に炎症誘発性サイトカインの発現を評価できる。組織または体液(例えば末梢血)をＤＮＡまたはＲＮＡについてプロセシングできる。ＰＣＲ、例えばＲＴ−ＰＣＲを実施できる。サイトカインのＲＴ−ＰＣＲ用試薬を含む種々のアレイが市販されている(例えばLife Technologies, Carlsbad, CAのTaqMan(登録商標)アレイ参照)。また、任意の目的とするサイトカインに対してプライマーを設計できる。他の例では、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)、酵素免疫アッセイ(ＥＩＡ)またはウェスタンブロットアッセイをサイトカイン発現の評価に使用できる。サイトカインおよび他の免疫タンパク質を評価するための試薬は周知であり、市販されている。例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびその他を含むが、これらに限定されない多くのサイトカインのためのＥＩＡおよびＥＬＩＳＡキットが市販されている。このようなアッセイで使用するための組織調整のために、当業者に知られる組織均質化手技を使用できる。組織を均質化緩衝液で均質化し、細片および不溶性物質を除去するために遠心分離し、総タンパク質濃度を決定できる(例えばクーマシータンパク質染色アッセイ、ＢＣＡ方法または当業者に知られる他の方法)。遠心分離した上清の一定量をウェスタンブロット用に処理するかまたは希釈し、直接ＥＬＩＳＡベースのアッセイに使用できる。
Ｇ. 適用および使用方法
ここで提供する区画化方法は、導入遺伝子産物の持続性で長期の高レベル発現を可能にする。従って、欠損遺伝子産物を置き換えるための適用または治療剤を外因的に投与するための適用を含む医学適用；移植用臓器産生；トランスジェニック動物での治療的タンパク質(例えばバイオリアクター)；および農業、動物および産業用途を含むが、これらに限定されない多様な適用において、本方法を使用できる。例えば、選択ポリペチドのインビボでの細胞発現のために方法を使用できる。ある例においては、本ペプチド剤は、ポリペチドが対象における障害または状態を処置するまたは回復させるかまたは対象のクオリティ・オブ・ライフを他に改善する治療現場で有用であり得る。他の例において、本ペプチド剤は、農業用途、例えば、肉生産の品質または量を改善する適用で有用であり得る。
本方法を、遺伝子治療処置を必要とし、本発明方法による処置に適しているあらゆる対象または患者で実施できる。このような対象の例は、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびヒトを含むが、これらに限定されない。具体例において、乳児、幼児および低年齢の小児を含む１８歳未満の小児が、遺伝子欠損と関連する疾患または状態の処置のためにここで意図される。
本発明方法の適用例を下に提供する。当然であるが、投与する特定の核酸分子により他の適用が存在する。任意の所望の適用に基づき興味のある核酸分子を選択するのは当業者のレベルの範囲内である。下の記載は単なる例示である。
１. 疾患および障害処置
ここに提供されるのは、ここで提供する区画化方法を使用して対象に核酸分子を送達することによる、疾患、障害または状態の処置方法である。処置する疾患、障害または状態は、外因的に送達した核酸分子による処置に適するあらゆるものである。例えば、このような疾患または状態は、状態と関連する遺伝子の発現の減少または上昇、状態と関連する遺伝子産物の活性の減少または上昇により処置が達成されるまたは状態と関連する変更(例えば疾患または状態と関連する徴候、症状または作用)と他に対抗するあらゆるものを含む。例えば、遺伝子治療を一遺伝子性疾患(例えば血友病ＡおよびＢ、Ｉ型糖尿病、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)、嚢胞性線維症、筋ジストロフィーおよび多くのその他)を含む遺伝子欠損と関連する疾患または状態の処置に使用できまたは疾患または状態(例えば癌)の回復と関連する治療タンパク質のコードにより疾患または状態の処置にを使用できる。
ここでのこのような例のいずれかにおいて、送達剤は、治療核酸であるかまたは治療ポリペチドをコードする核酸分子であるかまたは核酸分子を含む。それゆえに、ここに提供されるのは、対象の臓器またはその部分を区画化し、目的とする核酸分子であるまたはそれを含む選択送達剤を直接区画化臓器またはその部分に投与し、臓器またはその部分への血管循環を回復することによる、疾患または障害を有する対象の処置方法である。
ここに提供する方法を広範な疾患および障害の処置に使用できる。送達剤およびその中の核酸分子は、扱うべき障害または疾患および特定の罹患臓器に基づき選択する。本明細書の他の場所に記載するとおり、当業者は、処置する特定の疾患または障害により核酸分子のタイプを決定できる。さらなる例として、例えば、区画化方法を、嚢胞性線維症の処置のためにＣＦＴＲをコードする核酸、疼痛の処置のためにＮＰ２をコードする核酸、癌の処置のために血管形成阻害剤または腫瘍サプレッサーをコードする核酸、糖尿病の処置のためにインスリンまたはエキセンディン−４をコードする核酸の送達に使用する。
さらに、区画化する特定の組織または臓器は処置する疾患または障害および投与する特定の送達剤によることは当業者に知られる。いくつかの例において、送達剤は組織または臓器形質導入を示さず、それゆえに、直接患部組織または臓器に送達される。他の例においては、特定の送達剤を、全身発現後組織指向性または形質導入を示すように選択する。例えば、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−８およびＡＡＶ−９は、肺、心臓、肝臓、腎臓、骨格および心臓を含む複数組織への広範な形質導入を示し、それゆえに、骨格または心疾患および障害の処置を達成するための全身発現用送達剤であり得る。他の例では、ＡＡＶ−９は中枢神経系(ＣＮＳ)への形質導入のために血液脳関門を迂回でき、それゆえに、神経変性障害または他のＣＮＳ疾患および障害の処置を達成するための全身発現用送達剤である。
特に、肺は、とりわけ癌、喘息、嚢胞性線維症、アルファ−１−アンチトリプシン欠損および呼吸促迫症候群を含む、多くの急性および慢性疾患の遺伝子治療のための重要な標的臓器である。筋肉は、筋ジストロフィーまたはシャルコー・マリー・トゥース(ＣＭＴ)病のような筋肉または運動障害の処置のための遺伝子治療の標的臓器である。脳は、運動神経疾患(例えば脊髄性筋萎縮症(ＡＭＡ)、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー(ＡＬＤ))、パーキンソン病または代謝またはリソソーム障害、例えばサンフィリポ(ムコ多糖症III型；ＭＳＰIII)またはカナバン病を含む不在または欠損遺伝子と関連する疾患および状態の遺伝子治療のための重要な標的臓器である。皮膚は、慢性創傷、肥大型瘢痕、ケロイド、癌、遺伝子疾患および全身疾患の遺伝子治療のための標的臓器である。例えば、増殖因子(例えばＰＤＧＦ−Ｂ、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ)を、創傷治癒のために皮膚に標的化できる(Liu et al. (2001) Yonsei Medican Journal, 42:634-645)。肝臓は、ヘモクロマトーシス、血友病ＡおよびＢ、アルファ１アンチトリプシン欠損、ウィルソン病、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、IIａ型家族性高コレステロール血症、無フィブリノーゲン血症、リソソーム貯蔵疾患、糖原病、フェニルケトン尿症、テイ・サックス病、誘発肝炎を含むが、これらに限定されない多くの遺伝性、遺伝的および代謝肝疾患および障害の遺伝子治療のための標的臓器である。
目的とする核酸を含む送達剤の特定の組織または臓器への遺伝子治療は全身発現に有効であり得る。例えば、肝臓への遺伝子治療送達を使用して、肝臓の細胞機構が大量のタンパク質を産生し、血液に分泌するため、肝臓と無関係な全身疾患または状態の処置に使用できる。それゆえに、肝臓のターゲティングは、凝血因子、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、代謝酵素群および抗プロテアーゼを含むが、これらに限定されない種々の疾患および状態の処置のために血液循環に治療的タンパク質を産生させるために使用できる。肝臓はまた肝細胞を、肝臓内でインスリン分泌β細胞に分化させるために使用できる。遺伝子治療は、肝臓のターゲティングにより多くの疾患および状態を処置するために使用されている(Nakai H., “Hepatic Gene Therapy,” pp. 343-370 in Molecular Pathology of Liver Diseases (S.P.S. Monga, ed.))。他の例では、ケラチン生成細胞が循環に放出され得る大量のタンパク質を産生するために、全身疾患を、皮膚のターゲティングにより処置できる。それゆえに、皮膚の遺伝子治療を使用して、サイトカイン(例えばインターフェロンまたはインターロイキンまたは他のサイトカイン)、ホルモン(例えばインスリン、成長ホルモンおよび他のホルモン)、凝血因子および新生物、ウイルス、炎症性および遺伝子疾患を処置するための他のタンパク質をコードする送達核酸を送達できる。例えば、遺伝子欠損、例えば血友病Ｂは、第IX因子のケラチン生成細胞への送達により処置できる。
さらに、投与する送達剤の量は、核酸分子によりコードされる治療核酸または治療的ポリペチドの所望の治療的投与量に基づき調節できる。ここに記載するとおり、ここで提供する区画化方法を使用して、送達剤の用量とタンパク質産出量は直線的である。それゆえに、特定の投与量の送達剤を、特定の核酸分子、送達剤、特定の遺伝子療法、送達剤を投与する対象、標的臓器またはその部分、予測される取り込み、必要な治療量および他の因子に基づき、経験的に決定できる。
ここでの区画化方法による核酸分子の送達により処置できる疾患または障害の例は、遺伝性酵素欠損(例えば、ムコ多糖症、糖原病およびリソソーム貯蔵疾患)、癌、血友病、糖尿病、筋ジストロフィー、心血管障害、嚢胞性線維症、癌、神経変性障害、外傷、疼痛、鎌状赤血球貧血、自己免疫性疾患、炎症性疾患、遺伝性免疫欠損、高血圧およびパーキンソン病を含むが、これらに限定されない。例えば、疾患または状態は、とりわけ血友病ＡおよびＢ、Ｉ型糖尿病、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、II型、家族性高コレステロール血症、無フィブリノーゲン血症、糖原病(ＧＳＤ)Ｉａ型、ＧＳＤ Ｉｂ型、ＧＳＤ II型(ポンペ)、ムコ多糖症(ＭＰＳ１)、ＭＰＳ IIIＡ、ＭＰＳ IIIＢ、ＭＰＳ VII、ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損(ＯＴＣ)、フェニルケトン尿症、肝線維症、肝虚血再灌流傷害、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、ガラクトース血症、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、チロシン血症Ｉ型、メチルマロン酸血症、シトルリン血症、痛風およびレッシュ・ナイハン症候群、スライ症候群、ツェルウェーガー症候群、重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)、嚢胞性線維症、急性間欠性ポルフィリン症、リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)または多発性硬化症から選択される。
肝臓を例にして、本発明方法は、遺伝子治療が当分野で使用されている、あらゆる疾患を処置するために、区画化肝臓または肝臓の部分に、任意の核酸、例えばセクションＤ.１に記載のいずれかを含む送達剤の送達に使用できる。例えば、肝臓(または他の組織または臓器)は、血友病Ａの処置のための第VIII因子の送達；血友病Ｂの処置のための第IX因子の送達；α(アルファ)１−アンチトリプシン欠損の処置のためのα(アルファ)１−アンチトリプシンの送達；糖原病(ＧＳＤ)Ｉａ型の処置のためのグルコース−６−ホスフェート−α；ＧＳＤ Ｉｂ型の処置のためのＧ６ＰＴの送達；ＧＳＤII型(ポンペ)の処置のための酸−α−グルコシダーゼの送達；ムコ多糖症(ＭＰＳ１)の処置のためのα−Ｌ−イズロニダーゼの送達；ＭＰＳ IIIＡの処置のためのスルファミダーゼの送達；ＭＰＳ IIIＢの処置のためのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)の送達；ＭＰＳVIIの処置のためのβ−グルクロニダーゼの送達；ファブリー病の処置のためのα−ガラクトシダーゼＡの送達；ゴーシェ病の処置のためのグルコセレブロシダーゼの送達；ニーマン・ピック症候群の処置のための酸スフィンゴミエリナーゼの送達；ＯＴＣ欠損の処置のためのオルニチントランスカルバミラーゼ欠損(ＯＴＣ)の送達；クリグラー・ナジャー症候群の処置のためのＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１(ＵＧＴ１Ａ１)の送達；家族性高コレステロール血症の処置のためのＬＤＬ受容体の送達；フェニルケトン尿症の処置のための；フェニルアラニンヒドロキシラーゼの送達メタロプロテアーゼ(ＭＭＰ１またはＭＭＰ８)；肝線維症の処置のためのｕ−ＰＡ、ＴＩＭＰアンタゴニストまたは抗ＨＳＣ分子の送達；肝虚血再灌流傷害の処置のための抗ＲＯＳ分子の送達；糖尿病の処置のためのプロインスリン前駆体またはβ細胞トランス分化の転写因子の送達；Ｂ型肝炎の処置のためのウイルスＲＮＡに対するＲＮＡｉの送達；Ｃ型肝炎の処置のためのウイルスＲＮＡに対するＲＮＡｉの送達；肝癌の処置のためのｐ５３の送達；多発性硬化症の処置のためのＩＦＮ−βまたは他の抗炎症性サイトカインの送達；誘発肝炎の処置のためのインターフェロン−αの送達；またはリポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)の処置のためのリポタンパク質リパーゼの送達を含むが、これらに限定されない送達および疾患および状態の処置のために本方法において区画化できる。
核酸によりコードされる治療核酸または治療ポリペチドで対処できるあらゆる疾患または状態が対処され得るため、この一覧は限定的であることを意図しない。疾患および状態の例を下に記載する。
ａ. 血友病ＡおよびＢ
ここでの区画化方法および物質により処置できる状態の例は、血友病である。ＡおよびＢの２種の血友病がある。血友病Ａの患者は第VIII因子として知られるタンパク質を欠き、血友病Ｂの患者は第IX因子を欠く。これらの血凝固因子の例レベルまたは完全な非存在が、傷を負ったときまたは血管構造が損われたとき、出血を止める患者の能力の重度の障害をもたらす。これは、致命的結果となり得る長時間の出血をもたらす。血友病の現在の処置は、血液製剤または必要な血液因子の組み換え変異体の定期的輸血である。しかしながら、ドナー血液のスクリーニングの改善にもかかわらず、血液または血液製剤輸血を介したウイルス感染の危険性は問題のままである。さらに、血液製剤由来および組み換え由来第VIII因子または第IX因子治療で、凝固因子の活性を遮断する抗体の発生が、幾分かの患者で処置合併症である。血友病は、第VIII因子または第IX因子レベルの中程度の上昇が、血友病ＡまたはＢそれぞれの多くの臨床的帰結の改善に十分であることが示されているため、遺伝子治療の理想的候補と考えられている。
本発明方法を使用して、第VIII因子の遺伝子を含む送達剤を使用して、血友病Ａを処置できる。他の例では、本発明方法を使用して、第IX因子の遺伝子を含む送達剤を使用して、血友病Ｂをできる。本方法は、肝臓、例えば、肝臓の小部分が、必要な血凝固因子を循環に永久に分泌し、それゆえに、おそらく本疾患の帰結を回復できる新規内分泌腺とする。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器、例えば、区画化肝臓、例えば肝臓の小部分に、凝固因子をコードする送達剤の組み換えウイルス(例えばアデノウイルス)またはある他のタイプのベクターを直接送達することにより達成される。例えば、特定の凝固因子は、根底の欠損により第VIII因子または第IX因子である。遺伝子情報は転写および形質導入され、それゆえに、凝固因子は合成され、循環に分泌され、血凝血機能障害／欠損を補正する。
ｂ. 家族性高コレステロール血症
ここでの区画化方法および物質により処置できる状態の例は、家族性高コレステロール血症である。家族性高コレステロール血症は、低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬＲ)遺伝子における変異による常染色体優性障害である。血漿コレステロール低下は冠動脈疾患のリスクを下げるが、家族性高コレステロール血症の患者は、一般的に医学的処置にほとんど応答しない。家族性高コレステロール血症を有する対象は、低密度リポタンパク質受容体をコードする核酸の投与により処置されている(例えば Grossman et al. (1995) Nat. Med., 1:1148-1154; Shichiri et al. (2003) Gene Ther., 10:827-31; Yang et al. (1994) Immunity, 1:433-442; Yang et al. (1995) J. Virol., 69:2004-2015; Yang et al. (2004) Biochem. J., 379:89-97参照)。同様に、ここでの区画化方法を使用して、ＬＤＬＲの遺伝子を含む送達剤を使用して、家族性高コレステロール血症を処置できる。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器、例えば、区画化肝臓、例えば肝臓の小部分に、ＬＤＬＲをコードする送達剤の組み換えウイルス(例えばアデノウイルス)またはある他のタイプのベクターを直接送達することにより達成できる。
ｃ. Ｉ型糖尿病
ここでの区画化方法および物質により処置できる状態のさらなる例はＩ型糖尿病である。Ｉ型糖尿病は、インスリン産生の不全によりもたらされ、これは、血糖値の顕著な上昇に至る。さらに、持続性高血糖値は、患者のクオリティ・オブ・ライフおよび寿命をひどく減少させる、重度の帰結に至る。糖尿病は現在治癒しない慢性疾患である。
糖尿病のいくつかの病理学的影響の軽減は、本方法を使用したインスリンレベルの部分的回復により達成できる。ここでの区画化方法を使用して、インスリンの遺伝子を含む送達剤を使用して糖尿病を処置できる。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器、例えば、区画化肝臓、例えば患者肝臓の小部分に、インスリン遺伝子をコードする送達剤(例えばウイルスベクターまたは他のベクター)を直接送達することにより達成できる。これは、形質導入肝細胞によるインスリンの安定な、長期、合成および分泌をもたらし得る。
ｄ. アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損
ここでの区画化方法および物質により処置できる状態のさらなる例は一般的一遺伝子性肺疾患アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損である。ＡＡＴは、肝臓により産生され、循環に分泌され、そこで、肺への道を発見し、そこで、肺胞壁のエラスチン繊維および他の結合組織成分が好中球エラスターゼにより分解されることから保護する。ＡＡＴ欠損は、気腫による患者の死をもたらし得る。ＡＡＴをコードする遺伝子が単離され、組み換えヒトＡＡＴタンパク質を用いる外来性投与は現在の治療の一つである。
遺伝子治療に基づく治療手法の開発が有望であることを示す多くの研究もある。遺伝子治療方法は、例えば、ＡＡＴを発現するための骨格筋細胞または肝細胞の形質導入である(Song et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14384-14388; Song et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., 98:4084-8; Song et al. (2001) Gene Ther., 8:1299-1306; Song et al. (2004) Hepatology, 40:918-24; Zhang et al. (2003) Gene Therapy, 10:2148-52; Ferkol et al. (1998) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 18:591-601)。
本発明方法を使用して、ＡＡＴの遺伝子を含む送達剤を使用して、ＡＡＴ欠損を処置できる。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器の実質(例えば筋肉または肝臓、例えば肝臓の小部分)にＡＡＴをコードする送達剤(例えば非ウイルスまたはウイルスベクター、例えばアデノウイルス)を直接送達することにより達成できる。本方法を使用する、ベクターへのＡＡＴをコードする核酸配列の取り込みおよび組織臓器の部分の形質導入により、ＡＡＴの安定な長期発現が達成でき、気腫を解消する可能性がある。
ｅ. 血管形成および癌
ここでの区画化方法により処置できる疾患または状態の例は血管形成である。血管形成は、先在する脈管構造から新規毛細血管が形成される過程である。内皮細胞の増殖と遊走が関与する複雑な過程である。血管形成は、生殖、胚発育および創傷治癒に基礎的役割を有する。しかしながら、未制御の血管形成は、多くの疾患、例えば固形腫瘍増殖および転移、関節炎、糖尿病および失明のいくつかの形態の進行に中心的役割を有する。例えば、血管形成は、腫瘍を増殖でき、転移を促進する腫瘍への血液供給の形成により、癌の増殖および拡散に役割を有する。それゆえに、癌および血管形成が役割を有する他の疾患の処置に抗血管形成剤を使用できる。
血管形成は、血管新生促進増殖因子、例えばＶＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦと、抗血管形成因子、例えばエンドスタチンおよびアンジオスタチンの間の複雑な相互作用により制御されている。これら２群間のアンバランスが病的血管形成を生じる。抗血管形成因子、例えばエンドスタチンまたはアンジオスタチンの患者癌への点滴が、これら二つの力の間のバランスを復旧し、異常血管形成を抑止し、それゆえに、腫瘍増殖および転移を抑止することを証明するいくつかの研究がある。
本発明方法を使用して、抗血管形成因子をコードする核酸を含む送達剤を、血管新生疾患および状態、例えば癌、関節炎、糖尿病および失明の処置に使用できる。これは、本発明方法を使用して、抗血管形成因子、例えばエンドスタチンまたはアンジオスタチンをコードする送達剤(例えば非ウイルスまたはウイルスベクター、例えばアデノウイルス)を、区画化された組織または臓器の実質(例えば肝臓、例えば肝臓の小部分)に直接送達することにより達成できる。本方法を使用する、抗血管形成因子をコードする核酸配列のベクターへのとりこみおよび組織臓器の部分の形質導入により、抗血管形成薬剤の安定な長期発現が達成できる。
ｆ. 自己免疫性および炎症性障害(例えば多発性硬化症)
ここでの区画化方法により処置できる疾患または状態の例は自己免疫性および炎症性障害、例えば多発性硬化症(ＭＳ)、リウマチ性関節炎、骨関節症、糖尿病、クローン病、シェーグレン症候群、嚢胞性線維症、筋炎および狼瘡である。例えば、ＭＳは、脳および脊髄の軸索の周りの脂肪性髄鞘が損傷される、中枢神経系(ＣＮＳ)の自己免疫性炎症性疾患である。その結果、軸索がもはやシグナルを伝達できなくなる。
遺伝子治療による自己免疫性炎症性障害、例えばＭＳおよび他の状態の処置は、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗Ｔ細胞モノクローナル抗体、シグナル伝達阻害剤を使用する、免疫活性化を標的とする。例えば、抗炎症性遺伝子は、免疫応答を下方制御するために導入できる(Neumann et al. (2005) Gene Therapy and Molecular Biology, 9:61-76)。抗炎症性遺伝子の例は、サイトカインまたは他の免疫調節剤、例えば、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、トランスフォーミング増殖因子ｂ、インターフェロン−ベータ(ＩＦＮβ)、インターロイキン−１受容体アルファ(ＩＬ−１Ｒα)、可溶性ＴＮＦ受容体(ｓＴＮＦ−Ｒ)、可溶性インターロイキン−１受容体(ｓＩＬ−１Ｒ)または可溶性インターフェロン−ガンマ受容体(ｓＩＦＮγＲ)を含むが、これらに限定されない。例えば、インターフェロンベータでの処置はＭＳに対して承認されている(Kieseier et al. (2007) Exp. Neurol., 203:1-4)。ウイルスおよび非ウイルス遺伝子治療手法に加えて、ＭＳの処置は、処置標的対象から回収した細胞(例えば樹状細胞またはＴ細胞)の使用を含み、これを抗炎症性サイトカイン(例えばＩＦＮ−β、ＩＬ−１０またはＩＬ−４)を発現するように改変し、次いで、遺伝子産物送達のために宿主対象に再導入する。
本発明方法を使用して、抗炎症性遺伝子またはサイトカインをコードする核酸を含む送達剤を使用して、自己免疫性および炎症性障害、例えば多発性硬化症(ＭＳ)、リウマチ性関節炎、骨関節症、糖尿病、クローン病、シェーグレン症候群、嚢胞性線維症、筋炎および狼瘡を処置できる。具体例において、抗炎症性遺伝子またはサイトカイン(例えばＩＦＮ−β、ＩＬ−１０またはＩＬ−４)をコードする核酸をコードする送達剤をＭＳの処置に使用する。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器の実質(例えば肝臓、例えば肝臓の小部分)に、抗炎症性遺伝子またはサイトカイン(例えばＩＦＮ−β、ＩＬ−１０またはＩＬ−４)をコードする送達剤(例えば非ウイルス、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたは全細胞)を直接送達することにより達成できる。本方法を使用する、抗炎症性遺伝子またはサイトカインをコードする核酸配列のベクターへの取り込みおよび組織臓器の部分の形質導入により、抗炎症性薬剤の安定な長期発現が達成できる。
ｇ. 急性間欠性ポルフィリン症(ＡＩＰ)
ここでの区画化方法により処置できる疾患または状態の例は急性間欠性ポルフィリン症(ＡＩＰ)である。ＡＩＰは、ヘム合成経路の第三酵素であるポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(ＰＢＧＤ)の欠損により特徴付けられる遺伝性代謝疾患である。酵素活性は、本遺伝子形質を受け継ぐ者では正常の〜５０％である。本疾患は、常染色体優性方法で遺伝性であり、最も一般的な急性ポルフィリン症である。全人種で起こるが、欧州北部、主にスウェーデン、英国およびアイルランドで最も蔓延している。米国および他の国での有病率は５／１００,０００と推定され、スウェーデン北部では６０〜１００／１００,０００ほども高い。今日まで、ＰＢＧＤ遺伝子における２２５を超える変異が記載されている。顕性な臨床的特徴は、腹痛および内臓神経および循環障害を含む、全ての神経系の機能不全による急性間欠性発作である。腹痛は症例の８５〜９５％で報告され、最も一般的な性質であり、神経学的変化が続くか、または合併する。ＡＩＰが認識されず、有害薬物、例えば発作により誘発され得る肝臓チトクロムＰ４５０酵素群により代謝される薬物が中止されないならば、呼吸器および球麻痺への進行および死となり得る。突然死も、心臓不整脈の結果として起こり得る。一次肝癌および腎臓機能障害が同様に起こることがある。
ＰＢＧＤ変異を受け継ぐ対象の大部分はポルフィリン症状を発症せず、すなわち臨床的浸透率は極めて低い。ＡＩＰ保因者の臨床的症状は、急性発作を誘発する薬物または他の誘発因子による、ヘム合成の要求の高まりの結果としての、ポルフィリン前駆体デルタ−アミノレブリン酸(ＡＬＡ)およびポルフォビリノーゲン(ＰＢＧ)産生および排泄の増加と関連する。これらの状態において、ＰＢＤＧ欠損はヘム合成を制限し、その結果、ＡＬＡシンテターゼ(ＡＬＡＳ１)のヘム仲介抑制が障害される。肝臓が過剰のポルフィリン前駆体の主源であることを示す証拠がある。これらの化合物は、ポルフィリン危機を繰り返しやすい対象において発作間で高いままであり、危機の間にさらに上昇する。疾患が長期間不活性であるならば、正常まで下がり得る。
急性発作は、通常思春期の後に起こり、内分泌因子およびステロイドホルモン、および薬物、栄養性因子、炭水化物およびカロリー摂取制限、喫煙、ステロイドホルモンおよび経口避妊薬、鉛中毒、介入性感染、手術および心理的ストレスを含む多様な環境因子により不顕性の個体で誘発され得る。薬物は、とりわけ、急性発作を誘発する最も重要な因子であり、安全な薬物の一覧はwww.drugs-porphyria.comから入手可能である。喫煙、エタノールおよびＣＹＰ４５０により代謝される薬物は、肝臓のヘム要求を著しく高め、ＡＬＡＳ１の誘発をもたらし、これは、ポルフィリン前駆体の産生を増加し、急性発作を誘発する。また、ＡＬＡＳ１は、空腹時に肝臓で誘発されるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクティベーター１α(ＰＧＣ１α)により正に制御される。誘発因子の中で、ステロイドホルモンが重要な役割を有すると考えられる。この概念は、本疾患の思春期前の発症が稀であり、経口避妊薬がＰＢＧＤ欠損を有する女性で発作を悪化させることがあるとの事実により支持される。また、女性(８０％)はしばしば男性(２０％)より罹患する。
急性発作は、グルコースおよびヘミン(Normosang, Orphan Europe)の点滴により処置する。グルコースは、ＰＧＣ−１αが仲介するＡＬＡＳ１誘発に拮抗するようである。ヘミンは、制御性ヘムプールを回復させ、肝臓ＡＬＡＳ１誘発を抑制する。女性は月経前発作を起こすことがあり、これは、ゴナドトロピン放出ホルモン(ＧｎＲＨ)アナログにより予防できる。ある患者は、反復性の急性発作および顕著な、身体障害性神経学機能不全を示す。進行した神経損傷ならびに亜急性および慢性症状は、一般的にヘム治療に応答しない。これは、今日まで、３名の患者において、神経毒性ＡＬＡおよびＰＢＧの蓄積を阻止している、同種肝移植によってのみ治癒できる生命を脅かす状態である。それにも係らず肝移植は適合性のドナーの可用性が制限され、罹病率および死亡率が顕著である。
遺伝子置換治療は、特に肝臓機能がＰＢＧＤ欠損以外は完全に正常である患者において、肝移植に代わる。ＰＢＧＤのポルフィリン症マウスへのアデノウイルスベクター仲介遺伝子伝達は、ＰＢＧＤの一過性肝臓発現の結果として短期治療有効性が確認された(Johansson, 2004, Mol. Ther. 10(2):337-43)。遺伝子治療をコードする遺伝子のもまたAmsterdam Molecular Therapeuticsｓおよび他社により開発中である(例えば米国公開出願番号ＵＳ２０１１／０２６２３９９および欧州特許番号ＥＰ１０４９４８７参照)。
本発明方法を使用して、ＰＢＤＧをコードする核酸を含む送達剤を使用して、急性間欠性ポルフィリン症(ＡＩＰ)を処置できる。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器の実質(例えば肝臓、例えば肝臓の小部分)に、ＰＢＤＧをコードする送達剤(例えば非ウイルス、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたは全細胞)を直接送達することにより達成できる。本方法を使用する、ＰＢＤＧをコードする核酸配列のベクターへの取り込みおよび組織臓器の部分の形質導入により、ＰＢＤＧの安定な長期発現がＡＩＰの処置のために達成できる。
ｈ. サンフィリポ症候群
ここでの区画化方法および物質により処置できる状態の例は、サンフィリポ症候群である。サンフィリポ症候群またはムコ多糖症III型(ＭＰＳ III)は、常染色体劣性遺伝欠損が、部分的に分解された硫酸ヘパランのオリゴ糖の蓄積を起こす、リソソーム貯蔵疾患である。７０,０００人の出生児あたり約１人で起こる。サンフィリポ症候群は、幼児期の学習能力低下、成長遅延または阻止、発育遅延および精神状態悪化と関連する。サンフィリポ症候群に、次の４種のサブタイプがある：サンフィリポタイプＡ(ＭＰＳ IIIＡは、酵素ヘパランＮ−スルファターゼが不在であるまたは変更されているときに起こる；サンフィリポタイプＢ(ＭＰＳ IIIＢ)は、酵素アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)が不在であるか、変更されているかまたは十分産生されないとき起こる；サンフィリポＣ(ＭＰＳ IIIＣ)は、酵素アセチル−コアルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼが不在であるか、変更されているかまたは十分産生されないとき起こる；およびサンフィリポタイプＤ(ＭＰＳ IIIＤ)は、酵素Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼが不在であるか、変更されているかまたは十分産生されないとき起こる。例えば、サンフィリポタイプＢは、酵素アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの欠損を起こし得る、ＮａＧｌｕ遺伝子の変異が原因である。
サンフィリポ症候群、例えばＭＰＳ IIIＡ、IIIＢ、IIIＣまたはIIIＤの処置は、不在または欠損遺伝子の送達により達成できる。送達は中枢神経系(ＣＮＳ)に直接的であり得る。送達はまた血液脳関門を越える効率的ＣＮＳ送達を達成する送達方法、例えば脈管構造から血液脳関門を通過できるアデノ随伴ウイルス血清型の使用により達成できる。このような血清型の例はＡＡＶ９である(例えば、Fu et al. (2011) Mol. Ther., 19:1025-33参照)。
本発明方法を使用して、ヘパランＮ−スルファターゼをコードする核酸を含む送達剤を使用してＭＰＳ IIIＡを処置でき、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)をコードする核酸を含む送達剤を使用してＭＰＳ IIIＢを処置でき、アセチル−コアルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む送達剤を使用してＭＰＳ IIIＣを処置でき、またはＮ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼをコードする核酸を含む送達剤を使用してＭＰＳ IIIＤを処置できる。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器の実質(例えば肝臓、例えば肝臓の小部分；または脳に直接的に)に、特定のＭＰＳ III障害の不在または欠損酵素をコードする送達剤(例えば非ウイルス、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたは全細胞)を直接送達することにより達成できる。具体例において、送達剤は、血液脳関門を通過する送達を達成するための、不在または欠損酵素(例えばｒＡＡＶ９−ｈＮＡＧＬＵ)をコードする核酸を含む、組み換えアデノウイルス関連９である。本方法を使用する、不在または欠損酵素をコードする核酸配列のベクターへの取り込みおよび組織臓器(例えば肝臓)の部分の形質導入により、不在または欠損酵素の安定な長期発現がＭＰＳ III(サンフィリポ症候群)のためにＣＮＳにおいて達成できる。
ｉ. リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)
ここでの区画化方法および物質により処置できる状態の例は、リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ；別名１型高脂血症、一次高リポタンパク血症または家族性高カイロミクロン血症)である。ＬＰＬＤは、リポタンパク質リパーゼ(ＬＰＬ)をコードする遺伝子の改変が原因である。ＬＰＬの不在またはＬＰＬの欠損により、長鎖脂肪酸類代謝欠損により血中脂肪レベルが上昇する。ＬＰＬＤに関連する症状は、例えば、腹痛および膵炎を含む。ＬＰＬＤはまた高血中トリグリセリドレベルとも関連し、これにより対象は早発性糖尿病および粥状動脈硬化に罹患しやすくなり得る。
遺伝子治療を使用して、ＬＰＬＤを処置できる。例えば、ＬＰＬＤ処置のために骨格筋に送達するための、ＬＰＬ遺伝子をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)が欧州で承認されている(グリベラ(登録商標)として販売)。
本発明方法を使用して、ＬＰＬをコードする核酸を含む送達剤を使用して、リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)を処置できる。これは、本発明方法を使用して、区画化された組織または臓器の実質(例えば肝臓、例えば肝臓の小部分；または骨格筋)にＬＰＬをコードする送達剤(例えば非ウイルス、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスまたは全細胞)を直接送達することにより達成できる。本方法を使用する、ＬＰＬをコードする核酸配列のベクターへの取り込みおよび組織臓器の部分の形質導入により、ＬＰＬの安定な長期発現がＬＰＬＤの処置のために達成できる。
２. 発現および製造
ここに提供されるのは、動物においてポリペチドを製造する方法である。動物における、治療的タンパク質または栄養補助食品を含む、タンパク質の治療的産生は当業者に周知である。例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、(ｔ−ＰＡ)、インスリン、成長ホルモンおよび凝血因子のような産物が動物、例えばウシ、ヒツジまたはヤギで産生されている(例えばMercier J.C. (1987) Exploiting New Technologies in Animal Breeding, p. 122-131, Oxford University Press; Lillico et al. (2005) Drug Discovery Today, 10:191-196; Echelard et al. (2006) Biopharm International, 19:36; Prather et al. (2003) Theriogenology, 59:115-123)。目的とする産物を発現するウイルスベクターを使用する昆虫細胞における遺伝子産物の製造も記載されている(例えば米国公開出願番号ＵＳ２０１１／０１１９７７７参照)。
動物におけるタンパク質の製造方法、例えばここに記載のまたは当分野で知られるいずれかは、ポリペチドをコードする核酸分子を含む送達剤を、産生動物の区画化した臓器またはその部分に投与し、該産生動物をポリペチドの発現を可能にする条件下に維持し、発現されたポリペチドを該産生動物から単離する(例えば、産生動物の血液または他の生物体液から)段階を含む。コードされたポリペチドは、製造が望まれるあらゆるタンパク質、特にあらゆる治療的タンパク質または栄養補助食品として使用できるタンパク質であり得る。このようなタンパク質の例は、凝血因子(例えば第VIII因子、第IX因子、フィブリノーゲン血凝固因子)、ラクトフェリン、ヘモグロビン、ヒトタンパク質Ｃ、アルファ−１−アンチトリプシン、組織プラスミノーゲンアクティベーター(ｔ−ＰＡ)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(ＣＦＴＲ)、インスリン、成長ホルモン、サイトカイン、モノクローナル抗体、ワクチン(例えば抗原)、コレステロールオキシダーゼおよびその他を含むが、これらに限定されない。
ポリペチドは、産生動物からの生物学的サンプルから単離できる。生物学的サンプルは血液、尿、乳、血漿、唾液または他の類似サンプルであり得る。具体例において、タンパク質産物は乳に出現し、使用できまたはそこから単離できる。産生動物はウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、雌鳥、ブタまたはウシ動物であり得る。本方法は、送達剤が、特に大型動物、例えばブタおよびウシにおいて大量のポリペチドを産生するようにスケール調製できるために、現在の産生方法を越える利点を提供する。さらに、上記のとおり、ポリペプチドは、産生動物の細胞により翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)され得る。
３. 農業および獣医用途
ここで提供する方法を、動物における遺伝子治療適用および特に獣医、農業または産業用途に使用できる。このような例において、本発明方法において送達するための送達剤は、動物における生産性向上および／または疾患制御に有効な核酸分子をコードする。動物における適用は、所望の形質を有する動物の改変または産生、動物の質の向上(例えば筋肉、乳、羊毛)、疾患に対する抵抗性の増加または産業用途のための産物(例えば絹)の産生のための適用を含むが、これらに限定されない。例えば、遺伝子治療適用は、動物における毛生産を増強するか、動物における羊毛生産量を増やすか、動物の成長を促すまたは栄養素合成もしくは利用を制御するものを含む。このような例において、核酸分子は、動物における筋肉生産量を増やす、動物における毛生産量を増やす、動物における羊毛生産量を増やす、動物の成長を促すまたは栄養素合成もしくは利用に関わるタンパク質をコードする。
このような適用は当業者に周知である。例えば、成長ホルモン(例えばソマトトロピン)をコードする核酸または成長ホルモンを仲介する試剤を投与することにより、例えば、核酸を含む送達剤を、動物における筋肉生産量を増やすために、動物に投与きる(例えばＩＧＦ−１、成長ホルモン放出因子またはニワトリＳｋｉ(ｃＳｋｉ)(例えば、Lee (1997) Theriogenology, 47:225; Palmiter et al. (1982) Nature, 300:611-615参照)。他の例では、核酸分子は肉生産に有用なミオスタチン阻害因子であるかまたはそれをコードし得る。例えば、核酸分子は、ミオスタチンのその受容体への結合を遮断し、それにより大きな筋肉の発達をもたらすフォリスタチンをコードし得る。
他の例では、動物およびその産物の質を改善し得る。このような例において、動物の全体的質の改善は、農業用途(例えば乳、卵または肉の利用のため)の助けとなり得る。一例では、核酸を含む送達剤を、乳生産を増やすためにまたは乳の質を高めるために動物に投与し得る(例えば、Mercier J.C. (1987) Exploiting New Technologies in Animal Breeding, p. 122-131, Oxford University Press参照)。さらに、動物の乳はまた乳を増やすためまたは品質を改善するために、例えば、ヒト消費のために、遺伝子治療方法によりまた修飾し得る。例えば、乳児または高齢者に与える栄養バランスのよい製品を提供するために、ラクトフェリンが牛乳に発現されるように改変されている(例えばvan Berkel et al. (2002) Nat. Biotech., 20:484-487参照)。また、動物の乳は、乳腺炎を起こす細菌の繁殖の阻害により改善できる(例えばMaga et al. (2006) Foodborne Pathog. Dis., 3:384-392)。他の例において、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を発現するように(例えばSaeki et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci., 101:6361-6366参照)、オメガ−３脂肪酸類に富むように(例えばLai et al. (2006) Nature Biotechnology, 24:435-436参照)；高レベルのベータ−カゼインおよびカッパ−カゼインの乳を産生するように(例えばBrophy et al. (2003) Nature Biotechnology, 21:157-162参照)または低リン糞尿を産生するために唾液フィターゼを発現するように(例えばGolovan et al. (2001) Nature Biotechnology, 19:741-745参照)動物を改変し得る。さらなる例では、核酸分子は、栄養素利用を改善するために使用できる、アミノ酸生合成またはグリオキシル酸回路遺伝子に関与するものを含む。例として、セリントランスアセチラーゼおよびｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードするｃｙｓＥおよびｃｓｓＫ遺伝子のような核酸分子を含む送達剤を投与できる。
さらなる例において、核酸分子を含む送達剤を、動物の疾患に対する抵抗性を高めるために、動物に投与できる。例えば、動物は、プリオンタンパク質を欠くように産生できる(Richt et al. (2007) Nature Biotechnology, 25:132-138)。他の例において、動物は、細菌感染、例えば黄色ブドウ球菌感染に抵抗性であるように改変できる(Wall et al. (2005) Nature Biotechnology, 23:445-451)。
さらなる例において、核酸分子は、動物における毛の成長を増やすかまたは羊毛生産量を増やすポリペプチドをコードし得る。このような面の具体例において、動物はヒツジまたは子ヒツジまたは毛または羊毛生産に適する毛を含む他の動物である。例えば、羊毛生産は、羊毛合成におけるアミノ酸を制限するシステインをコードする核酸分子；羊毛濾胞または皮膚におけるケラチンをコードする核酸分子または増殖因子(例えばＥＧＦまたはＩＧＦ−１)をコードする核酸分子を含む送達剤の投与により増強できる。動物はまた産業用途のために、例えば、絹を産生するクモ遺伝子を動物、例えばヤギに操作することにより、絹を産生するために改変もできる(例えばLazaris et al. (2002) Science, 295:472-476参照)。
Ｈ. 実施例
次の実施例は説明目的でのみ包含させ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１
尾状葉へのアデノウイルス形質導入のための区画化
アデノウイルスを、実質クランプを使用して脈管構造から隔離することにより区画化した尾状葉に注射した。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃと命名したアデノウイルスは、David T. Curiel(University of Alabama、例えばBass et al. (1995) Cancer Gene Ther., 2:97-104；公開国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ１９９５／０２６４１１参照)から提供された。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｌｕｃはヒトアデノウイルス５型由来であり、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含む。特に、アデノウイルス形質導入分析のために、Ｅ１領域欠失によりアデノウイルスを複製欠損とした。この欠失Ｅ１領域に、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ(Ａｄｌｕｃ)をクローン化し、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターにより駆動されるように構築した(命名ｒＡｄ−ＣＭＶ−ルシフェラーゼまたはＡｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃ)。
特に、肝臓の尾状葉に区画化されるはずであるアデノウイルス形質導入の程度を決定するために、１０匹のラットを、ペントバルビタールナトリウム(５０mg／kg)(Abbott Laboratories, Chicago, IL)の腹腔内(ｉ.ｐ.)注射により麻酔した。各ラットを、次いで仰臥位に置き、腹部領域の毛を剃り、腹腔を露出し、剣状突起から臍部まで３cm腹側正中線切開した。尾状葉の上部部分を位置づけし、切開し、小葉間および肝−胃靱帯をした。尾状葉の茎を同定し、１０mm止血微小鉗子を使用してクランプした(Fine Science Tools-USA Inc., Foster City, CA)。
尾状葉をクランプしたら、１mlシリンジ(Becton & Dickinson Corp., Franklin, NJ)中の１×１０９pfu組み換えＡｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃの５０μlリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を、５匹のラットの尾状葉の実質に注射した。残りの５匹のラットに、総量１００μl ＰＢＳ中の１×１０９pfu Ａｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを、コントロールとして大静脈に注射した。クランプを３０分維持した。次いで、ラットを5-0 Vicryl(Ethicon Inc., Somerville, NJ)で２面(筋肉および皮膚)縫合し、回復させた。
術後７２時間で、ラットをペントバルビタールナトリウムの過剰量ｉ.ｐ.投与により屠殺した。肝臓を回収し、肝臓の尾状核、右外側、左外側および中葉を分離し、組織病理学的評価、ルシフェラーゼ活性アッセイおよびヌクレオチド(ＤＮＡおよびＲＮＡ)抽出のために処理した。
ＤＮＡ抽出について：１０mg組織を、１００mM ＮａＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ×Ｃｌ、ｐＨ８、０.５％ＳＤＳ、０.１mg／mlプロテイナーゼＫの溶液４００μLに入れ、ほとんどの細胞性タンパク質が分解されるまでインキュベートした。消化物を連続的フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出により除タンパクし、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収し、乾燥し、ＴＥ ｐＨ８緩衝液に再懸濁した。
ホルマリン固定組織をパラフィン包埋し、通例の病理組織学に使用した。病理組織学のために、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織ブロックを５μmに切り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、認定病理学者により顕微鏡試験した。
ルシフェラーゼ活性アッセイのために、切開した葉をFast Prep 24、Sample Preparation System(MP Biomedicals)を使用して、Lysing Matrix D(MP Biomedicals)を５００μL溶解緩衝液(Luciferase assay system, Promega, Madison, WI)中で使用して均質化した。２０μlの上清を１００μlのルシフェラーゼアッセイ試薬に添加し、次いで、１０秒光子を測定するためのルミノメーター(Biotek, USA)を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。肝抽出物のタンパク質濃度を、タンパク質アッセイキット(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用してブラッドフォード方法により決定した。ルシフェラーゼ活性を、肝臓の種々の葉の比較および統計学的分析のために、ホモジネート中の総タンパク質で正規化した(総タンパク質のグラムあたりの相対的光単位(ｒｌｕ／ｇ))。
結果
肝臓炎症の組織学的分析を行った。肝臓炎症における区画化およびｉ.ｖ.輸注の効果を比較するために、７２時間目に得た肝臓切片を好中球浸潤の徴候について分析した。ｉ.ｖ.コントロールからのサンプルで行った肝臓組織学は、特に門脈周囲領域における、激しい限局性肝細胞壊死を示した。これらの限局性壊死性領域は好中球に浸潤されていた。肝細胞壊死、非実質細胞または浸潤炎症性細胞は、区画化動物で得た組織には全くなかった。
ルシフェラーゼ活性について、結果は、アデノウイルスの静脈内(IV)輸注を受けたコントロール動物から回収した全葉で同等レベルのルシフェラーゼ活性が測定されることを示した。対照的に、クランピング後、アデノウイルス注射を尾状葉に受けた動物は、肝臓の他の葉より３桁を超える強い強度のルシフェラーゼ活性を示し、アデノウイルス形質導入が注射組織に制限され、周囲組織はベクターへの暴露から残されることを示す。結果を図２に示す。
実施例２
全身解放を最小化するためのクランプ時間の決定
Ａ. クランプ解放後の全身ウイルス発現
注射組織へのアデノウイルスの区画化を行うためのクランピング時間の最適な長さを決定するために、実施例１に記載の外科手技を行い、続いて１mLインスリンシリンジを使用して、総体積５０μlに懸濁した１×１０１０pfu Ａｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを尾状葉の実質に注射した。止血微小鉗子クランプをアデノウイルス注射後７分、１５分、３０分および６０分に茎から解放した(ｎ＝６／時点)。クランプ解放１分後、２００μlの末梢血を大静脈から回収し、ＰＣＲ用に処理した。ルシフェラーゼ遺伝子を次のプライマーを使用して増幅した：センス５’−ＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧ−３’(配列番号１およびアンチセンス５’−ＡＡＡＡＣＣＧＧＧＡＧＧＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴ−３’(配列番号２)、２０μlの総反応体積中。ＰＣＲ条件は：９４℃で５分、続いて２５サイクルを９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒および７分、７２℃伸張であった。
結果を図３、パネルＡに示す。アデノウイルスＤＮＡ(ルシフェラーゼ)は、７分のクランプ時間後に末梢血で検出であった。クランプ時間を１５分に延ばすと、血中で検出されるアデノウイルスＤＮＡは、７分のクランプ時間後に見られるものの約半分に減少した。アデノウイルスＤＮＡは、３０分および６０分のクランプ時間後に末梢血で検出不可能であり、少なくとも３０分のクランプ時間がアデノウイルスの注射組織への制限を促進することを示す。
Ｂ. クランプ解放中および後のアデノウイルスＤＮＡの全身存在
３０分のクランプ時間後の末梢血におけるアデノウイルスＤＮＡの存在を評価する上記結果を確認するために、３０分のクランプ時間中および後の末梢血に存在するアデノウイルスを測定するための経時変化研究を行った(ｎ＝３)。特に、尾状葉をクランプしたら、実施例１に記載の外科手技を行い、続いて１mLインスリンシリンジを使用して、５０μlの総体積に懸濁した１×１０１０pfu Ａｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを尾状葉の実質に注射した。次いで、アデノウイルス注射後１分、３分および５分(クランピング中)およびクランプ解放後１分、３分および５分(クランプ解放後)に大静脈から１００μl採血した。クランプを３０分設置した。血液サンプルを、上記のとおりＰＣＲによりルシフェラーゼ遺伝子を増幅することによりアデノウイルスＤＮＡの存在について分析した。１０μlのＡｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃアデノウイルスをポジティブコントロールとして使用した(Ｃ＋)。
結果を図３、パネルＢに示す。アデノウイルスＤＮＡは、試験したいずれの時点でも血中に検出不可能であったが、ポジティブコントロールサンプルで検出可能であった。これらの結果は、クランプ手技が、クランプ設置中、注射したアデノウイルスが血流に入ることを阻止することを示す。結果はまた、クランプ除去最大５分後の血中に検出可能量のウイルスがないことにより証明されることにより、注射組織細胞へのウイルスの形質導入に３０分のクランプ時間が十分であることも確認する。
実施例３
導入遺伝子発現の用量−応答動態
タンパク質発現とアデノウイルス投与の相関を決定するために、用量応答曲線を作成した。実施例１に記載する外科手技およびクランピング手技に従った(ｎ＝６／用量群)。各群は、先に記載したとおり、５０μL ＰＢＳ中１×１０３、１×１０６、１×１０９または１×１０１２pfu Ａｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを注射された。コントロール群のラットは外科的手技にフされ、１００μL ＰＢＳの総体積の対応するアデノウイルス用量を直接的に大静脈に注射された(ｎ＝６／用量群)。注射後、ラットを実施例１に記載のとおり縫合し、回復させた。術後７２時間で、ラットを実施例１に記載のとおり屠殺し、実施例１に記載のとおり肝臓の尾状葉を改修し、ルシフェラーゼ活性アッセイのために処理した。ルシフェラーゼ活性がサンプルに存在するルシフェラーゼタンパク質の合成量に比例するため、この計量を、合成された遺伝子導入タンパク質の指標として使用した。
結果を図４に示す。ルシフェラーゼ活性／発現はベクター用量の増加と共に直線的に増加し、１０３pfuアデノウイルスの注射を受けた組織からの約２.５×１０２ｒｌｕ／ｇのタンパク質から、１０１２pfuの注射を受けた組織からの５×１０９rlu／ｇを超えるタンパク質までの範囲であった。これらの結果は、ベクター用量とタンパク質産出量に相関関係があることを示す。
実施例４
導入遺伝子発現の期間
導入遺伝子発現の持続性を、アデノウイルス投与後漸進的時点での導入遺伝子発現(ルシフェラーゼ活性)の測定により決定した。この目的で、ラット(ｎ＝６／時点)を実施例１に記載する外科手技に付し、実施例１に示すとおりのプロトコルに従い、尾状葉クランプ後、５０μl ＰＢＳ中の１×１０９pfuのＡｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを各動物の尾状葉に注射した。コントロール群のラット(ｎ＝５)を実験群と同じ外科的手技に付したが、１００μl ＰＢＳの１×１０９pfu ｏｆ Ａｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを大静脈へ静脈内(IV)注射した。アデノウイルス投与後、ラットを実施例１に記載のとおり縫合し、回復させた。時点あたりの５匹のラットを、上記のとおり、アデノウイルス注射後３０日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日および３６５日に屠殺した。次いで、実施例１に記載のとおり肝臓の尾状葉を回収し、アッセイルシフェラーゼ活性のための処理した。
結果を図５に示す。３０日目に、凡そ１０３rlu／ｇのタンパク質が、平均で、尾状核葉抽出物に観察された。ルシフェラーゼ活性は、アデノウイルス投与後３０日〜９０日で１００倍増加した(〜１０３rlu／ｇのタンパク質対〜１０５rlu／ｇのタンパク質)。アデノウイルス形質導入後１２０日で、タンパク質発現は形質導入後３０日で観察されたものの約半分に落ちた(〜５００rlu／ｇのタンパク質)。次いで、発現は、形質導入１５０日まで、最大で１０４rlu／ｇを超えるタンパク質まで反跳した。このレベルのタンパク質発現は注射後１８０日間維持され、アデノウイルス形質導入後１年(３６５日)でわずかしか低下していなかった。これらの結果は、形質導入後少なくとも１年間の持続性導入遺伝子発現を証明する。
実施例５
サイトカインｍＲＮＡ発現
区画化尾状核葉へのアデノウイルス送達により肝臓に誘発されるサイトカイン発現レベルおよび大静脈へのアデノウイルス送達により末梢血に誘発されるサイトカイン発現レベルを決定した。簡単にいうと、尾状葉をクランプし、実施例１に記載の外科手技を行い 続いて実施例１に記載のとおり、５０μlリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中の１×１０９pfu組み換えＡｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを尾状葉の実質に注射した。コントロール群として、動物に、実施例１に記載のとおり、総体積５０μl ＰＢＳ中の１×１０９pfu Ａｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃを大静脈に注射した。
手技７２時間後、ラットをペントバルビタールナトリウムのｉ.ｐ.投与により屠殺した。肝臓を回収し、肝臓の尾状葉、右外側、左外側および中葉を分離した。製造社のプロトコルに従い、総ＲＮＡをTrizolキット(Gibco/Life Technologies)を使用して抽出した。１μgの総ＲＮＡを逆転写に使用し、これは製造社の指示に従いＲＮＡＰＣＲキット(Applied Biosystems, Branchburg NJ)を使用して行った。腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦα)ｍＲＮＡ検出について、次のプライマーを使用した：センス５’−ＡＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＡ−３’(配列番号３)およびアンチセンス５’−ＣＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧ−３’(配列番号４)、２０μlの総反応体積中。ＰＣＲ条件は：９４℃で５分、続いて２５サイクルを９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で３０秒および７分、７２℃伸張であった。トランスフォーミング増殖因子ベータ(ＴＧＦβ)について、次のプライマーを使用した：センス５’−ＡＴＡＣＧＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴ−３’(配列番号５)およびアンチセンス５’−ＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴＴＧＡＴＴ−３’(配列番号６)、２０μlの総反応体積中。ＰＣＲ条件は：９４℃で５分、続いて２５サイクルを９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で３０秒および７分、７２℃伸張であった。インターフェロンガンマ(ＩＦＮγ)について、次のプライマーを使用した：センス５’−ＧＣＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＡＣＴＴＧ−３’(配列番号７)およびアンチセンス５’−ＣＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＣＴＴＴ−３’(配列番号８)、２０μlの総反応体積中。ＰＣＲ条件は：９４℃で５分、続いて２５サイクルを９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒および７分、７２℃伸張。インターロイキン６(ＩＬ−６)について、次のプライマーを使用した：センス５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＡＣＡＧ−３’(配列番号９)およびアンチセンス５’−ＡＣＡＧＴＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣＴＧＴＴＣ−３’(配列番号１０)、２０μlの総反応体積中。ＰＣＲ条件は：９４℃で５分、続いて２５サイクルを９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒および７分、７２℃伸張であった。ベータ−アクチンのためのＰＣＲプライマーを内部標準として使用し、次のとおりであった：センス５’−ＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣ−３’(配列番号１１)およびアンチセンス５’−ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ−３’(配列番号１２)、２０μlの総反応体積中。ＰＣＲ条件は：９４℃で５分、続いて２５サイクルを９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒および７分、７２℃伸張であった。
結果を図６に記載する。結果は、大静脈へのアデノウイルス送達は、全肝臓葉におけるＴＮＦαおよびＩＦＮγの検出をもたらすが、ＴＧＦβおよびＩＬ−６は、右側葉以外、全葉で観察されたことを示す。対照的に、アデノウイルスの区画化尾状核葉への送達は、尾状葉におけるＴＧＦβおよびＩＦＮγの検出および尾状葉におけるＴＮＦαの低レベル発現をもたらした。他の葉におけるこれらのサイトカインの発現は検出されなかった。ＩＬ−６はいずれの葉でも検出されなかった。それゆえに、結果は低肝臓サイトカイン発現を示す。
実施例６
死亡したブタ肝臓でのエキソビボクランピング試験
予備的エクスビボ試験をブタ肝臓で行った。サイズ、重量および肉眼的解剖学がヒトに極めて似ているため、ブタを動物モデルとして選択した。新鮮な全／完全肝臓を地元の肉屋から得た。腹腔鏡下デバイスを使用して、左中葉をクランプし、５ml ブロモフェノールブルーを実質に注射した。３０分後、クランプを外し、クランプが設置されていた両側の組織を切開し、青色色素の存在について分析した。青色色素は注射した組織に近位の側のクランピング境界で見られたが、青色色素は注射部位に遠位のクランピング境界の端の組織に浸透していなかった。それゆえに、クランピングデバイスは、デバイスの遠位側に溶液が伝わるのを阻止することにより、色素を区画化できた。
実施例７
ブタにおけるアデノウイルス形質導入の区画化
実施例１に記載した手技を次いで実施例６に記載したクランピングデバイスを使用してブタで試験した。ブタを標準条件下、１２時間昼／夜サイクルで飼育し、水および餌を自由に与えた。ブタを一般的麻酔下に置き、腹部領域の滅菌洗浄の後、５cm 剣状骨下方中央切開を行った。次いで肝臓の左中葉を位置づけし、暴露し、実施例５に記載した外科的クランプを左中葉の遠位部分に置いた。次いでｒＡｄ−ＣＭＶ−ルシフェラーゼの１×１０９感染性ウイルス粒子を含む５００μLのリン酸緩衝化溶液(ＰＢＳ)を、インスリンシリンジを使用した隔離した左中葉の実質に注射した。
３０分経過後、クランプを除去し、腹腔を２面で縫合し、動物を回復させた。術後７２時間で、動物を屠殺し、肝臓を回収した。組織サンプルを注射部位、左側葉、右側葉および注射部位の近位、中位および遠位の部位で右中葉から採った。組織サンプルをルシフェラーゼ活性およびウイルスＤＮＡネステッドポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)分析で使用するために凍結させた。
アデノウイルス形質導入の区画化を組織サンプルで評価した。簡単にいうと、実施例１に記載のとおり、組織サンプルを均質化し、ルシフェラーゼ活性アッセイを行った。結果を図７に示す。背景ルシフェラーゼ活性は、右外側、右中位および左側葉からの全サンプルからの葉で観察された。対照的に、注射部位で測定されたルシフェラーゼ活性は、他のサンプルのいずれよりも凡そ２０倍高かった。これらの結果は、ルシフェラーゼ活性が注射された、クランプされた組織に限定されることを証明し、アデノウイルス形質導入がブタにおいて区画化されたとの結論を支持した。
アデノウイルスの区画化形質導入を確認するために、組織サンプルをさらにネステッド−ＰＣＲにより分析した。ＰＣＲの最初のランを、特異的プライマーを使用して５０サイクル、ルシフェラーゼ遺伝子を増幅することにより行った。１０μlのＡｄ.ＣＭＶ.Ｌｕｃアデノウイルスをポジティブコントロールとして使用し、プラスミドｐｃＤＮＡ３(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)をネガティブコントロールとして使用した。最初の産物をアガロースゲル電気泳動で分析した。結果は、アデノウイルス注射組織から増幅したポジティブコントロールで観察されるものとサイズが類似するバンドを示したが、他の組織サンプルまたはネガティブコントロールサンプルではなかった。二回目のＰＣＲランは、最初のＰＣＲ産物およびネステッドプライマーを使用し、センス５’−ＣＡＡＣＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＡＧＡＧＡ−３’(配列番号１３)およびアンチセンス５’−ＡＴＴＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＴＡＴＣＧＴＴＴ−３’(配列番号１４)プライマーを２０μLの総反応体積で用いて行った。ＰＣＲ条件は：９４℃で５分、続いて２５サイクルを９４℃で３０秒、５３℃で３０秒および７２℃で３０秒および７分、７２℃伸張であった。アガロースゲル電気泳動によるバンドにより、ルシフェラーゼ遺伝子に対応する明らかなバンドが注射組織およびポジティブコントロールサンプルに存在し、他の組織およびネガティブコントロールサンプルでは全く存在しなかった。注射した、クランプした組織にウイルスＤＮＡ配列が存在し、隣接組織のいずれにも存在しないことは、ウイルス形質導入の区画化の成功を示す。
実施例８
区画化肝臓葉への送達後の血中の可溶性レポータータンパク質発現
可溶性タンパク質が発現され、血中で検出され得るかを決定するために、可溶性タンパク質を発現するアデノウイルスを、実質クランプを使用して区画化したラットの尾状葉に注射した。Ａｄ−ＡＬＢ−ＡＦＰと命名したアデノウイルスはヒトアデノウイルス５型由来であり、ラットアルブミンプロモーター配列により駆動されるラットアルファフェトプロテイン(ＡＦＰ)遺伝子をコードする(Herbomel et al. (1989) Molecular and Cellular Biology, 9:4750-4758; Tronche et al. (1989) Molecular and Cellular Biology, 9:4759-4766)。アデノウイルスは、Ｅ１領域欠失により複製欠損とした。この欠失Ｅ１領域に、レポーター遺伝子アルファフェトプロテイン(ＡＦＰ)をクローン化し、肝臓への特異性のためにラットアルブミン(ＡＬＢ)プロモーターにより駆動されるように構築した。ＡＬＢプロモーター制御下にラットＡＦＰをコードするｐＵＣ５７プラスミドをGenscript(Piscataway, NJ)により合成した。ｐＵＣ５７プラスミドからのＡＦＰ発現カセットをデュアルベーシックアデノウイルスシャトルベクターにサブクローン化し、Ａｄ５(ＤＥ１／ＤＥ３)ベクター(Vector Biolabs, Philadelphia, PA)と組み換えた。アデノウイルスをＨＥＫ２９３細胞にパッケージし、塩化セシウム超遠心分離法で精製した。ＡＬＢ−ＡＦＰウイルスを、５０μLの総体積中３.２５×１０９でと投与した。注射後５日目、動物を屠殺し、肝臓を回収した。
実施例１に記載した手技に準じて、区画化を行った。簡単にいうと、８匹のラットを６０mg／kg ケタミン−ＨＣｌおよび１０mg／kg キシラジン−ＨＣｌ(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL)の腹腔内(ｉ.ｐ.)注射で麻酔した。次いで各ラットを仰臥位に置き、腹部領域の毛を剃り、腹腔を暴露し、続いて剣状突起から臍部まで３cm腹側正中線切開した。尾状葉の上部部分を位置づけし、切開、小葉間および肝−胃靱帯をした。尾状葉の茎を同定し、１０mm止血微小鉗子を使用してクランプした(Fine Science Tools - USA Inc., Foster City, CA)。
尾状葉をクランプしたら、１mL シリンジ(Becton Dickinson Corp., Franklin, NJ)中、５０μLリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中の３.７５×１０９pfu組み換えＡｄ.ＡＬＢ−ＡＦＰを６匹のラットの尾状葉の実質に注射した。別の２匹のラットを非注射コントロールとして使用した。クランプを３０分維持した。次いで、ラットを5-0 Vicryl(Ethicon, Inc., Somerville, NJ)で２面(筋肉および皮膚)縫合し、回復させた。
術後７日で、１mLの末梢血を大静脈から回収した。血液を血清セパレーターチューブ(Becton Dickinson Corp., Franklin, NJ)を使用して回収し、サンプルを３０分凝血させ、１０００ｇで１５分遠心分離した。血清を取り、分注し、サンプルを−２０℃で貯蔵した。ＡＦＰを、製造社のプロトコルに従い、ラットアルファ−フェトプロテイン、ＡＦＰ ＥＬＩＳＡキット(Cusabio Biotech Co., Ltd., Wuhan China)を使用して血清で検出した。
結果を図８に記載する。結果は、ウイルスを注射されていないコントロールラットの血中のＡＦＰの検出を示した。結果は、Ａｄ.ＡＬＢ−ＡＦＰを注射されたラットが、コントロール動物よりも、血清で高いＡＦＰを有することを示した。それゆえに、結果は、アデノウイルスの注射は、肝臓の区画化葉における可溶性タンパク質を発現させ、血中で検出可能な可溶性タンパク質の発現をもたらすことを示す。
修飾が当業者には明らかであるため、本発明は添付する特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることを意図する。

Claims (30)

  1. 治療核酸により処置可能な疾患または状態の処置に使用するための組成物であって：
    該組成物は治療核酸分子を含む送達剤を含み；
    治療核酸を含む該送達剤は一本鎖ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、非ウイルスベクター、ウイルス、ウイルス様粒子、ミニサークル、ナノ粒子、ｄｓＲＮＡまたは治療核酸を含む全細胞であり；
    単回用量中の核酸の量は０.０１mg〜２０００mgであり；
    該組成物は組織、臓器または組織もしくは臓器の部分における実質に希釈せずに投与される単回用量として製剤化され、該実質は投与したウイルスまたはウイルスベクターの取り込みのために投与後少なくとも２５分〜１時間区画化され；
    該区画化された組織または臓器またはその部分における実質は結合組織、血管、神経または導管を含まず；そして
    該区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分は体循環から隔離され、これにより、組成物が実質投与されたとき、組織または臓器またはその部分への血液供給および血流が減少するかまたは排除されるように組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分に繋がるまたは通り抜ける動脈、静脈、導管および／または血管が遮断される、
    組成物。
  2. 区画化された組織、臓器または組織もしくは臓器の部分の実質細胞への送達剤の送達を促進する薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 治療核酸により処置可能な疾患または状態が遺伝子欠損、外来性遺伝子産物により回復する疾患または状態および病因に遺伝子産物の発現の異常または変更がある疾患または状態から選択される、または、動物における筋肉生産量を増やす、動物の成長を促すまたは動物における栄養素合成または利用をもたらす異種ポリペチドを対象において産生することにより処置される疾患または状態である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 核酸がポリペプチドをコードするかまたはｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
  5. 核酸が酵素、ホルモン、凝固因子または凝血因子、サイトカイン、増殖因子またはその活性部分、抗体またはその抗原部分、血管形成モジュレーター、免疫調節剤、疼痛モジュレーター、受容体またはその活性部分、輸送タンパク質、制御タンパク質、抗原およびアレルゲンから選択されるポリペチドをコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
  6. 核酸がアデノシンデアミナーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(ＣＴＦＲ)、ガルスルファーゼ、ラロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、酸アルファグルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、インスリン、甲状腺ホルモン、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン−１(ＩＬ−１)、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、インターフェロン(ＩＦＮ)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ｆｌｔ３)、ニューロピリン−２(ＮＰ２)、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、線維芽細胞増殖因子受容体(ＦＧＦＲ)、トランスフォーミング増殖因子受容体(ＴＧＦＲ)、血管内皮細胞増殖因子受容体(ＶＥＧＦＲ)、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、第VIII因子、第IX因子、フォン・ヴィルブランド因子、成長ホルモン、メタロプロテイナーゼトロンボスポンジンモチーフ１(ＭＥＴＨ−１)、ＭＥＴＨ−２、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ(ＴｒｐＲＳ)フラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、色素上皮由来増殖因子(ＰＥＤＦ)、バソスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲン−Ｅフラグメント、トロンボスポンジン、タムスタチン、カンスタチン、レスチン、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１(ｓＦｌｔ−１)、可溶性血管内皮細胞増殖因子受容体(ｓＦｌｋ)、可溶性ニューロピリン−１(ｓＮＲＰ１)、インターフェロンガンマ誘発タンパク質１０(ＩＰ−１０)、血小板第４因子(ＰＦ−４)、Gro-beta、可溶性エフリンＢ型受容体４(ｓＥｐｈＢ４)、セフリンＢ２、ＴＧＦ、ＩＧＦ−１、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ＨＳＶ−ＴＫ)、カルボキシペプチダーゼＧ２(ＣＰＧ２)、カルボキシルエステラーゼ(ＣＡ)、シトシンデアミナーゼ(ＣＤ)、チトクロムＰ４５０(ｃｙｔ−４５０)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)、ニトロレダクターゼ(ＮＲ)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ＰＮＰ)、チミジンホスホリラーゼ(ＴＰ)、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(ＶＺＶ−ＴＫ)、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＸＧＰＲＴ)、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通型タンパク質、システイントランスポーター、酸セラミダーゼ、酸α−Ｌ−フコシダーゼ、保護タンパク質／カテプシンＡ、酸β−グルコシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ、酸β−ガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸α−マンノシダーゼ、酸β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ニーマン・ピック病Ｃ１型(ＮＰＣ−１)、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：αグルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ、β−グルクロニダーゼ、酸リパーゼ、ネプリライシン、インスリン分解酵素インスリジン、thimetオリゴペプチダーゼ、カルビンディンＤ２８、パルブアルブミン、低酸素症誘発因子１−アルファ(ＨＩＦ１−アルファ)、サーチュイン−２(ＳＩＲＴ−２)、生存運動神経タンパク質−１(ＳＭＮ−１)、ＳＭＮ−２、グリア細胞由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、毛様体神経栄養因子(ＣＮＦ)、低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬＲ)、ｌｉｐｒｏタンパク質リパーゼ(ＬＰＬ)、アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)、ＵＤＰ−グルクロニル−トランスフェラーゼ(ＵＧＴ)、ＵＧＴ１Ａ１、グルコース−６ホスファターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ビオチニダーゼ、ベータ−グルコセレブロシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼおよびｐ５３から選択されるポリペチドをコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
  7. 治療核酸により処置可能な疾患または状態が関節炎、慢性疼痛、ＨＩＶ関連ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、遺伝性酵素欠損、遺伝性免疫欠損、癌、レトロウイルス感染、血友病、糖尿病、筋ジストロフィー、心血管障害、嚢胞性線維症、神経変性障害、外傷、疼痛、鎌状赤血球貧血、自己免疫性疾患、炎症性疾患および高血圧から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
  8. ポリペプチドをコードする治療核酸分子が血友病Ａを処置するための第VIII因子；血友病Ｂを処置するための第IX因子；Ｉ型糖尿病を処置するためのインスリン遺伝子；アルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)欠損を処置するためのアルファ−１−アンチトリプシン(ＡＡＴ)；ヘモクロマトーシスを処置するためのヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)；ウィルソン病を処置するための銅輸送ＡＴＰａｓｅ ２；クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型を処置するためのＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１(ＵＧＴ１Ａ１)；オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、II型を処置するためのオルニチントランスカルバミラーゼ(ＯＴＣ)；家族性高コレステロール血症を処置するための低密度リポタンパク質受容体(ＬＤＬＲ)；無フィブリノーゲン血症を処置するためのフィブリノーゲンアルファ(ＦＧＡ)、ベータ(ＦＧＢ)またはガンマ(ＦＧＢ)；糖原病(ＧＳＤ)Ｉａ型を処置するためのグルコース−６−ホスフェート−α；ＧＳＤＩｂ型を処置するためのＧ６ＰＴ；ＧＳＤ II型(ポンペ)を処置するための酸−α−グルコシダーゼ；ムコ多糖症(ＭＰＳＩ)を処置するためのα−Ｌ−イズロニダーゼ；ＭＰＳ IIIＡを処置するためのスルファミダーゼ；ＭＰＳ IIIＢを処置するためのα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(ＮａＧｌｕ)；ＭＰＳ VIIを処置するためのβ−グルクロニダーゼ；ファブリー病を処置するためのα−ガラクトシダーゼＡ；ゴーシェ病を処置するためのグルコセレブロシダーゼ；ニーマン・ピック症候群を処置するための酸スフィンゴミエリナーゼ；フェニルケトン尿症を処置するためのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ；肝線維症を処置するためのＴＩＭＰアンタゴニストまたは抗ＨＳＣ分子；肝虚血再灌流傷害を処置するための抗ＲＯＳ分子；アルツハイマー病を処置するためのアミロイド−ベータ分解酵素ネプリライシン、インスリン分解酵素インスリジンまたはthimetオリゴペプチダーゼ；筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)を処置するためのインスリン増殖因子−１(ＩＧＦ−１)、カルビンディンＤ２８、パルブアルブミン、低酸素症誘発因子１−アルファ(ＨＩＦ１−アルファ)、サーチュイン−２(ＳＩＲＴ−２)、生存運動神経タンパク質−１(ＳＭＮ−１)、ＳＭＮ−２、グリア細胞由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)または毛様体神経栄養因子(ＣＮＦ)；ガラクトース血症を処置するためのガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ；メープルシロップ尿症を処置するための分枝鎖アルファ−ケト酸デヒドロゲナーゼ；チロシン血症Ｉ型を処置するためのフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ；メチルマロン酸血症を処置するためのメチルマロニル−ＣｏＡムターゼ；シトルリン血症を処置するためのアルギニノコハク酸シンテターゼ；痛風およびレッシュ・ナイハン症候群を処置するためのヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；スライ症候群を処置するためのベータ−グルクロニダーゼ；ツェルウェーガー症候群を処置するためのペルオキシソーム膜タンパク質７０kDa、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染を処置するためのエンフュービルタイド；複合免疫不全(ＳＣＩＤ)を処置するためのアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)；嚢胞性線維症を処置するためのＣＦＴＲ；急性間欠性ポルフィリン症を処置するためのポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(ＰＢＤＧ)；多発性硬化症を処置するためのインターフェロン−ベータ；リポタンパク質リパーゼ欠損(ＬＰＬＤ)を処置するためのリポタンパク質リパーゼ、癌を処置するためのｐ５３；およびパーキンソン病を処置するためのグルタミン酸デカルボキシラーゼ(ＧＡＤ)から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
  9. 区画化された組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分が組織を通る血液供給および血流を遮断するために実質性にクランプされている、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
  10. 組織もしくは臓器または組織もしくは臓器の部分が肝臓、脳、脊髄、膵臓、心臓、皮膚、腎臓、肺、血管、骨、筋肉、子宮、子宮頸、前立腺、尿道および腸から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
  11. 組織または臓器が肝臓または肝臓の部分である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
  12. 動物における筋肉生産増強、動物における毛生産増強、動物における羊毛生産増強、動物の成長促進または動物における栄養素合成もしくは利用を促進するために使用する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
  13. 組成物が区画化された肝臓の部分の実質への核酸分子を含む送達剤の直接投与による投与のために製剤化される、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
  14. 肝臓の区画化部分が葉、葉のセグメントもしくは部分または肝臓のセグメントから選択される、請求項１３に記載の組成物。
  15. 葉または葉の部分が右葉、左葉、方形葉および尾状葉またはその部分から選択される、請求項１４に記載の組成物。
  16. ウイルスまたはベクターがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)、レトロウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスまたはベクターから選択される、請求項１５に記載の組成物。
  17. 送達剤が治療核酸分子を含むアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスであり、核酸分子がウイルスゲノムに異種である、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
  18. ウイルスがアデノウイルスであり、該アデノウイルスの血清型がアデノウイルス２型またはアデノウイルス５型である、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
  19. 送達剤が実質細胞への進入を促進する脂質またはポリマー試剤と製剤化されている、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
  20. 送達剤が送達剤の細胞取り込みを促進する薬剤と製剤化されている、請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物。
  21. 送達剤がウイルスであり、細胞取り込みを促進する薬剤がウイルス特異的細胞表面受容体の転写エンハンサーである、請求項２０に記載の組成物。
  22. 薬剤がヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)阻害剤である、請求項２０または２１に記載の組成物。
  23. 送達剤が異種核酸分子をそのゲノムに含むアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスであり；
    組成物が１回服用量投与用であり；
    組成物中のアデノウイルスの量が１×１０６〜１×１０１０粒子または１×１０７〜１×１０９粒子であるか；または１×１０６〜１×１０１０pfuまたは１×１０７〜１×１０９pfuであるか；または１×１０１２粒子、１×１０１１粒子、１×１０１０粒子、１×１０９粒子、１×１０８粒子、１×１０７粒子、１×１０６粒子、１×１０５粒子、１×１０４粒子以下であるか；または１×１０１２pfu、１×１０１１pfu、１×１０１０pfu、１×１０９pfu、１×１０８pfu、１×１０７pfu、１×１０６pfu、１×１０５pfuまたは１×１０４pfuである、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
  24. 成人または１８歳未満のヒト小児または胎児への投与のために製剤化されている、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
  25. 治療核酸により治療可能な疾患または状態が糖尿病である、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
  26. 治療核酸がインスリンをコードする、請求項１〜２５のいずれかに記載の組成物。
  27. 治療核酸により治療可能な疾患または状態が血友病である、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
  28. 治療核酸が第VIII因子をコードする、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
  29. 治療核酸が第IX因子をコードする、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
  30. 区画化を少なくとも３０分維持する、請求項１〜２９のいずれかに記載の組成物。
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